CN1935991B - 产气荚膜梭菌甘油脱水酶基因及其1,3-丙二醇的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种全新的甘油脱水酶基因的克隆及其在相关宿主中的表达，该酶的基因系克隆自产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)，它能够在正常的生化反应条件下将甘油转化为3-羟基丙醛。在本发明的基础上，可进一步把1，3-丙二醇氧化还原酶等相关酶基因一起重组到大肠杆菌中，获得一个新的代谢工程菌，这个代谢工程菌可以通过发酵将木薯淀粉的水解物、者葡萄糖或甘油转化为1，3-丙二醇。

Description

产气荚膜梭菌甘油脱水酶基因及其1，3-丙二醇的生产方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用生物转化法进行3-羟基丙醛和1，3-丙二醇生产的方法。

背景技术

1，3-丙二醇是生产聚对苯二甲酸丙二酯(PPT)的主要原料，也可用作合成增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的原料。特别是制造性能优异的PTT纤维，既具有聚对苯二甲酸乙二酯(PET)的性能，又具有尼龙良好的回弹性和抗污染性。在地毯、工程塑料、服装面料等领域应用广泛，成为目前国际上合成纤维开发的热点。目前1，3-丙二醇的生产方法主要是化学合成法，如以乙烯为原料，在高温(280℃)下用银作催化剂氧化成环氧乙烷，然后加氢和一氧化碳转化为3-羟基丙醛，最后氢化成产品1，3-丙二醇；或者以丙烯为原料，在350℃，0.2MPa下以钼作催化剂氧化为丙烯醛，再水化为3-羟基丙醛，然后氢化成1，3-丙二醇。这些方法都需要在高温和贵重催化剂作用下进行，产品除1，3-丙二醇外还有1，2-丙二醇及其二聚体、三聚体等性质相近的副产物，致使产品分离纯化较困难，生产成本较高，而且会照成环境的污染，因此现在人们把目光转移到生物法生产上。目前发现的能以甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇的天然菌主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)等。微生物在以甘油为底物转化生产1，3-丙二醇的过程中，起主要反应的关键酶为甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶。第一步，甘油脱水酶催化甘油转化成3-羟基丙醛和水(反应式1)，第二，3-羟基丙醛被NAD⁺偶联的氧化还原酶还原成1，3-丙二醇(反应式2)。

甘油→3-羟基丙醛+水                  (反应式1)

3-羟基丙醛+NADH+H⁺→NAD⁺+1，3-丙二醇 (反应式2)

反应第一步的甘油脱水酶是1，3-丙二醇生产的限速酶，对1，3-丙二醇的转化率起着至关重要的作用，无疑，提高它的酶活力有助于提高生产效率和转化率。甘油脱水酶主要分为两大类，一类是依赖辅酶B₁₂共同作用才有活力；另一类是不依赖辅酶B₁₂也有活力。目前，据报道只有丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)的甘油脱水酶是不依赖辅酶B₁₂，其它细菌的甘油脱水酶都是依赖辅酶B₁₂的，本发明所述的产气荚膜梭菌甘油脱水酶也是必须和辅酶B₁₂共同作用才显示活力。

在目前的公开文献中，我们检索到一些有关甘油脱水酶的公开报道如下：

1、【题名】克氏杆菌gldA基因亚克隆及其原核表达载体构建【作者】邵敬伟[1]郭养浩[1]吴志香[2]刘长江[3]【机构】[1]福州大学化学与化工学院，福州350002[2]辽宁中医学院附属医院，沈阳110032[3]沈阳农业大学食品学院，【刊名】农业生物技术学报.2005，13(2).-260-261【文摘】甘油脱水酶(glycerol dehydratase EC 4.2.1.30)是控制甘油分解和产生1，3-丙二醇的关键性限速酶。甘油脱水酶是由α、β和γ3个亚基组成的复合物(α2β2γ2)，分别由gldA、gldB和gldC基因编码。研究(Frank et al.1998；Macis et al.，1998；Markus et al.，1996)认为甘油脱水酶α亚基无论在甘油脱水酶的结构上还是功能上都起到重要的作用。本研究克隆了克氏杆菌的甘油脱水酶α亚基基因(gldA)并构建了该基因的原核表达载体，为甘油脱水酶基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。

2、【题名】重组甘油脱水酶的活性鉴定【作者】陈永胜[1]刘长江[2]李长彪[2]翟景波[3]【机构】[1]内蒙古民族大学农学院，沈阳农业大学，宝生物工程大连有限公司，【刊名】内蒙古民族大学学报：自然科学版.2005，20(2).-172-175【文摘】通过MBTH方法对重组甘油脱水酶活性进行检测。确定稳定的酶活检测***.结果显示重组甘油脱水酶的活性明显高于野生菌.此外，甘油脱水酶单个亚基及亚基两两组合未检测到酶活性.这一结果将对酶活性研究具有重要的意义.

3、【题名】甘油脱水酶gldC基因克隆、表达与鉴定【作者】陈永胜[1]刘长江[2]刘春萍[2]邵敬伟[2]翟景波[3]【机构】[1]内蒙古民族大学农学院，[2]沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161[3]宝生物工程大连有限公司，【刊名】生物技术.2005，15(1).-1-3【文摘】目的：表达及纯化甘油脱水酶γ亚基蛋白。方法：使用PCR及DNA重组技术，将甘油脱水酶7亚基基因gldC重组到含麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白表达载体pMAL-c2x中，在大肠杆菌中进行表达。结果：转化重组质粒pMAL/gldC的大肠杆菌经IPTG诱导，SDS-PAGE分析显示表达出的MBP-gldC融合蛋白相对分子质量约66kD，与预期大小一致，并经Western blot分析证实。用直链淀粉树脂亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。结论：成功地获得甘油脱水酶γ亚基融合蛋白，以便进一步研究其生物学性能。

4、【题名】微生物源甘油脱水酶的研究进展【作者】邵敬伟【机构】福州大学化学与化工学院，【刊名】郑州工程学院学报.2004，25(4).-85-88【关键词】脱水酶甘油微生物源失活酶活测定发酵研究前景研究进展***酶基因【文摘】综述了甘油脱水酶的结构、性质、酶活测定及其在甘油发酵中的作用机理等研究情况，介绍了甘油脱水酶基因工程的研究进展，并对其参与甘油脱水酶***性失活的再生反应进行了介绍，探讨了甘油脱水酶的研究前景并提出一些建议。

