JPH0325159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、種々の酵素活性を有する固定化さ
れた微生物の原核細胞、及び真核細胞、並びに植
物細胞に基礎を置く生物変換用細胞触媒に関す
る。 この発明の細胞生物触媒は、工業的生物変換に
使用することができ、これにより薬品工業、食品
工業及び農業において重要な化合物の非連続的又
は連続的型式による生産が可能になる。 一般に、細胞を固定化する公知方法には、物理
的方法、物理化学的方法及び化学的方法があり、
細胞と担体との結合は細胞をゲル中に包埋するこ
とにより機械的に、フアン・デル・ワールス
（van der Walls）力により、又は極性作用もし
くは共有結合により行われる。改良された水力学
的性質、沈降性及び固定化細胞の分離性を有し、
そして要求される酵素活性の安定性を助長する種
種の水不溶性合成又は天然の有機又は無機担体が
一般に使用される。これら以外の細胞固定化方
法、その利点及び欠点、並びにその経済的限界に
ついて、例えばバンダンメ（Vandamme）
（Chem.Ind.、No.24、1072 1976年）、アボツト
（Abott）（In：Advances Appl.Microbiol.、D.
Perlman、20、203、Acad.Press、ニユーヨー
ク、サンフランシスコ、ロンドン、1976年）、ジ
ヤツク（Jack）及びザジツク（Zajic）
（Advances Biochem.Eng.5、126、1977年）ドウ
ランド（Durand）及びナバロ（Navarro）（Prc.
Biochem.13、No.９、14、1978年）、並びにボジチ
セク（Vojtisec）等（Biologicke listy 44、192、
1979年）に総説されている。 細胞の物理的固定化方法は、例えばチエコスロ
バキア国特許第113908号（寒天）、イタリア国特
許第836462号（トリアセテートセルロース繊維）、
米国特許第3791926号及びソ連国特許第659611号
（アクリルアミドとメチレン−ビス−アクリルア
ミドとのラジカル重合体中に細胞を包埋する方
法）に記載されている。現在、細胞の化学的固定
化法に関する10件の特許が知られている。これら
の方法においては、例えば、共有結合のために
種々の合成重合体又は天然重合体が、予備的な化
学変性及び種々の薬剤による活性化の後に使用さ
れる。多くの合成有機材料又は天然材料、不活性
又は化学的に活性な重合体、例えばメタクリルア
ルデヒド、グリシジルメタクリレート、ヒドロキ
シアルキルメタクリレート、天然重合体、例えば
セルロース及びその誘導体、コラーゲン、ゼラチ
ン、無機材料、例えばガラス、チタン、ジルコニ
ウム及びバナジウム化合物が担体として使用され
る。 この種の担体は、細胞と結合した場合、低い比
活性を供し、そして得られた粒子は摩擦に対する
機械的耐性が弱く、高価であり、そして、その値
格、入手可能性、並びに、しばしば非常に攻撃的
薬剤及び毒性薬剤を用いる種々の化学的変性及び
活性化の技法のために、固定化細胞の製造及び工
業的利用が限定される。 チエコスロバキア発明者証第197101号には、細
胞結合技法の開発及びその工業的重要性について
記載されている。この方法は、ペニシリンアシラ
ーゼ活性を有する生細胞を種々の生物の細胞性担
体と結合せしめることから成る。未処理の及び／
又は物理的、化学的又は生化学的に処理した細
胞、又はこれらの不溶性断片が担体として使用さ
れる。化学的方法には、２個以上の第一及び／又
は第二アミノ基を有する凝集剤によりあらかじめ
物理化学的に凝集せしめた後、多官能価剤、特に
グルタルアルデヒドを用いて共有結合を生じさせ
るという方法が含まれる。この固定化法において
は、種々の発酵の後に得られる廃細胞、その破砕
混合物、又は廃細胞塊を使用することができ、し
かもこれらの価格は通常無視することができ又は
零であるから、経済的限界は回避される。これ以
外の、担体を使用しないさらに有利な化学的細胞
結合法が、チエコスロバキア国発明者証第203607
号に記載されており、そして、担体を用いないで
種々の酵素活性を有する微生物原核細胞及び真核
細胞を相互に固定化するための一般的方法がチエ
コスロバキア国発明者証第209265号に記載されて
いる。この明細書に引用した方法により、所望の
酵素活性を有する種々の微生物の共有結合により
相互に架橋せしめた細胞の非常に安定な生成物
を、良好な沈降性を有する一体に形成した粒子単
位として得ることができる。原理的には、この方
法は、未処理細胞を二官能価架橋剤、特にグルタ
ルアルデヒドと化学的に反応せしめることにより
個々の細胞の細胞内成分を共有結合により架橋
し、そして、これらの細胞の自然的又は人為的自
己消化に対する耐性を生じさせることから成る。
次に、架橋細胞を物理的処理、物理化学的処理又
は化学的処理を単独で又は組合わせて施すことに
より該細胞に透過性を付与し、グルタルアルデヒ
ドと反応しない細胞表面構造の一部分を構成する
高分子物質、特に脂質を放出することにより架橋
細胞の拡散障壁を喪失せしめる。最終段階とし
て、反応中に細胞が相互接触するのに都合のよい
条件例えば凍結、遠心力、過圧等の条件下で、
２個以上の第一及び／又は第二アミノ基を含有す
る共反応水溶性化合物、すなわちポリエチレンイ
ミン及びヘキサメチレンジアミンの混合物中で、
遊離架橋剤、特にグルタルアルデヒドの存在下で
架橋し、そして透過性を付与した細胞を相互に共
有結合せしめる。 上に引用した固定化細胞製造方法によりすでに
細胞生物触媒を十分に経済的な形で製造すること
が可能となつた。しかしながら、低分子の攻撃的
架橋剤の分子、例えばグルタルアルデヒドが非常
に低濃度であつても容易に細胞内に入るために、
細胞中に存在する幾つかの酵素は急速、且つ不可
逆的に不活性化し、このために幾つかの感受性酵
素の活性が大きく低下し、上に引用した方法は普
遍的に使用できるものではない。上記のような不
活性化は、おそらく、共有結合架橋の生成と、そ
れに続く酵素の活性部位の不可逆的な変形によつ
て生ずるものと予想される。このことは、特にラ
セマーゼ活性及びリアーゼ活性を有する細胞にお
いて実験的に示されている。 上記の欠点は、酵素活性を有する未処理細胞も
しくは場合によつては前もつて透過性付与処理を
施した細胞、もしくはこれらの細胞の断片及びこ
れらの細胞の細胞内顆粒；及び／又は未処理細胞
と細胞断片、細胞内顆粒及び細胞溶出成分との混
合物；及び／又は個々の細胞について架橋処理及
び透過性付与処理を施した細胞を、２個以上の第
一及び／又は第二アミノ基を有する水溶性化合
物、例えばポリエチレンイミン、ヘキサメチレン
ジアミン、リジン及びポリリジンと二官能価アル
デヒド、例えばグルタルアルデヒドと反応せしめ
ることにより生成する水溶性反応性重合体により
化学的に固定化し、場合によつてはさらに、該固
定化物を透過性付与処理しそして／又は機械的に
