JP2981774B2 - 固相沈澱アッセイ装置および方法 - Google Patents

固相沈澱アッセイ装置および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の技術分野 本発明は固相沈澱診断装置、および血液流体試料中の
低密度リポタンパク質（LDL）から高密度リポタンパク
質（HDL）を分離する方法に関するものである。
2.参考文献 アライ・エフら、米国特許第4,826,761号、1989年５
月２日発行。
バコリク・ピー・エスら、イン・メソッズ・イン・エ
ンザイモロジイ、第129巻、アカデミック・プレス（198
6）、78−100頁。
フィゲラスら、米国特許第4,144,306号、1979年３月1
3日発行。
ゴールドファーブ・エイら、米国特許第3,464,413
号、1969年９月２日発行。
ヴォゲルら、米国特許第4,477,575号、1984年10月16
日発行。
ザファロニ・エイ、米国特許第3,797,494号、1974年
３月19日発行。
ジーゲンホーンら米国特許第4,544,630号、1985年10
月１日発行。
3.発明の背景 健康状態、例えば心臓病の危険を予言する分析のため
の血液その他の身体の流体を幅広く試験する傾向にあ
る。血液中に存在するコレステロールの分量は冠動脈病
の危険に関連するひとつのファクターである。
コレステロールはタンパク質結合形態で優位に血液中
を循環する。コレステロールを運搬するタンパク質はリ
ポタンパク質であり、それらの密度に基づき３つのクラ
スにさらに分けられる。超低密度リポタンパク質（VLD
L）は肝臓中で合成され最後には低密度リポタンパク質
（LDL）に変わり、人体中の大部分の血漿コレステロー
ルを運搬する、トリグリセリドの豊富なリポタンパク質
である。高密度リポタンパク質（HDL）はトリグリセリ
ドの豊富なリポタンパク質の異化作用において、また周
辺組織からのコレステロールの除去および肝臓への移送
において含まれるリポタンパク質である。血清HDL水準
と心臓病の危険との間の反比例関係が確立されている。
特に、HDLと結合した血清コレステロールの割合が低い
ならば、心臓病の危険は増加する。
アテローム症の危険評価および管理における相対的な
血清コレステロール水準の重要性を考慮して、HDL、LD
L、ならびに全コレステロールおよびトリグリセリドの
血清水準に対する正常と高リスクの両方の個体の大母集
団をスクリーニングするためにかなりの努力が費やされ
てきた。高リスクの個体の治療の有効性は種々のリポタ
ンパク質の区画においてコレステロールの血清水準を規
則的に試験することによってモニターされていた。
LDLおよびHDLコレステロール試験のためのひとつの方
法はポリアニオン性化合物、例えばデキストランサルフ
ェート、ヘパリン、およびホスホタングステートによっ
て、Mg2+、Mn2+、およびCa2+のような第II族のカチオン
の存在で、血清中の非HDLリポタンパク質を選択的に沈
澱させることに基づくものである。沈澱の特異性と度合
は、ポリアニオン／金属剤の種類と濃度を含めて、種々
のファクターに依存している。一般に、血清コレステロ
ール粒子の沈澱の順位は、ポリアニオンの濃度の増加と
共にVLDL、LDL、およびHDLである。HDLの少数のアポＥ
種は一層低い密度の粒子と共に沈澱できるが、HDLは通
常、一層低い密度の粒子を完全に沈澱するヘパリンまた
はデキストランサルフェートの濃度で溶解して残ってい
る。
一層低い密度の粒子を選択的に沈澱することによっ
て、HDL血清コレステロール水準を決定することができ
る。HDL値は、全血清コレステロールとトリグリセリド
の測定値と共に、次の関係式に従ってLDLを計算するた
めに使用することができる： LDLコレステロール＝全コレステロール −トリグリセリド/5−HDLコレステロール 代表的な脂質アッセイ法では、少量の血液を取って遠
心分離して透明なプラズマまたは血清の流体試料をつく
る。次に流体試料を、（ａ）全血清コレステロール、
（ｂ）トリグリセリド、および（ｃ）HDLコレステロー
ルの測定のため、複数のアッセイチューブに等分する。
HDL試料を上記のように沈澱させ、コレステロール検出
前に濾過または遠心分離によって低密度の粒子を除去す
る。次に試料を、コレステロールエステラーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびH2O2
の存在ではっきりと着色された生成物に酸化できる染料
を含む酵素混合物と反応させる。チューブは分光光度計
によって読み取り、所望の全量のHDLおよびLDLコレステ
ロール値を測定することができる。
前記液相コレステロールアッセイを用いて達成できる
精度と信頼性にもかかわらず、このアッセイは幅広いス
クリーニングにおいて使用するには多くの制限がある。
第１に、この方法は静脈血試料を使用し、訓練された技
術者が血液試料を取り出し分別し、処理血液を各アッセ
イチューブに等分することが必要である。少なくとも１
本の試料チューブを（HDL測定のために）沈澱剤を用い
て取り扱い、さらに沈澱物質を除去するように処理する
必要がある。これらの方法のいくつかは自動化できる
が、このために設計された分析機械は高価であり、大病
院以外では広く入手することができない。
本発明は血清コレステロール水準を測定するための液
体アッセイ方法に伴う上述の問題点の多くを実質的に解
決するアッセイ装置を提供する。１実施例では、本装置
は、LDLおよびVLDL粒子も含む血液試料において、HDL結
合コレステロールの濃度を測定するために設計される。
本装置はマトリックスを通って流体試料が移動するとき
溶解するリポタンパク質と沈澱するリポタンパク質を分
離することができる篩分けマトリックスを含む。マトリ
ックスと結合した貯蔵器を、流体試料がマトリックス内
に引き入れられ通過するとき、LDLおよびVLDLを選択的
に沈澱するため、沈澱剤を放出するように設計する。こ
れは、篩分けマトリックスを通る一層速いHDLの移動に
基づいて、沈澱したリポタンパク質からHDLを分離す
る。非HDLリポタンパク質をこのようにして消耗した液
体試料をコレステロールについてアッセイする。
4.発明の概要 本発明のひとつの目的は、血清LDL、HDL、および全コ
レステロール値をアッセイするための液体−アッセイ方
法と関連する上記問題点を実質的に解消しあるいは減ら
すアッセイ装置と方法を提供することである。
本発明の一般的な目的は可溶性アッセイ妨害化合物も
含む流体試料中の可溶性分析物を測定するための改良さ
れた固相アッセイ装置を提供することである。
１具体化では、本発明は特にHDLと結合した血清コレ
ステロールを測定する際に使用するためのアッセイ装置
を含む。沈澱剤は選択的にVLDLおよびLDLを沈澱し、そ
の結果HDL結合コレステロールはこれらの源から妨害さ
れないで測定することができる。
本発明のアッセイ装置は、試料が試料適用位置からマ
トリックスを通ってマトリックス内の試料収集位置まで
流れるとき、流体試料中の沈澱物質から溶解物を分離す
る篩分けマトリックスを含む。流体試料がマトリックス
に流入しこれを通って流れるとき、装置内の試薬貯蔵器
が沈澱剤をマトリックス内に徐々に放出するように設計
する。好適例では、篩分けマトリックスはグラスファイ
バのマトリックスから成り、沈澱剤はファイバ上に被覆
される。貯蔵器からの沈澱剤を徐々に放出すると、アッ
セイされる分析物を沈澱することなく、試料中の妨害化
合物（単数または複数）を沈澱するために有効なマトリ
ックス中の沈澱剤の濃度を与える。また、流体試料中に
存在する分析物濃度を測定するため、マトリックス上の
試料収集位置で収集された流体試料を移すことができる
アッセイパットが装置内に含まれる。
好適例では、沈澱剤はポリアニオン性化合物と第II族
金属カチオンとの組合せを含み、放出手段は、VLDLsお
