JP2600065B2 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 - Google Patents
高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床診断の分野におい
て脂質代謝の面で重要な高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中の
コレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールという）
の定量法に関する。
て脂質代謝の面で重要な高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中の
コレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールという）
の定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコ
レステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステ
ロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとす
る各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベ
ルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となること
が知られている。従来のＨＤＬコレステロールの定量法
は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の
２段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学
的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用
いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤ
Ｌを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかし
ながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点があ
る。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡
散法（ＳＲＩＤ法）、オクタロニー法などがあるが、こ
れらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、
正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。
電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜
やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法に
よりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、
経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合に
は、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（Ｖ
ＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）の表面に存在す
るアポ蛋白Ｂにポリエチレングリコール、ヘパリン、リ
ンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオ
ンと２価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成さ
せ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のＨＤ
Ｌコレステロールを定量する（臨床検査法提要、第２９
版、金井泉著、金原出版、４７１頁、１９８３年）。こ
の方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離
操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検
査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向き
である。さらに、従来の分画法では、分離したＨＤＬ画
分を定量ピペットではかり取る場合などに人為的誤差も
生じ易い。以上のように、ＨＤＬコレステロール測定の
煩雑さは、その分画操作にある。しかしながら、単純に
ＨＤＬを分画せずに血清検体を直接コレステロールエス
テラーゼとコレステロールオキシダーゼが含有された試
薬に添加しても、総コレステロールを定量する系と変わ
りがなく、ＨＤＬコレステロールを特異的に定量できな
い。特開昭６３−１２６４９８には、コール酸類を添加
してその特異性を高めることが記載されているが、この
方法では、ＨＤＬのみならずＬＤＬ、ＶＬＤＬなども徐
々に反応し完全な反応終点が得られにくいことにより、
特異性が必ずしも充分でない。
レステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステ
ロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとす
る各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベ
ルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となること
が知られている。従来のＨＤＬコレステロールの定量法
は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の
２段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学
的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用
いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤ
Ｌを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかし
ながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点があ
る。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡
散法（ＳＲＩＤ法）、オクタロニー法などがあるが、こ
れらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、
正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。
電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜
やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法に
よりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、
経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合に
は、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（Ｖ
ＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）の表面に存在す
るアポ蛋白Ｂにポリエチレングリコール、ヘパリン、リ
ンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオ
ンと２価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成さ
せ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のＨＤ
Ｌコレステロールを定量する（臨床検査法提要、第２９
版、金井泉著、金原出版、４７１頁、１９８３年）。こ
の方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離
操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検
査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向き
である。さらに、従来の分画法では、分離したＨＤＬ画
分を定量ピペットではかり取る場合などに人為的誤差も
生じ易い。以上のように、ＨＤＬコレステロール測定の
煩雑さは、その分画操作にある。しかしながら、単純に
ＨＤＬを分画せずに血清検体を直接コレステロールエス
テラーゼとコレステロールオキシダーゼが含有された試
薬に添加しても、総コレステロールを定量する系と変わ
りがなく、ＨＤＬコレステロールを特異的に定量できな
い。特開昭６３−１２６４９８には、コール酸類を添加
してその特異性を高めることが記載されているが、この
方法では、ＨＤＬのみならずＬＤＬ、ＶＬＤＬなども徐
々に反応し完全な反応終点が得られにくいことにより、
特異性が必ずしも充分でない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、煩雑
な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの
定量法を提供することにある。
な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの
定量法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＤＬ以
外のリポ蛋白すなわちＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭを凝
集させる試薬の存在下、コレステロール反応試薬を用い
てコレステロール定量の酵素反応をさせることにより、
特に生成した凝集物を分離することなくＨＤＬを含有す
る試料中のＨＤＬコレステロールを特異的に定量できる
ことを見い出し、本発明に至った。
外のリポ蛋白すなわちＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭを凝
集させる試薬の存在下、コレステロール反応試薬を用い
てコレステロール定量の酵素反応をさせることにより、
特に生成した凝集物を分離することなくＨＤＬを含有す
る試料中のＨＤＬコレステロールを特異的に定量できる
ことを見い出し、本発明に至った。
【０００５】本発明は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集さ
せる試薬の存在下、ＨＤＬを含有する試料にコレステロ
ール加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または
コレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化
水素または還元型補酵素を定量することを特徴とするＨ
ＤＬ中のコレステロールの定量法に関する。
せる試薬の存在下、ＨＤＬを含有する試料にコレステロ
ール加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または
コレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化
水素または還元型補酵素を定量することを特徴とするＨ
ＤＬ中のコレステロールの定量法に関する。
【０００６】本発明方法は、血液、尿などのＨＤＬを含
有する体液に適用できる。次に、本発明の定量法の一例
について説明する。第一試薬として、ＨＤＬ以外のリポ
蛋白を凝集させる試薬を含む中性付近の緩衝液を調製す
る。また、第二試薬として、コレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ（またはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼ）、パーオキシダーゼ、４−アミノ
アンチピリンおよびトリンダー試薬〔またはＮＡＤ
（Ｐ）〕を含む緩衝液を調製する（トリンダー試薬は第
一試薬中に入れてもよい）。体液検体を一定量第一試薬
に添加し、例えば３７℃で数分間加温してＬＤＬ、ＶＬ
ＤＬおよびＣＭを凝集させる。これに第二試薬を添加、
攪拌して酵素反応させた後、コレステロールオキシダー
ゼにより過酸化水素が発生する場合には４−アミノアン
チピリンおよびトリンダー試薬から過酸化水素とパーオ
キシダーゼによって生成する色素の極大波長における吸
光度を測定し、コレステロールデヒドロゲナーゼを用い
る場合にはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を３００〜５００ｎ
ｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、例えば３４０ｎｍ
での吸光度で測定する（ジアホラーゼ、テトラゾリウム
塩を添加してホルマザン色素の発色に導き、ホルマザン
色素を比色定量することも可能である）。ＨＤＬコレス
テロール量は、別途一定量のコレステロールを含む標準
液で同じ操作を行い、比較計算する。なお、第一試薬と
第二試薬とを最初からまとめ、これに体液検体を添加し
て例えば３７℃で数分間加温し、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよ
びＣＭを凝集させてさらに酵素反応させることもでき
る。
有する体液に適用できる。次に、本発明の定量法の一例
について説明する。第一試薬として、ＨＤＬ以外のリポ
蛋白を凝集させる試薬を含む中性付近の緩衝液を調製す
る。また、第二試薬として、コレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ（またはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼ）、パーオキシダーゼ、４−アミノ
アンチピリンおよびトリンダー試薬〔またはＮＡＤ
（Ｐ）〕を含む緩衝液を調製する（トリンダー試薬は第
一試薬中に入れてもよい）。体液検体を一定量第一試薬
に添加し、例えば３７℃で数分間加温してＬＤＬ、ＶＬ
ＤＬおよびＣＭを凝集させる。これに第二試薬を添加、
攪拌して酵素反応させた後、コレステロールオキシダー
ゼにより過酸化水素が発生する場合には４−アミノアン
チピリンおよびトリンダー試薬から過酸化水素とパーオ
キシダーゼによって生成する色素の極大波長における吸
光度を測定し、コレステロールデヒドロゲナーゼを用い
る場合にはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を３００〜５００ｎ
ｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、例えば３４０ｎｍ
での吸光度で測定する（ジアホラーゼ、テトラゾリウム
