JPH04108379A - 新規スーパーオキサイドディスムターゼ - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔従来の技術〕
SODは生体に有害なスーパーオキサイド(活性酸素分
子)を分解消去する酵素であり、全ての臓器、細胞内画
分(細胞質及びミトコンドリア)に存在する。しかし、
細胞膜及び組繊細胞外空間ではこのような防御機構は極
めて不十分であり、そのためこれらの局所で、時として
生体に極めて危険な酸化的病態が発生する。従来より、
これらの酸化的組織損傷病態を改善する目的でSODの
静脈内投与や局所投与が試みられてきているが、何れも
その生体内不安定性や短い半減期(数分)の故に、その
防御作用を十分発現しうるには至っていない。
子)を分解消去する酵素であり、全ての臓器、細胞内画
分(細胞質及びミトコンドリア)に存在する。しかし、
細胞膜及び組繊細胞外空間ではこのような防御機構は極
めて不十分であり、そのためこれらの局所で、時として
生体に極めて危険な酸化的病態が発生する。従来より、
これらの酸化的組織損傷病態を改善する目的でSODの
静脈内投与や局所投与が試みられてきているが、何れも
その生体内不安定性や短い半減期(数分)の故に、その
防御作用を十分発現しうるには至っていない。
最近、SODも血中半減期を延長させるためにSODの
様々な化学修飾が行われている。例えば、ポリエチレン
グリコール(特開昭61−249388 )、高分子デ
キストラン(W、F、Petrone et al、、
Proc。
様々な化学修飾が行われている。例えば、ポリエチレン
グリコール(特開昭61−249388 )、高分子デ
キストラン(W、F、Petrone et al、、
Proc。
Natl、Acad、Aci、USA、 77、115
9 (1980)) 、イヌリン(特開昭58−328
26)などによるSODの修飾が行われている。しかし
、これらの修飾SODは下記に示すように様々な欠点を
有し、問題点を十分解決するには至っていない。
9 (1980)) 、イヌリン(特開昭58−328
26)などによるSODの修飾が行われている。しかし
、これらの修飾SODは下記に示すように様々な欠点を
有し、問題点を十分解決するには至っていない。
また、血中のアルブミンを主体とする血清蛋白質と複合
体を作らせる目的でスチレンマレイン酸ブチルエステル
誘導体(SMA)を酵素のりジン残基に酸アミド結合に
より結合させたSOD誘導体(SMA−SOD)も考案
されている(井上正康ら、蛋白質核酸酵素、33,28
89 、(1988) )。しかしながら二のような非
天然の化学修飾したSODを血中に投与することは、予
期せぬ副作用をもたらす恐れがある。
体を作らせる目的でスチレンマレイン酸ブチルエステル
誘導体(SMA)を酵素のりジン残基に酸アミド結合に
より結合させたSOD誘導体(SMA−SOD)も考案
されている(井上正康ら、蛋白質核酸酵素、33,28
89 、(1988) )。しかしながら二のような非
天然の化学修飾したSODを血中に投与することは、予
期せぬ副作用をもたらす恐れがある。
〔発明が解決しようとする課題]
前述のように、有害なスーパーオキサイドラジカルの除
去にSODは有効であるが、投与俊速やかに***されて
しまうので薬効はあまり期待できない。
去にSODは有効であるが、投与俊速やかに***されて
しまうので薬効はあまり期待できない。
一方、様々な化学修飾法による修飾SODは、血中では
安定ではあるが、酸化的組織障害の起こる組織や細胞に
特異的に指向できないので、スーパーオキサイドを有効
に除去できない。さらに、修飾SODは生体には全くあ
るいは僅かにしか存在しない修飾試薬により修飾されて
いるので、修飾SODの投与により、副作用の生じる可
能性がある。また、これらの修飾SODを得るためには
、SODを精製してから化学修飾し、さらに精製すると
いう複雑な操作が必要であった。
安定ではあるが、酸化的組織障害の起こる組織や細胞に
特異的に指向できないので、スーパーオキサイドを有効
に除去できない。さらに、修飾SODは生体には全くあ
るいは僅かにしか存在しない修飾試薬により修飾されて
いるので、修飾SODの投与により、副作用の生じる可
能性がある。また、これらの修飾SODを得るためには
、SODを精製してから化学修飾し、さらに精製すると
いう複雑な操作が必要であった。
本発明者らはこれらを解決するため、以前に、ヘパリン
結合性部位を本来有しないスーパーオキサイドディスム
ターゼにヘパリン結合部位が付加された新規なスーパー
オキサイドディスムターゼを開発した(特願平1−52
141号)。これは生体内に存在する物質からなり、副
作用の可能性が極めて少なく、しかも微量で損傷の起こ
っている組織を特異的に保護することができる。しかし
ながら、プロテアーゼに対してより高い耐性を有し、持
続性を有するスーパーオキサイドディスムターゼが望ま
れている。
結合性部位を本来有しないスーパーオキサイドディスム
ターゼにヘパリン結合部位が付加された新規なスーパー
オキサイドディスムターゼを開発した(特願平1−52
141号)。これは生体内に存在する物質からなり、副
作用の可能性が極めて少なく、しかも微量で損傷の起こ
っている組織を特異的に保護することができる。しかし
ながら、プロテアーゼに対してより高い耐性を有し、持