よびHDLsを選択的に沈澱する化合物の濃度を与えるため
に十分な速度でポリアニオン性化合物を放出するために
有効である。試薬貯蔵器に使用するための好ましいポリ
アニオン性化合物は硫酸化多糖類、ヘパリン、およびリ
ンタングステン酸を含み、第II族金属はMg2+、Mn2+、お
よびCa2+から成る群から選ばれる。好ましい組合せは最
終濃度が0.5〜1.0mg/mlのデキストランサルフェートお
よび0.045〜0.15MのMg2+を含む。これらの好ましい沈澱
剤の配合は特にHDL結合コレステロールのアッセイに有
用である。
別の具体化では、装置は、このような沈澱剤の存在で
マトリックスに可溶性分析物が結合することを防ぐマト
リックスに塗布したコーティング物質を含む。HDLsがグ
ラスファイバに結合することを阻止するのに有効な好ま
しいコーティングは、親水性ポリマー、例えばポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリジン、ポリエチレング
リコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンイ
ミン、ポリビニルスルホン酸、ポリ（３−ヒドロキシブ
チル酸）、ポリアクリル酸、ポリ（３−ヒドロキシ吉草
酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（２−ア
クリルアミドスルホン酸）、またはポリ−Ｌ−グルタメ
ートを含む。
表面シリル基を有するガラスファイバーの網状組織か
ら成るマトリックスのための別の好適なコーティング
は、表面シリル基を含むコーティングがシリルエーテ
ル、特にビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリ
エトキシシランのシリルモノまたはジエーテルから成る
ものである。
他の面では、本発明は血液流体試料中のLDLsおよびVL
DLsからHDLsを分離する方法を含む。この方法では、流
体血液試料はLDLsおよびVLDLsを選択的に沈澱する若干
の沈澱剤と混合する。次いで試料を、HDLがグラスファ
イバに結合しないようにするコーティングを有するグラ
スファイバのマトリックスに通過させる。
好ましくは、本発明の方法に使用される沈澱剤はポリ
アニオン性化合物および第II族金属カチオンを含む。本
発明の方法に特に有用なポリアニオン性化合物は硫酸化
多糖類、ヘパリン、およびリンタングステン酸を含む。
第II族金属は好ましくはMg2+、Mn2+、またはCa2+であ
る。
本発明の方法の１具体化では、沈澱剤の存在でグラス
ファイバマトリックスに可溶性HDLが結合しないように
するために使用されるコーティングは好ましくはポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ポリエチレン
グリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン
イミン、ポリビニルスルホン酸、ポリ（３−ヒドロキシ
ブチル酸）、ポリアクリル酸、ポリ（３−ヒドロキシ吉
草酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（２−
アクリルアミドスルホン酸）、またはポリ−Ｌ−グルタ
メートから成る群から選ばれる親水性ポリマーである。
他の具体化では、マトリックスは表面シリル基を有す
るグラスファイバであり、コーティングはシリルエーテ
ルから成る。好ましいシリルエーテルはビス（ヒドロキ
シエチル）アミノプロピルトリエトキシシランのシリル
モノまたはジエーテルを含む。
5.図面の簡単な説明 図1Aおよび1Bは本発明に従って構成されたマルチ分析
物アッセイ装置の側面図、およびこの図に示された線で
切断した断面図をそれぞれ示す図であり； 図２は図１に示したアッセイ装置の中央の小板領域の
拡大破断図であり； 図3a、3b、および3cは装置内に用いられる３つのタイ
プの放出の遅い貯蔵器の拡大図であり； 図４は沈澱剤の放出と血清試料（図の左側）中のLDL
（白い四角）およびVLDL（白い三角）の沈澱、および装
置（図の中央）内の小板を通って移動した後に形成する
沈澱したLDLおよびVLDLからのHDL（黒丸）粒子の分離を
示す図であり； 図5A〜5Cはシリル化剤（5B）または親水性ポリマー
（5C）を用いてグラスファイバー表面（5A）をコーティ
ングするための方法を示す図であり； 図６は種々の処理およびグラスファイバコーティング
を用いたグラスファイバマトリックス上でHDLを分離し
た後に測定したHDLコレステロール値を示す棒グラフで
あり； 図７はHDLと結合した血清コレステロールの測定のた
めに設計したアッセイ装置中の小板の平面図であり； 図８は本発明の方法と装置の使用に従って２参照標準
曲線を用いるHDLコレステロール濃度の測定を示すプロ
ットであり； 図9aと9bは、それぞれ、そのうちのひとつがHDLであ
る複数の分析物の測定のために設計されたアッセイ装置
内の小板の平面図、およびこの小板の破断面図であり； 図10は本発明の方法に従ってアッセイ装置からの全コ
レステロール、HDL、および血清トリグリセリドを測定
した結果を示すプロットであり；そして 図11は本発明に従って測定したHDLコレステロール
と、標準液相アプローチによって測定したものを比較す
るプロットを示す図であり、図中の直線は２つの試験の
間の理想的な一致を示している。
6.発明の詳細な説明 A.アッセイ装置 このセクションは１種またはそれ以上の妨害化合物も
含む流体試料中の可溶性分析物を測定するために設計さ
れた単一または複数の分析物を使用するために適してい
るアッセイ装置について記述する。妨害化合物は関係す
る分析物を検出するために用いられる試薬と反応し、こ
のような試薬を阻害し、あるいは分析物特異的反応にお
いて生じた信号レベルで非特異的に妨害する化合物であ
る。この妨害化合物はまた可溶性分析物分子または分子
コンプレックスを沈澱しない条件下で選択的に沈澱（ま
たは凝集）できるものでもある。選択的な沈澱は試料を
沈澱剤に所定の濃度範囲内でさらすことによって生成す
る。妨害化合物はこの濃度範囲以下では不完全に沈澱す
ることがあり；この範囲を超えると分析物の沈澱が起こ
ることがある。
本発明によって検出するためのひとつの例示的な分析
物は高密度リポタンパク質結合コレステロール（HDLコ
レステロール）である。上記のように、HDLは血液中に
コレステロールを運搬するリポタンパク質の種類のひと
つである。HDL、および低密度リポタンパク質（LDL）と
結合したコレステロールのレベルは心血管疾患と強い相
互関係を与える。HDLアッセイにおいて妨害する化合物
は主としてキロミクロン、VLDLおよびLDLを含む非HDL血
清リポタンパク質である。以下に述べるように、非HDL
リポタンパク質は、第II族金属カチオンと組合わせて、
沈澱成分の選択された濃度範囲内で、種々のポリアニオ
ン性化合物によって選択的に沈澱することができる。
図1aは本発明に従って構成された複数の分析物のアッ
セイ装置14を示す。この装置は特に少量の血液試料を、
代表的には10〜50μｌの血液を使用する複数の分析物を
測定するために設計される。一般的なアッセイの構成
は、ここに参考文献として加えられる共有する米国特許
出願「マルチ分析物アッセイ装置」、第503,371号、199
0年４月２日に出願したものに記載されており、特に複
数の血液試料アッセイの測定のために適している。
装置14は一般に、一定量の血液試料、代表的には約25
〜50μｌの血液を収容する大きさと寸法のウェル16を画
定する支持体15を含む。プレート内に形成されたキャピ
ラリー導管18はウェルの底に設けられ、支持体の上縁に
形成された切り欠き領域20と連結する。この支持体は好
ましくは、標準の成形または加工方法によって形成され
たウェル、導管および切り欠き領域と共に、薄いプラス
チック板等である。