塩を添加してホルマザン色素の発色に導き、ホルマザン
色素を比色定量することも可能である）。ＨＤＬコレス
テロール量は、別途一定量のコレステロールを含む標準
液で同じ操作を行い、比較計算する。なお、第一試薬と
第二試薬とを最初からまとめ、これに体液検体を添加し
て例えば３７℃で数分間加温し、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよ
びＣＭを凝集させてさらに酵素反応させることもでき
る。
【０００７】リポ蛋白を凝集させる試薬には凝集剤およ
び２価の金属塩が含まれる。凝集剤としては、ヘパリン
またはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキ
ストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、
硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ
糖またはその塩、もしくはこれらの混合物などがあげら
れ、シクロデキストリンとしては、α−シクロデキスト
リン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリ
ンなどがあげられ、オリゴ糖としては、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオースなどがあげられ、塩
としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、ア
ンモニウム塩、マグネシウム塩などがあげられる。２価
の金属塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩、マ
ンガン塩、ニッケル塩などがあげられる。
び２価の金属塩が含まれる。凝集剤としては、ヘパリン
またはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキ
ストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、
硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ
糖またはその塩、もしくはこれらの混合物などがあげら
れ、シクロデキストリンとしては、α−シクロデキスト
リン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリ
ンなどがあげられ、オリゴ糖としては、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオースなどがあげられ、塩
としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、ア
ンモニウム塩、マグネシウム塩などがあげられる。２価
の金属塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩、マ
ンガン塩、ニッケル塩などがあげられる。
【０００８】凝集剤としては、０．０２〜１０ｍＭの分
子量５０００〜２００００のヘパリンまたはその塩、
０．１〜１０ｍＭの分子量４０００〜８０００のリンタ
ングステン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子量
１００００〜５０００００のデキストラン硫酸またはそ
の塩、０．１〜２０ｍＭの分子量１０００〜１００００
のデキストラン硫酸またはその塩、０．３〜１００ｍＭ
の分子量４０００〜２５０００のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）、０．１〜５０ｍＭの分子量１０００〜３
０００の硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、０．
１〜５０ｍＭの分子量４００〜３０００の硫酸化オリゴ
糖またはその塩、もしくはそれらの混合物などが好まし
く用いられる。さらに好ましくは、０．０３〜１ｍＭの
分子量１４０００〜１６０００のヘパリンまたはその
塩、０．１〜３ｍＭの分子量５０００〜７０００のリン
タングステン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子
量１５００００〜２５００００のデキストラン硫酸また
はその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量１０００〜５００
０のデキストラン硫酸またはその塩、１．０〜５０ｍＭ
の分子量５０００〜２２０００のＰＥＧ、０．１〜１０
ｍＭの分子量１０００〜２０００の硫酸化シクロデキス
トリンまたはその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量４００
〜２０００の硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはそ
れらの混合物などが用いられる。
子量５０００〜２００００のヘパリンまたはその塩、
０．１〜１０ｍＭの分子量４０００〜８０００のリンタ
ングステン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子量
１００００〜５０００００のデキストラン硫酸またはそ
の塩、０．１〜２０ｍＭの分子量１０００〜１００００
のデキストラン硫酸またはその塩、０．３〜１００ｍＭ
の分子量４０００〜２５０００のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）、０．１〜５０ｍＭの分子量１０００〜３
０００の硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、０．
１〜５０ｍＭの分子量４００〜３０００の硫酸化オリゴ
糖またはその塩、もしくはそれらの混合物などが好まし
く用いられる。さらに好ましくは、０．０３〜１ｍＭの
分子量１４０００〜１６０００のヘパリンまたはその
塩、０．１〜３ｍＭの分子量５０００〜７０００のリン
タングステン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子
量１５００００〜２５００００のデキストラン硫酸また
はその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量１０００〜５００
０のデキストラン硫酸またはその塩、１．０〜５０ｍＭ
の分子量５０００〜２２０００のＰＥＧ、０．１〜１０
ｍＭの分子量１０００〜２０００の硫酸化シクロデキス
トリンまたはその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量４００
〜２０００の硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはそ
れらの混合物などが用いられる。
【０００９】２価の金属塩としては、０．１〜５０ｍＭ
のマグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケ
ル塩などがあげられ、好ましくは、０．１〜５０ｍＭの
マグネシウム塩が用いられる。
のマグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケ
ル塩などがあげられ、好ましくは、０．１〜５０ｍＭの
マグネシウム塩が用いられる。
【００１０】トリンダー試薬としては、Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレン
ジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチル
フェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ
−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピ
ル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−
３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシ
ジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチル
アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピル
アニリン、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安
息香酸、フェノールなどがあげられる。
−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレン
ジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチル
フェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ
−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピ
ル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−
３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシ
ジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチル
アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピル
アニリン、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安
息香酸、フェノールなどがあげられる。
【００１１】酵素としては、通常市販されている、コレ
ステロールエステルを加水分解する能力を有する微生物
または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプ
ロテインリパーゼ、コレステロールを酸化して過酸化水
素を生成する微生物由来のコレステロールオキシダー
ゼ、微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲ
ナーゼなどがあげられるが、これら酵素の特異性、安定
性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを主成
分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基
などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いられ
る。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられ
る。
ステロールエステルを加水分解する能力を有する微生物
または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプ
ロテインリパーゼ、コレステロールを酸化して過酸化水
素を生成する微生物由来のコレステロールオキシダー
ゼ、微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲ
ナーゼなどがあげられるが、これら酵素の特異性、安定
性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを主成
分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基
などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いられ
る。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられ
る。
【００１２】本発明の系は、通常のコレステロールを測
定する系を含んでいるため、コレステロールオキシダー
ゼを活性化するためによく使用される界面活性剤あるい
はコール酸類も使用可能であり、また、グロブリンなど
を可溶化するための種々の塩類を使用することもでき
る。界面活性剤としては、ノニオン系、アニオン系、カ
チオン系の界面活性剤が０〜１％の範囲で使用され、コ
ール酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、タウ
ロコール酸、ケノデオキシコール酸などが０〜５％の範
囲で使用され、塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチ
ウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１
００ｍＭの範囲で使用される。
定する系を含んでいるため、コレステロールオキシダー
ゼを活性化するためによく使用される界面活性剤あるい
はコール酸類も使用可能であり、また、グロブリンなど
を可溶化するための種々の塩類を使用することもでき
る。界面活性剤としては、ノニオン系、アニオン系、カ
チオン系の界面活性剤が０〜１％の範囲で使用され、コ
ール酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、タウ
ロコール酸、ケノデオキシコール酸などが０〜５％の範
囲で使用され、塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチ
ウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１
００ｍＭの範囲で使用される。
【００１３】緩衝剤としては、５〜５００ｍＭのトリ
ス、グッドの緩衝剤などが好適に使用される。ｐＨは５
〜９の範囲がよい。次に、実施例によって本発明の態様
を説明する。
ス、グッドの緩衝剤などが好適に使用される。ｐＨは５
〜９の範囲がよい。次に、実施例によって本発明の態様
を説明する。
【００１４】
実施例１ リンタングステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法
〔デタミナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈澱〕
（臨床化学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９
８７年）、直接ＨＤＬコレステロールを測定する本法お
よび特開昭６３−１２６４９８に記載のコール酸を用い
る方法（以下、Ａ法という）を比較した。
〔デタミナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈澱〕
（臨床化学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９
８７年）、直接ＨＤＬコレステロールを測定する本法お
よび特開昭６３−１２６４９８に記載のコール酸を用い
る方法（以下、Ａ法という）を比較した。
【００１５】 本法の組成 第一試薬 リンタングステン酸 １０ ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ７．５ ＥＭＳＥ ０．３ アジ化ナトリウム ０．１ 第二試薬 トリス ２０ ｍＭ（ｐＨ７） ４−アミノアンチピリン ０．５ ｍｇ／ｍｌ パーオキシダーゼ ３０ ｕ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ １ コレステロールオキシダーゼ １ 本法では、検体５０μｌを第一試薬２．２５ｍｌに添加
