FI109808B

FI109808B - Puhdistettu entsyymikonsentraatti ja menetelmä sen valmistamiseksi

Info

Publication number: FI109808B
Application number: FI931582A
Authority: FI
Inventors: Jayarama K Shetty; Chimanbhai P Patel
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1992-04-08
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 2002-10-15
Also published as: JPH0646845A; EP0565168A2; AR248165A1; BR9301489A; FI931582A0; EP0565168A3; CA2093624A1; FI931582A; DE69330807T2; ES2164060T3; EP0565168B1; CA2093624C; ATE206158T1; DK0565168T3; KR930021781A; US5405767A; DE69330807D1

Description

109808

Puhdistettu entsyymikonsentraatti ja menetelmä sen valmistamiseksi Tämän keksinnön kohteena on entsyymien talteenotto 5 ja puhdistus fermentaatiovalmisteista. Kuvataan myös muodostunut puhdistettu entsyymituote. Tarkemmin keksinnön kohteena on menetelmä puhdistetun entsyymin valmistamiseksi fermentaatiokasvatusliuoksesta sekä menetelmä puhdistetun alkalisen proteaasin valmistamiseksi, joka on 10 johdettu Bacillus alcalophiluksen tai Bacillus licheni-formiksen fermentaatiokasvatusliuoksesta.

Entsyymien käyttö pesuaineissa on hyvin tunnettua. Yleensä entsyymit, joita käytetään pesuaineissa, ovat ensisijaisesti olleet alkalisesti stabiileja proteaaseja, 15 lipaaseja ja alfa-amylaaseja. Aikalisistä proteaaseista, seriiniproteaaseja, jotka on johdettu Bacillus-kannoista, nimittäin Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ja alkalofiilisestä Bacillus-bakteerista, on laajalti käytetty pesuainevalmistemuodoissa. (Starace, C. ja Barford, H.C., . . 20 Encyclopedia Chem. Technol. 9, sivut 138 -148 (1980); Koki • '· Horikoshi ja Terahiko Akika, A New Microbial World, :.V Springer-Verlag, N.Y., sivu 93 (1982)).

·.· : Entsyymit muodostavat ainoastaan pienen osan useimmista nestemäisistä pesuainevalmistemuodoista. Täten :*·*: 25 on tarpeellista muodostaa melko väkevöityjä entsyymival-misteita. Entsyymikonsentraatteja valmistetaan perinteisesti poistamalla vesi entsyymien vesipitoisista liu-ok- .·. ; sista käyttäen tavallisia menetelmiä, kuten ultrasuo- • · · dattamista ja haihduttamista.

30 Epäorgaanisia suoloja, kuten ammoniumsulfaattia ja • · • *·· natriumsulf aattia on laajalti käytetty entsyymien säestäjä : misessa vesipitoisesta liuoksesta sekä laboratoriomitta- '·'··' kaavassa, että kaupallisesti. (Dixon, M. ja Webb, E.D., • ·

Enzymes, Academic Press, N.Y., sivut 39 - 41 (1964), • · · · » ' '1" 35 Curline, Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, N.Y. (1980)). Näiden suolojen laaja käyttö suuressa 109808 2 mittakaavassa voi kuitenkin aiheuttaa ympäristöhaittoja ja vaikeuttaa jäteveden käsittelyä. Tosiasiassa monet maat Euroopassa ovat jo rajoittaneet näiden suolojen suuren mittakaavan käyttöä teollisuudessa. Orgaanisia liuottimia, 5 kuten etanolia ja asetonia on myös käytetty saostajina (Dixon ja Webb, Enzymes, supra, sivut 37 - 39; Bauer et ai., Israel Journal of Chemistry, 5 (3), sivut 117 - 20 (1967)), kuitenkin niiden käyttöä on rajoitettu johtuen kustannus- ja turvallisuussyistä.

10 Entsyymien väri ja maku voi haitallisesti vaikut taa pesuainevalmistemuotojen laatuun, joihin niitä lisätään. Täten on tarpeen poistaa pigmentit entsyymikon-sentraatista, joiden pigmenttien uskotaan muodostavan osan entsyymi-pigmenttikompleksista. Dixon, M. ja Webb, E.C., 15 Enzymes, supra, ovat esittäneet liuotinsaostusmenetelmiä pigmentin poistamiseksi proteaasiliuoksesta. Tämä menetelmä johti kuitenkin huonoon tuotesaantoon. Pigmenttien absorptiota aktiivihiilellä vesipitoisesta entsyymi-konsentraatista käytetään tavallisesti teollisuussovel-20 lutuksissa, kuitenkin ainehäviö, korkeat kustannukset ja • '· jätteen poisto ovat tärkeimmät puutteet.

On toivottavaa, että entsyymivalmisteet pesuaine-·.· * sovellutuksissa ovat vapaita aineosista, jotka voivat ai- *:*·: heuttaa ei-toivotun värin, sameuden, epästabiilisuuden ja 25 herkistymistä aiheuttavan aktiivisuuden lopputuotteessa.

• · .*:*· Näitä aineosia voi muodostua itse mikro-organismista tai fermentaatioj äännösraaka-aineista. Gram-positiivisen . Bacillin valmistuksessa, soluseinän anioniset polymeerit, • I i !..* peptidoglykaanit, galaktosyylipolymeerit ja muut polysak- *;* 30 karidiepäpuhtaudet muuttuvat liukoisiksi solukasvun aikana | johtuen soluseinän uusiutumisnopeudesta. Näiden bakteeris- ten soluseinäpolymeerien läsnäolo entsyymivalmisteissa voi aiheuttaa monia ei-toivottuja vaikutuksia, mukaan lukien • · herkistymisen kasvu, entsyymin stabiilisuuden vähentyminen 35 niiden sitoutuessa kationeihin, esim. Ca++:aan ja voivat aiheuttaa sumun muodostumista pesuainevalmistemuodoissa.

109808 3 US-patentissa nro 4 659 667 kuvataan entsyymin ki-teyttämismenetelmää, jossa ylikyllästetyn entsyymiliuoksen pH säädetään sen isoelektriseksi pH:ksi.

US-patentissa nro 4 699 882 kuvataan menetelmää 5 glukoosi-isomeraasin kiteyttämiseksi käyttäen ammonium- ja magnesiumsulfaattia.

Patent Cooperation Treaty (PCT) hakemuksessa nro WO 89/0583, julkaistu 29. kesäkuuta 1986, kuvataan menetelmää galaktosyylipolymeerin, joka liittyy herkistymistä 10 aiheuttavaan aktiivisuuteen, erottamiseksi proteaasival-misteista käyttäen ioninvaihtokromatografiaa.

US-patentissa nro 5 041 377 kuvataan menetelmää kiteisen subtilisiinin saamiseksi, jossa substilisiini, joka on johdettu Bacillus substiliksesta ja Bacillus amy-15 loliguefaciensista, kiteytetään lisäämällä halidisuolaa (natriumkloridia ja kaliumkloridia) emäksiseen proteaasi-liuokseen alhaisessa lämpötilassa.

PCT-hakemuksessa WO 91/09 943 kuvataan menetelmää entsyymien kiteyttämiseksi, jossa vesipitoista entsyymiä 20 sisältävää nestettä, jolla on suhteellisen korkea entsyy-. mipuhtaus ja jonka puhdas entsyymiproteiinipitoisuus on V.* vähintäin 5 g/1, käytetään lähtöaineena ja kiteyttämis- • j · ainetta, joka on ei-halidin kaltainen helposti liukeneva ·:**: suola, kuten Na, K, Ca tai Mg -formiaatti, -asetaatti tai ·*·*; 25 -nitraatti, lisätään lähtöaineeseen. Esimerkeissä, joissa • · käytetään proteaaseja, lähtöaine valmistetaan saostamalla natriumsulfaatilla.

. . Millään näistä edellä kuvatuista patenteista, pa- )..* tenttihakemuksista tai julkaisuista ei ole yksinkertaisen "·* 30 ja tehokkaan menetelmän tärkeitä etuja puhdistetun entsyy-i mivalmisteen valmistamiseksi, joka on vapaa epäpuhtauksis- ta, ja jossa saadaan korkea saanto puhdistettua entsyymiä .1. ja epäorgaanisten suolojen tai muiden ei-biologisesti ha- joavien yhdisteiden käyttö vältetään.

" " 35 109808 4

Keksinnön mukaiselle menetelmälle puhdistetun entsyymin valmistamiseksi fermentaatiokasvatusliuoksesta on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa 1.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle puhdistetun 5 alkalisen proteaasin valmistamiseksi, joka on johdettu Bacillus alcalophiluksen tai Bacillus licheniformiksen fermentaatiokasvatusliuoksesta on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa 18.

Tämän keksinnön kohteena on uusi menetelmä entsyy-10 mien puhdistamiseksi niin, että poistetaan pigmentit ja muut epäpuhtaudet, jotka aiheuttavat sameutta, värikonta-minaatiota ja hajua kaupallisissa entsyymivalmisteissa.

Tämän keksinnön lisäkohteena on yksinkertainen ja uusi menetelmä entsyymien puhdistamiseksi, jossa menetel-15 mässä poistetaan polysakkaridit ja oligosakkaridit ja muut galaktosyylipolymeerit, jotka aiheuttavat ongelmia, jotka liittyvät herkistymistä aiheuttavaan aktiivisuuteen.

Tämän keksinnön lisäkohteena on saavuttaa edellä kuvatut kohdat uudella menetelmällä, joka on sekä yksin-20 kertainen että kustannuksiltaan edullinen, mutta johtaa .*·· kuitenkin puhtaan entsyymin korkeaan talteenottoon.