硬化せしめることにより得られるこの発明の細胞
触媒を使用することにより回避することができ
る。 この触媒には、細胞成分として、原核生物の細
胞又は真核生物の細胞、すなわち、グラム陽性細
菌、グラム陰性細菌及びグラム・ラビール細菌、
抗酸菌、放線菌、酵母、並びに糸状菌のごとき他
の顕微鏡的生物、並びに高等な、すなわち寄生生
物、並びに植物細胞、あるいは又、さらにこれら
の細胞の断片及び細胞内顆粒であつて、酵素活
性、すなわちヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リア
ーゼ、脱炭酸酵素、酸化−還元酵素及び他の活性
を有する酵素及び／又は生化学的経路、特に分解
代謝、解糖系、ホルモンの変換、及びアルカロイ
ド、ソランアルカロイド（solane alkaloids）、
シトステロール（phtosterols）及び特に麦角ア
ルカロイドの生産を触媒する酵素系の全部又は一
部分の酵素の活性を有するものを含有せしめるこ
とができる。 上記の触媒の製造方法を提供することがこの発
明の目的であり、この方法は、細胞性材料を、２
個以上の第一及び／又は第二アミノ基を含有する
水溶性化合物、例えばポリエチレンイミンと二官
能価アルデヒド、例えばグルタルアルデヒドと
を、０℃〜50℃にて、水中で、PH4.0〜12.0の範
囲において反応せしめることによつて得られる水
溶性、且つ化学的に活性な重合体と混合し、そし
て該細胞成分と上記の重合体とを、水性環境中−
30℃〜50℃において、PH5.0〜9.0の範囲におい
て、そして場合によつては凝集剤の存在下で反応
せしめ、これにより形成された細胞固定化物又は
凝集体を反応混合物から分離し、水又は緩衝液で
洗浄し、そして場合によつては透過性付与処理及
び／又は機械的硬化処理を行うことにより細胞成
分を固定化することができるという事実に基礎を
置いている。 水溶性重合体の調製及び細胞性材料の前凝集の
ためには、分子量100000〜800000の範囲内の水溶
性ポリエチレンイミンが有用である。 細胞性材料と重合体との反応は、０〜45℃にお
いて、１〜50000ｇの相対遠心力下又は０〜
50000KPaの過圧下において、反応混合物を静
置し、ゆつくり混合し又は間欠的に混合しながら
行うのが好ましい。 固定化前の未処理細胞又は固定化後の細胞凝集
体に対する透過性付与処理は、水性環境下、０〜
70℃、PH4.0〜9.0において、界面活性剤及び／又
は水混和性もしくは非混和性有機溶剤、例えばア
セトン、エーテル、イソプロパノール、石油エー
テル、酢酸ブチル、クロロホルム、ジオキサン、
ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド
の存在下で、そして場合によつては強酸及び／又
は塩基の塩を加えることにより一時に又は逐次に
イオン強度を変化せしめながら細胞懸濁液を混合
することにより行う。 固定化した細胞粒子は、有機溶剤、好ましくは
アセトンにより、又は場合によつては有機溶剤中
もしくは有機溶剤と水との混合物中接着剤溶液に
より−20℃〜25℃にて処理して部分脱水すること
によりさらに硬化せしめることができ、こうして
得た固定化物はさらに取し、そして乾燥環境又
は湿潤環境中で部分乾燥し、場合によつてはさら
に後成形することができる。 この発明の利点は、化学的に反応性の水溶性重
合体（以下RSPと略す）により、高い比活性、
良好な沈降性を有する固定化細胞触媒を、高い固
定化収率をもつて製造することができ、又、低分
子架橋剤を使用する方法と異なり、この発明に従
つて調製したRSPは細胞内に透過できない程度
に高分子であるので細胞表面と活性化RSPの反
応性アルデヒド基との間でのみ共有結合（固定
化）が生ずるので、チエコスロバキア発明者証第
197101号、第203607号及び第209265号の方法を適
用することができない高感受性酵素に適用するこ
とができる点にある。 化学的に活性な水溶性重合体の形成機構、例え
ばポリエチレンイミンと二官能価架橋剤すなわち
グルタルアルデヒドとの機構は、グルタルアルデ
ヒドの末端のアルデヒド基とポリエチレンイミン
の第一又は第二のアミノ基との間の着色シツフ塩
基（Ｃ＝Ｎ結合）を優先的に生成せしめるポリエ
チレンイミン部分の内部架橋反応であつて、分枝
した、及びおそらくポリエチレンイミン鎖の末端
にも含まれている幾つかの第一又は第二アミノ基
の同時的化学的活性化と共にポリエチレンイミン
部分の分子量が増加する反応であると考えること
ができる。 こうして生成した架橋された、化学的に活性な
重合体はなお水性溶液に可溶性であり、この
RSP溶液は透明で黄褐色〜赤褐色の液体である。 一般に、この発明の方法は２つの技術的操作か
ら成つている。第１の段階においては、水性環境
下で、好ましくは反応混合物を混合しながら、排
水処理に使用される市販の凝集剤であつてポリエ
チレンイミンを含有するもの、例えばセデイプー
ル（Sedipur）KA又はセデイプールCL−930を、
二官能価架橋剤、特にグルタルアルデヒドと共に
使用することにより化学的に活性な水溶性重合体
（RSP）を調製する。重合速度は、例えば、着色
シツフ塩基の濃度を反映する可視スペクトルの範
囲（例えば550nｍ）における吸光の変化により
追跡することができ、この濃度は第一に両反応成
分、すなわち架橋剤及び共反応化合物の比率に依
存し、そして、反応時間と温度に依存する。反応
は一次反応に従つて進行する。第２の段階におい
て、あらかじめ培地から分離した所望の酵素活性
を有する未処理の新鮮な微生物細胞又は植物細胞
を、部分的に又は完全に反応せしめたRSP溶液
に加える。問題の酵素の感受性により架橋剤の遊
離溶液の使用が許容される場合には、架橋処理
し、そして透過性付与処理した細胞を加える。さ
らに、未処理細胞と細胞破砕物の懸濁液との混合
物を加えることもできる。使用する固定化技法、
すなわち凍結、静置、ゆるやかな撹拌、過圧効
果、遠心力、懸濁又は形成された粒子の適当な装
置による圧搾、及びこれに続く乾燥又は湿潤環境
下での粒子の部分的乾燥に依存して細胞固定化物
の大きさ、形状、性質、多孔性及び比活性を制御
することができる。 特に、出発材料として未処理細胞を使用する場
合、そして又、固定化した粒子を処理して粒子の
機械的安定性及び耐性を付与する場合、特にアセ
トンもしくは他の有機溶剤により、又は好ましく
は部分乾燥後粒子表面に水不溶性被膜の保護層を
形成する有機溶剤中市販接着剤のごとき溶液によ
り粒子の部分脱水を行う場合には、この発明の固
定化細胞の製造工程中に、固定化前の細胞の透過
性付与処理又は固定化後の細胞凝集体の透過性付
与処理を含める。 この発明の固定化細胞の製造のために、一般
に、目的とする酵素活性（一種類の酵素又は複数
の酵素の）が原形質又は細胞内領域（細胞の細胞
質中）のいかなる場所に存在するかにかかわら
ず、種々の種又は菌株の原核微生物細胞及び真核
微生物細胞を使用することができ、さらに植物細
