MXPA05003382A - Proceso para la produccion biologica de 1,3-propanodiol con alto rendimiento. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un microorganismo util para la produccion biologica del 1,3-propanodiol a partir de una fuente de carbono fermentable, con un rendimiento mas alto que el que se conocia previamente. La complejidad de los requerimientos del cofactor necesita el uso de un catalizador de celula completa para un proceso industrial que utiliza esta secuencia de reaccion para producir 1,3-propanodiol. La invencion proporciona un microorganismo con desorganizaciones en genes especificos y alteraciones en los niveles de expresion de los genes especificados, que es util en un proceso de mas alto rendimiento para producir 1,3-propanodiol.

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCION BIOLOGICA DE 1,3- PROPANODIOL CON ALTO RENDIMIENTO CAMPO DE LA INVENCION Esta invención comprende un proceso para bioconversión de una fuente de carbono fermentable a 1,3-propanodiol por un microorganismo simple.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El 1 , 3 -propanodiol es un monómero que tiene utilidad potencial en la producción de fibras de poliéster y la fabricación de poliuretanos y compuestos cíclicos. Una variedad de rutas químicas para el 1,3-propanodiol . Por ejemplo, el óxido de etileno puede ser convertido a 1 , 3 -propanodiol sobre un catalizador en presencia de fosfina, agua, monóxido de carbono, hidrógeno y un ácido, mediante hidratación en fase de solución catalítica de la acroleína, seguida por reducción, o a partir de compuestos tales como glicerol, que reaccionan en presencia de monóxido de carbono e hidrógeno sobre catalizadores que tienen átomos del grupo VIII de la tabla periódica. Aunque es posible generar el 1 , 3 -propanodiol mediante estos métodos, éstos son caros y generan corrientes de desecho que contienen contaminantes ambientales. Ha sido conocido por más de un siglo que el 1,3- Ref: 162970 propanodiol puede ser producido a partir de la fermentación del glicerol . Han sido encontradas cepas bacterianas capaces de producir 1 , 3 -propanodiol , por ejemplo, en los grupos Ci trorjacter, Clostridiu , Enterobacter, Iliobacter, Klebsiella , Lactobacillus y Pelobacter. En cada caso estudiado, el glicerol es convertido a 1 , 3 -propanodiol en una secuencia de reacción catalizada por enzima, de dos pasos. En el primer paso, una deshidratasa cataliza la conversión del glicerol a 3 -hidroxipropionaldehído (3-HPA) y agua, Ecuación 1. En el segundo paso, el 3-HPA es reducido a 1 , 3 -propanodiol por una oxidorreductasa ligada al NAD+, Ecuación 2. El 1,3-propanodiol no es metabolizado posteriormente y, como un resultado , Glicerol->3-HPA+H20 (Ecuación 1) 3 -HPA+NADH+H+->1 , 3 -propanodiol +NAD (Ecuación 2) se acumula en el medio. La reacción completa consume un equivalente reductor en la forma de un cofactor, el dinucleótido de ß-nicotinamida-adenina reducido (NADH) , que se oxida al dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD+) . En Klebsiella pneumonía, Citrobacter freundii y Clostridium pasteurianu , los genes que codifican para las tres subunidades estructurales de la glicerol-deshidratasa (dhaBl-3 o dhaB, C y E) están localizadas adyacentes a un gen que codifica para una oxidorreductasa de 1 , 3 -propanodiol específica (dhaT) . Aunque la organización genética difiere algo entre estos m croorganismos , estos genes están agrupados en un grupo que también comprende orfX y orfZ (genes que codifican para un factor de reactivación de deshidratasa para la glicerol-deshidratasa) , así como orfY y orfW (genes de función desconocida) . Las 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasas específicas {dhaTs) de estos microorganismos se sabe que pertenecen a la familia de las alcohol -deshidrogenasas tipo III; cada una muestra una porción conservada de enlace al hierro y tiene una preferencia por la interconversión ligada a NAD+/NADH, del 1 , 3 -propanodiol y de 3-HPA. No obstante, la interconversión ligada a NAD+/NADH del 1 , 3 -propanodiol y del 3-HPA es también catalizada por las alcohol -deshidrogenasas que no son específicamente ligadas a las enzimas deshidratases (por ejemplo, las deshidrogenasas alcohólicas de hígado de caballo y de levadura para hornear (E.C. 1.1.1.1)), aunque con parámetros cinéticos menos eficientes. La glicerol-deshidratasa (E.C. 4.2.1.30) y la diol[l,2-propanodiol ] deshidratasa (E.C. 4.2.1.28) son enzimas relacionadas pero distintas que son codificadas por distintos genes. Los genes de la diol -deshidratasa provenientes de Klebsiella oxitoca y Salmonella typhimurium son similares a los genes de la glicerol-deshidratasa y están agrupados en un grupo que comprende genes análogos a orfX y orfZ (Daniel et al., FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999); Toraya y Morí, J. Biol. Chem. 274, 3372 (1999); GenBank AF02670) . La producción de 1 , 3 -propanodiol a partir de glicerol es en general realizada bajo condiciones anaeróbicas utilizando glicerol como la única fuente de carbono y en ausencia de aceptores equivalentes reductores, exógenos . Bajo estas condiciones, por ejemplo, en cepas de Ci robacter, Clostridiuw y Klebsiella, opera una vía paralela para el glicerol, la cual primeramente involucra la oxidación del glicerol a dihidroxiacetona (DHA) por una glicerol-deshidrogenasa ligada al NAD+- (o NADP+-), Ecuación 3. La DHA, después de la fosforilación a dihidroxiacetona- fosfato (DHAP) por una cinasa de DHA (Ecuación 4) , erol+NAD+->DHA+NADH+H (Ecuación 3) DHA+ATP->DHAP+ADP (Ecuación 4) se vuelve disponible para la biosíntesis y para el apoyo de la generación de ATP vía, por ejemplo, la glucólisis. En contraste, a la vía del 1 , 3 -propanodiol , esta vía puede proporcionar carbono y energía a la célula y produce más que consumir NADH . En Klebsiella pneu oniae y Citrobacter freundii , los genes que codifican para las actividades funcionalmente ligadas de la gl icerol -deshidratasa (dhaB) , 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa (dhaT) , gl icerol -deshidrogenasa {dhaD) , y dihidroxiacetona-cinasa (dhaK) son abarcadas por el reguión dha. El reguión dha, en Klebsiella pneumoníae y Citrobacter freundii , también abarca un gen que codifica para una proteína activadora transcripcional (dhaR) . Los regulones dha provenientes de Citrobacter y Klebsiella han sido expresados en Escherichia coli y han mostrado que convierten el glicerol a 1 , 3 -propanodiol . Ninguno de los métodos químicos ni biológicos descritos anteriormente para la producción del 1 , 3 -propanodiol son muy adecuados para la producción a escala industrial, ya que los procesos químicos consumen mucha energía y los procesos biológicos están limitados a un título relativamente bajo a partir del material inicial caro, el glicerol. Estos inconvenientes podrían ser preparados con un método que requiera bajo aporte de energía y un material inicial barato tales como carbohidratos o azúcares, o mediante el incremento de la eficiencia metabólica de un proceso de glicerol. El desarrollo de cualquier método requerirá la habilidad para manipular la maquinaria genética responsable de la conversión de azúcares a glicerol, y de glicerol al 1 , 3 -propanodiol . Los procesos biológicos para la preparación de glicerol son conocidos. La basta mayoría de los productores de glicerol son levaduras, pero son también conocidas algunas bacterias, otros hongos y algas. Las bacterias y las levaduras producen glicerol mediante la conversión de la glucosa u otros carbohidratos a través de la vía de fructosa-1 , 5-bisfosfato en la glicólisis o la vía de Embden eyerhof Parnas . El fosfato de dihidroxiacetona es convertido a glicerol-3-fosfato por la acción de la glicerol - 3 - fosfato-deshidrogenasa , y el glicerol -3 - fosfato es convertido a glicerol por la acción de la glicerol-3-fosfatasa. El gen que codifica para la gl icerol - 3 - fosfato-deshidrogenasa (DAR1, GPD1) ha sido clonado y secuenciado a partir de S. diastaticus (Wang et al., J. Bact. 176, 7091-7095 (1994)) . El gen DAR1 fue clonado en un vector lanzadera y utilizado para transformar E. coli donde la expresión produjo la enzima activa. Wang et al. (supra) reconoce que DAR1 es regulado por el ambiente osmótico celular, pero no sugiere cómo el gen puede ser utilizado para aumentar la producción de 1 , 3 -propanodiol en un microorganismo recombinante . Han sido aisladas otras enzimas gl icerol - 3 - fosfato-deshidrogenasa : por ejemplo, la sn-gl icerol - 3 - fosfato-deshidrogenasa ha sido clonada y secuenciada a partir de Saccharomyces cerevisiae (Larason et al., Mol. Microbiol. 10, 1101 (1993)) y Albertyn et al. {Mol. Cell. Bíol. 14, 4135 (1994)) enseñan la clonación de GPD1 que codifica para una glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa a partir de Saccharomyces cerevisiae. Como Wang et al. (supra), Albertyn et al. y Larason et al. reconocen la osmosensibilidad de la regulación de este gen, pero no sugieren cómo el gen puede ser utilizado en la producción de 1 , 3 -propanodiol en un microorganismo recombinante . Como con G3PDH, la gl icerol -3 - osfatasa ha sido aislada a partir de Saccharomyces cerevisiae y la proteína identificada como es codificada por los genes GPP1 y GPP2 (Norbeck et al., J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996)) . Como los genes que codifican para G3PDH, parece que GPP2 es osmosensible . W09634961 y Hernández -Montalvo et al. (Appl . Microbiol. Biotechnol. 57: 186-191 (2001) describen las cepas de E. coli que tienen los fenotipos "PTS" menos/glucosa más. La Patente Europea EP-1170376 Al describe la supresión de un gen para la NADH-deshidratasa II para mejorar la eficiencia de energía. El documento WO 2001016346 describe la utilidad de la "aldehído-deshidrogenasa A" y la "aldehído-deshidrogenasa B" para la producción de ácido 3 -hidroxipropiónico . WO 9635696 (Patente de los Estados Unidos No. 5,686,276, ?.?. du Pont de Nemours and Company ("DuPont")) describe un método para la producción de 1 , 3 -propanodiol a partir de un sustrato de carbono diferente de glicerol o la deshidroxiacetona (especialmente, por ejemplo, glucosa), utilizando un microorganismo simple que comprende una actividad de deshidratasa . El documento WO 9928480 (DuPont) describe un método similar con ventajas derivadas de expresar actividades endógenas de uno o ambos de la glicerol -3 - fosfato-deshidrogenasa y la glicerol -3 - fosfato- fosfatasa, al tiempo que perturba una o ambas de las actividades endógenas de la gl icerol -cinasa y la gl icerol -deshidrogenasa . El documento O 9821339 (Patente de los Estados Unidos No. 6,013,494, DuPont) describe un proceso para la producción de 1 , 3 -propanodiol utilizando un microorganismo simple que comprende glicerol -3-fosfato-deshidrogenasa exógena, glicerol-3 -fosfato- osfatasa , deshidratasa , y 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa (por ejemplo dhaT) . El documento WO 9821341 (Patente de los Estados Unidos No. 6,136,576, DuPont) describe un método para la producción de 1 , 3 -propanodiol que comprende un microorganismo recombinante , que incluye además una deshidratasa y proteína X (posteriormente identificada como un péptido del factor de reactivación de deshidratasa) . El documento WO 2001012833 (DuPont) describe un mejoramiento al proceso, donde es obtenido un incremento significativo en el título (gramos de producto por litro) en virtud de una actividad catalítica no específica (distinguida de la 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa codificada por dhaT) para convertir la 3-hidroxipropionaldehído a 1 , 3 -propanodiol . ?1 documento US 10/420587 (2003) (US 60/374931 (2002) DuPont)) describe los vectores y plásmidos útiles para la producción de 1,3-propanodiol. Las solicitudes de DuPont son incorporados por referencia en la presente especificación, como si describiera en su totalidad en la presente. La producción biológica de 1 , 3 -propanodiol requiere glicerol como un sustrato intermediario para una reacción secuencial de dos pasos en la cual una enzima deshidratasa (típicamente una deshidratasa dependiente de la coenzima B12) convierte el glicerol a 3 -hidroxipropionaldehído , el cual es luego reducido a 1 , 3 -propanodiol por una oxidorreductasa dependiente del NADH (o del NADPH) . La complejidad de los requerimientos del cofactor necesita el uso de un catalizador celular completo para un proceso industrial, que utiliza esta secuencia de reacción para la producción de 1 , 3 -propanodiol . Una deficiencia específica en los procesos biológicos conducentes para la producción de 1 , 3 -propanodiol a partir de glucosa, ha sido el bajo rendimiento del producto logrado vía la fermentación. El documento O 2001012833 (DuPont) describe los rendimientos en peso del 1 , 3 -propanodiol a partir de glucosa dentro del intervalo de 24% y 35%. El problema que queda por ser resuelto es cómo producir biológicamente el 1 , 3 -propanodiol , con alto rendimiento y por un microorganismo simple, a partir de un sustrato de carbono barato tal como glucosa u otros azúcares. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los solicitantes han resuelto el problema establecido. La presente invención proporciona la bioconversión de una fuente de carbono fermentable a 1,3-propanodiol con un rendimiento más alto que aquel previamente obtenido, y con el uso de un microorganismo simple. El rendimiento obtenido es mayor de 35%, y preferentemente mayor de 40%. La glucosa es utilizada como un sustrato modelo y se utiliza Escherichia coli como el microorganismo hospedero modelo con modificaciones genéticas útiles y las desintegraciones detalladas en la presente. Los solicitantes han proporcionado una cepa de E. coli que comprende: a) un sistema de fosfoenolpiruvato-glucosa-fosfotransferasa endógeno, desorganizado, que previene la expresión de las proteínas activas del sistema PEP-glucosa-fosfotransferasa ; b) un gen de galP endógeno, suprarregulado que codifica para la galactosa act iva-simportador de protones; c) un gen de glk endógeno, suprarregulado, que codifica para la glucocinasa activa; y d) un gen gapñ endógeno subregulado que codifica para la glicerolaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa activa. Los solicitantes han proporcionado también una cepa de E. coli descrita anteriormente en donde el sistema desorganizado de la fosfoenolpiruvato-glucosa- fosfotransferasa endógena comprende uno o más de : al) un gen ptsH endógeno, desorganizado, que previene la expresión de la proteína fosfoportadora activa; a2 ) un gen ptsl endógeno desorganizado, que previene la expresión de la fosfoenolpiruvato-proteína fosfotransferasa activa; y a3) un gen crr endógeno, desorganizado, que previene la expresión del componente IIA específico de la glucosa, activo. Las modalidades de E. coli descritas anteriormente pueden comprender además uno o más de: e) un gen arcA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la proteína activa del control de la respiración aeróbica; f) un gen ppc endógeno, suprarregulado, que codifica para la fosfoenolpiruvato-carboxilasa activa; g) un gen btuR endógeno, suprarregulado, que codifica para la cob ( I ) alamin-adenosiltransferasa activa; y h) un gen yqhD suprarregulado que codifica para la alcohol -deshidrogenasa activa. Las modalidades de E. coli descritas anteriormente pueden además comprender uno o más de: i) un gen de gsA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la metilglioxal - sintasa activa; j) un gen ackA endógeno, desorganizado, que previene la expresión de la acetato-cinasa activa; k) un gen pta endógeno, desorganizado, que previene la expresión de la fosfotransacetilasa activa; 1) un gen aldA endógeno, desorganizado, que previene la expresión de la aldehído-deshidrogenasa A activa; y m) un gen aldB endógeno, desorganizado, que previene la expresión de la aldehído-deshidrogenasa B activa. Las modalidades de E. coli descritas anteriormente pueden comprender además uno o más de : n) un gen edd endógeno desorganizado, que previene la expresión de la fosfogluconato-deshidratasa activa; o) un gen glpK endógeno desorganizado, que previene la expresión de la glicerol -cinasa activa; y p) un gen gldA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la glicerol -deshidrogenasa activa dependiente de NADH. Adicionalmente , el 1 , 3 -propanodiol puede ser bioproducido mediante el contacto de una cepa de E. coli descrita en la presente con un sustrato de carbono adecuado tal como glucosa bajo condiciones adecuadas para la fermentación. Además, la 1 , 3 -propanodiol puede ser bioproducida al poner en contacto una cepa de E. coli descrita en la presente, la cepa de E. coli comprende además un activo: ( i ) glicerol -3 -fosfato-deshidrogenasa; (ii) glicerol-3-fosfatasa; (iii) deshidratasa ; y (iv) actividad de reactivación de deshidratase; con un sustrato de carbono adecuado bajo condiciones adecuadas . Además, cualquiera de las modalidades descritas anteriormente puede también incluir las construcciones pSYCOlOl, pSYCO103, pSYCO106, pSYCO109 o sus secuencias nucleotídicas correspondientes SEQ ID NOs : 65, 66, 67 ó 68.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS, DESCRIPCIONES DE SECUENCIAS Y DEPOSITOS BIOLOGICOS La invención puede ser más completamente comprendida a partir de la siguiente descripción detallada, la Figura 1, el listado de secuencia anexo y las descripciones, y los depósitos biológicos que forman parte de esta solicitud. La Figura 1 muestra la producción 1 , 3 -propanodiol comparada entre dos fermentaciones corridas esencialmente como se describe en LOS METODOS GENERALES. En un caso, la cepa utilizada fue FMP ' : : Km/ SYCOl 03. En el otro caso, la cepa utilizada fue FMP/pSYCO103. Las 68 descripciones de secuencia y el listado de secuencias anexo a la presente, cumplen con las reglas que gobiernan las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos en las solicitudes de patente como se describen en 37 C.F.R. § 1.821-1.825 ("Requerimientos para Solicitudes de Patente que Contienen descripciones de Secuencias de Nucleótidos y/o Secuencias de Aminoácidos-las Regias de Secuencia") y será consistente con el Estándar ST2.5 (1998) de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) y los requerimientos del listado de secuencias del EPO y PCT í (Reglas 5.2 y 49.5(a-bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones Administrativas) . Las Descripciones de Secuencias contienen el código de una sola letra para los caracteres de secuencias de nucleótidos y los códigos de tres letras para los aminoácidos como se definen de conformidad con C ios estándares IUPAC-IYUB descritos en Nucleic Acids res. 13, 3021-3030 (1985) y en Biochemical Journal 219, 345-373 (1984) que son incorporadas por referencia en la presente. La SEQ ID NO: 1 es la secuencia parcial de nucleótidos de pLoxCat27 que codifica para el cásete loxPSll-5 Cat-2oxP511. Las SEQ ID NOs : 2-3 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la desorganización de arcA. Las SEQ ID NOs: 4-5 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la desorganización de arcA. 0 La SEQ ID NO: 6 es la secuencia parcial de nucleótidos de pLoxCatl que codifica para el cásete loxP-Cat- loxP. Las SEQ ID NOs: 7-8 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para construir pR6KgalP, el plásmido plantilla para 5 el reemplazo del promotor trc del promotor galP cromosomico.

Las SEQ ID NOs: 9-10 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para construir pRSKglk, el plásmido plantilla para el reemplazo del promotor trc del promotor glk cromosómico. La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos del rásete 1oxP- Cat- 1oxP-Trc . Las SEQ ID NOs : 12-13 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la integración de la SEQ ID NO: 11 para el reemplazo del promotor galP ,;romosómico . Las SEQ ID NOs : 14-15 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la integración de la SEQ ID NO: 11 para el reemplazo del promotor glk cromosómico . Las SEQ ID- NOs : 16-17 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para construir la desorganización edd. Las SEQ ID NOs : 18-19 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la desorganización de edd. La SEQ ID NO: 20 es la secuencia nucleotídica para el promotor trc seleccionado que controla la expresión de glk. La SEQ ID NO: 21 es la secuencia parcial de nucleótidos para el promotor trc estándar. Las SEQ ID NOs : 22-23 son los cebadores oligonucleotídicos utilizados para la amplificación de gapA. Las SEQ ID NOs : 24-25 son los cebadores oligonucleotídicos utilizados para alterar el codón de inicio de gapA a GTG. Las SEQ ID NOs : 26-27 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para alterar el codón de inicio de gapA a TTG. La SEQ ID NO: 28 es la secuencia nucleotídica para el promotor 1.5 GI corto, Las SEQ ID NOs : 29-30 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para el reemplazo del promotor gapA cromosomico con el promotor 1.5 GI corto. La SEQ ID NO: 31 es la secuencia nucleotídica para el promotor 1.20 GI corto. La SEQ ID NO: 32 es la secuencia nucleotídica para el promotor 1.6 GI corto. Las SEQ ID NOs : 33-34 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para el reemplazo del promotor gapA cromosomico con el promotor 1.20 GI corto. La SEQ ID NO: 35 es el cebador ol igonucleot ídico con la SEQ ID NO: 33 que se utiliza para el reemplazo del promotor gapA cromosomico con el promotor 1.6 GI corto. Las SEQ ID NOs : 36-37 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para construir la desorganización de mgsA.

Las SEQ ID NOs : 38-39 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la desorganización de mgsA. Las SEQ ID NOs : 40-41 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para el reemplazo del promotor ppc cromosómico con el promotor 1.6 GI corto. La SEQ ID NO: 42 es un cebador oligonucleotídico utilizado para confirmar el reemplazo del promotor ppc. Las SEQ ID NOs : 43-44 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para el reemplazo del promotor yciK-btuR cromosómico con el promotor 1.6 GI corto. Las SEQ ID NOs: 45-46 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para el reemplazo del promotor yciK-butR. Las SEQ ID NOs 47-48 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para el reemplazo del promotor yqhD cromosómico con el promotor 1.6 GI corto. La SEQ ID NO: 49 es un cebador oligonucleotídico utilizado para confirmar el reemplazo del promotor yqhD. Las SEQ ID NOs : 50-51 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para construir la desorganización de pta-ackA. Las SEQ ID NOs: 52-53 son cebadores oligonucleotídicos para confirmar la desorganización de pta-ackA.

Las SEQ ID NOs : 54-55 son cebadores oligonucleotídicos para construir la desorganización de ptsHlcrr. La SEQ ID NO: 56 es un cebador oligonucleotídico utilizado para confirmar la desorganización de ptsHlcrr. Las SEQ ID NOs : 57-58 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para construir la desorganización de aldA. Las SEQ ID NOs: 59-60 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la desorganización de aldA. Las SEQ ID NOs: 61-62 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para construir la desorganización aldB. Las SEQ ID NOs : 63-64 son cebadores oligonucleotídicos utilizados para confirmar la desorganización de aldB. La SEQ ID NO: 65 es la secuencia nucleotídica para el plásmido pSYCOlOl. La SEQ ID NO: 66 es la secuencia nucleotídica para el plásmido pSYC01C3. La SEQ ID NO: 67 es la secuencia nucleotídica para el plásmido pSYC01C6. La SEQ ID NO: 68 es la secuencia nucleotídica para el plásmido pSYCO109.