·/·/- Tämän keksinnön lisäkohteena on edellä mainitut ! kohteet käyttämättä ympäristölle vaarallisia tai kalliita ·;··· kemikaaleja tai epäorgaanisia suoloja.

25 Keksinnön mukaisesti saatava koostumus sisältää puhdistettua entsyymiä ja orgaanista yhdistettä, jossa orgaaninen yhdiste valitaan ryhmästä karboksyylihapot, jois- . . sa on vähintäin kaksi karboksyyliryhmää, näiden karbok- » · · ; / syylihappojen suolat tai esterit, aminohapot, näiden ami- • · ···’ 30 nohappojen suolat tai esterit ja kahden tai useamman ·*·,. tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset.

Edullisesti kuvattu koostumus sisältää puhdistet- » · · tua alkalista proteaasia ja lysiiniä, lysiini-HCl:ää, *···’ asparagiinihappoa, malonihappoa, sukkiinihappoa, fumaari- 35 109808 5 happoa, sitruunahappoa tai näiden happojen natrium- tai kaliumsuolaa.

Keksinnön kohteena on myös menetelmä puhdistetun entsyymin valmistamiseksi fermentaatiokasvatusliuoksesta, 5 jossa menetelmässä muodostetaan entsyymiliuos erottamalla entsyymi soluista ja suspendoimalla kiinteät aineet fer-mentaatiokasvatusliuokseen; saatu entsyymiliuos väkevöi-dään; ja väkevöityyn entsyymiliuokseen lisätään orgaanista yhdistettä, joka on valittu ryhmästä karboksyylihappo, 10 jossa on vähintäin kaksi karboksyyliryhmää, näiden karbok-syylihappojen suolat tai esterit, aminohapot, näiden aminohappojen suolat tai esterit ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset.

Edullisesti kuvatussa menetelmässä käytetään or-15 gaanista yhdistettä ryhmästä lysiini, lysiini-HCl, aspar-tiinihappo, malonihappo, meripihkahappo, fumaari-happo, sitruunahappo tai näiden happojen natrium- tai kaliumsuo-lat. Vielä edullisemmin orgaanisen yhdisteen lisääminen väkevöityyn entsyymiliuokseen tapahtuu sekoituksenalai-20 sissa olosuhteissa ja lämpötila-alueella n. 5 °C - n.

» · . ·.* 50 °C ja edullisimmin n. 30 °C - 40 °C.

• ·

Eräs tämän keksinnön suoritusmuodon etu on, että • · • ^· j ensimmäistä kertaa kuvataan entsyymin puhdistusmenetelmää, *:**: jossa entsyymi saostetaan orgaanisella yhdisteellä, joka on 25 entsyymin aineosa.

φ · Tämän keksinnön toinen hyöty on kyky puhdistaa • · « entsyymivalmisteita käyttämättä ympäristölle haitallisia . . tai vaarallisia kemikaaleja, täten edesauttaen huomat- ),, tavasti ympäristön säilymistä.

·;·* 30 Keksintö, yhdessä lisäkohteiden ja etujen kanssa : ·.. tulee parhaiten ymmärretyksi viitaten tässä oleviin ku- vauksiin, esimerkkeihin ja taulukoihin. Keksintö ei kuitenkaan ole rajoittunut näihin.

I · ’···] Puhdistettuna entsyyminä tulisi käsittää entsyymi, I I M · 35 jolla on huomattavasti vähennetty väri, luultavasti johtuen pigmenttien poistamisesta. Puhdistetulla entsyymillä on 6 105808 pääosin vähentynyt pitoisuus galaktosyylipolymeeriä, yleensä vähemmän kuin 1,00 mg galaktosyylipolymeeriä/gramma entsyymiproteiinia ja edullisesti vähemmän kuin 0,65 mg/g. Kuvauksen vuoksi puhdistetulla alkalisella proteaasilla 5 Bacillus alcalophiluksesta on absorbanssi, joka on pienempi kuin 1,3 470 nmrssä, kun se on väkevöity aktiivisuuteen 1 000 000 DU/ml ja puhdistetulla alkalisella proteaasilla Bacillus licheniformiksesta on absorbanssi, joka on pienempi kuin 0, 5 470 nm:ssä, kun se on väkevöity 440 10 DAPU/ml aktiivisuuteen.

Erään tämän keksinnön suoritusmuodon mukaisesti puhdistettu alkalinen proteaasituote valmistetaan seuraavasti .

Bacillus alcalophilus -fermentaatiokasvatusliuos 15 valmistetaan viljelemällä sopivaa kantaa nestemäisessä viljelyelatusnesteessä, joka sisältää aineosia, jotka ovat tarpeellisia mikro-organismien kasvulle.

Fermentaation jälkeen muodostuu entsyymiliuos erottamalla entsyymi mikrobisoluista, erilaisista sus-20 pendoiduista kiinteistä aineista ja jäljelle jääneistä • · • ” raaoista fermentaatioaineista, joita on läsnä fermentaa- • · *.·.· tiokasvatusliuoksessa, käyttäen tavallisia erotusmene- ·,·· telmiä. Saatu alkalinen proteaasientsyymiliuos väkevöidään väkevöidyksi entsyymiliuokseksi käyttäen ultrasuodatta-25 mistä kunnes saavutetaan sopiva proteaasiaktiivisuus, joka Bacillus alcalophiluksen alkalisen proteaasin tapauksessa on n. 1 000 000 Delft-yksikköä/ml ("DU/ml").

. Väkevöityyn entsyymiliuokseen lisätään orgaanista • t · !.,* yhdistettä, joka sisältää lysiini-HCl, lopputilavuudeksi *;* 30 0,5 M. Liuoksen pH säädetään arvoon n. 5,0 ja liuoksen \ *.. annetaan inkuboitua 30 °C:ssa 24 tuntia jatkuvasti sekoit- taen. Lisättäessä lysiini-HCl, alkalinen proteaasi alkaa erottua liuoksesta sakkana. Entsyymisakka erotetaan kirk- • kaasta kerroksesta sentrifugoimalla 15 000 kierrosta mi-35 nuutissa 30 minuuttia. Entsyymisakka on pääosin kiteisessä muodossa ja on hyvin puhdistettu entsyymituote. Saostuneen 109808 7 puhdistetun alkalisen proteaasin talteenotto on yli 94 % alkalisesta proteaasista, jota on läsnä puhdistamattomassa väkevöidyssä alkalisessa proteaasiliuoksessa ennen saosta-mista.

5 Tämän keksinnön toisessa suoritusmuodossa saadaan puhdistettu alkalinen proteaasijohdannainen Bacillus licheniformiksesta. Bacillus licheniformiksen fermentaa-tiokasvatusliuos valmistetaan viljelemällä sopivaa kantaa nestemäisessä viljelyelatusnesteessä, joka sisältää aine-10 osia, jotka ovat tarpeen mikro-organismien kasvulle. Fer-mentaation jälkeen entsyymiliuos muodostetaan erottamalla entsyymi mikrobisoluista, eri suspendoituneista kiinteistä aineista ja jäljelle jääneistä fermentaatioraaka-aineista, joita on läsnä fermentaatiokasvatusliuoksessa, käyttäen 15 tavallisia erotusmenetelmiä. Saatu alkalinen proteaa-sientsyymiliuos väkevöidään väkevöidyksi entsyymiliuokseksi käyttäen ultrasuodattamista, kunnes saavutetaan sopiva proteaasiaktiivisuus, joka Bacillus licheniformiksen tapauksessa on n. 863 alkalista detergenttiproteaasiyksik-20 köä/ml ("DAPU/ml").

• t » · • *1 Väkevöityyn entsyymiliuokseen lisätään orgaanista • · .*.· yhdistettä, joka sisältää meripihkahappoa, lopputilavuu- • · ·.· · deksi 0,5 M. Liuoksen pH säädetään arvoon 6,0 ja inkuboi- daan 37 °C:ssa neljä tuntia jatkuvasti sekoittaen. Lisät-25 täessä meripihkahappoa, alkalinen proteaasi alkaa erottua • · .'I*. liuoksesta sakan muodossa. Entsyymisakka erotetaan kirk kaasta kerroksesta sentrifugoimalla 20 000 kierrosta mi- . nuutissa 20 minuuttia. Entsyymisakka on hyvin puhdistettu • * · !.,* entsyymituote ja on osittain kiteinen. Saadun saostuneen *" 30 puhdistetun alkalisen proteaasin talteenotto on n. 86 % » · j '·· alkalisen proteaasin kokonaismäärästä, joka oli läsnä puh- distamattomassa väkevöidyssä entsyymiliuoksessa ennen saostamista.