領域20に収容される篩分けパッド22は、図1aに示した
ように底から上部まで、試料がウェルから離れた方向に
マトリックスを通って移動するとき、大きい粒状物質
（血球を含む）を部分的に動かすように働く。パッド22
は、表面湿潤によって水性流体を引き出し、血液試料が
マトリックスを通って引き出されるとき血球の移動を遅
らせるように設計された繊維状マトリックス材料から形
成される。すなわち、パッドは、媒体を通過する異なる
移動速度に基づいて可溶性血清成分から血球の大きさの
粒子を分離するためのクロマトグラフィー媒体として働
く。
セルロース、セルロースアセテート、およびグラスフ
ァイバマトリックスを含む繊維状マットフィルターに使
用されるような種々の繊維状材料が、篩分けパッド用材
料に適している。所望により、ファイバは、化学的架
橋、熱溶融等によって架橋することができる。また多孔
性支持体、例えば焼結ガラス、溶融ポリマービーズ等、
隙間の湿潤性および寸法が表面のぬれによってマトリッ
クス内に水性媒体の移動を促すようなものが適してい
る。１実施例のフィルターはグラスファイバフィルター
であり、例えばワットマンによって供給され、約0.16g/
cm3の充填密度を有するGF/Dまたは、PD008フィルターが
ある。小板は側面寸法が約３×8mm、および厚さが約1mm
に切断される。パッドは一定の容量、代表的には約３〜
25μｌ、そして好ましくは約15〜25μｌの流体試料を吸
着するような大きさである。
篩分けパッド22はさらに赤血球捕獲試薬、例えばレク
チン、赤血球表面膜タンパク質に対して特異的な抗体、
トロンビン、またはイオン交換剤を含む。また、パッド
22の上部表面は流体試料中に存在する血球その他の粒状
物質を濾過するように設計されたミクロ細孔膜によって
被覆することができる。血液中の大きいリポタンパク質
本体、例えば、HDL、LDL、およびVLDLと結合することが
できる全コレステロールまたは他の脂質成分をアッセイ
するために装置を使用する場合、この種の膜の孔寸法は
血球を濾過するが、これらの分子を通過させるように選
択される。ひとつの好ましい膜はヌクレオポア（カリホ
ルニア州リバーモア）から入手でき、１ミクロンの孔寸
法をもつポリカーボネート膜である。
特に図２を参照すると、この図はアッセイ装置の中央
部の拡大図であり、篩分けパッド22は、順番にプレート
の上縁の内側部分に取付けられこれに沿って延びている
細長い小板またはマトリックス26によって被覆されてい
る。マトリックス26は流体試料を、マトリックス小板の
中央試料適用領域28から、マトリックスの端部付近の向
い合った試料収集領域30、32まで分配するために役立つ
（図１）。マトリックスは好ましくは、パッド22に用い
たような繊維状物質から形成され、毛細管流によって小
板を通って流体を引き出すことができる。
マトリックスは、小板の試料収集領域まで小板の試料
適用領域に供給される少量、例えば、10〜25μｌの流体
を吸着し分配するような充填密度および厚さである。マ
トリックスは充填密度が約0.16g/cm3と4.0g/cm3の間で
あることが好ましい。１実施例のマトリックス材料は、
約0.2gm/cm3の充填密度、約3mmの幅、約3cmの長さ、お
よび約0.12mmの厚さを有するワットマンから入手できる
BSB−20グラスファイバフィルターである。分離マトリ
ックス中のグラスファイバは、以下に述べるように、沈
澱剤の存在でグラスファイバにHDLが結合することを妨
げるために有効なコーティングを含むように調製され
る。
図２を引続き参照すると、装置内の試薬貯蔵器34は、
流体試料をマトリックスの試料適用領域に引き入れると
き、流体試料中のLDLおよびVLDL粒子のような妨害化合
物を選択的に沈澱するために使用される沈澱剤を含む。
貯蔵器34は、マトリックス26の中央試料適用領域28と篩
分けパッド22との間に挿入される繊維状ウェブ（図3a、
3b、および3cに示した）を含む。図に見られるように、
ウェブは領域20の縁部をいくらか越えて伸びており、パ
ッド22からマトリックス26に引き入れる流体試料もまた
貯蔵器を通して引き出されるようにする。ウェブはパッ
ド22またはマトリックス26に用いられるような繊維状フ
ィルター材料から形成することができる。１実施例の材
料は充填密度が約0.2gm/cm3、厚さが約0.12mm、および
長さおよび幅寸法がそれぞれ約4mmおよび3mmのグラスフ
ァイバフィルターである。以下に詳しく述べるように、
図3a、3b、および3cは、そのウェブ構成を示す試薬貯蔵
器の拡大部分の実施例を示す。貯蔵器はここではマトリ
ックス26から分離して示されているが、マトリックスの
中央部分に沈澱剤を組み込むことによって、貯蔵器をマ
トリックスと一体形成することができることが認められ
るだろう。
試薬貯蔵器34はマトリックスに入る流体試料中の薬剤
の濃度を維持する速度で沈澱剤を放出するように設計さ
れ、さらに特に、少なくとも最初の10％そして好ましく
は20〜40％の全流体試料をマトリックス上の試料適用位
置および試料収集位置の間のマトリックスに引き入れ、
その濃度範囲は流体試料中の非HDL化合物を選択的に沈
澱または凝集するために有効な範囲内である。
沈澱剤は（ａ）妨害化合物を沈澱する能力が濃度に依
存し、そして（ｂ）可溶性の形で流体試料に貯蔵器から
放出される、任意の化学的な１または複数の成分であ
る。薬剤は塩折沈澱効果を生じる塩、選択的なpH依存沈
澱効果を生じる酸または塩基、またはさらに代表的に
は、妨害化合物（単数または複数）と分子内凝集物を形
成する１または複数の化合物であることができる。好ま
しい沈澱剤は、非HDL血清リポタンパク質の選択的沈澱
に使用するため、スルホン化多糖、例えば中性pHを維持
するように緩衝剤で処理された酢酸マグネシウムまたは
塩化マグネシウムと組合わせたデキストランサルフェー
ト（代表的な分子量は50,000ダルトンである）である。
上述のように、リポタンパク質は選択されたポリアニ
オン性化合物および二価のカチオンの組合せを含む種々
の沈澱剤によって選択的に沈澱することができる。リポ
タンパク質沈澱においてこれらの薬剤を使用することは
概説されている（バコリク・ピー・エスら、イン・メソ
ッズ・イン・エンザイモロジイ、アカデミック・プレス
（1986）、78〜100頁）。最も広く使用されている薬剤
は（ａ）ヘパリン−Mn2+またはヘパリン−Ca2+、（ｂ）
デキストランサルフェート−Mg2+、（ｃ）ホスホタング
ステート−Mg2+、および（ｄ）ポリエチレングリコール
である。
ヘパリンおよび二価金属を含むヘパリン剤は1mg/mlの
ヘパリン濃度で有効であり、1mg/mlまでの濃度ではHDL
を沈澱しない。Mn2+、代表的にはMnCl2塩の形で、非HDL
（アポＢ含有）リポタンパク質の完全な沈澱に対して少
なくとも約0.04M、そして好ましくは約.006と.092Mの間
のMn2+でなければならない。同様の濃度のCa2+をMg2+と
置換することができる。
デキストランサルフェートとMg2+を含むデキストラン
サルフェート剤は好ましくは約50kd（キロダルトン）の
分子量のデキストランサルフェートを用いる。高分子
量、例えば500kdでは、かなりの分量のHDLが沈澱する。
低分子量、例えば15kdでは、アポＢリポタンパク質が不
完全に沈澱する。非HDL粒子の選択的沈澱のため最適な
デキストランサルフェート濃度は約0.91mg/mlであり、1
0mg/mlまでの濃度ではHDLを沈澱しない。Mg2+の濃度
は、代表的にはMgCl2の形で約0.045Mと0.15Mの間であ
る。
ホスホタングステート剤は水溶性ホスホタングステー
トおよびMg2+を、代表的にはMgCl2の形で含む。非HDLリ
ポタンパク質を選択的に沈澱するために有効な薬剤の濃
度は２〜8mg/mlのホスホタングステートおよび約0.025
と0.075Mの間のMg塩である。