Los solicitantes han realizado los siguientes depósitos biológicos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patente .

Referencia de Identificación Designación Fecha del Del Depositante Internacional del Depósito Depositario E. coli y DH5a transformada ATCC 69789 18 abril 1995 que contiene una porción del genoma de lebsiella que codifica para la enzima glicerol-deshidratasa E. coli y DH5a transformada ATCC 69790 18 abril 1995 que contiene el cósmido pKP4 que contiene una porción del genoma de Klebsiella que codifica para una enzima diol-deshidratasa E. CO/ MSP33.6 ATCC 98598 25 Noviembre 1997 Mutante glpK de E. coli RJF lOm ATCC 98597 25 Noviembre 1 97 Escherichia coli: RJ8n ATCC PTA4216 9 Abril 2002 Escherichia coli: FMP' ::Km ATCC PTA-4732 28 Septiembre 2002 Los depósitos serán mantenidos en el depositario internacional indicado por al menos 30 años, y se pondrán a disposición del público después del otorgamiento de una patente que los describa. La disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental . Como se utiliza en la presente ATCC se refiere a la American Type Culture Collection (Colección Norteamericana de Cultivo de Especies) que es depositarla internacional localizada en 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209 E.U.A. La "ATCC No." es el número de acceso para los cultivos en depósito con la ATCC. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona un proceso mejorado para la bioconversión de una fuente de carbono fermentable directamente a 1 , 3 -propanodiol utilizando un microorganismo simple. El método está caracterizado por un rendimiento mejorado de 1 , 3 -propanodiol a niveles no previamente obtenidos. Las cepas hospederas de producción descritas han sido manipuladas mediante ingeniería genética para elevar al máximo la eficiencia metabólica de la vía mediante la incorporación de diversas mutaciones de supresión que previenen la desviación del carbono a compuestos no productivos. Se contempla que las transformaciones y mutaciones pueden ser combinadas para controlar las actividades enzimáticas particulares para el mejoramiento de la producción de 1 , 3 -propanodiol . De este modo, está dentro del alcance de la presente invención el anticipar las modificaciones de un catalizador celular completo que conduzca a una producción incrementada de 1 , 3 -propanodiol . Términos y Definiciones La invención puede ser más completamente comprendida con referencia a los siguientes términos y definiciones utilizados en las reivindicaciones y en las especificaciones. Genes que son suprimidos : Los términos "deshidrogenasa II de la NADH" , "NDH II" y "Ndh" se refieren a la NADH-deshidrogenasa tipo II, una proteína que cataliza la conversión de ubiquinona-8 + NADH + H+ a ubiquinol-8 + NAD+. Típica de la NADH-deshidrogenasa II es EC 1.6.9S.3. La NADH-deshidrogenasa II es codificada por ndh en E. coli. Los términos "proteína de control de la respiración aeróbica" y "ArcA" se refieren a una proteína reguladora global. La proteína de control de la respiración aeróbica es codificada por arcA en E. coli. Los términos "fosfogluconato-deshidratasa" y "Edd" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de 6-fosfo-gluconato a 2 - ceto- 3 -desoxi - 6 - fosfo-gluconato + H20. Típica de la deshidratasa de fosfogluconato es EC 4.2.1.12. La fosfogluconato-deshidratasa es codificada por edd en E. coli . Los términos "proteína fosfoportadora HPr" y "ptsH" se refieren a la proteína fosfoportadora codificada por ptsH en E. coli. Los términos "fosfoenolpiruvato-proteína-fosfotransferasa" y "Ptsl" se refieren a la fosfotransferasa EC 2.7.3.9, codificada por ptsl en E. coli. Los términos "sistema PTS" , "componente IIA específico de la glucosa" , y "Crr" se refieren a EC 2.7.1.69, codificada por crr en E. coli. PtsH, Ptsl, y Crr comprenden el sistema PTS. El término "sistema de fosfoenolpiruvato-azúcar-fosfotransferasa" , "sistema PTS" o "PTS" se refiere al sistema de captación de azúcar dependiente del fosfoenolpiruvato. Los términos "metilglioxal - sintasa" y "MgsA" se refieren a una proteína que cataliza la conversión del dihidroxi-acetona-fosfato a met il -gl ioxal+fosfato . La metilglioxal - sintasa típica es EC 4.2.3.3. La metilglioxal -sintasa es codificada por mgsA en E. coli.

Los términos "aldehído-deshidrogenasa A" y "AldA" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de H20 + NAD++aldehído a NADH+alcohol . La aldehído-deshidrogenasa A típica es EC 1.2.1.22. La aldehído-deshidrogenasa A es codificada por aldA en E. coli. Los términos "aldehído-deshidrogenasa B" y "AldB" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de H20+NAD++aldehído a NADH+alcohol. La aldehído-deshidrogenasa B típica es EC 1.2.1.22. La aldehído-deshidrogenasa B es codificada por aldB en E. coli. Genes cuya expresión ha sido modificada: Los términos "galactosa-simportador de protones" y "GalP" se refieren a una proteína que cataliza el transporte de un azúcar y un protón desde el periplasma hacia el citoplasma. La D-glucosa es un sustrato preferido para GalP. La galactosa-simportador de protones es codificada por galP en E. coli. Los términos "glucocinasa" y "Glk" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de la D-glucosa+ATP a glucosa-6-fosfato+ADP. La glucocinasa típica es EC 2.7.1.2. La glucocinasa es codificada por glk en E. coli. Los términos "gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa" y "GapA" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de gliceraldehído-3-fosfato+fosfato+NAD+ a 3 - fosfo-D-gl icerol - fosfato+NADH+H+ . La gl iceraldehído- 3 -fosfato-deshidrogenasa típica es EC 1.2.1.12. La gliceraldehído-3 - fosfato-deshidrogenasa es codificada por gapA en E. coli . Los términos "fosfoenolpiruvato-carboxilasa" y "Ppc" se refieren a una proteína que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato+H20+C02 a fosfato+ácido oxaloacético . La fos oenolpiruvato-carboxilasa típica es EC 4.1.1.31. La fosfoenolpiruvato-carboxilasa es codificada por ppc en E. coli. El término "YciK" se refiere a una enzima putativa codificada por yciK que es traduccionalmente acoplada a btuR, el gen que codifica para la Cob ( I ) alamin- adenosiltransferasa en Escherichia coli. El término "cob (I ) alamin-adenosiltransferasa" se refiere a una enzima responsable de la transferencia de una porción desoxiadenosilo de ATP al corrinoide reducido. La cob ( I ) alamin-adenosiltransferasa típica es EC 2.5.1.17. La cob ( I ) alamin-adenosiltransferasa es codificada por el gen "btufl" (GenBank M21528) en Escherichia coli, "cobA" (GenBank: L08890) en Salmonella typhimurium, y "cobO" (GenBank M62866) en Pseudomonas denitrificans . Definiciones adicionales: El término "promotor 1.20 GI corto" se refiere a la SEQ ID NO: 31. El término "promotor 1.5 GI corto" se refiere a la SEQ ID NO: 28. Los términos "promotor 1.6 GI corto" y "promotor tipo silvestre corto" son utilizados intercambiablemente y se refieren a la SEQ ID NO: 32. Los términos "glicerol-3-fosfato-deshídrogenasa" y "G3PDH" se refieren a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de dihidroxiacetona- fosfato (DHAP) a gl icerol - 3 - fosfato (G3P) . G3PDH in vivo puede ser NADH; NADPH; o dependiente de FAD . Cuando se hace referencia específicamente a un cofactor específico glicerol-3 - fosfato-deshidrogenasa , serán utilizados los términos "gl icerol -3 - fosfato-deshidrogenasa dependiente del NADH", "gl icerol - 3 - fosfato-deshidrogenasa dependiente de NADPH" y "gl icerol - 3 - fosfato-deshidrogenasa dependiente de FAD". Como es en general el caso en que las glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa dependientes de NADH y dependiente de NADPH son capaces de utilizar NADH y NADPH intercambiablemente (por e emplo por el gen codificado por gpsA) , los términos glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa dependiente del NADH y dependiente del NADPH serán utilizados intercambiablemente. La enzima dependiente de NADH (EC 1.1.1.8) es codificada, por ejemplo, por varios genes incluyendo GPD1 (GenBank Z74071x2) , o GPD2 (GenBank Z35169xl), o GPD3 (GenBank G984182), o DAR1 (GenBank Z74071x2) . La enzima dependiente de NADPH (EC 1.1.1.94) es codificada por gpsA (GenBank U321643, (cds 197911-196892) G466746 y L45246) . La enzima dependiente de FAD (EC 1.1.99.5) es codificada por GUT2 (GenBank Z47047x23), o glpD (GenBank G147838), o glpABC (GenBank M20938) (ver WO 9928480 y referencias en la presente, que son incorporadas por referencia en la presente) . Los términos "glicerol-3 -fosfatasa" , "sn-glicerol -3 -fosfatasa", o "d, 1-glicerol-fosfatasa" , y "G3P-fosfatasa" se refieren a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión del glicerol -3 - fosfato y agua al glicerol y fosfato inorgánico. La G3P- fosfatasa es codificada, por ejemplo, por GPP1 (GenBank Z47047xl25) , o GPP2 (GenBank U18813xll) (ver WO 9928480 y referencias en la presente, las cuales se incorporan por referencia en la presente) . El término "glicerol -cinasa" se refiere a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol y ATP a glicerol-3 -fosfato y ADP . El donador de fosfato de alta energía ATP puede ser reemplazado por sustitutos fisiológicos (por ejemplo, fosfoenolpiruvato) . La glicerol -cinasa es codificada, por ejemplo, por GUT1 (GenBank U11583xl9) y glpK (GenBank L19201) (ver WO 9928480 y referencias en la presente, las cuales se incorporan por referencia en la presente) . El término "glicerol-deshidrogenasa" se refiere a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol a dihidroxiacetona ) (E.C. 1.1.1.6) o glicerol a gliceraldehído (E.C. 1.1.1.72). Un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión del glicerol a dihidroxiacetona es también denominado como una "dihidroxiacetona-reductasa" . La glicerol-deshidrogenasa puede ser dependiente de NADH (E.C. 1.1.1.6), NADPH (E.C. 1.1.1.72), u otros cofactores (por ejemplo, E.C. 1.1.99.22) . Una glicerol-deshidrogenasa dependiente de NADH es codificada, por ejemplo, por gldA (GenBank U00006) (ver WO9928480 y referencias en la presente, las cuales se incorporan por referencia en la presente) . El término "enzima deshidratasa" o "deshidratasa" se refieren a cualquier actividad enzimática que cataliza la conversión de una molécula de glicerol al producto 3-hidroxipropionaldehído . Para fines de la presente invención, las enzimas deshidratasas incluyen una gl icerol -deshidratasa (E.C. 4.2.1.30) y una diol -deshidratasa (E.C. 4.2.1.28) que tienen sustratos preferidos de glicerol y 1 , 2 -propanodiol , respectivamente. Los genes para las enzimas deshidratas han sido identificados en Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii , Clostridium pasteurianum, Salmonella typhimuriu , y Klebsiella oxytoca. En cada caso, las deshidratas está compuesta de tres subunidades. La subunidad grande o "a", la subunidad media o "ß" , y la subunidad pequeña o "?" . Debido a la amplia variación en la nomenclatura de los genes utilizada en la literatura, se da en la Tabla 1 un diagrama, comparativo para facilitar la identificación. Los genes son también descritos en, por ejemplo, Daniel et al. (FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)) y Toraya y Mori (J. Biol . Chem. 274, 3372 (1999)). Con referencia a la Tabla 1, los genes que codifican para la subunidad grande o "a" de la glicerol -deshidratas incluyen dhaBl , gldA y dhaB; los genes que codifican para la subunidad mediana o "ß" incluyen dhaB2, gldB y dhaC; los genes que codifican para la subunidad pequeña o "?" incluyen dhaB3 , gldC y dhaE. También con referencia a la Tabla 1, los genes que codifican para la subunidad grande o "a" de la diol-deshidratas incluyen pduC y pddA; los genes que codifican para la subunidad mediana o "ß" incluyen pduD y pddB; los genes que codifican para la subunidad pequeña o "?" incluyen pduE y pddC.

Tabla 1: Diagrama comparativo de los nombres de los genes y referencias de GenBank para la deshidratasa y funciones ligadas a la deshidratasa FUNCION DEL GEN: Regulatoria Desconocida Reactivación 1 ,3-PD- Desconocida deshidrogenasa Gen Pares de Gen Pares de Gen Pares de Gen Pares de Gen Pares de bases bases bases bases bases ORGANISMO fReferencia de GenBank) K. pneumoniae (SEQ ID NO: dhaR 2209- ?Gß? 41 12- orJX 4643- dhaT 5017- orJY 6202-6630 O 4134 4642 4996 6108 K. pneumoniae (U30903) orJ2c 71 16- orflb 6762- dhaT 5578- orf2a 5 125-5556 7646 71 1 5 6741 K. pneumoniae (U60992) GdrB 15 C. freundii (\J09n \) dhaR 3746- orfW 5649- orfX 6180- dhaT 6550- orfY 7736-8 164 5671 61 79 6533 7713 C. pasteurianum AF05 1373) C. pasteurianum (AF0060034) orfW 210-731 ??ß 1-196 dhaT 1232- orfY 746-1177 2389 S. typhímurium (AF026270) pduH 8274- 8645 K. oxytoca (AFO 17781) ddrB 2063- 2440 K. oxytoca (AF051373) FUNCION DEL GEN: deshidratasa, deshidratasa, ß deshidratasa, ? reactivación Gen Pares de Gen Pares de Gen Pares de Gen Pares de 5 bases bases bases bases ORGANISMO (Referencia de GenBank) K. pneumoniae (SEQ ID NO: 1) dhaBl 7044- dhaB2 8724- dhaB3 9311- rJZ 9749- 8711 9308 9736 11572 K. pneumoniae (U30903) dhuBl 3047- dhaBl 2450- dhaB3 2022- dhaB4 186- 10 4714 2890 2447 2009 K. pneumoniae (U60992) gidA 121- gldB 1801- GldC 2388- gdrA 1788 2385 2813 C. freundii (\J0917\) dhaB 8556- dhaC 10235- DhaE 10822- orfZ 11261- 10223 10819 11250 13072 15 C. pasteurianum (AF0 1373) dhaB 84-1748 dhaC 1779- DhaE 2333- orfZ 2790- 2318 2773 4598 C, pasteurianum (AF0060034) S. typhimurium (AF026270) pduC 3557- pduD 5232- Pude 5921- pduG 6452- 5221 5906 6441 8284 ?'. oxytoca (AFO 17781) ddrB 2063- ddrA 241- 2440 2073 K. oxytoca (AF051373) pddA 121- pddB 1796- PddC 2485- 1785 2470 3006 Las deshidratasas de glicerol y de diol son sometidas a inactivación suicida basada en el mecanismo por el glicerol y algunos otros sustratos (Daniel et al., FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999)). El término "factor de reactivación de deshidratas" se refiere a aquellas proteínas responsables de la reactivación de la actividad de la deshidratasa . Los términos "actividad de reactivación de deshidratasa" , "reactivación de la actividad de deshidratasa" o "regeneración de la actividad de deshidratasa" se refiere al fenómeno de conversión de una deshidratasa no capaz de realizar la catálisis de un sustrato, a una capaz de realizar la catálisis de un sustrato, o al fenómeno de inhibir la inactivación de una deshidratas, o al fenómeno de extender la vida media útil de la enzima deshidratasa in vivo. Han sido identificadas dos proteínas por estar involucradas como el factor de reactivación de deshidratasa (ver WO 9821341 (US 6013494) y referencias en la presente, las cuales se incorporan por referencia en la presente; Daniel et al., supra; Toraya y Kori , J. Biol. Che . 274, 3372 (1999); y Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181, 4110 (1999)) . Con referencia a la Tabla 1, los genes que codifican para una de las proteínas incluyen orfZ, dhaB4 , gdrA, pduG y ddrA. También con referencia a la Tabla 1, los genes que codifican para la segunda de las dos proteínas incluyen orfX, orf2b, gdrB, pduH y ddrB.

Los términos "1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa" , "1 , 3 -propanodiol -deshidrogenasa" o "DhaT" se refieren al o a los polipéptidos responsables de una actividad enzimática que es capaz de catalizar la interconversión de 3-HPA y el 1,3-propanodiol, con la condición de que el o los genes que codifican para tal actividad sean encontrados como física y transcripcionalmente ligados a una enzima deshidratasa en su ambiente natural (por ejemplo, tipo silvestre); por ejemplo, el gen es encontrado dentro de un reguión dha como es el caso con dhaT de Klebsiella pneumoniae . Con referencia a la Tabla 1, los genes que codifican para la 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa incluyen dhaT proveniente de Klebsiella pnuemoniae, Citrobacter freundii, y Clostridium pasteurianum . Cada uno de estos genes codifican para un polipéptido que pertenece a la familia de las alcohol -deshidrogenasas tipo III, muestra una porción conservada de enlace al hierro, y tiene una preferencia por la interconversión de 3-HPA y 1,3-propanodiol ligada a NAD+/NADH (Johnson y Lin, J". Bacteriol. 169, 2050 (1987); Daniel et al., J. Bacteriol. 177, 2151 (1995); y Leurs et al., FEMS Microbiol . Lett. 154, 337 (1997)) . Las enzimas con propiedades físicas similares han sido aisladas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri (Veiga da Duna y Foster, Appl . Environ. Microbiol. 58, 2005 (1992) ) . El término "reguión dha" se refiere a un grupo de genes asociados o estructuras de lectura abierta que codifican para diversas actividades biológicas, incluyendo pero no limitadas a una actividad de deshidratasa , una actividad de reactivación, y una 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa .

Típicamente, un reguión dha comprende las estructuras de lectura abierta dhaR, orfY, dhaT, orfX, orfW, dhaBl , dhaB2, dhaB3 , y orfZ como se descrie en la presente. El término "actividad catalítica no específica" se refiere al o a los polipéptidos responsables de una actividad enzimática que es suficiente para catalizar la interconversión de 3-HPA y 1 , 3 -propanodiol , y excluye específicamente a las 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasas . Típicamente, estas enzimas son alcohol -deshidrogenasas . Tales enzimas pueden utilizar cofactores diferentes de NADVNADH, incluyendo pero no limitadas a flavinas tales como FAD o FMN. Un gen para una alcohol -deshidrogenasa no específica (yqhD) es encontrado, por ejemplo, como endógenamente codificado y funcionalmente expresado dentro de cepas E. coli K12. Los términos "función" o "función enzimática" se refieren a la actividad catalítica de una enzima en la alteración de la energía requerida para realizar una reacción química específica. Se entiende que tal actividad puede aplicar a una reacción en el equilibrio donde la producción de cualquier producto o sustrato puede ser lograda bajo condiciones adecuadas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" son utilizados intercambiablemente . Los términos "sustrato de carbono" y "fuente de carbono" se ref eren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por microorganismos hospederos de la presente invención, y particularmente las fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de. monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos , y sustratos de un solo carbono, o mezclas de los mismos. Los términos "célula hospedera" o "microorganismo hospedero" se refieren a un microorganismo capaz de recibir genes extraños o heterólogos y capaz de expresar esos genes para producir un producto génico activo. Los términos "gen extraño" , "ADN extraño" , "gen heterólogo" y "ADN heterólogo" se refieren al material genético nativo para un organismo que ha sido colocado dentro de un microorganismo hospedero por diversos medios. El gen de interés puede ser un gen de origen natural, un gen mutado, o un gen sintético. Los términos "transformación" y "transíección" se refieren a la adquisición de nuevos genes en una célula después de la incorporación del ácido nucleico. Los genes adquiridos pueden ser integrados dentro del ADN cromosómico o introducidos como secuencias de replicacion extracromosomicas. El término "transformante" se refiere al producto de una transformación . El término "genéticamente alterado" se refiere al proceso de cambiar el material hereditario por transformación o mutación. Los términos "microorganismo recombinante" y "hospedero transformado" se refieren a cualquier microorganismo que haya sido transformado con genes heterólogos o extraños o copias extras de genes homólogos. Los microorganismos recombinantes de la presente invención expresan genes extraños que codifican para la glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (GPD1) , glicerol-3 -fosfatasa (GPP2), glicerol -deshidratasa (dhaBl, dhaB2 y dhaB3) , factor de reactivación de deshidratasa (orfZ y orfX) , y opcionalmente 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa {dhaT) para la producción de 1 , 3 -propanodiol a partir de sustratos de carbono adecuados. Una modalidad preferida es un E. coli transformado con estos genes, pero que carecen de un dhaT funcional. Un microorganismo hospedero, diferente de E. coli, puede también ser transformado para contener los genes descritos y el gen para la actividad catalítica no específica, para la interconversión de 3-HPA y 1 , 3 -propanodiol , específicamente excluyendo la 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa ( s ) (dhaT). "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (5' de no codificación) y que siguen (3' de no codificación) la región de codificación. Los términos "nativo" y "tipo silvestre" se refieren a un gen como es encontrado en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras . Los términos "que codifica" y "codifica" se refieren a un proceso mediante el cual un gen, a través de los mecanismos de transcripción y de traducción, produce una secuencia de aminoácidos. Se entiende que el proceso de codificación de una secuencia específica de aminoácidos incluye secuencias de ADN que pueden involucrar cambios de base que no provocan un cambio en el aminoácido codificado, o que involucran cambios de base que pueden alterar uno o más aminoácidos, pero no afectan las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. Se entiende por lo tanto que la invención abarca más de las secuencias ejemplares específicas. El término "aislado" se refiere a una proteína o secuencia de ADN que es removida de al menos un componente con el cual ésta está asociada de manera natural . Una "molécula de ácido nucleico aislada" es un polímero de ARN o de ADN que es de una sola hebra o de doble hebra, que contiene opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Una molécula de ácido nucleico aislada en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendida de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético . "Sustancialmente similar" se refiere a las moléculas de ácido nucleico en donde los cambios en una o más' bases nucleotídicas dan como resultado la sustitución de uno o más aminoácidos, pero no afectan las propiedades funcionales de la proteína codificada- por la secuencia de ADN. "Sustancialmente similar" también se refiere a las moléculas de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases específicas no afectan la habilidad de la molécula de ácido nucleico para mediar la alteración de la expresión del gen por tecnología antisentido o co- supresión . "Sustancialmente similar" se refiere también a modificaciones de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (tal como supresión o inserción de una o más bases nucleotídicas) que no afectan de manera sustancial las propiedades funcionales del transcrito resultante frente a la habilidad para mediar la alteración de la expresión del gen por tecnología antisentido o cosupresión, o alteración de las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante. La invención abarca más de las secuencias ejemplares específicas . Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que las alteraciones en un gen que dan como resultado en la producción de un químicamente equivalente en un sitio dado, pero no afectan las propiedades funcionales de la proteína codificada, son comunes. Para los propósitos de la presente invención, las sustituciones son definidas como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos: 1. Residuos pequeños alifáticos no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) ; 2. Residuos polares, negativamente cargados y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; 3. Residuos polares positivamente cargados: His, Arg , Lys ; 4. Residuos no polares alifáticos grandes: Met, Leu, lie, Val (Cys) , y 5. Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp . De este modo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica para otro residuo menos hidrofóbico (tal como glicina) o un residuo más hidrofóbico (tal como valina, leucina, o isoleucina) . Similarmente , los cambios que dan como resultado la sustitución de un residuo negativamente cargado por otro (tal como ácido aspártico por ácido glutámico) o un residuo positivamente cargado por otro más (tal como lisina por arginina) puede también esperarse que produzca un producto funcionalmente equivalente. En muchos casos, los cambios de nucleótidos que dan como resultado la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de proteína, tampoco podría esperarse que alteren la actividad de la proteína.