胞をも使用することができる。一般に、酵素の性
質及び酵素により触媒される生化学的反応のタイ
プは限定要因ではない。原核細胞又は真核細胞の
所定のタイプに従つて特定の化学的技法、例えば
凍結法、静置法、撹拌法等、そして特に固定化の
前及び／又は後における細胞への透過性付与技法
を選択する必要がある。技法の選択は、細胞中に
おける酵素の存在場所、酵素の量又は酵素により
触媒される反応のタイプ、及び細胞表面の知られ
ている又は予想される組成〔ペプチドグリカン、
脂質蛋白質、多糖脂質、キチン、キトーサン
（Chitosan）〕に従つて行う。未処理の生細胞を
固定化する場合には、技法を正しく選択すること
が特に重要である。 前記したこの発明の固定化法の技法はさらに、
固定化細胞の種類及び物理的状態により決定され
る細胞表面成分である反応基の数及び利用性に従
つて選択しなければならない。細胞表面の反応基
の数と利用性が少ない細胞を使用する場合には、
この発明の方法は、２個以上の第一及び／又は第
二アミノ基を有する凝集剤により未処理細胞懸濁
液をあらかじめ凝集せしめることによつて変形す
ることができる。あらかじめ物理化学的に形成し
たこの凝集体は吸引取した後又は直接RSP溶
液に加え、こうして細胞の相互接触を促進せしめ
る。さらに、細胞表面は、反応基によつて富化さ
れる。 この発明の固定化細胞の製造には種々の酵素を
含有する細胞、すなわち、細菌の色々な種及び
株、放線菌、酵母、糸状菌例えば不完全糸状菌、
高度に寄生的な糸状菌、並びに植物細胞を使用す
ることができる。遺伝的改良、選択、集積法及び
遺伝的処理により得られる、固定化物が高い比活
性を有するようにした変異生物の細胞を使用する
のが有利である。 この発明の方法により得られる結合細胞（粒
子）の大きさを、目盛を付した接眼レンズを使用
して顕微鏡（光学顕微鏡）的に測定した。幾つか
の標品を走査電子顕微鏡で観察した。沈降性は次
の方法により試験した。すなわち、2.5ｇの湿潤
標品を全容量が25mlになるようにメスシリンダー
中で脱塩（脱イオン）水に懸濁し、そして粒子の
定量的沈降に必要な時間を測定する。粒子の大き
さの測定にはさらに金属篩を使用した。0.03mm〜
2.00mmの網目を有する３種類の篩により結合細胞
を分離した。 固定化物の酵素活性は、一定温度で撹拌しなが
ら、基質溶液中で一定量の結合細胞粒子を使用し
て測定した。活性は、０次酵素反応の範囲内にお
いて測定し、そして特にことわらない限り比活
性、すなわち粒子の湿重量mg又はｇ当たりの生成
物のマイクロモルμmolとして表わした。固定化
細胞の全連鎖の酵素活性は、測定中にシユークロ
ースから生成するCO₂の総量により、マノメータ
ーを使用して測定した。特にアルカロイド、ソラ
ンアルカロイド及びシトステロールの生成は
HPLCにより測定した。 得られた固定化細胞粒子は、場合によつては有
機溶剤、好ましくはアセトンにより、又は市販の
接着剤溶液により固形化した後、吸引過し、そ
して部分乾燥し、そしてさらに変形し、その大き
さ、形状、性質、多孔性、比活性及び沈降性を調
整することができる。 次の例においては、２個以上の第一及び／又は
第二アミノ基を有する化合物として、分子量
200000〜300000のポリエチレンイミンを約30重
量／容量％含有するセデイプール型の市販凝集剤
（すなわちセデイプールCL−930又はセデイプー
ル−KA）を使用した。 次に、この発明をさらに詳細に説明するために
例を記載するが、これによりこの発明の範囲を限
定するものではない。 例 １ 脱イオン水中セデイプールCL−930（BASF社
製）の1.0重量／容量％溶液100ml及び2.0重量／
容量％溶液100mlを調製した。この溶液を500mlの
丸底フラスコに移し、そしてロータリーシエーカ
ー（260回／分）に装着した。PHが6.1であるこの
溶液に、それぞれ反応混合物中の濃度が0.5容量
％及び1.0容量％となるようにグルタルアルデヒ
ド（メルク社製）の25％水溶液を加えて。反応混
合物を収容したフラスコをアルミニウム箔で覆
い、撹拌を開始し、そして重合速度を550nｍに
おいて分光光度計〔ユニカム（Unicam）、SP−
500、10×10mmのガラスキユベツト〕により追跡
した。反応は、撹拌を継続しながら20℃において
行つた。所定の時間間隔における吸光を脱イオン
水と比較して測定した。両反応混合物におけるシ
ツフ塩基の濃度の増加を示す測定結果を第１表に
示す。

【表】 表中（＋）印を付した数値及びそれより下方に
記載した数値はサンプルを希釈して測定した後計
算して得た値である。 24時間の反応の後、赤褐色に着色したPH4.9の
溶液が得られた。遠心分離により得られたアスパ
ルテートアンモニウムリアーゼ活性を有するアル
カリゲネス・メタアルカリゲネス（Alcaligenes
metmlcaligenes）の未洗浄湿菌体ペースト25ｇ
を、強く撹拌しながら、反応せしめたRSP混合
物に加えた。細胞の比活性は、550μmolL−アス
パラギン酸／分／ｇ湿重量（37℃、PH8.5、基質
1.35Mフマル酸アンモニウム）であつた。それぞ
れの反応混合物に細胞を混合した後、均一な懸濁
液を直径20cmの２個のアルミニウム板に移し、そ
して−20℃のフリーザー中に４時間置いた。懸濁
層の深さを約1.5cmとした。この時間が経過した
後板を取り出し、凍結物を約100mlの脱イオン水
で覆い、そして板を室温に１時間置いた。この解
凍時間の後、形成された凝集体を1000mlの脱イオ
ン水を収容したガラス容器に移し、ゆつくり撹拌
し、静置して定量的に沈降させ、洗浄水を廃棄
し、そして凝集体を1000mlづつの飲用水で３回デ
カントした。次に、粒子を繊維材を通してフリ
ツトガラス上で十分に吸引過しそして重量を測
定した。第１の反応混合物から16.0ｇの湿固定化
細胞が得られ、他方から18.2ｇの湿固定化細胞が
得られた。 両タイプの固定化物を生化学的に分析し、さら
に性質を調べた。結果を次の第２表に示す。

【表】 例 ２ 例１の場合と同様にしてRSP溶液（両反応成
分の出発濃度はセデイプールCL−930が2.0％、
グルタルアルデヒドが1.0％）を調製した。 例１に記載したのと同様にして25mlの細菌細胞
を100mlのRSP溶液と激しく混合した。
512μmolL−アスパラギン酸／分／ｇ湿重量の比
活性を有する十分に吸引過した凝集体17.2ｇを
得た。これを、５％のカナゴム（Kanagom）を
含むあらかじめ−20℃に冷却したアセトン50mlに
懸濁した。これを室温にて３分間混合した後手早
く吸引過し、そして個々の粒子表面上の接着剤
が部分的に乾燥するまで15分間吸引過した。こ
のあと重量を測定し（10.5ｇ）、そしてPH8.5の
1.35Mフマル酸アンモニウム溶液100mlに懸濁し、
８℃にて一夜貯蔵した。これを再度吸引過し、
フリツトガラス上で1000mlの水で洗浄し、吸引
過し、そして重量を測定した（13.0ｇ）。 このものの比活性は180μmolL−アスパラギン
