DE69132513T2

DE69132513T2 - Vorrichtung und verfahren zur festphase-präzipitationsbestimmung von hdl-cholesterin

Info

Publication number: DE69132513T2
Application number: DE69132513T
Authority: DE
Inventors: M Jones
Original assignee: Cholestech Corp
Current assignee: Cholestech Corp
Priority date: 1990-07-16
Filing date: 1991-07-15
Publication date: 2001-08-23
Anticipated expiration: 2011-07-16
Also published as: EP1028319A3; CA2087255A1; ES2155057T3; WO1992001498A2; ATE198796T1; DE9117297U1; US5213964A; EP0539495A1; JP2981774B2; WO1992001498A3; EP0539495B1; JPH06502911A; DE69132513D1; EP1028319A2; AU656733B2; US5451370A; AU8298691A; US5316916A; CA2087255C

Description

1. Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Festphasen- Präzipitationsdiagnose-Vorrichtung und auf ein Verfahren zum Trennen von Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) von Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) in einer Blutflüssigkeitsprobe.

2. Referenzen:

Arai, F. et al. US 4,826,761, erteilt am 2. Mai 1989.
Bachorik, P. S. et al., in Methods in Enzymology, Vol. 129, Academic Press (1986) Seiten 78 bis 100.
Figueras et al. US 4,144, 306, erteilt am 13. März 1979.
Goldfarb, A. et al. US 3,464,413, erteilt am 2. September 1969. Vogel et al. US 4,477,575, erteilt am 16. Oktober 1984.
Zaffaroni, A. US 3,797,494, erteilt am 19. März 1974.
Ziegenhorn et al. US 4,544,630, erteilt am 1. Oktober 1985.

3. Hintergrund der Erfindung:

Es gibt einen Trend zum weitverbreiteten Testen von Blut und anderen Körperflüssigkeiten auf Analyten, welche die Gesundheitszustände, wie beispielsweise das Risiko einer Koronar-Erkrankung, vorhersagen. Die Menge von Cholesterin, die im Blut vorhanden ist, ist ein Faktor, der mit dem Risiko einer Erkrankung der Koronar-Arterien zusammenhängt.
Cholesterin zirkuliert im Blut überwiegend in einer proteingebundenen Form. Die Proteine, welche Cholesterin transportieren, sind die Lipoproteine, die nach ihrer Dichte in drei Klassen unterteilt werden. Die Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) sind triglyceridreiche Lipoproteine, die in der Leber synthetisiert werden und letztlich zu Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) umgewandelt werden, die das meiste Plasmacholesterin im Menschen transportieren. Die Lipoproteine hoher Dichte (HDL) sind Lipoproteine, die im Katabolismus der triglyceridreichen Lipoproteine und beim Abtransport des Cholesterins von peripheren Geweben und dem Transport zur Leber involviert sind. Ein inverser Zusammenhang zwischen dem HDL-Pegel im Serum und dem Risiko einer Erkrankung der Koronargefäße wurde festgestellt. Insbesondere dann, wenn der Anteil des dem HDL zugeordneten Cholesterin im Serum gering ist, ist das Risiko einer Erkrankung der Koronargefäße erhöht.
Im Hinblick auf die Bedeutung des relativen Serum-Cholesterin-Spiegels bei der Risikobeurteilung und beim Management arteriogener Erkrankungen wurden beachtliche Bemühungen unternommen, um große Populationen von sowohl normalen als auch hoch gefährdeten Individuen auf den Serumspiegel von HDL, LDL sowie des gesamten Cholesterins und der Triglyceride zu untersuchen. Die Effektivität der Behandlungen von hoch gefährdeten Individuen wurde durch regelmäßiges Testen des Serum-Cholesterin-Spiegels der verschiedenen Lipoproteinklassen überwacht.
Eine Methode zum Testen des LDL und des HDL-Cholesterins basiert auf der selektiven Präzipitation von nicht-HDL Lipoproteinen im Serum durch polyanionische Verbindungen, wie beispielsweise Dextransulfat, Heparin und Phosphorwolframat in Gegenwart eines Kations der zweiten Hauptgruppe, beispielsweise Mg²&spplus;, Mn²&spplus; und Ca²&spplus;. Die Spezifität und der Grad der Präzipitation hängen von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich des Typs und der Konzentration des Polyanion/Metall-Agens ab. Im allgemeinen erfolgt die Präzipitation der Serumcholesterinteile mit zunehmender Konzentration des Polyanions in der Reihenfolge VLDL, LDL und HDL. HDL bleibt gewöhnlich löslich bei Konzentrationen von Heparin oder Dextransulfat, welche Partikel geringerer Dichte vollständig ausfällen, obwohl unbedeutende apoE-Spezies von HDL gemeinsam mit den Partikeln geringerer Dichte co-präzipitiert werden können. Durch selektive Präzipitation der Partikel geringer Dichte können HDL- Serum-Cholesterin-Spiegel bestimmt werden. Der HDL-Wert kann dann gemeinsam mit den Messungen des gesamten Cholesterins und der Triglyceride im Serum verwendet werden, um den LDL-Wert nach der folgenden Beziehung auszurechnen:
LDL-Cholesterin = gesamtes Cholesterin - Triglyceride/5 - HDL- Cholesterin
In einem typischen Lipid-Assay-Vorgang wird ein kleines Blutvolumen entnommen und zentrifugiert, um eine klare Probe von Plasma- oder Serumflüssigkeit zu erzeugen. Die Flüssigkeitsprobe wird dann in gleichen Teilen auf verschiedene Teströhrchen verteilt zur Bestimmung (a) des gesamten Serumcholesterins, (b) der Triglyceride und (c) des HDL-Cholesterins. Die HDL- Probe wird, wie oben beschrieben, präzipitiert und die Partikel geringer Dichte werden durch Filtration oder Zentrifugation vor dem Cholesterinnachweis entfernt. Die Proben werden dann mit einer Enzymmischung zur Reaktion gebracht, wobei die Mischung Cholesterin-Esterase, Cholesterin-Oxidase, Peroxidase und einen Farbstoff enthält, der in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; zu einem klar unterscheidbar gefärbten Produkt oxidiert werden kann. Die Röhrchen können spektrophotometrisch abgelesen werden, und die gewünschten Cholesterinwerte des gesamten Cholesterins, des HDL und des LDL können somit bestimmt werden.
Trotz der Genauigkeit und Zuverlässigkeit, die mit dem oben beschriebenen Flüssigphasen-Cholesterin-Assay erreicht werden kann, hat der Assay eine Anzahl von Beschränkungen beim Gebrauch für breitangelegte Untersuchungen. Erstens benützt die Methode eine venöse Blutprobe, welche eine trainierte Fachkraft zur Entnahme und Fraktioniening der Blutprobe sowie zum Aufteilen der behandelten Blutprobe in gleichen Teilen auf die Teströhrchen erfordert. Zumindest eines der Probenröhrchen (zur HDL-Bestimmung) muß mit einem Präzipitations-Agens behandelt und weiter verarbeitet werden, um das präzipitierte Material zu entfernen. Wenngleich einige dieser Prozeduren automatisiert werden können, sind Analysemaschinen, die zu diesem Zweck konstruiert sind, teuer und stehen außerhalb großer Kliniken nicht verbreitet zur Verfügung.
Eine Anzahl von Assay-Vorrichtungen und Verfahren wurde entwickelt, die versucht, eine oder mehrere der Beschränkungen, wie beispielsweise die oben beschriebene, die mit der quantitativen Cholesterinbestimmung verbunden sind, zu verhindern. Ein solches Assay ist in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. O 415 298 beschrieben, die am 06.03.1991 publiziert wurde. In dem beschriebenen Verfahren werden nicht-HDL Lipoproteine von biologischen Flüssigkeiten getrennt, in dem eine flüssige Probe auf einen Durchflussträger aufgebracht wird, der ein Präzipitationsmittel für nicht-HDL Lipoproteine enthält. Der Träger kann ebenfalls anorganische oder organische Bindemittel enthalten, um die mechanische Stabilität und Stärke des Fasergewebes zu verbessern.
In dem US-Patent Nr. 4,215,993, das am 05.08.1980 erteilt worden ist, wird ein alternatives Präzipitationsmittel und ein Verfahren zur selektiven Präzipitation von Lipoproteinen mit nicht hoher Dichte beschrieben. Das Präzipitationsmittel enthält Phosphorwolframsäure, einen organischen Puffer und ein neutrales Polymer. Das Verfahren verwendet geringe Konzentrationen von Polyanionen und vermeidet die Verwendung von Metalllkationen zum Zwecke der Vermeidung einiger der Beschränkungen der Lipoproteintrennungsverfahren aus dem Stand der Technik.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung für einen Assay bereit, welche im wesentlichen viele der oben genannten Probleme im Zusammenhang mit den Vorgängen eines Flüssigkeits-Assays zum Messen des Serum-Cholesterin- Spiegels überwindet. Die Vorrichtung ist zum Messen der Konzentration des HDL assoziierten Cholesterins in einer Blutprobe entworfen, welche ebenfalls LDL- und VLDL-Partikel enthält. Die Vorrichtung umfaßt eine Siebmatrix, die in der Lage ist, lösbare und präzipitierte Lipoproteine zu trennen, wenn eine flüssige Probe durch die Matrix wandert. Ein mit der Matrix verbundenes Reservoir ist ausgelegt, um ein Präzipitations-Agens zum selektiven Präzipitieren der LDL und VLDL freizusetzen, wenn eine flüssige Probe in und durch die Matrix gezogen wird. Dies erlaubt eine Trennung des HDLs von den präzipitierten Lipoproteinen basierend auf der schnelleren Migration des HDL durch die Siebmatrix. Die somit von den nicht-HDL Lipoproteinen befreite Flüssigkeitsprobe wird mit einem Assay auf Cholesterin untersucht.
Es wird ebenfalls ein auf die Matrix aufgebrachtes Beschichtungsmaterial bereitgestellt, dass die Bindung des lösbaren Analyts, HDL, an die Matrix in der Gegenwart des Präzipitations-Agens verhindert.
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung eine Assay-Vorrichtung bereit, die viele der Beschränkungen der existierenden Cholesterin-Assay- Vorrichtungen überwindet. Im speziellen enthält die vorliegende Vorrichtung eine Matrix, die mit einem Material beschichtet ist, dass effektiv die HDL-Bindung an die Matrix bei Vorhandensein des Reagenz zur Präzipitation von Lipoproteinen nicht hoher Dichte in der Probe verhindert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Beschichtungsmaterial ein hydrophiles Polymer.
Polymere haben eine weit verbreitete Verwendung in vielen Technologiegebieten gefunden. Es ist z. B. bekannt, Glasfasern mit Polymeren zur Verwendung in verstärkten thermoplastischen Polymeren zu behandeln, die dann zur Bildung von thermoplastischen Artikeln mit guten thermischen Alterungseigenschaften verwendet werden können (z. B. US 4,615,946, erteilt am 07.10.1986).
Polymere sind ebenfalls benutzt worden, um Stabilität und schnelle Lösung von Reagenzien von Trägermatrizen zu schaffen. Trägermatrizen, die aus Polyvinylalkohol beschichtetem Glas bestehen, sind zum Zwecke der auflösenden Freisetzung von imprägnierten Proteinreagenzien bei Kontakt mit einer flüssigen Probe entwickelt worden, wobei die biologische Aktivität des Proteins während langer Perioden der Speicherung erhalten bleibt (EP-A-0 353 570, veröffentlicht am 02.07.1990).

4. Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Assay-Vorrichtung und ein Verfahren zu schaffen, welche im wesentlichen die oben genannten Probleme überwinden oder reduzieren, die mit den Flüssig-Assay-Vorgängen zur Untersuchung von Serum HDL-Werten verbunden sind.
Die Erfindung ist auf eine in Anspruch 1 beschriebene Assay-Vorrichtung und auf ein in Anspruch 8 beschriebenes Verfahren zur Verwendung in der Messung von Serum-Cholesterin gerichtet, welches spezifisch dem HDL assoziiert ist. Ein Präzipitations-Agens präzipitiert selektiv VLDL und LDL, so dass HDLassoziiertes Cholesterin ohne Störung durch diese Quellen gemessen werden kann.
Die Assay-Vorrichtung der Erfindung umfasst eine Matrix von Glasfasern, welche lösliches Material von präzipitiertem Material in der Flüssigkeitsprobe trennt, wenn die Proben vom Probeneintragsort zum Probesammelort in der Matrix durch die Matrix fließt. In der Vorrichtung ist ein Reagenzreservoir konstruiert, um langsam ein Präzipitations-Agens in der Matrix freizusetzen, wenn eine Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Fasern mit dem Präzipitations-Agens beschichtet. Die langsame Freisetzung des Präzipitations-Agens aus dem Reservoir schafft eine Konzentration des Präzipitations-Agens in der Matrix, welche effektiv die störende Verbindung bzw. die störenden Verbindungen in der Probe präzipitiert, ohne den zu testenden Analyt zu präzipitieren. In der Vorrichtung ist ebenfalls ein Assay-Pad enthalten, auf welches die Flüssigkeitsprobe, die am Probensammelort der Matrix gesammelt wird, zur Bestimmung der Konzentration des Analyten in der Flüssigkeitsprobe übertragen werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Präzipitations-Agens die Kombination einer polyanionischen Verbindung und eines Metallkations der zweiten Hauptgruppe, und die Freisetzungsmittel sind wirksam, um die polyanionische Verbindung mit einer Rate freizusetzen, die ausreicht, eine Konzentration der Verbindung bereitzustellen, die die VLDLs und HDLs selektiv präzipitiert. Bevorzugte polyanionische Verbindungen zur Verwendung in dem Reagenzreservoir umfassen sulfatierte Polysaccharide, Heparin und Phosphorwolframsäure, und das Metall der zweiten Hauptgruppe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mg²&spplus;, Mn²&spplus; und Ca²&spplus;. Eine bevorzugte Kombination beinhaltet abschließende Konzentrationen von 0,5 bis 1,0 mg/ml Dextransulfat und 0,045 bis 0,15 M Mg²&spplus;. Die bevorzugten Zusammensetzungen des Präzipitations-Agens sind besonders geeignet für einen Assay des HDL- assoziierten Cholesterins.
Die Vorrichtung beinhaltet ein auf die Matrix aufgetragenes Beschichtungsmaterial, welches das Binden des löslichen Analyten an die Matrix in Gegenwart des Präzipitations-Agens verhindert. Beschichtungen, die wirksam das Binden von HDLs an Glasfasern verhindern, umfassen hydrophile Polymere, wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidin, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyethylenimin, Polyvinylsulfonsäure, Poly(3- hydroxybuttersäure), Polyacrylsäure, Poly(3-hydroxyvaleriansäure), Poly(4- styrolsulfonsäure), Poly(2-acrylamidosulfonsäure) oder Poly-L-Glutamat.
Eine andere Beschichtung für eine Matrix aus einem Glasfasernetzwerk mit Oberflächensilylgruppen ist eine solche, bei der die Beschichtung einschließlich der Oberflächensilylgruppen zusammengesetzt ist aus Silylethern, insbesondere Silylmono- oder -diethern von Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan, wobei man das Beschichten durch die chemische Reaktion der Oberflächensilylhydroxylgruppen mit einem hydrophilen silylierenden Agen der allgemeinen Form R-Si (OX)n erreicht, wo R eine hydrophile Gruppe, X ein niederes Alkyl und n 2 oder 3 ist.
In einem anderen Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Trennen von HDLs, von LDLs und VLDLs in einer Blutflüssigkeitsprobe. Die Blutflüssigkeitsprobe wird in dem Verfahren mit der Vorrichtung der Erfindung in Kontakt gebracht.
Das vorzugsweise bei dem Verfahren verwendete Präzipitations-Agens umfaßt eine polyanionische Verbindung und ein Metallkation der zweiten Hauptgruppe. Polyanionische Verbindungen, welche für die erfindungsgemäße Methode besonders geeignet sind, umfassen sulfatierte Polysaccharide, Heparin und Wolframphosphorsäure. Das Metall der zweiten Hauptgruppe ist vorzugsweise Mg²&spplus;, Mn²&spplus; oder Ca²&spplus;.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Beschichtung, welche benutzt wird, um das Binden des löslichen HDL an die Glasfasermatrix in Gegenwart des Präzipitations-Agens zu verhindern, vorzugsweise ein hydrophiles Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidin, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Poylethylenimin, Polyvinylsulfonsäure, Poly(3-hydroxybuttersäure), Polyacrylsäure, Poly(3-hydroxyvaleriansäure), Poly(4-styrolensulfonsäure), Poly(2-acrylamidosulfonsäure) oder Poly-L-Glutamat.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Matrix Glasfasern mit Oberflächensilylgruppen, und die Beschichtung ist aus Silylethern zusammengesetzt. Bevorzugte Silylether umfassen Silylmono- oder diether von Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan.

5. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A und 1B zeigen eine Seitenansicht bzw. einen Querschnitt durch die Seitenansicht entlang der angezeigten Linie einer Vorrichtung für einen Multi- Analyt-Assay, die in Übereinstimmung mit der Erfindung konstruiert ist;
Fig. 2 ist eine vergrößerte Teilansicht des zentralen Streifenbereiches der in Fig. 1 gezeigten Assay-Vorrichtung;
Fig. 3a, 3b und 3c sind vergrößerte Ansichten von drei Typen eines Reservoirs zur langsamen Freisetzung, welches in der Vorrichtung verwendet wird;
Fig. 4 illustriert die Freisetzung eines Präzipitations-Agens und die Präzipitation von LDL (offene Quadrate) und VLDL (offene Dreiecke) in einer Serumprobe (linke Seite der Figur) und die Trennung von HDL-Partikeln (volle Kreise) von dem präzipitierten LDL und VLDL, welche sich nach der Migration durch den Streifen in der Vorrichtung bilden (Mitte der Figur);
Fig. 5A bis 5C illustrieren Methoden zur Beschichtung einer Glasfaseroberfläche (SA) mit einem silylierenden Agens (5B) oder mit einem hydrophilen Polymer (5C);
Fig. 6 ist ein Balkendiagramm, welches die gemessenen Werte für HDL- Cholesterin nach der HDL-Trennung in einer Glasfasermatrix mit verschiedenen Behandlungen und Glasfaserbeschichtungen zeigt;
Fig. 7 ist eine Aufsicht auf einen Streifen in der Assay-Vorrichtung, der entworfen ist zur Bestimmung des Serumcholesterins, welches mit HDL assoziiert ist;
Fig. 8 ist ein Plot, der die Bestimmung von HDL-Cholesterinkonzentrationen unter Verwendung einer Standardkurve mit zwei Referenzwerten illustriert in Übereinstimmung mit dem Gebrauch der Methode und der Vorrichtung der Erfindung;
Fig. 9a und 9b illustrieren eine Aufsicht auf einen Streifen bzw. einen Teilquerschnitt durch den Streifen in der Assay-Vorrichtung, der entworfen ist zur Bestimmung von mehreren Analyten, von denen einer HDL ist;
Fig. 10 ist ein Plot, der die Bestimmung des gesamten Cholesterins, des HDLs und des Serumtriglyzerins von der Assay-Vorrichtung in Übereinstimmung mit der Methode der Erfindung illustriert; und
Fig. 11 ist ein Plot, der die HDL-Cholesterinwerte, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gemessen wurden, mit Meßergebnissen nach der Standardflüssigphasen-Methode vergleicht, wobei die gerade Linie in der Figur ideale Übereinstimmung zwischen den beiden Tests anzeigt.

6. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

A. Assay-Vorrichtung

Dieser Abschnitt beschreibt eine für den Gebrauch mit einem einzelnen oder mehreren Analyten geeignete Assay-Vorrichtung, die zur Messung von HDL- Cholesterin in einer Flüssigkeitsprobe, die ebenfalls LDL und VLDL enthält, entworfen wurde.
Wie oben diskutiert, ist HDL eine Klasse der Lipoproteine, welche Cholesterin im Blut transportiert. Cholesterinspiegel, die mit dem HDL und den Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) assoziiert sind, weisen eine starke Korrelation mit Erkrankungen der Herzgefäß auf.
Verbindungen, die im HDL-Assay stören, sind insbesondere die nicht-HDL- Serumlipoproteine einschließlich der Chylomikronen, VLDL und LDL. Wie weiter unten dargelegt wird, können die nicht-HDL-Lipoproteine selektiv präzipitiert werden durch eine Vielzahl polyanionischer Verbindungen in Kombination mit Metallkationen der zweiten Hauptgruppe in ausgewählten Konzentrationsbereichen der präzipitierenden Komponenten.
Fig. 1a zeigt eine Vorrichtung 14 für einen Assay für multiple Analyten, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde. Die Vorrichtung ist insbesondere entworfen zur Bestimmung multipler Analyten unter Verwendung eines geringen Volumens einer Blutprobe, typischerweise zwischen 10 bis 50 ul Blut. Die allgemeine Assay-Konfiguration wurde in der internationalen PCT-Veröffentlichung WO 90/10869 mit dem Titel "Analyte Assay Device and Apparatus", veröffentlicht am 20. September 1990, beschrieben, welche besonders zur Bestimmung von multiplen Blutproben-Assays geeignet ist.
Die Vorrichtung 14 umfaßt generell einen Täger 15, der ein Reservoir 16 definiert, welches dimensioniert und abgemessen ist, um eine Blutprobe von typischerweise zwischen 25 und 50 ul Blut aufzunehmen. Ein Kapillarkanal 18, der in der Platte geformt ist, wird an der Basis des Reservoirs bereitgestellt und steht mit der vertieften Region 20 in Verbindung, die im oberen Rand des Trägers ausgebildet ist. Der Träger ist vorzugsweise eine dünne Plastikplatte oder ähnliches, wobei das Reservoir, das Röhrchen und die gekerbte Region mit Standardmethoden zur Formgebung oder Bearbeitung gebildet werden.
Ein im Bereich 20 getragenes Siebpad 22 dient dazu, teilweise aus großen Partikeln bestehendes Material (einschließlich Blutzellen) zu entfernen, wenn die Probe von dem Reservoir weg von unten nach oben durch die Matrix wandert, wie es in Fig. 1a dargestellt ist. Das Siebpad 22 ist aus einem faserförmigen Matrixmaterial gebildet, welches entworfen ist, um eine wässrige Flüssigkeit durch Oberflächenbenetzung anzuziehen und um die Bewegung von Blutzellen zu verzögern, wenn die Blutprobe durch die Matrix gezogen wird. Das heißt, das Siebpad wirkt als ein chromatographisches Medium zum Trennen zellgroßer Partikel von löslichen Serumkomponenten auf der Basis unterschiedlicher Migrationsraten durch das Medium.
Eine Vielzahl von Fasermaterialien, wie beispielsweise Matrizen aus Zellulose, Zelluloseacetat und Glasfasern, werden für Fasermattenfilter eingesetzt und sind geeignete Materialien für das Siebpad. Die Fasern können, falls gewünscht, quervernetzt (crosslinked) sein durch chemisches Quervernetzen, Hitzeschmelzen oder ähnliches. Ebenso sind poröse Substrate geeignet, wie beispielsweise gesintertes Glas, zusammengeschmolzene Polymerperlen oder ähnliches, wobei deren Benetzbarkeit und die Dimension der Zwischenräume so beschaffen sind, daß die Bewegung des wässrigen Mediums in die Matrix durch Oberflächenbenetzung gefördert wird. Ein Beispiel für einen Filter ist ein Glasfaserfilter, wie ein GF/D oder PD008 Filter, der von Whatman geliefert wird und der eine Packungsdichte von etwa 0,16 g/cm³ aufweist. Der Streifen ist auf Seitenabmessungen von 3 · 8 mm und eine Dicke von etwa 1 mm zugeschnitten. Das Pad ist so bemessen, daß es ein definiertes Volumen einer Flüssigkeitsprobe absorbieren kann, das typischerweise zwischen ungefähr 3 bis 25 ul und vorzugsweise zwischen 15 und 25 ul beträgt.
Das Siebpad 22 kann zusätzlich Reagenzien zum Fangen roter Blutkörper beinhalten, wie beispielsweise Lektine, Antikörper, die spezifisch für Oberflächenmembranproteine der roten Blutkörper sind, Thrombin oder ionenaustauschende Agenzien. Alternativ dazu kann die obere Oberfläche des Siebpads 22 mit einer mikroporösen Membran bedeckt werden, welche entworfen ist, um Blutzellen und anderes partikelförmiges Material, welches in der Flüssigkeitsprobe enthalten ist, herauszufiltern. Bei einer Verwendung der Vorrichtung für einen Assay für das gesamte Cholesterin oder für andere Lipidkomponenten, die mit den großen Lipoproteinkörpern im Blut assoziiert sein können, z. B. HDL, LDL und VLDL, sind die Porengrößen einer solchen Membran so gewählt, daß sie Blutzellen herausfiltern, aber das Passieren dieser Moleküle erlauben. Eine bevorzugte Membran ist eine von Nucleopore (Livermore, CA) erhältliche Polykarbonatmembran mit einer Porengröße von 1 um.
Unter Bezugnahme insbesondere auf Fig. 2, die eine Vergrößerung des Zentralbereichs der Assay-Vorrichtung wiedergibt, zeigt sich, daß das Siebpad 22 wiederum mit einem länglichen Streifen oder einer Matrix 26 bedeckt ist, welche sich entlang eines inneren Bereiches des oberen Randes der Platte erstreckt und daran befestigt ist. Eine Matrix 26 dient dazu, die Flüssigkeitsprobe von dem zentralen Probenauftragungsbereich des Matrixstreifens zu den Probensammelbereichen 30, 32 zu verteilen, die an die Enden der Matrix (Fig. 1) angrenzen. Die Matrix ist vorzugsweise aus einem fasrigen Material geformt, das in der Fläche 22 verwendet wird und welches geeignet ist, Flüssigkeit mit Kapillarfluß durch den Streifen zu ziehen.
Die Packungsdichte und die Dicke der Matrix sind so beschaffen, daß kleine Flüssigkeitsvolumina, beispielsweise 10 bis 25 ul, die dem Probeneintragsbereich des Streifens eingegeben wurden, absorbiert und zu den Probensammelbereichen des Streifens verteilt werden. Die Matrix hat eine bevorzugte Packungsdichte zwischen ungefähr 0,16 g/cm³ und 4,0 g/cm³. Ein exemplarisches Matrixmaterial ist der BSB 20 Glasfaserfilter, der von Whatman erhältlich ist und eine Packungsdichte von etwa 0,2 g/cm³, eine Breite von etwa 3 mm, eine Länge von etwa 3 cm und eine Dicke von ungefähr 0,12 mm aufweist. Die Glasfasern in der Trennungsmatrix sind präpariert, um eine Beschichtung zu enthalten, welche wirksam ist, das Binden von HDL an die Glasfasern in der Gegenwart eines Präzipitations-Agens zu verhindern, wie weiter unten beschrieben wird.
Im folgenden wird weiterhin auf Fig. 2 Bezug genommen. Ein Reagenzreservoir 34 in der Vorrichtung enthält ein Präzipitations-Agens, welches zur selektiven Präzipitation störender Verbindungen, wie beispielsweise LDL- und VLDL- Partikel, in der Flüssigkeitsprobe verwendet wird, wenn die Flüssigkeitsprobe in den Probeneingabebereich der Matrix gezogen wird. Reservoir 34 umfaßt ein fasriges Netzwerk (dargestellt in Fig. 3a, 3b und 3c), welches zwischen dem Siebpad 22 und dem zentralen Probeneingabebereich 28 der Matrix 26 angeordnet ist. Das Netzwerk erstreckt sich etwas jenseits der Ränder des Bereichs 20, wie in der Figur zu erkennen ist, wodurch gewährleistet wird, daß die von dem Pad 22 in die Matrix 26 gezogene Flüssigkeitsprobe ebenfalls durch das Reservoir gezogen wird. Das Netzwerk kann aus einem fasrigen Filtermaterial gebildet werden, wie es in dem Filterpad 22 oder der Matrix 26 verwendet wird. Ein beispielhaftes Material ist ein Glasfaserfilter mit einer Packungsdichte von etwa 0,2 g/cm³, einer Dicke von etwa 0,12 mm und Längen- bzw. Breitenabmessungen von etwa 4 bzw. 3 mm. Wie im folgenden im einzelnen beschrieben sein wird, zeigen Fig. 3a, 3b und 3c von Ausführungsformen eines vergrößerten Bereichs des Reagenzreservoirs, wobei dessen Netzwerkaufbau illustriert ist. Wenngleich das Reservoir hier von der Matrix 26 getrennt dargestellt ist, ist anzuerkennen, daß das Reservoir einteilig mit der Matrix ausgebildet werden kann, in dem das Präzipitations-Agens in einen zentralen Bereich der Matrix inkorporiert wird.
Das Reagenzreservoir 34 ist entworfen, um das Präzipitations-Agens mit einer Rate freizusetzen, welche die Konzentration des Agens in der Flüssigkeitsprobe, welche in die Matrix eintritt, aufrechterhält. Genauer gesagt, mindestens die ersten 10% und vorzugsweise 20 bis 40% der gesamten Flüssigkeitsprobe, welche in die Matrix zwischen dem Probeneintragsbereich und dem Probensammelbereich auf der Matrix gezogen wird, werden in einem Konzentrationsbereich gehalten, der wirksam ist, um selektiv die nicht-HDL-Verbindungen in der Flüssigkeitsprobe zu präzipitieren oder zu aggregieren.
Das Präzipitations-Agens kann jede chemische Komponente oder Komponenten sein, (a) deren Fähigkeit zum Präzipitieren der störenden Verbindungen konzentrationsabhängig ist und (b) welche vom Reservoir in die Flüssigkeitsprobe in löslicher Form abgegeben werden. Das Agens kann ein Salz sein, welches eine Salzfällungsreaktion bewirkt, eine Säure oder eine Base, welche einen selektiven pH-Wert-abhängigen Präzipitationseffekt erzielt, oder typischer, eine Verbindung oder Verbindungen, welche intermolekulare Aggregate mit der störenden Verbindung bzw. den störenden Verbindungen bilden. Das bevorzugte Präzipitations-Agens für die Verwendung zur selektiven Präzipitation von nicht- HDL-Serum-Lipoproteinen ist ein sulfoniertes Polysaccharid, wie beispielsweise Dextransulfat, (welches ein typisches Molekulargewicht von etwa 50.000 Dalton hat) in Kombination mit Magnesiumacetat oder -chlorid, wobei es gepuffert ist, um einen neutralen pH-Wert aufrechtzuerhalten.
Wie oben diskutiert wurde, können Lipoproteine durch eine Vielzahl von Präzipitations-Agenzien, welche Kombinationen von ausgewählten polyanionischen Verbindungen und divalenten Kationen umfassen, selektiv präzipitiert werden. Die Verwendung dieser Agenzien zur Präzipitation von Lipoproteinen ist in einem Übersichtsartikel zusammengefaßt (Bachorik, P. S., et al., in Methods in Enzymology, Academic Press (1986), pp 78-100). Die Agenzien, die meistens verwendet werden sind (a) Heparin-Mn²&spplus; oder Heparin- Ca²&spplus;, (b) Dextransulfat-Mg²&spplus;, (c) Phosphorwolframat-Mg²&spplus; und (d) Polyethylenglykol.
