JPH0822239B2 - 変異ヒト腫傷壊死因子 - Google Patents
変異ヒト腫傷壊死因子Info
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- JPH0822239B2 JPH0822239B2 JP63169378A JP16937888A JPH0822239B2 JP H0822239 B2 JPH0822239 B2 JP H0822239B2 JP 63169378 A JP63169378 A JP 63169378A JP 16937888 A JP16937888 A JP 16937888A JP H0822239 B2 JPH0822239 B2 JP H0822239B2
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- patnf
- plasmid
- amino acid
- necrosis factor
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は野生型(天然型)のヒト腫瘍壊死因子(以
下、hTNFと略す)のアミノ酸配列において、カルボキシ
末端(最末端)の1個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列で示される変異hTNFに関するもので
ある。
下、hTNFと略す)のアミノ酸配列において、カルボキシ
末端(最末端)の1個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列で示される変異hTNFに関するもので
ある。
[従来技術とその課題] 腫瘍壊死因子は、人間等の動物自身が体内で産生する
制癌作用のある物質であり、腫瘍細胞に対して特異的な
細胞毒性作用を持った抗腫瘍剤として、その結果が期待
されている。近年の遺伝子組換え技術の発達によって野
生型ヒト腫瘍壊死因子のcDNAがクローニングされ、該DN
Aを用いて高純度、かつ多量の組換hTNFを供給すること
が可能となった。しかしながら、活性がより高く、かつ
より安定であり、抗腫瘍剤として臨床上より有用なhTNF
誘導体の開発が望まれている。
制癌作用のある物質であり、腫瘍細胞に対して特異的な
細胞毒性作用を持った抗腫瘍剤として、その結果が期待
されている。近年の遺伝子組換え技術の発達によって野
生型ヒト腫瘍壊死因子のcDNAがクローニングされ、該DN
Aを用いて高純度、かつ多量の組換hTNFを供給すること
が可能となった。しかしながら、活性がより高く、かつ
より安定であり、抗腫瘍剤として臨床上より有用なhTNF
誘導体の開発が望まれている。
[課題を解決するための手段] 本発明者らは、治療目的に適った、高活性で安定な変
異hTNFの開発を目的とし鋭意研究を重ねてきたが、その
過程で、野生型hTNFの安定性について以下の知見を得
た。
異hTNFの開発を目的とし鋭意研究を重ねてきたが、その
過程で、野生型hTNFの安定性について以下の知見を得
た。
まず、野生型hTNFをコードしている遺伝子を合成し、
大腸菌トリプトファンオペロンプロモーターの支配下に
hTNF遺伝子を発現させるプラスミドpATNFを組み立てた
(第4図参照)。このプラスミドpATNFを用いて大腸菌K
12株C600を形質転換し、形質転換体から組換hTNFを常法
通り単離し、得られた組換hTNFを非還元型のNative電気
泳動にかけたところ、数本のバンドに分かれた。そこ
で、このhTNFをヒドロキシアパタイトカラムによるHPLC
にかけ、分離したピークを分取してその各々の安定性を
調べたところ、水溶液中、4℃で分離前のパターンに戻
ることが分かった。次に、これら各ピークの画分のアミ
ノ末端を分析し、アミノ末端としてMet、Val、Arg、Ser
の各アミノ酸を検出した。この結果を、hTNFのアミノ末
端領域の配列がVal−Arg−Ser−Ser−Serであることに
照らして考察すると、hTNFの精製品は、アミノ末端に様
々な欠損を有するコンフォーマーの集合体であると考え
られる。これは、野生型hTNFの不安定さを示すものであ
る。
大腸菌トリプトファンオペロンプロモーターの支配下に
hTNF遺伝子を発現させるプラスミドpATNFを組み立てた
(第4図参照)。このプラスミドpATNFを用いて大腸菌K
12株C600を形質転換し、形質転換体から組換hTNFを常法
通り単離し、得られた組換hTNFを非還元型のNative電気
泳動にかけたところ、数本のバンドに分かれた。そこ
で、このhTNFをヒドロキシアパタイトカラムによるHPLC
にかけ、分離したピークを分取してその各々の安定性を
調べたところ、水溶液中、4℃で分離前のパターンに戻
ることが分かった。次に、これら各ピークの画分のアミ
ノ末端を分析し、アミノ末端としてMet、Val、Arg、Ser
の各アミノ酸を検出した。この結果を、hTNFのアミノ末
端領域の配列がVal−Arg−Ser−Ser−Serであることに
照らして考察すると、hTNFの精製品は、アミノ末端に様
々な欠損を有するコンフォーマーの集合体であると考え
られる。これは、野生型hTNFの不安定さを示すものであ
る。
次いで、野生型hTNFの安定性と構造上の特徴との関係
を明らかにするために、既知の野生型hTNFの1次構造を
チャウ(Chou)およびファスマン(Fasman)のアルゴリ
ズム(algorithm)にかけ、2次構造の予測を行った。
結果を第1図に示す。図中、AAAAAAAはアルファヘリッ
クス構造、BBBBBはベータ−シート構造、そしてTTTTは
ターン構造を表す。第1図から、hTNFは全体にβ−シー
ト折り畳み構造に富んだ構造をとっていることが分る。
このようなβ−シート構造をとるタンパク質としてはマ
ウスEGFが知られている。マウスEGFの高解像度NMR分析
の結果から、マウスEGFはβ−シートの三層構造をとる
ことが分かっており、該タンパク質の末端部分を欠損さ
せて三層構造を崩すと生物活性(細胞増殖促進作用)が
低下することが報告されている[バイオケミストリー
(Biochemistry)115、2624(1976)およびネイチャー
(Nature)327(28)、339(1987)]。これらの報告
は、折り畳み構造が全体構造の安定性、生物活性に寄与
しており、特に末端領域のアミノ酸配列がそれらに大き
く影響を及ぼすことを示すものである。
を明らかにするために、既知の野生型hTNFの1次構造を
チャウ(Chou)およびファスマン(Fasman)のアルゴリ
ズム(algorithm)にかけ、2次構造の予測を行った。
結果を第1図に示す。図中、AAAAAAAはアルファヘリッ
クス構造、BBBBBはベータ−シート構造、そしてTTTTは
ターン構造を表す。第1図から、hTNFは全体にβ−シー
ト折り畳み構造に富んだ構造をとっていることが分る。
このようなβ−シート構造をとるタンパク質としてはマ
ウスEGFが知られている。マウスEGFの高解像度NMR分析
の結果から、マウスEGFはβ−シートの三層構造をとる
ことが分かっており、該タンパク質の末端部分を欠損さ
せて三層構造を崩すと生物活性(細胞増殖促進作用)が
低下することが報告されている[バイオケミストリー
(Biochemistry)115、2624(1976)およびネイチャー
(Nature)327(28)、339(1987)]。これらの報告
は、折り畳み構造が全体構造の安定性、生物活性に寄与
しており、特に末端領域のアミノ酸配列がそれらに大き
く影響を及ぼすことを示すものである。