酸／分／ｇ湿重量であり、平均粒子サイズが400
〜600μｍの粗い明瞭な板状固形物から成つてい
た。２分間の静置の後定量的に沈降した。 例 ３ RSP溶液を例１及び２と同様にして調製した。
但し、反応時間は３時間とし、他の反応条件は同
じにした。例１及び２の場合と同様にして、100
mlのRSP溶液に細菌細胞25ｇを加え、その後の
操作は例２と同様にした。但し、凝集体をアセト
ン中接着剤溶液で処理する前に、0.1％の界面活
性剤〔スロバフオール（Slovafol）909〕を含有
するPH8.5の1.0M硫酸アンモニウム水溶液100ml
中で３時間混合（30℃、ロータリーミキサー、
260回／分）することにより凝集体に透過性付与
処理を施し、この後前記の方法により吸引過
し、1000mlの水で洗浄し、再度吸引過し、重量
を測定し（16.0ｇ）、そしてさらに例２に記載し
たように処理した。 250μmolL−アスパラギン酸／分／ｇ湿重量の
活性を有する固定化湿菌体10ｇを得た。このもの
は、300〜550μｍの平均粒子サイズを有する粗
い、明瞭な板状固形物であり、３分間の静置の後
定量的に沈降した。 例 ４ 8.0μmol6−APA／時／mg湿細胞（42℃、PH
7.6、基質としてベンジルペニシリンのカリウム
塩を使用）のペニシリンアシラーゼ活性を有する
エツセリヒア・コリー（Escherichia coli）の未
処理細胞の新鮮なペースト300ｇを、例１に記載
した方法により２％のセデイプールKAと１％の
グルタルアルデヒドとを30℃にて24時間反応せし
めて得たRSP溶液1000mlに、スチール製プロペ
ラで激しく撹拌しながら懸濁し、均一な懸濁液を
得た。次に、懸濁液を、およそ４等分し（約320
ml）、それぞれを別々にポリエチレン袋に入れ、
袋の縁を数回折し曲げ、そして金属製クリツプで
止め、そして、この袋を−20℃〜−25℃のフリー
ザーに約５時間水平に置き、水平においた反応混
合物の層の厚さを0.5〜2.0cmとした。 この後、フリーザーから袋を取り出し、凍結し
た内容物を機械的に破砕し、袋を切り開き、そし
てその内容物をガラス容器中の25℃の脱イオン水
10000mlに入れた。この内容物を、１〜２時間に
わたつて時々混合しながら解凍し、得られた粒子
を定量的に沈降せしめ、洗浄水を廃棄し、5000ml
づつの飲用水で３回デカントした。そして、凝集
体を布により吸引過し、5000mlの飲用水で再
度洗浄し、そして再度吸引過し湿ケーキを得
た。 215ｇの十分に吸引過した湿ケーキを、500ml
のあらかじめ冷却したアセトン−水混合物（１：
１）に、−15℃において混合しながら懸濁し、そ
して室温において希釈アセトン中で３分間激しく
混合した。この後、生成物を手早く吸引過し、
さらに５〜10分間真空過器で吸引過し、約
5000mlの飲用水で洗浄し、再度十分に吸引過
し、そしてPH7.6の0.05M燐酸緩衝液1000mlに懸
濁し、そして８℃にて一夜膨潤せしめた。 6.5μmol6−APA／時間／mg湿重量のペニシリ
ンアシラーゼ比活性を有する合計180ｇの湿固定
化細胞を得た。このものは平均粒径サイズが150
〜450μｍの明瞭な小板状物であり、５分間の静
置の後定量的に沈降した。 例 ５ ペニシリンアシラーゼ活性（比活性：
7.0μmol6−APA／時間／mg湿重量）を有し、チ
エコスロバキア発明者証第203607号に記載されて
いる方法により得た架橋処理及び透過性付与処理
を施したイー・コリー（E.coli）の湿重量230ｇ
の細胞を、例１に記載した方法により調製した
RSP1000mlと混合した。但し、RSP調製のため
の反応時間は５時間とした。細胞を、RSP溶液
中で均一な懸濁液が得られるまで混合した後、ア
セトン−水混合液による処理を含む例４の方法に
従つて固定化細胞を調製した。 ペニシリンアシラーゼ活性を有する総量166ｇ
の湿固定化細胞を得た。このものは比活性が
6.0μmol6−APA／時間／mg湿重量であり、180〜
400μｍの平均粒径サイズを有する明瞭な赤褐色
の小板であり、そして３分間の静置の後定量的に
沈降した。 例 ６ 例４の場合と同様のペニシリンアシラーゼ活性
を有するイー・コリーの新鮮な未処理湿細胞40ｇ
を、例４におけるのと同じRSP溶液150ml中に均
一に懸濁し、そしてこの混合物をポリエチレン製
キユベツトに入れ、固定化細胞粒子に所定の相対
遠心力をかけた。20℃で３時間反応せしめた。反
応後、生成物を水で２回デカントし、布により
真空吸引過し、例４の場合と同様にしてアセト
ン−水混合液で処理し、例４の場合と同様にして
一夜膨潤せしめた。そしてさらに吸引過し、重
量を測定し、さらに性質を調べた。結果を次の第
３表に示す。

【表】 注：固定化物はこの明細書の記載に従
つて評価した。
例 ７ β−ガラクトシダーゼ酵素を含有するイー・コ
リーの新鮮な未処理細胞ペーストを、例１に記載
した24時間反応法により調製したRSP溶液100ml
に懸濁した。但し、両反応成分の出発濃度は、セ
デイプールCL−930を５重量／容量％、グルタル
アルデヒドを2.0容量％とした。隻鮮な未処理細
胞の比活性は、0.42μmolグルコース＋ガラクト
ース／分／ｇ湿重量（37℃、PH7.0、基質として
ラクトース溶液を使用）であつた。 均一な細胞懸濁液を室温に２時間静置すること
により反応せしめた。この後、細胞凝集体のスポ
ンジ状沈澱物を前記の方法により吸引過し、得
られた湿ケーキ状の生成物を真空布袋に移し、
袋の縁を折り曲げて金属製クリツプで止め、この
袋を２枚の金属板の間に水平に配置し、室温にて
２時間、1.25×104KPa（油圧）の過圧をかけ
た。この後、円板状になつた固形物を細片に破砕
し、これを食品ミキサー中の100mlの水に移し、
ミキサーのスイツチを断続しながら低速回転によ
り小粒子に破砕した。破砕及び均一化の後、生成
物を500mlの水で３回デカントし、十分に吸引
過し、重量を測定し（16.2ｇ）、そして0.2％の界
面活性剤（スロバフオール910）及び１％のジメ
チルスルホキシドを含有する1MNaCl溶液100ml
中に移し、この懸濁液を40℃で平衡化し、そして
３時間連続混合した。透過性付与処理の後、粒子
を1000mlの飲用水で３回デカントし、前記の方法
により十分に吸引過し、PH7.0の0.1M燐酸緩衝
液に移し、そして一夜膨潤せしめた。 固定化細胞を過し、そして洗浄した後、非常
に急速に沈降する小塊状の不規則な暗色不定形の
総重量13.2ｇの湿潤物を得た。このものの比活性
は0.12μmolグルコース＋ガラクトース／分／ｇ
湿重量であり、その平均粒子サイズは0.5〜2.6mm
であつた。 例 ８ 例７の場合と同様のβ−ガラクトシダーゼ活性
を有するイー・コリーの未処理細胞30ｇを、0.5
％の界面活性剤（スロバフオール910）を含有す
る0.5MNaCl溶液100mlに加え、この懸濁液を強
力な混合によつて十分に均一化し、そして500ml