Cada una de las modificaciones propuestas está muy por dentro de la experiencia ordinaria en la técnica, como es la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. Además, la persona experta en la técnica reconoce que las secuencias sustancialmente similares abarcadas por esta invención son también definidas por su habilidad para hibridarse, bajo condiciones astringentes (0.1X SSC, 0.1% de SDS, 65°C y lavado con 2X SSC, 0.1% de SDS seguido por 0. IX SSC, 0.1% de SDS), con las secuencias ejemplificadas aquí. Los fragmentos de ácido nucleico preferidos, sustancialmente similares de la presente invención, son aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son al menos 80% idénticas a las secuencias de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Los fragmentos de ácido nucleico más preferidos son al menos 90% idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Los más preferidos son los fragmentos de ácido nucleico que son al menos 95% idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente. Un fragmento de ácido nucleico es "hibridable" a otro fragmento de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma de una sola hebra del fragmento de ácido nucleico puede recocerse al otro fragmento de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica en solución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y ejemplificadas en Sambrook, J. , Fritsch, EE . F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1989) , particularmente Capítulo 11 y Tabla 11.1 en la misma (completamente incorporada por referencia en la presente) . Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "exigencia" o "severidad" de la hibridación. Para la selección preliminar para los ácidos nucleicos homólogos, pueden ser utilizadas condiciones de hibridación de baja exigencia, correspondiente a una Tm de 55°, por ejemplo, 5X SSC, 0.1% de SDS , 0.25% de leche, y sin formamida ; o 30% de formamida, 5X de SSC, 0.5% de SDS. Las condiciones de hibridación de exigencia moderada corresponden a una Tm más alta, por ejemplo, 40% de formamida, con 5X o 6X de SSC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la exigencia de la hibridación, los malos acoplamientos entre las bases son posibles. La estringencia apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables bien conocidos en la técnica. Entre mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de Tw para los híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a Tm más alta) de la hibridación de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN : ARN, ADN : AR , AD :ADN . Para los híbridos de más de 100 nucleotidos de longitud, han sido derivadas las ecuaciones para calcular Tm (ver Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición de los malos acoplamientos se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (ver Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). En una modalidad, la longitud para un ácido nucleico hibridable es al menos de aproximadamente 10 nucleotidos. Es preferible una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable, de al menos aproximadamente 15 nucleotidos, más preferentemente de al menos 20 nucleotidos; y lo más preferentemente la longitud es al menos de 30 nucleotidos. Además, el experto en la técnica reconocerá la temperatura y la concentración de la sal de la solución de lavado pueden ser ajustadas como sea necesario de acuerdo a los factores tales como la longitud de la sonda. Una "porción sustancial" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de nucleotidos que comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido y la secuencia de nucleotidos de un gen para proporcionar identificación putativa de ese polipéptido o gel, ya sea mediante evaluación manual de la secuencia por una persona de experiencia en la técnica, o por comparación secuencial automatizada por computadora e identificación utilizando algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J\ Mol. Biol. 215: 403-410 (1993); ver también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS/) . En general, una secuencia de diez o más aminoácidos continuos o treinta o más nucleótidos, es necesaria con el fin de identificar putativamente una secuencia polipeptídica o de ácidos nucleicos como homologa a una proteína o gen conocidos. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas oligonucleotídicas específicas de genes que comprenden 20 a 30 nucleótidos contiguos pueden ser utilizadas en los métodos dependientes de la secuencia de identificación de genes (por ejemplo, hibridación de Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o de placas de bacteriófagos) . Además, los oligonucleótidos cortos de 12 a 15 bases pueden ser utilizados como cebadores de amplificación en PCR con el fin de obtener una molécula particular de ácido nucleico que comprende los cebadores. En consecuencia, una "porción sustancial" de una secuencia nucleotídica comprende suficiente de la secuencia para proporcionar identificación específica y/o aislamiento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente especificación enseña las secuencias parciales o completas de aminoácidos y de nucleótidos que codifican para una o más proteínas particulares. El experto en la técnica, teniendo el beneficio de las secuencias como se reporta en la presente, pueden ahora utilizar toda o una porción sustancial de las secuencias descritas para el propósito conocido por aquellos expertos en la técnica. En consecuencia, la presente invención comprende las secuencias completas como son reportadas en el Listado de Secuencias anexo, así como las porciones sustanciales de aquellas secuencias como se definieron anteriormente. El término "complementario" describe la relación entre las bases de nucleótidos que son capaces de hibridarse una con la otra. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. En consecuencia, la presente invención también incluye las moléculas aisladas de ácido nucleico que son complementarias a las secuencias completas como son reportadas en el Listado de Secuencias anexo, así como aquellas secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares. El término "identidad porcentual", como es conocido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleotidos, como son determinadas por comparación de las secuencias . En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación secuencial entre las secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos , como pueda ser el caso, como es determinado por el acoplamiento entre hileras de tales secuencias. "Identidad" y "similitud" pueden ser calculadas fácilmente por métodos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquellos descritos en: Computational Molecular Biology; Lesk, A. M . , Ed. ; Oxford University Press: New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects; Smith, D. W., Ed.; Academic Press: New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1; Griffin, A. M. y Friffin, H. G., Eds . ; Humana Press: New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology; von Heinje, G., Ed.; Academic Press: New York, 1987; y Seqruence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.; Stockton Press: New York, 1991. Los métodos preferidos para determinar la identidad son diseñados para dar el mayor acoplamiento o concordancia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud son codificados en los programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos preferidos en programa de computadora para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el programa GCG Pileup encontrado en el paquete de programa GCG, utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch con sus valores por omisión estándares de penalidad por creación de espacio vacío = 12 y penalidad por extensión de espacio vacío = 4 (Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Pearson et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 85: 2444-2448 (1988) . El programa BLASTX es públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al., Nati. Cent. Biotechnol . Inf., Nati. Library Med. (NCBI NLM) NIH, Bethesda, Md. 20894 ; Altschul et al., J". Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., "Gapped BLAST y PSI-BLAST: una nueva generación de programas de búsqueda de bases de datos de proteínas", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)) . Otro método preferido para determinar la identidad porcentual, es mediante el método de protocolo de alineamiento de proteínas DNASTAR utilizando el algoritmo de Jotun-Hein (Hein et al., Methods Enzymol. 183: 626-645 (1990)). Los parámetros por omisión para el método de Jotun-Hein para los alineamientos son: para alineamientos múltiples, penalidad por espacio vacío=ll, penalidad por longitud de espacio vacío=3; para alineamientos por pares ktuple=6. Como una ilustración, por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" a una secuencia nucleotídica de referencia, se pretende que la secuencia nucleotídica del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser suprimidos o sustituidos con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia, pueden ser insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden aparecer en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia nucleotídica de referencia o en cualquier otro sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Análogamente, por un polipeptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, por ejemplo, 95% de identidad a una secuencia de aminoácidos de referencia, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipeptido sea idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia polipeptídica puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden ser suprimidos o sustituidos con otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta 5% de los residuos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia, pueden ser insertados dentro de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden aparecer en las posiciones terminales amino o carboxilo de la secuencia de aminoácidos de referencia, o en cualquier otro sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El término "homólogo (a) " se refiere a una proteína o polipéptido nativo o que aparece de manera natural en una célula hospedera dada. La invención incluye microorganismos que producen proteínas homologas vía la tecnología de ADN recombinante . El término "homología porcentual" se refiere al grado de identidad de la secuencia de aminoácidos entre los pol ipépt idos . Cuando una primera secuencia de aminoácidos es idéntica a una segunda secuencia de aminoácidos, entonces la primera y segunda secuencias de aminoácidos muestran 100% de homología. La homología entre cualesquiera dos polipéptidos es una función directa del número total de aminoácidos mal apareados en una posición dada en cualquier secuencia, por ejemplo, si la mitad del número total de aminoácidos en cualquiera de las dos secuencias son los mismos, entonces se dice que las dos secuencias muestran 50% de homología. "Degeneración del codón" se refiere a la divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El experto en la técnica está muy bien enterado de la "desviación de codón" mostrada por una célula hospedera específica en el uso de los codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para la expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable diseñar al gen tal que su frecuencia de uso de codón se aproxime a la frecuencia de uso de codón preferido de la célula hospedera. Se contemplan también modificaciones a la secuencia, tales como supresiones, inserciones o sustituciones en la secuencia que producen cambios silenciosos que no afectan de manera sustancial las propiedades funcionales de la molécula de proteína resultante. Por ejemplo, es contemplada la alteración en la secuencia génica que refleja la degeneración del código genético, o que da como resultado la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado. De este modo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica para otro residuo menos hidrofóbico, tal como glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como valina, leucina, o isoleucina. Similarmente , los cambios que dan como resultado la sustitución de un residuo negativamente cargado por otro, tal como el ácido aspártico por ácido glutámico, o un residuo positivamente cargado por otro más, tal como lisina por arginina, puede también esperarse que produzcan un producto biológicamente equivalente. Los cambios nucleotídicos que dan como resultado la alteración de las porciones N-terminal y extermina! de la molécula de proteína tampoco podrían esperarse que alteren la actividad de la proteína. En algunos casos, puede de hecho ser deseable elaborar mutantes de la secuencia con el fin de estudiar el efecto de la alteración sobre la actividad biológica de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas está muy por dentro de la experiencia ordinaria en la técnica, como esa determinación de la retención de la actividad biológica en los productos codificados. Además, el experto en la técnica reconoce que las secuencias abarcadas por esta invención son también definidas por su habilidad para hibridarse, bajo condiciones severas o exigentes (0.1X de SSC, 0.1% de SDS, 65°C), con las secuencias ejemplificadas en la presente. El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción para el producto génico a partir de un gen que codifica para la secuencia del producto génico. Los términos "plásmido" , "vector" y "cásete" se refieren a un elemento cromosómico extra que lleva frecuentemente genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en la forma de moléculas de ADN circular de doble hebra. Tales elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración del genoma, secuencias de fagos o nucleótidos, ADN o ARN lineal o circular, de una sola hebra o de doble hebra, derivados de cualquier fuente, en los cuales un número de secuencias nucleotidicas han sido unidas o recombinadas en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento promotor y la secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada, dentro de una célula. "Cásete de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que facilita la transformación de una célula hospedera particular. "Cásete de expresión" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene los elementos además del gen extraño, que permiten la expresión aumentada de ese gen en un hospedero extraño . Construcción de Organismos Recombinantes Los organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codificarán para la vía enzimática para la conversión de un sustrato de carbono a 1 , 3 -propanodiol , pueden ser construidos utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Los genes que codifican para la gl icerol -3 - fosfato-deshidrogenasa (GPD1) , la gl icerol - 3 - fosfatasa (GPP2) , la gl icerol -deshidratas (dhaBl, dhaB2 y dhaB3) , el factor de reactivación de deshidratasa [orfZ y orfX) y la 1,3-propanodiol -oxidorreductasa (dhaT) fueron aislados de un hospedero nativo tal como Klebsiella o Saccharomyces y utilizados para transformar las cepas hospederas tales como E. coli DH5a , ECL707, AA200 o KLP23. Aislamiento de Genes Los métodos para la obtención de genes deseados a partir de un genoma bacteriano son comunes y bien conocidos en la técnica de biología molecular. Por ejemplo, si la secuencia del gen es conocida, pueden ser creadas bibliotecas genómicas adecuadas por digestión con endonucleasa de restricción y pueden ser seleccionadas con sondas complementarias para la secuencia génica deseada. Una vez que se aisla la secuencia, el ADN puede ser amplificado utilizando métodos estándares de amplificación dirigida por cebadores tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202) para obtener cantidades de ADN adecuadas para la transformación utilizando vectores apropiados . Alternativamente, las bibliotecas de cósmidos pueden ser creadas donde segmentos grandes de ADN genómico (35-45 kb) pueden ser empaquetados dentro de vectores y utilizados para transformar hospederos apropiados. Los vectores cósmidos son únicos al ser capaces de acomodar grandes cantidades de ADN. En general, los vectores cósmidos tienen al menos una copia de la secuencia de ADN de eos que es necesaria para el empaquetamiento y la circulari zación subsecuente del ADN extraño. Además de la secuencia eos estos vectores contendrán también un origen de replicación tal como ColEl y marcadores de resistencia a fármacos tales como un gen resistente a la ampicilina o a la neomicina. Los métodos para utilizar los vectores cósmidos para la transformación de hospederos bacterianos adecuados son bien descritos en Sambrook, J. et al . , supra . Típicamente, para clonar cósmidos, el ADN extraño es aislado utilizando endonucleasas de restricción apropiadas y ligado, adyacente a la región eos del vector cósmido, utilizando las ligasas apropiadas. Los vectores cósmidos que contienen el ADN extraño linearizado se hacen reaccionar luego con un vehículo de empaquetamiento de ADN tal como el bacteriófago. Durante el proceso de empaquetamiento los sitios eos son escindidos y el ADN extraño es empaquetado dentro de la porción de cabeza de la partícula viral bacteriana. Estas partículas son luego utilizadas para transfectar células hospederas adecuadas tales como E. coli. Una vez inyectado dentro de E. coli el ADN extraño se circulariza bajo la influencia de los extremos pegajosos eos. De esta manera, pueden ser introducidos segmentos grandes de ADN extraño y expresados en células hospederas recombinantes .

Aislamiento y Clonación de Genes que Codifican para la Glicerol -Deshidratasa (dhaBl, dhaB2, y dhaB3) , Factores de Reactivación de Deshidratasa (orfZ y orfX) , y 1 , 3 -propanodiol -deshidrogenasa [dhaT) Los vectores cósmidos y los métodos para la transformación de cósmidos fueron utilizados dentro del contexto de la presente invención para clonar segmentos grandes de ADN genómico a partir de géneros bacterianos que se sabe poseen genes capaces de procesar el glicerol hasta 1,3-propanodiol . Específicamente, el ADN genómico proveniente de K. pneumoniae fue aislado mediante métodos bien conocidos en la técnica y seguidos por la enzima de restricción Sau3A para la inserción dentro de un vector cósmido Supéreos 1 , y empaquetado utilizando los extractos de empaquetamiento Gigapackll. Después de la construcción del vector, las células de E. coli XLl-Blue MR fueron transformadas con el ADN cósmido. Los transformantes fueron seleccionados para la habilidad de convertir el glicerol a 1 , 3 -propanodiol desarrollando las células en presencia de glicerol y analizando los medios para la formación del 1 , 3 -propanodiol . Dos de los transformantes positivos al 1,3-propanodiol fueron analizados y los cósmidos fueron nombrados pKPl y pKP2. El secuenciamiento del ADN reveló homología extensa al gen de la glicerol -deshidratasa proveniente de C. freundii, demostrando que estos transformantes contenían ADN que codifica para el gen de la gl icerol -deshidratasa . Otros transformantes positivos al 1 , 3 -propanodiol fueron analizados y los cósmidos fueron nombrados p P4 y pKP5. El secuenciaraiento del ADN reveló que estos cósmidos llevaban el ADN que codifica para un gen de la diol -deshidratasa . Aunque la presente invención utiliza los genes aislados provenientes de un cósmido de Klebsiella , las fuentes alternativas de los genes de las deshidratas y los genes del factor de reactivación de deshidratasa incluye, pero no están limitados a, Citrobacter, Clostridia y Salmonella (ver Tabla 1) . Genes que Codificar, para la G3PDH y G3P-fosfatasa La presente invención proporciona los genes adecuados para la expresión de las actividades de G3PDH y G3P-fosfatasa en una célula hospedera. Los genes que codifican para G3PDH son conocidos. Por ejemplo, GPD1 ha sido aislado de Saccharomyces (Wang et al., supra) . Similarmente , la actividad de G3PDH ha sido también aislada a partir de Saccharomyces, codificada por GPD2 (Eriksson et al., Mol. Microbiol. 17, 95 (1995)). Para fines de la presente invención, se contempla que cualquier gen que codifica para un polipéptido responsable de la actividad de G3PDH dependiente de NADH, es adecuado, en donde esa actividad sea capaz de catalizar la conversión del fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) a glicerol - 3 - fosfato (G3P) .

Además, se contempla que cualquier gen que codifica para la secuencia de aminoácidos de los G3PDH dependientes de NADH correspondiente a los genes DAR1 , GPD1, GPD2 , GPD3 , y gpsA será funcional en la presente invención, en donde esa secuencia de aminoácidos puede abarcar sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos que no alteren la función de la enzima. La persona experta apreciará que los genes que codifican para G3PDH aislado de otras fuentes, serán también adecuados para el uso en la presente invención. Son conocidos los genes que codifican para la GP3 - fosfatasa . Por ejemplo, GPP2 ha sido aislado de Saccharomyces cerevisiae (Norbeck et al., J. Biol . Chem. 271, 13875 (1996)). Para los fines de la presente invención, cualquier gen que codifica para una actividad de fosfatasa de G3P es adecuado para el uso en el método, en donde esa actividad es capaz de catalizar la conversión de gl icerol - 3 - fosfato más H20 a glicerol más fosfato inorgánico. Además, cualquier gen que codifique para la secuencia de aminoácidos de la G3P- fosfatasa correspondiente a los genes GPP2 y GPP1, será funcional en la presente invención, incluyendo cualquier secuencia de aminoácidos que abarque las sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos que no alteren la función de la enzima G3P- fosfatasa . La persona de experiencia en la técnica apreciará que los genes que codifican para la G3P- fosfatasa aislada de otras fuentes, serán también adecuados para el uso en la presente invención. Células Hospederas Las células hospederas adecuadas para la producción recombinante de 1 , 3 -propanodiol pueden ser ya sea procarióticas o eucarióticas, y estarán limitadas únicamente por la habilidad de la célula hospedera a expresar las enzimas activas para la vía del 1 , 3 -propanodiol . Las células hospederas adecuadas serán microorganismos tales como Ci robacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces , Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella , Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas . Preferidas en la presente invención son Escherichia coli, Escherichia blattae, Klebsiella, Citrobacter y Aerobacter. Más preferidos son E. coli (KLP23 ( O 2001012833 A2 ) ; RJ8. n (ATCC PTA-4216), E. coli: FMP'::Km (ATCC PTA4732) , MG 1655 (ATCC 700926)) . Vectores y Casetes de Expresión La presente invención proporciona una variedad de vectores y casetes de transformación y de expresión adecuados para la clonación, transformación y expresión de G3PDH, G3P-fosfatasa, deshidratasa , y factor de reactivación de deshidratasa en una célula hospedera adecuada. Los vectores adecuados serán aquellos que sean compatibles con el microorganismo empleado. Los vectores adecuados pueden ser derivados, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como el bacteriófago T7 o un fago derivado de M-13), un cósmido, una levadura o una planta. Los protocolos para obtener y utilizar tales vectores son conocidos por aquellos expertos en la técnica (Sambrook et al., supra) . Las regiones de control de la iniciación, o promotores, que son útiles, para impulsar la expresión de los genes de G3PDH y GEP- fosfatas (DAR1 y GPP2 , respectivamente), en la célula hospedera deseada, son numerosos y familiares para aquellos expertos en la técnica. Virtualmente cualquier promotor capaz de impulsar estos genes es adecuado para la presente invención, incluyendo pero no limitados a CYC1, HIS3, GAL1 , GALIO, ADH1 , PGK, PH05 , GAPDH , ADC1 , TRP1, URA3 , LEU2 , ENO y TPI (útil para la expresión en Saccharomyces) ; A0X1 (útil para la expresión en Pichia) ; y lac, trp, /tPL, ???, T7 , tac, y trc (útil para la expresión en E. coli) . Las regiones de control de la terminación pueden también ser derivadas de diversos genes nativos para los hospederos preferidos. Opcionalmente , un sitio de terminación puede ser innecesario; no obstante, éste es más preferido si se incluye. Para la expresión efectiva de las presentes enzimas, el ADN que codifica para las enzimas es ligado operablemente a través de codones de iniciación a las regiones de control de expresión seleccionadas tal que la expresión da como resultado la formación del ARN mensajero apropiado. Particularmente útiles en la presente invención son los vectores pSYCOlOl, pSYCO103, pSYCO106 y pSYCO109. Los elementos esenciales son derivados del reguión dha aislado de Klebsiella pneumoniae y de Saccharomyces cerevisiae . Cada uno contiene las estructuras de lectura abierta dhabl, dhaB2, dhaB3 , d aX, orfx, DAR1 y GPP2 acomodadas en tres operones separados, las secuencias nucleotídicas de los cuales se dan en las SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, respectivamente. Las diferencias entre los vectores se ilustran en el diagrama siguiente [el prefijo "p-" indica un promotor; las estructuras de lectura abierta contenidas dentro de cada " ( ) " representan la composición de un operón] : pSYCOlOl (SEQ ID NO: 65) : p-trc (Darl_GPP2) en orientación opuesta en comparación a los otros 2 operones de la vía, p-1.6 long GI (dhaBl_dhaB2_dhaB3_dhaX) , y p-1.6 long GI (orfY_orfX_orfW) , pSYCO103 (SEQ ID NO: 66) : p-trc (Darl_GPP2) misma orientación en comparación a los otros 2 operones de la vía, p-1.5 logn GI (dhaBl_dhaB2_dhaB3_dhaX) , y p-1.5 long GI (orfY_orfX_orfW) , pSYCO106 (SEQ ID NO: 67) : p-trc (Darl_GPP2) misma orientación en comparación a los otros 2 operones de la vía. p-1.6 long GI (dhaBl_dhaB2_dhaB3_dhaX) , y p-1.6 long GI (orfY_orfX_orfW) . pSYCO109 (SEQ ID NO: 68) : p-trc (Darl_GPP2) misma orientación en comparación a los otros 2 operones de la vía, p-1.6 long GI (dhaBl_dhaB2_dhaB3_dhaX) , y p-1.6 long GI (orfY_orfX) . Transformación de Hospederos Adecuados y Expresión de Genes para la Producción de 1 , 3 -propanodiol Una vez que los casetes adecuados son construidos, éstos son utilizados para transformar las células hospederas apropiadas. La introducción del cásete que contiene los genes que codifican para G3PDH, G3P-fosfatasa, deshidratasa y el factor de reactivación de la deshidratasa dentro de la célula hospedera, puede ser logrado mediante procedimientos conocidos tales como mediante transformación (por ejemplo, utilizando células permeabilizadas con calcio, electroporación) , o mediante transfección utilizando un virus fago recombinante (Sambrook ct al., supra) .