し、３７℃で５分間インキュベーションし、この時点で
一旦５５５ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ１）。次いで、
第二試薬を０．７５ｍｌ添加して攪拌し、５分後の同波
長における吸光度を測定した（Ｅ２）。ＨＤＬコレステ
ロールの濃度は、コレステロール濃度２００ｍｇ／ｄｌ
の標準液を用いて同様の操作を行い、（Ｅ２−Ｅ１）の
値を比較することにより算出した。
し、３７℃で５分間インキュベーションし、この時点で
一旦５５５ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ１）。次いで、
第二試薬を０．７５ｍｌ添加して攪拌し、５分後の同波
長における吸光度を測定した（Ｅ２）。ＨＤＬコレステ
ロールの濃度は、コレステロール濃度２００ｍｇ／ｄｌ
の標準液を用いて同様の操作を行い、（Ｅ２−Ｅ１）の
値を比較することにより算出した。
【００１６】沈澱法では遠心分離後日立７２５０自動分
析機を用いてデタミナーＬＴＣ（協和メデックス社製）
で測定した。結果を第１表に示す。
析機を用いてデタミナーＬＴＣ（協和メデックス社製）
で測定した。結果を第１表に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】本法は、現在ＨＤＬコレステロールの測定
法として常用されているリンタングステン酸−デキスト
ラン硫酸−Ｍｇ沈殿法とよい相関を示した。 実施例２ 第一試薬に用いる凝集剤および２価の金属塩を種々組み
換える以外は実施例１の本法と同様の操作を行い、血清
検体３０検体を日立７２５０自動分析機（検体４μｌ、
第一試薬３００μｌ、第二試薬１００μｌの条件）でそ
れぞれ測定した。沈澱法との相関を相関係数（Ｒ）でみ
た。
法として常用されているリンタングステン酸−デキスト
ラン硫酸−Ｍｇ沈殿法とよい相関を示した。 実施例２ 第一試薬に用いる凝集剤および２価の金属塩を種々組み
換える以外は実施例１の本法と同様の操作を行い、血清
検体３０検体を日立７２５０自動分析機（検体４μｌ、
第一試薬３００μｌ、第二試薬１００μｌの条件）でそ
れぞれ測定した。沈澱法との相関を相関係数（Ｒ）でみ
た。
【００１９】結果を第２表に示す。 第一試薬の組成 Ａ． リンタングステン酸 １０ ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ７．５ ＥＭＳＥ ０．３ Ｂ． デキストラン硫酸 ナトリウム(MW=4000) ７．５ ｍｇ／ｍｌ（１．９ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 １０ ＥＭＳＥ ０．３ Ｃ． ヘパリンナトリウム １０ ｍｇ／ｍｌ（０．７ｍＭ） 塩化Ｃａ・２水和物 １０ ＥＭＳＥ ０．３ Ｄ． リンタングステン酸 １０ ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ） デキストラン硫酸 ナトリウム(MW=200000) ７．５ （１．９ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ７．５ ＥＭＳＥ ０．３ Ｅ． リンタングステン酸 １０ ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ） ヘパリンナトリウム ７．５ （０．５ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ７．５ ＥＭＳＥ ０．３ Ｆ． リンタングステン酸 １０ ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ） ＰＥＧ６０００ ７．５ （１．２５ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ７．５ ＥＭＳＥ ０．３ Ｇ． ＰＥＧ６０００ ５ ｍｇ／ｍｌ（0.８３ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ５ ＥＭＳＥ ０．３ Ｈ． 硫酸化 α−シクロデキストリン １ ｍｇ／ｍｌ（０．８ｍＭ） 塩化Ｍｇ・６水和物 ５ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）− ｍ−トルイジン ０．６ Ｉ． 硫酸化 マルトヘプタオース ２ ｍｇ／ｍｌ（０．６ｍＭ） 塩化Ｍｇ・６水和物 ５ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３， ５−ジメトキシアニリン ０．７
【００２０】
【表２】
【００２１】実施例３ 第一試薬に添加される２価の金属塩の種類を変え添加量
を３０ｍＭとして実施例１の本法と同様の操作を行い、
血清検体３０検体を日立７２５０自動分析機（検体４μ
ｌ、第一試薬３００μｌ、第二試薬１００μｌの条件）
でそれぞれ測定した。沈澱法との相関を相関係数（Ｒ）
でみた。
を３０ｍＭとして実施例１の本法と同様の操作を行い、
血清検体３０検体を日立７２５０自動分析機（検体４μ
ｌ、第一試薬３００μｌ、第二試薬１００μｌの条件）
でそれぞれ測定した。沈澱法との相関を相関係数（Ｒ）
でみた。
【００２２】結果を第３表に示す。 組成 第一試薬 リンタングステン酸 １０ ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ） （２価金属塩 ３０ ｍＭ） ＥＭＳＥ ０．３ 塩化ナトリウム ５ アジ化ナトリウム ０．１ 第二試薬 トリス ２０ ｍＭ（ｐＨ７） ４−アミノアンチピリン ０．５ ｍｇ／ｍｌ コール酸ナトリウム ５ パーオキシダーゼ ３０ ｕ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ １ コレステロールオキシダーゼ １
【００２３】
【表３】
【００２４】実施例４ サンブライト４００１（日本油脂）を用いコレステロー
ルエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼをポ
リエチレングリコール（分子量６０００）で化学修飾
し、これを用いて下記に示す組成で実施例１の本法と同
様の操作を行った。結果を第４表に示す。
ルエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼをポ
リエチレングリコール（分子量６０００）で化学修飾
し、これを用いて下記に示す組成で実施例１の本法と同
様の操作を行った。結果を第４表に示す。
【００２５】なお、化学修飾は、以下のようにして行っ
た。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に酵素（１０ｍｇ
／ｍｌ）を溶解させて５℃に冷却後、これに２０倍モル
のサンブライト４００１を添加して溶解させ、５℃で４
時間反応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せ
ずそのまま酵素溶液として用いた。
た。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に酵素（１０ｍｇ
／ｍｌ）を溶解させて５℃に冷却後、これに２０倍モル
のサンブライト４００１を添加して溶解させ、５℃で４
時間反応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せ
ずそのまま酵素溶液として用いた。