の丸底フラスコに移し、このフラスコをアルミニ
ウム箔で覆い、ロータリーシエーカー（260回／
分）に装着した。未処理細胞の懸濁液を30℃にて
20分間連続的に混合することにより細胞に透過性
を付与した。次に、この細胞を遠心分離し
（20000ｇ／10分間）、上澄液を廃棄し、ペースト
状細胞沈澱物の重量を測定した。 上記のように処理した湿細胞26ｇを、例２にお
いて記載したRSP溶液100ml中に懸濁し、懸濁液
を均一化し、そして例２に記載した方法に従つて
反応混合物を凍結することにより細胞を固定化
し、固定化した細胞を例２に記載した方法により
処理し、こうして得た湿粒子17ｇをあらかじめ−
20℃に冷却した50mlの純アセトンに懸濁した。ア
セトン処理を３分間で終了し、処理物を手早くフ
リツトガラス上で吸引過し、水で洗浄し、そし
てPH7.0の0.1M燐酸緩衝液中で、８℃にて一夜膨
潤せしめた。 こうして、0.38μmolグルコース＋ガラストー
ス／分／ｇ湿重量のβ−ガラクトシダーゼ比活性
を有する総重量12.6ｇの固定化湿細胞を得た。こ
のものの平均粒子サイズは85〜400μｍであり、
不規則な縁を有する小板状をしており、そして５
分間の静置の後定量的に沈降した。 例 ９ 38アゾカゼイン単位／ｇ湿重量（37℃、PH7.5、
基質としてアゾカゼイン使用）を有する指数増殖
期の終了前に集菌したバシルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）の新鮮な未処理湿細胞
2.5Kgを、10000mlの脱塩水に懸濁し、この懸濁液
を激しい混合により均一化し、そして５℃に冷却
した。この懸濁液を細孔機械的破砕機中で250気
圧にて３回破砕した。それぞれの破砕処理の間に
連続的に冷却し、破砕混合物の温度が35℃を超え
ないようにした。 全量1000mlの破砕細胞懸濁液のPHを、連続混合
しながら20％NaOH溶液により7.5に調整し、破
砕懸濁液中の最終濃度が0.25容量％となるように
凝集剤（セデイプールKA）を加えた。この懸濁
液を十分に混合し、約１時間室温に静置し、この
間に細胞片を完全に凝集せしめた。 この後、例１に記載したようにして24時間反応
により調製したRSP溶液2000mlを、1000mlの懸
濁液に加えた。但し、例１と異なり、RSPの調
製における両反応成物の出発濃度は、セデイプー
ルKAを４重量／容量％、グルタルアルデヒドを
２容量％とした。あらかじめ形成した凝集粒子が
破壊されるのを回避しながら、両成分をステンレ
ス製撹拌棒によりゆつくりと混合した。２時間静
置した後、粘度の高い部分的に反応した懸濁液を
ゆつくり混合し、そして約0.3づつを10個のポ
リエチレン袋に移した。さらに、例４の場合と同
様にして処理した。但し、固定化粒子は、激しく
撹拌しながら、あらかじめ−20℃に冷却したアセ
トンにより３分間処理した。そして、この処理物
を手早く吸引過し、水で数回デカントし、そし
てPH7.5の0.1M燐酸緩衝液1000mlに移し、そして
８℃にて一夜膨潤せしめた。 こうして得た懸濁液を篩上で洗浄しながらゆつ
くりと処理することにより1.28Kgの湿固定化粒子
を得た。この固定化物の比活性は3.62アゾカゼイ
ン単位／ｇ湿重量であり、平均粒径サイズは0.4
〜2.0mmであり、そして２分間の静置により粒子
が定量的に沈降した。 例 10 蛋白質分解性を有するバシルス・メガテリウム
の新鮮な未処理湿細胞50ｇを、0.05％NaCl水溶
液100mlに懸濁し、このPHを例９において記載し
たように20％NaOHにより7.0に調製した。懸濁
液を均一化した後PHを再度7.0に調整し、凍結乾
燥した卵リゾチームを最終濃度が100μｇ／mlに
なるように添加し、30分後、NaOHにより懸濁
液のPHを注意深く8.6に調整し、そして、この懸
濁液を、該懸濁液の粘度が急激に変化し、そして
細胞壁が酵素的に分解されるまで数分間50℃に加
熱した。 例９に記載した反応成分を含有するRSP溶液
100mlを、あらかじめ凝集せしめることなく、懸
濁液に加えた。この懸濁液を激しく混合し、さら
に例８（反応混合物の凍結）と同様に固定化し、
粒子をアセトンで処理した。 2.4アザカゼイン単位／ｇ湿重量の活性を有す
る固定化湿粒子30ｇを得た。平均粒子サイズは
0.2〜1.0mmであり、３分間の静置の後定量的に沈
降した。 例 11 0.017μmolグルコース＋ガラクトース／分／mg
湿重量のβ−ガラクトシダーゼ（37℃、PH6.0、
基質としてラクトースを使用）を含有する酵母ク
ルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces
fragilis）の未処理湿細胞ペースト30ｇを、0.1％
の界面活性剤（スロバフオール910）及び１％の
ジメチルスルホキシドを含有するPH7.0の0.1燐酸
緩衝液100ml中に懸濁し、そしてこの懸濁液を40
℃に加熱し、30分間連続撹拌した。この後、透過
性を付与した細胞を遠心分離し（5000ｇ、10分
間）、上澄液を廃棄し、そして沈澱した細胞ペー
ストの重量を測定した。 透過性を付与した湿細胞25ｇを、例８の方法に
従つて固定化した。但し、固定化後の粒子をアセ
トン中カナゴン１％溶液で処理した。処理及び膨
潤における他の条件は例８に記載した通りとし
た。 0.02μmolグルコース＋ガラクトース／分／mg
湿重量の比活性を有する固定化湿細胞15ｇを得
た。粒子サイズの分布は0.2〜1.5mmの範囲であ
り、そして粒子は２分間の静置の後定量的に沈降
した。凝集体は線状であり、その沈澱物は比較的
大であつた。 例 12 比活性5.9μmolL−リジン／時／mg湿重量（37
℃、PH7.5、Ｌ−α−アミノ−ε−カプロラクタ
ム水溶液）のＬ−α−アミノ−ε−アミノカプロ
ラクタムヒドロラーゼ活性を有する酵母クリプト
コツカス・ラウレンテイー（Cryptococcus
laurentii）の新鮮な未処理細胞25ｇを、例２の方
法に従つて調製したRSP溶液100mlに懸濁した。
１時間ゆつくり撹拌した後、高粘性線状懸濁液
を、例２の凍結技法を用いて固定化し、固定化後
の凝集体を例２の方法に従つてアセトン中接着剤
溶液により処理した。吸引過して得られた凝集
体を、８℃においてPH7.0の燐酸緩衝液中で一夜
膨潤せしめた。 3.2μmolL−リジン／時／mg湿重量の比活性を
有する固定化湿細胞15ｇを得た。平均粒子サイズ
は0.125〜1.5mmの範囲であり、この定量的沈降は
２分間の静置の後に生じた。この固定化物は、肉
眼的には不定形の線状構造を有し、顕微鏡的には
不規則な縁を有する不規則な構造を有していた。 例 13 7.1単位／ｇ湿重量（１単位は30℃、PH5.5にお
いて５分間でＬ−アスパラギン酸から100μの
CO₂を発生する酵素量である）の比活性のＬ−ア
スパラギン酸脱炭酸酵素を含有するミコバクテリ
ウム・エスピー（Mycobacterium sp.）の新鮮
な未処理細胞の湿ペースト30ｇを、例２の場合と