続性を有するスーパーオキサイドディスムターゼが望ま
れている。
従って、本発明はプロテアーゼ抵抗能を持つヘパリン結
合性部位が付加された新規なスーパーオキサイドディス
ムターゼを提供する。
合性部位が付加された新規なスーパーオキサイドディス
ムターゼを提供する。
[課題を解決するための手段]
生体内に多く存在するヘパリン結合性ペプチドの共通点
は塩基性アミノ酸のクラスターを持つことである(E、
Rauvala、 EMBOJ、旦、 2933−29
41.1989;及びS、5oeda ら、Bioch
em、 Biophys、Acta、 99929−3
5.1989)。しかしながら、プロテアーゼのなかに
は例えばトリプシンのようにポリペプチド鎖中のアルギ
ニン、リジン残基のカルボキシル基側を特異的に切断す
るものが多く存在する。しかし、塩基性アミノ酸残基の
隣がプロリンである時、そのペプチドはプロテアーゼに
よる消化を受けにくい。
は塩基性アミノ酸のクラスターを持つことである(E、
Rauvala、 EMBOJ、旦、 2933−29
41.1989;及びS、5oeda ら、Bioch
em、 Biophys、Acta、 99929−3
5.1989)。しかしながら、プロテアーゼのなかに
は例えばトリプシンのようにポリペプチド鎖中のアルギ
ニン、リジン残基のカルボキシル基側を特異的に切断す
るものが多く存在する。しかし、塩基性アミノ酸残基の
隣がプロリンである時、そのペプチドはプロテアーゼに
よる消化を受けにくい。
そこで、ヘパリン結合能を持ち、がっ、プロテアーゼ抵
抗能を持つペプチドとして、次の一般式:%式%) (式中、Xは任意のアミノ酸であり、Yは相互に独立に
アルギニン又はリジンであり、Proはプロリンであり
、そしてnは1〜10の整数である)で表わされるペプ
チドを使用する。nは好ましくは5以下であり、例えば
2又は3である。
抗能を持つペプチドとして、次の一般式:%式%) (式中、Xは任意のアミノ酸であり、Yは相互に独立に
アルギニン又はリジンであり、Proはプロリンであり
、そしてnは1〜10の整数である)で表わされるペプ
チドを使用する。nは好ましくは5以下であり、例えば
2又は3である。
本発明においては任意のスーパーオキサイドディスムタ
ーゼを使用することができ、動物(例えばヒト、ウシ)
、植物、微生物等の生物体中に存在するいずれのSOD
も使用できる。
ーゼを使用することができ、動物(例えばヒト、ウシ)
、植物、微生物等の生物体中に存在するいずれのSOD
も使用できる。
SODとヘパリン結合性ペプチドの結合様式としては、
ペプチドのN−末端アミノ酸のアミン基とSODのC−
末端のカルボキシル基をアミド結合により結合せしめる
方法、ペプチドのC−末端アミノ酸のカルボキシル基と
SODのN−末端アミノ酸のアミノ基とをペプチド結合
により結合させる方法等がある。この様な結合様式にお
いては、SOD分子とヘパリン結合性ペプチドとが一本
のポリペプチドを構成しているため、これをコードする
遺伝子を用いて製造することができる。
ペプチドのN−末端アミノ酸のアミン基とSODのC−
末端のカルボキシル基をアミド結合により結合せしめる
方法、ペプチドのC−末端アミノ酸のカルボキシル基と
SODのN−末端アミノ酸のアミノ基とをペプチド結合
により結合させる方法等がある。この様な結合様式にお
いては、SOD分子とヘパリン結合性ペプチドとが一本
のポリペプチドを構成しているため、これをコードする
遺伝子を用いて製造することができる。
本発明のヘパリン結合性ペプチドはプロテアーゼ耐性で
あるため、このペプチドを有するSODを容易に収率よ
く精製することができる。また、このSODは予想通り
SOD活性を有し、且っヘパリン結合性を有する。この
ことは、実施例3において本発明のペプチドがヘパリン
セファロースカラムにより吸着されることからも明らか
である。
あるため、このペプチドを有するSODを容易に収率よ
く精製することができる。また、このSODは予想通り
SOD活性を有し、且っヘパリン結合性を有する。この
ことは、実施例3において本発明のペプチドがヘパリン
セファロースカラムにより吸着されることからも明らか
である。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
。この実施例においては、ヘパリン結合性ペプチドの一
例として: A la −Arg −Pro −Arg −Arg
−Pro −Arg −Arg −Pr。
。この実施例においては、ヘパリン結合性ペプチドの一
例として: A la −Arg −Pro −Arg −Arg
−Pro −Arg −Arg −Pr。
を用い、SODとしてヒト赤血球型SODを用いる。そ
して前記ペプチFがこのSODに結合したヘパリン結合
性SODをr )IB−500−4Jと称する。
して前記ペプチFがこのSODに結合したヘパリン結合
性SODをr )IB−500−4Jと称する。
[実施例]
遺」1倚口よ )IB−500−4i 云 の構築プ
ロテアーゼ抵抗能を持つヘパリン結合性ペプチドとして
、Arg−Arg −Proの繰り返し配列を持つペプ
チドをコードする塩基配列を合成した。すなわち、 A343:5 GATCGCCCGTCCTCGTCG
CCCACGTCGACCATGAG3’ A344:5”TCGACTCATGGTCGACGT
GGGCGACGAGGACGGGC3” を合成した。池原らの方法(M、Ikehara et