沈澱剤は代表的には、選択された分量の沈澱剤を用い
て貯蔵器ウェブを浸出させる所望の濃度までHEPES緩衝
液のような水性緩衝液に配合される。貯蔵器内の薬剤の
全量は、所望の沈澱剤濃度にて、沈澱剤を含むだろうア
ッセイ装置内の推定溶媒初期容量、およびその濃度を生
じるために必要な沈澱剤の全量から計算される。ウェブ
に適用される配合は、以下に図3aを参照して記載される
バインダー、または放出の遅いコーティングを用いて被
覆される沈澱剤単独を含むことができる。デキストラン
サルフェート−MgCl2沈澱剤を含む貯蔵器の詳細は実施
例１で示す。
バインダー材料、および配合中の沈澱剤に対するバイ
ンダーの割合は、流体試料をマトリックス中に引き出す
とき、さらに特に、最初の10〜40％またはそれ以上の全
流体試料をマトリックス中に引き出すとき、その間に徐
々に粒子が溶解するように選択される。好ましいポリマ
ーバインダーは線状ポリオキシド、ポリプロピレンオキ
シド、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリアク
リルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリル
酸、ポリビニル酢酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルオキサゾリドン、および種々の水溶性ヒドロキシルポ
リマー、例えば天然ゴム、ゼラチン、および水溶性セル
ロース化合物、例えばメチルセルロースおよびヒドロキ
シメチルセルロース、およびコポリマーおよびこれらポ
リマーの混合物である。これらのポリマーは一般に種々
の分子量の大きさで市販品として入手できる。バインダ
ーの配合はバインダーと沈澱剤を、代表的には約1:10な
いし1:1の沈澱剤：バインダーの重量比で調製すること
ができる。乾燥したバインダーの配合は代表的には、バ
インダーの性質と貯蔵器の所望の溶解速度に従って、約
1:10ないし1:1の薬剤対バインダーの割合で含む。しか
し特に、バインダーそれ自体は沈澱剤または１の薬剤成
分であっても良く、例えばデキストランサルフェートと
Mg2+から成る沈澱剤中のデキストランサルフェートポリ
マーがある。
図3a、3b、および3cは、特に好適例のウェブ様構成を
示す貯蔵器34の具体化の拡大図である。図3aに示した実
施例では、沈澱剤はバインダー中に配合され、ウェブの
繊維上で乾燥される。即ち、38で示したウェブの繊維は
バインダー／沈澱剤混合物の乾燥した不規則な沈積物36
に覆われる。バインダー材料、および配合中のバインダ
ー対沈澱剤の割合は、流体試料をマトリックス中に引き
出すとき、さらに特に、全流体試料の最初の10〜40％ま
たはそれ以上をマトリックス中に引き出すとき、その間
に徐々に粒子を溶解するように選択される。貯蔵器を調
製するため、既知の分量の沈澱剤を含むバインダー配合
の懸濁液を用いてウェブは浸出される。次にウェブを、
例えば真空下に、あるいは加熱によって乾燥し、図3aに
示したようなウェブコーティングを得る。実施例１はデ
キストランセルフェートおよびMgCl2を含有するこのタ
イプの貯蔵器の調製を記載する。
図3bに示した第２の実施例では、沈澱剤をウェブ中に
浸出させ、脱水し、ウェブの繊維上に沈積物45を形成す
る。次にこの沈積物を水溶性物質、代表的には上述のよ
うな水溶性ポリマーを用いて被覆し、流体試料と接触し
て沈積物の溶解を遅らせるように働く沈積物上に徐々に
放出するコーティング46（図中の点線）を形成する。コ
ーティングは噴霧、浸漬、またはウェブと沈積物に塗布
された非水性溶媒からの脱水によって行うことができ
る。コーティングは好ましくはウェブ全体に異なる厚さ
のコーティングを塗布するように行われ、貯蔵器を通っ
て試料物質が流れるとき連続して薬剤を放出させる。
図3cは貯蔵器内の貯蔵器粒子48のミクロスフェアまた
はマイクロカプセルのタイプを示す。ミクロスフェアは
微細孔ポリマー外殻49および、沈澱剤を含む封入された
内側領域51から成る。封入剤を有するミクロスフェアは
米国特許第3,797,494および3,464,413号に記載されたよ
うな既知の方法によって調製され、ウェブ内に包埋され
る。ミクロスフェアの孔は関係する分析物化合物を排除
するような大きさであり、分析物がミクロスフェア内の
高濃度の沈澱剤にさらされないようにする。
図４は血清試料中のHDLを測定するためのアッセイの
間に、マトリックス26内の試料適用と試料収集領域との
間に起こる選択的な沈澱と分離の操作を示している。試
料中の異なるリポタンパク質は黒丸（HDL）、白い四角
（VLDL）、白い三角（LDL）、およびユニットの集団
（集塊）によって示される。流体試料は、図に示すよう
に、矢印で示したように、マトリックスを通って左から
右へ流れる。
図４の左側部分はマトリックスの試料適用領域28を示
し、表層部を切り取り内部を見せている部分はマトリッ
クス内の試薬貯蔵器34の繊維38およびこの繊維に含まれ
る沈澱剤の領域36を示している。この領域の流体試料
は、図に示したように、元のリポタンパク質濃度での元
のリポタンパク質成分の全部を含む。
図の中央部は、試薬貯蔵器から下流で、試料適用領域
28と試料収集部位32との間に、マトリックス26の一部44
を示す。流体試料を貯蔵器中でウェブを通って引き出す
とき、沈澱剤を試料中に放出しながら、ウェブ上の沈積
物が徐々に溶解する。溶媒前部のコレステロール含有粒
子を図中の右へ試料収集領域に対して引き出すとき、集
塊および非集塊の粒子をクロマトグラフィーで分離す
る。中央の表層部を切り取り内部を見せている部分に示
されるように、LDLおよびVLDLリポタンパク質は主とし
て沈澱、または集塊した形である。
図の右側部分は試料収集部位32でマトリックスの一部
を示している。ここでは最初に試料収集領域に到達する
流体試料の成分は非HDL粒子を殆ど含まないが、初めか
ら適用された血液試料中に存在する濃度でHDL粒子を含
む。
本発明のひとつの特徴によれば、選択的に沈澱する非
HDL血液リポタンパク質に使用される薬剤を用いて血液
を処理すると、市販品として入手できるガラスフィルタ
ーに供給されるタイプのグラスファイバに対して試料中
に存在するHDLの一部を結合することになることが見出
された。グラスファイバへのこの結合から得られる測定
されたHDLコレステロールの減少は、以下の図６のデー
ターから認められるだろう。このような結合は分離マト
リックス26の繊維にコーティングを追加して有効に排除
することができる。
ふたつの好ましいタイプのコーティングとその調製法
は図5A〜5Cに示される。
図5Aは基52のようなシリルヒドロキシル（Si−OH）表
面基を有するグラスファイバ50の断片表面部分を示す。
このシリルヒドロキシル基は市販のガラスフィルター等
のグラスファイバ面が代表的である。ここには示してい
ないが、ファイバはまた、配合前にグラスファイバの充
填性を改良するため、ガラスと共に配合されるポリビニ
ルアルコール（PVA）のようなポリマーを少量パーセン
ト（約２重量％以下）含むように配合することができ
る。
図5Bに示したコーティング方法では、ガラスフィルタ
ーは表面シリルヒドロキシル基を一般式Ｒ−Si（OX）ｎ
（式中のＲは親水性基であり、Ｘは低級アルキル、好ま
しくはメチルまたはエチルラジカルであり、ｎは２また
は３である）を有する親水性シリル化剤と化学的に反応
させて被覆される。例示的なシリル化剤はビス（ヒドロ
キシエチル）アミノプロピルトリエトキシシランのシリ
ルモノおよびジエーテルを含む。
反応はシリル化ガラスについて既知の方法に従って行
われる。代表的な方法では、ビス（ヒドロキシエチル）
アミノプロピルトリエトキシシランのようなシリル化試
薬の２％水性“ワーキング”溶液は、例えばフルス・ア
メリカ（ペトラーチ・システムズ、ブリストル、PA）か