• ·

Monet vaihtoehtoiset suoritusmuodot ovat mahdol-35 lisiä. Esimerkiksi, tavallisesti entsyymi johdetaan bakteerisesta lähteestä. Keksinnön yleisessä suoritusmuodossa 109808 8 saatava entsyymi valitaan ryhmästä proteaasit, lipaasit, amylaasit, sellulaasit, hemisellulaasit, pektinaasit, amidaasit, katalaasit, isomeraasit ja oksidaasit. Myös näiden saatavien entsyymien proteiinimanipulaatio-5 muunnelmat kuuluvat keksinnön piiriin. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa saatava entsyymi on proteaasi, alkalinen proteaasi tai näiden entsyymien proteiini-manipulaatiomuunnelma. Keksinnön edullisemmassa suoritusmuodossa saatava entsyymi on alkalinen proteaasi tai 10 geenimanipulaatiomuunnelma, joka on johdettu Bacillus-lajeista. Edullisimmassa suoritusmuodossa saatava entsyymi on bakteerin en alkalinen proteaasi, joka on johdettu Bacillus licheniformiksesta. Bacillus alcalophiluksesta. Bacillus lentuksesta, Bacillus amyloliquefaciensiksesta, 15 Bacillus subtiliksesta, näiden johdannaisista tai näiden entsyymien proteiinimanipulaatiomuunnelmasta. Hyviä tuloksia on saatu bakteerisilla aikalisillä proteaaseilla, jotka on johdettu Bacillus licheniformiksesta tai Bacillus alcalophiluksesta. Tulisi ymmärtää, että alkalinen pro-20 teaasi, joka on johdettu Bacillus licheniformiksesta tai • · . ” Bacillus alcalophiluksesta, käsittää luonnolliset pro- *.V teaasit, kuten myös niiden geenimanipulaatiomuunnelmat.

·,· · Entsyymiä tulisi olla läsnä väkevöidyssä entsyy- ·:·*: miliuoksessa pitoisuutena, joka on riittävä mahdollistamaan i‘·’: 25 saostumisen.

• ·

Tavallisesti läsnä oleva orgaaninen yhdiste keksinnön mukaisesti saatavassa koostumuksessa on orgaaninen . . yhdiste valittuna ryhmästä karboksyylihapot, joissa on • · · vähintäin kaksi karboksyyliryhmää, näiden karboksyyli- • · ·;** 30 happojen suolat tai esterit, aminohapot, näiden ! ·.. aminohappojen suolat tai esterit ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset. Karboksyylihapot valitaan edullisesti alifaattisista, tyydyttyneistä tai • ·

• I

tyydyttymättömistä karboksyylihapoista. Aminohapot ovat • · · · · 35 edullisesti luonnossa esiintyviä aminohappoja, jotka ovat joko luonnollista tai synteettistä alkuperää. Valittujen 109808 9 orgaanisten yhdisteiden tulisi olla liukoisia veteen, ts. niiden liukoisuuden tulisi olla puhtaassa vedessä yli 5 g/1 25 °C:ssa.

Tässä kuvattuja edullisia orgaanisia yhdisteitä 5 ovat luonnossa esiintyvät aminohapot, näiden aminohappojen suolat tai esterit, koska ne ovat itse entsyymin aineosia.

Luonnossa esiintyvät aminohapot ja näiden aminohappojen suolat ja esterit valitaan yleensä happamista aminohapoista, emäksisistä aminohapoista, näiden 10 aminohappojen suoloista, näiden aminohappojen estereistä ja kahden tai useamman tällaisen aminohapon seoksista. Edullisesti ne valitaan ryhmästä lysiini, arginiini, ornitiini, histidiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, metioniini, fenyylialaniini, tyrosiini, seriini, niiden 15 natrium- ja kaliumsuolat, niiden kloorihydraatit, lysiini-HC1 (lysiinin kloorihydraatti), L-lysiini-metyyli- esteridihydrokloridi ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset. Edullisemmin ensisijaisia ovat luonnossa esiintyvät aminohapot ja tällaisten ami-20 nohappojen suolat tai esterit, valittuna ryhmästä lysiini, * · ,**; arginiini, histidiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo ja ’ly näiden aminohappojen natriumsuola, lysiini-HCl ja kahden ! tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset. Hyviä ·;-·» tuloksia on saatu lysiinin, lysiini-HCl: n ja asparagii- 25 nihapon kanssa. Parhaat tulokset on saatu lysiinillä ja • » ,···, lysiini-HCl: llä .

• · «

Alifaattiset, tyydyttyneet tai tyydyttymättömät . , karboksyylihapot, joissa on vähintäin kaksi karboksyyli- | i » ryhmää, ja näiden karboksyylihappojen suolat ja esterit * · <··’ 30 valitaan tavallisesti karboksyylihapoista, joissa on 2 - 3 ·*·,, karboksyyliryhmää ja jotka sisältävät vähintäin kolme hii- liatomia, niiden natrium-, kalsium-, kalium- tai magne- « · · siumsuoloista ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen i · yhdisteen seoksista. Edullisesti ne valitaan karboksyyli- mu ‘ ‘ 35 hapoista, joissa on 2 - 3 karboksyyliryhmää ja jotka si sältävät 3-6 hiiliatomia, niiden natrium- tai kaliumsuo- 109808 10 loista ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seoksista. Edullisemmin orgaaninen yhdiste valitaan ryhmästä malonihappo, meripihkahappo, sitruunahappo, ma-leiinihappo, fumaarihappo, näiden happojen natrium- tai 5 kaliumsuolat ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset. Hyviä tuloksia on saatu malonihapolla, meripihkahapolla, sitruunahapolla, näiden happojen nat-riumsuolalla ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seoksilla. Parhaat tulokset on saatu meripihka-10 hapolla, sitruunahapolla tai näiden happojen natrium-suolalla .

Tämän keksinnön kohteena on myös menetelmä puhdistetun entsyymin valmistamiseksi fermentaatiokasvatusliu-oksesta, jossa menetelmässä: 15 (i) muodostetaan entsyymiliuos erottamalla entsyy mi soluista ja suspendoituneista kiinteistä aineista mainitussa fermentaatiokasvatusliuoksessa; (ii) väkevöidän mainittu entsyymiliuos; (iii) lisätään mainittuun väkevöityyn entsyymiliu-20 okseen orgaaninen yhdiste valittuna ryhmästä karboksyy- • · • " lihapot, joissa on vähintäin kaksi karboksyyliryhmää, näi- *.·.* den karboksyylihappoj en suolat tai esterit, aminohapot, • · ·,· * näiden aminohappojen suolat tai esterit ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset; ·*·': 25 (iv) inkuboidaan mainittu väkevöity entsyymiliuos, • · .*;*· joka sisältää mainittua orgaanista yhdistettä; ja (v) kerätään puhdistettu entsyymisakka.

; Fermentaatio-, erotus- ja väkevöintimenetelmät ovat • · · !..* hyvin tunnettuja alalla ja tavallisia menetelmiä voidaan 30 käyttää haluttujen tulosten saavuttamiseksi.

| '·· Tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukai- : : sesti valmistetaan puhdistettu alkalinen proteaasiliuos.

• Tämä keksintö käsittelee erityisesti fermentaatioseoksia • · '*. joko Bacillus lichenif ormiksesta tai Bacillus alcalo- • t * · « 35 philuksesta.

n 109808

Viljeltäessä kantoja, jotka muodostavat entsyymiä, käytetään tavallisesti kiinteää tai nestemäistä viljely-elatusnestettä, joka sisältää alkalista puskuria, kuten myös aineosia, jotka ovat tarpeellisia mikro-organismien 5 kasvulle, hiililähteen, typpilähteen ja epäorgaanisia suoloja. Tietenkin optimaalinen ravintoaineseos riippuu valitusta mikro-organismikannasta, mikä tieto on helposti saatavissa alaan perehtyneelle. Elatusnesteessä puskurin pH tulisi tavallisesti pitää tasolla 7,0 - 10,0. Sopivia hii-10 lilähteitä ovat mannoosi, fruktoosi, mannitoli, maltoosi, sellobioosi, sakkaroosi, dekstriini, tärkkelys, molassit, glukoosi, hydrolysoitu tärkkelys tai kahden tai useamman tällaisen hiililähteen seos. Typpilähteitä, joita voidaan käyttää, ovat soijapapujauho, kaseiini, maissineste, sie-15 meniä sisältävä puuvillajauho, saatavissa olevien proteiinien entsymaattiset hydrolysaatit, kuivattu hiiva, hiiva-uute, kalajauho, perunajauho tai kahden tai useamman tällaisen typpilähteen seos. Esimerkkejä sopivista aikalisistä puskureista ovat natriumkarbonaatti, kaliumkarbonaatti, . . 20 natriumbikarbonaatti ja natriumfosfaatti.

• · ; ’· Elatusneste, joka sisältää edeltäviä aineosia, « · · steriloidaan tavalliseen tapaan ja yhdistetään yhden tämän * · ·.: : keksinnön kannan kanssa, joka muodostaa entsyymin. Viljely voidaan toteuttaa aerobisesti sekoittaen tai ilmakuplituk- : * : 25 sella edullisesti 30 °C:ssa - 40 °C:ssa 30 - 120 tunnin • · aikana antamaan viljelmä.

Kun halutaan korkea saanto erityistä entsyymiä, voi .·.: olla edullista valmistaa fermentaatioelatusneste mikro- • « · .···. organismikannan kanssa, jossa spesifisen entsyymin 30 ekspressio on vahvistettu. Tällaiset mikro-organismit ovat • · i *·· tavallisesti bakteereita ja valmistetaan tavallisesti :...· käyttäen menetelmiä, kuten geenimanipulaatiota ja bakteeri- .···. transformaatiota tai selektiivistä mutaatiota, jotka • · menetelmät ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

35 Fermentaation jälkeen mikrobisolut ja erilaiset suspendoituneet kiinteät aineet, mukaanlukien raa'at fer- 109808 12 mentaatioainejäännökset, poistetaan tavallisilla erotusmenetelmillä. Suodatus, sentrifugointi, mikrosuodatus, pyörö-tyhjösuodatus, ultrasuodatus, sentrifugointi, mitä seuraa ultrasuodatus tai vastaava, ovat tavallisesti riit-5 täviä.

Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käytetään sentrifugointia, ultrasuodatusta tai sentrifugointia, mitä seuraa ultrasuodatus. Parhaat tulokset on saatu sentrifu-goinnilla.

10 On toivottavaa, että entsyymiliuos on väkevöity talteenoton optimoimiseksi. Väkevöimättömien liuosten käyttö vaatii pitemmän inkubointiajan puhdistetun entsyy-misakan keräämiseksi.

Entsyymiliuosta väkevöidään väkevöidyksi entsyymi- 15 liuokseksi käyttäen tavallisia väkevöintimenetelmiä, kunnes haluttu entsyymiaktiivisuus on saavutettu. Entsyymiliuoksen väkevöinti voidaan toteuttaa millä tahansa tavallisella menetelmällä, mukaanlukien suodattaminen, sentrifugointi, mikrosuodatus, pyörö-tyhjösuodatus, ultrasuodatus, sentri- . . 20 fugointi, mitä seuraa ultrasuodatus, haihduttaminen, ; / uuttaminen tai kromatografointi. Keksinnön edullisessa • · · suoritusmuodossa käytetään sentrifugointia ja/tai ultra- • · : suodatusta. Keksinnön edullisemmassa suoritusmuodossa ’·“· käytetään ultrasuodattamista. Entsyymiä tulisi olla läsnä M · | 25 väkevöidyssä entsyymiliuoksessa pitoisuutena, joka on riittävä mahdollistamaan saostumisen. Alkaliselle proteaasille, joka on johdettu Bacillus alcalophiluksesta, .·. : entsyymiliuos väkevöidään väkevöidyksi entsyymiliuokseksi, ,···, kunnes entsyymiaktiivisuus on tavallisesti vähintäin “* 30 n. 250 000 DU/ml ja edullisesti vähintäin n. 750 000 DU/ml.

« · ! ’·* Parhaat tulokset on saatu entsyymiaktiivisuudella 1 000 000 ί,,.ί DU/ml. Alkaliselle proteaasille, joka on johdettu Bacillus /··. licheniformiksesta, entsyymiliuosta väkevöidään väkevöidyk- si entsyymiliuokseksi kunnes entsyymiaktiivisuus on n.

35 250 DAPU/ml ja edullisesti vähintäin n. 300 DAPU/ml.

13 109808

Parhaat tulokset on saavutettu vähintäin n. 400 DAPU/ml:n entsyymiaktiivisuudella.

Väkevöity entsyymiliuos yhdistetään tässä kuvatun orgaanisen yhdisteen kanssa.

5 Vähintäin vaikuttavan määrän ja optimimäärän valinta orgaanista yhdistettä, joka on riittävä aiheuttamaan entsyymin saostumisen, ja saostamisolosuhteet mak-simitalteenotolle, mukaanlukien inkubointiaika, pH, lämpötila ja entsyymin pitoisuus, ovat hyvin ilmeisiä alaan 10 perehtyneelle tämän julkaisun valossa yksinkertaisen ru-tiinitestauksen jälkeen.

Yleensä orgaanisen yhdisteen pitoisuus on vähintäin 0,06 M, tavallisesti n. 0,07 M - 1 M. Alkali- proteaasin tapauksessa orgaanista yhdistettä lisätään 15 tavallisesti loppupitoisuudeksi n. 0,08 M - 0,9 M ja edullisesti loppupitoisuudeksi n. 0,09 M ja 0,8 M. Bacillus licheni f omiksesi a johdetun alkalisen proteaasin tapauksessa orgaanista yhdistettä lisätään edullisesti n. 0,09 M - 0,75 M loppupitoisuudeksi. Bacillus . . 20 alcalophiluksesta johdetun alkalisen proteaasin tapauksessa • · ; / orgaanista yhdistettä lisätään edullisesti loppupitoi- *·'·’ suudeksi n. 0,25 M - 0,8 M.

• · • · : Optimaalinen pitoisuus lisättyä orgaanista '·'· yhdistettä halutun entsyymin puhdistamiseksi riippuu • · · • ' · 25 kyseisen entsyymin luonteesta, sen rakenteesta, stabii- lisuudesta ja kemiasta. Esimerkiksi Bacillus alcalophilus alkalinen proteaasi tarvitsee tavallisesti lysiiniä : pitoisuutena 0,5 M saostuakseen liuoksesta, kun taas .···. Bacillus licheniformis voi pääosin saostua liuoksesta ’·’ 30 lisättäessä niinkin vähän kuin 0,1 M. Orgaanisen yhdisteen i ’*· optimaalinen pitoisuus ja reaktio-olosuhteet halutun ί.,.ί entsyymin puhdistamiseksi riippuvat myös käytetystä .·*·. spesifisestä orgaanisesta yhdisteestä, sen rakenteesta ja • · kemiasta ja erityisesti sen hydrofobisuudesta.

35 14 109808

Liuoksen pH säädetään arvoon, joka riippuu puhdistettavasta entsyymistä ja käytetystä orgaanisesta yhdisteestä, kuten edellä on selitetty. Aikalisille proteaa-seille liuoksen pH säädetään tavallisesti arvoon 5 n. 3,5 - 10,5. Edullisesti liuoksen pH-arvo säädetään välille n. 4 - 10. Bacillus licheniformiksesta johdettu alkalinen proteaasi on antanut hyviä tuloksia pH-arvoilla 5,5 - 9,5. Bacillus alcalophiluksesta johdetulla alkalisella proteaasilla on saatu hyviä tuloksia pH-10 arvoilla 4 - 9,5.

Yleensä lämpötila saostamisen aikana on n. 5 °C - n. 50 °C, tavallisesti menetelmä toteutetaan lämpötila-alueella n. 20 °C - n. 45 °C ja edullisesti n. 28 °C - n. 40 °C. Optimilämpötila saostumisen 15 käynnistämiseksi vaihtelee riippuen liuosolosuhteista ja käytetystä entsyy-mistä tai orgaanisesta yhdisteestä. Esimerkiksi Bacillus alcalophiluksesta johdettu alkalinen proteaasi saostuu pääosin kuuden tunnin inkuboinnin jälkeen lämpötila-alueella 20 °C - 40 °C.

. 20 Tämän keksinnön vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa hydrolyyttisiä entsyymejä voidaan lisätä väkevöityyn ent- • · · syymiliuokseen. Täten vaihe (iii) voi lisäksi käsittää • · · vaiheen, jossa lisätään väkevöityyn entsyymiliuokseen ·”· vähintäin yhtä hydrolyyttistä entsyymiä. Näiden hydrolyyt- • · · • 25 tisten entsyymien lisääminen voi tapahtua ennen orgaanisen yhdisteen lisäämistä tai yhtä aikaa sen kanssa ja entsy-maattinen hydrolyysi ja orgaanisen yhdisteen lisääminen : voidaan toteuttaa jaksottain tai yhtäaikaisesti. Hydro- .·*·, lyyttisten entsyymien lisäämisen tarkoituksena on hydro- '·' 30 lysoida polymeerisiä epäpuhtauksia, jotka ovat ei-toivot- : “ tuja, kuten soluseinän anionisia polymeerejä, peptidogly- :...· kaaneja, galaktoosipolymeerejä ja muita poly- ja oligosak- .···. karidiepäpuhtauksia, jotka muuttuvat liukoisiksi mikro- ....: organismien fermentaation aikana. Sopivia hydrolyyttisiä 35 entsyymejä ovat entsyymit, jotka hydrolysoivat polysakkarideja, mukaanlukien oligosakkaridit, amylaasit, alfa- 15 109808 amylaasit, pullulanaasit, transferaasit, polysakkaridi-hydrolaasit, glykohydrolaasit, galaktosyylihydrolaasit, pektinaasit, glukonaasit, glukoamylaasit tai kahden tai useamman tällaisen hydrolyyttisen entsyymin seokset.

5 Esimerkkejä edullisista hydrolyyttisistä entsyymeistä ovat CLAREX- pektinaasi ja DIAZYME L-200 -glukoamylaasi, entsyymit, joita on saatavissa Solvay Enzymes Incrstä Elkhart, Indiana.

Tämän suoritusmuodon mukaisesti entsyymiliuos 10 voidaan pitää vakio-pH:ssa ja lämpötilassa inkubointijakson ajan orgaanisen yhdisteen lisäämisen jälkeen. Inkubointi-jakson aikana entsyymi erotetaan hydrolysoituneista polymeerisistä epäpuhtauksista ja dissosioidaan pigmenteistä. Tässä suoritusmuodossa on toivottavaa, että väke-15 vöidyn entsyymiliuoksen, mukaan lukien hydrolyyttiset entsyymit, annetaan inkuboitua 48 - 72 tuntia galaktosyyli- polymeerin täydellisen hydrolyysin varmistamiseksi.

Vaadittava inkubointiaika tämän keksinnön mukaisen puhdistetun entsyymisakan aikaansaamiseksi ei riipu ainoas- . 20 taan spesifisen entsyymin luonteesta ja sen väkevyydestä, I vaan myös lisätystä spesifisestä orgaanisesta yhdisteestä • · · ]·'·' ja sen väkevyydestä. Yleensä 1-48 tunnin inkubointijakso • · '·! ' on riittävä saostumiselle, tavallisesti 2-32 tunnin jakso '*"* ja edullisesti 3-25 tunnin jakso on riittävä. Esimerkiksi • · · • 25 Bacillus alcalophiluksesta johdettu alkalinen proteaasi on yleensä pääosin saostunut 15 - 20 tunnin inkuboinnin jälkeen, jolloin sakka on lysiini pitoisuutena 0,5 M ja : inkubointiolosuhteissa pH on 5,0 ja lämpötila 30 °C.

