JP2653755B2 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 - Google Patents
高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法Info
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Description
て脂質代謝の面で重要な高密度リポ蛋白(HDL)に含
まれるコレステロール(以下、HDLコレステロールと
いう)の定量法に関する。
レステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステ
ロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとす
る各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベ
ルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となること
が知られている。従来のHDLコレステロールの定量法
は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の
2段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学
的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用
いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってHD
Lを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかし
ながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点があ
る。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡
散法(SRID法)、オクタロニー法などがあるが、こ
れらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、
正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。
電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜
やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法に
よりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、
経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合に
は、低密度リポ蛋白(LDL)、超低密度リポ蛋白(V
LDL)およびカイロミクロン(CM)の表面に存在す
るアポ蛋白Bにポリエチレングリコール、ヘパリン、リ
ンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオ
ンと2価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成さ
せ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のHD
Lコレステロールを定量する(臨床検査法提要、第29
版、金井泉著、金原出版、471頁、1983年)。こ
の方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離
操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検
査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向き
である。さらに、従来の分画法では、分離したHDL画
分を定量ピペットではかり取る場合などに人的誤差も生
じ易い。以上のように、HDLコレステロール測定の煩
雑さは、その分画操作にある。しかしながら、単純にH
DLを分画せずに血清検体を直接コレステロールエステ
ラーゼとコレステロールオキシダーゼが含有された試薬
に添加しても、総コレステロールを定量する系と変わり
がなく、HDLコレステロールを特異的に定量できな
い。特開昭63−126498には、コール酸類を添加
してその特異性を高めることが記載されているが、この
方法では、HDLのみならずLDL、VLDLなども徐
々に反応し完全な反応終点が得られにくいことにより、
特異性が必ずしも充分でない。
な分画分離操作の不要な簡便なHDLコレステロールの
定量法を提供することにある。
および蛋白可溶化剤を存在させたコレステロール測定試
薬の系により超遠心で分画されたHDL、LDL、VL
DLおよびCMの各リポ蛋白を用いて測定したところ、
糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせにより各リポ
蛋白との反応性が異なり、その結果HDLコレステロー
ル、LDLコレステロール、VLDLコレステロール、
CMコレステロールの反応性が異なることを見い出し、
本発明に至った。
在下、試料中のLDL、VLDLおよびCM中のコレス
テロール量を測定し、試料中の総コレステロール量との
差を求めることを特徴とするHDLコレステロールの定
量法に関する。また、本発明により、糖化合物および蛋
白可溶化剤存在下、試料中のHDL中のコレステロール
量を測定することを特徴とするHDLコレステロールの
定量法を提供することができる。
は異なって水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換
もしくは非置換のアルカノイル、スルホ、−(グルコシ
ル)p−H(式中、pは1または2を表す)または−
(マルトシル)q −H(式中、qは1または2を表す)
を表し、mは6〜8の整数を表す〕で表される化合物ま
たは一般式(II)
は5〜2000の整数を表す)で表される化合物が好ま
しく用いられる。また、試料中のLDL、VLDLおよ
びCM中のコレステロール量を測定する際の蛋白可溶化
剤としては、一般式(III )
は0または1を表し、R5 はR14−X−O−(式中、R
14はアルキルまたはアルケニルを表し、Xは単結合また