En la presente invención fueron utilizados casetes para transformar E. coli como se describe completamente en METODOS GENERALES Y EJEMPLOS.

Mutantes Además de las células ejemplificadas, se contempla que el presente método será capaz de hacer uso de células que tengan mutaciones simples o múltiples, específicamente diseñadas para aumentar la producción del 1 , 3 -propanodiol . Las células que desvían normalmente una reserva de alimentación de carbono hacia las vías no productoras, o que muestran expresión significativa de catabolitos, podrían ser mutadas para evitar estas deficiencias fenotípicas. Por ejemplo, muchas células tipo silvestre son sometidas a represión de catabolitos a partir de glucosa y los subproductos en el medio, y se contempla que las cepas mutantes de estos organismos de tipo silvestre, capaces de realizar la producción de 1 , 3 -propanodiol que son resistentes a la represión de la glucosa, podrían ser particularmente útiles en la presente invención. Los métodos para crear mutantes son comunes y bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células de tipo silvestre pueden ser expuestas a una variedad de agentes tales como radiación o mutágenos químicos y luego seleccionadas para el fenotipo deseado. Cuando se crean mutaciones a través de la radiación, puede ser utilizada ya sea radiación ultravioleta (UV) o radiación ionizante. Las longitudes de onda corta de UV adecuadas, para las mutaciones genéticas caerán dentro del intervalo de 200 nm a 300 nm, donde 254 nm es lo preferido. La radiación UV en esta longitud de onda provoca cambios dentro de la secuencia de ácido nucleico a partir de guanidina y citosina a adenina y timidina. Ya que todas las células tienen mecanismos de reparación de ADN que podrían reparar la mayoría de las mutaciones inducidas por la luz ultravioleta, los agentes tales como cafeína y otros inhibidores pueden ser agregados para interrumpir el proceso de reparación y elevar al máximo el número de mutaciones efectivas. Mutaciones de UV de onda larga utilizando luz en el intervalo de 300 nm a 400 nm, son también posibles, pero son en general no tan efectivas como la luz ultravioleta de onda corta, a no ser que se utilice en conjunto con diversos activadores tales como colorantes de psoraleno que interactúan con el ADN. La mutagénesis con agentes químicos es también efectiva para generar mutantes, y las sustancias comúnmente utilizadas incluyen productos químicos que afectan el ADN no replicante tal como HN02 y NH2OH, así como agentes que afectan la replicación del ADN tales como colorantes de acridina, notables por provocar mutaciones de cambio estructural. Los métodos específicos para crear mutantes utilizando radiación o agentes químicos, están bien documentados en la técnica. Ver, por ejemplo, Thomas D. Brock in Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. , o Deshpande, Mukund V. , Appl. Biochem. Biotechnol . 36, 227 (1992), incorporada por referencia en la presente. Después de que ha ocurrido la mutagénesis , los mutantes que tienen el fenotipo deseado pueden ser seleccionadas por una variedad de métodos. La selección aleatoria es la más común donde las células mutagenizadas son seleccionadas por la habilidad de producir el producto o intermediario deseado. Alternativamente, el aislamiento selectivo de los mutantes puede ser realizado mediante el desarrollo de una población mutagenizada sobre medios selectivos, donde únicamente pueden desarrollarse las colonias resistentes. Los métodos de selección de mutantes son altamente desarrollados y bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial. Ver por ejemplo Brock, supra; DeMancilha et al., Food Che . 14, 313 (1984). Además de los métodos para la creación de mutantes descritos anteriormente, los genes seleccionados involucrados en la conversión del sustrato de carbono a 1 , 3 -propanodiol pueden ser supra-regulados o sub-regulados por una variedad de métodos los cuales son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Es bien comprendido que la supra-regulación o la sub-regulación de un gen se refiere a una alteración en la actividad de la proteína codificada por ese gen, con relación a un nivel de actividad control, por ejemplo, por la actividad de la proteína codificada por el gen de tipo silvestre (o no alterado) correspondiente. Supra -Regulación : Los genes específicos involucrados en una vía enzimática pueden ser supra-regulados para incrementar la actividad de su o sus funciones codificadas. Por ejemplo, copias adicionales de genes seleccionados pueden ser introducidas dentro de la célula hospedera sobre plásmidos de copias múltiples tales como pBR322. Tales genes pueden también ser integrados dentro del cromosoma con secuencias reguladoras apropiadas que dan como resultado actividad incrementada de sus funciones codificadas. Los genes objetivo o diana pueden ser modificados para estar bajo el control de los promotores no nativos o los promotores nativos alterados. Los promotores endógenos pueden ser alterados in vivo mediante mutación, supresión y/o sustitución. Sub-Regulación : Alternativamente, puede ser útil el reducir o eliminar la expresión de ciertos genes con relación a un nivel de actividad dado. Para los fines de esta invención, es útil distinguir entre la reducción y la eliminación. El término "sub-regulación" de un gen se refiere a una reducción, pero no a una eliminación total, de la actividad de la proteína codificada. Los métodos de sub-regulación y desorganización de genes son conocidos por aquellos expertos en la técnica. La sub-regulación puede ocurrir mediante supresión, inserción o alteración de regiones de codificación y/o regiones reguladoras (promotoras) . Las sub-regulaciones específicas pueden ser obtenidas mediante mutación aleatoria, seguidas por selección o clasificación o, donde es conocida la secuencia del gen, mediante intervención directa por métodos de biología molecular conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un método particularmente útil, pero no exclusivo para efectuar la sub-regulación, es alterar la fuerza del promotor . Desorganización : Las desorganizaciones de los genes pueden ocurrir, por ejemplo, mediante 1) supresión de las regiones de codificación y/o las regiones reguladoras (promotoras), 2) la inserción de secuencias exógenas de ácido nucleico dentro de regiones de codificación y/o regiones reguladoras (promotoras) , y 3) la alteración de las regiones de codificación y/o las regiones reguladoras (promotoras) (por ejemplo, mediante la elaboración de cambios de pares de bases en el ADN) . Tales cambios podrían ya sea prevenir la expresión de la proteína de interés, o dar como resultado la expresión de una proteína que es no funcional. Las desorganizaciones o perturbaciones específicas pueden ser obtenidas mediante mutación aleatoria seguida por selección o clasificación o, en casos donde las secuencias génicas son conocidas, las desorganizaciones específicas pueden ser obtenidas mediante intervención directa utilizando métodos de biología molecular conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. Un método particularmente útil es la supresión de cantidades significativas de regiones de codificación y/o ' regiones reguladoras (promotoras) . Los métodos para la alteración de la expresión de la proteína recombinante son conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se discuten en parte en Baneyx, Curr . Opinión Biotehc. (1999) 10: 411; Ross et al., J. Bacterio!. (1998) 180: 5375; deHaseth, et al., J. Bacteriol . ( 1998 ) 180: 3019; Smolke y Keasling, Biotech. And Bioengineering (2002) 80: 762; S artz, Curr. Opinions Biotech. (2001) 12: 195; y Ma . et al., J. Bacteriol. (2002) 184: 5733. Alteraciones en la Vía de Producción de 1 , 3 -propanodiol Vía Enzimática Representativa. La producción del 1 , 3 -propanodiol a partir de la glucosa puede ser lograda por la siguiente serie de pasos. Esta serie es representativa de un número de vías conocidas por aquellos expertos en la técnica. La glucosa es convertida en una serie de pasos por enzimas de la vía glicolítica a dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) y 3 -fosfogl iceraldehído (3-PG) . El glicerol es luego formado ya sea mediante la hidrólisis de DHAP a dihidroxiacetona (DHA) seguido por reducción, o reducción de DHAP a glicerol -3 - fosfato (G3P) seguido por hidrólisis. El paso de hidrólisis puede ser catalizado por cualquier número de fosfatases celulares, las cuales se sabe que son no específicas con respecto a sus sustratos, o la actividad puede ser introducida dentro del hospedero mediante recombinación . El paso de reducción puede ser catalizado por una enzima hospedera ligada al NAD+ (o NADP+) o la actividad puede ser introducida dentro del hospedero por recombinación. Es notable que el reguión dha contiene una glicerol -deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.6) que cataliza la reacción reversible de la Ecuación 3.

Glicerol->3-HPA+H20 (Ecuación 1) 3-HPA+NADH+H+- l , 3 -propanodiol+NAD+ (Ecuación 2) glicerol+NAD+^DHA+NADH+H+ (Ecuación 3) El glicerol es convertido a 1 , 3 -propanodiol vía el intermediario 3 -hidroxi -propionaldehído (3-HPA) como ha sido descrito con detalle anteriormente. El intermediario 3-HPA es producido a partir de glicerol, Ecuación 1, por una enzima deshidratasa que puede ser codificada por el hospedero o puede ser introducida dentro del hospedero mediante recombinación. Esta deshidratasa puede ser glicerol -deshidratasa (E.C. 4.2.1.30), diol-deshidratasa (E.C. 4.2.1.28) o cualquier otra enzima capaz de catalizar esta transformación. La glicerol-deshidratasa, pero no la diol-deshidratasa, es codificada por el reguión dha. El 1 , 3 -propanodiol es producido a partir de 3-HPA, Ecuación 2, por una enzima hospedera ligada al NAD^ (o NADP+) o la actividad puede ser introducida dentro del hospedero mediante recombinación. Esta reacción final en la producción del 1 , 3 -propanodiol puede ser catalizada por la 1 , 3 -propanodiol -deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.202) u otras alcohol -deshidrogenasas . Mutaciones y transformaciones que afectan la canalización del carbono. Una variedad de microorganismos mutantes que comprenden variaciones en la vía de producción de 1 , 3 -propanodiol serán útiles en la presente invención. Las mutaciones que bloquean las vías alternativas para los in ermediarios de la vía de producción del 1 , 3 -propanodiol , podrían ser también útiles para la presente invención. Por ejemplo, la eliminación de la glicerol -cinasa previene que el glicerol, formado a partir del G3P por la acción de la G3P-fosfatasa, sea reconvertido a G3P a expensas del ATP. También, la eliminación de la gl icerol -deshidrogenasa (por ejemplo, gldA) previene que el glicerol, formado a partir del DHAP por la acción de la glicerol -3 -fosfato-deshidrogenasa dependiente de NADH, se convierta a dihidroxiacetona . Las mutaciones pueden ser dirigidas hacia un gen estructural para deteriorar o mejorar, la actividad de una actividad enzimática o pueden ser dirigidas hacia un gen regulador, incluyendo las regiones promotoras y los sitios de enlace al ribosoma, para modular así el nivel de expresión de una actividad enzimática.

De este modo, se contempla que las transformaciones y mutaciones pueden ser combinadas para controlar las actividades enzimáticas particulares para el mejoramiento de la producción de 1 , 3 -propanodiol . De este modo, está dentro del alcance de la presente invención el anticipar modificaciones a un catalizador celular completo que conduce a una producción incrementada de 1 , 3 -propanodiol . La presente invención utiliza una vía preferida para la producción de 1 , 3 -propanodiol a partir de un sustrato de azúcar, donde el flujo de carbono se mueve desde la glucosa hacia DHAP, G3P, glicerol, 3-HPA, y finalmente a 1,3-propanodiol. Las presentes cepas de producción han sido manipuladas mediante ingeniería genética para elevar al máximo la eficiencia metabólica de la vía mediante la incorporación de diversas mutaciones de supresión que previene la desviación del carbono hacia compuestos no productivos. El glicerol puede ser desviado desde la conversión a 3HPA mediante transformación ya sea a DHA o G3P vía la glicerol-deshidrogenasa o la glicerol-cinasa como se discutió anteriormente. En consecuencia, las presentes cepas de producción contienen mutaciones de supresión en los genes gldA y glpK. Similarmente , DHAP puede ser desviado a 3-PG por la triosafosfato- isomerasa, de este modo el presente microorganismo productor también contiene una mutación de supresión en este gen. El presente método incorpora adicionalmente una enzima deshidratasa para la conversión del glicerol a 3HPA, que funciona al unísono con el factor de reactivación, codificado por orfX y orfZ del reguión dha. Aunque la conversión de 3HPA a 1 , 3 -propanodiol es típicamente lograda vía una 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa , el presente método utiliza una actividad catalítica no específica que produce títulos mayores y rendimientos mayores del producto final, 1 , 3 -propanodiol . En tal proceso, los títulos del 1,3-propanodiol de al menos 10 g/litro son logrados, donde se esperan títulos de 200 g/litro. Alternativamente, un proceso mejorado para la producción de 1 , 3 -propanodiol puede utilizar glicerol o dihidroxiacetona como un sustrato, donde la vía comprende únicamente los últimos tres sustratos, glicerol-^3HA-^l , 3 -propanodiol. En tal proceso, la oxidorreductasa es nuevamente eliminada a favor de la actividad catalítica no específica (que se espera sea una alcohol -deshidrogenasa) , no obstante es anulada la necesidad para mutaciones de supresión por las consideraciones de energía de agregar glicerol al cultivo. En tal proceso, son alcanzados títulos de 1 , 3 -propanodiol de al menos 71 g/litro donde se esperan títulos de 200 g/litro. Similarmente , está dentro del alcance de la invención el proporcionar mutantes de microorganismos de tipo silvestre que han sido modificados mediante la supresión o mutación de la actividad de dhaT para crear productores de 1 , 3 -propanodiol mejorados. Por ejemplo, los microorganismos, los cuales contienen de manera natural todos los elementos del reguión dha, pueden ser manipulados para inactivar el gen dhaT que codifica para la actividad de 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa . Se esperará que estos microorganismos produzcan más altos rendimientos y títulos de 1 , 3 -propanodiol , mediados por la presencia de una actividad catalítica endógena, que se espera sea una alcohol -deshidrogenasa . Los ejemplos de tales microorganismos incluyen, pero no están limitadas a Klebsiella sp. , Citrobacter sp. , y Clostridium sp. Medios y Sustratos de Carbono Los medios de fermentación en la presente invención deben contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir pero no están limitados a monosacáridos tales como glucosa y fructosa y oligosacáridos tales como lactosa o sucrosa. En la presente invención, el sustrato de carbono preferido es la glucosa. Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación deben contener minerales, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes adecuados, conocidos por aquellos expertos en la técnica, adecuados para el desarrollo de los cultivos y la promoción de la vía enzimática necesaria para la producción de 1 , 3 -propanodiol . Se da atención particular a las sales de Co(II) y/o vitamina B12 o precursores de la misma. La adenosil -cobalamina (coenzima B12) es un cofactor esencial para la actividad de la deshidratasa . La síntesis de la coenzima B12 es encontrada en procariotes, algunos de los cuales son capaces de sintetizar el compuesto de novo, por ejemplo, Escherichia blattae, especies de Klebsiella, especies de Ci troJacter, y especies de Clostridium, mientras que otros pueden realizar reacciones parciales. E. coli, por ejemplo, no puede fabricar la estructura del anillo de corrina, pero es capaz de catalizar la conversión de la cobinamida al corrinoide, y puede introducir el grupo 5 ' -desoxiadenosilo . De este modo, es conocido en la técnica que un precursor de la coenzima B12 , tal como la vitamina Bi2 , necesita ser proporcionado en fermentaciones de E. coli. Las adiciones de vitamina Bi2 a las fermentaciones de E. coli pueden ser agregadas continuamente, a una velocidad constante o gradualmente para coincidir con la generación de la masa celular, o puede ser agregada en adiciones de bolo simples o múltiples. Las proporciones preferidas de la vitamina B12 (mg) alimentada a la masa celular (OD550) son de 0.06 a 0.60. Las proporciones más preferidas de la vitamina Bi2 (mg) alimentada a la masa celular (OD550) son de 0.12 a 0.48. Aunque la vitamina B12 es agregada al E. coli ¦transformado de la presente invención, se contempla que otros microorganismos, capaces de realizar la biosíntesis de vitamina B12 de novo, serán también células productoras adecuadas, y no será necesaria la adición de vitamina B12 a estos microorganismos. Condiciones de Cultivo: Típicamente, las células son desarrolladas a 35°C en medios apropiados. Los medios de crecimiento preferidos en la presente invención son medios comercialmente preparados, comunes, tales como el caldo Luria Bertani (LB) , el caldo de dextrosa de Sabouraud (SD) o el caldo de medio de Levadura (YM) . Otros medios de crecimiento definidos o sintéticos pueden ser también utilizados y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular será conocido por alguien experto en la técnica de la microbiología o la ciencia de la fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la represión de catabolitos directa o indirectamente, por ejemplo, 2 ' : 3 ' -monofosfato de adenosina cíclica, puede ser también incorporado dentro de los medios de reacción. Similarmente , el uso de agentes que se sabe modulan las actividades enzimáticas (por ejemplo, viológeno de metilo) que conducen al aumento de la producción del 1 , 3 -propanodiol , pueden ser utilizados en conjunto con o como una alternativa a las manipulaciones genéticas. Los intervalos de pH adecuados para la fermentación están entre pH 5.0 a pH 9.0, donde pH 6.0 a pH 8.0 es preferido como la condición inicial . Las reacciones pueden ser realizadas bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, donde las condiciones aeróbicas, anóxicas o anaeróbicas son preferidas, con base en los requerimientos del microorganismo. Las fermentaciones del lote alimentado pueden ser realizadas con alimentación de carbono, por ejemplo, glucosa, limitada o en exceso. Fermentaciones en Lote y Continuas: El presente proceso emplea un método de fermentación por lotes. La fermentación clásica por lotes es un sistema cerrado donde la composición del medio es ajustada al comienzo de la fermentación, y no es sometida a alteraciones artificiales durante la fermentación. De este modo, al comienzo de la fermentación, el medio es inoculado con el microorganismo o microorganismos deseados y se deja que ocurra la fermentación no agregando nada al sistema. Típicamente, no obstante, la fermentación por "lote" es con respecto a la adición de la fuente de carbono, y se realizan frecuentemente intentos para controlar los factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas por lotes las composiciones del metabolito y de la biomasa del sistema cambian constantemente hasta que el tiempo en que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lotes las células se moderan a través de una fase de retraso estático a una fase logarítmica de alto crecimiento, y finalmente una fase estacionaria donde la velocidad de crecimiento es disminuida o detenida. Si no son tratadas, las células en la fase estacionaria tarde o temprano mueren. Las células en la fase logarítmica en general son responsables del volumen de producción del producto final o el intermediario. Una variación sobre el sistema estándar por lotes es el sistema de Lote Alimentado. Los procesos de fermentación por Lote-Alimentado son también adecuados en la presente invención y comprenden un sistema típico por lotes con la excepción de que el sustrato es agregado en incrementos conforme progresa la fermentación. Los sistemas de Lote Alimentado son útiles cuando la represión del catabolito es apta para inhibir el metabolismo de las células, y donde es deseable tener cantidades limitadas del sustrato en el medio. La medición de la concentración efectiva del sustrato en los sistemas de lote alimentado es difícil, y es por lo tanto estimada con base en los cambios de los factores mensurables tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases de desecho tales como C02. Las fermentaciones por lote y por Lote Alimentado son comunes y bien conocidas en la técnica y pueden ser encontrados ejemplos en Brock, supra . Aunque la presente invención es realizada en el modo por lotes, se contempla que el método podría ser adaptable a los métodos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto donde un medio de fermentación definido es agregado continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio condicionado es removida simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua mantiene en general los cultivos a una alta densidad constante, donde las células están principalmente en el crecimiento de fase logarítmica. La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o la concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno a una proporción fija, y permitirá moderar otros parámetros. En otros sistemas un número de factores que afectan el crecimiento puede ser alterado continuamente mientras que la concentración celular, medida por la turbidez del medio, es mantenida constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener las condiciones de crecimiento en estado estable y de este modo la pérdida de células debida al medio que es gastado debe ser balanceada contra la velocidad de crecimiento de las células en la fermentación. Los métodos para la modulación de los nutrientes y los factores de crecimiento para los procesos de fermentación continua así como las técnicas para elevar al máximo la velocidad de formación del producto, son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial y una variedad de métodos son detallados por Brock, supra. Se contempla que la presente invención puede ser practicada utilizando los procesos por lotes, por lote alimentado o continuo, y que cualquier modo conocido de fermentación podría ser adecuado. Adicionalmente , se contempla que las células pueden ser inmovilizadas sobre un sustrato como catalizadores de células completas y sometidos a condiciones de fermentación para la producción de 1,3-propanodiol . Identificación y purificación de 1 , 3 -propanodiol Los métodos para la purificación del 1 , 3 -propanodiol a partir de los medios de fermentación, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los propanodioles pueden ser obtenidos a partir de los medios celulares al someter la mezcla de reacción a extracción con un solvente orgánico, destilación y cromatografía en columna (Patente de los Estados Unidos No. 5,356,812). Un solvente orgánico particularmente bueno para este proceso es el ciclohexano (Patente de los Estados Unidos No. 5, 008, 473) . El 1 , 3 -propanodiol puede ser identificado directamente al someter el medio a análisis de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) . Preferido en la presente invención es un método donde el medio de fermentación es analizado sobre una columna analítica de intercambio iónico utilizando una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01 N de una manera isocrática. METODOS GENERALES Y MATERIALES Los procedimientos para las fosforilaciones, ligaduras y transformaciones son bien conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para el uso en los siguientes ejemplos pueden ser encontradas en Sambrook, J. et al., supra . Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y desarrollo de los cultivos bacterianos son bien conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para el uso en los siguientes ejemplos pueden ser encontradas en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilo , Eugene W. Nester, illis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds) , American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) o Thomas D. Brock en Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. Todos los reactivos y materiales utilizados para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas fueron obtenidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI ) , DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a no ser que se especifique de otro modo. El significado de las abreviaturas es como sigue: "hr" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "seg" significa segundo(s), "d" significa día(s), "mi" significa mililitros, "L" significa litros, 50 amp es 50 µa/t?.? de ampicilina, y LB-50 amp, es caldo Luria-Bertani que contiene 50 µ?/p?? de ampicilina. Dentro de las tablas se utilizan las siguientes abreviaturas. "Con." es conversión, "Sel." es selectividad basada en el carbono y "nd" es no detectado. Las cepas y vectores utilizados y construidos en los siguientes ejemplos se listan en la tabla A que se muestra a continuación : Nombre Nombre Fenotipo alternativo FM5 RJF10 FM5 glpK- KLP23 FM5 glpK- gldA- W2O2001012833 A2 KLndh81 FM5 glpk- gldA- ndh- Lpts7 FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- KmR KlgalP-trc FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- KmR galpp-trc KLGG FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- KmR galpP-trc glkp-trc Nombre Nombre Fenot ipo alternativo KLGG AarcA FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- KmR galpP-trc glkp-trc arcA- KLGG AarcA Aedd FMP FM5 glpk- gldA.- ndh- ptsHlcrr. KmR galPp-trc glkp-trc arcA- edd- FMP seleccionado FMP ' : : m FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- KmR galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- FMP' : : Km 1.5 gapA FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- KmR galPp-trc glkp-trc* arcA- edd- gapA- 1.5 FMP' 1.5 gapA FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- 1.5 FMP' 1.5 gapA ??t-gsA FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- 1.5 mgsA-Nombre Nombre Fenotipo alternativo FMP' 1.5 gap Amgs Triple FM5 glpk- glcA- ndh- 1.6 ppc ptsHlcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- 1.5 mgsA- ppcp- 1.6 Triple 1.6 btuR FM5 glpk- gldA- nd - ptsHicrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp-1.5 mgsA- ppcp- 1.6 yciK- btuRp- 1.6 Triple 1.6 btuR 1.6 FM5 glpk- gldA- ndh-yqhD ptsHlcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- 1.5 mgsA- ppcp- 1.6 yciK- btuRp- 1.6 yqhC- yqhDp- 1.6 Triple 1.6 btuR 1.6 Triple FM5 glpk- gldA- ndh- yqhD AackA-pta Triple ptsHlcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- 1.5 mgsA- ppcp- 1.6 yciK- btuRp- 1.6 yqhC- yqhDp- 1.6 ackA-pta- Nombre Nom re Fenotipo alternativo Triple Triple AaldA F 5 glpk- gldA- ndh- ptsHIcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- i .5 mgsA- ppcp- 1.6 yciK-btuRp- 1.6 yqhC- yqhDp-1.6 ackA- pta-aldA- Triple Triple AaldB FM5 glpk- gldA- ndh- ptsHlcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- 1.5 mgsA- ppcp- 1.6 yciK- btuRp- 1.6 yqhC- yqhDp- 1.6 ackA- ptra- aidB- Triple Triple AaldA FM5 glpk- gldA- ndh- Aald3 ptsHlcrr- galPp-trc glkp- trc* arcA- edd- gapAp- 1.5 mgsA- ppcp- 1.6 yciK- btuRp- 1.6 yqhC- yqhDp- 1.6 ackA-pta- aldA- aldB- Cepas : KLP2 (WO 2001012833 A2 ) , RJ8. (ATCC PTA-4216) , G 1655 ATCC 700926 (comercialmente disponible) Plásmidos : pAH48 WO 9821340 Al pDT29 WO 2001012833 A2 pKP32 WO 2001012833 A2 pSYCOlOl SEQ ID NO: 65 pSYCO103 SEQ ID NO: 66 pSYCOioe SEQ ID NO: 67 pSYCO109 SEQ ID NO: 68 Los plásmidos pKD3 , pKD4 , pKD13 y pKD46, y pCP20 han sido descritos (Datsenko y Wanner, supra) . Los plásmidos pLoxCat2 y pJW168 han sido descritos (Palmeros et al., supra) . Integración Cromosómica ' para Supresiones de Genes, Reemplazos de Promotores e introducción de Mutaciones Cromosómicas Para integrar el ADN dentro de una región específica del cromosoma, se requieren la homología del ADN de inserción al sitio cromosómico objetivo, y un marcador seleccionable . Es ventajoso si el marcador puede ser fácilmente removido después de la integración. El sistema de recombinasa loxP/Cre proveniente del fago ?1 y el sistema de recombinasa FRT/Flp proveniente de levadura proporcionan un mecanismo para remover el marcador. Los sitios loxP y FRT son sitios de reconocimiento para las recombinasas Cre y Flp. Cre y Flp son recombinasas específicas del sitio, que extirpan el ADN de intervención de los sitios de reconocimiento directamente repetidos . El cásete de integración que contiene los brazos homólogos al sitio cromosómico objetivo y que codifica para un marcador seleccionable flanqueado por el sitio loxP [Palmeros et al. Gene 247, 255-264 (2000)] o FRT [Datsenko y Wanner, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 97, 6640-6645 (2000)] es transformado dentro de las células objetivo que albergan pKD46 (Datsenko y Wanner, supra) . Los integrantes exitosos son seleccionados mediante el desarrollo de las células en presencia del antibiótico. Subsecuentemente, pKD46 es curado a partir de las células y los plásmidos de recombinasa son luego introducidos dentro de los integrantes para la eliminación del gen del antibiótico. Las cepas integradas con un cásete loxP son transformadas con pJW 168 que codifica para la recombinasa Cre (Palmeros et al., supra) . Las cepas que contienen un cásete FRT son transformadas con pCP20 que codifica para la recombinasa Flp (Datsenko y Wanner, supra) . Después de la eliminación del marcador integrado, los plásmidos de recombinasa son curados a partir de la cepa. La transducción de vir de Pl fue realizada como se describió previamente [Miller, J.H., A short course in bacterial genetics. A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria (1992), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] . ENSAYOS ENZIMATICOS Ensayos para la Actividad de Glucocinasa (Glk) : La actividad de glucocinasa (Glk) fue evaluada siguiendo la conversión de la glucosa hasta glucosa- 6 - fos fato , espectrofotométricamente a 340 nm por el acoplamiento de la reacción de glucocinasa con aquella de la glucosa- 6 - fosfato-deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.49). El ensayo contenía NADP 0.5 m , ATP 5 mM, MgCl 5 mM, y 2 unidades de glucosa- 6 - fosfato-deshidrogenasa en amortiguador de fosfato 100 mM, pH 7.2. Pueden ser encontrados ensayos alternativos en T . E. Barman, Enzyme Handbook (1985) , Springer-Verlag, Berlín. Ensayo para la actividad de gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa : El ensayo para la actividad de gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa fue medido en extractos libres de células por la aparición de NADH. Un sobrenadante libre de células ultracentrifugado (50,000 x g, 1 h, 4°C) fue parcialmente purificado utilizando una columna de intercambio iónico antes del ensayo. El ensayo contenía gl iceraldehído- 3 -fosfato 0.2 mM, NAD+ 2.5 mM, EDTA 2 mM, cisteamina 5 mM, fosfato de potasio 20 mM y trietanolamina 40 mM a pH 8.9. Pueden ser encontrados ensayos alternativos en T. E. Barman, supra .