al、Proc。
ロテアーゼ抵抗能を持つヘパリン結合性ペプチドとして
、Arg−Arg −Proの繰り返し配列を持つペプ
チドをコードする塩基配列を合成した。すなわち、 A343:5 GATCGCCCGTCCTCGTCG
CCCACGTCGACCATGAG3’ A344:5”TCGACTCATGGTCGACGT
GGGCGACGAGGACGGGC3” を合成した。池原らの方法(M、Ikehara et
al、Proc。
Natl、八cad、Sci、、 USA、 81.5
956.1984)に従い、これら4種の合成りNAを
リン酸化した後、アニーリングし、pBRsODl (
特願平1−52141参照)(なおこのプラスミドの構
築方法は本明細書の参考例に記載する)のBamHrと
5alIで消化した約4.5 kbのDNA断片とライ
ゲーションし、得られたプラスミド−をρBRHBSO
D4 とした。ρBR)IBSOD4 は、S。
956.1984)に従い、これら4種の合成りNAを
リン酸化した後、アニーリングし、pBRsODl (
特願平1−52141参照)(なおこのプラスミドの構
築方法は本明細書の参考例に記載する)のBamHrと
5alIで消化した約4.5 kbのDNA断片とライ
ゲーションし、得られたプラスミド−をρBRHBSO
D4 とした。ρBR)IBSOD4 は、S。
Dとヘパリン結合性ペプチドの結合した遺伝子がEco
RIと5altで切り出される構造になっている(第1
図)。
RIと5altで切り出される構造になっている(第1
図)。
pBRHBsOD4のHB−SOD−4をコードする部
分の塩基配列およびそれのコードするアミノ酸配列を第
2図に示した。
分の塩基配列およびそれのコードするアミノ酸配列を第
2図に示した。
以上のようにして、プロテアーゼ抵抗能を持つヘパリン
結合性ペプチドを有するHB−5OD−4の遺伝子を構
築した。
結合性ペプチドを有するHB−5OD−4の遺伝子を構
築した。
実施l HB−SOD−4の での実施例1で構築
したHB−SOD−4遺伝子を酵母の発現プラスミドに
連結した。酵母の発現プラスミドとして、pYI(CC
IOI C特開平1−37291参照。なお、pYHc
clolで形質転換された酵母がと胚加用1匹照cer
evisiae SAMO750と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に昭和62年(1987) 7
月16日付けで微工研菌寄第9475号(FERM P
−9475) として、更に平成2年(1990) 2
月23日付けで国際寄託に移管され微工研条寄第276
7号(FERM BP−2767)として寄託されてい
る)を用いた。
したHB−SOD−4遺伝子を酵母の発現プラスミドに
連結した。酵母の発現プラスミドとして、pYI(CC
IOI C特開平1−37291参照。なお、pYHc
clolで形質転換された酵母がと胚加用1匹照cer
evisiae SAMO750と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に昭和62年(1987) 7
月16日付けで微工研菌寄第9475号(FERM P
−9475) として、更に平成2年(1990) 2
月23日付けで国際寄託に移管され微工研条寄第276
7号(FERM BP−2767)として寄託されてい
る)を用いた。
pBRHBsOD4をEcoRIと5altで消化して
得られる約480bpのDNA断片をpYI(CCIO
IをEcoRIと5alIで消化して得られる約8kb
のDNA断片とライゲーションし、得られたプラスミド
をpYsO6000とした。このプラスミドを大腸菌D
HIを用いて、増幅し、酵母G−1315株(Mat
a、 trpl)01.Yoshizumiet al
、、 J、Jpn、Soc、5tarch Sci、3
4.148 (1987))を形質転換した。なお、こ
の場合の酵母株としては(trp 1 )株であればい
ずれも使用することができる。形質転換の方法は、伊藤
らの方法によった(Ito et al、、 J、Ba
cteriol、153.163 (1983))。
得られる約480bpのDNA断片をpYI(CCIO
IをEcoRIと5alIで消化して得られる約8kb
のDNA断片とライゲーションし、得られたプラスミド
をpYsO6000とした。このプラスミドを大腸菌D
HIを用いて、増幅し、酵母G−1315株(Mat
a、 trpl)01.Yoshizumiet al
、、 J、Jpn、Soc、5tarch Sci、3
4.148 (1987))を形質転換した。なお、こ
の場合の酵母株としては(trp 1 )株であればい
ずれも使用することができる。形質転換の方法は、伊藤
らの方法によった(Ito et al、、 J、Ba
cteriol、153.163 (1983))。
トリプトファンの合成能の回復した形質転換株を得た。
以下、この形質転換株をG−1315(pYsO600
0)とする(第3図)。
0)とする(第3図)。
以上に述べた酵母ベクターはHB−5on−4生産のた
めの一例であり、酵母のプロモーターとしてホスホグリ
セロキナーゼまたは抑制型酸性ホスファターゼなどの遺
伝子のプロモーターを使用することもできる。
めの一例であり、酵母のプロモーターとしてホスホグリ
セロキナーゼまたは抑制型酸性ホスファターゼなどの遺