5、【题名】能量驱动对Klebsiella pneumoniae发酵甘油合成1，3-丙二醇的影响【作者】张延平饶治杜晨宇李春曹竹安【机构】清华大学化工系生物化工研究所，【刊名】过程工程学报.2004，4(6).-567-571【文摘】考察了外加能量对Klebsiella pneumoniae合成1，3-丙二醇的影响，结果表明，外加0.6～0.8g/L三磷酸腺苷(ATP)可以有效促进Klebsiella pneumoniae发酵甘油的还原代谢，1，3-丙二醇产量提高了50％～70％，得率在发酵后期仍能维持在较高水平.利用休止细胞研究了甘油脱水酶催化失活后能量刺激复活的情况，结果表明外加三磷酸腺苷(ATP)对休止细胞中甘油脱水酶的复活有明显的驱动作用，经多次失活/驱动复活后甘油脱水酶活性可维持不变。

6、【题名】途径工程生产1，3-丙二醇的研究进展【作者】杨登峰韦宇拓杜丽琴黄日波【机构】广西大学生物技术实验中心，【刊名】现代化工.2004，24(11).-24-26【文摘】利用基因工程技术生产1，3-丙二醇，特别是途径工程的利用已取得了重大突破.利用生物技术生产1，3-丙二醇的成本比化学法的低25％，它将逐步实现工业化生产.介绍了一步法生产1，3-丙二醇的超级基因工程菌所需的3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)、甘油3-磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)，并对关键酶dhaB进行了分析，同时介绍了穿梭质粒和甘油-3-磷酸酶积累对生产的影响.最后，对今后的研究重点和策略进行了探讨.

7、【题名】编码1，3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达【作者】迟乃玉[1]刘长江[2]刘英昊[3]张庆芳[1]郑学仿[4]【机构】[1]大连大学生物工程学院[2]沈阳农业大学食品学院沈阳110161[3]中国科学院微生物研究所[4]大连大学生命科学工作【刊名】微生物学报.2003，43(6).-717-721【文摘】采用PCR法克隆了巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)CpN-86菌株编码1，3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT基因)；完成了dhaT基因测序、表达载体构建和在大肠杆菌中表达；分离和纯化了dhaT基因表达的重组蛋白。实验结果：(1)PCR法克隆的dhaT基因和肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonine菌株dhaT基因的序列同源性为82.9％；(2)dhaT基因表达蛋白的酶活为108U/mg；(3)dhaT基因表达的蛋白分子量为43kD；(4)Western blot确定了dhaT基因表达的蛋白和CpN-86菌株天然蛋白有相同的抗原反应。

8、【题名】克雷伯氏菌1，3-丙二醇氧化还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达【作者】周文广黄日波【机构】广西大学生命科学与技术学院，蛋白质与酶工程发酵所，【刊名】广西农业生物科学.2004，23(2).-145-148【文摘】以基因组DNA为模板，利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中扩增得到含有1，3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的DNA片段，将其定向连接到克隆质粒pGEM-3xf上，得到重组质粒pGEM-dhaT。将此重组质粒转化到受体菌Escherichia coli DH5α中，通过蓝白斑鉴定挑选出阳性菌株。DNA序列分析表明其基因全长为1185bp。将该片段***表达载体pSE380，构建成重组子pSE-dhaT，并在E.coli JM109中获得表达，经SDS-PAGE检测，表达产物分子质量与天然纯1，3-丙二醇氧化还原酶(DHAT)相同，约为43ku。

9、【题名】克雷伯杆菌生产1，3-丙二醇关键酶发酵条件研究【作者】陈宏文[1]王蔚[2]方柏山[2]胡宗定[1]【机构】[1]天津大学化工学院生化工程系，[2]华侨大学生物工程与技术系，福建泉州【刊名】高校化学工程学报.2004，18(5).-621-627【文摘】研究了克雷伯杆菌生产1，3-丙二醇关键酶(甘油脱氢酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶)的发酵条件。研究各种碳源、无机氮源、有机氮源及无机盐对产酶的影响，应用均匀设计、神经网络和遗传算法优化发酵培养基组成，结果为(g·L^-1)：甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl20.28、酵母浸膏2.8。在温度37℃、初始pH7.0、摇床转速200r·min^-1和接种量5％条件下，发酵24h，无细胞抽提液中甘油脱氢酶、1，3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶活力(U·mg^-1)分别为9.16、18.72、0.48，发酵34h，发酵液中1，3-丙二醇(1，3-PD)最大浓度为7.96g·L^-1。代谢过程中关键酶酶活与1，3-PD峰值出现时间不一致，且提早于1，3-PD峰值的出现。此外，结果表明优化后的培养基去除了多种微量元素，克雷伯杆菌生产1，3-丙二醇关键酶可以在微氧条件下进行。

10、【题名】克雷伯杆菌生产1，3-丙二醇关键酶发酵条件研究【作者】陈宏文[1]王蔚[2]方柏山[2]胡宗定[1]【机构】[1]天津大学化工学院生化工程系，天津300072[2]华侨大学生物工程与技术系，【刊名】高校化学工程学报.2004，18(5).-621-627【文摘】研究了克雷伯杆菌生产1，3-丙二醇关键酶(甘油脱氢酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶)的发酵条件。研究各种碳源、无机氮源、有机氮源及无机盐对产酶的影响，应用均匀设计、神经网络和遗传算法优化发酵培养基组成，结果为(g·L^-1)：甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl20.28、酵母浸膏2.8。在温度37℃、初始pH7.0、摇床转速200r·min^-1和接种量5％条件下，发酵24h，无细胞抽提液中甘油脱氢酶、1，3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶活力(U·mg^-1)分别为9.16、18.72、0.48，发酵34h，发酵液中1，3-丙二醇(1，3-PD)最大浓度为7.96g·L^-1。代谢过程中关键酶酶活与1，3-PD峰值出现时间不一致，且提早于1，3-PD峰值的出现。此外，结果表明优化后的培养基去除了多种微量元素，克雷伯杆菌生产1，3-丙二醇关键酶可以在微氧条件下进行。