Ensayo para la actividad de fosfoenolpiruvato-carboxilasa (Ppc) : La actividad de fosfoenolpiruvato-carboxilasa (Ppc) fue medida en extractos libres de células mediante un ensayo acoplado (Flores y Gancedo, FEBS Lett. 412, 531-534 (1997)) . Este método involucró la incubación a temperatura ambiente de una muestra de extracto libre de células ultracentrifugado (50,000 x g, 1 h, 4°C) en una cubeta que contenía NADH 0.22 mM, fosfoenolpiruvato 1.1 mM (PEP) , acetil-CoA 0.25 mM, y 6 U de malato-deshidrogenasa (MDH) en amortiguador de Tris/HCl 0.1 M, pH 8.5, con bicarbonato de sodio 11 mM y sulfato de magnesio 11 mM, en un volumen total de 1.0 mi. Una velocidad antecedente de la reacción de la enzima y NADH fue primeramente determinada a 340 nm en ausencia de PEP. El segundo sustrato, PEP, fue subsecuentemente agregado y el cambio en la absorbancia con el tiempo fue adicionalmente monitorizado . La actividad Ppc fue definida al sustraer la velocidad antecedente de la velocidad bruta. Pueden ser encontrados ensayos alternativos en T . E. Barman, supra . Ensayos para las enzimas deshidratasas : La actividad de deshidratasa en los extractos libres de células fue determinada utilizando ya sea glicerol o 1,2-propanodiol como sustrato. Típicamente, los extractos libres de células fueron preparados mediante la desintegración celular utilizando una prensa french, seguido por centrifugación del desecho celular. El ensayo, basado en la reacción de aldehidos con metilbenzo-2 -tiazolona-hidrazona, ha sido descrito por Forage y Foster (Biochim. Biophys. Acta 569, 249 (1979) ) . Honda et al. (J. Bacteriol. 143, 1458 (1980)) describen un ensayo que mide la reactivación de las deshidratasas . La actividad de deshidratase fue determinada en células completas toluenizadas, con y sin ATP, utilizando ya sea glicerol o 1 , 2 -propanodiol como sustrato. La reactivación fue determinada por la proporción de formación del producto con versus sin la adición de ATP. La formación del producto (3-HPA o propionaldehído cuando se utiliza glicerol o 1 , 2 -propanodiol como sustrato, respectivamente) se midió directamente, utilizando HPLC, o indirectamente, utilizando el reactivo de metilbenzo-2-tiazolona-hidrazona . Alternativamente, se determinó la formación del producto mediante el acoplamiento de la conversión del aldehido a su respectivo alcohol utilizando una alcohol -deshidrogenasa ligada al NADH y monitorizando la desaparición del NADH. Ensayos para la 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa : La actividad de la 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa , algunas veces denominada como 1 , 3 -propanodiol -deshidrogenasa , fue determinada para los extractos libre de células en solución o en rebanadas de gel utilizando 1 , 3 -propanodiol y NAD+ como sustrato (Johnson y Lin, J. Bacteriol. 169, 2050 (1987)) . Alternativamente, se determinó la conversión de 3-HPA y NADH a 1 , 3 -propanodiol y NAD+ por la desaparición de NADH. El ensayo de gel en rebanada tiene la ventaja potencial de separar la actividad de la 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasa (dhaT) de aquella de las alcohol -deshidrogenasas no específicas en virtud de la separación por tamaño. Los pesos moleculares nativos de las 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasas (dhaT) provenientes de Cítrobacter freundii, Klebsiella pneu oniae y Clostridium pasteurianum son inusualmente grandes, del orden de 330,000 a 440,000 daltones. Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri contienen 1,3-propanodiol -oxidorreductasas asociadas a la oxidorreductasas, con propiedades similares a aquellas de las 1 , 3 -propanodiol -oxidorreductasas conocidas {dhaT) . Ensayos para la actividad de gl icerol -3 - fosfato-deshidrogenasa : Se utilizó un procedimiento como se modificó más adelante a partir de un método publicado por Bell et al. (J. Biol. Chem. 250, 7153 (1975)) . Este método involucró la incubación de una muestra de un extracto libre de células en una cubeta que contenía NADH 0.2 mM, fosfato de dihidroxiacetona 2.0 mM (DHAP) , y enzima en Tris/HCl 0.1 M, pH 7.5, amortiguador con DTT 5 mM, en un volumen total de 1.0 mi a 30°C. Fue primeramente determinada una velocidad antecedente de la reacción de la enzima y NADH a 340 nm por al menos 3 minutos. El segundo sustrato, DHAP, fue subsecuentemente agregado y el cambio de absorbancia con el tiempo fue adicionalmente monitorizado por al menos 3 minutos. La actividad de G3PDH fue definida al sustraer la velocidad antecedente de la velocidad bruta. Ensayo para la actividad de glicerol -3 - fosfatasa : El ensayo para la actividad de la enzima fue realizado mediante la incubación del extracto con un sustrato de fosfato orgánico en un bis-Tris o MES y amortiguador de magnesio, pH 6.5. El sustrato utilizado fue ya sea fosfato de 1-oc-glicerol o fosfato de d, 1-ot-glicerol . Las concentraciones finales de los reactivos en el ensayo son: amortiguador (bis-Tris 20 mM o MES 50 mM) ; cloruro de magnesio 10 mM; y sustrato 20 mM. Si la proteína total en la muestra fue baja y no ocurre la precipitación visible con un apagado con ácido, la muestra fue convenientemente evaluada en la cubeta. Este método involucró la incubación de una muestra de enzima en una cubeta que contenía sustrato 20 mM (50 µ?, 200 mM) , MES 50 mM, cloruro de magnesio 10 mM, amortiguador de pH 6.5. El volumen de ensayo final de fosfatasa fue de 0.5 mi . La muestra que contenía la enzima fue agregada a la mezcla de reacción; los contenidos de la cubeta fueron mezclados y luego la cubeta fue colocada en un baño de agua circulante a T = 37 °C por 5 a 120 minutos, la longitud de tiempo dependiendo de si la actividad de fosfatas en la muestra de enzima estuvo en el intervalo de 2 a 0.02 U/ml . La reacción enzimática fue apagada por la adición del reactivo molibdato ácido (0.4 mi) . Después se agregaron el reactivo de Fiske SubbaRow (0.1 mi) y 1.5 mi de agua destilada, la solución se mezcló y se dejó revelar. Después de 10 minutos, para permitir el desarrollo de color completo, la absorbancia de las muestras fue leída a 660 nm, utilizando un espectrofotómetro Cary 219 UV/vis. La cantidad de fosfato inorgánico liberada fue comparada a una curva estándar que fue preparada mediante el uso de una solución de fosfato inorgánico de reserva (0.65 mM) y preparando 6 estándares con concentraciones finales de fosfato inorgánico en el intervalo de 0.026 a 0.130 µ???/ml. Ensayo para la actividad de gl icerol - cinasa : Una cantidad apropiada de la enzima, típicamente un extracto crudo libre de células, se agregó a una mezcla de reacción que contenía ATP 40 m , sulfato de magnesio 20 mM, glicerol 21 mM uniformemente marcado con 13C (a 99%, Cambridge Isotope Laboratories) , y Tris-HCl 0.1 M, pH 9 por 75 minutos a 25°C. La conversión de glicerol a glicerol -3 -fosfato fue detectada mediante RMN 13C (125 MHz) : glicerol (63.11 ppm, d, J = 41 Hz y 72.66 ppm, t, J = 41 Hz) ; gl icerol - 3 - fosfato (62.93 ppm, d, J = 41 Hz; 65.31 ppm, d amplio, J = 43 Hz; y (2.66 ppm, dt, J = 6, 41 Hz) .

Ensayo de glicerol -deshidrogenasa ligado a NADH: La actividad de glicerol -deshidrogenasa ligado a NADH (gldA) en extractos libres de células provenientes de las cepas de E. coli fue determinada después de la separación de las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La conversión de glicerol más ??? a dihidroxiacetona más NADH fue aunada con la conversión del bromuro de 3 - [4 , 5 -dimetiltiazol -2 - il ] -2 , 5 -difeniltetrazolio (MTT) a un formazan profundamente coloreado, utilizando metosulfato de fenazina (PMS) como mediador (Tang et al., J. B cteriol. 140, 182 (1997)) . La electroforesis se realizó por duplicado mediante procedimientos estándares utilizando geles nativos (8-16% de TG, 1.5 mm, geles de 15 bandas de Novex, San Diego, California) . El glicerol residual fue eliminado de los geles mediante lavado 3 veces con Tris 50 niM o amortiguador de carbonato de potasio, pH 9 por 10 minutos. Los geles por duplicado fueron revelados, con y sin glicerol (concentración final de aproximadamente 0.16 M) , en 15 mi de solución de ensayo que contenía Tris 50 mM o carbonato de potasio, pH 9.60 mg de sulfato de amonio, 75 mg de NAD+, 1.5 mg de MTT, y 0.5 mg de PMS . La presencia o ausencia de la actividad de glicerol-deshidrogenasa ligada a NADH en las cepas de E. coli [gldA) fue también determinada, después de la electroforesis en gel de pol iacrilamida , mediante reacción con anticuerpos policlonales producidos para la glicerol -deshidrogenasa purificada de K. pneumoniae (dhaD) . Aislamiento e Identificación de 1 , 3 -propanodiol : Análisis de HPLC de los productos de fermentación. La conversión de la glucosa a 1 , 3 -propanodiol fue monitorizada mediante HPLC. Los análisis fueron realizados utilizando la cromatografía estándar. Un método adecuado utilizó un sistema de HPLC de Waters Alliance utilizando una detección por RI . Las muestras fueron inyectadas sobre una columna Aminex HPX87H (7.8 mra x 300 mm, Biorad, Hercules, CA) equipada con una precolumna Catión H Refill Cartridge (4.6 mm x 30 mm, Biorad, Hercules, CA) , la temperatura se controló a 50°C, utilizando ácido sulfúrico 5 mM como la fase móvil a una velocidad de flujo de 0.4 ml/minuto. El sistema fue calibrado semanalmente contra los estándares de concentración conocidos. Típicamente, los tiempos de retención de la glucosa, glicerol, 1 , 3 -propanodiol y ácido acético fueron de 12.7 min, 19.0 min, 25.2 min, y 21.5 min, respectivamente. Análisis de GC/MS de los métodos de fermentación La producción del 1 , 3 -propanodiol fue confirmada por GC/MS. Los análisis fueron realizados utilizando técnicas estándares y materiales disponibles para una persona de experiencia en la técnica de GC/MS. Un método adecuado utilizó un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 Serie II acoplado a un detector selectivo de masa Hewlett Packard de la Serie 5971 (El) y una columna HP-IN OWax (30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno, 0.25 micrómetros de espesor de película) . El tiempo de retención y el espectro de masa del 1 , 3 -propanodiol generado fueron comparados a aquellos del 1,3-propanodiol auténtico (m/e: 57, 58) . Un método alternativo para GC/MS involucró la derivatización de la muestra. A 1.0 mi de muestra (por ejemplo, sobrenadante de cultivo) se agregaron 30 µ? de ácido perclórico concentrado (70% v/v) . Después del mezclado, la muestra fue congelada y liofilizada. Se agregaron 300 µ? de una mezcla 1:1 de bis (trimetilsilil ) trifluoroacetamida : piridina al material liofilizado, se mezcló vigorosamente y se colocó a 65°C por una hora. La muestra se clarificó en material insoluble mediante centri ugación. El líquido resultante se dividió en dos pasos, la superior de la cual fue utilizada para el análisis. La muestra fue sometida a cromatografía sobre una columna DB-5 (48 , 0.25 mm de diámetro interno, 0.25 µp? de espesor de película; de J&W Scientific) y el tiempo de retención y el espectro de masa del derivado de 1,3-propanodiol obtenido a partir de los sobrenadantes de cultivo, fueron comparados a aquellos obtenidos a partir de los estándares auténticos. Los espectros de masa del 1,3-propanodiol derivatizado con TMS contienen los iones característicos de 205, 177, 130 y 115 AMU. Composición del medio El medio TM2 (TM2) es una receta básica a la cual se agregan una fuente de carbono (típicamente glucosa, a 20 g/litro o 40 g/litro) , antibióticos apropiados, y otros componentes. El medio T 2 contiene los siguientes componentes: K2HP04 (13.6 g/litro), KH2P04 (13.6 g/litro), MgS04-7H20 (2 g/litro) , ácido cítrico monohidratado (2 g/litro), citrato férrico de amonio (0.3 g/litro, ( H4)2S04 (3.2 g/litro), extracto de levadura (5 g/litro), solución de elementos en trazas (1 mi) . El pH se ajustó a 6.8. La solución de elementos en trazas contiene: ácido cítrico, H20 (4.0 g/1), MnS04-H20 (3.0 g/1), NaCl (1.0 g/1), FeS04'7H20 (0.10 g/1), CoCl2-6H20 (0.10 g/1), ZnS04-7H20 (0.10 g/1), CuS04-5H20 (0.010 g/1), H3BO3 (0.010 g/1), y Na2Mo04-2H20 (0.010 g/1). El medio T 3 (TM3) es idéntico al medio TM2 excepto que éste contiene 0.5 g/1 de extracto de levadura. El medio LB (LB) contiene 5 g/1 de extracto de levadura, 10 g/1 de triptona, y 10 g/1 de cloruro de sodio. Las placas de LB (o LA) son el medio LB + 2% de agar. El medio 2YT (2YT) contiene 10 g/1 de extracto de levadura, 16 g/1 de triptona, y 10 g/1 de cloruro de sodio. El caldo de soya con glucosa (SBG 1%) contiene 10 g/1 de Soytone (Difco) , 5 g/1 de extracto de levadura, 10 g/1 de cloruro de sodio y 10 g/1 de glucosa. Protocolo de Fermentación (14 1) Cultivos en matraz con agitación de todas las cepas descritas (KLP23, RJ8.n,. MB 1655) se desarrollaron ya sea sobre el medio 2YT o sobre el medio LB que contenía los antibióticos apropiados, como se detalla en los ejemplos, para elaborar el precultivo para la inoculación de los fermentadores . Los cultivos fueron iniciados a partir de los frascos de siembra congelados, preparados con 15% de glicerol como un crioprotector , o a partir de una colonia simple desarrollada sobre placas LA frescas con 50 mg/1 de espectinomicina . Los cultivos iniciados con un frasco congelado fueron desarrollados en 500 mi del medio especificado en un matraz de 2 litros; cuando se utilizó una colonia simple para iniciar el precultivo, ésta se colocó en 30 mi del medio especificado en un matraz protegido de 250 mi. Los cultivos fueron incubados a 34 °C y fue alcanzada una agitación de 300 rpm a una D0550 de aproximadamente 1.0 AU y se utilizó para sembrar el termentador . En algunos casos, un termentador de siembra fue utilizado para proporcionar un precultivo más grande para inocular un termentador de producción. Los termentadores de siembra fueron en general idénticos a los termentadores de producción excepto que no se agregó vitamina B12 al tanque de siembra. Detalles respecto a los procedimientos para utilizar los fermentadores de siembra se describen en los ejemplos pertinentes. Los fermentadores de siembra y de producción fueron preparados con el mismo medio, que contenían KH2P04 (7.5 g/1), MgS04-7H20 (2 g/1), ácido cítrico monohidratado (2 g/1), citrato férrico de amonio (0.3 g/1), CaCl2-2H20 (0.2 g/1), ácido sulfúrico (98%; 1.2 ml/1), Mazu DF204 (0.4 ml/1) como antiespumante, extracto de levadura (5 g/1), solución de elementos en trazas (10 ml/1) . La solución de los elementos en trazas contiene: ácido cítrico bihidratado (4.0 g/1), MnS04-H20 (3.0 g/1), NaCl (1.0 g/1), FeS04-7H20 (0.10 g/1), CoCl2-6H20 (0.10 g/1), ZnS04-7H20 (0.10 G/L) , CuS04-5H20 (0.010 g/1), H3BO3 (0.010 g/1), y Na2Mo04-2H20 (0.010 g/1). Después de la esterilización, el pH se ajustó a 6.8 con hidróxido de amonio al 20-28% y se hicieron adiciones de glucosa (a 10-25 g/1 a partir de una solución al 60-67% (p/p) ) y los antibióticos apropiados (ver ejemplos específicos para detalles. El volumen del termentador después de la inoculación fue de 6 litros. Se preparó un termentador de tanque de 14 litros, con agitación con el medio descrito anteriormente. La temperatura fue controlada a 34°C y se utilizó amoniaco acuoso (20-28% en peso) para controlar el pH 6.8. La contrapresión fue controlada a 0.5 barg y el control de dO ajustado a 5%.