• « .···, Bacillus lichenif ormiksen alkalinen proteaasi saostuu

'·' 30 samassa ajassa, jolloin sakka on lysiini pitoisuutena 0,5 M

i * : " ja inkubointiolosuhteissa pH on 6,0 ja lämpötila 25 °C. Kun sakka on meripihkahappo- pitoisuutena 0,5 M, Bacillus .···. licheniformiksen alkalinen proteaasi saostuu n. neljän f<ij; tunnin kuluttua inkubointiolosuhteissa, joissa pH on 6,0 ja 35 lämpötila 37 °C.

1S 109808 lb

Puhdistetun entsyymisakan kokonaistalteenotto ja tehokkuus, jolla menetelmä toteutetaan, muodostuu paremmaksi sekoittamalla liuosta, joka sisältää entsyymiä ja lisättyä orgaanista yhdistettä, sekä orgaanisen yhdisteen 5 lisäyksen aikana, että tätä seuraavan inkubointijakson aikana. Sopivia sekoitusmenetelmiä ovat mekaaninen sekoittaminen tai ravistaminen, voimakas kuplitus tai mikä tahansa muu alalla hyväksytty menetelmä.

Inkubointijakson jälkeen puhdistettu entsyymi 10 erotetaan dissosioituneesta pigmentistä ja muista epäpuhtauksista ja kerätään tavallisilla erotusmenetelmillä, kuten suodattamalla, sentrifugoimalla, mikrosuodat-tamalla, pyörö-tyhjösuodattamalla, ultrasuodattamalla, puristussuodattamalla, ristivirtauskalvomikrosuodattamalla, 15 sentrifugoimalla, mitä seuraa ultrasuodatus, tai vastaavalla. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käytetään suodattamista. Ristivirtauskalvomikrosuodattamista on käytetty tähän tarkoitukseen erinomaisin tuloksin. Puhdistetun entsyymisakan lisäpuhdistus voidaan aikaansaada . . 20 pesemällä saostuma vedellä, edullisesti vettä sisältävällä ; / orgaanisella yhdisteellä.

·’·’ Kuten edellä on todettu, mikäli orgaaninen yhdis- : te, jota lisätään entsyymin saostamiseksi, on aminohappo, ’·”· saatu puhdistettu entsyymituote on pääosin kiteinen. Vas- • · t j \l 25 taavasti, entsyymituote, joka on saatu kun dikarboksyyli- :*,·*: happoa on lisätty, on osittain kiteinen. Täten voidaan käyttää standardimenetelmiä kidesaannon kasvattamiseksi.

: Esimerkiksi ymppäyskiteiden käyttö aiheuttaa edullisemman » · .···, kinetiikan kiteytymisprosessille. Reaktioastian käyttö, *!* 30 jolla on tietyt pintaominaisuudet, on myös edullista. Nämä • · : *·· ominaisuudet ovat ilmeisiä alaan perehtyneelle. Kidekasvua ϊ.,,ϊ voidaan myös edullisesti edistää ravistamalla kiteytys- .···. astiaa. Suuremman kiteytymisasteen edistäminen sakassa on edullista, koska kiteisiä tuotteita voidaan helpommin 35 käyttää ja käsitellä lisättäessä kaupallisiin tuotteisiin.

109808 17

Erään tämän keksinnön suoritusmuodon mukaisesti saadut puhdistetut kiinteät entsyymit tai koostumukset ovat hyödyllisiä kaikissa sovellutuksissa, joissa entsyymejä käytetään joko kiinteässä tai nestemäisessä muodossa. Nämä 5 valmisteet voidaan valmistaa lopputuotteiksi, jotka ovat joko nestemäisä liuoksia, kiinteitä, raemaisia jauheita tai lietteitä. Esimerkiksi niitä voidaan käyttää pyykin pesuaineissa ja tahranpoisto-aineissa, piilolinssien entsymaattisissa puhdistusjärjestelmissä, karvanpoisto-10 aineena nahan valmistuksessa, ruokateollisuudessa ja veriseerumin testausmenetelmissä epätäydellisten vasta-aineiden havaitsemiseksi.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut alkaliset proteaasit ovat erityisen hyödyllisiä pesuaineissa ja 15 puhdistusaineissa, johtuen pienemmästä pigmenttipitoi-suudesta ja täten niillä on vähemmän sameuden muodostusta, haju- ja värikontaminaatiota. Lisäksi galaktosyylipolymee-rien ja niiden herkistymistä aiheuttavien ominaisuuksien poistaminen tämän keksinnön suoritusmuotojen mukaisesti . 20 valmistetuista entsyymivalmisteista on erityisen hyödyl- * listä entsymaattisten piilolinssituotteiden ja muiden • · · y’;’ kaupallisten sovellutusten valmistuksessa ja myös ruoka-, • · *·ί ! rehu- ja pesuaineteollisuudessa.

’·"* Pesuainesovellutuksissa keksinnön mukaisesti vai- • · · • 25 mistettuja aikalisiä proteaaseja käytetään tavallisesti : .* : nestekoostumuksessa, joka sisältää propyleeniglykolia.

Alkalinen proteaasi liuotetaan edullisesti propyleeniglyko-.‘.j liin kierrättämällä 25-%:isessa tilav./tilav. propyleeni- .··, glykoliliuoksessa, joka sisältää 10 % kalsiumkloridia. Pii- 30 lolinssien entsymaattisten puhdistusjärjestelmien sovellu-: '* tuksissa tämän keksinnön mukaisesti valmistetut entsyymit ovat tavallisesti kuivattuja. Edullisesti ne on kuivattu kylmäkuivaamalla. Tuote voidaan valmistaa myös granuloidus-sa muodossa, kuten on kuvattu U.S. patentisa nro. 4 689 • · 35 297, Good et ai., otsikolla "Dust Free Particulate Enzyme formulation", julkaistu 25. elokuuta 1987, joka on liitetty 109808 18 tähän viitteenä. Lisäksi tuote voi olla lietteen muodossa, joka sisältää suspendoitua liukenematonta entsyymiä vedessä .

Seuraavien esimerkkien ja liitettyjen taulukkojen 5 tarkoituksena on kuvata edelleen keksintöä. On kuitenkin ymmärrettävä, että keksintö ei rajoitu näihin spesifisiin esimerkkeihin tai niissä esitettyihin suoritusmuotoihin.

Esimerkki 1

Tutkittiin eri lysiinipitoisuuksien vaikutusta 10 entsyymin saostumiseen. Fermentaatiokasvatusliuos valmistettiin Bacillus alcalophilus -viljelmässä sopivassa ela-tusnesteessä. Fermentaation jälkeen entsyymiliuos muodostettiin erottamalla entsyymi mikrobisoluista, suspendoitu-neista kiinteistä aineista ja muista fermentaation raaka-15 ainejäännöksistä käyttäen tavallisia menetelmiä, kuten sentrifugointia ja tyhjörumpusuodattamista. Väkevöity entsyymiliuos muodostettiin sitten saadusta alkalisesta prote-aasiliuoksesta ultrasuodattamalla aktiivisuuteen 1 000 000 DU/ml. Lysiiniä lisättiin eri pitoisuuksina väkevöityyn . . 20 entsyymiliuokseen. Väkevöidyn entsyymiliuoksen pH sää-• ♦ * t* dettiin arvoon 5,0 käyttäen laimeaa etikkahappoa 10-%:isena ’·'·* tilav./tilav. Käsiteltyjä näytteitä inkuboitiin sitten : 30 °C:ssa sekoittaen vakionopeudella magneettisekoittimel- la.

« t t | 25 24 tunnin inkuboinnin jälkeen pääosin kiteinen entsyymisakka erotettiin kirkkaasta kerroksesta sentrifu-goimalla 15 000 kierrosta minuutissa 30 minuuttia. Sitten : sakka liuotettiin propyleeniglykoliin pH-arvossa 5,0 ja

• I

.••*t sekoitettiin 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Puhdistetun 30 Bacillus alcalophilus alkalisen proteaasisakan prosen- : *· tuaalinen talteenotto määritettiin kokeen avulla, joka perustuu kaseiinisubstraatin hydrolyysille.

.···, Entsyymiaktiivisuus määritettiin Delft Unit (DU) • ♦ mukaisesti. Kaseiiniliuos hydrolysoitiin saostumattomalla 35 alkalisella proteaasilla kirkkaassa kerroksessa 40 °C:n lämpötilassa ja boraattipuskurissa pH-arvossa 8,5.

19 109808

Hydrolysoitumaton kaseiini saostettiin trikloori-etikkahapolla ja poistettiin sentrifugoimalla. Trikloori-asetaattiin liukoisen kaseiini-hydrolysaatin absorbanssi määritettiin spektrofotometrisesti 275 nm:ssä. Mikäli 1 ml 5 2-%:ista entsyymivalmisteliuosta antoi 0,4:n absorbans-sieron koeolosuhteissa, proteaasivalmisteella oli 1 000 DU: n aktiivisuus. Kirkkaan kerroksen alkalisen proteaasin kokonaisaktiivisuusarvoa (DU/ml) verrattiin ei-saostuneen kontrollin aktiivisuuteen prosentuaalisen talteenoton mää-10 rittämiseksi sakassa.