11、【题名】Klebsiella pneumoniae甘油脱水酶α亚基基因的克隆与序列分析【作者】邵敬伟刘长江【机构】沈阳农业大学食品学院，【刊名】无锡轻工大学学报.2004，23(2).-27-30【文摘】甘油脱水酶是1，3-丙二醇发酵过程中的重要限速酶，具有很好的工业应用前景.其中α亚基为甘油脱水酶的主要组成部分，该基因的正确克隆与分析对甘油脱水酶的正确表达起重要作用.作者采用PCR技术，从肺炎克雷伯氏杆菌A.S.1.1736基因组中扩增得到了编码甘油脱水酶α亚基的gldA基因，并将其克隆至pMD18-T载体中.经核苷酸序列分析证实，gldA基因开放阅读框架由1668bp组成.经GenBank检索对照分析，gld基因序列与国外文献报道的同源性达99.34％，表明所克隆的gldA基因即为克雷伯氏甘油脱水酶α亚基基因.

12、【题名】重组依赖辅酶B12的甘油脱水酶基因表达***构建【作者】邵敬伟[1]刘长江[1]吕淑霞[2]吴志香[3]【机构】[1]沈阳农业大学食品学院，[2]沈阳农业大学生物技术学院，[3]辽宁中医学院附属医院，【刊名】生物技术通讯.2004，15(1).-13-16【文摘】采用PCR方法从肺炎克雷伯氏杆菌基因组中分别扩增得到了编码依赖辅酶B12的甘油脱水酶α、β、γ三个亚基的基因gldA、gldB、gld将gldBC基因克隆至pSIM-T载体上，经测序正确后亚克隆至pGEX-4T-1载体中。将gldA进行T-A克隆后测定核苷酸序列正确，亚克隆至连有gldBC基因的pGEX-4T-1载体中。从而成功的构建了gldABC基因的同向串联原核融合表达载体pGEX-gldABC。

13、【题名】MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建【作者】邵敬伟[1]刘长江[1]陈永胜[1]叶秀秀[2]【机构】[1]沈阳农业大学食品学院，[2]浙江大学生命科学学院，【刊名】生物技术.2003，13(6).-1-3【文摘】目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌，方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC，分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中，经测序正确后，再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上，构建成表达质粒pMAL-gldABC，并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中，结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体，为研究甘油脱水酶基因(gldABC)的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。

上述有的文献是本发明人的前期研究，公开了选用克雷伯氏菌，培养并分离得到编码甘油脱水酶基因，并将其克隆至表达载体中，然后导入大肠杆菌中生产1，3-丙二醇，但这些文献介绍的研究还存在一些问题，如仅仅是对克雷伯氏菌脱水酶酶学性质和在大肠杆菌中表达的研究，而没有对其它可能具有更高酶活性和更有利用前途的甘油脱水酶的研究。

发明内容

本发明人在分析上百种微生物的基因组时，发现可以用生物信息学的方法在一系列未注释的脱氧核糖核酸中发现非常有用的信息。结合基因的克隆和异源基因表达技术，以及通过对表达的蛋白质进行特性特征鉴定，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或推测是蛋白质”的极为有用基因，其中包括至今为止人们并未发现的甘油脱水酶基因，并把这种脱水酶基因经过克隆到大肠杆菌中表达，在宿主中表达出酶活很高的甘油脱水酶，使基因工程菌能以甘油、葡萄糖等碳源发酵得到1，3-丙二醇，是一种有利用前途的甘油脱水酶基因。

本发明的方法与现有技术类似，首先是选择可以分离出具有甘油脱水酶的菌种，并扩大培养菌种，从该菌克隆出甘油脱水酶基因，将甘油脱水酶基因及其它相关基因在大肠杆菌中表达，然后再以碳源为底物发酵生产1，3-丙二醇。

本发明所述的选择可以分离出甘油脱水酶的菌种是产气荚膜梭菌(clostridium perfringensCVCC 2015)，该菌种可以从微生物菌种保藏中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。

本发明所述的甘油脱水酶生产1，3-丙二醇代谢工程菌的构建，是先克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌例如BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脱水基因转化到上述工程菌进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

本发明所述的从产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)克隆出甘油脱水酶基因的方法是：设计以下引物：

1、正向引物(Sense primer)：

5’-ACTCATATGAAATCTAAAAGATTCCAAGTAT-3’

2、反向引物(Antisense Primer)：

5’-ATAGGATCC TTACTCTTCTATTCTTAATTTATTT-3’

然后用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组里获得目的基因，然后用的专用试剂盒对PCR产物进行初步纯化。首先94℃2分钟；然后按以下条件进行30个循环：94℃30秒，56℃30秒，72℃2分30秒；最后72℃10min。市售的PCR产物纯化试剂盒都可以用于纯化，如Takara，Promega，Invitrogen等公司的专用试剂盒都可以用于PCR产物的纯化。纯化后用NdeI和BamHI限制性内切酶对PCR产物进行双酶切，再与同样用NdeI和BamHI双酶切过的pET22b⁺质粒连接，获得表达质粒pET22b-dhaB。

产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)分离得到的甘油脱水酶具有以下特征：

1、有大、中、小三个亚基，分子量分别为：61.0kD，20.9kD，16.3kD。

2、大、中、小三个亚基的等电点分别为：4.72，6.67，5.11。

3、酶的最适反应温度为35～50℃，优选40～45℃。

4、酶的反应的pH是8.0～10.0，优选pH9.0～9.5。

5、当辅酶B₁₂不存在下，该酶没有活力。

6、加入辅酶B₁₂后，该酶在有氧气或在甘油存在的情况，活性急剧下降。

本发明所述的将甘油脱水酶基因及其它相关基因在大肠杆菌中表达的方法为：

将甘油脱水酶基因(dhaB)在大肠杆菌中表达的工艺是：制备大肠杆菌的感受态细胞，然后用重组质粒pET22b-dhaB转化感受态细胞，得重组大肠杆菌pET22b-dhaB.