Excepto para excursiones menores, la concentración de la glucosa fue mantenida entre 0 g/litro y 25 g/litro con una alimentación de 60 a 67% (p/p) . Las adiciones de vitamina Bi2 y cualesquiera otros cambios al procedimiento general descrito aquí, son anotadas en los ejemplos. El rendimiento molar, ya sea como fracción o %, representa (moles de glicerol producidos + moles de 1,3-propanodiol producidos )/ (moles de glucosa consumida) . El rendimiento en peso, en general dado como %, representa (gramos de 1 , 3 -propanodiol producidos) / (gramos de glucosa consumida) . EJEMPLO 1 CONSTRUCCIÓN DE LAS CEPAS DE E. COLI NADH DESHIDROGENASA II MENOS (Andh) PARA LA PRODUCCIÓN DE 1 , 3 - PROPANODIOL Construcción de KLndh81. Se obtuvo una mutación ndh medíante la interrupción de una región de codificación con un cásete loxP511. El gen ndh (para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096) , con las regiones flanqueantes corriente arriba (5') y corriente abajo (3'), fue amplificado por PCR a partir de E. coli MG1655 y clonado. El cásete ndh fue digerido con Stul, cortando aproximadamente en la parte intermedia del gen, y se clonó un cásete loxP511 -Cat-loxP511 dentro de este sitio con el gen cat en la dirección opuesta con relación al gen ndh. El cásete lox.P511-Cat-lox.P511 fue obtenido a partir del plásmido pLoxCat27 [SEQ ID NO: 1] por digestión con Spel y EcoRV, seguido por relleno para generar extremos romes, y purificación en gel del fragmento 1.1 kb. El sitio 2oxP511 es una variante del sitio loxP (Palmeros et al., supra) . El cásete ndh::Cat fue amplificado por PCR y sometido a electroporesis dentro de células competentes KLP23 creando la cepa KLndh81::Cm. El marcador de cloranfenicol fue removido por la recombinasa Cre (Palmeros et al., supra) dejando 96 pares de bases de la secuencia de interrupción que contenía un sitio 2o.xP511. Esta cepa fue designada KLndh81.

Alternativamente, fue obtenida una mutación ndh mediante la interrupción de la región de codificación con un cásete Cat sin los sitios loxP para dar la cepa KLNDH413. Construcción de RJ8.n Un cásete que contenía la secuencia flanqueante ndh y loxP511-Cat - loxP511 proveniente de Klndh81::Cm fue amplificado por PCR y clonado dentro de pUni/V5-His TOPO [Invitrogen] para crear pAHlll. El cásete ndh-loxP511-Cat-loxPSll proveniente de pAHlll fue integrado dentro de la cepa RJ8/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas para la resistencia al cloranfenicol . La integración exitosa del cásete dentro de ndh fue confirmada por PCR. El marcador de cloranfenicol fue removido mediante el uso de la recombinasa Cre (Palmeros et al., supra) creando la cepa RJ8.n.

EJEMPLO 2 COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE 1 , 3 -PROPANODIOL Y GLICE OL CON E. COLI CEPAS KLP23/pAH48/pDT29 Y KLP23/pAH48/pKP32 La cepa KLP23 fue transformada con los plásmidos pAH48 y pDT29 o pKP32. La producción de 1 , 3 -propanodiol (y glicerol) fue determinada en fermentadores de 14 litros como se describe en Métodos Generales. Los precultivos para cada fermentación fueron preparados utilizando frascos congelados, descongelados y desarrollados en 500 mi de medio 2YT con 200 mg/litro de carbenicilina y 50 mg/litro de espectinomicina . Los contenidos completos del matraz fueron utilizados para inocular el termentador. El termentador fue operado a 35°C y un punto de ajuste d6 de 10%; todos los otros parámetros de control son como se describe en Métodos Generales. La estrategia de vitamina B12 para cada fermentación se detalla enseguida . Fermentación con KLP23/pAH48/pDT29 En este ejemplo, la vitamina Bi2 (0.075 g/1, 500 mi) fue alimentada, comenzando 3 horas después de la inoculación, a una velocidad de 16 ml/h. Un resumen de fermentación representativo de la conversión de la glucosa a 1,3-propanodiol (1,3-PD) utilizando E. coli cepa KLP23/pAH48/pDT29 se da en la Tabla 2.1. El rendimiento del 1 , 3 -propanodiol fue de 24% en peso (gramos de 1 , 3 -propanodiol/gramos de glucosa consumida) y se obtuvo un título de 68 g/litro de 1,3-propanodiol . TABLA 2.1 Resumen de la fermentación representativa de la conversión de glucosa a 1 , 3-propanodiol (1,3-PD) utilizando E. coli cepa KLP23/pAH48/pDT29 Tiempo OD550 DO (% ) Glucosa Glicerol 1, 3-PD (h) (AU) (g/D (g/D (g/D 0 0 150 12.9 0.0 0 6 17 80 8.3 3.1 1 12 42 53 2.8 12.5 9 18 98 9 5.7 12.6 32 24 136 11 32.8 12.0 51 30 148 10 12.3 13.3 62 32 152 11 12.5 14.3 65 38 159 11 1.5 17.2 68 Se obtuvieron resultados similares con u alimentación idéntica de la vitamina Bi2 a dos veces concentración o adiciones de bolo de vitamina B12 a través del curso de tiempo de la fermentación. El titulo más alto obtenido fue de 77 g/litro. Fermentación mejorada con KLP23/pAH48/pKP32 Un resumen de la fermentación representativa de la conversión de glucosa a 1 , 3-propanodiol (1,3-PD) utilizando E. coli cepa KLP23 /pAH48 /pKP32 se da en la Tabla 2.2. La vitamina Bi? (0.150 g/1, 500 mi) fue alimentada, comenzando 3 horas después de la inoculación, a una velocidad de 16 ml/h. Después de 36 horas, se purgaron aproximadamente 2 litros de caldo de fermentación con el fin de permitir la adición continua de la alimentación de glucosa. El rendimiento de 1 , 3-propanodioi fue de 26% en peso (g de 1, 3-propanodiol/g de glucosa consumida) y se obtuvo un titulo de 112 g/1 de 1,3-propanodiol .

TABLA 2.2 Resumen de la fermentación representativa de la conversión de glucosa a 1 , 3-propanodioi (1,3-PD) utilizando E. coli cepa KLP23/pAH48/p P32 Tiempo OD550 DO (%) Glucosa Glicerol 1, 3-PD (h) (AU) (g/D (g/D (g/D 0 0 148 12.3 0.0 0 6 22 84 6.9 3.3 0 12 34 90 9.7 10.4 7 18 66 43 9.3 5.9 24 24 161 9 0.2 2.5 46 Tiempo OD550 DO (%) Glucosa Glicero (h) (AU) (g/1) (g/l) (g/l) 30 200 10 0.2 6.0 67 36 212 10 1.2 9.7 88 42 202 2 0.1 15.5 98 48 197 12 1.2 23.8 112 Se obtuvieron resultados similares con una alimentación idéntica de vitamina B12 a la mitad de la concentración o adiciones de bolo de la vitamina Bi2 a través del curso de tiempo de la fermentación. El titulo más alto obtenido fue de 114 g/lirro.

EJEMPLO 2A COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE 1, 3-PROPANODIOL Y GLICEROL CON E. COLI CEPAS RJ8 /pAH48 /pDT29 Y RJ8 /pAH48 /pKP32 Los precultivos de RJ8 /pAH48 /pDT29 y RJ8 /pAH48 /pKP32 fueron preparados utilizando frascos congelados, los cuales se descongelaron y se desarrollaron en 500 mi de 2YT con 200 mg/litro de carbenicilina y 50 mg/litro de espectinomicina . Los contenidos completos de los matraces fueron utilizados para inocular el fermentador. El fermentador fue operado a 35°C y un punto de ajuste d6 de 10%; todos los otros parámetros de control son como se describen en los Métodos Generales. RJ8 /pAH48 /pKP32 es idéntico a RJ8/pAH48/pDT29 excepto que dhaT está suprimido. La estrategia de vitamina Bi2 para cada fermentación se detalla enseguida.

Fermentación con RJ8/pAH48/pDT29 Un resumen de fermentación representativo de la conversión de glucosa a 1 , 3 -propanodiol (1,3-PD) utilizando E. coli cepa RJ8/pAH48/pDT29 se da en la Tabla 2A1. La vitamina Bi2 fue proporcionada como adiciones de bolo de 2 , 16 y 16 mg a 2, 8, y 26 horas, respectivamente. El rendimiento de 1,3-propanodiol fue de 35% en peso (g de 1 , 3 -propanodiol/g de glucosa consumida) y se obtuvo un título de 50.1 g/litro de 1 , 3 -propanodiol .

TABLA 2A.1 Resumen de fermentación representativo de la convers glucosa a 1 , 3-propanodiol (1,3-PD) utilizando E. col RJ"8/pAH48/pDT29 Tiempo OD550 DO (%) Glucosa Glicerol 1, 3-PD (h) (AU) (g/D (g/D (g/D 0 0 140 10.6 0.1 0.0 6 5 107 11.1 0.5 0.4 Tiempo OD550 DO (%) Glucosa Glicerol 1, 3-PD (h) (AU) (g/D (g/D (g/D 10 16 90 8.5 1.7 1.3 14 25 86 1.8 2.4 5.9 19 38 53 3.5 5.9 15.4 25 53 38 0.1 9.2 26.7 31 54 10 4.5 7.4 39.0 37 37 23 17.2 6.0 45.0 43 21 13 9.9 7.7 50.1 Fermentación mejorada con RJ8 /pAH 8 /p P32 Un resumen de fermentación representativo de la conversión de glucosa a 1 , 3-propanodiol (1,3-PD) utilizando E. coli cepa RJ8 /pAH48/pKP32 se da en la Tabla 2A.2. La vitamina B12 fue proporcionada como adiciones de bolo de 48 y 16 mg a aproximadamente 26 y 44 horas, respectivamente. El rendimiento de 1 , 3-propanodiol fue de 34% en peso (g de 1,3-propanodiol/g de glucosa consumida) y se obtuvo un titulo de 129 g/1 de 1 , 3-propanodiol .

TABLA 2?.2 Resumen, de fermentación representativo de la conversión mejorada de glucosa a 1 , 3-propanodiol (1,3-PD) utilizando E. coli cepa RJ8 /pAH48 /pKP32 Tiempo OD550 DO (%) Glucosa Glicerol 1, 3-PD (h) (AU) (g/D (g/D (a/1) 0 0 150 12 .6 0. 1 0 6 12 113 o . 0 2. 6 0 12 24 99 0. 0 10 .6 0 18 51 76 2. 4 28 .9 0 24 78 82 2. 4 44 .2 5 30 114 70 3. 8 26 .9 33 36 111 72 0. 0 20 .0 57 42 139 65 0. 1 21 .9 69 48 157 36 0. 1 22 .4 79 55 158 25 0. 2 21 .4 94. 64 169 14 0. 1 15 .8 113 72 169 12 0. 1 13 .4 119 74 162 14 0. 1 14 .8 129 Producción de 1 , 3 -propanodiol y glicerol con E. coli cepa RJ8.n/pAH48/pKP32 La cepa RJ8. n fue transformada con los plásmidos pAH48 y pKP32. La producción de 1 , 3 -propanodiol (y glicerol) fue determinada en fermentadores de 14 litros como se describe en Métodos Generales. Un frasco congelado de RJ8. n/pAH48/pKP32 fue descongelado y transferido a 500 mi de medio LB con 200 mg/1 de carbenicilina y 50 mg/1 de espectinomicina para preparar el precultivo. El cultivo fue transferido a un termentador de siembra y desarrollado por 16 horas antes de que se transfiriera 1 litro del cultivo al termentador de producción. A este tiempo, la OD550 había alcanzado más de 50 AU y 30 g/1 de glicerol se habían acumulado en el caldo. Los termentadores de siembra y de producción fueron operados a 35°C y un punto de ajuste d6 de 10%; todos los otros parámetros de control son como se describen en Métodos Generales. La vitamina B12 fue agregada al tanque de producción en bolos de 16 mg a 12 h, 17.3 h, 22.8 h, y 27.5 h. El título final fue de 112.7 g/1 de 3G y el rendimiento en masa fue de 31.6%. EJEMPLO 3 CONSTRUCCIÓN Y FUNCIONAMIENTO DE MATRAZ DE AGITACION DE UNA CEPA DE E . COLI CON UNA SUPRESIÓN EN EL REGULADOR GLOBAL arcA Una supresión de arcA [por referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] fue realizada mediante el reemplazo de 0.6 kb de la región de codificación con el cásete FRT-CmR-FRT de pKD3. Un cásete de reemplazo fue amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 utilizando pKD3 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 2 contiene 41 pares de bases de homología al extremo 5' de arcA y 20 pares de bases de homología a pKD3. El cebador SEQ ID NO: 3 contiene 42 pares de bases de homología al extremo 3' de arcA y 20 pares de bases de homología pKD3. El producto de PCR fue purificado en gel y sometido a electroporesis en células competentes G 1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas de LB con 12.5 mg/1 de cloranfenicol . La supresión del gen arcA fue confirmada mediante PCR , utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 0.7 kb mientras que la cepa recombinante da un producto de PCR característico de 1.1 kb. La cepa ha sido designada G1655 AarcA: :Cm. Se preparó un lisado Pl y se utilizó para mover la mutación hacia la cepa KLndh81 para formar KLndh81 AarcA::Cm. La cepa KLndh81 AarcA::Cm y la cepa de control KLndh81 fueron electrotransformadas con el plásmido pSYCOlOl. Una colonia de cada cepa fue incubada 10 horas en medio LB con 50 mg/1 de espectinomicina . Un volumen de 200 µ? de estos cultivos fue luego transferido a un matraz Erlenmeyer protegido de 250 mi que contenia 10 mi de medio TM2 con 40 g/1 de glucosa, 50 rag/1 de espectinomicina y 2 mg/1 de vitamina Bi2- Los matraces fueron incubados a 300 rpm y 34°C por 40 horas. Los resultados en la Tabla 3 muestran que la mutación de arcA mejora el rendimiento molar de la producción de glicerol y 1 , 3-prcpanodiol . TABLA 3 Producción de glicerol y 1 , 3-propanodiol en las cepas de E. coli control y AarcA::CM Cepa Glicerol (g/1) 1 ,3-propanodiol DO 550 nm Rendimiento Molar (g/1) (mol/mol) KLndh81 578 10.7 29.2 0.87 pSYCOlOl KLndh81 6.8 11.4 25.9 0.95 AarcA pSYCOlOl EJEMPLO 4 CONSTRUCCIÓN DE LAS CEPAS DE E. COLI DEL SISTEMA DE FOSFOTRANSFERASA MENOS (PTS~) CON LOS PROMOTORES TRC QUE CONTROLAN LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DEL SIMPORTADOR DE GALACTOSA-PROTONES (galP) Y GLUCOCINASA (glk) Construcción del cásete loxP-CAT- loxP-Trc (pTrCm42) El ADN lineal fue obtenido a partir del plásmido pTrc99a (Pharmacia) y digerido con Hindlll y Ncol , rellenado con la ADN-polimerasa T4 , circularizado y transformado dentro de E. coli TOP-10 (Invitrogen, Carlsbad, California). Después de la selección sobre placas de agar Luria que contenían 50 mg/1 de carbenicilina , el plásmido resultante (pTrcl) fue purificado y sometido a análisis de enzima de restricción para confirmar que la región de ADN originalmente presente entre Hindlll y Ncol estaba ausente. El sitio BspMl único en pTrcl (corriente arriba (5') de la región -35 del promotor trc) se utilizó para insertar un cásete que contenía un gen de resistencia al cloranfenicol (CAT) flanqueado por los sitios loxP. El ADN lineal fue obtenido a partir de pTrcl digerido con BspMl, purificado en gel utilizando un equipo de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) , rellenado con la ADN-polimerasa T4 y ligado a un cásete 1oxP-Cat - loxP. El cásete loxP-Cat - loxP fue obtenido a partir del plásmido pLoxCatl, ver SEQ ID NO: 6, mediante digestión con Stul y Barríñl . pLoxCatl es similar a pLoxCat2 (Palmeros et al., supra . La mezcla de ligadura fue transformada dentro de E. coli TOP-10 (Invitrogen) y la selección fue realizada sobre placas de agar Luria que contenía 50 g/1 de carbenicilina y 20 mg/1 de cloranfenicol . El plásmido fue obtenido y se realizó el análisis de enzimas de restricción. Dos plásmidos, que contenían loxP-Cat- loxP-Trc con el cásete 1oxP-Cat - loxP en la misma y en la orientación opuesta al promotor trc, fueron designados pTrCm41 y pTrCm42, respectivamente. Construcción de una plantilla de reemplazo del promotor trc para galP (pR6Kga!P) . Un cásete de ADN que contenía el promotor trc y el operador lac con un cásete 1oxP-Ca - loxP corriente arriba (5') fue amplificado por PCR a partir de pTrCm42 utilizando el par de cebadores corriente arriba (5') SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. El par de cebadores incorpora 40 pares de bases de homología hacia la región corriente arriba (5') de galP hacia cada extremo del producto de PCR. Los parámetros de PCR fueron 95°C por 1 min; 55°C por 1 min; 72°C por 2 min, 30 ciclos utilizando la polimerasa Tag (Roche) . El producto fue subclonado dentro de Echo pUni/His 5 R6K (Invitrogen) para generar el plásmido pR6KgalP. Construcción de una plantilla de reemplazo del promotor trc para glk (pR6Kglk) . Un cásete de ADN que contenía el promotor trc y el operador lac con un cásete 1oxP-Cat - loxP corriente arriba (5') fue amplificado a partir de pTrCm42 mediante PCR utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. El par de cebadores SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 incorpora 39 (con una supresión de una sola base) y 40 pares de base de homología, respectivamente, a la región corriente arriba (5') glk hacia cada extremo del producto de PCR. Los parámetros de PCR fueron 95°C por 1 min; 55°C por 1 min; 72°C por 2 min, 30 ciclos utilizando la polimerasa Taq (Roche) . El producto fue subclonado dentro de Echo pUni/His5 R6K (Invitrogen) para generar el plásmido pR6Kglk. Construcción de una cepa de E. coli AptsHlcrr (KLpts7) . Un derivado PTS menos (AptsHlcrr) de E. coli cepa KLndh81 fue obtenido mediante transducción de Pl vir utilizando un derivado de E. coli cepa NF9 como donador (Flores et al., Nature Biotechnology 14, 620-623 (1996)). La transducción reemplaza, el operón que comprenden ptsH, ptsl y crr con un marcador de resistencia al antibiótico kanamicina (Levy et al., Gene 86, 27-33 (1990)) para dar la cepa KLpts7. La siembra en placas sobre agar de MacConkey (lactosa") + 1% de glucosa, de KLpts7 muestra un fenotipo de colonias blancas. Reemplazo del promotor galP natural con el promotor trc sintético (KLgalP-trc) Un producto de amplificación por PCR que comprende un cásete loxP-Cat- loxP-Trc y que incorpora 40 pares de bases de homología a la región corriente arriba de galP [para referencia, ver GenBank, Acceso # U000096] a cada extremo fue generado utilizando la ARN-pol imerasa rTt (Perkin Elmer) , pR6KgalP como la plantilla y el par de cebadores SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. El cásete de integración amplificado por PCR fue transformado en células KLpts7 electro-competentes que contenían pKD46 para la integración utilizando el sistema lambda Red como se describe en Datsenko y Wanner, supra . La selección fue realizada sobre placas de LB que contenían 10 mg/1 de cloranfenicol . La integración exitosa de este cásete reemplaza la región de 38 a 181 pares de bases corriente arriba (5') del codón de inicio ATG de galP (para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096) con el cásete 2oxP-Cat - loxP-Trc (SEQ ID NO: 11) para proporcionar la cepa KLpts : :galP-trc . La integración fue confirmada mediante análisis de PCR utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (amplificando el sitio de integración para dar un producto de 1.4 kb) y el par de cebadores SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 (amplificando el sitio de integración, incluyendo las regiones corriente arriba (5') y corriente abajo (3'), para dar un producto de 2.1 kb) . Los parámetros de PCR fueron 95°C por 1 min; 55°C por 1 min 72°C por 2 min, 30 ciclos utilizando la polimerasa Taq o la polimerasa rTt . KLpts : :galP-trc , sembrado en placas sobre agar de MacConkey (lactosa") + 1% de glucosa, muestra un fenotipo de colonias rojo claro. El marcador de cloranfenicol fue removido como se describe por Palmeros et al., supra. La eliminación fue confirmada mediante análisis por PCR utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 (para dar un producto de 1.1 kb) y la cepa resultante fue diseñada KLgalP-trc.