Lysiinipitoisuuden vaikutus proteaasisakan määrään on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Puhdistetun alkalisen proteaasisakan talteenotto 15 käyttäen lysiiniä

Lysiinipitoisuus Puhdistetun sakan prosentuaa-Molaarisuus linen talteenotto 0,1 1,5 . . 20 0,2 1,7 9 9 : 0,3 68,0 0,4 85,0 • · : 0,5 88,0 • · • t · : *,· 25 Esimerkki 2 :: ; Lysiinin lisääminen väkevöityyn esimerkin 1 entsyymiliuokseen aiheutti pH:n kasvun, jolloin tarvittiin .*.J pH: n säätämistä pH-arvon ylläpitämiseksi arvossa 5,0.

.*··, Lysiini-HCl käytettiin entsyymin puhdistamiseksi ja tai- ·* 30 teenottoa verrattiin näytteeseen, joka oli saostunut käy- > ♦ ·* tettäessä ainoastaan lysiiniä. Valmistettiin Bacillus alcalophiluksen alkalisen proteaasin väkevöity entsyymi-.*··. liuos, jonka aktiivisuus oli 1 000 000 DU/ml. Lysiiniä ja lysiini-HCl lisättiin erillisiin näytteisiin loppupitoi-35 suudeksi 0,5 M. pH säädettiin arvoon 5,0 ja liuosta inku-boitiin 30 °C:ssa 24 tuntia jatkuvasti sekoittaen. Pääosin 109808 20 kiteiset alkaliset proteaasisakat erotettiin sentrifugoi-malla ja aktiivisuus määritettiin prosentuaalisena talteenottona. Tulokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2 5 Lysiinin ja lysiini-HCl:n saostamisvaikutuksen ver tailu

Orgaaninen yhdiste Sakan prosentuaalinen talteenotto lysiini >94 10 lysiini-HCl >94

Ero saadun kiteytyneen entsyymin määrässä vaihteli mitättömän vähän verrattaessa puhdistusta lysiinillä ja lysiini-HCl:llä. Täten voi olla edullista käyttää lysiini-15 HC1, jolloin vältetään pH:n uudelleensäätäminen.

Esimerkki 3

Tutkittiin pH:n vaikutusta entsyymin saostumiseen. Valmistettiin Bacillus_alcalophiluksen alkalisen proteaasin väkevöity entsyymiliuos, jonka . . 20 aktiivisuus oli 1 000 000 DU/ml. Lysiini-HCl lisättiin * · ♦ i

,* ,* loppupitoisuudeksi 0,4 M. Erotettujen liuososien pH

« · · t·';* säädettiin arvoihin 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 ja • · *.! ί 10,0 käyttäen 20-%:ista paino/tilavuus -natriumhydroksidia.

"·"· pH:n stabiloinnin jälkeen käsiteltyjä näytteitä inkuboitiin

4 1 I

; *(! 25 30 °C:ssa 24 tuntia jatkuvasti sekoittaen. Pääosin kitei- set alkaliset proteaasisakat erotettiin sentrifugoimalla kirkkaista kerroksista ja aktiivisuus määritettiin prosen-: tuaalisen talteenoton määrittämiseksi. Tulokset on esitetty • t · ,·*·, taulukossa 3.

< · · t I f » · · t III I · • II· • • I I I · » · f I · »

tilli I I

21 109808

Taulukko 3 pH:n vaikutus alkalisen proteaasin puhdistamiseen pH inkuboinnin aikana Sakan prosentuaalinen talteen- 5 otto 4.5 85 5.0 88 5.5 93 10 6,0 83 7.0 73 8.0 63 9.0 69 10.0 5 15

Kuten taulukossa 3 on esitetty, Bacillus alcalophi-luksen alkalisen proteaasin maksimi saostuminen tapahtui happamalla pH-alueella.

Esimerkki 4 20 L-lysiini-metyyliesteridihydrokloridin vaikutusta . . entsyymin saostumiseen tutkittiin. Valmistettiin Bacillus ; alcalophiluksen alkalisen proteaasin väkevöity entsyymi- • · · *·'·' liuos, jonka aktiivisuus oli 1 000 000 DU/ml, mikä saatiin • * M : esimerkin 1 olosuhteissa. L-lysiiniä ja L-lysiini-metyy- ·"·’ 25 liesteridihydrokloridia lisättiin erikseen loppupitoisuu- • deksi 0,5 M.

• · · : : Liuosten pH säädettiin arvoon 5,5 ja liuoksia in- kuboitiin 30 °C:ssa 24 tuntia jatkuvasti sekoittaen. Pro- j teaasisakat erotettiin sentrifugoimalla 15 000 kierrosta > · .*··, 30 minuutissa 20 minuuttia kirkkaasta kerroksesta ja entsyy-miaktiivisuus määritettiin prosentuaalisen talteenoton : ·· määrittämiseksi. Tulokset on koottu taulukkoon 4.

• * 22 109808

Taulukko 4

Lysiinijohdannaisen vaikutus entsyymin saostumiseen

Orgaaninen yhdiste Sakan prosentuaalinen talteenotto 5 L-lysiini 95 L-lysiini-metyyliesteri- 76 dihydrokloridi

Esimerkki 5 10 Eri lysiinipitoisuuksien vaikutusta entsyymin saos tumiseen tutkittiin. Valmistettiin Bacillus licheniformik-sen alkalisen proteaasin väkevöity entsyymiliuos, jonka aktiivisuus oli 500 DAPU/ml. Lysiiniä lisättiin väkevöi-tyyn entsyymiliuokseen loppupitoisuuksiksi 0,01 M, 0,05 M, 15 0,1 M, 0,2 M ja 0,5 M. Jokaisen liuoksen pH säädettiin arvoon 6,0 ja liuoksia inkuboitiin 25 °C:ssa 24 tuntia jatkuvasti sekoittaen. Pääosin kiteiset alkaliset prote-aasisakat erotettiin kirkkaasta kerroksesta sentrifugoi-malla ja aktiivisuus mitattiin prosentuaalisen talteenoton 20 määrittämiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 5.

, . Bacillus licheniformiksen alkalisen proteaasisakan • · •prosentuaalinen talteenotto määritettiin kokeen avulla, joka perustuu kaseiinisubstraatin hydrolyysiin 40 °C:ssa : pH-arvossa 8,5 (boraattipuskuri). Kaseiini hydrolysoitiin '·*'· 25 saostumattomalla alkalisella proteaasilla kirkkaassa ker- : roksessa. Hydrolysoitumaton kaseiini saostettiin trikloo- :*·*: rietikkahapolla ja poistettiin sentrifugoimalla. Trikloo- riasetaattiin liukoisen kaseiini-hydrolysaatin absorbanssi .·. : mitattiin spektrofotometrisesti 275 nmrssä. Yksi alkalinen • · .··. 30 detergentti proteaasiyksikkö (DAPU) on se aktiivisuus, ’* joka vapauttaa 4 mikromoolia tyrosiinia/minuutti koeolo- : " suhteissa. Kirkkaan kerroksen alkalisen proteaasin koko- naisaktiivisuusarvoa (DAPU/ml) verrattiin ei-saostuneen .···. kontrollin aktiivisuuteen prosentuaalisen talteenoton mää- 35 rittämiseksi.

23 109808

Taulukko 5

Lysiinipitoisuuden vaikutus entsyymin saostumiseen

Lysiinipitoisuus Sakan prosentuaalinen talteenotto 5 0,01 3 0,05 29 0,10 45 0,2 67 0,5 89 10

Esimerkki 6

Tutkittiin dikarboksyylihappoja sisältävien orgaanisten happojen vaikutusta entsyymin saostumiseen. Valmistettiin Bacillus licheniformiksen alkalisen proteaa-15 sin väkevöity entsyymiliuos, jonka aktiivisuus oli 863 DAPU/ml. Väkevöidyn entsyymiliuoksen osien erottamiseksi lisättiin malonihappoa (HOOC-CH2-COOH), meripihkahappoa (HOOC-(CH2)2-COOH) ja glutaarihappoa (HOOC-(CH2)3-COOH) lop-pupitoisuuksiksi 0,5 M. Liuosten pH säädettiin arvoon 6,0 20 ja inkuboitiin 37 °C:ssa neljä tuntia jatkuvasti sekoittaen. Entsyymisakat erotettiin kirkkaista kerroksista ja . " aktiivisuus mitattiin prosentuaalisen talteenoton määrit- ν'.· tämiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 6.

·_· · Taulukko 6 ·:··.· 25 Tiettyjen dikarboksyylihappojen vaikutus entsyymin ·’·*: saostumiseen • · • · ·

Dikarboksyylihappo Rakennekaava Sakan prosentuaali- . H00C-(CH2)n-C00H nen talteenotto 30 malonihappo H00C-CH2-C00H 73 meripihkahappo HOOC-(CH2)2-COOH 70 • '·· glutaarihappo HOOC-(CH2)3-COOH 55 • · • · 24 109808

Esimerkki 7

Tutkittiin orgaanisten happojen, jotka sisälsivät monia karboksyyliryhmiä, vaikutusta entsyymien saostumi-seen. Valmistettiin Bacillus licheniformiksen alkalisen 5 proteaasin väkevöity liuos, jonka aktiivisuus oli 440 DAPU/ml. Väkevöidyn entsyymiliuoksen erillisiin näytteisiin lisättiin monokarboksyylihapon (etikkahappo) natrium-suoloja, kahta dikarboksyylihappoa (malonihappo ja meri-pihkahappo) ja trikarboksyylihappoa (sitruunahappo) loppu-10 pitoisuudeksi 0,5 M. Liuosten pH säädettiin arvoon 6,0 ja inkuboitiin 37 °C:ssa neljä tuntia jatkuvasti sekoittaen. Entsyymisakat erotettiin kirkkaasta kerroksesta ja proteiinipitoisuus, proteaasiaktiivisuus ja prosentuaalinen talteenotto määritettiin. Tulokset on esitetty taulukos-15 sa 7.