伝子のプロモーターを使用することもできる。
得られた形質転換体G−1315(pYs06000)
及びG−1315を2dのハークホルダー培地(P、R
,Burkholder。
及びG−1315を2dのハークホルダー培地(P、R
,Burkholder。
八m、J、Bot、、 30.206. (1943)
)にて、30℃で2晩振とう培養した。1.5dを集菌
後、ヤッフェらの方法(M、P、Yaffe et a
l、Proc、Natl、Acad、Sci、IJSA
、。
)にて、30℃で2晩振とう培養した。1.5dを集菌
後、ヤッフェらの方法(M、P、Yaffe et a
l、Proc、Natl、Acad、Sci、IJSA
、。
81、4819 (1984))で酵母菌体から蛋白質
を得て、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。
を得て、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。
電気泳動後、コマジ−ブリリアントブルーR250によ
る蛋白染色〔方法はたとえば、今堀ら、続生化学実験講
座タンパク質の化学、東京化学同人(1987) )を
行った結果、どの形質転換株にもプラスミドをもたない
G4315にはない明瞭な蛋白質のバンドがみられ、こ
のバンドは菌体蛋白質の約5%に相当する。この分子量
は約19.000テ、HB−5OD−4(D予想される
分子量とほぼ一致した。また、ウェスタンプロティング
を行い、抗SOD抗体を用いて、酵素抗体法〔例えば、
今堀ら、続生化学実験講座タンパク賞の化学、東京化学
同人(1987) )によりその抗体と反応するものを
検出したところ、1本のバンドが見られ、これは蛋白染
色のHB−SOD−4と考えられるハンドの位置と一致
したので、HB−5OD−4が組換え酵母で生産されて
いるとした。
る蛋白染色〔方法はたとえば、今堀ら、続生化学実験講
座タンパク質の化学、東京化学同人(1987) )を
行った結果、どの形質転換株にもプラスミドをもたない
G4315にはない明瞭な蛋白質のバンドがみられ、こ
のバンドは菌体蛋白質の約5%に相当する。この分子量
は約19.000テ、HB−5OD−4(D予想される
分子量とほぼ一致した。また、ウェスタンプロティング
を行い、抗SOD抗体を用いて、酵素抗体法〔例えば、
今堀ら、続生化学実験講座タンパク賞の化学、東京化学
同人(1987) )によりその抗体と反応するものを
検出したところ、1本のバンドが見られ、これは蛋白染
色のHB−SOD−4と考えられるハンドの位置と一致
したので、HB−5OD−4が組換え酵母で生産されて
いるとした。
裏施拠l 川づ並」■精製
スラント上のG−1315(ρYSO6000)を1白
金耳、5威のパークホルダー培地に植菌し、30°Cで
40時間振とう培養した。これを1リツトルのエルレン
マイヤーフラスコにいれた400dのハークホルダー培
地に植菌し、同様に培養した。次にこの培養液を30リ
ツトルの0.1mMの硫酸銅と0.1mMの硫酸亜鉛を
含むパークホルダー培地でジャーファーメンタ−にて4
4時間培養した。遠心分離により集菌し、約1.3kg
の菌体を得た。
金耳、5威のパークホルダー培地に植菌し、30°Cで
40時間振とう培養した。これを1リツトルのエルレン
マイヤーフラスコにいれた400dのハークホルダー培
地に植菌し、同様に培養した。次にこの培養液を30リ
ツトルの0.1mMの硫酸銅と0.1mMの硫酸亜鉛を
含むパークホルダー培地でジャーファーメンタ−にて4
4時間培養した。遠心分離により集菌し、約1.3kg
の菌体を得た。
菌体をl■H硫酸銅、1mM硫酸亜鉛、10mMβメル
カプトエタノール、1n+M(バラ−アミジフェニル)
メタンスルホニルフルオライド塩酸塩(APMSF)
ヲ含む20mMTris−HCI緩衝液pH8,8,2
リツトルに懸濁し、ダイノミルにて菌体を破砕した。破
砕菌体を遠心分離し、遠心上清を70度で10分間熱処
理を行った後、遠心分離し、その上清を回収した。この
画分に50%硫酸アンモニウムを加えてよく溶解した後
遠心分離し、その上清を50%硫酸アンモニウムを含む
20mM燐酸カリウム緩衝液pH7,0で平衡化したプ
チルトーヨーパール650()−ソー社)カラム(5X
20cm)に吸着させた。50%硫酸アンモニウムを含
む20mM燐酸カリウム緩衝液(pH7,0)、500
!Idlでカラムを洗浄した後、30%硫酸アンモニウ
ムを含む20mM燐酸カリウム緩衝液で溶出し、SOD
活性画分(活性測定は、チトクロームC法(J、M、M
cCord et al、J、Biol、 Chew、
、 244.6049(1969))ニよった)を集め
た。この画分を5ephadexG25(ファルマシア
社)カラム(15X90cm)で脱塩した後、10+w
M Tris−HCI(pH8,5) 、30mM N
aC1と同じ電気伝導度にNaC1を加えて合わせた。
カプトエタノール、1n+M(バラ−アミジフェニル)
メタンスルホニルフルオライド塩酸塩(APMSF)
ヲ含む20mMTris−HCI緩衝液pH8,8,2
リツトルに懸濁し、ダイノミルにて菌体を破砕した。破
砕菌体を遠心分離し、遠心上清を70度で10分間熱処
理を行った後、遠心分離し、その上清を回収した。この
画分に50%硫酸アンモニウムを加えてよく溶解した後
遠心分離し、その上清を50%硫酸アンモニウムを含む