Reemplazo del promotor glk natural con el promotor trc sintético (KLGG) Un producto de amplificación por PCR que comprende el cásete loxP-Cat-loxP-Trc y que incorpora aproximadamente 40 pares de bases de homología a la región corriente arriba de glk [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] a cada extremo, se generó utilizando una ARN-polimerasa rTt (Perkin Elmer) , pR6Kglk como la plantilla, y el par de cebadores SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. El cásete de integración amplificado por PCR fue transformado dentro de células KLgalP-trc electro-competentes que contenían pKD46 para la integración utilizando el sistema lambda Red como se describió anteriormente. La selección fue realizada sobre placas de LB que contenían 10 mg/1 de cloranfenicol . La integración exitosa de este cásete reemplaza la región de 40 a 137 pares de bases corriente arriba del codón de inicio ATG de glk (para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096) con un cásete loxP-Cat-loxP-Trc (SEQ ID NO: 11) . La integración fue confirmada mediante análisis por PCR utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 (amplificando el sitio de integración, incluyendo las regiones corriente arriba (5') y corriente abajo (3') , para dar un producto de 2.4 kb) . Las colonias en placa sobre agar de MacConkey (lactosa") + 1% de glucosa, muestran un color rojo profundo, indicando un incremento en la conversión de la glucosa a ácido en comparación al progenitor (KLgalP-trc) . El marcador de cloranfenicol fue removido como se describió anteriormente y el análisis de PCR subsecuente (utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 para dar un producto de 1.3 kb) dio la cepa KLGG. Supresión del gen arcA, que codifica para un regulador global (KLGG AarcA) Un lisado de Pl de la cepa MG1655 AarcA: : Cm se preparó y se utilizó para mover la mutación hacia la cepa KLGG. Un clon resultante resistente al cloranfenicol , KLGG AarcA: :Cm, fue verificado mediante PCR genómica para asegurar que la mutación estuviera presente. El marcador de resistencia al cloranfenicol fue removido utilizando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) y esta cepa ha sido designada KLGG AarcA. Supresión del gen edd, que codifica para el gen de la 6-fosfogluconato-deshidratasa (KLGG .AarcA Aedd, también designado FMP) Una supresión de edd [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] se obtuvo mediante el reemplazo de 1.7 kb de la región de codificación con el cásete loxP-Cat- loxP proveniente de pLoxCat2. Un cásete de reemplazo fue amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17. El cebador SEQ ID. NO: 16 contiene 80 pares de bases de homología hacia el extremo 5' de edd y 18 pares de bases de homología hacia la plantilla pLoxCat2. El cebador SEQ ID NO: 17 contiene 78 pares de bases de homología hacia el extremo 3' de edd y 19 pares de bases de homología a pLoxCat2. El producto de PCR fue purificado en gel y sometido a electroporesis dentro de células competentes para KLGG AarcA/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas de LB con 12.5 mg/1 de cloranfenicol . La supresión del gen edd fue confirmada mediante PCR utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 2.2 kb mientras que el recombinante da un producto de PCR característico de 1.6 kb. Esta cepa ha sido designada KLG AarcA Aedd::cat. El marcador de cloranfenicol fue removido utilizando la recombinasa Cre (Palmeros et al., supra) y esta cepa ha sido designada KLGG AarcA Aedd o, alternativamente, FMP. Selección y caracterización de una cepa de FMP que muestra una proporción aumentada de consumo de glucosa Invariablemente, las células que comprenden AptsHlcrr, el reemplazo del promotor trc del promotor galP natural, y el reemplazo del promotor trc del promotor glk natural (las tres modificaciones como se describen en el Ejemplo 4) inicialmente mostraron desarrollo lento. También invariablemente, una selección subsecuente (como se describe más adelante) condujo a un derivado de desarrollo más rápido. La actividad de glucocinasa, evaluada a partir de los extractos libres de células, fue típicamente tres veces mayor para el derivado de crecimiento más rápido, en comparación al progenitor de crecimiento más lento. E. coli cepa FMP, transformada con el plásmido pSYCO103, se desarrolló en un termentador de 14 1 esencialmente como se describe en el Ejemplo 2. Los frascos para el almacenamiento a -80°C (reservas de 15% de glicerol) fueron elaborados en el curso de la fermentación. Una placa de LB fue rayada a partir de la alícuota tomada a las 33 horas (OD550 fue de 30.7 AU) y las colonias simples fueron recuperadas y designadas "FMP/pSYCOl 03 seleccionadas". Las colonias simples fueron similarmente obtenidas a partir de la cepa FMP que no contenía plásmido y designada "FMP seleccionada" . Los genes galP y glk, incluyendo la región introducida del promotor trc, fueron amplificadas por PCR a partir de dos colonias de "FMP/pSYCO103 seleccionada" y una colonia de "FMP seleccionada" utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 13 y el par de cebadores SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 15, respectivamente. El análisis secuencial sobre estas tres muestras fue realizado utilizando los mismos cebadores. En cada caso, el gen galP y la región promotora permanecieron sin cambio de la cepa progenitora, mientras que el gen glk y la región promotora contenían un cambio de par de bases simple, idéntico, cuando se compararon a la cepa progenitora. Los dos aislados de "FMP/pSYCO103 seleccionada" y un aislado de "FMP seleccionada" contenían la secuencia identificada como SEQ ID NO: 20 en la región -35 a -10 del promotor trc que controla la expresión de glk en comparación a la secuencia progenitora correspondiente SEQ ID NO: 21. La cepa que se origina de "FMP seleccionada" a partir de la cual se obtuvo la secuencia galP y de glk fue designada cepa FMP' : :Km.

EJEMPLO 5 EJEMPLOS COMPARATIVOS DE FERMENTACIONES DE GLUCOSA A 1,3- PROPANODIOL UTILIZANDO LAS CEPAS FMP/pSYCO103 Y FMP' : :Km/pSYCO103 Las cepas FMP y FMP' : : Km fueron transformadas con el plásmido pSYCO103. La producción de 1 , 3 -propanodiol fue determinada en termentadores de 14 litros como se describe en los Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control o el termentador. Un frasco congelado de FMP/pSYCO103 fue descongelado y luego transferido a 500 mi de 2YT con 50 mg/litro de espectinomicina para preparar el precultivo. El punto de ajuste do fue de 15%. Se agregó vitamina B12 al termentador en bolos de 16 mg a las 30, 43 y 51 horas.

Un frasco congelado de FMP ' : : m/pSYC0103 fue descongelado y luego transferido a 500 mi de SBG al 1% con 50 mg/1 de espectinomicina para preparar el precultivo. Se agregó vitamina Bi2 al termentador en bolos de 16 mg a las 21, 40 y 40.5 horas . La Figura 1 muestra la producción del 1,3-propanodiol por FMP' : : Km/pSYCO103 que es más rápido que por FMP/pSYCO103.

EJEMPLO 6 EXPRESIÓN ALTERADA POR INGENIERIA GENETICA DE LA GLICERALDEHIDO-3 -FOSFATO-DESHIDROGENASA (gapA) EN CEPAS DE E. COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE 1 , 3 - PROPANODIOL A PARTIR DE GLUCOSA Disminución de la expresión de GapA mediante la alteración del codón de inicio El nivel de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, GapA, fue disminuido mediante el reemplazo del codón de inicio ATG del gen gapA con un codón de inicio GTG o TTG. El gen gapA de E. coli más la secuencia flanqueante corriente arriba (5') y corriente abajo (3') fue amplificado mediante PCR a partir de E. coli cepa MG1655 utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. El producto de PCR fue clonado directamente a partir de la reacción de PCR dentro de pCR-BluntlI-TOPO (Invitrogen) para formar pDT50.

Los plásmidos pDT50 y pLitmus 28 (New England Biolabs, Inc.) fueron digeridos con Sphl y BarriHI y el fragmento del gen gapA y el vector, respectivamente, fueron purificados en gel y ligados. El plásmido resultante, pDT51, fue transformado dentro de E. coli TOP10 (Invitrogen) . Los plásmidos mutantes de gapA fueron construidos utilizando el Método de Mutagenesis Dirigida al Sitio de 1 Día Stratagene QuickChange (Stratagene, La Jolla, California). El plásmido plantilla, pDT51, fue mezclado ya sea con el par de cebadores SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25 para crear la mutación GTG o con el par de cebadores SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 para crear la mutación TTG. Después de la amplificación por PCR, las reacciones fueron digeridas con Dpnl para remover el plásmido plantilla y dejar únicamente los plásmidos amplificados. Los plásmidos fueron transformados luego dentro de E . coli TOP10 (Invitrogen) . Las construcciones gapA-GTG y gapA-TTG fueron amplificadas por PCR utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. Los productos de PCR fueron sometidos a electroporesis dentro de la cepa suprimida en el gen de gapA, KLP23A112. E. coli cepa KLP23A112 fue construido mediante la transducción de KLP23 con un lisado del fago Pl obtenido a partir de E. coli DS112 (E. co2i Genetic Stock Center) , una cepa de supresión en gapA que contiene un marcador CmR. Los recombinantes fueron seleccionados para el desarrollo sobre placas LB sin glucosa agregada y sensibilidad al cloranfenicol . El secuenciamiento confirmó la integración exitosa de las mutaciones GTG y TTG. Las cepas mutadas fueron nombradas KLPAGTG y KLPATTG, respectivamente. La medición de las actividades de GapA en las cepas KLPAGTG y KLPATTG mostraron que los niveles de GapA fueron de 4% y <1¾ de la cepa control KP23, respectivamente. Las cepas KLP23, KLPAGTG y KLPATTG fueron transformadas con el plásmido pSYCOlOl y probadas para la producción de 1 , 3-propanodiol en el medio TM2 que contenia 40 g/i de glucosa, 50 mg/1 de espect inomicina , y 1 mg/1 de vitamina B12. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Resumen de matraces de agitación representativos de la conversión de glucosa a 1 , 3-propanodiol utilizando E. coli cepas KLP 23/pSYCO101, KLP AGTG/pSYCOl 01 , y KLPATTG/pSYCOl 01 Cepa Glicerol 1,3- Rendimiento (g/1) propanodiol Molar (g/1) (mol/mol) KLP23 pSYCOlOl 578 10.7 0.87 KLPAGTG pSYCOlOl 0.7 1.3 0.11 KLPATTG pSYCOlOl 0.2 0.4 0.04 Alteración de la expresión de GapA mediante el reemplazo del promotor El reemplazo del promotor gapA natural con el promotor 1.5 GI corto sintético (SEQ ID NO: 28) fue realizado mediante el reemplazo de 225 pares de bases de la secuencia gapA corriente arriba (5') [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] con FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado por ingeniería genética. El cásete de reemplazo fue amplificado por PCR con el par de cebadores SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 utilizando pKD3 como una plantilla. El cebador SEQ ID NO: 29 contiene 39 pares de bases de homología a gapA incluyendo el inicio ATG, contiene el promotor corto 1.5 GI y contiene 20 pares de bases de homología a la plantilla p D3. El cebador SEQ ID NO: 30 contiene 59 pares de bases de homología a la secuencia gapA corriente arriba (5') y 21 pares de bases de homología a pKD3. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de células competentes MG1655/pKD46 para dar G1655 1.5gapA : : Cm. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas LB con 12.5 mg/1 de cloranfenicol . La integración exitosa del cásete reemplaza la región de 34-258 pares de bases corriente arriba del codón de inicio ATG de gapA con un cásete FRT-CmR-FRT-promotor corto 1.5 GI . Se preparó un lisado del fago Pl y se utilizó para mover la mutación para F P'::Km. Esta cepa fue designada FMP ' : : Kml .5gapA : : Cm.

El promotor de gapA corto 1.5 GI en G1655 1.5gapA::Cm fue reemplazado con el promotor corto 1.20 GI (SEQ ID NO: 31) o el promotor corto 1.6 GI (SEQ ID NO: 32) . Para crear la cepa 1.20 gapA, un cásete de reemplazo fue amplificado por PC con el par de cebadores SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 utilizando el ADN genómico proveniente de MG1655 1.5gapA::Cm como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 33 contiene 24 pares de bases de homología a la región corriente arriba (5') de gapA. El cebador SEQ ID NO: 34 contiene homología a la región corriente arriba (5') en MG1655 1.5gapA: : Cm y contiene el promotor corto 1.20 GI . Para crear la cepa 1.6gapA, un cásete de reemplazo fue amplificado por PCR con el par de cebadores SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 35 utilizando el ADN genómico proveniente de MG1655 1.5gapA: : Cm como plantilla. El cebador SEQ ID NO: 35 contiene homología para la región corriente arriba (5') de gapA en MG1655 1.5gapA::Cm y contiene el promotor corto 1.6 GI . El cásete de reemplazo del promotor corto 1.20 GI y el cásete de reemplazo del promotor corto 1.6 GI fueron utilizados para reemplazar el promotor gapA natural de MG1655 como se describe anteriormente para dar las cepas MG1S55 1.20gapA::Cm y MG1655 1.6gapA::Cm, respectivamente. G1655 1.20gapA::Cm y MG1655 1.6gapA::Cm fueron utilizados para reemplazar el promotor gapA natural de la cepa F P ' : : Km (utilizando la transducción de Pl como se describió anteriormente) para dar las cepas FMP'::Km 1.20gapA::Cm y FMP' : :Km 1.6gapA::Cm, respecti amente. Las actividades de gliceraldehído-3-fosfaio-des idrogenasa fueron determinadas utilizando los extractos libres de células preparados a partir de las cepas FMP' :: Km 1.20gapA: :Cm, FMP':: Km 1.5gapA::Cm, FMP' :: Km 1.6gapA::Cm y FMP' : : Km como control. Los valores obtenidos, comparados a aquellos del control fueron de 10%, 251 y 140% para las cepas FMP': : Km 1.20gapA : : Cm, FMP' :: Km 1.5gapA::Cm, FMP' :: Km 1.6gapA::Cm, respectivamente. Las cepas que contenían los reemplazos del promotor GI fueron transformados con el plásmido pSYCO106 y comparadas a la cepa progenitora para la producción de 1 , 3-propanodiol en el medio TM2 que contenía 20 g/1 de glucosa, 50 mg/1 de espectinorr.icina , y 1 mg/l de vitamina Bi2. Los resultados se muestran en la Tabla 5. TABLA 5 Resumen de los matraces de agitación representativos de las cepas gapA promotoras de FMP' : : Km GI transformadas con el plásmido pSYCO106 Cepa Glicerol 1,3- Rendimiento (g/1) propanodiol Molar (g/1) (mol/mol) FMP' : Km/pSYCO106 6.8 07 FMP' : Km 1.6gapA/pSYCO106 3.3 92 FMP' : Km 1.5gapA/pSYCO106 3.6 21 Cepa Glicerol 1,3- Rendimiento (g/1) propanodiol Molar (g/1) (mol/mol) FMP' ::Km 1.20gapA/pSYCO106 7.6 2.8 1.26 EJEMPLO 7 ELIMINACION DE LOS MARCADORES A PARTIR DE FMP' ::Km 1.5qapA::Cm El marcador de cloranfenicol fue removido de la cepa FMP' : :Km 1.5gapA::Cm (como se describe en la sección de Métodos Generales) para dar las cepas FMPr : :Km 1.5gapA. El marcador de kanamicina introducido dentro de FMP' : :Km 1.5gapA como una consecuencia de la elaboración de KLndh81 PTS menos (AptsHlcrr) fue reemplazado con un cásete FRT-cm-FRT removióle mediante transducción de Pi a parrir de MG1655 AptsHlcrr : : Cm . Una supresión ptsHlcrr en MG1655 fue realizada con un cásete de reemplazo amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55 utilizando pKD3 como plantilla. El cebador SEQ ID NO: 54 contiene 78 pares de bases de homología a la región remanente de ptsH dejada en el cromosoma de la cepa FMP' ::Km 1.5gapA y 20 pares de bases de homología a pKD3. El cebador SEQ ID NO: 55 contiene 77 pares de bases de homología a la región remanente de crr en la cepa FMP' ::Km 1.5gapA y 20 pares de bases de homología a pKD3. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de células componentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas LB con 12.5 mg/l de cloranfenicol . El análisis de PCR confirmó la integración del cásete. Sembrado en placas sobre agar MacConkey (lactosa") + 1% de glucosa, MG1655 AptsHlcrr : : Cm muestra, un fenotipo de colonias blancas. Un lisado del fago Pl fue preparado y el marcador Cm transducido dentro de FMP':: Km 1.5gapA. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre cloranfenicol y el análisis de PCR confirmó la integración exitosa del cásete. El marcador de cloranfenicol fue removido utilizando la recombinasa Flp y el secuenciamiento (utilizando el cebador SEQ ID NO: 56) confirmó la eliminación del marcador de cloranfenicol . La cepa resultante fue designada FMP' 1.5gapA.

EJEMPLO 8 DEMOSTRACIÓN DEL ALTO RENDIMIENTO DEL 1,3- PROPANQDIOL A PARTIR DE LA GUCLOSA UTILIZANDO E. COL! CEPA FM ' 1.5gapA/pSYC0106 La cepa FMP' 1.5gapA fue transformada con el plásmido pSYCO106. La producción de 1 , 3 -propanodiol y glicerol fue determinada en termentadores de 14 litros como se describe en la sección Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para el termentador. Un frasco congelado de FMP' 1.5gap/pSYC0106 fue descongelado y luego transferido a 500 mi de SBG1¾ con 50 mg/l de espectinoraicina para preparar el precultivo. Se agregó vitamina B12 al termentador en bolos de 16 mg antes de la inoculación y a las 28 horas. La concentración final de 1,3-propanodiol fue de 129 g/1 y el rendimiento en masa fue de 40.2%.

EJEMPLO 9 MANIPULACIÓN POR INGENIERIA GENETICA DE UN MUTANTE METILGLIOXAL-SINTASA {mgsA) EN E. COLI La supresión de mgsA [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] fueron realizadas mediante el reemplazo de 0.4 kb de la región de codificación con el cásete FRT-Kan-FRT de pKD4. Un cásete de reemplazo fue amplificado por PCR con el par de cebadores SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 utilizando pKD4 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 36 contiene 40 pares de bases de homología al extremo 5' de mgsA y 20 pares de bases de homología a la plantilla de ADN, pKD . El cebador SEQ ID NO: 37 contiene 40 pares de bases de homología al extremo 3' de mgsA y 20 pares de bases de homología pKD4. El producto de PCR fue purificado en gel y sometido a electroporesis en células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas LB con 12.5 mg/1 de kanamicina. La supresión del gen mgsA fue confirmada mediante PCR, utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 1.3 kb mientras que la cepa recombinante da un producto de PCR característico de 2.4 kb. Esta cepa ha sido designada MG1655 AmgsA: :kan. Una vez que el mutante de mgsA fue obtenido en MG1655, se preparó un lisado del fago Pl y se utilizó para mover la mutación hacia FMP' 1.5gapA (Ejemplo 8) . El marcador de resistencia a la kanamicina fue removido utilizando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) y esta cepa ha sido designada FMP' 1.5gapA AmgsA. FMP' 1.5gapA AmgsA y su progenitor fueron transformados con el plásmido pSYCO106 para dar FMP' 1.5gapA AmgsA/pSYCO106 y FMP' 1.5gapA/pSYCO106, respectivamente. Las cepas fueron probadas para la producción de 1 , 3-propanodiol en el medio TM2 que contenía 20 g/1 de glucosa, 50 mg/1 de espectinomicina , y 1 mg/1 de vitamina Bi2. Los resultados se muestran en la Tabla 6. TABLA 6 Resumen de matraces de agitación representativos de las cepas FMP' 1.5gapA/pSYCO106 y FMP' 1.5gapA AmgsA/pSYCOl 06 Cepa Glicerol 1 ,3- Rendimiento (g/1) propanodiol Molar (g/1) (mol/mol) F P ' 1.5gapA/pSYCO106 6.6 3 ß 1.21 FMP' 1.5gapA AmgsA/pSYCO106 8-3 2.4 1.26 COLI CEPA FMP ' 1.5gapA AmgsA/pSYCOl 06 La cepa FMP' 1.5gapA AmgsA fue transformada con el plásmido pSYCO106. La producción de 1 , 3 -propanodiol (y glicerol) fue determinada en termentadores de 14 litros como se describe en la sección de Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para los fermentadores . Una colonia simple proveniente de una placa fresca (LA con 50 mg/1 de espectinomicina) de FMP' 1.5gapA AmgsA/pSYCO106 se transfirió a 30 mi de LB con 100 mg/1 de espectinomicina en un matraz de 250 mi para preparar el precultivo. Después de la incubación a 34 °C y a 300 rpm a una OD50o de 1 AU, se transfirieron 10.8 mi del cultivo al fermentador. El fermentador fue corrido con limitación de glucosa durante gran parte de la corrida. Se agregó vitamina ¾2 al fermentador en bolos de 16 mg antes de la inoculación, a las 28 horas y a las 38 horas. La concentración final de 1 , 3-propanodiol fue de 130 g/l y el rendimiento en masa fue de 47.5%. Una corrida con glucosa mantenida en exceso (0-20 g/l) dio 141 g/l de 1, 3-propanodiol y un rendimiento en masa de 43.6%. EJEMPLO 11 CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UN PROMOTOR MANIPULADO POR INGENIERIA GENETICA PARA LA F0SFOENOLPIRUVAT0-CARB0XILASA (ppcj POR TRANSFORMACIÓN DE ADN LINEAL El reemplazo del promotor ppc natural con el promotor sintético corto 1.6 GI fue realizado mediante el reemplazo de 59 pares de bases del cásete de la secuencia ppc corriente arriba (5') que contenía FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado por ingeniería genética. El producto de PCR fue amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 utilizando pKD3 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 40 contiene 80 pares de bases de homología a la secuencia de ppc corriente arriba (5') y 20 pares de bases de homología a la plantilla pKD3. El cebador SEQ ID NO: 41 contiene 39 pares de bases de homología a la secuencia de ppc corriente arriba (5') , contiene la secuencia del promotor corto 1.6 GI y contiene 20 pares de bases de homología a pKD3. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas LB con 12.5 mg/1 de cloranfer.icol para dar MG1655 1.6ppc: :Cm. La integración exitosa del cásete reemplaza la región de 90 a 148 pares de bases corriente arriba (5') del inicio ATG de ppc [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] con un cásete FRT-CmR-FRT-promotor corto 1.6 GI . La integración dentro de la región ppc corriente arriba (5') fue confirmada por el par de cebadores SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 0.2 kb mientras que la cepa recombinante da un producto de PCR característico de 1.2 kb. Este producto de PCR fue secuenciado utilizando el cebador SEQ ID NO: 42, el cual indicó que el reemplazo del promotor ocurrió efectivamente. Se preparó un lisado del fago Pl y se utilizó para mover la mutación a la cepa FMP' 1.5gapA AmgsA. Esta cepa fue designada FMP ' 1.5gapA Amgs 1.6ppc: :Cm. El marcador de resistencia al cloranf enicol fue removido utilizando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) , y la cepa resultante fue electrotransf ormada con el plásmido pSYC0106 para dar FMP' 1.5gapA Amgs 1.6ppc/pSYCO106. Los cultivos de matraz de agitación fueron utilizados para evaluar la conversión de la glucosa a 1,3-propanodiol en E . col i cepas FMP' 1.5gapA Amgs/pSYCO106 y FMP ' 1.5gap Amgs 1.6ppc/pSYCO106. Las cepas , desarrolladas en el medio LB que contenía 50 mg/1 de e s p e c i n o m i c i n a por 10 horas , f ueron utilizadas para inocular (200 µ 1 ) dentro de matraces Erlenmeyer protegidos de 250 mi que contenían 10 mi del medio TM2 , 20 g/1 de glucosa , 50 mg/1 de espectinomicina , y 2 mg/1 de vitamina B12. Los matraces fueron incubados a 300 rpm y a 34 °C . Los resultados representativos se dan en la Tabla 7. Se observó un incremento en el rendimiento molar y una disminución de la producción de acetato con la adición de la mutación 1.6ppc a la epa progenitora TABLA 7 Matraces de Agitación para la Conversión de Glucosa a 1, propanodiol (1,3-PD) Cepa Glicerol Acetato Rendimiento producido propanodiol producido Molar (g 1) producido (g/l) (g/l) FMP' 1 .5gap AmgsA/pSYCO 106 8.24 2. 19 1 .78 1 .25 Cepa Glicerol Acetato Rendimiento producido propanodiol producido Molar (g/l) producido (g/l) (g/l) FMP 1 .5gap Amgs 1 .6ppc/pSYC0106 7.5 3.4 0.34 La actividad de la fosfoenolpiruvato-carboxilasa (Ppc) se midió a partir de los extractos libres de células obtenidos de los matraces en agitación descritos inmediatamente arriba. Las alícuotas de las células fueron cosechadas en la fase semi-logarítmica , desintegradas mediante dos pases a través de una celda de prensa Frenen, centrifugadas por 15 min a 14,000 rpm, y ultracentrifugadas 1 hora a 50,000 rpm. El sobrenadante fue removido y utilizado como una fuente de proteínas. Las actividades específicas de P?C son reportadas en la Tabla 8 siguiente. El reemplazo del promotor ppc natural con el promotor corto 1.6 GT incrementó la actividad de la enzima Ppc tres veces.