このような観点から第1図のTNFの2次構造および第
2図のハイドロパシー特性を示すグラフを考察すると、
カルボキシ末端の10個のアミノ酸(148−157)は疎水性
アミノ酸群からなり、β−シート構造をとっていること
が分かる。また、アミノ酸147付近のSer−Gly−Gln配列
の領域は、β−ターン構造を形成していると考えられ
る。さらに69Cysと101Cysはジスルフィド結合を形成し
ているが、この領域では非並行(アンチパラレル)なβ
−シート構造を形成していることが分かる。なお、アミ
ノ末端は親水性のアミノ酸群から構成されているため
(第2図参照)、ランダムコイルを形成し、分子表面に
露出していると考えられる。また、カルボキシ末端部分
の147番目以降のアミノ酸配列は、Ser−Gly−Gln−Val
−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−Ala−Leuとなっており、
タンパク質の立体構造をもとにして得られる平均露出面
積の値に基づいて検討すると、152Pheから157Leuまでの
配列は分子内部に見出される確率の高い配列である。従
って、TNF全体でこのカルボキシ末端領域は、タンパク
質内部にもぐりこんでいると予想される。以上から、野
生型hTNFの2次構造は、アミノ末端部分が突出し、カル
ボキシ末端がタンパク質内にもぐりこんでいる、β−シ
ートの折り畳み構造であると結論された。
2図のハイドロパシー特性を示すグラフを考察すると、
カルボキシ末端の10個のアミノ酸(148−157)は疎水性
アミノ酸群からなり、β−シート構造をとっていること
が分かる。また、アミノ酸147付近のSer−Gly−Gln配列
の領域は、β−ターン構造を形成していると考えられ
る。さらに69Cysと101Cysはジスルフィド結合を形成し
ているが、この領域では非並行(アンチパラレル)なβ
−シート構造を形成していることが分かる。なお、アミ
ノ末端は親水性のアミノ酸群から構成されているため
(第2図参照)、ランダムコイルを形成し、分子表面に
露出していると考えられる。また、カルボキシ末端部分
の147番目以降のアミノ酸配列は、Ser−Gly−Gln−Val
−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−Ala−Leuとなっており、
タンパク質の立体構造をもとにして得られる平均露出面
積の値に基づいて検討すると、152Pheから157Leuまでの
配列は分子内部に見出される確率の高い配列である。従
って、TNF全体でこのカルボキシ末端領域は、タンパク
質内部にもぐりこんでいると予想される。以上から、野
生型hTNFの2次構造は、アミノ末端部分が突出し、カル
ボキシ末端がタンパク質内にもぐりこんでいる、β−シ
ートの折り畳み構造であると結論された。
以上の知見を得て、本発明者らは、野生型hTNFのアミ
ノ酸配列を、β−シート構造を破壊せずに一層安定性の
高い構造をとり得る配列に変換すれば、構造の安定化に
伴い、生物活性が増強されるという予測をたてた。とこ
ろで、hTNFについて、その末端のアミノ酸配列が安定性
および活性に極めて大きく寄与していることが知られて
いる。例えば、カルボキシ末端の1個のアミノ酸(ロイ
シン)を欠失すると失活することが分かっている。従っ
て、カルボキシ末端を変化させると、タンパク質構造全
体に大きい影響があるものと考えられる。本発明者らは
そのような観点から種々検討を加えた結果、カルボキシ
末端、とりわけ最末端の唯一個のアミノ酸(ロイシン)
を疎水性の高い他のアミノ酸に置換すると顕著にTNF活
性が高められることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
ノ酸配列を、β−シート構造を破壊せずに一層安定性の
高い構造をとり得る配列に変換すれば、構造の安定化に
伴い、生物活性が増強されるという予測をたてた。とこ
ろで、hTNFについて、その末端のアミノ酸配列が安定性
および活性に極めて大きく寄与していることが知られて
いる。例えば、カルボキシ末端の1個のアミノ酸(ロイ
シン)を欠失すると失活することが分かっている。従っ
て、カルボキシ末端を変化させると、タンパク質構造全
体に大きい影響があるものと考えられる。本発明者らは
そのような観点から種々検討を加えた結果、カルボキシ
末端、とりわけ最末端の唯一個のアミノ酸(ロイシン)
を疎水性の高い他のアミノ酸に置換すると顕著にTNF活
性が高められることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
即ち、本発明は、野生型ヒト腫瘍壊死因子のカルボキ
シ末端のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてなるアミ
ノ酸配列で示される変異ヒト腫瘍壊死因子を提供するも
のである。
シ末端のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてなるアミ
ノ酸配列で示される変異ヒト腫瘍壊死因子を提供するも
のである。
本発明のカルボキシ末端変異hTNF(以下、hTNF−CFと
称する)は、野生型hTNFをコードしているDNA配列のC
末端アミノ酸に対応するコドンを他のアミノ酸に対応す
るコドンで置換し、得られたDNA配列を適当なベクター
に組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、得ら
れた形質転換体を培養することにより製することができ
る。他のアミノ酸としては、疎水性の高いフェニルアラ
ニン、トリプトファン、チロシン、アラニン、およびヒ
スチジンを挙げることができるが、構造の安定化および
活性の向上の両面でフェニルアラニンが最適である。
称する)は、野生型hTNFをコードしているDNA配列のC
末端アミノ酸に対応するコドンを他のアミノ酸に対応す
るコドンで置換し、得られたDNA配列を適当なベクター
に組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、得ら
れた形質転換体を培養することにより製することができ
る。他のアミノ酸としては、疎水性の高いフェニルアラ
ニン、トリプトファン、チロシン、アラニン、およびヒ
スチジンを挙げることができるが、構造の安定化および
活性の向上の両面でフェニルアラニンが最適である。
カルボキシ末端のロイシンが疎水性のフェニルアラニ
ンで置換された本発明のhTNF−CFをSDS−PAGEおよび非
還元型Native電気泳動にかけると、単一のバンドを示
し、野生型hTNFのようなコンフォーマーを形成していな
いことが示された(第8図)。このことは、カルボキシ
最末端の変化が、アミノ末端の安定化に寄与しているこ
とを意味するものである。
ンで置換された本発明のhTNF−CFをSDS−PAGEおよび非
還元型Native電気泳動にかけると、単一のバンドを示
し、野生型hTNFのようなコンフォーマーを形成していな
いことが示された(第8図)。このことは、カルボキシ
最末端の変化が、アミノ末端の安定化に寄与しているこ
とを意味するものである。
さらにこのhTNF−CFを上記アルゴリズムによって解析
すると、カルボキシ末端領域は依然β−シート構造を維
持しており、安定性に寄与していることが確認された
(第3図参照)。このhTNF−CFを、L929細胞を用いる細
胞毒性試験に委ねて生物活性を評価した結果、その活性
は野生型hTNFの約30倍であり、活性の著しい向上が達成