はCOを表す)またはH−(CH2 CH2 O)c −N
(R15)−(式中、cは1〜200の整数を表し、R15
はアルキルまたはアルケニルを表す)を表し、R6 はア
ルキルまたはアルケニルを表す〕で表される化合物、一
般式(IV)
よびR12は同一または異なってアルカノイルを表す)で
表される化合物または一般式(V)
を表し、Yは
アルキルまたはアルケニルを表す)、−CH2 CH(O
H)(CH2 )d −(式中、dは1〜22の整数を表
す)、−CH=CH(CH2 )e −(式中、eは1〜2
2の整数を表す)、−OCOCH(CH2 COOR17)
−(式中、R17はアルキルまたはアルケニルを表す)ま
たはこれらの混合物を表す〕で表される化合物が、試料
中のHDL中のコレステロール量を測定する際の蛋白可
溶化剤としては、一般式(VI)
を表す)で表される化合物、一般式(VII )
を表す)で表される化合物、一般式(VIII)
20はアルキルを表す)で表される化合物または胆汁酸類
が好ましく用いられる。以下、一般式(I)〜一般式
(VIII)で表される化合物をそれぞれ化合物(I)〜化
合物(VIII)という。一般式(I)〜一般式(VIII)の
各基の定義において、アルキルおよびアルカノイルのア
ルキル部分としては、直鎖または分枝状の炭素数1〜2
2の、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert- ブチル、
ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘ
プチル、デシル、ペンタデシル、イコサニル、ドコサニ
ルなどがあげられ、アルケニルとしては、炭素数2〜2
2の、例えば、ビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテ
ニル、ヘキセニル、ヘプテニル、デセニル、ペンタデセ
ニル、イコセニル、ドコセニルなどがあげられる。
換基としては、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スル
ホなどがあげられる。胆汁酸類としては、例えば一般式
(IX)
って水素、−OR25(式中、R25は水素、スルホまたは
SO3 Naを表す)またはオキソを表し、R23は水素ま
たは−OR25(式中、R25は前記と同義である)を表
し、R24は水素、アルキル、アルケニルまたは金属を表
す〕で表される化合物があげられる。金属としては、ナ
トリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウ
ム、カルシウムなどのアルカリ土類金属などがあげら
れ、アルキルおよびアルケニルは前記と同義である。
合物(II)の中でもシクロデキストリン誘導体が、特に
メチル化シクロデキストリンなどが好ましく用いられ
る。例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキ
ストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シ
クロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリ
ン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、2−
ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、2−ヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、カルボキ
シメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−
シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキスト
リン、マルトシル−β−シクロデキストリン、パーシャ
リーメチル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキ
ストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフ
ェートなどがあげられる。
コレステロール量を測定する際の蛋白可溶化剤として
は、化合物(III )、化合物(IV)または化合物(V)
などの界面活性剤の中でも、特にノニオン系界面活性
剤、アニオン系界面活性剤などが好ましく用いられる。
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエ
チレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエ
ーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリ
オキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン
ベヘニルエーテル、ポリオキシエチレンモノラウレー
ト、ポリオキシエチレンモノステアレート、ポリオキシ
エチレンモノオレエート、ポリオキシエチレンラウリル
アミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン、しょ糖
脂肪酸エステルなどがあげられ、アニオン系界面活性剤
としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸ナトリウム、高級アルコール硫酸エス
テルソーダなどがあげられる。
定する際の蛋白可溶化剤としては、化合物(VI)、化合
物(VII )、化合物(VIII)または胆汁酸類などの界面
活性剤の中でも、特にカチオン系界面活性剤、アニオン
系界面活性剤、ノニオン系界面活性剤、胆汁酸塩などが
好ましく用いられる。カチオン系界面活性剤としては、
例えば、オキシエチレンドデシルアミン、ポリオキシエ
チレンドデシルアミン、ポリオキシエチレンオクタデシ
ルアミンなどがあげられ、アニオン系界面活性剤として
は、例えば、ココイルメチルタウリン酸ナトリウム、ラ
ウロイルメチルタウリン酸ナトリウム、ミリストイルメ
チルタウリン酸ナトリウム、パルミトイルメチルタウリ
ン酸ナトリウム、ステアロイルメチルタウリン酸ナトリ
ウムなどがあげられ、ノニオン系界面活性剤としては、
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオ
キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテルなどがあげら
れ、胆汁酸塩としては、例えば、コール酸ナトリウム、
デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナ
トリウム、ウルソデオキシコール酸ナトリウム、リトコ
ール酸ナトリウム、イソケノデオキシコール酸ナトリウ
ム、7−オキソリトコール酸ナトリウム、12−オキソ
リトコール酸ナトリウム、12−オキソケノデオキシコ
ール酸ナトリウム、7−オキソデオキシコール酸ナトリ
ウムなどがあげられる。
コレステロール測定試薬系と共存させる点に特徴を有す
るものであり、コレステロール測定系自体は下記の反応
原理に基づく一般法に従うものである。ただし、色原体
および測定波長はこれに限定されるものではない。
いはコレステロール酸化酵素としては、通常市販されて
いる、コレステロールエステルを加水分解する能力を有
する微生物または動物由来のコレステロールエステラー
ゼやリポプロテインリパーゼ、コレステロールを酸化し
て過酸化水素を生成する微生物由来のコレステロールオ
キシダーゼなどがあげられるが、これら酵素の特異性、
安定性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを
主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピ
ル基などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いら
れる。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられ
る。
有する体液に適用できる。次に、本発明の定量法につい
て説明する。本発明を実施するに際しては、まず、糖化
合物溶液および蛋白可溶化剤溶液を調製する。糖化合物
溶液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば50mM T
ris−HCl緩衝液(pH7.4)に溶解し、反応時
に例えば100mM以下、好ましくは3〜80mMの濃
度になるように調製する。なお、糖化合物はあらかじめ
コレステロール測定試薬中に共存させておいてもよい。
蛋白可溶化剤溶液は、コレステロール測定試薬と共存さ
せ、反応時に例えば50g/l以下、好ましくは0.1
〜20g/lの濃度になるように調製する。試薬は、糖
化合物溶液およびコレステロール測定試薬が共存した蛋
白可溶化剤溶液から調製し、20〜50℃、好ましくは
30〜40℃で約5分保温する。次いで、上記試薬に試
料そのものもしくは必要に応じて水あるいは生理食塩水
で希釈した試料を加え、5〜30分間反応させる。反応
終了後、反応液の吸光度を500〜600nm、例えば
555nmで測定し、コレステロール量を算出する。試
料中のLDL、VLDLおよびCM中のコレステロール
量を測定した場合には、別に総コレステロール量を求
め、これらの差を求めることによりHDLコレステロー
ルが定量できる。
LDL、VLDLおよびCMの各フラクションを使用し
て上記試薬によりコレステロール量を測定した。その結
果、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせによりH
DLコレステロール、LDLコレステロール、VLDL
コレステロール、CMコレステロールの反応性が異な
り、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせにより各
リポ蛋白との反応性が異なることが確認された。
および蛋白可溶化剤ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル5g/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白
の反応性の差を第1表に示す。
ル−β−シクロデキストリン5mMおよび蛋白可溶化剤
5g/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の
反応性の差を第2表に示す。
および蛋白可溶化剤オキシエチレンドデシルアミン5g
/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の反応
性の差を第3表に示す。
ル−β−シクロデキストリン5mMおよび蛋白可溶化剤
5g/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の
反応性の差を第4表に示す。
または第2表の組み合わせの場合はLDL、VLDLお
よびCM中のコレステロール量から間接的にHDL中の
コレステロール量を測定することができ、第3表または
第4表の組み合わせの場合は直接的にHDL中のコレス
テロール量を測定することができる。次に、実施例によ
って本発明の態様を説明する。
キシエチレンラウリルアミン(5g/l)、コレステロ
ールエステラーゼ(1.0U/ml)、コレステロール
オキシダーゼ(5.0U/ml)、4−アミノアンチピ
リン(2.2mM)、EMSE(1.1mM)および3
0mMグッド緩衝液(pH6.75)からなる試薬を調
製した。試料としては、血清から超遠心で分画されたL
DL、VLDL、CMの混合サンプルを用いた。あらか
じめ37℃で加温した上記試薬3mlにサンプル50μ
lを混和し、37℃で15分間反応させ、得られた溶液
の555nmにおける吸光度を測定した。
L+VLDL+CMコレステロール濃度と吸光度との相
関関係を示すもので、LDL+VLDL+CMコレステ
ロール濃度は吸光度とよい相関を示した。
混合サンプルの代わりに血清サンプルを用いる以外は実
施例1と同様の操作を行って吸光度を測定し、第1図を
基準に血清サンプル中のLDL+VLDL+CMコレス
テロール濃度(A)を求めた。別に、血清サンプル中の
総コレステロール濃度(B)を、酵素法のコレステロー
ル測定試薬で測定し、求めた。HDLコレステロール濃
度は[(B)−(A)]とした。対照法として、デキス
トラン硫酸−リンタングステン酸−Mg沈殿法〔デタミ
ナーHDL(協和メデックス社製)で沈殿〕(臨床化
学、初版、荻三男著、医典社、110頁、1987年)
を用いて、血清サンプル中のHDLコレステロール濃度
を求めた。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数r=0.