20mM燐酸カリウム緩衝液pH7,0で平衡化したプ
チルトーヨーパール650()−ソー社)カラム(5X
20cm)に吸着させた。50%硫酸アンモニウムを含
む20mM燐酸カリウム緩衝液(pH7,0)、500
!Idlでカラムを洗浄した後、30%硫酸アンモニウ
ムを含む20mM燐酸カリウム緩衝液で溶出し、SOD
活性画分(活性測定は、チトクロームC法(J、M、M
cCord et al、J、Biol、 Chew、
、 244.6049(1969))ニよった)を集め
た。この画分を5ephadexG25(ファルマシア
社)カラム(15X90cm)で脱塩した後、10+w
M Tris−HCI(pH8,5) 、30mM N
aC1と同じ電気伝導度にNaC1を加えて合わせた。
これを10mM Tris−HCI(pH8,5) 、
30mM NaC1で平衡化したDEAEセファロース
CL6B (ファルマシア社)を充填したカラム(5X
10C111)にかけて非吸着画分を回収した。この画
分をIMの燐酸カリウム緩衝液(pH7,0)を適当量
加えてpHを7゜0に下げた後、10mM燐酸カリウム
緩衝液(pH7,0)で平衡化したSPセファロースC
−25(ファルマシア社) を充lしたカラム(5X1
0c1++)にかけて非吸着画分を回収した。これを1
On+M燐酸カリウム緩衝液(pF17.0)で平衡化
したヘパリンセファロースCL6B (ファルマシア社
)を充填したカラム(5X10C11)に吸着させた。
30mM NaC1で平衡化したDEAEセファロース
CL6B (ファルマシア社)を充填したカラム(5X
10C111)にかけて非吸着画分を回収した。この画
分をIMの燐酸カリウム緩衝液(pH7,0)を適当量
加えてpHを7゜0に下げた後、10mM燐酸カリウム
緩衝液(pH7,0)で平衡化したSPセファロースC
−25(ファルマシア社) を充lしたカラム(5X1
0c1++)にかけて非吸着画分を回収した。これを1
On+M燐酸カリウム緩衝液(pF17.0)で平衡化
したヘパリンセファロースCL6B (ファルマシア社
)を充填したカラム(5X10C11)に吸着させた。
50mMNaC1,10mM燐酸カリウム緩衝液(pH
7、0)50(ldで洗浄した後500*M NaC1
,10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7,0)で溶出し
た。活性画分を回収し、90%硫安で塩析して沈澱した
蛋白を少量の水に溶かし、生理食塩水に透析した。この
活性画分を前述のようにSDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動し、蛋白染色したところ、単一なバンドが観察
されたので、以上の精製により純粋なHB−500−4
を得たとした。なお、1(B−5OD−477)精製は
4℃で行った。
7、0)50(ldで洗浄した後500*M NaC1
,10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7,0)で溶出し
た。活性画分を回収し、90%硫安で塩析して沈澱した
蛋白を少量の水に溶かし、生理食塩水に透析した。この
活性画分を前述のようにSDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動し、蛋白染色したところ、単一なバンドが観察
されたので、以上の精製により純粋なHB−500−4
を得たとした。なお、1(B−5OD−477)精製は
4℃で行った。
11■玉 …」並」■止血I
HB−5OD−4のプロテアーゼ抵抗性を調べた。G−
1315(pYsO6000) 、 G−1315(p
YHBs2) (pYHBS2は、ヘパリン結合性部位
を本来有しないスーパーオキサイドディムターゼにヘパ
リン結合部位が付加された新規なスーパーオキサイドデ
ィスムターゼをコードする遺伝子を含有するプラスミド
である。特願平1−52141号参照]、及びG−13
15(pYsO200)(pYs0200はpYHBS
2の)1B−5OD−2遺伝子の代わりにヘパリン結合
性部位を有しないヒトのスーパーオキサイドディスミュ
ターゼ遺伝子の入ったプラスミドである〕を1白金耳、
10mのパークホルダー培地に植菌し、30°Cで40
時間振とう培養した。そのうちの1.5 dは集菌後、
ヤッフエらの方法(M。
1315(pYsO6000) 、 G−1315(p
YHBs2) (pYHBS2は、ヘパリン結合性部位
を本来有しないスーパーオキサイドディムターゼにヘパ
リン結合部位が付加された新規なスーパーオキサイドデ
ィスムターゼをコードする遺伝子を含有するプラスミド
である。特願平1−52141号参照]、及びG−13
15(pYsO200)(pYs0200はpYHBS
2の)1B−5OD−2遺伝子の代わりにヘパリン結合
性部位を有しないヒトのスーパーオキサイドディスミュ
ターゼ遺伝子の入ったプラスミドである〕を1白金耳、
10mのパークホルダー培地に植菌し、30°Cで40
時間振とう培養した。そのうちの1.5 dは集菌後、
ヤッフエらの方法(M。
P、Burkholder、 Am、J、Bot、、
30.206. (1943))で酵母菌体からタンパ
ク質を得た。残りの8.5 dは集菌後、菌体にI M
NaC1を0.5 d加えて懸濁しさらに、クロロホ
ルムを0.5 IM1加えて室温で1晩振とうした。そ
