MXPA04001186A

MXPA04001186A - N-acetil-d-glucosamina y proceso para producir n-acetil-d-glucosamina.

Info

Publication number: MXPA04001186A
Application number: MXPA04001186A
Authority: MX
Inventors: Andrew Bohlmann John
Original assignee: Cargill Inc
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2002-08-07
Publication date: 2004-07-08
Also published as: WO2003013435A2; US6693188B2; EP1521760A2; CA2456544A1; EP1521760A4; US20030073666A1; WO2003013435A3; BR0211766A; AU2002326559A1

Abstract

La presente invencion se refiere a N-Acetil-D-Glucosamina obtenida de la biomasa microbial, y a metodos para la obtencion de N-acetil-D-glucosamina de la biomasa microbial. En particular, la presente invencion se refiere al uso de la biomasa fungica para crear N-acetil-D-glucosamina. La N-acetil-D-glucosamina es obtenida de manera eficiente en alta pureza degradando la quitina en la biomasa fungica para crear N-acetil-D-glucosamina.

Description

wo 03/013435 A2 !111111 ll!lllll II l!IIl! IIIII iiil 1 II 1H !IIII illil Ifllf litl Illllii illl ifli IHi Buropean patent (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, For two-íetter codes and other abbreviations, refer to the "Guid- ES, FI, FR, GB, GR, IE, GG, LU, MC, NL, PT, SE, SK, ance Notes on Codes and Abbreviations" appearing at the begin- TR), OAPI patent (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, ning of each regidor issue of the PCT Gazette. GW, L, MR, E, SN, TD, TG). Publisiied: ¦ — witho t international search report and to be republished upan receipt of that report N-ACET1L-D-G LUCOS AMINA Y PROCESO PARA PRODUCIR N- ACETIL-D-GLU COS AMI A Campo de la Invención La presente invención se refiere a N-Acetil-D-Glucosamina y métodos para producir N-Acetil-D-Glucosamina. Antecedentes del Invento La quitina es un polisacárido natural presente en varios organismos marinos y terrestres, incluyendo crustáceos, insectos, moluscos, y microorganismos, tales como los hongos. La estructura de la quitina es la de un polímero sin ramificar de 2-acetoamido-2-desoxi-D-glucosa (también conocido como poli(N-acetil-D-glucosamina)), y puede ser representada por la estructura de repetición general: La quitina generalmente es un sólido amorfo que es altamente insoluble en agua, ácidos diluidos y alcalinos. Aunque la quitina tiene muchos usos, también puede ser degradada para formar otros materiales útiles, tales como carbohidratos, y uno de los cuales es el azúcar amino N-acetil-D-glucosamina (NAG). La N-acetil-D-glucosamina generalmente incluye una unidad de glucosamina sola, pero también puede incluir pequeñas cantidades de oligómeros cortos, tales como quitobiosa o quitotriosa, que tienen dos o tres unidades de g lucosamina, respectivamente. La N-acetil-D-glucosamina puede ser utilizada para varias aplicaciones, incluyendo como un aditivo alimenticio, y en composiciones farmacéuticas. La fuente más común de la quitina para utilizarla en la producción de N-acetil-D-glucosamina es la biomasa de los mariscos (tales como el camarón). Desafortunadamente, existen limitaciones con la recuperación de la N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa de mariscos. Un problema con la recuperación de N-acetil-D-glucosamina de mariscos es que es muy difícil obtener una biomasa uniforme del marisco. Los problemas de uniformidad ocurren , en parte, debido a que los mariscos con frecuencia varían de tamaño, edad, y especies; crecen bajo condiciones ambientales variables; y son recolectados de diferentes localizaciones. La carencia de uniformidad hace difícil procesar de manera precisa la biomasa de mariscos. Además, pueden originarse algunos problemas de control de calidad debidos al hecho de que la N-acetil-D-glucosamina obtenida de los crustáceos puede tener un contenido alto de cenizas, y puede contener metales pesados que son concentrados en los crustáceos de su ambiente acuático. Un problema adicional con la N-acetil-D-glucosamina derivada de los crustáceos recolectados, es que tiene el potencial de incluir proteínas y alérgenos indeseables. Por lo tanto, existe la necesidad de un material de N-acetil-D- glucosamina mejorado que sea obtenido utilizando una fuente de quitina que no sean los mariscos. Sumario de la Invención La presente invención se refiere a la N-acetil-D-glucosamina obtenida de la biomasa microbial, y a métodos para producir la N-acetil-D-glucosamina de biomasa microbial. En particular, la presente invención se refiere al uso de la biomasa fúngica para obtener la N-acetil-D-glucosamina. La N-acetil-D-glucosamina es obtenida en alta pureza de manera eficiente degradando la quitina de la biomasa para crear la N-acetil-D-glucosamina. La biomasa fúngica generalmente contiene una cantidad importante de glucano intermezclado con la quitina. El glucano es un polímero de alto peso molecular de la glucosa y se deriva de la pared celular de la biomasa microbial. El glucano puede incluir enlaces que son exclusivamente enlaces beta, exclusivamente enlaces alfa, o una mezcla de enlaces alfa y beta. Los componentes de glucano de la biomasa fúngica se enlazan e inmovilizan los materiales de