されたことが明らかになった。
すると、カルボキシ末端領域は依然β−シート構造を維
持しており、安定性に寄与していることが確認された
(第3図参照)。このhTNF−CFを、L929細胞を用いる細
胞毒性試験に委ねて生物活性を評価した結果、その活性
は野生型hTNFの約30倍であり、活性の著しい向上が達成
されたことが明らかになった。
本発明のhTNF−CFは、後述の如く、hTNF−CFをコード
する発現ベクターpATNF−CFを用いて適当な宿主細胞を
形質転換し、得られた形質転換体を培養し、次いで、培
養物から単離することにより得られる。
する発現ベクターpATNF−CFを用いて適当な宿主細胞を
形質転換し、得られた形質転換体を培養し、次いで、培
養物から単離することにより得られる。
従って、本発明は、上記の変異hTNFをコードするDNA
配列、該DNA配列を含有する発現ベクター、および該発
現ベクターで形質転換された形質転換体、並びに該形質
転換体を培養することからなる変異hTNFの製造方法を提
供するものである。
配列、該DNA配列を含有する発現ベクター、および該発
現ベクターで形質転換された形質転換体、並びに該形質
転換体を培養することからなる変異hTNFの製造方法を提
供するものである。
本明細書中、アミノ酸は、当該技術分野で一般的な省
略形で表すこととし、またhTNFという語句は天然のhTNF
およびDNA組換え法で得られる天然のhTNFと同じアミノ
酸配列を有するhTNFを総称するものとする。
略形で表すこととし、またhTNFという語句は天然のhTNF
およびDNA組換え法で得られる天然のhTNFと同じアミノ
酸配列を有するhTNFを総称するものとする。
本発明を例示する発現ベクターpATNF−CFは、前記の
天然型hTNF発現用ベクターpATNFから、第6〜7図記載
の方法で得られた。このプラスミドpATNFはヒト成長ホ
ルモン発現プラスミドpGH−L9および高コピー数プラス
ミドpAT153を出発物質として第5図に示した工程に従っ
て組み立てられた。
天然型hTNF発現用ベクターpATNFから、第6〜7図記載
の方法で得られた。このプラスミドpATNFはヒト成長ホ
ルモン発現プラスミドpGH−L9および高コピー数プラス
ミドpAT153を出発物質として第5図に示した工程に従っ
て組み立てられた。
プラスミドpATNFは、大腸菌内で複製および発現可能
であるが、大腸菌以外の適当な宿主細胞内で複製可能な
他のベクターを出発物質とし、本発明の変異hTNF遺伝子
を発現し得るプラスミドを組み立て得ることは当業者な
らば理解できるであろう。適当な宿主には、原核細胞お
よび下等な真核性微生物が含まれる。勿論適当な発現系
を用いればより高等な真核細胞においても本発明変異hT
NFを発現し得る。他の原核細胞には、グラム陽性または
グラム陰性の微生物、例えば大腸菌やバチルス(Bacill
i)が含まれる。好適な原核性宿主細胞は、実施例に示
した大腸菌K12C600(m-r-)であるが、その他、酵母AH2
2、大腸菌HB101または大腸菌JM101〜109等も適する。一
般に微生物類のベクターは、所望の宿主が認識し得る複
製起源、宿主内で機能し得るプロモーター、並びに抗生
物質耐性のような選択性遺伝子を含有している。
であるが、大腸菌以外の適当な宿主細胞内で複製可能な
他のベクターを出発物質とし、本発明の変異hTNF遺伝子
を発現し得るプラスミドを組み立て得ることは当業者な
らば理解できるであろう。適当な宿主には、原核細胞お
よび下等な真核性微生物が含まれる。勿論適当な発現系
を用いればより高等な真核細胞においても本発明変異hT
NFを発現し得る。他の原核細胞には、グラム陽性または
グラム陰性の微生物、例えば大腸菌やバチルス(Bacill
i)が含まれる。好適な原核性宿主細胞は、実施例に示
した大腸菌K12C600(m-r-)であるが、その他、酵母AH2
2、大腸菌HB101または大腸菌JM101〜109等も適する。一
般に微生物類のベクターは、所望の宿主が認識し得る複
製起源、宿主内で機能し得るプロモーター、並びに抗生
物質耐性のような選択性遺伝子を含有している。
通常、プロモーターは、所望の宿主にとってホモロー
ガスであり、例えば、実施例に示す如く、pBR322由来の
トリプトファンオペロンのプロモーターを用いることが
でき、その他、目的に応じて種々の既知のプロモーター
類が利用可能である。そのようなプロモーターの例とし
て、1ac、tac.λPL等を挙げることができる。
ガスであり、例えば、実施例に示す如く、pBR322由来の
トリプトファンオペロンのプロモーターを用いることが
でき、その他、目的に応じて種々の既知のプロモーター
類が利用可能である。そのようなプロモーターの例とし
て、1ac、tac.λPL等を挙げることができる。
本発明の発現ベクターpATNF−CFの組み立て出発物質
であるプラスミドpATNFには、Ball部位がhTNF遺伝子中
に1箇所、さらにベクター中に1箇所の計2箇所存在し
ている。この内、ベクター自身のBall部位付近にはpAT1
53ベクター由来のテトラサイクリン耐性付与遺伝子の転
写終止シグナルが存在していることが知られており、こ
の領域が除去された発現ベクターでは、Trpプロモータ
ーからの転写が終結せず、その複製や安定性に支障があ
る可能性がある。
であるプラスミドpATNFには、Ball部位がhTNF遺伝子中
に1箇所、さらにベクター中に1箇所の計2箇所存在し
ている。この内、ベクター自身のBall部位付近にはpAT1
53ベクター由来のテトラサイクリン耐性付与遺伝子の転
写終止シグナルが存在していることが知られており、こ
の領域が除去された発現ベクターでは、Trpプロモータ
ーからの転写が終結せず、その複製や安定性に支障があ
る可能性がある。
従って、hTNF−CF遺伝子の作成に当たっては、ベクタ
ー中の該Ball部位を保存するために、第5図に示すよう
に、hTNFの構造遺伝子の一部をクローニングベクターpU
C19またはM13mp19にサブクローニングし、pUC−TNFまた
はM13TNFを作成し、これを出発物質として種々の変異体
を調製した。
ー中の該Ball部位を保存するために、第5図に示すよう
に、hTNFの構造遺伝子の一部をクローニングベクターpU
C19またはM13mp19にサブクローニングし、pUC−TNFまた
はM13TNFを作成し、これを出発物質として種々の変異体
を調製した。
プラスミドpUC19からの、hTNF−CF用発現ベクターpAT
NF−CFの構築は、以下の方法で行われた。
NF−CFの構築は、以下の方法で行われた。
hTNF構造遺伝子のカルボキシ末端に存在するSall切断
部位およびそれより40bp上流に位置するBall部位を利用
してロイシンがフェニルアラニンで置換されたカルボキ
シ末端変異体をコードする式: で示されるDNAフラグメントを化学合成した。このDNAフ
ラグメントを用い、第6図記載の手順に従ってpATNF−C
Fを作成した。第6図の組立て模式図はpATNF−CFの構築
に関するものであるが、上記のDNAフラグメントにおい
てPheと表示されたコドンが他のアミノ酸をコードする
コドンで置き換えられたフラグメントを用い、該模式図
の手順に従って、他のカルボキシ末端変異hTNFの発現ベ
クターを構築することは容易である。このようにして得
られる他のカルボキシ末端変異hTNFもまた本発明の範囲
に包含される。
部位およびそれより40bp上流に位置するBall部位を利用
してロイシンがフェニルアラニンで置換されたカルボキ