【００２６】 組成 第一試薬 リンタングステン酸 １０ ｍｇ／ｍｌ（１．７ｍＭ） デキストラン硫酸 ナトリウム(MW=4000) ７．５ （１．９ｍＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ７．５ ＥＭＳＥ ０．３ 塩化ナトリウム ５ アジ化ナトリウム ０．１ アスコルビン酸 オキシダーゼ １ ｕ／ｍｌ 第二試薬 トリス ２０ ｍＭ（ｐＨ７） ４−アミノアンチピリン ０．５ ｍｇ／ｍｌ コール酸ナトリウム ５ パーオキシダーゼ ３０ ｕ／ｍｌ 修飾コレステロール エステラーゼ １ 修飾コレステロール オキシダーゼ １
【００２７】
【表４】
【００２８】実施例５ 組成 試薬 ピペラジン−１，４−ビス（２− エタンスルホニックアシッド）［同仁化学研究所（株）］ ３ ｍｇ／ｍｌ（９．９ｍＭ） （ｐＨ７） ＥＭＳＥ ０．３ デキストラン硫酸 ナトリウム ０．７ ｍｇ／ｍｌ（１．４μＭ） 硫酸Ｍｇ・７水和物 ７ ４−アミノアンチピリン ０．５ パーオキシダーゼ ５ ｕ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ １ コレステロールオキシダーゼ ５
【００２９】リンタングステン酸−デキストラン硫酸−
Ｍｇ沈殿法でＨＤＬコレステロール濃度が３８．９ｍｇ
／ｄｌと測定された検体５０μｌを上記試薬３ｍｌに添
加し、２０秒後に一旦５５５ｎｍの吸光度を測定した
（Ｅ１）。次いで、３７℃で５分間インキュベーション
し、直ちに同波長における吸光度を測定した（Ｅ２）。
ＨＤＬコレステロールの濃度は、コレステロール濃度２
００ｍｇ／ｄｌの標準液を用いて同様の操作を行い、
（Ｅ２−Ｅ１）の値を比較することにより算出した。そ
の結果、ＨＤＬコレステロール濃度は３９．１ｍｇ／ｄ
ｌと算出され、沈澱法で得られた結果とほぼ一致した。
Ｍｇ沈殿法でＨＤＬコレステロール濃度が３８．９ｍｇ
／ｄｌと測定された検体５０μｌを上記試薬３ｍｌに添
加し、２０秒後に一旦５５５ｎｍの吸光度を測定した
（Ｅ１）。次いで、３７℃で５分間インキュベーション
し、直ちに同波長における吸光度を測定した（Ｅ２）。
ＨＤＬコレステロールの濃度は、コレステロール濃度２
００ｍｇ／ｄｌの標準液を用いて同様の操作を行い、
（Ｅ２−Ｅ１）の値を比較することにより算出した。そ
の結果、ＨＤＬコレステロール濃度は３９．１ｍｇ／ｄ
ｌと算出され、沈澱法で得られた結果とほぼ一致した。
【００３０】実施例６ （１）デキストランを修飾する試薬であるＴ４０，ＴＣ
Ｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ベーリンガー社製）でコレス
テロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダー
ゼを化学修飾したもの、（２）ポリウレタンを修飾する
試薬であるポリウレタンＰ４０００−ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ（ベーリンガー社製）でコレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼを化学修飾したも
の、および（３）１，３−プロパンサルトンでコレステ
ロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ
を化学修飾したものを用い、また、検体としてリンタン
グステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法でＨＤＬコ
レステロール濃度が３８．９ｍｇ／ｄｌと測定された検
体５０μｌを用いて、実施例４と同様の操作を行った。
その結果、ＨＤＬコレステロール濃度はそれぞれ（１）
３９．７ｍｇ／ｄｌ、（２）３８．２ｍｇ／ｄｌおよび
（３）３９．０ｍｇ／ｄｌと算出され、沈澱法で得られ
た結果とほぼ一致した。
Ｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ベーリンガー社製）でコレス
テロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダー
ゼを化学修飾したもの、（２）ポリウレタンを修飾する
試薬であるポリウレタンＰ４０００−ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ（ベーリンガー社製）でコレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼを化学修飾したも
の、および（３）１，３−プロパンサルトンでコレステ
ロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ
を化学修飾したものを用い、また、検体としてリンタン
グステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法でＨＤＬコ
レステロール濃度が３８．９ｍｇ／ｄｌと測定された検
体５０μｌを用いて、実施例４と同様の操作を行った。
その結果、ＨＤＬコレステロール濃度はそれぞれ（１）
３９．７ｍｇ／ｄｌ、（２）３８．２ｍｇ／ｄｌおよび
（３）３９．０ｍｇ／ｄｌと算出され、沈澱法で得られ
た結果とほぼ一致した。
【００３１】なお、化学修飾は、以下のようにして行っ
た。 （１），（２） ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に酵
素（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解させて５℃に冷却後、これ
に２０倍モルのＴ４０，ＴＣＴ−ａｃｔｉｖａｔｅｄま
たはポリウレタンＰ４０００−ａｃｔｉｖａｔｅｄを添
加して溶解させ、５℃で４時間反応させた。得られた化
学修飾酵素は、精製分離せずそのまま酵素溶液として用
いた。
た。 （１），（２） ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に酵
素（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解させて５℃に冷却後、これ
に２０倍モルのＴ４０，ＴＣＴ−ａｃｔｉｖａｔｅｄま
たはポリウレタンＰ４０００−ａｃｔｉｖａｔｅｄを添
加して溶解させ、５℃で４時間反応させた。得られた化
学修飾酵素は、精製分離せずそのまま酵素溶液として用
いた。
【００３２】（３） ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）
に酵素（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解させ、これに２０倍モ
ルの１，３−プロパンサルトンのジメチルホルムアミド
溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で２４時間反
応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せずその
まま酵素溶液として用いた。
に酵素（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解させ、これに２０倍モ
ルの１，３−プロパンサルトンのジメチルホルムアミド
溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で２４時間反
応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せずその
まま酵素溶液として用いた。
【００３３】
【発明の効果】本発明により、煩雑な分画分離操作の不
要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法が提供され