quitina, y generalmente hacen que la quitina no esté disponible para la degradación eficiente para formar la N-acetil-D-glucosamina. La presente invención supera los problemas asociados con la presencia de los componentes de glucano, degradando el glucano lo suficiente para ganar el acceso químico a los componentes de quitina, los cuales son degradados posteriormente para formar la N-acetil-D-glucosamina. Los métodos para recuperar la N-acetil-D-glucosamina generalmente Incluyen proporcionar la biomasa fúngica que contiene quitina y glucano; degradar al menos una porción de glucano; y degradar al menos una porción de la quitina para producir N-acetil-D-glucosamina. En una implementación de la presente invención, la quitina y el glucano son degradados enzimáticamente mientras que en otras implementaciones la quitina y el glucano son degradados químicamente. La biomasa utilizada para formar la N-acetil-D-glucosamina de la presente invención , generalmente es una biomasa fúngica que tiene por lo menos el 5% en peso de quitina y por lo menos el 5% en peso de glucano en una base seca antes de la degradación , y aún más generalmente, tiene por lo menos el 1 5% en peso de quitina y el 50% en peso de glucano en una base seca antes de la degradación. Se pueden utilizar varias fuentes de biomasa fúngica, incluyendo la biomasa fúngica derivada de Aspergillus sp., Penicillium sp., Absidium sp., Lactarius sp., Mucor sp., Saccharomyces sp., Candida sp. o combinaciones de los mismos. Como se usa en la presente invención "sp." se refiere, ya sea a una "especie" singular, o "especies" plural. Las biomasas microbiales específicas adecuadas incluyen, sin limitación Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Lactarius vellereus, Mucor rouxii, Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Saccharomyces cerevisiae; y en particular, Candida guillermondi, Aspergillus niger, y Asperguillus terreus. Generalmente, la biomasa es recuperada a partir de una reacción de fermentación comercial , incluyendo la producción comercial de ácidos orgánicos, tales como ácido cítrico, y ácido itacónico. Como se usa en la presente invención, el término microbial cuando es utilizado para describir la fuente de biomasa fúngica, no incluye el fito-plancton, y los crustáceos o moluscos, los cuales difieren de manera importante en la composición y propiedades de la biomasa fúngica. En una ¡mplementación de la presente invención, la quitina y los componentes de glucano de la biomasa fúngica son degradados por medio de enzimas. Las enzimas generalmente son derivadas de microorganismos. Las enzimas pueden ser agregadas a la biomasa fúngica en la presencia de los microorganismos de los cuales son derivadas, y lo cual tiene la ventaja de evitar el paso de separación de las enzimas de sus organismos fuente. La inclusión de los organismos fuente puede también ser ventajosa en las implementaciones en donde los microorganismos continúan creando enzimas después de haber sido agregados a la biomasa fúngica. En otras implementaciones, las enzimas son separadas de sus microorganismos fuente (tal como mediante filtración o centrifugación), y posteriormente agregados a la biomasa fúngica. La enzimas adecuadas para degradar la quitina y el glucano incluyen quitinasas, ß-?-acetil-glucosaminidasas, y glucanasas. Las enzimas generalmente son secretadas de los microorganismos eucarióticos o procarióticos. Los organismos eucarióticos adecuados incluyen aquellos provenientes de los genes Tricoderma, incluyendo, por ejemplo, Tricoderma harizianum y Tricoderma reesei. Los organ ismos procarióticos adecuados i ncl uyen aquellos provenientes de Serratia genus, el Streptomyces genus, y el Nocardia genus. Los ejemplos de los organismos procarióticos i ncluyen Serratia marcesens, Streptomyces griseus, y Nocardia orientalis. Las enzimas de g lucanasa son particu larmente útiles para degradar el componente de gl ucano de la biomasa fúngica. Estas glucanasas deben de estar presentes en concentraciones relativamente altas en las i m plementaciones típicas de la presente i nvención . En general , no es necesario someter la biomasa fúngica a pretratamientos físicos o químicos extensos antes de procesarlos para crear la N-acetil-D-gl ucosami na. Por lo tanto , generalmente no es necesario moler la biomasa fúngica o tratarla previamente con un solvente orgánico. Dichos pasos generalmente no son requeridos, pero se pueden llevar a cabo de manera opcional en alg unas i mplementaciones de la presente invención. Cuando se utilizan enzimas para degradar la quitina y el glucano, la reacción de degradación generalmente es mantenida en u n pH de 4.0 a 6.0 , y a una temperatu ra de 20°C a 45°C . Las temperatu ras más altas generalmente son ventajosas, pero las temperaturas deben de ser lo suficientemente bajas para evitar que se deg raden las enzimas. No obstante los niveles altos de gl ucano presentes en la biomasa fú ng ica , la N-acetil-D-glucosa mina resultante es generalmente de alta pureza. Generalmente, la N-acetil-D-glucosamina forma por lo menos el 85% de los carbohidratos derivados de quitina de la biomasa fú ngica.