シ末端変異体をコードする式: で示されるDNAフラグメントを化学合成した。このDNAフ
ラグメントを用い、第6図記載の手順に従ってpATNF−C
Fを作成した。第6図の組立て模式図はpATNF−CFの構築
に関するものであるが、上記のDNAフラグメントにおい
てPheと表示されたコドンが他のアミノ酸をコードする
コドンで置き換えられたフラグメントを用い、該模式図
の手順に従って、他のカルボキシ末端変異hTNFの発現ベ
クターを構築することは容易である。このようにして得
られる他のカルボキシ末端変異hTNFもまた本発明の範囲
に包含される。
あるいは、M13TNFを用い、部位特異的突然変異誘発に
より、pATNF−CFを構築することもできる。この場合に
は、まず、式: 5"CTCATTAGAAAGCAATAAT3" (上記の式において、下線は変異を入れたPheに対応す
る部分を表す。で示されるプライマーを合成し、該プラ
イマーをアマーシャム社製のキットに適用してM13RFDNA
を作成し、以後は第7図記載の手順に従って目的のhTNF
−CF用発現ベクターを構築する。
より、pATNF−CFを構築することもできる。この場合に
は、まず、式: 5"CTCATTAGAAAGCAATAAT3" (上記の式において、下線は変異を入れたPheに対応す
る部分を表す。で示されるプライマーを合成し、該プラ
イマーをアマーシャム社製のキットに適用してM13RFDNA
を作成し、以後は第7図記載の手順に従って目的のhTNF
−CF用発現ベクターを構築する。
本発明の変異hTNF発現ベクターは大腸菌内で複製可能
であり、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適
当な条件下で培養することにより、所望の変異hTNFを産
生させることができる。形質転換体の培養方法は当業者
周知であり、適当な窒素および炭素供給源、ならびに、
微量元素を含有する培地中で、適当なpHおよび温度下で
培養する。
であり、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適
当な条件下で培養することにより、所望の変異hTNFを産
生させることができる。形質転換体の培養方法は当業者
周知であり、適当な窒素および炭素供給源、ならびに、
微量元素を含有する培地中で、適当なpHおよび温度下で
培養する。
培養された形質変換体からの変異hTNFの分離は、非分
泌型の微生物細胞の場合は音波処理等によって細胞を溶
解し、遠心して上清中に得ることができる。分泌型の細
胞の場合には遠心して細胞を分離するだけでよい。その
ような方法は当業者に周知である。得られた変異hTNFを
精製するには、まず、粗生成物を含有している遠心上清
を、例えば陰イオンクロマトグラフィーにかけて塩基性
タンパク質とDNAを除去して粗精製し、ついで、濃縮し
てゲルろ過することによって高分子量および低分子量の
タンパク質を除去し、さらにヒドロキシアパタイトカラ
ムによる吸着クロマトグラフィーにかけて精製すること
ができる。
泌型の微生物細胞の場合は音波処理等によって細胞を溶
解し、遠心して上清中に得ることができる。分泌型の細
胞の場合には遠心して細胞を分離するだけでよい。その
ような方法は当業者に周知である。得られた変異hTNFを
精製するには、まず、粗生成物を含有している遠心上清
を、例えば陰イオンクロマトグラフィーにかけて塩基性
タンパク質とDNAを除去して粗精製し、ついで、濃縮し
てゲルろ過することによって高分子量および低分子量の
タンパク質を除去し、さらにヒドロキシアパタイトカラ
ムによる吸着クロマトグラフィーにかけて精製すること
ができる。
このようにして得られた変異hTNFはSDS−PAGEおよびN
ative電気泳動で単一のバンドとして確認され、天然
の、または組換え法によって得られた天然型のhTNFのよ
うなコンフォーマーを形成せず、安定であることが明ら
かとなった。また、本発明の精製された変異hTNFのイン
ビトロにおける生物活性を、L−929細胞に対する細胞
毒活性に基づいて評価したところ、天然または組換え体
TNFの約30倍の活性を有していることが分かった。
ative電気泳動で単一のバンドとして確認され、天然
の、または組換え法によって得られた天然型のhTNFのよ
うなコンフォーマーを形成せず、安定であることが明ら
かとなった。また、本発明の精製された変異hTNFのイン
ビトロにおける生物活性を、L−929細胞に対する細胞
毒活性に基づいて評価したところ、天然または組換え体
TNFの約30倍の活性を有していることが分かった。
従って、本発明によれば、高活性のhTNFを容易に得る
ことができ、抗腫瘍治療を目的とする研究の推進を促
し、更には、臨床面での実用化に貢献することができ
る。
ことができ、抗腫瘍治療を目的とする研究の推進を促
し、更には、臨床面での実用化に貢献することができ
る。
以下に製造例および実施例を挙げ、本発明を更に詳し
く説明する。
く説明する。
製造例 hTNF発現ベクターpATNFの組み立ておよびhTNF
の単離 1) プラスミドpATNFの組み立て 既知の天然のhTNFのアミノ酸配列に基き、常法に従っ
て、hTNF遺伝子を含むClaI−SalIフラグメントを化学合
成した。
の単離 1) プラスミドpATNFの組み立て 既知の天然のhTNFのアミノ酸配列に基き、常法に従っ
て、hTNF遺伝子を含むClaI−SalIフラグメントを化学合
成した。
ヒト成長ホルモン発現用ベクター、pGH−L9DNA1μg
を、ClaIおよびSalI制限酵素各3単位(unit)で切断し
た後、常法により、ベクターフラグメントを抽出した。
hTNF遺伝子を含んだClaI−SalIフラグメント(1μg、
約5eq)を、抽出したベクターと混合し、50mM Tris−HC
l、pH8.0、10mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM ATPの存在下、
T4DNAリガーゼ(200単位)を加え、14℃で一夜反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌K12 HB101を形質転換
し、得られた大腸菌の内、アンドピシリン耐性を示すク
ローンから形質転換体HB101/phTNFを選択した。この形
質転換体から、常法に従ってプラスミドphTNFを調製し
た。次いで、プラスミドphTNFをPstIおよびClaI制限酵
素各3単位で切断し、上記の如くにしてtrpプロモータ
ー領域を含むPstI−ClaIフラグメントを調製した。
を、ClaIおよびSalI制限酵素各3単位(unit)で切断し
た後、常法により、ベクターフラグメントを抽出した。
hTNF遺伝子を含んだClaI−SalIフラグメント(1μg、
約5eq)を、抽出したベクターと混合し、50mM Tris−HC
l、pH8.0、10mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM ATPの存在下、
T4DNAリガーゼ(200単位)を加え、14℃で一夜反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌K12 HB101を形質転換
し、得られた大腸菌の内、アンドピシリン耐性を示すク
ローンから形質転換体HB101/phTNFを選択した。この形
質転換体から、常法に従ってプラスミドphTNFを調製し
た。次いで、プラスミドphTNFをPstIおよびClaI制限酵