ら市販品として入手される62％ストック溶液から調製さ
れる。マトリックスを形成するガラスフィルターは新し
く調製されたワーキング溶液に少なくとも10分間浸し、
95％エタノールですすぎ、オーブンで50℃で５分間乾燥
する。
図5Bに示すように、シリル化試薬は２つのSi−OH表面
基のいずれかひとつと反応し、54で示したシリルモノま
たはジエーテルコーティングを形成する。このコーティ
ングは未処理のガラスの表面Si−OH基をマスクして、こ
れらの基を上記タイプの親水性Ｒ基と置き換える。
図5Cに示した第２の一般的な実施例では、ガラスフィ
ルターは56で示したような親水性ポリマーを用いて被覆
される。ポリマーコーティングを適用するための好まし
い方法では、マトリックスを形成するガラスフィルター
はポリビニルアルコール（PVA）の溶液に浸し、次に数
分間高温（約90℃）で乾燥する。最終のポリマーの混入
量は、ガラスフィルターから有機化合物を火炎蒸発する
前後の質量を比較して見積もるとき、約５％の乾燥重量
である。図5Cはポリマー繊維から形成されて得られたポ
リマーコーティング58を示す。化学的改良方法を用いる
と、コーティングは表面Si−OH基をマスクしてそれらを
ポリマーサブユニットの親水性基と置き換えるために有
効である。
本発明に使用するために好ましいポリマーは、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ポリエチレン
グリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン
イミン、ポリビニルスルホン酸、ポリ（３−ヒドロキシ
酪酸）、ポリアクリル酸、ポリ（３−ヒドロキシ吉草
酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（２−ア
クリルアミドスルホン酸）、またはポリ−Ｌ−グルタメ
ートを含む。好ましいポリマーの分子量は約10〜200キ
ロダルトンの間である。正確な好ましいポリマー含量は
グラスファイバマトリックスのタイプ、そして特に、そ
のファイバー密度に依存する。以下に示されるように、
ワットマンBSB−20膜を用いると、好ましいポリマー含
量は、上記のように測定して、標準としてポリビニルア
ルコールに関して、約４％よりも大きいポリマーであ
る。
HDLをガラスフィルター繊維に結合する際の種々のガ
ラス組成と表面コーティングの効果は研究によって知る
ことができ、その結果は図６に示される。この研究で
は、以下に述べるように処理された６本のガラスフィル
ターの各々は、篩分けマトリックスとして使用した。各
場合において、VLDLとLDLを除去するようにデキストラ
ンサルフェート沈澱試薬を用いて予備処理した血清試料
を、フィルターに通し、次に通常のコレステロールアッ
セイによってHDL結合コレステロール含量を分析した。
コントロールとして、同じ試料を、フィルターに通さな
いで、溶液相法によって直接分析した。濾過物質に対す
るHDLコレステロール濃度を次に未濾過物質のパーセン
トとして表した。
図６のグラフの上部の棒（ａ）に示すように、マトリ
ックスのガラスにHDLを結合するため、未処理のグラス
ファイバ（ワットマンBSB−20）を通過する血清試料はH
DLコレステロール含量の約15％のロスとなった。製造者
の仕様書によれば、このフィルター上のグラスファイバ
ーは、ファイバの艶消性質を改良するため、配合中にガ
ラスフィルターに混入する約１％PVAを用いて配合され
る。
同じフィルター材料は、ビス（ヒドロキシエチル）ア
ミノプロピルトリエトキシシランを用いてシリル化した
後、コントロール試料（ｂ）のそれと同量のHDLコレス
テロール含量によって証明されるように、殆どHDLを結
合しないことが示された。同じフィルター材料はPVAの
溶液を用いて被覆したとき、４重量％以下のポリマー
（ｃ）で、未処理ファイバよりも低い結合を示すが、な
おHDLの結合を示した。４〜５重量％のPVAコーティング
（ｄ）を有するフィルターは評価できるHDL結合を示さ
なかった。これらの結果から、この研究（ワットマンBA
B−20）に用いられた繊維組成に対して、HDLのフィルタ
ー材料への結合を妨げるために４〜５％のPVAコーティ
ングが十分であったと結論することができる。必要なPV
Aコーティングの正確な分量は使用したフィルター材料
の組成そして特にグラスファイバー密度に依存すること
が、追加の研究から示唆された。
また図６には６重量％のPVAを含むように製造業者に
よって作られたガラスフィルターに試料を濾過した結果
を示している。これらのフィルターは、上記方法論に従
って、PVAを用いて表面が特に被覆されていなかった。
このフィルターを通過する試料は濾液のHDL−コレステ
ロール含量を僅かに減らした（ｅ）。このフィルターに
結合するHDLの減少は、追加したPVAが一部グラスファイ
バ表面で通常Si−OH基を被覆しマスクするように働いて
いることを示唆している。上記シリル化方法を用いて、
６％PVA増加繊維材料をさらにシリル化したとき、HDLを
フィルターに結合することによる試料のHDLコレステロ
ール含量の測定できるロスは観察されなかった（ｆ）。
この研究は、親水性シリル化基による化学コーティン
グおよび親水性ポリマー（十分なポリマー濃度で）によ
るポリマーコーティングの両方が、沈澱剤の存在でHDL
がグラスファイバに結合することを妨げるために有効で
あることを示している。
図１の記述をまとめると、装置14は細長い支持体62、
および図示した位置で、この支持体の下部表面に備えら
れた湿潤性吸着反応テストパッド64、66、68および70か
ら成るテストプレート60を含む。支持体は透明であり、
またはテストパッドを支持体を介して見ることができる
透明ウインドウを有する。テストプレート中のパッドは
透明または半透明粘着性材料によって、または音波溶接
または他の適当な結合方法によって支持体に取り付けら
れる。特定のアッセイにおいて使用される各パッドは、
既知の方法で、視覚または検出器のいずれかによって、
光学的に検出できるパッドにおける分析物に依存する変
化を生じさせるために有効な分析物依存試薬を含む。パ
ッドの全部または任意の一体のサブセットを特定のアッ
セイにおいて用いることができる。コレステロールおよ
びトリグリセリドアッセイのための試薬の性質は、以下
に、セクションＢおよびＣで述べる。
理想的には、反応テストパッドは、流体が完全に浸透
した後に、約100〜150μの厚さと約3mmの側部寸法を有
する多孔性の溶融ポリマーまたは微細孔のポリマー膜で
ある。各パッドの吸収容量は好ましくは約0.5〜２μｌ
の間である。反応パッドの好ましい組成材料はポリスル
ホンである。
マトリックス26の端部付近の部位32のような試料収集
部位に血清が達すると、テストプレート60を、パッド6
4、66、68、70がマトリックスと接触するまで動かす。
この位置では、マトリックス中の流体試料は、パッド表
面に正常な方向で生じる流体の動きと共にキャピラリー
流によって近接するパッドに引き入れられる。プレート
はこの位置で所望の程度に湿潤したパッドが得られるま
で保持される。
パッド中の分析物依存試薬は、既知の方法で、視覚ま
たは検出器によって、光学的に検出できるパッド中の分
析物依存の変化を生じさせる。パッドの信号水準を読み
取るため、および読み取りによって収集された分析物の
値を計算するためのひとつの好ましい装置は、“制御さ
れた容量アッセイ方法および装置”について1989年３月
８日に出願された共有の米国特許出願第320,474号に記
載されており、ここに参考文献として加える。
テストプレート60を、弾性ブロック71、72のような一
対の弾性部材によって支持体15に取り付ける。ブロック
は非移送位置に対してパッドをバイアスにするように働
き、この位置でパッドは、代表的には約0.5ないし1.0mm
の間の間隔でディスペンサーの試料移送表面から離れ