El resumen anterior de la presente invención no pretende describir cada una de las modalidades descritas de la presente invención. Ese es el propósito de la descripción detallada y las reivindicaciones siguientes. Breve Descripción de los Dibujos Otros aspectos y ventajas podrán ser apreciados a partir de la lectura de la siguiente descripción detallada, haciendo referencia a los dibujos, en los cuales: La figura 1 es una gráfica que ilustra la producción de N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa fúngica utilizando enzimas aisladas para degradar la quitina y el glucano. La figura 2 es una gráfica que ilustra la producción de N-acetil-D-glucosamina proveniente de biomasa fúngica utilizando enzimas agregadas en la presencia de los microorganismos para degradar la quitina y el glucano. La figura 3 es la primera gráfica que ilustra la producción de N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa fúngica que utiliza la degradación química de la quitina y el glucano. La figura 4 es una segunda gráfica que ilustra la producción de N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa fúngica utilizando la degradación química de la quitina y el glucano. La figura 5 es una tercera gráfica que ¡lustra la producción de N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa fúngica utilizando la degradación química de la quitina y el glucano. La figura 6 es una cuarta gráfica que ilustra la producción de N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa fúngica utilizando la degradación química de la quitina y el glucano. Aunque la descripción es susceptible de varias modificaciones y formas alternativas, las especificidades se han mostrado a modo de ejemplo y se describen con detalle. Sin embargo, deberá quedar entendido que la intención no es limitar la descripción a las modalidades particulares aquí descritas. Por el contrario, la intención es cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que se encuentran dentro del espíritu y alcance de la descripción, tal y como lo definen las reivindicaciones adjuntas. Descripción Detallada de la Invención A continuación, se describirán los aspectos específicos de la N-acetil-D-glucosamina, la biomasa, y los métodos de la invención,. La presente invención se relaciona con la N-acetil-D-glucosamina obtenida de biomasa microbial, y los métodos para la obtención de la N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa microbial. En particular, la presente invención se refiere al uso de la biomasa fúngica para crear N-acetil-D-glucosamina. La biomasa fúngica generalmente contiene una cantidad importante (por lo menos el 15%) de glucano intermezclado con la quitina. Los componentes de glucano de la biomasa fúngica retienen e inmovilizan los materiales de quitina, y generalmente hacen que no esté disponible la quitina para la degradación fácil para formar la N-acetil-D-glucosamina. La retención e inmovilización de la quitina es particularmente problemático debido a que puede interferir con la producción rápida eficiente de N-acetil-D-glucosamina, ya sea disminuyendo la producción de N-acetil-D-glucosamina, o requiriendo el uso de condiciones de reacción severas que descomponen el glucano, pero también degradan simultáneamente la N-acetil-D-glucosamina. Por lo tanto, es necesario degradar el glucano sin perder una cantidad excesiva de N-acetil-D-glucosamina en el proceso. La presente invención supera los problemas asociados con la presencia de los componentes de glucano degradando el glucano de manera suficiente para ganar el acceso químico a los componentes de quitina, los cuales son degradados posteriormente para formar la N-acetil-D-glucosamina, sin degradar excesivamente la N-acetil-D-glucosamina que es producida. Como se usa en la presente descripción, el término "degradación" se refiere a un cambio suficiente en el glucano para permitir la transformación de la quitina adyacente en N-acetil-D-glucosamina. La presente invención incluye generalmente proporcionar biomasa fúngica que contiene quitina y glucano, degradar al menos una porción del glucano, y degradar al menos una porción de la quitina para producir N-acetil-D-glucosamina. En una implementación de la presente invención, la quitina y el glucano son degradados enzimáticamente, mientras que en otras implementaciones la quitina y el glucano son degradados químicamente. Biomasa que Contiene Quitina La presente invención se relaciona con la N-acetil-D- glucosamina recuperada de la biomasa microbial, principalmente biomasa fúngica, incluyendo levadura y hongos filamentosos. La biomasa utilizada para formar la N-acetil-D-glucosamina de la presente invención , generalmente es una biomasa fúngica que tiene por lo menos el 5% en peso de quitina y por lo menos el 5% en peso de glucano en una base seca antes de la degradación , y aún más generalmente tiene por lo menos el 1 5% en peso de quitina y el 50% en peso de glucano en una base seca antes de la degradación. La mayoría de la biomasa fúngica tiene del 1 5% al 20% en peso de quitina; aproximadamente el 60% en peso de glucano; del 1 5% al 20% en peso de proteína; y un pequeño porcentaje de lípidos, mañano, galactano, etc. Los materiales restantes no tomados en cuenta pueden incluir ácidos nucleicos, ácidos fosfatídicos, y substituyentes lípidos, tales como colina, etanolamina, serina e inositol . Después de que la biomasa es procesada utilizando el método de la presente invención, la composición es generalmente de aproximadamente el 85% en peso de N-acetil-D-glucosamina y el 1 5% en peso o menos de glucano. Se pueden utilizar diferentes fuentes de biomasa fúngica, incluyendo la biomasa fúngica derivada de Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., Absidium sp., Lactarius sp., Saccharomyces sp., Candida sp. o combinaciones de los mismos. Las biomasas microbiales adecuadas incluyen Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Lactarius vellereus, Mucor rouxii, Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Saccharomyces cerevisiae; y en particular Candida guillermondi, Aspergillus niger, y Aspergillus terreus. Generalmente, la biomasa es recuperada a partir de una reacción de fermentación comercial, incluyendo la producción comercial de ácidos orgánicos, tales como ácido cítrico o ácido ¡tacónico. Aunque es posible generar la biomasa solamente para propósitos de la obtención de la N-acetil-D-glucosamina, la biomasa más frecuentemente es un derivado de otros procesos de producción. Por ejemplo, las instalaciones de fermentación de ácido cítrico utilizan hongos para crear el ácido cítrico. Tradicionalmente, la biomasa fúngica proveniente de la fermentación del ácido cítrico ha sido descartada o usada como combustible, alimentos, o fertilizantes. La presente invención permite la extracción de N-acetil-D-glucosamina de alta calidad de esta biomasa fúngica. La biomasa adecuada para utilizarse en la presente invención incluye la mayor parte de los tipos de biomasa microbial que contienen quitina, y en particular, la biomasa fúngica. La presente invención está particularmente bien adecuada para los usos en donde los niveles de quitina exceden del 5% del peso de la biomasa seca. Dicha biomasa generalmente tiene entre el 5% y el 25% de quitina, y generalmente del 10% al 20% de quitina, basada en el peso seco de la biomasa. Con el objeto de preparar N-acetil-D-glucosamina de la calidad más alta, algunas veces es deseable que la biomasa microbial sea producida de una manera substancialmente controlada que tenga niveles de temperatura y nutrientes relativamente uniformes durante el cultivo de la biomasa.