按《分子克隆：实验室手册》(1989年第二版)所述的方法，制备大肠杆菌的感受态细胞，然后用pET22b⁺-dhaB转化感受态细胞，于32-38℃培养10～20小时，挑出单菌落接入含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，32-38℃、220rpm/min条件下振荡培养10-20小时，取培养物200μl接入20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，32-38℃、220rpm/min条件下振荡培养直到OD值为0.4～0.6，然后加入IPTG至终浓度为1mM，再继续于32-38℃培养10～20小时。离心收集菌体后，即可进行蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和酶活的测定。

在可使甘油脱水酶基因表达的条件下培养该重组菌，把细胞破碎后用1，2-丙二醇做底物，在添加辅酶B12的条件下，用紫外分光光度计测定甘油脱水酶的酶活性，证明该重组菌具有甘油脱水酶活性。

本发明所述的产气荚膜梭菌甘油脱水酶核苷酸序列SEQ ID NO.1。甘油脱水酶基因全长2687bp，通过对这个序列的分析显示，存在大小分别为1662bp、570bp和423bp三个读码框；这个基因和其它菌的相应基因比较，其最高相似性低于74％。根据核苷酸序列SEQ ID NO1，推测产气荚膜梭菌甘油脱水酶蛋白含有三个不同的亚基，分为大亚基、中亚基、小亚基。大亚基由554个氨基酸组成，分子量为60,960Da；中亚基由190个氨基酸组成，分子量为20,859Da；小亚基由141个氨基酸组成，分子量为16,282Da，其氨基酸序列分别见SEQ ID NO2、SEQ IDNO3和SEQ ID NO4。通过对本发明涉及的甘油脱水酶基因推导的氨基酸序列与其它菌的甘油脱水酶氨基酸序列进行对比分析，结果表明菌株CVCC 2015的甘油脱水酶属于依赖辅酶B12的脱水酶家族的一员，与其它报道的甘油脱水酶的氨基酸序列相比，其相同性小于80％。

