CN1059759A

CN1059759A - 复合固定化酶的制备方法

Info

Publication number: CN1059759A
Application number: CN 90108304
Authority: CN
Inventors: 张绍镇; 陆维新; 王忠秋; 靳庆生; 王晓东
Original assignee: HEBEI NORMAL COLLEGE; Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: HEBEI NORMAL COLLEGE; Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 1990-10-20
Filing date: 1990-10-20
Publication date: 1992-03-25

Abstract

本发明是一种制备复合固定化酶的方法，包括如下步骤：

(1)制备共轭固定化酶：将通过处理已附着于多孔载体上具有侧胺基的聚胺化合物与胺反应性物料 ——种双功能化合物，如戊二醛中的一个胺反应性基团相反应，它的另一个胺反应性基团与酶或酶类的自由胺基反应，并与其相联接构成共轭固定化酶。

(2)将共轭固定化酶与产生该酶的微生物细胞共同包埋于一种或一种以上包埋剂中，构成复合固定化酶。

Description

本发明提出并详加阐明“复合固定化酶”（Complex Immobi-lized Enzymes）的制备方法，属生物工程领域。

在医药、食品和工业上用途日益广泛的酶，其本质属于蛋白质，通常是水溶性的，且一般是不稳定的。由于酶在溶液中应用只能是一次性的，在工业生产中引起种种不便。于是发明了固定化酶的种种方法。各种酶类的固定化方法以及生产酶类的微生物细胞的固定化方法在文献中已有大量记载。现将有关的背景材料特别是涉及葡萄糖异构酶方面的有关背景材料作一概述。

1965年，Tsumura（津村）、Takasaki（高崎）等分别发现了适合工业生产的葡萄糖异构酶生产菌种-暗色产色链霉菌（Strepto-myces phaeochromogenes）和白色链霉菌（Streptomyces albus）。1966年日本参松公司生产出酶法异构糖浆。1974年固定化葡萄糖异构酶工业化成功，推动固定化生物催化剂研究发展。我国1970年以来对玫瑰红链霉菌336、高温放线菌M1033、游动放线菌等生产葡萄糖异构酶的菌种、发酵、固定化工艺均作了研究。1988年全国固定化生物催化剂学术讨论会论文概括了固定化酶等各方面的进展。

本发明提供一种制备复合固定化酶的方法，它包括如下内容：

（1）制备共轭固定化酶，其步骤如下：

（a）多孔载体与具有侧胺基聚胺化合物溶液接触，使聚胺附着于多孔载体上;

（b）用无离子水洗涤，排除出溶剂和分散其中并未附着的聚胺，然后用已处理的多孔载体与胺反应性物料接触，该溶液是一种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酸酐、或是一种多功能偶氮化合物，使其中一个胺反应性基团与侧胺基起反应，留下另一胺反应性基团可以进行进一步反应;

（c）用无离子水洗涤，排除出溶剂和任何溶于其中而又未反应的胺反应性物料。已处理的多孔载体与至少一种酶溶液接触，以引起酶的胺基与未反应的胺反应性基团反应，通过共价键的形式固定酶。

本发明中多孔载体包括：

（1）颗粒硅藻土（Granular diatomaceous earth），

（2）空心微珠（Cenosphere），

（3）甲壳质（Chitin）。

颗粒硅藻土的物理化学性质如下：

物理性质：

颗粒大小：120-180目

密度：575公斤/立方米

形状：球形

挤压强度：17.6-18.6公斤/平方厘米

颜色：白至浅褐

平均表面积：40平方米/克

平均孔体积：0.16毫升/克

平均孔径：10-40微米

化学成分（%）及性质：

SiO₂：90.0

AL₂O₃：6.5

Fe₂O₃：2.3

CaO：0.2

MgO：0.3

其它氧化物：0.3

含水量：少于1.0

溶液pH：6.5-7.0

结构：主要是无定形硅藻土。

这种多孔颗粒硅藻土由于化学上稳定，物理上刚性和价格低廉，因而它可以做为一种多孔性无机载体。

空心微珠的理化性质如下：

1、外观：园球形

2、粒度：粒径为1～300微米

3、容重：250～400公斤/立方米

4、比重：0.5～0.75克/立方厘米

化学成分（%）：

SiO₂51.32～65.98

Al₂O₃22.62～39.86

Fe₂O₃2.18～8.73

CaO 0.49～3.35

MgO 0.86～1.96

本发明中适用的聚胺包括：聚乙稀二胺、聚乙烯亚胺、聚亚甲基二胺、聚六亚甲基二胺、聚四亚乙基五胺、多乙烯多胺。经聚胺处理的多孔载体，接着用胺反应性物料处理。

胺反应性物料是戊二醛、甲苯-2，4-二异硫氰酸盐、重氮基联苯胺。胺反应性物料的浓度为每升溶液含1-10克。水溶性胺反应性物料和非水溶性胺反应性物料分别溶于水及有机溶剂再应用于多孔载体。有机溶剂包括：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、甲醚、***、丙醚、异丙醚。反应一定时间，以使胺反应性物料从聚胺衍生游离胺基，已处理的多孔载体，用无离子水洗涤几次。