Métodos de Obtención de N-acet¡l-D-glucosamina Proveniente de Biomasa Fúngica que Contiene Quitina. La presente invención también se refiere, en parte, a métodos mejorados para producir N-acetil-D-glucosamina proveniente de biomasa que contiene quitina. En una implementación de la presente invención la quitina y los componentes de glucano de la masa fúngica son degradados por medio de enzimas. Las enzimas generalmente son derivadas de microorganismos. Las enzimas pueden ser agregadas a la biomasa fúngica en la presencia de los microorganismos de los cuales son derivadas, lo cual tiene las ventajas de evitar el paso de separación de las enzimas de sus organismos fuente. La inclusión de los microorganismos fuente también puede ser provechosa en las implementaciones en donde los microorganismos continúan creando enzimas después de haber sido agregados a la biomasa fúngica. En otras implementaciones, las enzimas son separadas de sus microorganismos fuente (tales cómo por medio de filtración o centrifugación) y posteriormente, agregadas a la biomasa fúngica. Las enzimas adecuadas para la degradación de la quitina y el glucano incluyen quitinasas, ß-?-acetii-glucosaminidasas, y glucanasas. Las enzimas generalmente son secretadas de un microorganismo eucariótico, tal como un organismo del Trichoderma genus, que incluye, por ejemplo, Trichoderma harizianum y Trichoderma reesei. Generalmente no es necesario someter la biomasa fúngica a preíraíamientos físicos o químicos extensos antes de procesarla para crear la N-acetil-D-glucosamina. Por lo tanto, generalmente no es necesario moler la biomasa fúngica o tratarla previamente con un solvente orgánico. Aunque dichos pasos generalmente no son requeridos, pueden ser realizados opcionalmente en algunas implementaciones de la presente invención. Cuando son utilizadas las enzimas para degradar la quitina y el glucano, la reacción de degradación generalmente es mantenida en un pH de 4.0 a 6.0 y a una temperatura de 20°C a 45°C. En implementaciones alternativas de la presente invención, la N-acetil-D-glucosamina es formada mediante la degradación química de la quitina y los componentes de glucano de la biomasa fúngica. Generalmente, la degradación química se puede llevar a cabo por medio de hidrólisis utilizando un ácido fuerte, tal como ácido clorhídrico. Las temperaturas de procesamiento y el volumen del ácido agregado a la biomasa fúngica deben de ser seleccionados de modo que sean lo suficientemente grandes para producir N-acetil-D-glucosamina sin degradar la N-acetil-D-glucosamina producida. Las temperaturas y las concentraciones de ácido más fuertes corresponden a una mejor producción de N-acetil-D-glucosamina, pero cuando las temperaturas y las concentraciones de ácido son demasiado altas, la N-acetil-D-glucosamina que es producida puede ser destruida simultáneamente. Por lo tanto, la temperatura y la concentración del ácido deben de ser lo suficientemente altas para degradar lo suficiente la quitina y el glucano para producir N-acetil- D-glucosam¡na, pero sin ser tan alta como para que se destruya la N-acetil-D-glucosamina. Las condiciones de reacción adecuadas incluyen , por ejemplo, aproximadamente 20% de HCI a una temperatura de 60°C. Otros rangos adecuados de las condiciones de reacción incluyen desde aproximadamente el 1 0% al 36% de HCI , y aún más generalmente del 15% al 36% de HCI . Las temperaturas adecuadas incluyen desde aproximadamente 20°C hasta 100°C, y más generalmente de aproximadamente 40° hasta 80°C. N-acetil-D-glucosamina No obstante los altos niveles de glucano presentes en la biomasa, generalmente la N-acetil-D-glucosamina forma por lo menos el 85% de los carbohidratos derivados de quitina de la biomasa fúngica. Generalmente, la composición de N-acetil-D-glucosamina contiene un total menor del 1 5% en peso de glucano y derivados de glucano. Estos otros derivados de glucano incluyen, por ejemplo, glucosa, maltosa, y otros oligosacáridos basados en glucosa. La N-acetil-D-glucosamina mejorada puede ser utilizada de manera provechosa en varias aplicaciones. Estas aplicaciones incluyen las aplicaciones farmacéuticas, usos médicos generales, productos nutricionales y dietéticos, y varios otros productos y procesos industriales y para el consumidor. También son apropiadas otras varias aplicaciones y usos para la N-acetil-D-glucosamina. Métodos de Ejemplo para la Obtención de N-acetil-D-glucosamina Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar los métodos para producir la N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa fúngica. En el primer ejemplo, la N-acetil-D-glucosamina es formada utilizando enzimas purificadas o aisladas, en el segundo ejemplo la N-acetil-D-glucosamina es formada utilizando una mezcla de enzimas y mecanismos productores de enzimas, y en el tercer ejemplo, la N-acetil-D-glucosamina es formada utilizando un ácido fuerte. I . N-acetil-D-glucosamina producido utilizando enzimas aisladas En este primer ejemplo, la N-acetil-D-glucosamina fue producida utilizando biomasa fúngica de Aspergillus niger generada de la producción de ácido cítrico. Las enzimas aisladas por medio de filtración o centrifugación de sus fuentes microbiales ( T. Harzianum o T. reesei) fueron utilizadas para degradar la biomasa fúngica. La fuente de biomasa fúngica fue preparada mediante un tratamiento previo con un número de reactivos para degradar las proteínas y otros contaminantes, así como para iniciar la degradación de la quitina y el glucano. Específicamente, se agregaron 100 gramos de biomasa de ácido cítrico a un vaso de precipitación de un litro. Los 100 gramos de biomasa de Aspergillus niger fueron utilizados conforme fueron recibidos de la instalación de producción de ácido cítrico. La biomasa contenía de aproximadamente el 15% al 20% de sólidos secos al momento de la medición . Por lo tanto, se utilizaron aproximadamente de 1 5 a 20 gramos de biomasa de las micelas de ácido cítrico en una base de peso seco para un matraz que contenía un litro de medios.