编码本发明所述的甘油脱水酶基因，以前功能未确定的DNA片段，长度为2687个碱基对，其中包含3个ORF分别编码三个亚基，氨基酸。基因的碱基组成是：

  1  GTGAAATCTA AAAGATTCCA AGTATTATCA GAACGTCCTG TAAACCAAGA

 51  TGGACTTATA GGAGAGTGGG CTGATGAAGG CTTAATAGCT TTAGATAGTC

101  CAAATGATCC AAAATCATCA ATAAAAATAG AAAATGGAAT AATTACTGAA

151  TTAGACGGCA GATCAAGAGA TGAGTTTGAT ATGATAGATA AATTTATAGC

201  AGAGTACGCT ATAAATATAG AAGACGCAGA AGCATCTATG AAACTTTCAT

251  CTAAAGAAAT AGCAAGAAGA TTAGTTGATA TAAATGTTAG TAGAGATGAA

301  ATAGTAAAAA TCACTACTTC AATAACACCA ATGAAGGCTG TAGAAGTTAT

351  TCAAGAAATG AACGTTGTTG AAATGATGAT GGCTCTTCAA AAAATGAGAG

401  CAAGAAGAAC ACCTGCTAAC CAATGTCACG TTACTAACGT AAAAGACAAC

451  CCAGTTCAAA TAGCAGCAGA TGCTGCAGAG GCTGCTTTAA GAGGATTCGC

501  AGAGCAAGAA ACTACAGTAG GTATAGTTAG ATATGCACCT TTTAATGCAT

551  TAGCTATCTT AGTAGGTTCA CAAGTAGGTA GAGGAGGAGT TTTAACTCAA

 601  TGTGCAGTTG AGGAAGCTAC TGAACTTGAC CTAGGAATGA GAGGACTTAC

 651  AAGTTATGCA GAAACAGTTT CAGTTTATGG AACAGAATCA GTATTTACAG

 701  ATGGAGATGA TACTCCATGG TCAAAAGCAT TCTTAGCATC AGCTTATGCT

 751  TCAAGAGGAC TTAAGATGAG ATTTACATCA GGTTCAGGTT CAGAAGCATT

 801  AATGGGATAC TCAGAAGGTA GATCAATGCT TTACTTAGAA TCAAGATGTA

 851  TATATATAAC TAAGGGAGCT GGAGTTCAAG GATTACAAAA TGGTGCAGTT

 901  AGTTGTATAG GTATGACAGG AGCAGTTCCA TCAGGAATAA GAGCAGTTCT

 951  TGGAGAAAAC TTAATAGCTG CAATGCTTGA TATAGAGGTT GCATCAGCAA

1001  ATGACCAAAC ATTCTCACAC TCAGACATAA GAAGAACAGC AAGAATGTTA

1051  ATGCAAATGC TTCCAGGAAC AGACTTCATA TTCTCAGGAT ATAGTGCAGT

1101  TCCAAACTAC GATAACATGT TTGCTGGATC AAACTTTGAT GCAGAAGACT

1151  TTGATGATTA CAACATACTT CAAAGAGACT TAAAAGTTGA CGGTGGATTA

1201  AGACCAGTTA CAGAAGAAGA AACTATAAAG GTTAGAAATA AAGCTGCTAA

1251  ATGCATACAA ATAATCTTTA GAGAATTAGG ATTCCCAGAA GTTACTGATG

1301  AAGAAGTAGA AGCTGCAACT TACTGTCACG GAAGTAAGGA AATGCCAAAC

1351  AGAAATGTAG TTGAAGATTT AAAGGCTGCA GAAGAAATGT TAGAAAGAAG

1401  AATAACAGGA TTAGATATAA TAAAAGCTTT AAGCAAAAAT GGTATGGAAG

1451  ATATAGCAAA CAACTTATTA AACATGCTTA AGCAAAGAGT TACTGGAGAT

1501  TATCTTCAAA CTTCAGCAAT TTTAGATAAA GATTTCAATG TTATAAGTGC

1551  TGTTAATGAT GTAAATGACT ATATGGGACC TGGAACAGGA TATAGACTAG

1601  ATGGTCAAAG ATGGGAAGAA ATCAAAAAAG TTCCTACAGT AATGAGACCA

1651  GAGGATATAG AGTAGGGGGA GAATGACAAT GGAAGAAAGA ACTTTTATAC

1701  CAGAAATAAC AGTTGAAGAA GTTGGAGAAG CTAAGGTTGG TTTAAGATCA

1751  GATGAAGTTG TTATAGGATT AGCACCTGCA TTTTTAAAAT ATCAAAATAA

1801  AACAATAGTA GATGTTCCTC ATACTGAAAC TTTACTTGAA ATTATAGCAG

1851  GTATTGAAGA AGAAGGATTA CATGCAAGAG TAGTTAGAAT TTTAAGAACA

1901  TCTGATGTAT CTTTTATAGC TCATGATGCA GCTTGTTTAA GTGGATCAGG

1951  AATAGGTATA GGAATACAAT CAAAAGGTAC TACAGTAATA CATCAAAAAG

2001  ATTTATTACC ATTAAATAAC TTAGAATTAT TCTCACAAGC TCCGCTTTTA

2051  ACTACAGAAA CATATAGATT AATCGGAAAA AATGCTGCTA AATATGCTAA

2101  AGGTGAGTCA CCAACACCAG TACCAGTAAA AAATGACCAA ATGGTTAGAC

2151  CTAAATTCAT GGCAAAGGCA GCTTTATTAC ACATAAAAGA AACTAAACAC

2201  GTTGAACCAG GTAAAAAGCC AGTTCAATTA GAAGTTAAGT TTTAATTTAG

2251  AAAGGATTGA AATCATGGAA AATAAGAGAA TGACTGCTGC AGATTATCCT

2301  TTAACTTCTA AGAGAAAAGG AGATATAAAA ACTCCTACAG GAAAAGCTTT

2351  AGAAGATATA ACTTTAGAAA AAGTTTTAAG TGGAGAAATC AATGCAGATG

2401  ATATAAGAAT TTCACCAGAA ACTTTAGAAA TGCAAGCTCA AATAGCTGAA

2451  AGCATGAACA GAGATGCTAT AGCTAGAAAC TTTAGAAGAG CTGCGGAGCT

2501  TATAAGAGTT CCAGACGATA GAATATTAGA GATGTACAAT GCTTTAAGAC

2551  CATATCGTTC AACAAAAGAA GATTTATTCA AAATAGCTGA TGAACTTGAA

2601  ACAAAATATG ATGCTAAAGT TAATGCTGAT TTTGTTAGAG AAGCAGCTGA

2651  AGTATATGAA ACTAGAAATA AATTAAGAAT AGAAGAG

编码本发明所述的甘油脱水酶的氨基酸序列

第一个亚基为554个氨基酸

  1  VKSKRFQVLS ERPVNQDGLI GEWADEGLIA LDSPNDPKSS IKIENGIITE

 51  LDGRSRDEFD MIDKFIAEYA INIEDAEASM KLSSKEIARR LVDINVSRDE

101  IVKITTSITP MKAVEVIQEM NVVEMMMALQ KMRARRTPAN QCHVTNVKDN

151  PVQIAADAAE AALRGFAEQE TTVGIVRYAP FNALAILVGS QVGRGGVLTQ

201  CAVEEATELD LGMRGLTSYA ETVSVYGTES VFTDGDDTPW SKAFLASAYA

251  SRGLKMRFTS GSGSEALMGY SEGRSMLYLE SRCIYITKGA GVQGLQNGAV

301  SCIGMTGAVP SGIRAVLGEN LIAAMLDIEV ASANDQTFSH SDIRRTARML

351  MQMLPGTDFI FSGYSAVPNY DNMFAGSNFD AEDFDDYNIL QRDLKVDGGL

401  RpVTEEETIK VRNKAAKCIQ IIFRELGFPE VTDEEVEAAT YCHGSKEMPN

451  RNVVEDLKAA EEMLERRITG LDIIKALSKN GMEDIANNLL NMLKQRVTGD

501  YLQTSAILDK DFNVISAVND VNDYMGPGTG YRLDGQRWEE IKKVPTVMRP

551  EDIE

第二个亚基为190个氨基酸

  1  MTMEERTFIP EITVEEVGEA KVGLRSDEVV IGLAPAFLKY QNKTIVDVPH

 51  TETLLEIIAG IEEEGLHARV VRILRTSDVS FIAHDAACLS GSGIGIGIQS

101  KGTTVIHQKD LLPLNNLELF SQAPLLTTET YRLIGKNAAK YAKGESPTPV

151  PVKNDQMVRP KFMAKAALLH IKETKHVEPG KKPVQLEVKF

第三个亚基为141个氨基酸

  1  MENKRMTAAD YPLTSKRKGD IKTPTGKALE DITLEKVLSG EINADDIRIS

 51  PETLEMQAQI AESMNRDAIA RNFRRAAELI RVPDDRILEM YNALRPYRST

101  KEDLFKIADE LETKYDAKVN ADFVREAAEV YETRNKLRIE E

本发明所述工程菌发酵的碳源是淀粉水解得到的葡萄糖或甘油，所述的淀粉包括稻米淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉或者其它谷类和薯类淀粉。

本发明所述的发酵生产1，3-丙二醇的方法是：

以淀粉水解成葡萄糖或甘油等碳源为出发原料，进行发酵生产1，3-丙二醇，首先将碳源用水稀释后加入到LB液体培养基中使糖的终浓度为1％，然后接种含有甘油脱水酶的1，3-丙二醇的代谢工程菌，在35℃，200rpm，通风量为0.9vvm的条件下发酵培养，8小时后开始流加葡萄糖，并通过流加氨水和柠檬酸来保持pH的稳定。连续发酵32-40小时后用高效液相来分析发酵液中的葡萄糖和1，3-丙二醇的含量，当发酵液中葡萄糖量不再减少及1，3-丙二醇的量不再增加时停止发酵。

如果是淀粉，需要经α-淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成的葡萄糖，将获得的葡葡萄糖作为碳源加入培养基使糖的终浓度为1％，然后进行上述含有甘油脱水酶的1，3-丙二醇的代谢工程菌发酵。