Das Heparin-Agens, umfassend Heparin und ein divalentes Metall, ist bei einer Heparin-Konzentration von 1 mg/ml wirksam und eine Konzentration von bis zu 1 mg/ml präzipitiert nicht HDL. Mn²&spplus;, das typischerweise in der Form eines MnCl&sub2;-Salzes vorliegt, sollte mindestens etwa 0,04 M sein, um komplette Präzipitation von nicht-HDL (apoB-enthaltenden) Lipoproteinen zu gewährleisten, wobei zwischen ungefähr 0,006 und 0,092 M Mn²&spplus; bevorzugt sind. Ähnliche Konzentrationen von Ca²&spplus; können als Ersatz für Mg²&spplus; dienen.
Das Dextransulfat-Agens, einschließlich Dextransulfat und Mg²&spplus;, verwendet vorzugsweise Dextransulfat von einem molekularen Gewicht von etwa 50 kD (Kilodaltons). Bei höheren MolekulargewiLchten von beispielsweise 500 kD wird eine beachtliche Menge von HDL präzipitiert. Bei geringen Molekulargewichten, wie beispielsweise 15 kD, werden die apoB-Lipoproteine unvollständig präzipitiert. Die optimale Dextransulfatkonzentration zum selektiven Präzipitieren der nicht-HDL-Partikel beträgt ungefähr 0,91 mg/ml und Konzentrationen bis zu 10 mg/ml präzipitieren kein HDL. Die Konzentration von Mg²&spplus;, welches typischerweise in der Form von MgCl&sub2; vorliegt, beträgt zwischen etwa 0,045 und 0,15 M.
Das Phosphorwolframat-Agens beinhaltet ein wasserlösliches Phosphorwolframat und Mg²&spplus;, das typischerweise als MgCl&sub2; vorliegt. Konzentrationen des Agens, die zur selektiven Präzipitation von nicht-HDL-Liproproteinen wirksam sind, betragen zwischen 2-8 mg/ml Phosphorwolframat und zwischen etwa 0,025 und 0,075 M Mg Salz.
Das Präzipitations-Agens wird typischerweise in einem wässrigen Puffer, beispielsweise einem HEPES-Puffer, mit einer gewünschten Konzentration zubereitet, die eine Infusion des Reservoirnetzwerks mit einer gewählten Menge des Präzipitations-Agens erlaubt. Die Gesamtmenge des Agens im Reservoir wird aus dem geschätzten Volumen der Fließmittelfront in der Assayvorrichtung berechnet, die das Präzipitations-Agens in der gewünschten Konzentration enthält, und aus der Gesamtmenge des Präzipitations-Agens, welche erforderlich ist, um diese Konzentration zu erzielen. Die dem Netzwerk eingegebene Zubereitung kann einen Binder enthalten, wie im folgenden unter Bezugnahme auf Fig. 3a beschrieben wird, oder das Präzipitations-Agens allein, welches mit einer langsam freisetzenden Beschichtung aufgetragen wird. Einzelheiten eines Reservoirs, welche ein Dextransulfat-MgCl&sub2; Präzipitations-Agens enthält, werden in Beispiel 1 angegeben.
Das Bindermaterial und das Verhältnis des Binders zum Präzipitations-Agens in der Zubereitung sind so gewählt, um graduelle Partikellösung über die Zeit zu gewährleisten, in der die Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen wird, und insbesondere, wenn die ersten 10-40% oder mehr der gesamten Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen werden. Bevorzugte Polymerbinder sind lineare Polyoxide, Polypropylenoxide, Polyethylenimine, Polyacrylsäure, Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Polymethacrylsäure, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinyloxazolidon und eine Vielzahl von wasserlöslichen Hydroxylpolymeren, wie beispielsweise natürliche Gummis, Gelatine und wasserlösliche Zelluloseverbindungen, wie beispielsweise Methylzellulose und Hydroxymethylzellulose, und Copolymere und Mischungen dieser Polymere. Diese Polymere sind im allgemeinen kommerziell in einer Vielfalt von Molekulargewichten erhältlich. Binderzubereitungen können durch Mischen des Binders mit dem Präzipitations-Agens typischerweise in einem Gewichtsverhältnis zwischen etwa 1 : 10 bis 1 : 1 Präzipitations-Agens zu Binder hergestellt werden. Die getrocknete Binderzubereitung enthält typischerweise zwischen etwa 1 : 10 bis 1 : 1 Agens zu Binder gemäß der Natur des Binders und der gewünschten Lösungsrate des Reservoirs. Es sei jedoch angemerkt, daß der Binder selbst das Präzipitations-Agens oder eine der Komponenten des Agens sein kann, wie beispielsweise ein Dextransulfatpolymer in einem Präzipitations- Agens, das aus Dextransulfat und Mg²&spplus; zusammengesetzt ist.
Fig. 3a, 3b und 3c zeigen vergrößerte Ansichten von Ausführungsformen des Reservoirs 34, die insbesondere die netzwerkartige Konstruktion des bevorzugten Ausführungsbeispiels illustrieren. In der in Fig. 3a illustrierten Ausführungsform ist das Präzipitations-Agens in einem Binder zubereitet und auf den Fasern des Netzwerks getrocknet. D. h. die als 38 bezeichneten Fasern des Netzwerks sind in eine getrocknete irreguläre Ablagerung 36 einer Mischung aus Binder und Präzipitations-Agens eingeschlossen. Das Bindermaterial und das Verhältnis von Binder zu Präzipitations-Agens in der Zubereitung sind so gewählt, um eine graduelle Partikelfreisetzung über die Zeit zu gewährleisten, in der eine Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen wird, und genauer, wenn die ersten 10- 40% oder mehr der gesamten Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen werden. Um das Reservoir zu präparieren, wird das Netzwerk mit einer Suspension der Binderzubereitung getränkt, die eine bekannte Menge des Präzipitations-Agens enthält. Das Netzwerk wird dann beispielsweise unter Vakuum oder durch Erhitzen getrocknet, was zu einer Beschichtung des Netzwerks führt, wie in Fig. 3a gezeigt ist. Beispiel 1 beschreibt die Zubereitung eines Reservoirs dieses Typs, welches Dextransulfat und MgCl&sub2; enthält.
In einer zweiten in Fig. 3b illustrierten Ausführungsform wird das Präzipitations-Agens in das Netzwerk eingebracht und dehydriert, wodurch eine Ablagerung 45 auf den Fasern des Netzwerks gebildet wird. Diese Ablagerung wird dann mit einem wasserlöslichen Material beschichtet, das typisch ein wasserlösliches Polymer der oben erwähnten Art ist und welches eine langsam freisetzende Beschichtung 46 bildet (in gepunkteten Linien dargestellt), die bewirkt, daß die Lösung der Ablagerung nach Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe verzögert wird. Die Beschichtung kann durch Sprühen, Eintauchen oder Dehydration einer nicht wässrigen Lösungsmischung auf das Netzwerk und die Ablagerung aufgetragen werden. Die Beschichtung wird vorzugsweise so aufgetragen, daß unterschiedliche Dicken der Beschichtung durch das ganze Netzwerk erzielt werden, um ein Kontinuum von freigesetztem Agens zu erzeugen, wenn das Probenmaterial durch das Reservoir fließt.
Fig. 3c illustriert einen Mikrosphären- oder Mikrokapsel-Typ eines Reservoirpartikels 48 im Reservoir. Die Mikrosphären sind aus einer mikroporösen polymerischen äußeren Schale 49 und einer eingekapselten inneren Region 51, die das Präzipitations-Agens enthält, zusammengesetzt. Die Mikrosphären mit dem eingeschlossenen Agens werden nach bekannten Methoden hergestellt, wie sie beschrieben sind in den US Patenten Nr. 3,797,494 und 3,464,413, und anschließend in das Netzwerk eingebettet. Die Porösität der Mikrosphären ist so beschaffen, daß die interessierende Analytverbindung ausgeschlossen wird, um zu verhindern, daß der Analyt der hohen Konzentration des Präzipitations-Agens innerhalb der Mikrosphären ausgesetzt wird.
Fig. 4 illustriert die Betriebsweisen der selektiven Präzipitation und Trennung, die zwischen dem Probeneintragsbereich und dem Probensammelbereich in der Matrix 26 während eines Assays zur Bestimmung des HDL in einer Serumprobe erfolgen. Die unterschiedlichen Lipoproteine in der Probe sind dargestellt mit vollen Kreisen (HDL), offenen Quadraten (VLDL), offenen Dreiecken (LDL) und Clustern der Einheiten (Aggregate). Eine Flüssigkeitsprobe fließt durch die Matrix von links nach rechts, wie durch die Pfeile angedeutet ist.
Der linke Teil der Fig. 4 zeigt den Probeneintragsbereich 28 auf der Matrix, wobei der ausgeschnittene Bereich die Fasern 38 des Reagenzreservoirs 34 in der Matrix und Bereiche 36 des Präzipitations-Agens zeigt, welche auf den Fasern vorhanden sind. Die Flüssigkeitsprobe in diesem Bereich enthält alle der ursprünglichen Lipoproteinkomponenten mit den ursprünglichen Lipoproteinkonzentrationen, wie angedeutet.
Der zentrale Bereich der Figur zeigt einen Abschnitt 44 der Matrix 26, der stromabwärts vom Reagenzreservoir zwischen dem Probeneintragsbereich 28 und einem Probensammelbereich 32 liegt. Die Ablagerung auf dem Netzwerk wird langsam aufgelöst, wobei das Präzipitations-Agens in die Probe freigesetzt wird, wenn die Flüssigkeitsprobe durch das Netzwerk in dem Reservoir gezogen wird. Die aggregierten und nichtaggregierten Partikel werden chromatografisch getrennt, wenn die Cholesterin enthaltenden Partikel in der Fließmittelfront zum Probensammelbereich auf der rechten Seite der Figur gezogen werden. Wie im zentralen ausgeschnittenen Bereich angedeutet ist, liegen LDL und VLDL Lipoproteine weitgehend in präzipitierter oder aggregierter Form vor.
Der rechte Abschnitt der Figur zeigt einen Abschnitt der Matrix im Probensammelbereich 32. Hier ist die Zusammensetzung der Flüssigkeitsprobe, welche zuerst die Probensammelregion erreicht, im wesentlichen frei von nicht- HDL-Partikeln, aber sie enthält HDL-Partikel in der Konzentration, die in der ursprünglich eingegebenen Blutprobe vorliegt.
Es ist entdeckt worden, daß die Behandlung von Blut mit Agenzien, die zur selektiven Präzipitation von nicht-HDL-Blutlipoproteinen verwendet werden, zur Bindung eines Teils der HDL in der Blutprobe an Glasfasern des Typs führt, der in kommerziell erhältlichen Glasfiltern geliefert wird. Die Reduktion im gemessenen HDL-Cholesterin, die aus dieser Bindung an die Glasfasern folgt, wird weiter unten aus den Daten in Fig. 6 ersichtlich werden. Eine solche Bindung kann durch Zugabe einer Beschichtung der Fasern der Trennungsmatrix 26 effektiv eliminiert werden.
Zwei bevorzugte Typen der Beschichtung und die Methode ihrer Präparation werden in den Fig. 5a bis 5c gezeigt.