Se le agregó a la biomasa A aproximadamente un litro de agua, a esto se le agregó lo siguiente en el orden determinado mientras que se mezclaba con un agitador magnético a una temperatura entre 20°C y 40°C. 2.79 gramos de sulfato de amonio ((NH4)2S04) y 2.0 gramos de fosfato de monopotasio (KH2P04), 15.14 gramos de dihidrato de fosfato de dihídrógeno de sodio (NaH2PO4-2H20), 0.3 gramos de heptahidrato de sulfato de magnesio (MgS04-7 H20), 19.94 gramos de ácido cítrico, 1 .0 gramos de peptona, y 0.59 gramos de urea. Se agregaron cantidades pequeñas de ingredientes adicionales, incluyendo 0.005 gramos de heptahidrato de sulfato de hierro (FeS04-7 H20), 0.016 gramos de monohidrato de sulfato de manganeso (MnSO4-H20). 0.014 gramos de heptahidrato de sulfato de zinc (ZnSO -7H20), y 0.02 gramos de dihidrato de cloruro de calcio (CaCI2-2H20). Mientras se continuó mezclando la solución, el pH del medio fue ajustado a 5.5 con adiciones en forma de gotas de hidróxido de potasio al 50% (KOH). El medio fue dividido en cantidades de 120 mi, en matraces desviados, y luego esterilizados.