应用本发明，先用无离子水洗涤多孔载体直至干净，然后真空排气。将聚胺溶液，配制成一定浓度，如用多乙烯多胺加到已洗涤的多孔载体上，多孔载体与多乙烯多胺水溶液体积比值约为1∶5，多乙烯多胺水溶液浓度约为0.1%-0.5%，在20-30℃轻度搅动下，有效反应时间2-5小时，过量的多乙烯多胺溶液用水洗涤已处理过的多孔载体来排除。若用戊二醛作交联剂，它的容积与多乙烯多胺溶液近似，即多孔载体与戊二醛溶液容积比值1∶5，戊二醛浓度为0.1%～1.0%，尤以0.25-0.7%浓度为宜。采用含0.05克分子碳酸氢钠的戊二醛水溶液，要求pH值为7.9-8.3。交联反应在20-30℃轻轻搅动，反应时间2小时，即得到多孔载体、多乙烯多胺和戊二醛支持物。将此生物催化剂支持物与特定的酶溶液接触，在适宜于该酶的pH下，温度20-30℃条件下轻轻搅拌4小时，即得到共轭固定化酶，于4℃保存适宜缓冲液中，备用。

实施本发明需将上述得到的共轭固定化酶与产生该酶（或酶类）的微生物细胞共同包埋于一种或一种以上包埋剂中，构成复合固定化酶。

实施本发明的例1详细地叙述了制备复合固定化葡萄糖异构酶的方法。用嗜酸链霉菌（Streptomyces acidophilus）发酵生产葡萄糖异构酶，依据发酵周期长短等具体条件的变化其胞内酶与胞外酶比例呈规律性变化。一般随着发酵周期延长，胞内酶与胞外酶的比值逐步递减。为使菌丝体内的葡萄糖异构酶与释放到发酵液中的葡萄糖异构酶均能充分回收，遂设计本发明中关于将嗜酸链霉菌细胞及所产生葡萄糖异构酶的复合固定化方法。通过实施例1，复合固定化酶这一概念变得更清晰和更明确。需要明确指出的是：复合固定化酶并不局限于仅仅固定一种酶及产生该酶的微生物细胞，一种以上的酶类及产生各该酶类的一种以上的微生物细胞的复合固定化亦属于这一范围之内。

各种酶类的固定化方法以及产生酶类的各种微生物细胞的固定化方法在文献中已有大量记载，通过如上所列出的关于葡萄糖异构酶研究及生产中所采用的各类菌种、发酵工艺以及与其相关联的各种固定化方法，可以清晰地看出菌种、发酵、固定化工艺等在这一具体领域的发展轨迹。

关于产生酶类微生物细胞的固定化方法很多，其中以包埋法最为常用。所采用的包埋剂有：卡拉胶、黄原胶、明胶、琼脂、二醋酸纤维、三醋酸纤维。

实施本发明的第一步是将发酵生产中游离酶固定于多孔载体制备成共轭固定化酶。第二步是将载有共轭固定化酶的多孔载体与产生该酶（或酶类）的微生物细胞共同包埋于各种包埋剂中，这种包埋剂可以是单一的也可以是几种包埋剂混合使用。

例1、

多孔颗粒硅藻土用于固定化之前需作如下处理：将40克120～180目多孔颗粒硅藻土分别用1N HCl、1N NaOH处理，每次处理后均用无离子水充分洗涤，待硅藻土沉淀后轻轻将洗涤水倾出，然后将硅藻土真空干燥。

按下述工艺方法由嗜酸链霉菌发酵液制备复合固定化葡萄糖异构酶：

1、制备共轭固定化葡萄糖异构酶：

（1）将已洗涤并真空干燥的颗粒硅藻土40克与pH9.8的0.2%多乙烯多胺水溶液250毫升充分混合，置500毫升摇瓶中于28～30℃轻轻振荡搅动4小时，然后自然沉降，轻轻倾出上清液。

（2）用无离子水充分洗涤以排除未附着于硅藻土上的聚胺-多乙烯多胺。然后用胺反应性物料戊二醛与附着在硅藻土上的聚胺的侧胺基结合：将含0.05克分子碳酸氢钠的0.5%戊二醛溶液250毫升，pH8.2，与已附着聚胺的硅藻土置500毫升摇瓶中，轻轻振荡2小时，然后轻轻倾出戊二醛溶液，用无离子水充分洗涤，除去未反应的戊二醛，