Fig. 5a zeigt einen fragmentarischen Oberflächenbereich einer Glasfaser 50 mit einer Silylhydroxyl (Si-OH) Oberflächengruppe, wie die Gruppen 52. Die Silylhydroxyl-Gruppen sind typisch für Glasfaseroberflächen in kommerziellen Glasfiltern und ähnlichen. Obwohl hier nicht gezeigt, kann die Faser auch so zusammengesetzt sein, daß sie einen geringen Prozentsatz (weniger als etwa 2 Gewichts-%) eines Polymers enthält, beispielsweise als Polyvinylalkohol (PVA), welches mit dem Glas vor der Formung zubereitet wird, um die Packungseigenschaft in der Glasfaser zu verbessern.
In der in Fig. 5b gezeigten Beschichtungsmethode wird der Glasfilter beschichtet durch chemisches Reagieren der Oberflächensilylhydroxyl-Gruppen mit einem hydrophilen Silylierungsagens, welches die allgemeine Form R-Si(OX)n aufweist, wobei R eine hydrophile Gruppe, X ein niederes Alkyl, vorzugsweise Methyl- oder Ethylradikal, und n gleich 2 oder 3 ist. Beispielhafte Silylierungsagenzien umfassen Silylmono- und -diether von Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan.
Die Reaktion wird nach bekannten Methoden zur Silylierung von Glas durchgeführt. In einer typischen Prozedur wird eine 2%ige wässrige "Arbeits"- Lösung des Silylierungsreagenz, wie beispielsweise Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan, von einer 62%igen Vorratslösung bereitet, die kommerziell erhältlich ist, z. B. von Huls Amerika (Petrarch Systems, Bristol, PA). Der die Matrix formende Glasfilter wird in die frisch präparierte Arbeitslösung für mindestens 10 Minuten eingetaucht, mit 95%igem Ethanol gewaschen und in einem Ofen bei 50ºC für fünf Minuten getrocknet.
Wie in Fig. 5b zu erkennen ist, kann das Silylierungsreagenz mit jeder von zwei Si-OH-Oberflächengruppen reagieren unter Bildung einer Silylmono- oder diether-Beschichtung, die unter Bezugsziffer 54 gezeigt ist. Diese Beschichtung maskiert die Oberflächen-Si-OH-Gruppen des unbehandelten Glases, in dem diese Gruppen durch hydrophile R-Gruppen des oben bezeichneten Typs ersetzt werden.
In einem zweiten generellen Ausführungsbeispiel, welches in der Fig. 5c dargestellt ist, wird der Glasfilter mit einem hydrophilen Polymer beschichtet, wie unter Bezugszeichen 56 angedeutet ist. In einer bevorzugten Methode zum Auftragen der Polymerbeschichtung wird der die Matrix formende Glasfilter in eine Lösung von Polyvinylalkohol (PVA) getaucht gefolgt von einem Trocknungsschritt bei erhöhter Temperatur (etwa 90ºC) für einige Minuten. Die abschließende Inkorporierung von Polymer beträgt ungefähr 5% des Trockengewichts nach einer Abschätzung durch Vergleich der Masse vor und nach Flammverdampfung der organischen Verbindung vom Glasfilter. Fig. 5c zeigt die resultierende Polymerbeschichtung 58, die aus Polymerfasern gebildet ist. Wie bei der chemischen Modifizierungsmethode ist die Beschichtung wirksam, die Oberflächen Si-OH-Gruppen zu maskieren und sie zu ersetzen durch hydrophile Gruppen der Polymeruntereinheiten.
Bevorzugte Polymere zum Gebrauch in der Erfindung umfassen Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidin, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyethylenimin, Polyvinylsulfonsäure, Poly(3-hydroxybuttersäure), Polyacrylsäure, Poly(3-hydroxyvaleriansäure), Poly(4-styrolsulfonsäure), Poly(2- acrylamidosulfonsäure) oder Poly-L-Glutamat. Bevorzugte Polymermolekulargewichte liegen etwa zwischen 10-200 Kilodaltons. Der genaue bevorzugte Polymerinhalt ist abhängig von dem Typ der Glasfasermatrix und insbesondere seiner Faserdichte. Wie im folgenden gezeigt wird, beträgt der bevorzugte Polymerinhalt beim Gebrauch einer Whatman BSB-20 Membran mehr als 4% Polymer gemessen nach der oben beschriebenen Methode mit Bezug auf Polyvinylalkohol als Standard.
Der Effekt der verschiedenen Glaskompositionen und Oberflächenbeschichtungen auf die Bindung des HDL an die Glasfilterfasern ist aus einer Studie ersichtlich, deren Ergebnisse in Fig. 6 wiedergegeben sind. In dieser Studie wurde jeder von sechs Glasfiltern als Siebmatrix benutzt, nachdem sie, wie im folgenden beschrieben, behandelt wurden. In jedem Fall wurde eine Serumprobe, die zuvor mit Dextransulfat als Präzipitations-Agens zum Entfernen von VLDL und LDL behandelt wurde, durch den Filter geleitet und dann nach HDL assoziiertem Cholesterin mittels eines konventionellen Cholesterin-Assays analysiert. Zur Kontrolle wurde die gleiche Probe direkt durch die Lösungsphasenmethode ohne Passage durch den Filter untersucht. Die HDL-Cholesterinkonzentration für das gefilterte Material wurde dann in Prozent des ungefilterten Materials ausgedrückt.
Wie im oberen Balken (a) in dem Diagramm der Fig. 6a ersichtlich ist, resultierte der Durchlauf einer Serumprobe durch unbehandelte Glasfasern (Whatman BSB-20) in einem Verlust von etwa 15% des HDL-Cholesterininhalts aufgrund von Bindung des HDL an das Glas der Matrix. Nach den Spezifikationen des Herstellers werden die Glasfasern dieses Filters mit etwa 1% PVA, welches bei der Formung in den Glasfilter inkorporiert wird, hergestellt, um die Matteneigenschaften der Fasern zu verbessern.
Das gleiche Filtermaterial zeigt nach einer Silylierung mit Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan fast keine Bindung von HDL, wie aus dem zur Kontrollprobe äquivalenten Gehalt an HDL-Cholesterin offensichtlich ist (b). Das gleiche Filtermaterial zeigt weniger Bindung als unbehandelte Fasern, aber es zeigte dennoch Bindung von HDL, wenn es mit einer Lösung von PVA mit weniger als 4 Gew.-% Polymer beschichtet wurde (c). Filter mit 4-5 Gew-% PVA-Beschichtung (d) wiesen keine beachtenswerte HDL-Bindung auf. Aufgrund dieser Ergebnisse kann festgestellt werden, daß für die in dieser Studie verwendeten Faserkomposition (Whatman BSB-20) eine 4-5 % PVA-Beschichtung ausreichend war, um Bindung von HDL an das Filtermaterial zu verhindern. Weitere Studien legten nahe, daß die genau erforderliche Menge von PVA-Beschichtung von der Komposition und insbesondere von der Glasfaserdichte des verwendeten Filtermaterials abhängt.
Ebenso ist in Fig. 6 das Ergebnis der Filtration einer Probe durch vom Hersteller gebildete Glasfilter gezeigt, welche 6 Gew.-% PVA enthalten. Diese Filter waren nicht spezifisch mit PVA-Oberflächen nach der oben beschriebenen Methode beschichtet. Der Durchlauf der Probe durch diesen Filter resultierte in einem leichten Rückgang des HDL-Cholesterininhalts des Filtrats (e). Die reduzierte HDL-Bindung an diesen Filter legt nahe, daß das zugegebene PVA teilweise dazu dient, um Si-OH-Gruppen, die gewöhnlich an der Glasfaseroberfläche vorliegen, zu beschichten und zu maskieren. Wenn 6% PVA verstärktes Fasermaterial zusätzlich silyliert wurde unter der Verwendung der oben beschriebenen Silylierungsmethode, wurde kein beachtenswerter Verlust des HDL- Cholesterininhalts in der Probe aufgrund von Bindung des HDL an den Filter beobachtet (f).
Die Studie zeigt, daß sowohl chemische Beschichtung durch hydrophile Silylierungsgruppen wie auch Polymerbeschichtungen durch ein hydrophiles Polymer (mit einer hinreichenden Polymerkonzentration) wirksam sind, um HDL- Bindung an Glasfasern in der Gegenwart eines Präzipitations-Agens zu verhindern.
Zur Vervollständigung der Beschreibung der Fig. 1 wird nun wieder auf diese Bezug genommen. Die Vorrichtung 14 umfaßt eine Testplatte 60 bestehend aus einem länglichen Träger 62 und mehreren benetzbaren absorbierenden Reaktionstestpads 64, 66, 68 und 70, die auf der unteren Oberfläche des Trägers an den gezeigten Positionen getragen werden. Der Träger ist durchsichtig oder er hat durchsichtige Fenster, die es ermöglichen, die Testpads durch den Träger zu sehen. Die Pads in der Testplatte sind am Träger durch durchsichtiges oder durchscheinendes klebendes Material oder durch Ultraschallschweißen oder andere geeignete Bindungsmethoden befestigt. Jedes in einem bestimmten Assay verwendete Pad beinhaltet analyt-abhängige Reagenzien, die wirksam sind, um eine analyt-abhängige Veränderung in dem Pad zu erzeugen, die optisch entweder visuell oder durch einen Detektor in bekannter Weise festgestellt werden kann. Alle Pads oder eine integrale Teilmenge der Pads kann in einem bestimmten Assay verwendet werden. Die Natur der Reagenzien für Cholesterin und Triglyzerid-Assays wird im folgenden in Abschnitten B und C beschrieben.
Es ist wünschenswert, daß die Reaktionstestpads poröses geschmolzenes Polymer oder mikroporöse Polymermembranen sind, die nach vollständiger Penetration der Flüssigkeit eine Dicke von etwa 100-150 um und Seitenabmessungen von etwa 3 mm aufweisen. Das Absorptionsvolumen jedes dieser Pads beträgt vorzugsweise zwischen etwa 0,5-2 ul. Ein bevorzugtes Kompositionsmaterial der Reaktionspads ist Polysulfon.
Wenn das Serum die Probensammelbereiche, wie den Bereich 32 erreicht, der an die Enden der Matrix 26 angrenzt, wird die Testplatte 60 bewegt, bis die Pads 64, 66, 68, 70 in Kontakt mit der Matrix sind. In dieser Position wird die Flüssigkeitsprobe in der Matrix durch Kapillarfluß in das angrenzende Pad gezogen, wobei die Flüssigkeitsbewegung in der Richtung senkrecht zur Testpadoberfläche erfolgt. Die Platte wird in dieser Position gehalten, bis ein gewünschtes Ausmaß an Benetzung der Testpads erreicht ist.
Die analyt-abhängigen Reagenzien in den Testpads erzeugen eine analytabhängige Veränderung in den Testpads, welche optisch entweder visuell oder mit einem Detektor in einer bekannten Art und Weise festgestellt werden kann. Ein bevorzugter Apparat zum Ablesen der Signallevel auf den Testpads und zur Berechnung eines korngierten Analytwerts, der auf dem abgelesenen Wert basiert, ist in der internationalen PCT-Veröffentlichung WO 90/10869 mit dem Titel "Analyte Assay Device and Apparatus", veröffentlicht am 20. September 1990, beschrieben.
Die Testplatte 60 ist auf dem Träger 15 mittels eines Paars von elastischen Elementen, wie beispielsweise elastomerischen Blöcken 71, 72, befestigt. Die Blöcke bewirken eine Vorspannung der Testpads in einer Nicht-Transferposition, in der die Testpads von der Probenübertragungsoberfläche mit einem typischen Abstand von etwa 0,5 bis 1,0 mm beabstandet sind.