Posteriormente se le agregaron enzimas comerciales a la biomasa fúngica previamente tratada, al momento del enfriamiento suficiente del medio. La consistencia de las enzimas comercialmente disponibles varía en la referencia con la actividad por unidad. Se utilizaron las siguientes enzimas, y fueron transferidas asépticamente al substrato: Enzima 1 : Enzima de lisado Sigma L-1412, con un contenido de 140 unidades por gramo de quitinasa, 0.728 unidades por gramo de proteasa, y 1 .54 unidades por gramo de celulasa. Se agregaron 0.1 gramos al tubo de tratamiento, equivalente a 14 unidades de quitinasa, 0.073 unidades de proteasa, y 0.154 unidades de celulasa; Enzima 2: Enzima de quitinasa Sigma C-61 37, con un contenido de 200 a 600 unidades por gramo de quitinasa (en donde una unidad liberará 1 .0 mg por hora de N-acetil-D-glucosamina proveniente de la quitina a un pH de 6.0 y una temperatura de 25°C en combinación con ß-?-acetil glucosaminidasa (también conocida como N-acetil-D-glucosaminidasa) en un ensayo de 2 horas). Se agregaron 0.001 gramos de enzima al tubo de tratamiento, equivalentes a aproximadamente 200 unidades de quitinasa. Enzima 3: ß-?-acetil glucosaminidasa Sigma A-31 89, con un contenido de 50 a 1 50 unidades por miligramo dividido entre 0.5% de ß-galactosidasa y ß-xilosidasa y 2% de alfa-galactosamina. Por lo tanto, una unidad hidrolizará 1 .0 micromoles de p-nitrofenil N-acetil-ß-D-glucosaminida por minuto en un pH de 4 a una temperatura de 25°C para liberar la N-acetil-glucosamina enlazada- terminal ß, y la N-acetil galactosamina de diferentes substratos. Aproximadamente cinco unidades de ß-?-acetil glucosaminidasa fueron agregados en la cantidad de 0.1 mi de solución al tubo de tratamiento. La enzima de lisado y la enzima de quitinasa fueron hidratadas con 0.1 mililitros de regulador reactivo frío antes de ser agregadas a los 8.3 mi de substrato (medio de biomasa cítrica) del tubo a una temperatura de 25°C. Todas las transferencias del regulador a la enzima y de la enzima al tubo del substrato se hicieron de una manera aséptica para disminuir la posibilidad de la contaminación portada por el aire. Los reactivos fueron un regulador de fosfato de potasio que incluía lo siguiente: 200 mM de fosfato de potasio (2.72 gramos por 1 00 mililitros), 2 m de cloruro de calcio (0.029 gramos por 1 00 mililitros), diluido a 100 mi con H20 desionizada y ajustada a un pH de 6.0 utilizando KOH 1 M. El regulador es sometido a autoclave y almacenado a temperatura ambiente. Al momento del uso para la hidratación , el regulador fue enfriado y se mantuvo en hielo hasta que fue utilizado para la hidratación. La N-acetil-D-glucosaminidasa fue agregada directamente al tubo de reacción sin mezclar el regulador debido a que ya estaba en forma suspendida. Al momento de la adición de las enzimas al tubo del substrato, los tubos fueron transferidos inmediatamente dentro de un vaso precipitador de vidrio, el cual fue colocado en un baño de agua con agitación a una temperatura de 28°C (a una velocidad de 1 80 rpm). Las muestras fueron tomadas del tubo a las 24 horas, 72 horas y 96 horas, recolectando aproximadamente 1 .5 mililitros de la muestra, la cual fue filtrada sin diluir con un filtro de 0.45 micrómetros, y analizada inmediatamente para determinar la N-acetil-D-glucosamina en un cromatógrafo líquido de alta presión. La enzima de lisado sola y la combinación de la quitinasa y N-acetil-D-glucosaminidasa fueron utilizadas como dos tratamientos en los medios de biomasa cítrica. La combinación de las dos enzimas dio como resultado 4.04 g/L de N-acetil-D-glucosamina a las 72 horas (como se muestra en ia Tabla 1 y la figura TABLA 1 II. N-acetil-D-glucosamina producida utilizando Tnchoderma harzianum y Trichoderma reesei Se colocaron en un contenedor de 1 litro, 100 gramos de biomasa cítrica (con un contenido de aproximadamente el 15% al 20% en peso de la biomasa seca). El pH de la biomasa fue ajustado a un pH de 5.5 con KOH, y esterilizado en cantidades de 120 mi en matraces desviados de 500 mi. Entonces se agregaron los ingredientes siguientes a la biomasa de ácido cítrico, en el siguiente orden, mientras se mezclaba con un agitador magnético: 2.79 gramos de ( H4)2S04, 2.0 gramos de KH2P04, 15.14 gramos de NaH2P04-2 H20, 0.3 gramos de MgS0 7-H20, 19.94 gramos de ácido cítrico, 1.0 gramos de peptona, 0.59 gramos de urea, 0.005 gramos de FeSO47 H20, 0.016 gramos de MnSO4-H20, 0.014 gramos de ZnSO -7H20, y 0.02 gramos de CaCI2-2H20. Mientras se mezclaba, el pH fue ajustado a un pH de 5.5 con adiciones en forma de gotas de KOH al 50%, y esterilizados en cantidades de 120 mi en matraces desviados de 500 mi. Al momento del enfriamiento, los matraces fueron inoculados con 2 mi de Trichoderma harzianum y T choderma reesei (ATCC 66589) proveniente de un hidratado de PDA inclinado con 1 % de Tween, o regulador de fosfato utilizado para hidratar las esporas de Trichoderma. Los inclinados fueron hidratados, ya sea con Tween o regulador durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente antes de abastecer asépticamente 2 mi de las esporas hidratadas en 120 mi del medio. Los matraces fueron incubados a una temperatura de 28°C, en un vaso de precipitación rotatorio a una velocidad de 1 80 rpm durante 21 6 horas antes de la transferencia dentro de la biomasa. Durante este período de incubación, se tomaron muestras cada 24 a 48 horas para el análisis de la producción de N-acetil-D-glucosamina. El ejemplo logró 0.19 g/L a las 212 horas en el primer ensayo, y logró 0.22 g/L a las 212 horas en el segundo ensayo, tal y como se muestran en la Tabla 2 y en la figura 2.