る。
B.HDLアッセイ 少量の血液試料でHDLを測定するためのアッセイにお
いて装置を操作するため、試料をウェル16に置き（図1
a）、試料をキャピラリーによってパッド22に引き入れ
パッドに通して、血球を含まない血清試料を生成し次に
貯蔵器34を介してマトリックス26に引き入れる。流体試
料をウェブを介して貯蔵器に引き入れると、沈澱剤を流
体試料に放出しながら、貯蔵器ウェブ上の沈澱剤／バイ
ンダー沈積物は徐々に溶解する。上記のように、貯蔵器
を通る全溶媒流の選択された部分−−代表的には少なく
とも最初の10〜40％の全溶媒流、そして好ましくは少な
くとも最初の20％の全溶媒流に対して、全量の沈澱剤を
放出するように設計する。沈澱剤の放出速度は、相当量
のHDLを沈澱することなく試料中に存在するLDLおよびVL
DLを選択的に沈澱するために必要な範囲内にある流体試
料中の試薬の濃度を維持するような速度である。
溶媒前部の下流領域中のコレステロール含有粒子は、
マトリックス中にそして試料収集領域に向って図の右側
に引き入れられるので、上記のように図４に示したよう
に、凝集粒子および非凝集粒子はクロマトグラフィーで
分離される。最初に試料収集領域に達する流体試料は非
HDL粒子を殆ど含まないが、マトリックスに導入される
血球を含まない（血清）流体試料血清と同じHDL濃度を
有する。
図７は、支持体62を介して見るときの装置14内のマト
リックス26の上面の平面図であり、また64、66、68、お
よび70で示される４個の反応パッドがテストプレート62
上に収容されていることを示す図である。図中の点線72
は下にある領域22の縁部を示し、装置内の貯蔵器34の縁
部に近接しており、マトリックス26の下の表層部を切り
取って内部を見せている。貯蔵器は、デキストランサル
フェートおよびMg2+を徐々に放出するために設計されて
おり、上述のように、ウェブ繊維38上の乾燥沈澱物36と
して示される。図から、マトリックスの両側に対して引
き出される流体試料は沈澱剤にさらされるので、マトリ
ックスの両側の非HDL粒子は、流体試料が反応パッドの
下にある試料収集領域に達するときHDL分析物から分離
される。
図７の実施例における反応パッドのうち２個は、HDL
コレステロール（HDL1およびHDL2）の二重アッセイのた
めに設計され、図では66および68で示した。２個の参照
標準パッドは（64および70で示したB1およびB2）、コレ
ステロール値を測定するため自己収集標準曲線を与え、
これについては“自己収集されたアッセイおよび方法”
として1989年８月23日に出願された米国特許出願第396,
326号に記載されており、ここに参考文献として加え
る。HDLテストおよび参照標準テストのパッドの多くの
配置が可能であることは高く評価される。すなわち、参
照標準パッドは、各場合において交替の場所でHDLテス
トパッドと共に、二者択一的に66および68、64および6
6、68および70に位置する。また、装置はコレステロー
ル依存試薬を含む唯一の反応テストパッドをもつように
することができる。さらに、装置は参照標準パッドなし
に作ることができ、標準化した反射率値を使用し、テス
トした液体試料中に存在するHDLコレステロールの濃度
を測定することができる。
血清がマトリックス26の端部付近の試料収集部位（3
0,32）に達すると、テストプレートをその試料移送位置
に向かって動かし、そこでテストパッドはマトリックス
と接触する。この位置で、ディスペンサー中の流体試料
を、パッド表面に対して正常な方向に生じる流体の動き
と共にキャピラリー流によってパッドに引き入れる。プ
レートはパッドが所望の湿潤度に達するまでこの位置に
保持される。
テストパッド中のコレステロール依存試薬は、既知の
方法で、視覚的にまたは検出器によって、光学的に検出
できるパッド内の変化を生じさせる。パッドの信号水準
を読み取るため、および読み取った値に基づいて補正さ
れた分析値を計算するためのひとつの好ましい装置は、
“制御された容量アッセイ方法および装置”について19
89年３月８日に出願された上記の共有の米国特許第320,
474号に記載されており、ここに参考文献として加え
た。
HDLアッセイを行うように配置するとき、上記装置は
テスト（HDL）および参照標準パッド（B1、B2）の両者
を含む。テストパッドはH2O2を着色信号反応生成物に変
えるため共通の経路試薬成分を含む。共通の経路成分は
パーオキシダーゼ、およびH2O2の存在で、パーオキシダ
ーゼによってはっきりと着色された信号反応生成物に変
える単一またはカップルになった染料システムを含む。
H2O2の酵素生成に対して、種々の基質特異的オキシダー
ゼを用いる酵素着色反応、およびその後の着色された反
応生成物を形成するための染料の酸化は良く知られてい
る。またHDLテストパッドは共通の経路成分に加えて、H
DLから遊離コレステロールを放出するためのコレステロ
ールエステラーゼ、および試料中の遊離コレステロール
と反応してH2O2を生成するためのコレステロールオキシ
ダーゼを含む。
参照標準パッドは、共通経路成分に加えて、種々の既
知量の非コレステロール参照化合物、好ましくはＤ−ア
ミノ酸、およびパッドが流体試料で湿れたときにH2O2を
発生するため、オキシダーゼ、例えばＤ−アミノ酸オキ
シダーゼを含む。
反応に存在する反応成分およびHDLアッセイに使用さ
れる参照パッドを表１にまとめて示す。
上記アッセイ装置において、各参照標準に加えられる
参照化合物の分量は、限定された反応混合物の所定容量
の存在で、コレステロールオキシダーゼの存在で同一の
条件下にアッセイされた既知濃度のコレステロールに対
応する信号水準を生成するように選択される。アッセイ
で生成する実際の参照標準はまた（ａ）血清試料中（HD
Lコレステロールの測定を妨害する非HDL化合物から区別
されるとき）に存在する可溶性妨害化合物の分量、
（ｂ）パッド中の反応成分の状態、および（ｃ）温度お
よび反応時間を含む反応条件にも依存するだろう。
２個の参照パッドの信号値は、参照化合物濃度の関数
としてプロットするとき、図８に示されるような２点標
準曲線を与える。この信号値は、測定された信号の性質
とプロットされた信号値との間の既知の関係を用いる反
射率または他の測定された信号の諸性質から計算され
る。図８の曲線がグラフの元のものとクロスしないとい
う事実は非線形抑制効果を示している。
二重のHDLパッドに対して測定された信号値は参照標
準曲線上にプロットされ、参照標準とコレステロールの
濃度との間の既知の一致を使用して、これらのパッドの
各々のコレステロール濃度を決定する。このように計算
されたコレステロール値は（ａ）標準曲線に基づいて計
算され、（ｂ）全部で４個の反応パッドがこれらの因子
において同じ変量に委ねられると仮定すると、反応条件
における変量、および共通経路成分の抑制効果と活性の
ロスに対して自動補正されることは高く評価されるだろ
う。HDLと結合したコレステロールの濃度は２個のHDL試
料パッドから測定されるコレステロール濃度の平均から
計算することができる。あるいはコレステロール濃度
を、単一の参照標準、または反射率が歴史的に得られる
標準、と比較される単一のHDL試料パッドから得られる
反射率から決定することができる。
C.マルチ分析物脂質アッセイ このセクションは、HDLコレステロールを含み、さら
に１種またはそれ以上の次の分析物：全血清コレステロ
ール、LDLコレステロール、および血清トリグリセリド
を含む、血清成分のマルチ分析物測定のために設計され
るアッセイ装置の実施例を記載する。
図9aはアッセイ装置における２つの部分マトリックス
76、78の上面の平面図であり、点線72はマトリックスの
試料適用領域の下にある篩分けパッド領域の縁部を示
す。繊維38およびこの繊維上に含まれる沈澱剤36の沈積
物は、この装置内の貯蔵器74から成るマトリックス76の