本发明与现有技术相比，具有的实质性特点和显著的进步是：

1、有大、中、小三个亚基，分子量分别为：61.0kD，20.9kD，16.3kD。

2、大、中、小三个亚基的等电点分别为：4.72，6.67，5.11。

3、酶的最适反应温度为35～50℃，优选40～45℃。工业化生产中可节省能源。

4、酶的反应的pH是8.0～10.0，优选pH9.0～9.5。

5、当辅酶B₁₂不存在情况下，该酶没有活力。

6、在厌氧的条件下能将甘油转化成3-羟基丙醛。

7、纯化的酶在体外保存30天，活力几乎不损失。

本发明的甘油脱水酶基因制备1，3-丙二醇的方法，包括以下工艺步骤：

克隆酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并分别在大肠杆菌菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把从产气荚膜梭菌得到的甘油脱水酶基因转化到上述工程菌进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

本发明利用甘油脱水酶基因构建的工程菌来制备1，3丙二醇的方法，用木薯淀粉制造1，3-丙二醇的工艺是：以淀粉浆的水解物为原料，先加去离子水兑成含30％的溶液，然后用于工程菌发酵过程中流加，在32-38℃，pH 6-7的条件下发酵32-40个小时，同时流加氨水和柠檬酸维持pH的稳定，发酵液用高效液相进行测定其1，3-丙二醇含量不再增加后停止发酵，即可得到1，3-丙二醇。

本发明利用甘油脱水酶基因构建的工程菌来制备1，3丙二醇的方法，以葡萄糖为出发原料，以1％的葡萄糖为底物进行发酵生产1，3-丙二醇，在32-38℃，pH 6-7的条件下发酵32-40个小时，发酵液用高效液相进行测定其1，3-丙二醇含量不再增加后停止发酵，即可得到1，3-丙二醇。

本发明利用甘油脱水酶基因构建的工程菌来制备1，3丙二醇的方法，以甘油为出发原料，以1％的甘油为底物进行发酵生产1，3-丙二醇，在32-38℃，pH 6-7的条件下发酵32-40个小时，发酵液用高效液相进行测定其1，3-丙二醇含量不再增加后停止发酵，即可得到1，3-丙二醇。

具体实施方式

以下是本发明的实验和实例，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并未在本专利说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求保护范围。

实施例1

一、产气荚膜梭菌基因组DNA的提取

采用产气荚膜梭菌CVCC 2015(购于中国中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，接种产气荚膜梭菌在20ml疱肉培养基中，置于厌氧培养箱里37℃培养过夜。取1.5ml培养物离心2min，于沉淀物中加入567μl的TE缓冲液和20μl(100mg/ml)溶菌酶，重悬混匀后于37℃放置2小时；之后加入30μl10％的SDS和3μl20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时。然后加入100μl5mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80μlCTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10分钟。该溶液用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，然后再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清用0.6倍体积的异丙醇沉淀，收DNA，70％乙醇洗涤2次，沉淀溶于100μl TE缓冲液中。

二、甘油脱水酶基因的克隆

设计以下引物：

1、正向引物(Sense primer)：

5’-ACTCATATGAAATCTAAAAGATTCCAAGTAT-3’

2、反向引物(Antisense Primer)：

5’-ATAGGATCC TTACTCTTCTATTCTTAATTTATTT-3’

然后按PCR Cloning Protocols中所讲的步骤进行：首先94℃2分钟；然后按以下条件进行30个循环：94℃30秒，56℃30秒，72℃2分30秒；最后72℃10min。

用Takara的专用试剂盒对PCR产物进行初步纯化，然后用NdeI和BamHI对PCR产物进行双酶切，再与同样用NdeI和BamHI酶切过的pET22b⁺质粒连接，获得重组质粒pET22b⁺-dhaB。

三、甘油脱水酶基因(dhaB)在大肠杆菌中的表达

重组质粒pET22b⁺-dhaB构建完毕，先转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，大量制备pET22b⁺-dhaB表达质粒，所得质粒可用一部分用于DNA测序以确认读码框的正确性，另一部分则可以用来进行甘油脱水酶基因表达试验。

按《分子克隆：实验室手册》(1989年第二版)所述的方法，制备大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，然后用pET22b⁺-dhaB转化BL21(DE3)感受态细胞，于32-38℃培养10～20小时，挑出单菌落接入含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，32-38℃、220rpm/min条件下振荡培养10-20小时，取培养物200μl接入20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，32-38℃、220rpm/min条件下振荡培养直到OD值为0.4～0.6，然后加入IPTG至终浓度为1mM，再继续于32-38℃培养10～20小时。离心收集菌体后，即可进行蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和酶活的测定。

四、生产1，3-丙二醇代谢工程菌的构建

(1)克隆到酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌。(2)把克隆得到的甘油脱水基因转化到上述工程菌进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

五、利用工程发酵葡萄糖生产1，3-丙二醇

实施例1

将获得的工程菌单菌落接种到5ml含有氨苄青霉素50μg/mlLB液体培养基中，在30℃培养12小时，然后接种到1升的下述培养基中：氨苄青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L。在30℃培养13小时，然后按4％的接种量种子接种到含20升下述发酵培养基的30升发酵罐中，每升发酵培养基含有：氨苄青霉素50mg，K₂HPO₄g/L7克，柠檬酸2克，7水硫酸镁2克，98％的硫酸2ml，柠檬酸铁铵，乳糖4克，葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠20g/L，用氨水调节pH为6.7。在35℃，200rpm，通风量为0.9vvm的条件下发酵培养，8小时后开始流加葡萄糖，并通过流加氨水和柠檬酸来保持pH的稳定。连续发酵32-40小时后用高效液相来分析发酵液中的葡萄糖和1，3-丙二醇的含量，当发酵液中葡萄糖量不再减少及1，3-丙二醇的量不再增加时停止发酵。经HPLC检测，工程菌发酵32-40小时后消耗葡萄糖约2.5kg，1，3-丙二醇的产量可以达到25～30克/每升发酵液，共得到约500克1，3-丙二醇，转化效率约为20％。