Proteiini-väriainesitoutumismenetelmää käytettiin kokonaisproteiinimäärän määrittämiseksi. (Bradford, Anal. Biochim; 72, 248, 1976). Proteiiniliuosnäyte (0,1 ml) pi-petoitiin koeputkeen ja 5 ml proteiini-väriainereagenssia 20 lisättiin siihen ja sekoitettiin sekoittimessa. Absorbans- si 595 nm:ssä määritettiin viiden minuutin kuluttua suh- • » •teessä sokkoreagenssiin, joka oli valmistettu 0,1 ml:sta • · vettä ja 5 mlrsta proteiini-väriainereagenssia. Proteiinin ·.· · määrä määritettiin sitten standardikäyrästä, joka oli vai- :·'.1 25 mistettu naudan gammaglobuliinista.

• · 1 • · 1 • · • · I < I • · · <11 • · · • · · • · • t • · « t · · » 25 109808

Taulukko 7

Kasvavan karboksyyliryhmäsubstituutioasteen vaikutus entsyymin saostumiseen 5

Proteiini Alkalinen proteaasi

Karboksyy- Rakennekaava lihappo mg/ml sakan pro- DAPU/ml sakan pro- ¢0 5 M) super- .sentuaali- super- sentuaali- 1 natan- nen tai- natan- nen tal- tissa teenotto tissa . teenotto 10

Kontrolli 63,0 0 440 0

Etikka- CH3-COOH 39.7 37 277 37 15 happo

Malonihap- H00C-CH2-C00H 16.0 73 118 73 po ' 20 Meripihka- H00C-CH2-CH2-C00H 18f9 70 132 70 happo • · • ·

Sitruuna- CH2-COOH 10,0 84 63 86

I happo I

• » · I

....125 CH-C00H

§ · j ·t CH2-C00H

• 1 1 t 1 ;/30 Kuten taulukosta 7 nähdään, entsyymin saostuminen ·;·1 kasvoi nostettaessa hapon substituutioastetta karboksyyli- ryhmillä. Dikarboksyylihapoilla ja trikarboksyylihapoilla saatiin parempia tuloksia kuin monokarboksyylihapoilla.

26 1 0 9 8 0 8

Esimerkki 8

Tutkittiin kaksoissidoksen sisältävien karboksyy-lihappojen lisäämisen vaikutusta entsyymin saostumiseen. Valmistettiin Bacillus licheniformiksen alkalisen proteaa-5 sin väkevöity entsyymiliuos, jonka aktiivisuus oli 453 DAPU/ml. Akryylihapon, maleiinihapon ja fumaarihapon nat-riumsuoloja lisättiin väkevöidyn entsyymiliuoksen erillisiin näytteisiin loppupitoisuuksiksi 0,5 M. Liuosten pH säädettiin arvoon 6,0 ja inkuboitiin 37 °C:ssa neljä tun-10 tia jatkuvasti sekoittaen. Entsyymisakat erotettiin kirkkaasta kerroksesta ja kokonaisproteiinimäärä, proteaasiak-tiivisuus ja prosentuaalinen talteenotto määritettiin. Tulokset on esitetty taulukossa 8. Maleiinihappo ja fumaa-rihappo, molemmat tyydyttymättömiä dikarboksyylihappoja, 15 saostivat entsyymin. Kuitenkaan, akryylihapolla, tyydytty-mättömällä monokarboksyylihapolla, ei ollut mitään vaikutusta alkalisen proteaasin liukoisuuteen eikä tapahtunut saostumista.

• · • · * 1 ♦ * · · I · • · · * · t · • I · · > 27 109808

Taulukko 8

Tyydyttymättömien karboksyylihappojen vaikutus entsyymin saostumiseen 5 _ . Proteiini Proteaasiaktii-

Rakenne-

Tyydytty kaava ______visuus _ mätön or· gaaninen mg/ml Sakan pro- DAPU/ml sakan pro- happo super- sentuaali- super- sentuaali-

natan- nen tai- natan- neh taito^ M) I tissa Iteenotto I tissa Iteenotto I

10

Kontrolli 58 0 453 0 15 Akryyli- H2C=CH-C00H 57 2 455 0 happo

Omenahap- CFf-COOH 30^0 52 222 49 " «

20 CH-C00H

. . (Cis) • «

Fumaari- HOOC-CH 18;6 68 163 64

happo II

" 25 HC-COOH

• · · : 1#i (Trans) « t § t » ♦ i 1 - — —1 ... 1 ... . .......1— -------- • · · ,·, : Esimerkki 9 • i t I./30 Tutkittiin pH: n vaikutusta sukkiinihapon kykyyn *!' saostaa entsyymi. Valmistettiin Bacillus licheniformiksen : ’·· alkalisen proteaasin väkevöity entsyymi liuos, jonka aktii- visuus oli 750 DAPU/ml. Meripihkahappoa lisättiin väkevöi-.···. tyyn entsyymiliuokseen loppupitoisuudeksi 0,25 M. Erillis- .,.,:35 ten 100 ml:n näytteiden pH säädettiin arvoihin 4,0, 5,0, 28 109808 6,0, 7,0, 8,0 ja 9,O käyttäen 20-%:ista natriumhydroksidia ja liuoksia inkuboitiin lämpötilassa 30 °C 20 tuntia jatkuvasti sekoittaen. Entsyymisakat erotettiin kirkkaasta kerroksesta ja aktiivisuus mitattiin prosentuaalisen tal-5 teenoton määrittämiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 9.

Taulukko 9 pH:n vaikutus entsyymin saostumiseen 10 Saostumis-pH Sakan prosentuaalinen talteenotto 4.0 0,8 5.0 5,7 6.0 71 7.0 81 15 8,0 92 9.0 94

Kuten taulukosta 9 nähdään, Bacillus licheniformik-sesta johdetun alkalisen proteaasin maksimi saostuminen 20 tapahtui emäksisillä pH-alueilla.

Esimerkki 10 • · • · • '· Tutkittiin ajan vaikutusta saostettaessa entsyymi • · · lysiinillä. Valmistettiin Bacillus alcalophiluksen alkali- « · ·.· i sen proteaasin väkevöity entsyymiliuos, jonka aktiivisuus '"‘•25 oli 1 000 000 DU/ml. Lysiiniä lisättiin loppupitoisuudeksi l ·’: 0,5 M. Liuoksen pH säädettiin arvoon 5,0 ja inkuboitiin 30 °C:ssa. Entsyymisakat erotettiin kirkkaista kerroksista ja aktiivisuus mitattiin prosentuaalisen talteenoton mää- .·, : rittämiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 10.

• » · * · · » · 1 > 29 109808

Taulukko 10

Inkubointiaika tunteina Sakan prosentuaalinen talteenotto 5 10 73 15 90 24 89,5 36 91 48 94 10

Kuten taulukosta 10 nähdään, suurin osa entsyymistä ilmaantui sakassa 10 - 20 tunnin kuluttua.

Esimerkki 11

Tutkittiin lämpötilan vaikutusta seostettaessa ent-15 syymi lysiinillä. Valmistettiin Bacillus alcalophiluksen alkalisen proteaasin väkevöity entsyymiliuos, jonka aktiivisuus oli 1 000 000 DU/ml. Lysiiniä lisättiin loppupitoi-suudeksi 0,5 M. Liuoksen erillisten näytteiden pH säädettiin arvoon 5,0 ja inkuboitiin eri lämpötiloissa kuusi 20 tuntia. Entsyymisakat erotettiin kirkkaasta kerroksesta ja , , aktiivisuus mitattiin prosentuaalisen talteenoton määrit- • · •'· tämiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 11.

• · ·

Taulukko 11 • ♦ • · « · · t * · 25 Inkubointilämpötila Sakan prosentuaalinen : ‘ : °C talteenotto ♦ · 5 l 20 65 .·. : 30 73 * < · 30 35 94 T* 40 91 • i :,t>: Kuten taulukosta 11 nähdään, suurin osa saostumi- sesta tapahtui lämpötila-alueella 20 °C - 40 °C näissä ^ . 35 olosuhteissa.

I * 109808

Esimerkki 12

Alkalinen proteaasi muodostettiin fermentaatio-kasvatusliuoksesta, joka oli Bacillus licheniformiksen viljelmä sopivassa elatusnesteessä. Fermentaation jälkeen 5 mikrobisolut ja suspendoituneet kiinteät aineet erotettiin alkalisesta proteaasista sentrifugoimalla. Sitten saatu alkalinen proteaasiliuos väkevöitiin käyttäen ultrasuo-dattamista. Saatiin alkalisen proteaasikonsentraatin vesipitoinen liuos, jonka entsymaattinen aktiivisuus oli 10 880 DAPU/ml.

Eri määriä aminohappoja lisättiin 30 ml:aan tätä väkevöityä entsyymiliuosta pH-arvossa 6,0. Liuoksen pH pidettiin pH-arvossa 6,0 käyttäen natriumhydroksidia. Liuoksen tilavuus säädettiin 50 ml:ksi vedellä ja inkuboi-15 tiin 37 eC:ssa neljä tuntia jatkuvasti sekoittaen. Entsyy-misakka erotettiin sentrifugoimalla 20 000 kierrosta minuutissa 20 minuuttia 5 °C:ssa.