HDL-Assay

Zum Betrieb der Vorrichtung in einem Assay zur Bestimmung des HDL in einer kleinen Blutprobe wird die Blutprobe im Reservoir 16 plaziert (Fig. 1a) und die Probe wird durch Kapillarität in und durch das Pad 22 gezogen, wodurch eine zellfreie Serumprobe erhalten wird, die dann durch das Reservoir 34 in die Matrix 26 gezogen wird. Die Ablagerung aus Präzipitations-Agens und Binder auf dem Reservoirnetzwerk wird langsam unter Freisetzung des Präzipitations-Agens in die Flüssigkeitsprobe aufgelöst, wenn die Flüssigkeitsprobe in das Netzwerk des Reservoirs gezogen wird. Wie oben beschrieben, ist das Reservoir so ausgelegt, daß es die gesamte Menge des Präzipitations-Agens über einen ausgewählten Bereich des gesamten Fließmittelflusses des Reservoirs freisetzt - typisch über mindestens die ersten 10-40% des gesamten Fließmittelflusses und vorzugsweise über mindestens die ersten 20% des Flusses. Die Freisetzungsrate des Präzipitations-Agens ist so, daß eine Konzentration des Agens in der Flüssigkeitsprobe aufrecht erhalten wird, die in dem erforderlichen Bereich liegt, um selektiv die in der Probe vorhandenen LDL und VLDL zu präzipitieren, ohne nennenswerte Mengen von HDL zu präzipitieren.
Wenn die Cholesterin beinhaltenden Teilchen in den stromabwärtigen Bereich der Fließmittelfront in die Matrix und in Richtung des Probensammelbereiches auf der rechten Seite der Figur gezogen werden, werden die aggregierten und nichtaggregierten Partikel chromatografisch getrennt, wie zuvor beschrieben wurde und in Fig. 4 dargestellt ist. Die Flüssigkeitsprobe, die zuerst den Probensammelbereich erreicht, ist im wesentlichen frei von nicht-HDL-Partikeln, aber sie hat die gleiche HDL-Konzentration, wie das zellfreie (Serum) Flüssigkeitsprobenserum, das in die Matrix eingeführt wird.
Fig. 7 ist eine Aufsicht auf die obere Oberfläche der Matrix 26 in der Vorrichtung 14, wie sie durch den Träger 62 gesehen wird, wobei außerdem die vier Reaktionspads gezeigt sind, welche auf der Testplatte 60 getragen werden und mit 64, 66, 68 und 70 bezeichnet sind. Die gepunkteten Linien 72 in der Figur zeigen die Ränder des darunterliegenden Bereiches 22 an und nähern sich den Rändern des Reservoirs 34 in der Vorrichtung an, das in dem freigeschnittenen Bereich unterhalb der Matrix 26 gezeigt ist. Das Reservoir ist zur langsamen Freisetzung von Dextransulfat und Mg²&spplus; entworfen, welches als eine getrocknete Ablagerung 36 auf den Netzwerkfasern 38 in der Figur dargestellt ist, wie oben beschrieben wurde. Anhand der Figur ist zu erkennen, daß die zu beiden Seiten der Matrix gezogene Flüssigkeitsprobe dem Präzipitations-Agens ausgesetzt ist, so daß nicht-HDL-Partikel auf beiden Seiten der Matrix vom HDL-Analyt getrennt sind, wenn die Flüssigkeitsprobe die Probensammelbereiche unterhalb der Reaktionspads erreicht.
Zwei der Reaktionspads der in der Fig. 7 gezeigten Ausführungsform sind für einen Doppelassay von HDL-Cholesterin (HDL&sub1; und HDL&sub2;) entworfen, wie unter 66 und 68 in der Figur angedeutet ist. Zwei Referenzstandardpads B&sub1; und B&sub2; (64 und 70) stellen eine selbstkorrigierende Standkurve zur Bestimmung des Cholesterinwerts bereit, wie in der internationalen PCT-Veröffentlichung WO 90/02200 "Self-Corrected Assay und Method", veröffentlicht am 08. 03.1990, beschrieben ist. Es ist zu würdigen, daß eine Anzahl von Konfigurationen der HDL-Testpads und der Referenzstandardtestpads möglich sind, das heißt, die Referenzstandardpads könnten alternativ an Positionen 66 und 68, 64 und 66 sowie 68 und 70 angeordnet sein, wobei die HDL-Testpads in jedem Fall an den alternativen Positionen sein würden. Alternativ dazu kann die Vorrichtung mit nur einem Reaktionstestpad hergestellt werden, das ein cholesterinabhängiges Reagenz enthält. Zusätzlich kann die Vorrichtung ohne ein Referenzstandardpad hergestellt werden und standardisierte Werte des Reflektionsvermögens können benutzt werden, um die Konzentration des in der getesteten Flüssigkeitsprobe vorliegenden HDL-Cholesterins zu bestimmen.
Wenn das Serum die Probensammelbereiche 30,32 erreicht, die an die Enden der Matrix 26 angrenzen, wird die Testplatte zu ihrer Probenübertragungsposition bewegt, bei der die Testpads in Kontakt mit der Matrix sind. In dieser Position wird die Flüssigkeitsprobe im Dispenser durch Kapillarfluß in die Testpads gezogen, wobei die Fließbewegung in einer Richtung senkrecht zur Oberfläche der Testpads erfolgt. Die Platte wird in dieser Position gehalten, bis ein gewünschter Grad an Benetzung der Testpads erzielt wurde.
Die cholesterinabhängigen Reagenzien in den Testpads erzeugen eine Veränderung in den Pads, die entweder visuell oder mit einem Detektor nach bekannter Weise optisch nachgewiesen werden kann. Ein bevorzugter Apparat zum Ablesen des Signalspiegels der Pads und zum Berechnen eines korrigierten Analytwerts basierend auf den gelesenen Werten ist in der oben zitierten internationalen PCT-Veröffentlichung WO 90/10869 beschrieben.
Der oben beschriebene Apparat enthält sowohl Pads (HDL) als auch Referenzstandardpads (B&sub1; und B&sub2;), da er zur Durchführung des HDL-Assays konfiguriert ist. Die Testpads enthalten übliche Komponenten der Reagenzien des Reaktionswegs zur Umwandlung von H&sub2;O&sub2; zu einem farbigen Signalreaktionsprodukt. Die üblichen Reaktionswegkomponenten beinhalten Peroxidase einen Einzelfarbstoff oder ein gekoppeltes Farbstoffsystem, welches durch die Peroxidase in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; in ein unterscheidbar gefärbtes Signalreaktionsprodukt umgewandelt wird. Enzymatische Farbreaktionen, die eine Vielzahl von substratspezifischen Oxidasen zur enzymatischen Erzeugung von H&sub2;O&sub2; und anschließender Oxidation eines Farbstoffs zu einem gefärbten Reaktionsprodukt verwenden, sind wohl bekannt. Die HDL-Testpads enthalten neben den üblichen Reaktionswegkomponenten Cholesterinesterase, um freies Cholesterin vom HDL freizusetzen, und Cholesterinoxidase, um H&sub2;O&sub2; durch Reaktion mit dem freien Cholesterin in der Probe zu erzeugen.
Die Referenzstandardpads enthalten neben den üblichen Reaktionswegkornponenten unterschiedliche bekannte Mengen einer Nichtcholesterinreferenzverbindung, vorzugsweise einer D-Aminosäure und einer Oxidase, wie einer D-Aminosäureoxidase zur Erzeugung von H&sub2;O&sub2;, wenn das Pad von der Flüssigkeitsprobe benetzt wird.
Die in den bei dem HDL-Assay verwandten Reaktionspads und Referenzpads vorhandenen Reaktionskomponenten sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1
In der oben beschriebenen Assay-Vorrichtung ist die Menge einer Referenzverbindung, die zu jedem Referenzstandard zugegeben wird, so gewählt, daß sie in Gegenwart eines gegebenen Volumens einer definierten Reaktionsmixtur einen Signalspiegel erzeugt, der einer bekannten Konzentration von Cholesterin nach einem Assay unter identischen Bedingungen in der Gegenwart von Cholesterinoxidase entspricht. Der tatsächlich in dem Assay erfolgte Referenzstandard wird ebenfalls abhängen von (a) der Menge der löslichen, störenden Verbindungen, die in der Serumprobe vorhanden sind (zu unterscheiden von nicht-HDL-Verbindungen, die die Messung von HDL- Cholesterin stören), (b) der Bedingung der Reaktionskomponenten in dem Pad, und (c) den · Reaktionsbedingungen einschließlich der Temperatur und der Reaktionszeit.
Die Signalwerte der beiden Referenzpads ergeben eine Zwei-Punkt- Standardkurve, wie sie in Fig. 8 gezeigt ist, wenn sie als eine Funktion der Konzentration der Referenzverbindung geplottet wird. Der Signalwert wird vom Reflektionsvermögen oder anderen gemessenen Signaleigenschaften errechnet, in dem bekannte Zusammenhänge zwischen der gemessenen Signaleigenschaft und dem aufgetragenen Signalwert verwendet werden. Die Tatsache, daß die Kurve in Fig. 8 nicht den Ursprung des Graphen schneidet, deutet einen nicht-linearen Inhibitionseffekt an.
Die für die doppelten HDL-Pads gemessenen Werte werden auf der Referenzstandardkurve aufgetragen und dann wird der bekannte Zusammenhang zwischen dem Referenzstandard und den Cholesterinkonzentrationen benutzt, um die Cholesterinkonzentration in jedem dieser Testpads zu bestimmen. Hierbei ist zu würdigen, daß die so berechneten Cholesterinwerte (a) auf der Basis einer Standardkurve berechnet sind und (b) selbst korrigiert sind für Abweichungen der Reaktionsbedingungen und für inhibitorische Effekte und Aktivitätsverluste der üblichen Reaktionswegkomponenten unter der Annahme, daß alle vier Reaktionspads den gleichen Variationen bzgl. dieser Faktoren unterworfen sind. Die Konzentration des mit HDL assoziierten Cholesterins kann vom Durchschnitt der in beiden HDL-Probenpads bestimmten Cholesterinkonzentration berechnet werden. Alternativ dazu kann die Cholesterinkonzentration anhand des Reflektionsvermögens bestimmt werden, das von einem einzelnen HDL- Probenpad erhalten und mit einem einzelnen Referenzstandard oder mit einem Standard von historisch erhaltenen Werten des Reflektionsvermögens verglichen wurde.