实施例2

以甘油为出发原料，进行发酵生产1，3-丙二醇，在实施例1中的培养基中添加甘油浓度为1％，在35℃，200rpm，通风量为0.9vvm的条件下发酵培养，8小时后开始流加甘油，并通过流加氨水和柠檬酸来保持pH稳定在6-7。连续发酵32-40小时后用高效液相来分析发酵液中的甘油和1，3-丙二醇的含量，当发酵液中甘油量不再减少及1，3-丙二醇的量不再增加时停止发酵。经HPLC检测，工程菌发酵32-40小时后消耗甘油约1.5kg，1，3-丙二醇的产量可以达到30～35克/每升发酵液，共得到约600克1，3-丙二醇，转化效率约为40％。

实施例3

以淀粉为出发原料，经α-淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成的葡萄糖，将获得的葡葡萄糖按实例1进行发酵生产1，3-丙二醇，实验表明每3公斤淀粉经α淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成葡萄糖用于工程菌的发酵，在32-38℃，pH 6-7的条件下发酵32-40个小时，可以得到约500克的1，3-丙二醇。除去淀粉中水份和杂质，转化效率和直接用葡萄糖做底物的转化效率相同。

Claims (6)

1.一种甘油脱水酶基因，其特征在于：该甘油脱水酶基因是产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)中获得，核苷酸序列包含在SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列中，其基因的DNA序列和氨基酸序列如下所示：