右側部のみを表層部で切り取って内部を見せた図で示し
ている。マトリックス76の方へ引き出される流体試料は
この貯蔵器を通過し、沈澱剤を徐々に放出させ、試料物
質中の非HDLリポタンパク質を沈澱させる。マトリック
ス78の左側の方へ篩分けパッドから流れる物質は沈澱剤
にはさらされない。図9bは、マトリックス76、78の２つ
の部分の間の区分、および装置の左側ではなく右側の貯
蔵器内に点画によって示される沈澱剤82の存在を示す試
料適用領域における装置の断片的な断面図を示す。貯蔵
器の両側と装置のマトリックスとの間の区分は図9aおよ
び9bにおいて空間として示される；代りに、物理的防
壁、例えば流体試料を透さず従って篩分けマトリックス
の２つの部分の間の拡散を妨げるプラスチックシートを
装置内に使用することができる。試薬貯蔵器に対応する
装置の左側に80で示した領域はウェブ様試薬貯蔵器マト
リックスを含むか、または分離マトリックス78によって
占領されることができる。全体のマトリックス76、78
は、上記のように、好ましくは親水性ポリマーまたはシ
リル化剤を用いて被覆される。
図9aの実施例で示される４個のテスト反応テストパッ
ドは全コレステロール（TCh）、トリグリセリド脂質（T
G）、およびHDLコレステロール（HDL）を測定するため
に設計され、参照標準テストパッド（B1）を含む。各パ
ッドは、H2O2をはっきりと着色された信号反応生成物に
変えるため上述の共通経路の成分を含む。参照標準パッ
ドは既知の分量の参照化合物、例えばＤ−アミノ酸、お
よび、上述のように、対応するオキシダーゼを含む。
全コレステロールおよびHDLテストパッドの各々は、
共通経路の成分に加えて、HDL、LDL、およびVLDL粒子を
含む血清リポタンパク質から遊離コレステロール形態で
エステル化コレステロールを放出するためのコレステロ
ールエステラーゼ、および流体試料中の遊離コレステロ
ールとの反応によってH2O2を生成するためのコレステロ
ールオキシダーゼを含む。
トリグリセリドテストパッドは、共通経路の成分に加
えて、リパーゼ、Ｌ−グリセロールキナーゼ、およびH2
O2をトリグリセリドから生成するため、Ｌ−グリセロー
ル−３−ホスフェートオキシダーゼを含む。これら３種
の酵素はトリグリセリド基質をＬ−グリセロール−３−
ホスフェートに変えて、後者の化合物をH2O2の発生と共
に酸化する働きがある。TGパッドに引き入れた血清試料
はすべての血清リポタンパク質を含むので、TG信号は全
血清トリグリセリドを表わす。
アッセイ中の参照標準パッドは図10に示されるような
単一点標準曲線を構成するために用いられる。この標準
曲線はコレステロールおよびトリグリセリドの予定され
た濃度に対応し、従って測定された信号値から分析物濃
度を決定するためのプロットを与える。上述のように、
標準曲線はまた共通経路成分中の酵素活性のロスに対し
て、また、非線形抑制効果は補正されないが、反応条件
の変化に対して分析物の示数を補正するように働く。図
８に示されるように、２点標準曲線は勿論５個のパッド
のアッセイ装置を用いて構成することができる。
全コレステロール、トリグリセリド、およびHDLに対
する信号値は標準曲線上にプロットされ、３個の分析物
パッドに対する自動補正された分析物濃度値を決定す
る。これらの数値から、LDLコレステロールを次の関係
式から計算することができる： LDLコレステロール＝全コレステロール −全トリグリセリド/5−HDLコレステロール 上述のことから、本発明の種々の目的および特徴に如
何に合致しているかが認められるだろう。アッセイ装置
は、流体試料を予備処理または遠心分離する必要がな
く、選択的に沈澱できる妨害化合物を含有する流体試料
中の分析物をアッセイするために簡単な１段階方法を提
供する。この特徴は特に妨害化合物を除去するために実
際に予備処理することができない少量の多数の分析物を
アッセイするために有用である。特に、この方法は少な
くとも１種の分析物、例えばHDLが関係するリポタンパ
ク質を選択的に除去する必要があるマルチ分析物アッセ
イに用いられるような一般的には50μｌ以下の少量の血
液を用いることを可能にする。
次の実施例はコレステロールおよび他の脂質テストの
ためのアッセイ装置の作成と使用を示す。これらの実施
例は説明のためのものであり、本発明の範囲を制限する
ものではない。
実施例１ HDLのためのアッセイ 図１に示したようなアッセイ装置を、セクションＡに
述べた好ましいフィルター材料を用いて作成した。スト
ック溶液Ａは2g/100mlの50,000ダルトンのデキストラン
サルフェートを含んでいた。ストック溶液Ｂは1Mの酢酸
マグネシウムを含んでいた。1/8″と5/16″と150ミクロ
ン厚さのグラスファイバーフィルターにストック溶液Ａ
およびＢを各々0.75μｌおよび2.21μｌの水を加えた。
フィルターを20分間50℃で乾燥し、上述のように、沈澱
剤含有貯蔵器として装置に組み入れた。
装置内の４個のテストパッドは上記のセクションＢに
記述した試薬を含んでいた。各反応パッドは、２×4mm
の長方形に切断された150ミクロン厚さのポリスルホン
フィルター（TR450;ゲルマン・サイエンシーズ、アン・
アーボァ、MI）から作成した。コレステロール測定のた
めの２個の反応パッドは、150U/mlのコレステロールエ
ステルヒドロラーゼ、10U/mlのコレステロールオキシダ
ーゼ、80U/mlのパーオキシダーゼ、および20mMの４−ア
ミノアンチピリン（４−AAP）と80mMのＮ−エチル−Ｎ
−スルホヒドロキシプロピル−Ｍ−トルイジン（TOOS）
を、濃縮された形で、中性pHのホスフェート緩衝液中に
含む10μｌの試薬溶液を浸出させた。参照標準用の２個
の反応パッドは、40U/mlのＤ−アミノ酸オキシダーゼ、
80U/mlのパーオキシダーゼ、および20mMの４−アミノア
ンチピリン（４−AAP）と80mMのTOOSを、濃縮された形
で、ホスフェート緩衝液中に浸出させて、乾燥した層を
含んでいた。次に３μｌの20mMのＤ−アミノ酸エタノー
ル溶液を加えて、パッドを乾燥させた。参照標準の分量
を、限定された反応緩衝液を含む液相アッセイ中で、限
定された反応条件下に換算し、非イオン性洗剤中の予定
された容量の既知濃度のコレステロール溶液から、同様
に測定されたコレステロール濃度と比べた。減圧下に乾
燥させた後、反応パッドを集めて装置中の反応パッドプ
レートに取付けた。
ヒトのテスト対象からの全血液試料を従来通りに得
て、４個のテストパッドを湿らせるに十分な分量で装置
内のウェルに塗布した。湿らせたパッドを室温で90秒
間、またはさらに着色の発生が観察されなくなるまでイ
ンキュベートした。
分析物関連の信号を、500〜700nmの照明波長で、反射
率分光光度計によって読み取った。参照標準パッドのた
めの数値をプロットして、コレステロールの示度を計算
する２点自動補正標準曲線を与えた。
実施例２ 血清HDLアッセイ 使用したアッセイ装置は図１を参照して述べたものと
似ており、実施例１に記載したように、貯蔵器を使用し
て作成し、中性pHでデキストランサルフェート（MW50,0
00）−Mg沈澱剤を含ませた。反応パッドの配合は、コレ
ステロールの酵素による測定のため、実施例１に記載し
たものと同じであった。1/8″と5/16″と150ミクロンの
厚さのグラスファイバフィルターを、５重量％のポリビ
ニルアルコールを用いて被覆し、その他は上記実施例１
と同様に用いた。
５種類の試料を、既知分量のHDLコレステロールを15
〜100mg/dLの範囲で濃度を変化させて、均一に間隔をあ
けた稀釈度で含むように、ヒト血清から調製した。全試
料のHDLコレステロールをアッセイ装置中で３回測定
し、その結果を表２に示した。
計算値または理論値（Ｙ軸）を、図11に示すように、
本発明のアッセイ装置で測定したときの試料に対して得
られた結果に対してプロットした。