（3）将葡萄糖异构酶酶活达20，000 IGIU（International Glucose Isomerase Unit）/L的嗜酸链霉菌发酵液200毫升，经离心分离，离心后得到的湿菌丝体4℃保存备用。取含有游离酶的滤液与上述含有硅藻土、多乙烯多胺和戊二醛的支持物，pH6.8，置500毫升摇瓶中，于28℃轻轻振荡4小时，倾出液体，即制成共轭固定化葡萄糖异构酶，用无离子水洗涤后备用。

2、将共轭固定化酶与嗜酸链霉菌细胞共同包埋，制成复合固定化葡萄糖异构酶。

（1）将上述离心分离得到的湿菌丝体25克，分散混悬于8%100毫升柠檬酸镁溶液中，于40℃轻轻振荡2小时，离心分离，洗涤后再与25毫升生理盐水于45℃作成菌丝体悬液。

（2）将卡拉胶3.0克与琼脂3.0克，在70℃条件下溶于50毫升生理盐水，待冷至40℃将上述共轭固定化酶与已经柠檬酸镁在细胞内预固定的，菌丝体悬浮液一并倾入卡拉胶与琼脂的混合胶体中，搅拌均匀，冷却至10℃，静止至少2小时，将此凝胶浸于0.3M KCl溶液中，10℃经4小时后、造粒成型。

（3）将已成型颗粒分别用0.2%多乙烯多胺及0.5%戊二醛处理各8小时以上，用无离子水洗涤除掉多余的多乙烯多胺及戊二醛即制成复合固定化葡萄糖异构酶，总回收率可达92%，酶生产能力可达4，500克果葡糖（干基）/克（固定化酶）。

例2：

用已经过酸、碱处理、无离子水洗涤并真空干燥的空心微珠为载体，按如下步骤由嗜酸链霉菌发酵液制备葡萄糖异构酶的复合固定化酶：

1、将40毫升空心微珠与pH9.8，0.2%多乙烯多胺水溶液250毫升混合，置500毫升摇瓶中于30℃振荡搅动4小时，然后沉降并倾出上清液。

2、用无离子水充分洗涤以排除未附着于空心微珠上的多乙烯多胺。然后用含有0.05克分子碳酸氢钠的0.5%戊二醛溶液250毫升，pH8.2，与经上述处理的空心微珠混合置入500毫升摇瓶中，轻轻振荡2小时，静止后，轻轻分离出戊二醛溶液，用无离子水充分洗涤，得到含有空心微珠、多乙烯多胺和戊二醛的支持物。

3、将嗜酸链霉菌发酵液200毫升经离心分离的含有游离酶的滤液与上述含有空心微珠、多乙烯多胺和戊二醛的支持物，置500毫升摇瓶中于28℃下振荡4小时，轻轻分离倾出液体，再用无离子水洗涤即制成共轭固定化葡萄糖异构酶。

4、将上述共轭固定化葡萄糖异构酶与经离心分离得到的湿菌丝体，该菌丝体需经过8%柠檬酸镁溶液处理，然后按照例1的工艺方法共同包埋于卡拉胶与明胶组成的混合凝胶中，制成复合固定化葡萄糖异构酶，酶的总回收率94%，经干燥后的复合固定化酶生产能力达4800克果葡糖（干基）/克.固定化酶。

例3：

空心微珠的处理步骤与例2相同。第一步制备得到含有空心微珠、多乙烯多胺和戊二醛的支持物其方法亦同例2。

将生产葡萄糖淀粉酶的黑曲霉发酵液100毫升，离心分离，得到滤液，用0.2M醋酸盐缓冲液调至pH4.8将此含有葡萄糖淀粉酶的滤液与上述含有空心微珠、多乙烯多胺和戊二醛的支持物混合并置于500毫升摇瓶中于室温下轻轻振荡4小时，轻轻分离出空心微珠，用无离子水洗涤，即制成共轭固定化葡萄糖淀粉酶。

离心分离后所得的湿菌体，按照例1的方法，与上述共轭固定化葡萄糖淀粉酶共同包埋于卡拉胶与琼脂组成的混合凝胶中，制成复合固定化葡萄糖淀粉酶。

例4

有机多孔载体甲壳质（chitin）按如下方法制备及处理：20克蟹壳加入1N HCl100毫升，先在室温下处理2小时，再煮沸8小时，除去残留蛋白质，室温放置过夜，用无离子水洗涤，然后浸于0.5%高锰酸钾溶液中1小时，过滤，洗涤，室温干燥，研磨过筛，120～160目颗粒备用。