8320(n=20)〕。
キシエチレンラウリルアミン(5g/l)、コレステロ
ールエステラーゼ(1.0U/ml)、コレステロール
オキシダーゼ(5.0U/ml)、4−アミノアンチピ
リン(2.2mM)、EMSE(1.1mM)および3
0mMグッド緩衝液(pH6.75)からなる試薬の代
わりにヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン(1
0mM)、ポリオキシエチレンモノラウレート(0.5
g/l)、コレステロールエステラーゼ(1.0U/m
l)、コレステロールオキシダーゼ(5.0U/m
l)、4−アミノアンチピリン(2.2mM)、EMS
E(1.1mM)、30mMグッド緩衝液(pH6.7
5)からなる試薬を用いる以外は実施例2と同様の操作
を行い、沈殿法による結果と比較した。
結果は沈殿法による結果と良好な相関を示した。
キシエチレンラウリルアミン(5g/l)、コレステロ
ールエステラーゼ(1.0U/ml)、コレステロール
オキシダーゼ(5.0U/ml)、4−アミノアンチピ
リン(2.2mM)、EMSE(1.1mM)および3
0mMグッド緩衝液(pH6.75)からなる試薬の代
わりにジメチル−β−シクロデキストリン(5mM)、
コレステロールエステラーゼ(1.0U/ml)、コレ
ステロールオキシダーゼ(5.0U/ml)、4−アミ
ノアンチピリン(2.2mM)、EMSE(1.1m
M)および30mMグッド緩衝液(pH6.75)から
なる試薬を用いる以外は実施例2と同様の操作を行い、
沈殿法による結果と比較した。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数r=0.
969(n=20)〕。
エチレンドデシルアミン(0.25g/l)、コレステ
ロールエステラーゼ(1.0U/ml)、コレステロー
ルオキシダーゼ(5.0U/ml)、4−アミノアンチ
ピリン(2.2mM)、EMSE(1.1mM)、30
mMグッド緩衝液(pH6.75)からなる試薬を調製
した。試料としては、血清から超遠心で分画されたHD
Lのサンプルを用いた。あらかじめ37℃で加温した上
記試薬3mlにサンプル50μlを混和し、37℃で1
5分間反応させ、得られた溶液の555nmにおける吸
光度を測定した。
Lコレステロール濃度と吸光度との相関関係を示すもの
で、HDLコレステロール濃度は吸光度とよい相関を示
した。
に血清サンプルを用いる以外は実施例5と同様の操作を
行って吸光度を測定し、第2図を基準に血清サンプル中
のHDLコレステロール濃度を求めた。対照法として、
デキストラン硫酸−リンタングステン酸−Mg沈殿法
〔デタミナーHDL(協和メデックス社製)で沈殿〕
(臨床化学、初版、荻三男著、医典社、110頁、19
87年)を用いて、血清サンプル中のHDLコレステロ
ール濃度を求めた。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数r=0.
889(n=20)〕。
エチレンドデシルアミン(0.25g/l)、コレステ
ロールエステラーゼ(1.0U/ml)、コレステロー
ルオキシダーゼ(5.0U/ml)、4−アミノアンチ
ピリン(2.2mM)、EMSE(1.1mM)、30
mMグッド緩衝液(pH6.75)からなる試薬の代わ
りにコール酸ナトリウム(5mg/ml)、ポリエチレ
ングリコールで修飾したコレステロールエステラーゼ
(1.0U/ml)、ポリエチレングリコールで修飾し
たコレステロールオキシダーゼ(5.0U/ml)、4
−アミノアンチピリン(2.2mM)、EMSE(1.