同じRSP溶液100mlに懸濁し、均一な懸濁液を生
成せしめた。そして例２と同様にして反応混合物
を凍結し、デカントし、洗浄し、そして吸引過
し、そして19.6ｇの固定化湿細胞を得た。 上記の量の粒子を、0.5％の界面活性剤（スロ
バフオール910）を含有するPH6.5の1MNaCl溶液
100mlに懸濁した。この懸濁液にクロロホルム
（５容量％）を加え、そして混合しながらこの懸
濁液の温度を35℃にし、この温度において１時間
激しく混合した。これを1000mlの水で希釈し、
0.5の水で３回デカントし、透過性を付与した
粒子を前記のように吸引過し、あらかじめ−25
℃に冷却した50mlのアセトンに懸濁し、そして室
温にて３分間激しく混合した。粒子を再度吸引
過し、フリツトガラス上で十分に水洗し、PH6.0
の0.05M酢酸緩衝液50mlに懸濁し、そして８℃に
て一夜膨潤せしめた。 4.0単位／ｇ湿重量の比活性を有する固定化湿
細胞14.2ｇを得た。粒子サイズ分布は75〜800μｍ
の範囲であつた。この粒子は、肉眼的には湿潤表
面の少ない不定形線状フレーク形を有していた。
固定化細胞はほとんど自然沈降しなかつた。すな
わち、粒子は液の上層に残留した。しかし過性
及び吸引過性は良好であつた。 例 14 比活性16.4単位／ｇ湿サンプル（１単位は、30
℃、PH5.5においてＬ−リジンから100μのCO₂
を発生せしめる酵素量）のＬ−リジン脱炭酸酵素
を含有するバクテリウム・キヤダベリス
（Bacterium cadaveris）の新鮮な未処理湿細胞
30ｇを、例２の場合と同様のRSP溶液100mlに懸
濁した。さらに例２の場合と同様にして凍結、デ
カント、洗浄、及び吸引過を含む処理を行つ
た。24ｇの固定化湿細胞を得た。 上記の量は吸引過粒子を、0.1％の界面活性
剤（スロバフオール909）を含有するPH6.5の
1MNaCl溶液100mlに懸濁し、この懸濁液を37℃
にて１時間連続混合した。固定化し、そして透過
性付与処理を行つた菌体を、例13に記載した方法
によりさらに処理した。 11.8単位／ｇ湿重量の比活性を有する固定化湿
細胞19.1ｇを得た。この固定化物は、平均粒子サ
イズが180〜600μｍであり、粒子は顕微鏡的には
明瞭な小板状であり、肉眼的には不定形褐色粒子
であり、３分間の静置の後定量的に沈降した。 例 15 148単位／ｇ湿重量（30℃、PH4.75、基質とし
てシユークロースを使用）の比活性のインベルタ
ーゼを含有する酵母サツカロミセス・セレビシエ
ー（Saccharomyces cerevisiae）の新鮮は未処
理湿細胞20ｇを、例２の場合と同じRSP溶液100
mlに懸濁し均一な懸濁液を得た。さらに、例２に
記載した方法により、凍結及びその他のすべての
操作を含む固定化処理を行つた。細胞を例８と同
様にアセトンで処理した。 90単位／ｇ湿重量の比活性を有する固定化湿細
胞12.1ｇを得た。粒子サイズの平均分布は0.32〜
2.0mmであり、粒子は、顕微鏡的には縁に亀裂を
有する不規則な形状の不明瞭な構造を有し、肉眼
的には淡褐色〜ベージユ色の不定形粒子であり、
２分間の静置の後定量的に沈降した。 例 16 酵母サツカロミセス・コレアヌス
（Saccharomyces coreanus）を液体培養した後
の培地１を遠心分離〔ジツネツキ（Janetzki）
Ｓ−70、3000ｇ、10分間〕し、上澄液は廃棄し、
そして新鮮な未処理湿菌体28ｇを得た。 こうして得た量のペースト状の新鮮な酵母菌体
を、例２に記載した方法により調製したRSP溶
液100mlに懸濁し、この懸濁液を激しく混合して
十分に均一化し、そして反応混合物を小型往復式
実験室振とう機に装着し、温度にて１時間振とう
（50回／分）した。そして混合を停止し、懸濁液
を上記の温度にて３時間静置した。この後、生成
した凝集体の高粘性スポンジ状マツシユを500ml
のポリエチレン製キユベツトに移し、そして上記
のようにして遠心分離し、上澄液を廃棄し、沈澱
物は脱イオン水に懸濁し、そしてゆつくり混合し
て250mlの水で３回デカントした。凝集体のデカ
ント及び定量的沈澱の後、固定化物を真空過
し、約100mlの水で再度洗浄し、そして重量を測
定した（14ｇ）。これをあらかじめ−25℃に冷却
したアセトン25ml中に懸濁して強く混合し、フリ
ツトガラス上で手早く吸引過しそして約1000ml
の脱イオン水で洗浄し、再度十分に吸引過し、
そして重量を測定した（９ｇ）。得られた固定化
湿菌体を上記の遠心分離上澄液（酵母を培養した
後の培地）に懸濁し、そして室温にて数時間膨潤
せしめた。 固定化物を再度十分に真空過し、湿菌体100
mgをワールブルグ容器に入れ、遠心分離した透明
な発酵液（PH4.6）を２ml加え、12.5％シユーク
ロース0.5mlをワールブルグ容器の側室に入れ、
第１の対象容器には未処理固定化菌体（100mgの
未処理湿ペースト）を入れ、そして２mlの遠心分
離した発酵液を加えた。第２の対象容器には上澄
液のみ（菌体を加えない）を入れ、そしてシユー
クロースを側室に入れ、そしてマノメーターを取
り付け、振とう機のスイツチを入れ、30℃にて15
分間インキユベートした。マノメーターの脱気を
行い、シユークローズ溶液を側室から注入し、そ
して発生するCO₂の測定を開始した。 第１の対象（未処理未固定化菌体）においては
3064μ／時のCO₂が発生し、第２の対象（菌体
を含まない上澄液のみ）ではCO₂の発生がなく、
第３の測定（第１の対象の場合と同濃度の固定化
菌体を使用）においては165μ／時のCO₂が発生
した。この量は、最初の（固定化してない）菌体
の全代謝活性の5.4％に相当する。 酵母固定化物は、顕微鏡的には不規則な形状の
明瞭な粒子として観察され、肉眼的にはベージユ
色の不定形粒子として観察された。１分間の静置
により定量的に沈降し粒子サイズの分布は300〜
900μｍであつた。 例 17 比活性100μmolL−アスパラギン酸／分／ｇ湿
重量（37℃、PH5.0、基質としてＬ−アスパラギ
ンを使用）のＬ−アスパラギンアミノヒドロラー
ゼ酵素を含有するエルウイニア・アロイデア
（Erwinia aroidea）の新鮮な未処理湿菌体ペー
ストを、例７に記載した方法によりRSP溶液100
ml中に懸濁した。この懸濁液を激しく混合して均
一化し、例16の場合と同様に30分間ゆるやかに撹
拌し、そして１時間室温において。この後、粘調
なスポンジ状物を500mlのポリエチレン製キユベ
ツトに注入し、5000×ｇで30分間遠心分離した。
上澄液を廃棄し、例７に記載したようにして沈澱
物に過圧をかけた。但し、沈澱粒を約５分間油
圧手段により圧搾し（RSP液部分を搾除する）、
脆い固形物を破砕し、特殊な鋼製の１mm孔径のイ
ンサートを有する肉用ホモジナイザーに入れ、こ
のインサートを通して棒状顆粒形に押出し、この
顆粒を25℃にて約３時間空気乾燥し、水で３回デ
カントし、脱イオン水中で一夜膨潤せしめた。お