る。
要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法が提供され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 上釜 兼人 熊本県熊本市長嶺町1716−80 (72)発明者 大澤 進 千葉県四街道市みそら４−17−９ (56)参考文献 特開 平６−242110（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−210265（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】 高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）以外のリポ蛋
白を凝集させる試薬を含む緩衝液の存在下、ＨＤＬを含
有する試料にコレステロールエステル加水分解酵素およ
びコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素
酵素を作用させて、生成した凝集物を分離することな
く、緩衝液中に生成する過酸化水素または還元型補酵素
を定量することを特徴とするＨＤＬ中のコレステロール
の定量法。 - 【請求項２】 ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬
がヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはそ
の塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレング
リコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫
酸化オリゴ糖またはその塩もしくはこれらの混合物、お
よび２価の金属塩からなる請求項１記載のＨＤＬ中のコ
レステロールの定量法。 - 【請求項３】 コレステロールエステル加水分解酵素、
コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵
素が化学修飾されたコレステロールエステラーゼ、化学
修飾されたコレステロールオキシダーゼまたは化学修飾
されたコレステロールデヒドロゲナーゼである請求項１
記載のＨＤＬ中のコレステロールの定量法。
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|---|---|---|---|
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| TW084102147A TW265413B (ja) | 1994-03-08 | 1995-03-07 | |
| US08/545,722 US5691159A (en) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Method of determining the amount of cholesterol in a high-density lipoprotein |
| CN95190280A CN1072723C (zh) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | 高密度脂蛋白中胆固醇的定量方法 |
| DE0699767T DE699767T1 (de) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Verfahren zur bestimmung von cholesterin in high-density lipoproteinen |
| ES95910768T ES2106694T3 (es) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Procedimiento para la determinacion de colesterol en las lipoproteinas de alta densidad. |
| DK95910768T DK0699767T3 (da) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Fremgangsmåde til bestemmelse af cholesterolmængden i et high-density-lipoprotein |
| AT95910768T ATE204330T1 (de) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Verfahren zur bestimmung von cholesterin in high- density lipoproteinen |
| AU18619/95A AU677514C (en) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Method of determining cholesterol in high-density lipoprotein |
| DE69522159T DE69522159T2 (de) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Verfahren zur bestimmung von cholesterin in high-density lipoproteinen |
| KR1019950704963A KR100188576B1 (ko) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | 고밀도 리포단백질중의 콜레스테롤의 정량법 |
| CA002162289A CA2162289C (en) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Method of determining the amount of cholesterol in a high-density lipoprotein |
| PCT/JP1995/000378 WO1995024502A1 (fr) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Procede de recherche du cholesterol dans les lipoproteines haute densite |
| EP95910768A EP0699767B1 (en) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Method of determining cholesterol in high-density lipoprotein |
| US08/966,646 US5888755A (en) | 1994-03-08 | 1997-11-10 | Method of determining the amount of cholesterol in a high-density lipoprotein |
| HK97102215A HK1000716A1 (en) | 1994-03-08 | 1997-11-20 | Method of determining cholesterol in high-density lipoprotein |
| GR980300003T GR980300003T1 (en) | 1994-03-08 | 1998-02-27 | Method of determining cholesterol in high-density lipoprotein |