素各3単位で切断し、上記の如くにしてtrpプロモータ
ー領域を含むPstI−ClaIフラグメントを調製した。
高コピー数プラスミドpAT153(1μg)をPstIおよび
ClaI制限酵素各3単位で切断し、常法に従ってベクター
フラグメントを調製した。このようにして得られた両フ
ラグメントを混合し、上記と同様、14℃で一夜ライゲー
ション反応に付し、得られた反応混合物で大腸菌K12 HB
101を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体か
らプラスミドDNAを調製し、制限酵素分析により、プラ
スミドpATrpを得た。このプラスミドpATrpは、大腸菌ト
リプトファンオペロンのプロモーターを用いており、出
発プラスミドのリボゾーム結合部位(SD配列)と開始コ
ドン(ATG)との距離を改良されたものである。
ClaI制限酵素各3単位で切断し、常法に従ってベクター
フラグメントを調製した。このようにして得られた両フ
ラグメントを混合し、上記と同様、14℃で一夜ライゲー
ション反応に付し、得られた反応混合物で大腸菌K12 HB
101を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体か
らプラスミドDNAを調製し、制限酵素分析により、プラ
スミドpATrpを得た。このプラスミドpATrpは、大腸菌ト
リプトファンオペロンのプロモーターを用いており、出
発プラスミドのリボゾーム結合部位(SD配列)と開始コ
ドン(ATG)との距離を改良されたものである。
このpATrp(1μg)をCalIおよびSalI各3単位で切
断した後、常法通りベクターフラグメントを調製した。
他方、pHTNF(1μg)をClaIおよびSalI制限酵素各3
単位で切断した後、hTNFに相当するフラグメントを調製
し、これを先に調製したベクターフラグメントと一緒に
し、上記同様、14℃で一夜ライゲーション反応に付し
た。得られたライゲーション反応混合物を用いて大腸菌
K12 HB101を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転
換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素分析によっ
て、野生型の合成hTNFを発現する所望のプラスミドpATN
Fを得た(第4図)。
断した後、常法通りベクターフラグメントを調製した。
他方、pHTNF(1μg)をClaIおよびSalI制限酵素各3
単位で切断した後、hTNFに相当するフラグメントを調製
し、これを先に調製したベクターフラグメントと一緒に
し、上記同様、14℃で一夜ライゲーション反応に付し
た。得られたライゲーション反応混合物を用いて大腸菌
K12 HB101を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転
換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素分析によっ
て、野生型の合成hTNFを発現する所望のプラスミドpATN
Fを得た(第4図)。
実施例1 プラスミドpATNF−CFの組み立て 1)hTNF遺伝子の一部のサブクローニング 以下の如くにしてプラスミドpUCTNFおよびM13TNFを作
成し、hTNF遺伝子の一部(PstI−SalI制限フラグメン
ト)をサブクローニングした。
成し、hTNF遺伝子の一部(PstI−SalI制限フラグメン
ト)をサブクローニングした。
製造例1で得たプラスミドphTNF1μgをEcoRIバッフ
ァー中で、各2unitの制限酵素PstIおよびSalIで切断
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、hTNF構造
遺伝子を含む405bp(塩基対)のPstI−SalIフラグメン
トを分離精製した。
ァー中で、各2unitの制限酵素PstIおよびSalIで切断
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、hTNF構造
遺伝子を含む405bp(塩基対)のPstI−SalIフラグメン
トを分離精製した。
このフラグメントを、プラスミドpUC19またはM13mp19
をPstIおよびSalIで切断して得た大きいフラグメント各
20mgと、50mMTris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM AT
P、0.5mM DTT溶液中でT4−DNAリガーゼ300unitと一緒に
16℃で一夜反応させた。各反応混合物を用いて大腸菌
(E.coli)K−12JM109を常法によって形質転換し、得
られた形質転換体からプラスミドpUCTNFDNAまたはM13TN
FDNAを標準的な手法で得た。
をPstIおよびSalIで切断して得た大きいフラグメント各
20mgと、50mMTris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM AT
P、0.5mM DTT溶液中でT4−DNAリガーゼ300unitと一緒に
16℃で一夜反応させた。各反応混合物を用いて大腸菌
(E.coli)K−12JM109を常法によって形質転換し、得
られた形質転換体からプラスミドpUCTNFDNAまたはM13TN
FDNAを標準的な手法で得た。
プラスミドpUCTNFおよびM13TNFの組み立て模式図を第
5図に示す。
5図に示す。
これらを出発物質として以下の2通りの方法でプラス
ミドpATNF−CFを組み立てた。
ミドpATNF−CFを組み立てた。
2)プラスミドpUCTNFを出発物質とする方法 2.1)変異hTNFのカルボキシ末端部分をコードするBalI
−SalIフラグメントの作成hTNF構造遺伝子のカルボキシ
末端のロイシン残基に対応するコドンがフェニルアラニ
ンに対応するコドンで置換されている、変異hTNFのカル
ボキシ末端部分をコードしているオリゴヌクレオチド35
マーおよび39マーを、DNA合成装置(Applied Biosystem
s製、DNASynthesizer)を用いて化学合成した。以下に
その配列を示す。
−SalIフラグメントの作成hTNF構造遺伝子のカルボキシ
末端のロイシン残基に対応するコドンがフェニルアラニ
ンに対応するコドンで置換されている、変異hTNFのカル
ボキシ末端部分をコードしているオリゴヌクレオチド35
マーおよび39マーを、DNA合成装置(Applied Biosystem
s製、DNASynthesizer)を用いて化学合成した。以下に
その配列を示す。
これら各フラグメント200pmolを混合し、最終濃度10m
M Tris−HCl(pH8.0)、7mM MgCl2、1mM ATP、5mM DTT
の溶液50μl中、T4ポリヌクレオチドキナーゼ8unitと
一緒に37℃で1時間インキュベートし、リン酸化反応を
行った。反応液にTE(pH8.0)200μlを加え、フェノー
ル:CHCl3(1:1)混液200μlで2回抽出し、1/10容量の
3M NaOAC(pH5.5)、次いで、2当量のエタノールを加
え、−80℃で30分間放置した。続いて、15,000rpmで5
分間遠心して上澄みを除去し、沈殿を得た。沈殿を乾燥
した後、50mM Tris−HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、100mM
NaCl溶液10μlに溶かし、制限酵素BalIおよびSalI各1
00unitを加え、37℃で1時間反応させた。反応液を上記