して遠心を行い、上清を回収した。
30.206. (1943))で酵母菌体からタンパ
ク質を得た。残りの8.5 dは集菌後、菌体にI M
NaC1を0.5 d加えて懸濁しさらに、クロロホ
ルムを0.5 IM1加えて室温で1晩振とうした。そ
して遠心を行い、上清を回収した。
これらの蛋白をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行った。その結果を第4図に示した。ヤッフエらの方
法で調製した場合、細胞内のプロテアーゼは作用しない
ので、三種類のどのSODも分解せず低分子化していな
いが、クロロホルム抽出を行うと酵母のプロテアーゼが
作用するため、プロテアーゼの消化を受は易いHB−S
OD−2は分解して低分子化した蛋白がみられる。しが
し、SODや1(B−5OD−4では、低分子化した蛋
白はみられず、HB−5OD−4がHB−5OD−2に
比べてプロテアーゼに対して抵抗性であると考えられる
。
を行った。その結果を第4図に示した。ヤッフエらの方
法で調製した場合、細胞内のプロテアーゼは作用しない
ので、三種類のどのSODも分解せず低分子化していな
いが、クロロホルム抽出を行うと酵母のプロテアーゼが
作用するため、プロテアーゼの消化を受は易いHB−S
OD−2は分解して低分子化した蛋白がみられる。しが
し、SODや1(B−5OD−4では、低分子化した蛋
白はみられず、HB−5OD−4がHB−5OD−2に
比べてプロテアーゼに対して抵抗性であると考えられる
。
次に、精製したHB−SOD−4のアミノ酸分析を行っ
た。結果を次の第1表に示す。分析値はDNAの塩基配
列から予想される値とよい一致を示した。
た。結果を次の第1表に示す。分析値はDNAの塩基配
列から予想される値とよい一致を示した。
また、HB−5OD−4の吸収スペクトルは組み換えヒ
)SODと一致したので、銅及び亜鉛を含む活性のある
蛋白であると考えられる。
)SODと一致したので、銅及び亜鉛を含む活性のある
蛋白であると考えられる。
第1表
アミノ酸分析
ヒト胎盤から、グアニジウムチオシアネートを用いて常
法に従い、全RNAを得た。第17ゴdTセルロースカ
ラムクロマトグラフイーを用いて全RNAからポリアデ
ニル化RNAをmRNA画分として分取した。このRN
A画分を用いて、ガブラーらの方法(Gubler、
U、et al、、 Gene+ 25+ 263(1
983)に従い作製されたcDNA合成キ・ント(アマ
ジャム社)を用いて2本1j D N Aを作製した。
法に従い、全RNAを得た。第17ゴdTセルロースカ
ラムクロマトグラフイーを用いて全RNAからポリアデ
ニル化RNAをmRNA画分として分取した。このRN
A画分を用いて、ガブラーらの方法(Gubler、
U、et al、、 Gene+ 25+ 263(1
983)に従い作製されたcDNA合成キ・ント(アマ
ジャム社)を用いて2本1j D N Aを作製した。
この2本鎖DNAにターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ(ファルマシア社)によりデオキシ
CTPホモポリマーを付加した。これと、pBR322
のPst、1部位にデオキシGTPのホモポリマーを付
加したベクター(ファルマシア社)とをアニーリングし
て、大腸菌081を形質転換し、約40万クローンのc
DNAライブラリーを作製した。
トランスフェラーゼ(ファルマシア社)によりデオキシ
CTPホモポリマーを付加した。これと、pBR322
のPst、1部位にデオキシGTPのホモポリマーを付
加したベクター(ファルマシア社)とをアニーリングし
て、大腸菌081を形質転換し、約40万クローンのc
DNAライブラリーを作製した。
(2)彫I膚J■1欠1択
始めにヒト5ODcDNA検出用のプローブとして下記
の配列をもつDNA A039を合成した。その配列は
5’ GAAAGTACAAAGACAGGAAACG
CTGGAAGTCGTTTGGCTTG3’である。
の配列をもつDNA A039を合成した。その配列は
5’ GAAAGTACAAAGACAGGAAACG
CTGGAAGTCGTTTGGCTTG3’である。
この配列は既に知られているヒトsoDのcDNAの塩
基配列[Sherman ey al、、 Proc、
Natl。
基配列[Sherman ey al、、 Proc、
Natl。
Acad、Sci、USA、 80.5465 (19
83) )に含まれる配列である。合成はアプライドバ
イオシステムズ社の381A DNA合成装置を用いて
行った。このプローブ゛を(T〜32P)八TP(アマ
ジャム社)とT4−ポリヌクレオチジルキナーゼを用い
て標識し、SOD遺伝子の検出用プローブとして用いた
。コロニハイプリダイゼーションの手法により、このプ
ローブとハイブリダイズする大腸菌形質転換体を上記c
DNAライブラリーから得た。この形質転換体を通常の
方法で培養して増殖させ、菌体よりプラスミドDNAを
抽出した。このプラスミドはPstIで切り出されるヒ
ト由来の600bpのcDNAを含んでいた。このプラ
スミドをpsOloとした。この挿入部分の塩基配列を
M13ファージを鋳型とするジデオキシ法〔たとえば、
高温ら、続生化学実験講座、遺伝子研究法■ 東京化学
同人(1986) )により決定した。決定した塩基配
列は前述の既に報告された塩基配列と一致したが、アミ