产气荚膜梭菌甘油脱水酶基因的DNA序列：

1    GTGAAATCTA AAAGATTCCA AGTATTATCA GAACGTCCTG TAAACCAAGA

51   TGGACTTATA GGAGAGTGGG CTGATGAAGG CTTAATAGCT TTAGATAGTC

101  CAAATGATCC AAAATCATCA ATAAAAATAG AAAATGGAAT AATTACTGAA

151  TTAGACGGCA GATCAAGAGA TGAGTTTGAT ATGATAGATA AATTTATAGC

201  AGAGTACGCT ATAAATATAG AAGACGCAGA AGCATCTATG AAACTTTCAT

251  CTAAAGAAAT AGCAAGAAGA TTAGTTGATA TAAATGTTAG TAGAGATGAA

301  ATAGTAAAAA TCACTACTTC AATAACACCA ATGAAGGCTG TAGAAGTTAT

351  TCAAGAAATG AACGTTGTTG AAATGATGAT GGCTCTTCAA AAAATGAGAG

401  CAAGAAGAAC ACCTGCTAAC CAATGTCACG TTACTAACGT AAAAGACAAC

451  CCAGTTCAAA TAGCAGCAGA TGCTGCAGAG GCTGCTTTAA GAGGATTCGC

501  AGAGCAAGAA ACTACAGTAG GTATAGTTAG ATATGCACCT TTTAATGCAT

551  TAGCTATCTT AGTAGGTTCA CAAGTAGGTA GAGGAGGAGT TTTAACTCAA

601  TGTGCAGTTG AGGAAGCTAC TGAACTTGAC CTAGGAATGA GAGGACTTAC

651  AAGTTATGCA GAAACAGTTT CAGTTTATGG AACAGAATCA GTATTTACAG

701  ATGGAGATGA TACTCCATGG TCAAAAGCAT TCTTAGCATC AGCTTATGCT

751  TCAAGAGGAC TTAAGATGAG ATTTACATCA GGTTCAGGTT CAGAAGCATT

801  AATGGGATAC TCAGAAGGTA GATCAATGCT TTACTTAGAA TCAAGATGTA

851  TATATATAAC TAAGGGAGCT GGAGTTCAAG GATTACAAAA TGGTGCAGTT

901  AGTTGTATAG GTATGACAGG AGCAGTTCCA TCAGGAATAA GAGCAGTTCT

951  TGGAGAAAAC TTAATAGCTG CAATGCTTGA TATAGAGGTT GCATCAGCAA

1001 ATGACCAAAC ATTCTCACAC TCAGACATAA GAAGAACAGC AAGAATGTTA

1051 ATGCAAATGC TTCCAGGAAC AGACTTCATA TTCTCAGGAT ATAGTGCAGT

1101 TCCAAACTAC GATAACATGT TTGCTGGATC AAACTTTGAT GCAGAAGACT

1151 TTGATGATTA CAACATACTT CAAAGAGACT TAAAAGTTGA CGGTGGATTA

1201 AGACCAGTTA CAGAAGAAGA AACTATAAAG GTTAGAAATA AAGCTGCTAA

1251 ATGCATACAA ATAATCTTTA GAGAATTAGG ATTCCCAGAA GTTACTGATG

1301 AAGAAGTAGA AGCTGCAACT TACTGTCACG GAAGTAAGGA AATGCCAAAC

1351 AGAAATGTAG TTGAAGATTT AAAGGCTGCA GAAGAAATGT TAGAAAGAAG

1401 AATAACAGGA TTAGATATAA TAAAAGCTTT AAGCAAAAAT GGTATGGAAG

1451 ATATAGCAAA CAACTTATTA AACATGCTTA AGCAAAGAGT TACTGGAGAT

1501 TATCTTCAAA CTTCAGCAAT TTTAGATAAA GATTTCAATG TTATAAGTGC

1551 TGTTAATGAT GTAAATGACT ATATGGGACC TGGAACAGGA TATAGACTAG

1601 ATGGTCAAAG ATGGGAAGAA ATCAAAAAAG TTCCTACAGT AATGAGACCA

1651 GAGGATATAG AGTAGGGGGA GAATGACAAT GGAAGAAAGA ACTTTTATAC

1701 CAGAAATAAC AGTTGAAGAA GTTGGAGAAG CTAAGGTTGG TTTAAGATCA

1751 GATGAAGTTG TTATAGGATT AGCACCTGCA TTTTTAAAAT ATCAAAATAA

1801 AACAATAGTA GATGTTCCTC ATACTGAAAC TTTACTTGAA ATTATAGCAG

1851 GTATTGAAGA AGAAGGATTA CATGCAAGAG TAGTTAGAAT TTTAAGAACA

1901 TCTGATGTAT CTTTTATAGC TCATGATGCA GCTTGTTTAA GTGGATCAGG

1951 AATAGGTATA GGAATACAAT CAAAAGGTAC TACAGTAATA CATCAAAAAG

2001 ATTTATTACC ATTAAATAAC TTAGAATTAT TCTCACAAGC TCCGCTTTTA

2051 ACTACAGAAA CATATAGATT AATCGGAAAA AATGCTGCTA AATATGCTAA

2101 AGGTGAGTCA CCAACACCAG TACCAGTAAA AAATGACCAA ATGGTTAGAC

2151 CTAAATTCAT GGCAAAGGCA GCTTTATTAC ACATAAAAGA AACTAAACAC

2201 GTTGAACCAG GTAAAAAGCC AGTTCAATTA GAAGTTAAGT TTTAATTTAG

2251 AAAGGATTGA AATCATGGAA AATAAGAGAA TGACTGCTGC AGATTATCCT

2301 TTAACTTCTA AGAGAAAAGG AGATATAAAA ACTCCTACAG GAAAAGCTTT

2351 AGAAGATATA ACTTTAGAAA AAGTTTTAAG TGGAGAAATC AATGCAGATG

2401 ATATAAGAAT TTCACCAGAA ACTTTAGAAA TGCAAGCTCA AATAGCTGAA

2451 AGCATGAACA GAGATGCTAT AGCTAGAAAC TTTAGAAGAG CTGCGGAGCT

2501 TATAAGAGTT CCAGACGATA GAATATTAGA GATGTACAAT GCTTTAAGAC

2551 CATATCGTTC AACAAAAGAA GATTTATTCA AAATAGCTGA TGAACTTGAA

2601 ACAAAATATG ATGCTAAAGT TAATGCTGAT TTTGTTAGAG AAGCAGCTGA

2651 AGTATATGAA ACTAGAAATA AATTAAGAAT AGAAGAG

产气荚膜梭菌甘油脱水酶的氨基酸序列：

第一个亚基为554个氨基酸

VKSKRFQVLS ERPVNQDGLI GEWADEGLIA LDSPNDPKSS IKIENGIITE

LDGRSRDEFD MIDKFIAEYA INIEDAEASM KLSSKEIARR LVDINVSRDE

IVKITTSITP MKAVEVIQEM NVVEMMMALQ KMRARRTPAN QCHVTNVKDN

PVQIAADAAE AALRGFAEQE TTVGIVRYAP FNALAILVGS QVGRGGVLTQ

CAVEEATELD LGMRGLTSYA ETVSVYGTES VFTDGDDTPW SKAFLASAYA

SRGLKMRFTS GSGSEALMGY SEGRSMLYLE SRCIYITKGA GVQGLQNGAV

SCIGMTGAVP SGIRAVLGEN LIAAMLDIEV ASANDQTFSH SDIRRTARML

MQMLPGTDFI FSGYSAVPNY DNMFAGSNFD AEDFDDYNIL QRDLKVDGGL

RPVTEEETIK VRNKAAKCIQ IIFRELGFPE VTDEEVEAAT YCHGSKEMPN

RNVVEDLKAA EEMLERRITG LDIIKALSKN GMEDIANNLL NMLKQRVTGD

YLQTSAILDK DFNVISAVND VNDYMGPGTG YRLDGQRWEE IKKVPTVMRP

EDIE

第二个亚基为190个氨基酸

MTMEERTFIP EITVEEVGEA KVGLRSDEVV IGLAPAFLKY QNKTIVDVPH

TETLLEIIAG IEEEGLHARV VRILRTSDVS FIAHDAACLS GSGIGIGIQS

KGTTVIHQKD LLPLNNLELF SQAPLLTTET YRLIGKNAAK YAKGESPTPV

PVKNDQMVRP KFMAKAALLH IKETKHVEPG KKPVQLEVKF

第三个亚基为141个氨基酸

MENKRMTAAD YPLTSKRKGD IKTPTGKALE DITLEKVLSG EINADDIRIS

PETLEMQAQI AESMNRDAIA RNFRRAAELI RVPDDRILEM YNALRPYRST

KEDLFKIADE LETKYDAKVN ADFVREAAEV YETRNKLRIE E。

2.如权利要求1所述的甘油脱水酶基因所编码的甘油脱水酶，其特征在于：三个亚基，分子量分别为：61.0kD，20.9kD，16.3kD，三个亚基的等电点分别为：4.72，6.67，5.11，酶的最适反应温度为35～50℃，反应的pH是8.0～10.0，当辅酶B12不存在时，该酶没有活力，在厌氧的条件下能将甘油转化成3-羟基丙醛，纯化的酶在体外保存30天，活力几乎不损失。

3.生产1，3-丙二醇代谢工程菌的构建方法，其特征在于：克隆酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并分别在大肠杆菌菌株中进行高效表达；构建得到能转化葡萄糖生产甘油的工程菌，把如权利要求1所述的甘油脱水酶基因转化到上述工程菌进行多个基因共表达，获得生产1，3-丙二醇的代谢工程菌。

4.利用权利要求3所述方法构建的工程菌来制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于：用木薯淀粉制造1，3-丙二醇的工艺是：以淀粉浆的水解物为原料，先加去离子水兑成含30％的溶液，然后用于工程菌发酵过程中流加，在32-38℃，pH 6-7的条件下发酵32-40个小时，同时流加氨水和柠檬酸维持pH的稳定，发酵液用高效液相进行测定其1，3-丙二醇含量不再增加后停止发酵，即可得到1，3-丙二醇。

5.利用权利要求3所述方法构建的工程菌来制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于：以葡萄糖为出发原料，以1％的葡萄糖为底物进行发酵生产1，3-丙二醇，在32-38℃，pH 6-7的条件下发酵32-40个小时，发酵液用高效液相进行测定其1，3-丙二醇含量不再增加后停止发酵，即可得到1，3-丙二醇。

6.利用权利要求3所述方法构建的工程菌来制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于：以甘油为出发原料，以1％的甘油为底物进行发酵生产1，3-丙二醇，在32-38℃，pH 6-7的条件下发酵32-40个小时，发酵液用高效液相进行测定其1，3-丙二醇含量不再增加后停止发酵，即可得到1，3-丙二醇。