TABLA 2 I I I . N-acetil-D-glucosamina producida utilizando ácido clorhídrico Este ejemplo utilizó la hidrólisis química para producir N-acetil-D-glucosamina proveniente de la biomasa de ácido" cítrico (Aspergillus niger). Aproximadamente 500 gramos de biomasa que habían sido tratados anteriormente con hidróxido de sodio al 2% (para eliminar las proteínas) fue colocado en un matraz de un reactor de tres cuellos. Se le agregaron ácido clorhídrico y agua desionizada para ajustar la concentración del ácido y la concentración de la biomasa a un valor deseado. El reactor fue calentado posteriormente a una temperatura entre 60° y 90°C, y las muestras retiradas en intervalos de 30 minutos después de un período de 6 a 7 horas. Las muestras fueron analizadas inmediatamente para determinar la N-acetil-D-glucosamina y la glucosamina utilizando un cromatógrafo líquido de alta presión . Los resultados indican que la formación de N-acetil-D-glucosamina fue favorecida bajo las condiciones de 20% de ácido clorhídrico y una temperatura de 60°C. En estas condiciones, se observaron hasta 6.42 gramos de N-acetil-D-glucosamina. También se puede apreciar, que la N-acetil-D-glucosamina es favorecida cinéticamente debido a un índice mucho más bajo de desaparición de N-acetil-D-glucosamina en el recipiente del reactor bajo estas condiciones, comparadas con las de las condiciones a una temperatura de 90°C . Los niveles bajos de ácido clorhídrico (2%) mostraron poca o ninguna formación de N-acetil-D-glucosamina en temperaturas de 60°C y 90°C. Como se indica a continuación en la Tabla 3 y en la figura 3, la formación importante de N-acetil-D-glucosamina ocurrió con 20% de HCI , y una temperatura de 60°C.

TABLA 3 Como se indica en la Tabla 4 y la figura 4 siguientes, existe una producción importante rápida de N-acetil-D-glucosamina a partir de una mezcla que contiene 20% de HCI a una temperatura de 90°C, pero esta N-acetil-D-glucosamina se degradó rápidamente y fue perdida de la solución .