Kirkas kerros analysoitiin proteiinin ja entsyymi-aktiivisuuden suhteen. Tulokset on koottu taulukkoon 12. 20 Taulukko 12

Aminohappojen vaikutus entsyymin saostumiseen t · < ·

* * - I

• ; ; Amino- Proteiini Proteaasiaktiivisuus · happo • · • · • · * * · · __ _ - I —' — '!“·25 pi-toisuiB mg/nl sakan pro- DAPU/ml sakan pro- ,, . (molaa- super- sentuaali- super- sentuaali- j ’ ! risuus) natan- nen tai- natan- nen tal- ,,, tissa teenotto tissa teenotto I * · * · · > ,·, j Kontrolli 0 74,0 0 500 0 ’;./30------- ,,,· Aspara- . 0,50 36} 7 50 253 49 ,,· giini- ; *,, happo ----— - ------- ·,,,· Aspara- 0,75 30,0 59 208 58 • giini- •"*« happo '•••‘.35------ ’ ί ‘ * I Lysiini 0^50 30,0 59 208 58 3i 109808

Esimerkki 13

Tutkittiin monokarboksyylihappojen lisäämisen vaikutusta entsyymin saostumiseen. Valmistettiin Bacillus licheniformiksen alkalisen proteaasin väkevöity liuos, 5 jonka aktiivisuus oli 440 DAPU/ml. Kahden monokarboksyyli-hapon, etikkahapon ja muurahaishapon, natriumsuoloja lisättiin loppupitoisuudeksi 0,5 M. Liuoksen pH säädettiin arvoon 6,0 ja liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa neljä tuntia jatkuvasti sekoittaen. Entsyymisakka erotettiin kirkkaasta 10 kerroksesta sentrifugoimalla ja proteiinipitoisuus, proteaasiaktiivisuus ja prosentuaalinen talteenotto määritettiin. Tulokset on esitetty taulukossa 13.

Taulukko 13 15 Monokar- Proteiini Proteaasiaktiivisuus boksyyli-happo mg/ml super- sakan pro- DAPU/ml sakan pro- 20 natantissa sentuaali- supernatan- sentuaali- . . nen tai- tissa nen tal- ,'·· teenotto teenotto • t · i » • « • * _____ - ^^_____ I I ' -

• * I

! Kontrolli 70 0 488 0

Silti • t • · ^ ^ 25 '1 —*— ' —— : Etikka- A5 n 36 306 37 happo 1 !(V! Muurahais- 42r0 40 291 40 .’**! 3Q happo i ----— — F 1 * t · • I >

Vertaamalla vertailevan esimerkin 13 tuloksia » » • · esimerkin 7, joka toteutettiin identtisissä olosuhteissa, i i * tuloksiin, nähdään, että saadaan huomattavasti parempia i Ί": 35 tuloksia käyttäen tässä kuvattua orgaanista yhdistettä saostaj ana.

Claims

32 109808 Fa tentti vaatimukset:

1. Menetelmä puhdistetun entsyymin valmistamiseksi fermentaatiokasvatusliuoksesta, tunnettu siitä, 5 että se käsittää seuraavat vaiheet, joissa: (i) muodostetaan entsyymiliuos erottamalla entsyymi soluista ja suspendoituneista kiinteistä aineista mainitussa fermentaatiokasvatusliuoksessa, (ii) väkevöidään mainittu entsyymiliuos, 10 (iii) lisätään mainittuun väkevöityyn entsyymi- liuokseen orgaanista yhdistettä, jossa orgaaninen yhdiste valitaan ryhmästä karboksyylihapot, joissa on vähintäin kaksi karboksyyliryhmää, näiden karboksyylihappojen suolat tai esterit, aminohapot, näiden aminohappojen suolat tai 15 esterit ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset, (iv) inkuboidaan mainittua väkevöityä entsyymi-liuosta, joka sisältää mainittua orgaanista yhdistettä ja (v) kerätään puhdistettu entsyymisakka.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, .. tunnettu siitä, että vaihe (iii) toteutetaan pH- • · * .* alueella 3,5 - 10,5.

• · · ’·’·* 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, : tun nettu siitä, että vaiheet (iii) ja (iv) *·*'· 25 toteutetaan olosuhteissa, joihin lukeutuu sekoittaminen.

• · · • * : 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että vaiheessa (iii) lisätään orgaanista yhdistettä loppupitoisuudeksi vähintäin 0,06 M.

: 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · · • · ,···. 30 tun nettu siitä, että vaihe (iii) toteutetaan '·’ lämpötila-alueella n. 5 °C - n. 50 °C.

« · : * 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • i » tun nettu siitä, että se käsittää vaiheen (v) .···. jälkeen vaiheen (vi) , jossa pestään puhdistettu entsyymi- • I I 35 sakka vedellä, joka sisältää orgaanista yhdistettä. • · 33 109808

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että orgaaninen yhdiste valitaan luonnossa esiintyvistä aminohapoista, näiden aminohappojen suoloista tai estereistä, valittuna happamista amino- 5 hapoista, emäksisistä aminohapoista, niiden suoloista, niiden estereistä ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seoksista.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että orgaaninen yhdiste valitaan 10 ryhmästä lysiini, arginiini, histidiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, niiden natriumsuolat, lysiini-HCl ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että orgaaninen yhdiste valitaan 15 ryhmästä asparagiinihappo, lysiini ja lysiini-HCl.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaaninen yhdiste valitaan karboksyylihapoista ja näiden karboksyylihappojen suoloista, valittuna karboksyylihapoista, joissa on 2 - 3 20 karboksyyliryhmää, ja jotka sisältävät vähintäin kolme hiiliatomia, niiden natrium-, kalsium-, kalium- tai • ” magnesiumsuoloista ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seoksista. • t

·· · 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että orgaaninen yhdiste valitaan ·*·*: ryhmästä malonihappo, meripihkahappo, sitruunahappo, • · maleiinihappo, fumaarihappo, niiden natrium- tai kaliumsuolat ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen . . yhdisteen seokset. • · · I.,* 30

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, • « ·;· tunnettu siitä, että orgaaninen yhdiste valitaan • t : ryhmästä meripihkahappo, sitruunahappo ja näiden happojen natriumsuola.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että entsyymi valitaan ryhmästä pro-teaasit, lipaasit, amylaasit, sellulaasit, hemisellulaasit, 109808 pektinaasit, amidaasit, katalaasit, isomeraasit ja oksidaasit.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi käsittää alkalisen 5 proteaasin.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on alkalinen prote-aasi, joka on johdettu Bacillus alcalophiluksesta ja että vaiheessa (ii) entsyymiliuosta väkevöidään väkevöidyksi 10 entsyymiliuokseksi, kunnes entsyymiaktiivisuus on vähintäin 250 000 DU/ml.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on alkalinen prote-aasi, joka on johdettu Bacillus licheniformiksesta ja että 15 vaiheessa (ii) entsyymiliuosta väkevöidään väke-vöidyksi entsyymiliuokseksi, kunnes entsyymiaktiivisuus on vähintäin n. 250 DAPU/ml.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (iii) lisätään 20 mainittuun väkevöityyn entsyymiliuokseen vähintäin yhtä . . hydrolyyttistä entsyymiä. • 1·

18. Menetelmä puhdistetun alkalisen proteaasin valmistamiseksi, joka on johdettu Bacillus alcalophiluksen \1 · tai Bacillus licheniformiksen fermentaatiokasvatus- '·**.' 25 liuoksesta, tunnettu siitä, että se käsittää seu- :1·1: raavat vaiheet, joissa: • « :1·1; (i) muodostetaan alkalinen proteaasiliuos erotta- maila alkalinen proteaasi soluista ja suspendoituneista .·, : kiinteistä aineista mainitussa f ermentaatiokasvatus- • 1 · 1..1 30 liuoksessa, • · (ii) väkevöidään mainittu alkalinen proteaasi- • · : 1·· liuos, : : (iii) lisätään mainittuun väkevöityyn alkaliseen .···, proteaasiliuokseen orgaanista yhdistettä, joka orgaaninen » t 35 yhdiste valitaan ryhmästä karboksyylihapot, joissa on vähintäin kaksi karboksyyliryhmää, näiden karboksyylihappojen 109808 suolat tai esterit, aminohapot, näiden aminohappojen suolat tai esterit ja kahden tai useamman tällaisen orgaanisen yhdisteen seokset, (iv) inkuboidaan mainittu väkevöity alkalinen 5 proteaasiliuos, joka sisältää mainittua orgaanista yhdistettä ja (v) kerätään puhdistettu alkalinen proteaasisakka, jolla mainitulla alkalisella proteaasilla on galaktosyylipolymeeripitoisuus, joka on pienempi kuin 1,00 10 mg/g entsyymiproteiinia.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu alkalinen proteaasi on johdettu Bacillus alcalophiluksen fermentaatiokasvatus-liuoksesta ja mainitulla puhdistetulla alkalisella 15 proteaasilla, kerättynä vaiheen (v) aikana, on absorbanssi, joka on alle 1,3 470 nm:ssä, väkevöitynä n. 1 000 000 DU/ml:n aktiivisuuteen.

20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu puhdistettu alkalinen 20 proteaasi on johdettu Bacillus licheniformiksen fermentaa- . . tiokasvatusliuoksesta ja mainitulla puhdistetulla alkali- ; / sella proteaasilla, kerättynä vaiheessa (v), on absor- • · · banssi, joka on pienempi kuin 0,5 470 nm:ssä väkevöitynä : aktiivisuuteen 440 DAPU/ml. t • t 25 • · • · f · • · · • · · • · · · • · · • · • · · • · I · · t t < « • · · t I i • · • · • » · 1 » 36 109808