| GR20010401871T GR3036998T3 (en) | 1994-03-08 | 2001-10-24 | Method of determining cholesterol in high-density lipoprotein |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-37328 | 1994-03-08 | ||
| JP3732894 | 1994-03-08 | ||
| JP6-217224 | 1994-09-12 | ||
| JP21722494 | 1994-09-12 | ||
| JP6296137A JP2600065B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-11-30 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08131197A JPH08131197A (ja) | 1996-05-28 |
| JP2600065B2 true JP2600065B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=27289429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6296137A Expired - Lifetime JP2600065B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-11-30 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0699767B1 (ja) |
| JP (1) | JP2600065B2 (ja) |
| KR (1) | KR100188576B1 (ja) |
| CN (1) | CN1072723C (ja) |
| AT (1) | ATE204330T1 (ja) |
| CA (1) | CA2162289C (ja) |
| DE (2) | DE69522159T2 (ja) |
| DK (1) | DK0699767T3 (ja) |
| ES (1) | ES2106694T3 (ja) |
| GR (2) | GR980300003T1 (ja) |
| HK (1) | HK1000716A1 (ja) |
| TW (1) | TW265413B (ja) |
| WO (1) | WO1995024502A1 (ja) |
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| US6979552B2 (en) | 2000-11-14 | 2005-12-27 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of lipid assay and reagent for use therein |
| WO2007007443A1 (ja) | 2005-07-11 | 2007-01-18 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
| EP2080810A1 (en) | 1997-08-27 | 2009-07-22 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Methods for quantitating high-density lipoprotein cholesterol |
| US7682831B2 (en) | 2002-11-27 | 2010-03-23 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method of measuring lipid in specific lipoprotein |
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| JP3695596B2 (ja) * | 1994-05-13 | 2005-09-14 | 東洋紡績株式会社 | 生体成分の測定方法および測定用試薬組成物 |
| JP3256241B2 (ja) * | 1995-03-16 | 2002-02-12 | 協和メデックス株式会社 | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
| EP0764848A4 (en) * | 1995-03-20 | 2001-04-11 | Kyowa Medex Co Ltd | METHOD FOR QUANTIFYING CHOLESTEROL IN LOW DENSITY OR VERY LOW DENSITY LIPOPROTEIN |
| US5888750A (en) * | 1997-05-30 | 1999-03-30 | Synsorb Biotech, Inc. | Method of recovering shiga-like toxins and vaccines comprising inactivated shiga-like toxin |
| DE69840725D1 (de) * | 1997-06-25 | 2009-05-20 | Sysmex Corp | Methode und reagenzien zum bestimmen von substanzen in biologischen proben |
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| JP4428863B2 (ja) * | 1998-09-18 | 2010-03-10 | 協和メデックス株式会社 | リポ蛋白中のコレステロールの分別定量方法および定量用試薬 |
| ATE330026T1 (de) * | 1999-06-21 | 2006-07-15 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | Verfahren zum vorbehandeln von proben und zum quantifizieren von cholesterin in spezifischen lipoproteinen |
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| US20020016597A1 (en) * | 2000-08-02 | 2002-02-07 | Dwyer Clifford J. | Delivery apparatus for a self-expanding stent |
| DE60318685T2 (de) | 2002-01-30 | 2008-12-24 | Denka Seiken Co., Ltd. | Verfahren zur quantifizierung von cholesterin in hd-(high density)-lipoprotein und reagenszusammensetzungen |
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| US20050186652A1 (en) * | 2002-02-22 | 2005-08-25 | Wong Luet L. | Electrochemical detection |
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