TABLA 4 Como se indica a continuación en la Tabla 5 y en la figura 5, formaron cantidades importantes de N-acetil-D-glucosamina luciones del 2% de HCI a una temperatura de 60°C. TABLA 5 Horas - N-acetil-D-glucosamina (g/L) 0 0.01 0.5 0.02 1.0 0.02 1.5 0.0 2.0 0.11 2.5 0.01 Como se indica en la Tabla 6 siguiente y en la figura 6, i formaron cantidades importantes de N-acetil-D-glucosamina soluciones de HCI al 2% a una temperatura de 90°C. TABLA 6 La descripción anterior, los ejemplos y los datos proporcionan una descripción de las composiciones y los métodos de la presente invención. Debido a que se pueden hacer muchas incorporaciones de la presente invención , sin salirse del espíritu y alcance de la misma, la invención reside en las siguientes reivindicaciones.

Claims

26 REIVINDICACIONES 1 . Un método para producir N-acetil-D-glucosamina proveniente de biomasa fúngica, comprendiendo el método: a. proporcionar biomasa fúngica que contiene quitina y glucano; b. degradar al menos una porción de glucano; y c. degradar al menos una porción de quitina para producir N-acetil-D-glucosamina. 2. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y cóma se describe en la reivindicación 1 , el cual comprende además: proporcionar enzimas seleccionadas para degradar la quitina y el glucano; en donde por lo menos una porción de la quitina y el glucano son degradados por medio de enzimas. 3. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque al menos una porción de la quitina y una porción del glucano son degradados químicamente. 4. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la biomasa fúngica antes de ser degradada tiene por lo menos el 5% en peso de quitina y por lo menos el 5% en peso de glucano en una base seca. 5. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y 27 como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la biomasa fúngica antes de ser degradada tiene por lo menos el 15% en peso de quitina y el 50% en peso de glucano en una base seca. 6. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la N-acetil-D-glucosamina resultante comprende al menos el 85% de todos los carbohidratos derivados de la biomasa fúngica. 7. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque al menos el 10% de la quitina es degradada para producir N-acetil-D-glucosamina. 8. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque por lo menos el 50% del glucano es degradado. 9. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la biomasa fúngica es derivada de Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., Absidium sp., Lactarius sp., Saccharomyces sp., Candida sp. o combinaciones de los mismos. 1 0. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la biomasa fúngica contiene por lo menos una parte de glucano por parte de quitina. 1 1 . El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque las 28 enzimas son derivadas de microorganismos, y las enzimas son agregadas a la biomasa fúngica en la presencia de los microorganismos. 12. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque las enzimas derivadas de los microorganismos, y las enzimas son agregadas a la biomasa fúngica substancialmente en ausencia de los microorganismos. 13. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa fúngica no es previamente tratada de manera importante con solventes orgánicos antes de ser degradada. 14. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la quitina y el glucano son degradados enzimáticamente por una quitinasa, una beta-n-acetil-glucosaminidasa, y una glucanasa. 15. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque las enzimas son secretadas de un microorganismo eucariótico. 16. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque el microorganismo eucariótico es seleccionado de microorganismos del Tríchoderma genus. 17. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque el 29 microorganismo eucariótico es seleccionado del grupo de Trichoderma harizianum y Trichoderma reesei. 18. El método de producción de N-acetil-D-glucosamina tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la degradación ocurre en un pH de 4.0 a 6.0, y una temperatura de 20°C a 45°C. 19. La N-acetil-D-glucosamina formada tal y como se describe en el método de la reivindicación 1. 20. Una composición que contiene N-acetil-D-glucosamina derivada de biomasa fúngica, en donde la N-acetil-D-glucosamina comprende por lo menos el 85% de todos los carbohidratos de la composición derivada de la biomasa fúngica. 21. La composición tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizada porque la composición contiene menos del 15% en peso de glucano y derivados de glucano. 22. La composición tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizada porque la biomasa fúngica es derivada de Aspergülus sp., Penicillium sp., Absidium sp., Lactarius sp., Mucor sp., Saccharomyces sp., Candida sp. o combinaciones de los mismos. 30 RESUME N La presente invención se refiere a N-Acetil-D-Glucosamina obtenida de la biomasa microbial, y a métodos para la obtención de N-acetil-D-glucosamina de la biomasa microbial . En particular, la presente invención se refiere al uso de la biomasa fúngica para crear N-acetil-D-glucosamina. La N-acetil-D-glucosamina es obtenida de manera eficiente en alta pureza degradando la quitina en la biomasa fúngica para crear N-acetil-D-glucosamina.