よび１〜３mmの長さの棒状で不規則な粒子サイズ
を有する比活性64μmolL−アスパラギン酸／ｇ湿
重量の固定化菌体の総重量８ｇの顆粒状固形物を
得た。このものは数10秒間で定量的に沈降した。 例 18 比活性0.21μmolフラクトース／分／ｇ湿重量
（60℃、PH6.85、基質としてグルコースを使用）
のグルコースイソメラーゼ酵素を含有するストレ
プトマイセス・パエオクロモゲネス
（Streptomyces phaeochromogenes）の新鮮な
未処理湿菌体ペースト50ｇを、PH7.0の0.1MNaCl
溶液200mlに懸濁し、この懸濁液を70℃にて10分
間連続撹拌しながら加熱した。次に、この懸濁液
を冷却し、そして遠心分離した（5000×ｇ、15
分）。上澄液は廃棄し、沈澱物は、例７の方法に
従つて調製したRSP溶液150mlに懸濁した。さら
に、遠心分離、短時間の圧搾、破砕、及び乾燥を
含む例17に記載した方法による固定化操作を行つ
た。但し、後成形した固定化菌体の顆粒は、２％
の接着剤（カナゴン）を含有するあらかじめ冷却
したアセトン50mlで−28℃にて３分間処理した。
そして粒子を手早く吸引過し、約1000mlの
0.05M燐酸緩衝液で洗浄し、再度吸引過し、そ
して100mlの同じ緩衝液に懸濁し、そして８℃に
て一夜貯蔵した。 総量20ｇの固定化菌体の顆粒状湿固形物を得
た。比活性は0.1μmolフラクトース／ｇ湿重量で
あり、粒子は小棒状であり、粒子サイズは不規則
で0.5〜3.0mmの範囲であつた。固定化物は数10秒
の間に定量的に沈降した。 例 19 比活性0.1μmolH₂O₂／分／mg湿重量のグルコー
スオキシダーゼ酵素とカタラーゼを含有するアス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の未
処理湿菌体ペースト45ｇを、例７の方法により調
製したRRP溶液150mlに加えた。さらに、例７に
記載した方法により固定化処理を行つた。但し、
後成形した顆粒は、室温にて24時間、40％湿度の
空気（H₂SO₄）で乾燥した。この後、菌体を脱
イオン水に移し、そして８℃にて24時間膨潤せし
めた。 0.045μmolH₂O₂／ml湿菌体の比活性を有する総
計29ｇの固定化湿菌体を得た。粒子サイズは不規
則で0.5〜3.0mmの範囲であつた。粒子の形は棒状
であつた。この固定化物は数10秒間に定量的に沈
降した。 例 20 シユークロースによる高張圧環境下でソランア
ルカロイド及びシトステロールを合成する植物ソ
ロニウム・アビクラレ（Solanum aviclare）（単
細胞培養）の新鮮な洗浄湿細胞20ｇを、例２の方
法に従つて調製したRSP溶液100mlに懸濁し、激
しく混合して得た均一懸濁液をアルミニウム製皿
（直径15cm）に移し、そしてこれを−19℃のフリ
ーザー中に４時間置いた。凍結した反応混合物を
フリーザーから取り出し、そして0.75MのKClを
含有するPH5.7の0.05M燐酸緩衝液約50mlで覆つ
た。２時間室温においた後、植物細胞の凝集体を
1000mlの上記の緩衝液に移し、常に粒子を定量的
に沈降せしめながらこの緩衝液で数回デカントし
た。次に固定化細胞を十分に真空過し、フリツ
トガラス上で緩衝液により洗浄し、再度吸引過
し、そして重量を測定した（18ｇ）。 次に、粒子を、殺菌した８重量／容量％のシユ
ークロース水溶液100mlに移し、そしてこの懸濁
液を20℃にて24時間間隔で３回電磁撹拌機で撹拌
した。凝集体を分離した後、ソランアルカロイド
及びシトステロールの細胞外生産を、ジルク
（Jirku）等（Biotechnol.Letters、３、No.８、
447、1981年）により記載された方法により、
HPLCを用いて24時間間隔で追跡した。 24時間×３期の間、上記の固定化細胞による上
記の物質の生産が維持された。粒子を走査電子顕
微鏡で観察したところ、植物細胞相互間の結合が
認められた。 例 21 例20と同様の新鮮な未洗浄植物細胞30ｇを、
0.75MのKClを含有する0.05M燐酸緩衝液100mlに
懸濁した。混合しながら、均一な細胞懸濁液に凝
集剤（セデイプールKA）を加えた（0.5容量％）。
混合した後、細胞の凝集が視覚的に観察できるよ
うになるまで室温に１時間置いた。この後、懸濁
液を注意深く（生成したフレークが崩壊しないよ
うに）フリツトガラス上に移し、そして繊維
（布）を通してゆつくりと、且つ十分に真空過
した。過剰の液を吸引除去し、そして得られた固
形物を、混合することなく、例10の方法に従つて
調製したRSP溶液100mlに加え、そしてこの懸濁
液をゆつくり撹拌することにより注意深く均一化
した。均一化した後、懸濁液を１時間室温にお
き、さらに、例12の方法に従つて固定化した。但
し、凍結温度は−25℃とした。 ４時間凍結した後、凍結物をフリーザーから取
り出し、そして例20の方法に従つてその後の操作
を行つた。但し、室温での解凍時間は１時間とし
た。固定化し、洗浄し、そして十分に吸引過し
た細胞20ｇを得た。 次に、粒子を例20に記載したのと同じ媒体に移
した。但し、ソランアルカロイドとシトステロー
ルの生合成は、生物触媒床を通してシユークロー
ス溶液を５×24時間再循環することにより行つ
た。例20に記載した方法により、ソランアルカロ
イド及びシトステロールの生産を24時間間隔で追
跡した。 上記物質の生産及び生産周期は24時間×５期間
維持された。 例 22 分子量40000〜50000のポリリジン0.1重量／容
量％を含有する溶液、及び分子量26200のポリリ
ジン１重量／容量％を含有する溶液を、それぞれ
25mlづつ調製した。分子量40000〜50000のポリリ
ジンは蒸留水に溶解し、分子量26200のポリリジ
ンは0.1Mトリス緩衝液（PH8.0）に溶解した。第
１の溶液（分子量40000〜50000のポリリジン溶
液）においては反応混合物中の実際の濃度が0.3
容量％になるように、第２の溶液（分子量26200
のポリリジン溶液）においては0.5容量％になる
ように、両溶液に25％グルタルアルデヒド水溶液
を加えた。反応混合物を収容した容器をロータリ
ーシエーカーに装着し、反応混合物を30℃にて10
時間連続混合した。重合速度すなわちシツフ塩基
の生成速度を、例１に記載した方法に従つて分光
光度計により追跡した。但し、430nｍで測定し
た。 インベルターゼ活性（比活性14μmolグルコー
ス／分／mg乾燥重量、30℃、PH4.8、基質として
シユークロースを使用）を有する酵母サツカロミ
セス・セレビシエーの新鮮な未処理菌体６ｇを、
RRP溶液に懸濁して均一な懸濁液を調製した。
この懸濁液を往復式実験室振とう機上で１時間混
合し、そして２時間静置し、次に粒子を遠心分離
し（10分間、5000ｇ）、沈澱物を針を付けてない
注射器にとり、ペースト状固形物をアルミニウム
箔上に棒状に押出した。未洗浄のまま後成形した
粒子を室温にて６時間乾燥し、そしておよそ同じ
大きさの粒子に均一化し、５℃にて一夜、水中で