ノ末端の3アミノ酸残基をコードする遺伝子が欠失して
いた。
83) )に含まれる配列である。合成はアプライドバ
イオシステムズ社の381A DNA合成装置を用いて
行った。このプローブ゛を(T〜32P)八TP(アマ
ジャム社)とT4−ポリヌクレオチジルキナーゼを用い
て標識し、SOD遺伝子の検出用プローブとして用いた
。コロニハイプリダイゼーションの手法により、このプ
ローブとハイブリダイズする大腸菌形質転換体を上記c
DNAライブラリーから得た。この形質転換体を通常の
方法で培養して増殖させ、菌体よりプラスミドDNAを
抽出した。このプラスミドはPstIで切り出されるヒ
ト由来の600bpのcDNAを含んでいた。このプラ
スミドをpsOloとした。この挿入部分の塩基配列を
M13ファージを鋳型とするジデオキシ法〔たとえば、
高温ら、続生化学実験講座、遺伝子研究法■ 東京化学
同人(1986) )により決定した。決定した塩基配
列は前述の既に報告された塩基配列と一致したが、アミ
ノ末端の3アミノ酸残基をコードする遺伝子が欠失して
いた。
(3) HB−5OD’云の
欠失しているアミノ末端の遺伝子と開始コドン、及び発
現へシラーへのつなぎ込みのためのEcoR1部位の作
製のため、以下の実験を行った。
現へシラーへのつなぎ込みのためのEcoR1部位の作
製のため、以下の実験を行った。
合成りNA AO71、すなわち5”GGGGGGGG
GGAATTCATGGCGACGAAGGCCGTG
TGC3’ を前述のようにアプライド°゛ハイオシス
テムズ社のDNA合成装置381Aにより作製した。こ
の合成りNAをプライマーに、psOloのPstIで
切り出される600bpのDNA断片をM13mp19
にクローニングして得た組換え1本鎖DNAを鋳型にし
て、シラーらの方法(M、J。
GGAATTCATGGCGACGAAGGCCGTG
TGC3’ を前述のようにアプライド°゛ハイオシス
テムズ社のDNA合成装置381Aにより作製した。こ
の合成りNAをプライマーに、psOloのPstIで
切り出される600bpのDNA断片をM13mp19
にクローニングして得た組換え1本鎖DNAを鋳型にし
て、シラーらの方法(M、J。
Zoller et al、、 Nuc、Ac1d R
es、+ 10.6487(1982))により部位特
異的突然変異を生じさせた。この突然変異体の挿入部分
の塩基配列を決定したところ、目的の通り、欠失してい
たアミノ末端の3残基のアミノ酸をコードする遺伝子と
開始コドンとEcoR1部位が生じていたので、完全長
のSOD cDNAが得られたことがわかった。この突
然変異の生した組換えM131本鎖DNAを調製し、P
stlで切り出される600bPのDNA断片をpUC
9のPst1部位にサブクローニングした。得られた組
換え体の内、EcoRIとPstlで切り出される60
0bpのDNA断片を持つプラスミドをρ50100と
した。psOlooからEcoRIと5au3A1で切
り出される450bpのDNA断片をρBR322のE
coRIとBamH1部位にサブクローニングした。こ
のプラスミドをpBR5OD1 とした。
es、+ 10.6487(1982))により部位特
異的突然変異を生じさせた。この突然変異体の挿入部分
の塩基配列を決定したところ、目的の通り、欠失してい
たアミノ末端の3残基のアミノ酸をコードする遺伝子と
開始コドンとEcoR1部位が生じていたので、完全長
のSOD cDNAが得られたことがわかった。この突
然変異の生した組換えM131本鎖DNAを調製し、P
stlで切り出される600bPのDNA断片をpUC
9のPst1部位にサブクローニングした。得られた組
換え体の内、EcoRIとPstlで切り出される60
0bpのDNA断片を持つプラスミドをρ50100と
した。psOlooからEcoRIと5au3A1で切
り出される450bpのDNA断片をρBR322のE
coRIとBamH1部位にサブクローニングした。こ
のプラスミドをpBR5OD1 とした。
第1図は、SOD遺伝子を含有するプラスミドpBR5
OD1とヘパリン結合性ペプチドをコードする合成オリ
ゴヌクレオチドとから、ヘパリン結合性ペプチドがC−
末端に付加されたSODをコードするDNAを含むプラ
スミドpBR1(BSOD4の構築を示す。 第2図は、本発明の、ヘパリン結合性ペプチドが付加さ
れたS OD (HB−SOD−4)のアミノ酸配列及
びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す。 第3図は、酵母発現用プラスミドpYHcc101と、
HB−5OD−4をコードする遺伝子を含有するプラス
ミドpBRHBsOD4とからのHB−SOD−4用の
酵母発現プラスミドpYsO6000の構築を示す。 第4図は、(A)本発明のヘパリン結合性SOD (H
B−SOD−4)、(B)未修飾のSOD、及び(C)
ヘパリン結合部位として分泌性SODヘパリン結合性ペ
プチドが付加されているS OD (HB−5OD−2
)を酵母にて発現させた場合の分解を比較したものであ
り、図中(1)はクロロホルム抽出により回収した場合
(酵母のプロテアーゼの作用を受ける)、レーン(2)
ヤッフェの方法により抽出した場合(酵母プロテアーゼ
の作用を受けない)、レーン(S)分子量標準、及びレ