同様にフェノール抽出、およびエタノール沈殿に付し、
沈殿をTE(pH8.0)10μlに溶解し、10%ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけ、通常の方法でDNAフラグメ
ントを回収した。
M Tris−HCl(pH8.0)、7mM MgCl2、1mM ATP、5mM DTT
の溶液50μl中、T4ポリヌクレオチドキナーゼ8unitと
一緒に37℃で1時間インキュベートし、リン酸化反応を
行った。反応液にTE(pH8.0)200μlを加え、フェノー
ル:CHCl3(1:1)混液200μlで2回抽出し、1/10容量の
3M NaOAC(pH5.5)、次いで、2当量のエタノールを加
え、−80℃で30分間放置した。続いて、15,000rpmで5
分間遠心して上澄みを除去し、沈殿を得た。沈殿を乾燥
した後、50mM Tris−HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、100mM
NaCl溶液10μlに溶かし、制限酵素BalIおよびSalI各1
00unitを加え、37℃で1時間反応させた。反応液を上記
同様にフェノール抽出、およびエタノール沈殿に付し、
沈殿をTE(pH8.0)10μlに溶解し、10%ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけ、通常の方法でDNAフラグメ
ントを回収した。
2.2)ライゲーションおよびプラスミドpUCTNF−CFの組
み立て 1)で調製したpUCTNFを、BalI−SalIで切断し、BalI
−SalIフラグメントを除いて得られた大きいフラグメン
トと、2)で化学合成したBalI−SalIDNAフラグメント
とを、上記1)と同様の条件下、ライゲーション反応に
付すことによりベクターpUCTNF−CFを組み立てた。実質
上、上記1)記載の方法に従い、ベクターpUCTNF−CFを
StuI−SalIで切断し、hTNF構造遺伝子のStuI−SalIフラ
グメントを得た。
み立て 1)で調製したpUCTNFを、BalI−SalIで切断し、BalI
−SalIフラグメントを除いて得られた大きいフラグメン
トと、2)で化学合成したBalI−SalIDNAフラグメント
とを、上記1)と同様の条件下、ライゲーション反応に
付すことによりベクターpUCTNF−CFを組み立てた。実質
上、上記1)記載の方法に従い、ベクターpUCTNF−CFを
StuI−SalIで切断し、hTNF構造遺伝子のStuI−SalIフラ
グメントを得た。
他方、プラスミドpATNFをStuI−SalI消化に付し、大
きいフラグメントを得、このフラグメントと上記のhTNF
構造遺伝子のStuI−SalIフラグメントとを、既述のライ
ゲーション反応の条件下、T4−DNAライゲースの存在下
で反応させた。このライゲーション反応の反応混合物10
μlを用い、CaCl2法によって大腸菌K12株C600(m-r-)
を常法通り形質転換した。アンピシリン50μg/mlを含ん
だL−プレート(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エ
キス、1%NaCl、1.5%バクトアガー)で37℃において1
5時間培養し、得られた形質転換細胞から常法に従って
プラスミドDNAを抽出した。
きいフラグメントを得、このフラグメントと上記のhTNF
構造遺伝子のStuI−SalIフラグメントとを、既述のライ
ゲーション反応の条件下、T4−DNAライゲースの存在下
で反応させた。このライゲーション反応の反応混合物10
μlを用い、CaCl2法によって大腸菌K12株C600(m-r-)
を常法通り形質転換した。アンピシリン50μg/mlを含ん
だL−プレート(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エ
キス、1%NaCl、1.5%バクトアガー)で37℃において1
5時間培養し、得られた形質転換細胞から常法に従って
プラスミドDNAを抽出した。
プラスミドDNAの制限酵素分析およびClaI部位からSal
I部位までの塩基配列の配列決定によって、目的のプラ
スミドpATNF−CFを得た。プラスミドpATNF−CFの組み立
て模式図を第6図に示す。
I部位までの塩基配列の配列決定によって、目的のプラ
スミドpATNF−CFを得た。プラスミドpATNF−CFの組み立
て模式図を第6図に示す。
3)M13TNFを出発物質とする部位特異的突然変異誘発に
よるプラスミドpATNF−C群の組み立て 部位特異的突然変異誘発(サイト・ダイレクテッド・
ミュータジェネシス)のために以下の合成プライマーを
得、アマシャム製のキットを用い、その指示に従ってM1
3RFDNAを得た。
よるプラスミドpATNF−C群の組み立て 部位特異的突然変異誘発(サイト・ダイレクテッド・
ミュータジェネシス)のために以下の合成プライマーを
得、アマシャム製のキットを用い、その指示に従ってM1
3RFDNAを得た。
5"CTCATTAGAAAGCAATAAT3" (上記の式において、下線は変異を入れたPheに対応す
る部分を表す。このM13RFDNAから、上記2.2)に記載の
方法と同様の手順に従って目的プラスミドpATNF−CFを
得た。プラスミドpATNF−CFの組み立て模式図を第7図
に示す。
る部分を表す。このM13RFDNAから、上記2.2)に記載の
方法と同様の手順に従って目的プラスミドpATNF−CFを
得た。プラスミドpATNF−CFの組み立て模式図を第7図
に示す。
上記の方法と同様にして、カルボキシ末端のロイシン
がそれぞれトリプトファン、チロシン、アラニン、およ
びヒスチジンで置換された変異体をコードしているプラ
スミドpATNF−CW、pATNF−CY、pATNF−CA、pATNF−CH、
pATNF−CKおよびpATNF−CDを組み立てた。形質転換体大
腸菌(E.coli)K12株C600(m-r-)/pATNF−CFは、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている(受託番
号:微工研菌寄第10099号、寄託日:昭和63年6月24
日)。
がそれぞれトリプトファン、チロシン、アラニン、およ
びヒスチジンで置換された変異体をコードしているプラ
スミドpATNF−CW、pATNF−CY、pATNF−CA、pATNF−CH、
pATNF−CKおよびpATNF−CDを組み立てた。形質転換体大
腸菌(E.coli)K12株C600(m-r-)/pATNF−CFは、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている(受託番
号:微工研菌寄第10099号、寄託日:昭和63年6月24
日)。
実施例2 変異hTNFの大量生産、精製およびキャラクタ
リゼーション 1) 培養 プラスミドpATNF−CFを含有する形質転換細胞K12C600
(m-r-)/pATNF−CFを以下の方法で大量培養した。
リゼーション 1) 培養 プラスミドpATNF−CFを含有する形質転換細胞K12C600
(m-r-)/pATNF−CFを以下の方法で大量培養した。
実施例1で得た形質転換体を含んだプレートから得た
極く少量の菌体をLB培地(アンピシリン50μg/ml)5ml
中で6時間培養した後、この培養液を種にして、LB培地
(アンピシリン50μg/ml)100ml中で一夜前培養を行っ
た。続いてM9最小培地(0.6%Na2HPO4、0.3%KH2PO4、