1mM)、30mMグッド緩衝液(pH6.75)から
なる試薬を用いる以外は実施例6と同様の操作を行い、
沈殿法による結果と比較した。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数r=0.
980(n=40)〕。
要な簡便なHDLコレステロールの定量法が提供され
る。
本発明の方法により測定された吸光度との相関関係を示
すものである。
り測定された吸光度との相関関係を示すものである。
Claims (7)
- 【請求項1】 糖化合物および蛋白可溶化剤存在下、試
料中の低密度リポ蛋白(LDL)、超低密度リポ蛋白
(VLDL)およびカイロミクロン(CM)中のコレス
テロール量を測定し、試料中の総コレステロール量との
差を求めることを特徴とする高密度リポ蛋白(HDL)
中のコレステロールの定量法。 - 【請求項2】 糖化合物および蛋白可溶化剤存在下、試
料中のHDL中のコレステロール量を測定することを特
徴とするHDLコレステロールの定量法。 - 【請求項3】 糖化合物が一般式(I) 【化1】 〔式中、R1 、R2 およびR3 は同一または異なって水
素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置
換のアルカノイル、スルホ、−(グルコシル)p−H
(式中、pは1または2を表す)または−(マルトシ
ル)q −H(式中、qは1または2を表す)を表し、m
は6〜8の整数を表す〕で表される化合物または一般式
(II) 【化2】 (式中、R4 は水素またはNaを表し、nは5〜200
0の整数を表す)で表される化合物である請求項1また
は請求項2記載の定量法。 - 【請求項4】 蛋白可溶化剤が一般式(III ) 【化3】 〔式中、aは1〜200の整数を表し、bは0または1
を表し、R5 はR14−X−O−(式中、R14はアルキル
またはアルケニルを表し、Xは単結合またはCOを表
す)またはH−(CH2 CH2 O)c −N(R15)−
(式中、cは1〜200の整数を表し、R15はアルキル
またはアルケニルを表す)を表し、R6 はアルキルまた
はアルケニルを表す〕で表される化合物、一般式(IV) 【化4】 (式中、R7 、R8 、R9 、R10、R11およびR12は同
一または異なってアルカノイルを表す)で表される化合
物または一般式(V) 【化5】 〔式中、R13はアルキルまたはアルケニルを表し、Yは 【化6】 −O−、−CH(R16)−(式中、R16はアルキルまた
はアルケニルを表す)、−CH2 CH(OH)(CH
2 )d −(式中、dは1〜22の整数を表す)、−CH
=CH(CH2 )e −(式中、eは1〜22の整数を表
す)、−OCOCH(CH2 COOR17)−(式中、R
17はアルキルまたはアルケニルを表す)またはこれらの
混合物を表す〕で表される化合物である請求項1記載の
定量法。 - 【請求項5】 蛋白可溶化剤が一般式(VI) 【化7】 (式中、R18はアルキルまたはアルケニルを表す)で表
される化合物、一般式(VII ) 【化8】 (式中、R19はアルキルまたはアルケニルを表す)で表
される化合物または一般式(VIII) 【化9】 (式中、fは1〜100の整数を表し、R20はアルキル
またはアルケニルを表す)で表される化合物である請求
項2記載の定量法。 - 【請求項6】 蛋白可溶化剤が胆汁酸類である請求項2
記載の定量法。 - 【請求項7】 試料中にコレステロールエステル加水分
解酵素およびコレステロール酸化酵素を作用させ生成す
る過酸化水素を定量することからなるコレステロール量
を測定する方法において、使用するコレステロールエス
テル加水分解酵素またはコレステロール酸化酵素が化学
修飾されたコレステロールエステラーゼまたは化学修飾
されたコレステロールオキシダーゼである請求項1〜請
求項6記載の定量法。
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