この実施例によって示されるように、本発明の改良さ
れたアッセイ装置は、本発明との対比で、静脈血試料を
必要として液体試料の取扱いを含む液相テストと同じ正
確度を有するHDL測定値を与える。
実施例３ 血清脂質アッセイ このアッセイ装置は、図９を参照して述べたものと類
似しており、下にある篩分けパッド半分だけに近い試料
適用領域中に沈澱試薬貯蔵器を有し、実施例１に記載し
た貯蔵器および反応テストパッドの配合を用いて作成さ
れる。
反応パッドのための値は上記のように500〜700nmで測
定される。５番目のパッドからの反射率の測定は標準曲
線を構成するために用いられ、この曲線は実施例１に記
載したように既知のコレステロールとトリグリセリド濃
度に対して標準化される。最初の４個のパッドからの信
号値はこの曲線上にプロットされ、補正された分析物濃
度は濃度軸上の対応する位置から読み取られる。
全血清コレステロール、HDL、遊離コレステロールお
よびトリグリセリドは標準曲線から測定され、これらの
数値は上述のようにLDLを計算するために用いられる。
本発明は特定の実施例と構成を参照して記載したが、
種々の変化および変更が本発明から離れることなく行わ
れることは当業者によって高く評価されるだろう。

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】予定された濃度の沈澱剤にさらされる際
    に、選択的に沈澱させることができる低密度リポタンパ
    ク質（LDL）または超低密度リポタンパク質（VLDL）も
    含む流体試料中の高密度リポタンパク質（HDL）を測定
    するためのアッセイ装置が、 該試料がグラスファイバの篩分けマトリックスを通って
    該マトリックス中の試料適用位置から試料収集位置まで
    流れるとき、該流体試料中の沈澱物質から可溶物を分離
    することができる該篩分けマトリックス、該マトリック
    スはこのような沈殿剤の存在でマトリックスへのHDLの
    結合を妨げるために有効なコーティング物質を含む、 このような予定された濃度の範囲内にある該流体試料中
    に該沈澱剤濃度を生じさせるために有効な該マトリック
    スに流体試料が流入しこれを通過するとき、試薬貯蔵器
    から該マトリックス中に該剤を放出する速度を生み出す
    ための放出装置および該沈澱剤を含む該試薬貯蔵器、お
    よび 該試料収集位置にて収集される流体試料をアッセイする
    ことができるアッセイパッド から成る前記アッセイ装置。
  2. 【請求項２】該マトリックスがグラスファイバの網状組
    織から成り、該試薬貯蔵器が該ファイバ上に被覆されて
    いる、請求項１記載の装置。
  3. 【請求項３】該沈澱剤がポリアニオン性化合物および第
    II族の金属カチオンを含み、流体試料と接触して、極め
    て低密度のリポタンパク質、および低密度のリポタンパ
    ク質を選択的に沈澱するために有効な該化合物の濃度を
    生じさせる速度にて、該放出装置が該ポリアニオン性化
    合物を放出するために有効である、請求項１記載の装
    置。
  4. 【請求項４】該ポリアニオン性化合物が硫化多糖類、ヘ
    パリン、およびリンタングステン酸から成る群から選ば
    れ、第II族金属がMg2+、Mn2+、およびCa2+から成る群か
    ら選ばれる、請求項３記載の装置。
  5. 【請求項５】該ポリアニオン性化合物がデキストランサ
    ルフェートであり、該第II族金属がMg2+であり、そして
    該マトリックス中の該沈澱剤の濃度が、該流体試料と接
    触後、デキストランサルフェートに対して約0.5と1.0mg
    /mlの間であり、約0.045ないし0.15MのMg2+の間にあ
    る、請求項４記載の装置。
  6. 【請求項６】該マトリックスがグラスファイバの網状組
    織から成り、該コーティング物質が親水性ポリマーであ
    る、請求項１記載の装置。
  7. 【請求項７】前記コーティング物質がポリビニルアルコ
    ール、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコー
    ル、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンイミン、
    ポリビニルスルホン酸、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、
    ポリアクリル酸、ポリ（３−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ
    （４−スチレンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミ
    ドスルホン酸）、またはポリ−Ｌ−グルタメートから成
    る群から選ばれる、請求項６記載の装置。
  8. 【請求項８】該マトリックスが表面シリル基を有するグ
    ラスファイバの網状組織から成り、前記コーティング物
    質が、該表面シリル基を含み、シリルエーテルから成
    る、請求項１記載の装置。
  9. 【請求項９】コーティング物質がビス（ヒドロキシエチ
    ル）アミノプロピルトリエトキシシランのシリルモノま
    たはジエーテルから成る、請求項８記載の装置。
  10. 【請求項１０】血液流体試料中の低密度のリポタンパク
    質と極めて低密度のリポタンパク質とから高密度のリポ
    タンパク質を分離する方法が、 該試料を、高密度のリポタンパク質がグラスファイバに
    結合することを妨げるコーティングを有する該グラスフ
    ァイバのマトリックスに通過させ、および 該試料が前記マトリックスに流入し通るとき、該低密度
    のリポタンパク質と極めて低密度のリポタンパク質を選
    択的に沈澱するために有効な一定量を、該マトリックス
    に放出する、 工程から成る前記方法。
  11. 【請求項１１】該沈澱剤がポリアニオン性化合物および
    第II族金属カチオンを含む、請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】該ポリアニオン性化合物が硫化多糖類、
    ヘパリン、およびリンタングステン酸から成る群から選
    ばれ、そして該第II族金属がMg2+、Mn2+、およびCa2+か
    ら成る群から選ばれる、請求項11記載の方法。
  13. 【請求項１３】該マトリックス上の該コーティングがポ
    リビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ポリエチ
    レングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチ
    レンイミン、ポリビニルスルホン酸、ポリ（３−ヒドロ
    キシ酪酸）、ポリアクリル酸、ポリ（３−ヒドロキシ吉
    草酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（２−
    アクリルアミドスルホン酸）、またはポリ−Ｌ−グルタ
    メートから成る群から選ばれる、請求項10記載の方法。
  14. 【請求項１４】該マトリックスが表面シリル基を有する
    グラスファイバから成り、前記コーティングが、表面シ
    リル基を含み、シリルエーテルから成る、請求項10記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】該コーティングがビス（ヒドロキシエチ
    ル）アミノプロピルトリエトキシシランのシリルモノま
    たはジエーテルから成る、請求項14記載の方法。
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