将上述制备的多孔有机载体甲壳质按例1工艺方法制备甲壳质、多乙烯多胺和戊二醛的支持物。将100毫升葡萄糖氧化酶发酵液离心分离获得菌丝体与滤液两部分，滤液与上述含有甲壳质、多乙烯多胺和戊二醛的支持物，置500毫升摇瓶中于25℃轻轻振荡4小时，滤去液体即制成共轭固定化葡萄糖氧化酶。

将湿菌体混悬于无离子水中，于室温下制成悬浮液15毫升，倾入50毫升0.5%海藻酸钠与0.5%明胶混合凝胶中，搅匀冷却至10℃至少2小时，用成型装置挤入2.5MCaCl₂溶液中，置冰箱中过夜，用3%柠檬酸溶液处理，再用无离子水洗涤，制成复合固定化葡萄糖氧化酶。

Claims

1、一种制备复合固定化酶的方法，它包括如下内容：

(1)制备共轭固定化酶，其步骤如下：

(a)多孔载体与具有侧胺基聚胺化合物溶液接触，使聚胺附着于多孔载体上；

(b)用无离子水洗涤，排除出溶剂和分散其中并未附着的聚胺，然后用已处理的多孔载体与胺反应性物料接触，该溶液是一种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酸酐、或是一种多功能偶氮化合物，使其中一个胺反应性基团与侧胺基起反应，留下另一胺反应性基团可以进行进一步反应；

(c)用无离子水洗涤，排除出溶剂和任何溶于其中而又未反应的胺反应性物料。已处理的多孔载体与至少一种酶溶液接触，以引起酶的胺基与未反应的胺反应性基团反应，通过共价键的形式固定酶。

(2)将共轭固定化酶与产生该酶的微生物细胞共同包埋于一种或一种以上包埋剂中，制成复合固定化酶。

2、根据权利要求1所述的方法，其中多孔载体包括：

（1）颗粒硅藻土。

（2）空心微珠。

（3）甲壳质。

3、根据权利要求1所述的方法，其中聚胺是聚乙烯二胺、聚乙烯亚胺、聚亚甲基二胺、聚六亚甲基二胺、聚四亚乙基五胺、多乙烯多胺。

4、根据权利要求1所述的方法，其中胺反应性物料是戊二醛。

5、根据权利要求1所述的方法，其中酶是葡萄糖异构酶、葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、转葡糖苷酶、葡萄糖氧化酶。

6、共轭固定化酶包括被附着于多孔载体的如下反应产物：具有侧胺基聚胺化合物与胺反应性物料-一种双功能化合物戊二醛中的一个胺反应性基团相反应，它的另一个未被反应的胺反应性基因与酶或酶类的自由胺基反应，并与之相联接构成共轭固定化酶。

7、根据权利要求6所述的共轭固定化酶，其中多孔载体包括：

（1）颗粒硅藻土。

（2）空心微珠。

（3）甲壳质。

8、根据权利要求6所述的共轭固定化酶，其中聚胺是聚乙烯二胺、聚乙烯亚胺、聚亚甲基二胺、聚六亚甲基二胺、聚四亚乙基五胺、多乙烯多胺。

9、根据权利要求1所述的方法，其中包埋剂是：卡拉胶、黄原胶、明胶、琼脂、海藻酸、二醋酸纤维、三醋酸纤维、聚丙烯酰胺。

10、一种制备复合固定化葡萄糖异构酶及异构化葡萄糖的方法，该方法包括如下步骤：

（1）使多孔载体与具有侧胺基聚胺化合物接触，使聚胺附着于多孔载体上;

（2）用无离子水洗涤，排除出溶剂和分散其中却又未附着的聚胺，与胺反应性物料溶液接触，该溶液是一种双功能化合物，如戊二醛，其中一个胺反应性基团与聚胺的侧胺基起反应，留下另一个胺反应性基团可以进行进一步反应;

（3）用无离子水洗涤，排除出溶剂和任何溶于其中而又未反应的胺反应性物料。已作上述处理的多孔载体与葡萄糖异构酶溶液接触，使酶的胺基与胺反应性物料的另一个胺反应性基团反应，通过共价键的形式固定葡萄糖异构酶，构成共轭固定化葡萄糖异构酶。

（4）将上述共轭固定化葡萄糖异构酶与产生该酶的嗜酸链霉菌细胞共同包埋于包埋剂中，并再一次分别与带有侧胺基的聚胺化合物、戊二醛反应，制成复合固定化葡萄糖异构酶。

（5）将复合固定化葡萄糖异构酶装入反应柱中，与液体葡萄糖接触、使葡萄糖异构化为果糖。