TABLA 8 Actividad Especifica de la Enzima PPC Cepa Actividad específica de la fosfoenolpiruvato- carboxilasa (U/mg de proteína) FMP'1.5gap AmgsA/pSYCOl 06 0.28 FMP'1.5gap AmgsA 1.6ppc, 0.86 pSYCO106 EJEMPLO 11A FERMENTACIÓN DE GLUCOSA A 1 , 3-PR0PAN0DI0L UTILIZANDO E . COLI CEPA FMP' 1.5gapA AmgsA/pSYCOl 06 La producción del 1 , 3-propanodiol a partir de FMP' 1.5gapA AmgsA 1.6ppc/pSYCO106 fue determinada en termentadores de 14 litros come se describe en la sección de Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para los termentadores. Una colonia simple proveniente de una placa fresca (LA con 50 mg/1 de espectinomicina ) de FMP' 1.5gapA AmgsA 1.6ppc/pSYCO106 se transfirió a 30 mi de LB con 100 mg/1 de espectinomicina en un matraz de 250 mi para preparar el precultivo. Después de la incubación a 34°C y 300 rpm a una OD550 de 1 AU, 10.8 mi del cultivo se transfirieron al termentador. La vitamina B12 fue agregada al termentador en bolos de 16 mg antes de la inoculación, a las 28 horas y a las 38 horas. La concentración final de 1 , 3 -propanodiol fue de 135.3 g/1 y el rendimiento en masa fue de 46.1%. EJEMPLO 12 CONSTRUCCIÓN DE LA CEPA E. COLI CON UN PROMOTOR MANIPULADO POR INGENIERIA GENETICA POR yciK/btuR POR TRANSFORMACION DE ADN LINEAL Los genes yciJC y jbtaR están presentes dentro de un operón simple en E. coli. El reemplazo del promotor yciK-btuR natural con el promotor sintético corto 1.6 GI se realizó mediante la inserción de un c sete de 1.3 kb, corriente arriba (5') de yciK-btuR. El cásete de reemplazo, que contenía FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado por ingeniería genética, fue amplificado por PCR con el par de cebadores SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 utilizando pKD13 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 43 contiene 70 pares de bases de homología a la secuencia yciK-btuR corriente arriba y 20 pares de bases de homología a la plantilla pKD13. El cebador SEQ ID NO: 44 contiene 30 pares de bases de homología a la secuencia yciK-btuR corriente arriba, contiene la secuencia del promotor corto 1.6 GI y contiene 20 pares de bases de homología a pKD13. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de las células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas LB con 25.0 mg/1 de kanamicina para dar MG1655 1.6yciK-btuR : : Km . La integración exitosa del cásete da como resultado una inserción entre el par de bases 27 y el par de bases 28 corriente arriba (5') del codón de inicio ATG de yciK [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] con un cásete FRT-CmR-FRT-promotor corto 1.6 GI. La integración dentro de la región yciK/btuR corriente arriba (5') fue confirmada por el par de cebadores SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 1.4 kb mientras que la cepa recombinante da un producto característico de PCR de 2.8 kb . Un lisado del fago Pl fue preparado y utilizado para mover la mutación hacia un derivado de la cepa FMP'1.5gap Amgs 1.6ppc llamada Triple. Después de eliminar el antibiótico, se obtuvo la cepa Triple 1.6btuR. EJEMPLO 12A FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA A 1 , 3 - ROPANODIOL UTILIZANDO LA E. COLI CEPA Triple 1.6btuR/pSYC0109 La cepa Triple 1.6btuR fue transformada con pSYCO109. La producción de 1 , 3 -propanodiol por Triple 1.6btuR/pSYCO109 fue determinada en termentadores de 14 litros en la sección de Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para la fermentación. Una colonia simple proveniente de una placa fresca (LA con 50 mg/1 de espectinomicina) de Triple 1.6btuR/pSYCO109 se transfirió a 30 mi de LB con 100 mg/1 de espectinomicina en un matraz de 250 mi para preparar el precultivo. Después de la incubación a 34 °C y 300 rpm a una OD550 de 1 AU, se transfirieron 10.8 mi de cultivo al termentador. Se agregó vitamina Bi2 al termentador en bolos de 8 mg antes de la inoculación, a las 28 horas y a las 38 horas. La concentración final de 1 , 3 -propanodiol fue de 123 g/1 y el rendimiento en masa fue de 45.7%. EJEMPLO 13 CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UN PROMOTOR MANIPULADO POR INGENIERIA GENETICA PARA yqhD POR TRANSFORMACION DE ADN LINEAL El reemplazo del promotor natural yqhD (alcohol -deshidrogenasa) con el promotor sintético corto 1.6 GI fue realizado mediante el reemplazo de 967 pares de bases de la secuencia yqhD corriente arriba (5') incluyendo el gen yqhC con un cásete que contenía FRT-CmR-FRT y un promotor manipulado por ingeniería. El producto de PCR fue amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48 utilizando pKD3 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 47 contiene 78 pares de bases de homología a la secuencia yqhD corriente arriba (5') y 20 pares de bases de homología a la plantilla pKD3. El cebador SEQ ID NO: 48 incorpora 41 pares de bases de homología (con una supresión de 1 par de bases) a la secuencia yqhD corriente arriba (5') , 40 pares de bases de homología a la secuencia promotora corta 1.6 GI , y 19 pares de bases de homología a pKD3. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas de LB con 12.5 mg/1 de cloranfenicol para dar MG1655 1.6yqhD::Cm. La integración exitosa del cásete reemplaza la región de 50-1016 pares de bases corriente arriba (5') del inicio ATG de yqhD [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] con un cásete FRT-CmR-FRT-promotor corto 1.6 GI . La integración dentro de la región yqhD corriente arriba (5') fue confirmada mediante secuenciamiento con el cebador SEQ ID NO: 49 e indicó que el reemplazo del promotor ocurrió efectivamente. Se preparó un lisado del fago Pl y se utilizó para mover la mutación hacia la cepa Triple 1.6btuR. Después de eliminar el antibiótico (como se describió anteriormente) , se obtuvo la cepa Triple 1.6btuR l.SyqhD. EJEMPLO 13A FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA A 1 , 3 -PROPANODIOL UTILIZANDO E. COLI CEPA Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 La cepa Triple 1.6btuR 1.6yqhD se transformó con pSYCO109. La producción de 1 , 3 -propanodiol por Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 fue determinada en termentadores de 14 litros como se describe en la sección Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para la fermentación. Una colonia simple proveniente de una placa fresca (LA con 50 mg/1 de espectinomicina) de Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 se transfirió a 30 mi de LB con 100 mg/1 de espectinomicina en un matraz de 250 mi para preparar el precultivo. Después de la incubación a 34°C y 300 rpm a una OD550 de 1 AU, se transfirieron 10.8 mi del cultivo al termentador. Se agregó vitamina B12 al termentador en un bolo simple de 16 mg a las 20.6 horas de tiempo de fermentación transcurrido. La concentración final de 1 , 3 -propanodiol fue de 113.3 g/1 y el rendimiento en masa fue de 48.8%. EJEMPLO 14 CONSTRUCCIÓN DE UNA CEPA DE E. COLI CON UNA MUTACIÓN DE SUPRESION EN LA ACETATO- CINASA j ck) Y LA FOSFOTRANSACETILASA (ota) POR TRANSFORMACIÓN DE ADN LINEAL La supresión de pta-ackA [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] se realizó mediante el reemplazo de 3.3 kb de la región de codificación con el cásete FRT-CmR-FRT de pKD3. El cásete de reemplazo fue amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51 utilizando pKD3 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 50 contiene 80 pares de bases de homología al extremo 5' de pta y 20 pares de bases de homología al ADN plantilla, pKD3. El cebador SEQ ID NO: 51 contiene 80 pares de bases de homología al extremo 3' de ackA y 20 pares de bases de homología a pKD3. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas de LB con 12.5 mg/1 de cloranfenicol para dar la cepa MG1655 AackA-pta : : Cm. La supresión de los genes pta-aciA fue confirmada por PCR, utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 3.8 kb mientras que la cepa recombinante da un producto de PCR característico de 1.6 k . Se preparó un lisado del fago Pl y se utilizó para pasar la mutación a la cepa Triple 1.6btuR 1.6yqhD para formar la cepa Triple 1.6btuR 1.6yqhD AackA-pta::Cm. El marcador de resistencia al cloranfenicol fue removido utilizando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) para dar Triple 1.6btuR 1.6yqhD AackA-pta (renombrado Triple Triple (TT) ) . Las cepas Triple 1.6btuR 1.6yqhD y TT fueron electrotransformadas con el plásmido pSYCO109. EJEMPLO 15 MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA FOSFOTRANSACETILASA (Pta) EN LA CEPA TRIPLE TRIPLE/pSYCO109 COMPARADA A LA CEPA TRI PLE 1.6btuR 1.6yqhD/pSYC0109 Las fermentaciones con TT/pSYCO109 y Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYC0109 se llevaron a cabo en termentadores de 14 litros como se describe en la sección de Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para la fermentación. Una fermentación típica con Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 como se describe en el Ejemplo 13A. Un precultivo de TT/pSYCO109 se desarrolló en 30 mi de LB con 100 mg/1 de espectinomicina en un matraz de 250 mi a una OD550 de aproximadamente 1 AU. Un termentador de siembra preparado como se describe, fue inoculado con 10.8 mi de ese cultivo. Después de 30.5 horas del tiempo de fermentación, 1.2 litros del cultivo se transfirieron a un termentador de producción. Este termentador recibió un bolo simple de 16 mg de vitamina Bi2 1 hora después de la inoculación. La concentración final del 1 , 3 -propanodiol en una fermentación típica fue de 114 g/1 y el rendimiento fue de 48%. Muestras provenientes de una fermentación típica de Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 se analizaron para la actividad de la enzima Pta. Una actividad específica de 0.4 U/mg de proteína fue obtenida. Las muestras fueron evaluadas a partir de una fermentación típica de TT/pSYCO109 y no mostraron actividad detectable de la enzima Pta. EJEMPLO 16 ESTABILIDAD MEJORADA DE LOS RENDIMIENTOS MOLARES EN LA CEPA TT/pSYCO109 EN COMPARACIÓN A TRIPLE 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109 Cultivos de matraces con agitación por duplicado fueron agregados con las cepas Triple 1.6btuR 1.6yqhD, pSYCO109 y TT pSYCO109. Después de la incubación de una colonia por 10 horas en LB + 50 mg/1 de espectinorricina, se transfirieron 100 mi de cultivo a 30 mi del medio TM2 con 25 de glucosa y con o sin 50 ppm de espectincmicina (día 1) . Con el fin de estudiar la estabilidad del rendimiento, se transfirió un volumen de 100 mi de los cultivos de 1 día después de 24 horas, a un volumen fresco de 30 mi del medio TM2 que contenía 2% de glucosa o sin 50 ppm de espectincmicina. Esto se repitió 4 veces. El rendimiento molar fue calculado como en el E emplo 2 al final de cada periodo de 24 horas, y los resultados se dan enseguida en la Tabla 9. La supresión de ackA-pta estabiliza el rendimiento molar, por lo tanto mejora la producción de 1 , 3-propanodiol . TABLA 9 Rendimiento Molar Cepa Con (+) Sin Rendimiento Rendimiento Rendimiento Rendimiento Rendimiento (-) Especti- Molar dia l Molar día 2 Molar día3 Molar día 4 Molar día 5 nomicina Triple btuR 1.6vqhD. pSYCO109 1.24 1.28 1.06 0.84 0.79 TT, pSYCOI09 1.15 1.22 1.24 1.24 1.07 Triple btuR. l.óyqhD. pSYCO109 1.23 1.04 0.95 0.61 0.25 TT. pSYCOI09 1.23 1.22 123 1.13 1.11 EJEMPLO 17 CONSTRUCCION DE LA CEPA DE E. COLI CON MUTACIONES DE SUPRESIÓN EN LAS ALDEHIDO-DESHIDROGENASAS POR TRANSFORMACIÓN DE ADN LINEAL Una supresión de aldA [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] fue realizada mediante el reemplazo de 1.3 kb de la región de codificación con el cásete FRT-Cm - FRT de pKD3. El cásete fue amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 utilizando pKD3 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 57 contiene 80 pares de bases de homología al extremo 5' de aldA y 20 pares de bases de homología al ADN plantilla pKD3. El cebador SEQ ID NO: 58 contiene 80 pares de bases de homología al extremo 3' de aldA y 20 pares de bases de homología a pKD3. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas de LB con 12.5 mg/1 de cloranfenicol . La supresión del gen aldA fue confirmada por PCR, utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 2.0 kb mientras que la cepa recombinante da un producto característico de PCR de 1.8 kb. Un lisado Pl de esa cepa fue preparado y utilizado para mover la mutación a la cepa TT para formar la cepa TT AaldA::Cm. El marcador de resistencia al cloranfenicol fue removido utilizando la recombinasa FLP (Datsenko y Wanner, supra) para crear TT aldA. Una supresión aldB [para referencia, ver GenBank, Acceso # U00096] se realizó mediante el reemplazo de 1.5 kb de la región de codificación con el cásete FRT-CmR-FRT del pKD3. Un cásete de reemplazo fue amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62 utilizando pKD3 como la plantilla. El cebador SEQ ID NO: 61 contiene 80 pares de bases de homología al extremo 5' de aldB, y 20 pares de bases de homología a pKD3. El cebador SEQ ID NO: 62 contiene 80 pares de bases de homología al extremo 3' de aldB y 20 pares de bases de homología a pKD3. Los productos de PCR fueron purificados en gel y sometidos a electroporesis dentro de células competentes MG1655/pKD46. Las cepas recombinantes fueron seleccionadas sobre placas LB con 12.5 mg/1 de cloranfenicol . La supresión del gen aldB fue confirmada por PCR, utilizando el par de cebadores SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64. La cepa de tipo silvestre da un producto de PCR de 1.5 kb mientras que la cepa recombinante da un producto característico de PCR de 1.1 kb. Se preparó un lisado de Pl y se utilizó para mover la mutación hacia la cepa TT para formar la cepa TT AaldB::Cm. Un clon resistente al cloranfenicol fue verificado mediante PCR genómico con el par de cebadores SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64 para asegurar que la mutación estuviera presente. EJEMPLO 17A PRODUCCIÓN DE GLICEROL CON LA CEPA FMP ' 1.5gap/pSYC0106 La cepa FMP' 1.5gapA fue transformada con el plásmido pSYCO106. La producción del glicerol fue determinada en termentadores de 14 litros como se describe en la sección de Métodos Generales, con las siguientes diferencias en los parámetros de control para la fermentación. Un frasco congelado de FMP ' 1.5gap/pSYCO106 fue descongelado y luego transferido a 500 ral de SBG 1% con 50 mg/l de espectinomicina para preparar el precultivo. No se agregó vitamina Bi2 al termentador. Una fermentación típica dio como resultado la producción de 202 g/1 de glicerol con un rendimiento molar de 115% . EJEMPLO 17B PRODUCCIÓN DE GLICEROL CON LA CEPA TT/pSYCO109 La producción de glicerol fue determinada en termentadores de 14 litros como se describe en la sección de Métodos Generales con las siguientes diferencias en los parámetros de control para la fermentación. Una colonia simple de TT/pSYCO109 sobre una placa de LB con 50 mg/l de espectinomicina se transfirió a 30 mi de LB con 100 mg/l de espectinomicina en un matraz de 250 mi. Cuando se alcanzó una OD550 de aproximadamente 1 AU, se utilizaron 10.8 mi del cultivo para inocular un termentador preparado como se describe. No se agregó vitamina Bi2 al termentador. Una fermentación típica dio como resultado la producción de 302 g/1 de glicerol con un rendimiento molar de 137%.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (8)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una cepa de E. coli, caracterizada porque comprende : a) un sistema endógeno desorganizado de fosfoenolpiruvato-glucosa-fosfotransferasa , que previene la expresión de proteínas activas del sistema de PEP-glucosa-fosfotransferasa ; b) un gen galP endógeno supra-regulado que codifica para el simportador activo de galactosa-protones; c) un gen glk endógeno supra-regulado que codifica para la glucocinasa activa; y d) un gen gapA endógeno sub-regulado que codifica para la gliceraldehído-3 - fosf to-deshidrogenasa activa.

2. La cepa de E. coli de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sistema endógeno desorganizado de fosfoenolpiruvato-glucosa- fosfotransferasa comprende uno o más de : i) un gen ptsH endógeno desorganizado, que previene la expresión de la proteína fosfoportadora activa; ii) un gen ptsl endógeno desorganizado, que previene la expresión de la fosfoenolpiruvato-proteína- fosfotransferasa activa; y iii) un gen crr endógeno desorganizado, que previene la expresión del componente activo IIA específico de la glucosa .

3. La cepa de E. coli de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende uno o más de : e) un gen arcA endógeno desorganizado que previene la expresión de la proteína de control de la respiración aeróbica, activa; f) un gen ppc endógeno, supra - regulado , que codifica para la fosfoenolpiruvato-carboxilasa activa; g) un gen btuR endógeno supra-regulado, que codifica para la cob ( I ) alamin-adenosiltransferasa activa; y h) un gen yqhD supra-regulado que codifica para la alcohol -deshidrogenasa activa.

4. La cepa de E. coli de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizada porque comprende uno o más de : i) un gen mgsA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la metilglioxal - sintasa activa; j) un gen ackA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la acetato-cinasa activa; k) un gen pta endógeno desorganizado, que previene la expresión de la fosfotransacetilasa activa; 1) un gen aldA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la aldehído-deshidrogenasa A; y m) un gen aldB endógeno desorganizado, que previene la expresión de la aldehído-deshidrogenasa B activa.

5. La cepa de E. coli de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, caracterizada porque comprende además uno o más de: n) un gen edd endógeno desorganizado, que previene la expresión de la fosfogluconato-deshidratasa activa; o) un gen glpK endógeno desorganizado, que previene la expresión de la glicerol -cinasa activa; y p) un gen gldA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la glicerol -deshidrogenasa dependiente de NADH, activa.

6. Un método para la bioproducción de 1,3-propanodiol, caracterizado porque comprende poner en contacto la cepa de E. coli de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5 con un sustrato de carbono adecuado bajo condiciones adecuadas.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cepa de E. coli comprende además: (i) la glicerol-3 -fosfato-deshidrogenasa ; (ii) glicerol -3 -fosfatasa; (iii) deshidratasa ; y (iv) el factor de reactivación de deshidratasa.

8. Una cepa de E. coli, caracterizada porque comprende : a) un sistema endógeno desorganizado de la fosfoenolpiruvato-glucosa- fosfotransferasa , que previene la expresión de las proteínas activas del sistema de la PEP-glucosa- fosfotransfersa activa; b) un gen galP endógeno supra-regulado, que codifica para el simportador activo de galactosa-protones; c) un gen glk endógeno supra-regulado, que codifica para la glucosinasa activa; d) un gen gapA endógeno sub- regulado que codifica para la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa activa; e) un gen arcA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la proteína de control de la respiración aeróbica, activa; f) un gen ppc endógeno supra-regulado, que codifica para la fosfoenolpiruvato-carboxilasa activa; g) un gen btuR endógeno supra-regulado, que codifica para la cob ( I } alamin-adenosiltransferasa activa; h) un gen yqhD endógeno supra-regulado, que codifica para la alcohol -deshidrogenasa activa; i) un gen mgsA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la metilglioxal -sintasa activa; j) un gen ackA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la acetato-cinasa activa; k) un gen pta endógeno desorganizado, que previene la expresión de la fosfotransacetilasa activa; 1) un gen aldA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la aldehído-deshidrogenasa A activa; m) un gen aldB endógeno desorganizado, que previene la expresión de la aldehído-deshidrogenasa B activa. n) un gen edd endógeno desorganizado, que previene la expresión de la fosfogluconato-deshidratasa activa; o) un gen glpK endógeno desorganizado, que previene la expresión de la glicerol-cinasa activa; p) un gen gldA endógeno desorganizado, que previene la expresión de la glicerol-deshidrogenasa dependiente de NADH activa; y q) cualquiera de las secuencias de nucleótidos para una construcción pSYCO de la SEQ ID NOs : 65, 66, 67 ó 68.