膨潤せしめた。膨潤した粒子を真空過し、数回
水洗し、十分に吸引過し、そして重量を測定し
た。 第１の場合及び第２の場合において、それぞれ
276μmolグルコース／分／ｇ湿重量の比活性を有
する総湿重量5.6ｇの粒子、及び387.2μmolグルコ
ース／分／ｇ湿重量の比活性を有する湿重量3.6
ｇの粒子を得た。いずれの場合にも、粒子は膨潤
後直径1.2mm、平均長さ1.45〜４mmの棒状固形物
であつた。この固定化物は数秒間で定量的に沈降
した。 387.2μmolグルコース／分／ｇ湿重量の比活性
を有する湿重量５ｇの固定化菌体を、PH4.9の
0.05M酢酸緩衝液にシユークロースを溶解した
0.5M溶液50mlに懸濁し、シユークロースのグル
コースとフラクトースの混合物への転化を、30℃
において連続混合（100回／分で低速回転するい
かり型撹拌機）しながら行つた。使用した条件下
で酵素的転化は３時間で完結した。同じバツチの
生物触媒を使用してこの方法法を10回繰り返し
た。各反復酵素転化の後、ポリアミド網により粒
子を篩別し、上記の緩衝液で洗浄し、そして上記
のごとくして再使用した。同じ固定化菌体を10回
反復使用した場合の平均酵素転化率は92.6％であ
つた。 例 23 PH8.2の0.1Mトリス緩衝液中工業用Ｌ−リジン
（活性成分含量89％）の10％溶液50mlを調製した。
反応混合物中のグルタルアルデヒドの濃度が５容
量％となるように上記の溶液にグルタルアルデヒ
ド水溶液（25％）を加えた。この反応混合物を、
例22に記載した条件下で連続混合した。但し、反
応時間は24時間とした。 この後、例22に記載したのと同じ酵素活性を有
する同じ微生物の湿重量12ｇの新鮮な菌体を、
RRPの暗褐色溶液50mlに懸濁した。この懸濁液
を低速振動撹拌器で均一化し、アルミニウム箔皿
に移し、そして24時間−20℃のフリーザーに置い
た。次にこの皿を取り出し、この内容物を室温に
て自然解凍せしめた。高粘性スポンジ状混合物を
遠心分離し（10000ｇにて15分間）、そして上澄液
を廃棄し、沈澱物を注射器にとつた。これ以後の
操作は例22に記載したのと同様に行つた。但し、
後成形した粒子の空気乾燥は10時間で終了した。 例22に記載した方法に従つて過、洗浄及び膨
潤を行つた後、比活性180μmolグルコース／分／
ｇ湿重量のインベルターゼ活性と1.2〜3.7mmの平
均粒子サイズを有する湿重量2.8ｇの粒子を得た。
膨潤後固定化物はスポンジ状のやや軟かい粒子で
あり、数秒間で定量的に沈降した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ポリエチレンイミン、ヘキサメチレンジアミ
   ン、リジン又はポリリジンと二官能価アルデヒド
   との反応により生成した水溶性反応性重合体によ
   り、酵素活性を有する、未処理細胞もしくは場合
   によつては透化性付与処理を施した細胞、もしく
   はこれらの細胞の断片及び細胞内顆粒；及び／又
   は未処理細胞と細胞断片、細胞内顆粒及び細胞溶
   出成分との混合物；及び／又は個々の細胞につい
   て架橋処理及び透過性付与処理を施した細胞を化
   学的に固定化し、場合によつてはさらに該固定化
   物に透過性付与処理を施し、そして／又は該固定
   化物を機械的に硬化せしめて成る生物的変換用細
   胞触媒。 ２ ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、脱
   炭酸酵素、酸化還元酵素、もしくは他の酵素、及
   び／又は生化学的代謝経路の一部を成す酵素群、
   もしくはホルモンの生物変換もしくはアルカロイ
   ドの生産を触媒する酵素の活性を有する原核細胞
   もしくは真核細胞であるグラム陽性細菌、グラム
   陰性細菌もしくはグラム・ラビール細菌、抗酸
   菌、放線菌、酵母、糸状菌、もしくは植物細胞、
   又は前記の細胞の断片及び細胞内顆粒を含んで成
   る特許請求の範囲第１項記載の細胞触媒。 ３ 分子量100000〜800000のポリエチレンイミン
   とグルタルアルデヒドとの反応により生成した水
   溶性、且つ化学的に活性な重合体により前記細胞
   性材料を化学的に固定化して成る特許請求の範囲
   第１項又は第２項記載の細胞触媒。 ４ 未処理細胞もしくは場合によつては透化性付
   与処理を施した細胞、もしくはこれらの細胞の断
   片及び細胞内顆粒；及び／又は未処理細胞と細胞
   断片、細胞内顆粒及び細胞溶出成分との混合物；
   及び／又は個々の細胞について架橋処理及び透過
   性付与処理を施した細胞を、水性媒体中−30℃〜
   50℃、PH5.0〜9.0の範囲において、そして場合に
   よつては凝集剤の存在下で、ポリエチレンイミ
   ン、ヘキサメチレンジアミン、リジン又はポリリ
   ジンと二官能価アルデヒドとを水性媒体中で０℃
   〜60℃、PH4.0〜12.0において反応せしめて得ら
   れる水溶性且つ化学的に活性な重合体と接触せし
   めることにより固定化し、反応混合物から固定化
   物を分離し、水又は緩衝液で洗浄し、そして場合
   によつては透過性付与処理及び／又は機械的硬化
   処理を行うことを特徴とする生物的変換用細胞触
   媒の製造方法。 ５ 分子量100000〜800000のポリエチレンイミン
   を水溶性重合体の製造、及び場合によつては細胞
   類の予備凝固に使用することを特徴とする特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 ６ 前記の細胞類と前記の重合体との反応を０℃
   〜45℃において、そして１〜50000ｇの相対遠心
   力下、又は０〜50000Kpaの過圧下で、静置し
   て、もしくはゆつくり混合しながら、もしくは静
   置と混合を繰り返しながら行うことを特徴とする
   特許請求の範囲第４項又は第５項記載の方法。 ７ 固定化前の細胞又は固定化後の細胞凝集体の
   透過絶付与処理を、水性環境中０℃〜70℃、PH
   4.0〜9.0において、界面活性剤、及び／又は水混
   和性有機溶剤及び／又は水不混和性有機溶剤の存
   在下で、場合によつては強酸及び／又は塩基の塩
   を加えることにより懸濁液中のイオン強度を一時
   に又は逐次に変化せしめながら、細胞懸濁液を混
   合することによつて行うことを特徴とする特許請
   求の範囲第４項又は第６項記載の方法。 ８ 場合によつてはさらに、有機溶剤による部分
   脱水により、又は有機溶剤もしくは有機溶剤と水
   との混合物中接着剤溶液により、−25℃〜20℃の
   範囲の温度において固定化細胞の機械的硬化を行
   い、そしてこの固定化物を吸引過し、そして乾
   燥条件下もしくは湿潤条件下で部分乾燥を行い、
   又は場合によつては適当に後成形することを特徴
   とする特許請求の範囲第４項又は第５項記載の方
   法。