ーンH(形質転換されない宿主)のSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動図である。 SB C H5
OD1とヘパリン結合性ペプチドをコードする合成オリ
ゴヌクレオチドとから、ヘパリン結合性ペプチドがC−
末端に付加されたSODをコードするDNAを含むプラ
スミドpBR1(BSOD4の構築を示す。 第2図は、本発明の、ヘパリン結合性ペプチドが付加さ
れたS OD (HB−SOD−4)のアミノ酸配列及
びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す。 第3図は、酵母発現用プラスミドpYHcc101と、
HB−5OD−4をコードする遺伝子を含有するプラス
ミドpBRHBsOD4とからのHB−SOD−4用の
酵母発現プラスミドpYsO6000の構築を示す。 第4図は、(A)本発明のヘパリン結合性SOD (H
B−SOD−4)、(B)未修飾のSOD、及び(C)
ヘパリン結合部位として分泌性SODヘパリン結合性ペ
プチドが付加されているS OD (HB−5OD−2
)を酵母にて発現させた場合の分解を比較したものであ
り、図中(1)はクロロホルム抽出により回収した場合
(酵母のプロテアーゼの作用を受ける)、レーン(2)
ヤッフェの方法により抽出した場合(酵母プロテアーゼ
の作用を受けない)、レーン(S)分子量標準、及びレ
ーンH(形質転換されない宿主)のSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動図である。 SB C H5
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、次のアミノ酸配列: ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Xは任意のアミノ酸であり、Yはそれぞれ独立
にアルギニン又はリジンであり、Proはプロリンであ
り、そしてnは1〜10の整数である)を有するヘパリ
ン結合部位が付加されているスーパーオキサイドディス
ムターゼ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22426390A JPH04108379A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 新規スーパーオキサイドディスムターゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22426390A JPH04108379A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 新規スーパーオキサイドディスムターゼ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04108379A true JPH04108379A (ja) | 1992-04-09 |
Family
ID=16811039
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP22426390A Pending JPH04108379A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 新規スーパーオキサイドディスムターゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH04108379A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5506133A (en) * | 1994-04-11 | 1996-04-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Superoxide dismutase-4 |
EP2091959A1 (en) * | 2006-11-28 | 2009-08-26 | Alzhyme Pty Ltd | Improved peptide composition |
-
1990
- 1990-08-28 JP JP22426390A patent/JPH04108379A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5506133A (en) * | 1994-04-11 | 1996-04-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Superoxide dismutase-4 |
US5871729A (en) * | 1994-04-11 | 1999-02-16 | Human Genome Sciences, Inc. | Superoxide dismutase-4 |
EP2091959A1 (en) * | 2006-11-28 | 2009-08-26 | Alzhyme Pty Ltd | Improved peptide composition |
EP2091959A4 (en) * | 2006-11-28 | 2010-05-05 | Alzhyme Pty Ltd | IMPROVED PEPTIDE COMPOSITION |
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