0.05%NaCl、0.1%NH4Cl、0.5%カザミノ酸、2mM MgS
O4、0.2%グルコース、0.1mM CaCl2、アンピシリン50μ
g/ml)15に、上記の種菌75mlを加え、37℃の旋回培養
機で培養した。600nmにおける吸光度を30分毎に測定
し、ODが0.2に達したとき、IAA(インドールアクリル
酸)40μl/mlを加えて24時間培養した。
極く少量の菌体をLB培地(アンピシリン50μg/ml)5ml
中で6時間培養した後、この培養液を種にして、LB培地
(アンピシリン50μg/ml)100ml中で一夜前培養を行っ
た。続いてM9最小培地(0.6%Na2HPO4、0.3%KH2PO4、
0.05%NaCl、0.1%NH4Cl、0.5%カザミノ酸、2mM MgS
O4、0.2%グルコース、0.1mM CaCl2、アンピシリン50μ
g/ml)15に、上記の種菌75mlを加え、37℃の旋回培養
機で培養した。600nmにおける吸光度を30分毎に測定
し、ODが0.2に達したとき、IAA(インドールアクリル
酸)40μl/mlを加えて24時間培養した。
2) 精製 上記1)で得た培養液を6,000rpmで20分間遠心して集
菌し、これに20mM Tris−HClpH(8.0)および30mM NaCl
溶液を加え、懸濁した後、遠心分離して菌体を得た。菌
体の混重量による収量は15gであった。菌体を同液に再
懸濁し、超音波処理によって菌体を完全に破砕した。こ
れを26,000rpmで1時間超遠心して上清25mlを得た。こ
の上清をDEAE−トヨパール650Sを用いた陰イオンクロマ
トグラフィーにかけ、塩基性タンパク質とDNAを除き、
粗精製した。上記のクロマトクラフィーは、20mMTris−
HCl(pH8.0)溶媒中、0mM〜300mMのNaCl勾配を用い、1m
l/minの流速で300分間溶出させることで行なわれた。各
フラクションをSDS−PAGEで分析し、17,000のバンドが
現れる画分を回収した。
菌し、これに20mM Tris−HClpH(8.0)および30mM NaCl
溶液を加え、懸濁した後、遠心分離して菌体を得た。菌
体の混重量による収量は15gであった。菌体を同液に再
懸濁し、超音波処理によって菌体を完全に破砕した。こ
れを26,000rpmで1時間超遠心して上清25mlを得た。こ
の上清をDEAE−トヨパール650Sを用いた陰イオンクロマ
トグラフィーにかけ、塩基性タンパク質とDNAを除き、
粗精製した。上記のクロマトクラフィーは、20mMTris−
HCl(pH8.0)溶媒中、0mM〜300mMのNaCl勾配を用い、1m
l/minの流速で300分間溶出させることで行なわれた。各
フラクションをSDS−PAGEで分析し、17,000のバンドが
現れる画分を回収した。
次いで、試料をYM−10膜(アミコン)を用いて5mlま
で濃縮した後、セファクリル(Sephacryl)S−200スー
パーファイン(Super Fine)を用いたゲル濾過に付し、
低分子量のタンパク質および高分子量のタンパク質を除
いた。溶出液には、20mM Tris−HCl(pH8.0)、100mM N
aClを用い、流速1.0ml/minで行った。その他の測定条件
は、チャートスピード0.02cm/min、OD280フルスケール
2.0である。SDS−PAGEで17,000のバンドの現れるフラク
ションを集めてこれを50mM Tris−HCl(pH8.0)に対し
て一夜透析した後、CM−トヨパール650Sによるイオン交
換クロマトグラフィーにかけた。NaCl 0mM〜500mMを用
い、流速1.0ml/min、300分間で勾配溶出した。その他の
測定条件は、チャートスピード0.02cm/min、洗浄液100m
l、OD680フルスケール2.0である。このようにして得ら
れた試料は、SDS−PAGE、およびNativeGEL電気泳動で単
一のバンドとして確認された。これを水に対して透析し
た後、凍結乾燥し、白色粉末状のカルボキシ末端変異hT
NF7mgを得た。最終生成物のSDS−PAGEおよびNativeGEL
電気泳動の結果を第8図に示す。
で濃縮した後、セファクリル(Sephacryl)S−200スー
パーファイン(Super Fine)を用いたゲル濾過に付し、
低分子量のタンパク質および高分子量のタンパク質を除
いた。溶出液には、20mM Tris−HCl(pH8.0)、100mM N
aClを用い、流速1.0ml/minで行った。その他の測定条件
は、チャートスピード0.02cm/min、OD280フルスケール
2.0である。SDS−PAGEで17,000のバンドの現れるフラク
ションを集めてこれを50mM Tris−HCl(pH8.0)に対し
て一夜透析した後、CM−トヨパール650Sによるイオン交
換クロマトグラフィーにかけた。NaCl 0mM〜500mMを用
い、流速1.0ml/min、300分間で勾配溶出した。その他の
測定条件は、チャートスピード0.02cm/min、洗浄液100m
l、OD680フルスケール2.0である。このようにして得ら
れた試料は、SDS−PAGE、およびNativeGEL電気泳動で単
一のバンドとして確認された。これを水に対して透析し
た後、凍結乾燥し、白色粉末状のカルボキシ末端変異hT
NF7mgを得た。最終生成物のSDS−PAGEおよびNativeGEL
電気泳動の結果を第8図に示す。
3) キャラクタリゼーション 上記のカルボキシ末端変異hTNFをアミノ酸分析に付し
た。結果を表1に示す。
た。結果を表1に示す。
表1の右欄のアミノ酸残基数/タンパク質モル数の値
を、野生型hTNFのそれと比較すると、ロイシンは18から
17に減少し、フェニルアラニンは4から5に増加してい
る。このことは、本願発明のhTNF−CFのカルボキシ末端
には、ロイシンの代わりにフェニルアラニンが存在して
いることを示すものである。
を、野生型hTNFのそれと比較すると、ロイシンは18から
17に減少し、フェニルアラニンは4から5に増加してい
る。このことは、本願発明のhTNF−CFのカルボキシ末端
には、ロイシンの代わりにフェニルアラニンが存在して
いることを示すものである。
本願発明のhTNF−CFのpI(等電点)は等電点電気泳動
(pH域3.5〜9.5、電流50mA、電圧1500V)の結果、6.8で
あった。
(pH域3.5〜9.5、電流50mA、電圧1500V)の結果、6.8で
あった。
本発明の変異hTNFの生物活性を以下の実験例に示す方
法で検討した。
法で検討した。
実験例1 L−929細胞の培養液の上清を除き、5mlの新鮮な培地
(MEM−Eagle、10%FCS)を加え、細胞数が3.0×104個/
100mlになるように1μg/mlのアクチノマイシンを含む
懸濁液を調製した。一方、10〜10-5μg/mlとなるように
PBSで希釈したTNF、およびコントロールとしてのPBS各1
00μlを96穴のプレートに分注し、該プレートを37℃の
CO2インキュベーター内で暖めておいた。このプレート
に上記の細胞懸濁液100μlずつを分注し、該プレート
を再度37℃のCO2インキュベーター内で18時間培養し
た。
(MEM−Eagle、10%FCS)を加え、細胞数が3.0×104個/
100mlになるように1μg/mlのアクチノマイシンを含む
懸濁液を調製した。一方、10〜10-5μg/mlとなるように
PBSで希釈したTNF、およびコントロールとしてのPBS各1
00μlを96穴のプレートに分注し、該プレートを37℃の
CO2インキュベーター内で暖めておいた。このプレート
に上記の細胞懸濁液100μlずつを分注し、該プレート
を再度37℃のCO2インキュベーター内で18時間培養し
た。
プレートから培養上清を除き、PBS約100μlで洗浄し
た後、0.5%クリスタルバイオレット溶液(0.5%クリス
タルバイオレット、25%メタノール)を100μlずつ分
注し、生細胞を室温で1時間染色した。染色後、液を除
き、蒸留水で3回、色素を洗い流した後、100%メタノ
ールを100μずつ分注して色素を抽出した。メタノール
抽出したクリスタルバイオレットの濃度を540nmにおけ
る吸光度として測定した。吸光度は生き残った細胞数に
比例する。コントロールの50%の値に対応する希釈率を
求めて単位U/mlとした。本発明のカルボキシ末端変異hT
NFは30×106U/mgの値を示した。これは、天然のhTNFや
組換え体hTNFの約30倍に相当する。第9図に各希釈倍率
におけるL−929細胞に対する細胞毒性作用の作用曲線
を示した。横軸は希釈率を、縦軸は細胞増殖抑制率を示
す。図から明らかなように、本発明の変異hTNF(▽)
は、白血球の調整培地から単離された天然のhTNF(●)
や野生型の合成遺伝子から得られたhTNF(○)よりも2
〜3桁高い抑制効果を示した。
た後、0.5%クリスタルバイオレット溶液(0.5%クリス
タルバイオレット、25%メタノール)を100μlずつ分
注し、生細胞を室温で1時間染色した。染色後、液を除
き、蒸留水で3回、色素を洗い流した後、100%メタノ
ールを100μずつ分注して色素を抽出した。メタノール
抽出したクリスタルバイオレットの濃度を540nmにおけ
る吸光度として測定した。吸光度は生き残った細胞数に
比例する。コントロールの50%の値に対応する希釈率を
求めて単位U/mlとした。本発明のカルボキシ末端変異hT
NFは30×106U/mgの値を示した。これは、天然のhTNFや
組換え体hTNFの約30倍に相当する。第9図に各希釈倍率
におけるL−929細胞に対する細胞毒性作用の作用曲線
を示した。横軸は希釈率を、縦軸は細胞増殖抑制率を示
す。図から明らかなように、本発明の変異hTNF(▽)
は、白血球の調整培地から単離された天然のhTNF(●)
や野生型の合成遺伝子から得られたhTNF(○)よりも2
〜3桁高い抑制効果を示した。
第1図は天然のhTNFのアミノ酸配列に基づくChouおよび
Fasmanのアルゴリズムによるタンパク質の推定の2次構
造を示す模式図、第2図はhTNFタンパク質のハイドロパ
シーを表す模式図、第3図はhTNF−CFタンパク質の推定
の2次構造を示す模式図、第4図はプラスミドpATNFの
組み立て模式図、第5図はプラスミドpUCTNFおよびM13T
NFの組み立て模式図、第6図はpATNF−CFの組み立て模
式図、第7図は別法によるプラスミドpATNF−CFの組み
立て模式図、第8図は最終生成物hTNF−CFのSDS−PAGE
およびNative−Gel電気泳動の結果を示す模写図、第9
図は変異hTNFのL−929細胞に対する細胞毒性の作用曲
線を示すグラフである。
Fasmanのアルゴリズムによるタンパク質の推定の2次構
造を示す模式図、第2図はhTNFタンパク質のハイドロパ
シーを表す模式図、第3図はhTNF−CFタンパク質の推定
の2次構造を示す模式図、第4図はプラスミドpATNFの
組み立て模式図、第5図はプラスミドpUCTNFおよびM13T
NFの組み立て模式図、第6図はpATNF−CFの組み立て模
式図、第7図は別法によるプラスミドpATNF−CFの組み
立て模式図、第8図は最終生成物hTNF−CFのSDS−PAGE
およびNative−Gel電気泳動の結果を示す模写図、第9
図は変異hTNFのL−929細胞に対する細胞毒性の作用曲
線を示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 1/21 8828−4B 15/09 ZNA //(C12P 21/02 C12R 1:19)
Claims (8)
- 【請求項1】野生型ヒト腫瘍壊死因子のカルボキシ末端
のアミノ酸が疎水性アミノ酸で置換されてなるアミノ酸
配列を有する変異ヒト腫瘍壊死因子。 - 【請求項2】疎水性アミノ酸がフェニルアラニンである
請求項1記載の変異ヒト腫瘍壊死因子。 - 【請求項3】請求項1または2記載の変異ヒト腫瘍壊死
因子をコードしているDNA配列。 - 【請求項4】請求項3記載のDNA配列を含有し、微生物
宿主内で複製及び発現可能な変異ヒト腫瘍壊死因子用発
現ベクター。 - 【請求項5】プラスミドpATNF−CFである請求項4記載
のベクター。 - 【請求項6】請求項4または5のいずれかに記載のベク
ターを含有する形質転換体。 - 【請求項7】大腸菌K12C600(m-r-)/pATNF−CFである
請求項6記載の形質転換体。 - 【請求項8】請求項6または7記載の形質転換体を培養
することからなる変異ヒト腫瘍壊死因子の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63169378A JPH0822239B2 (ja) | 1988-07-07 | 1988-07-07 | 変異ヒト腫傷壊死因子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63169378A JPH0822239B2 (ja) | 1988-07-07 | 1988-07-07 | 変異ヒト腫傷壊死因子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0220296A JPH0220296A (ja) | 1990-01-23 |
JPH0822239B2 true JPH0822239B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=15885485
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63169378A Expired - Lifetime JPH0822239B2 (ja) | 1988-07-07 | 1988-07-07 | 変異ヒト腫傷壊死因子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0822239B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR970005042B1 (ko) * | 1993-02-09 | 1997-04-11 | 한일합성섬유공업 주식회사 | 종양괴사인자-알파 뮤테인 |
KR20030013181A (ko) | 2001-08-07 | 2003-02-14 | 삼성전자주식회사 | 취반기능을 갖는 전자렌지 및 그 제어방법 |
JP2019518713A (ja) * | 2016-03-16 | 2019-07-04 | メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド | 癌療法のための改変trail |
-
1988
- 1988-07-07 JP JP63169378A patent/JPH0822239B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0220296A (ja) | 1990-01-23 |
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