C Multianalyt Lipid Assay

Dieser Abschnitt beschreibt Ausführungsformen der Assay-Vorrichtungen, welche für die Multianalytbestimmung von Serumkomponenten einschließlich HDL-Cholesterin und zusätzlich eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe umfassend gesamtes Serumcholesterin, LDL-Cholesterin und Serumtriglyzeride entworfen worden ist.
Fig. 9a ist eine Aufsicht auf die obere Oberfläche einer zweiteiligen Matrix 76, 78 in der Assay-Vorrichtung, wobei die punktierte Linie 72 wiederum die Ränder der Siebpadregion unterhalb des Probeneingabebereichs der Matrix andeutet.
Fasern 38 und die Ablagerungen des Präzipitations-Agens 36, die auf den Fasern enthalten sind, sind in dem freigeschnittetem Ausschnitt nur auf der rechten Seite der Matrix 76 gezeigt, welche in dieser Vorrichtung das Reservoir 74 enthält. Die Flüssigkeitsprobe, welche zur Matrix 76 gezogen ist, passiert dieses Reservoir, wobei sie eine langsame Freisetzung des Präzipitations-Agens und Präzipitation der nicht-HDL-Lipoproteine im Probenmaterial verursacht. Das von dem Siebpad zur linken Seite der Matrix 78 fließende Material ist nicht dem Präzipitations- Agens ausgesetzt. Fig. 9b zeigt eine fragmentarische Querschnittsansicht der Vorrichtung im Probeneingabebereich, wobei die Aufteilung zwischen den beiden Teilen der Matrix 76, 78 und das Vorliegen des Präzipitations-Agens 82 (angedeutet durch Punktierung) in dem Reservoir auf der rechten Seite aber nicht auf der linken Seite der Vorrichtung illustriert ist. Die Aufteilung zwischen den beiden Seiten des Reservoirs und der Matrix der Vorrichtung ist als ein Spalt in den Fig. 9a und 9b illustriert; als Alternative dazu kann eine physikalische Barriere, wie beispielsweise eine Plastikfolie, die für die Flüssigkeitsprobenflüssigkeit undurchlässig ist und die daher die Diffusion zwischen den beiden Teilen der Siebmatrix verhindert, in der Vorrichtung verwendet werden. Der als 80 angedeutete Bereich auf der linken Seite der Vorrichtung, der dem Reagenzreservoir entspricht, kann eine netzwerkartige Reagenzreservoirmatrix enthalten, oder er kann durch die Trennungsmatrix 78 besetzt sein. Die gesamte Matrix 76, 78 ist vorzugsweise mit hydrophilem Polymer oder Silylierungsagenzien beschichtet, wie oben beschrieben wurde.
Die vier Reaktionstestpads der in Fig. 9a gezeigten Ausführungsform sind zur Messung des gesamten Cholesterins (TCh), Triglyzeridlipids (TG), und HDL- Cholesterins (HDL) ausgelegt und umfassen ein Referenzstandardtestpad (B&sub1;). Jedes Pad umfaßt die oben beschriebenen allgemeinen Reaktionswegkomponenten zur Umwandlung von H&sub2;O&sub2; zur einem unterscheidbar gefärbten Signalreaktionsprodukt. Das Referenzstandardpad enthält eine bekannte Menge einer Referenzverbindung, wie beispielsweise D-Aminosäure und eine entsprechende Oxidase, wie zuvor beschrieben wurde.
Die Testpads für das gesamte Cholesterin und für HDL enthalten jeweils zusätzlich zu den allgemeinen Reaktionswegkomponenten Cholesterinesterase zur Freisetzung des veresterten Cholesterins von den Serumlipoproteinen in freie Cholesterinform, wobei die Lipoproteine HDL-, LDL- und VLDL-Partikel umfassen, und Cholesterinoxidase zur Erzeugung von H&sub2;O&sub2; durch die Reaktion mit dem freien Cholesterin in der Flüssigkeitsprobe.
Die Triglyzeridtestpads enthalten zusätzlich zu den allgemeinen Reaktionswegtestkomponenten Lipase, L-Glyzerinkinase und L-Glyzerin-3- Phosphatoxidase zur Erzeugung von H&sub2;O&sub2; aus Triglyzerid. Diese drei Enzyme dienen zur Konvertierung des Triglyzeridsubstrats in L-Glycerin-3-Phosphat und zum Oxidieren der letztgenannten Verbindung unter der Erzeugung von H&sub2;O&sub2;. Insofern, als die in das TG-Pad gezogene Serumprobe alle der Serumlipoproteine enthält, repräsentiert das TG-Signal die gesamten Serumtriglyzeride.
Das Referenzstandardpad in dem Assay wird verwendet zur Erzeugung einer Ein- Punkt-Standardkurve, wie sie in Fig. 10 gezeigt ist. Die Standardkurve entspricht vorherbestimmten Konzentrationen von Cholesterin und Triglyzeriden und stellt daher einen Plot zur Bestimmung der Analyt-Konzentrationen von den gemessenen Signalwerten bereit. Wie oben beschrieben, ermöglicht die Standardkurve eine Korrektur der gelesenen Analytwerte aufgrund von Verlust der Enzymaktivität in den gemeinsamen Reaktionspfadkomponenten und aufgrund von Schwankungen der Reaktionsbedingungen, obwohl nicht lineare Inhibitionseffekte unkorrigiert bleiben. Selbstverständlich könnte eine Zwei- Punkt-Standardkurve, wie sie in Fig. 8 gezeigt ist, generiert werden, indem eine Assayvorrichtung mit fünf Pads verwendet wird.
Die Signalwerte für das gesamte Cholesterin, Triglyzerid und HDL werden auf der Standardkurve aufgetragen, um die selbstkorrigierten Analytkonzentrationswerte für diese drei Analytpads zu bestimmen. Aus diesen Werten kann das LDL-Cholesterin nach der folgenden Beziehung berechnet werden:
LDL-Cholesterin = gesamtes Cholesterin - gesamte Triglyceride/5 - HDL-Cholesterin.
Nach dem Vorhergehenden ist zu würdigen, wie die unterschiedlichen Aufgaben und Merkmale der Erfindung realisiert werden. Die Assay-Vorrichtung stellt eine einfache Einschrittmethode zur Durchführung eines Assays an einem Analyt in einer Flüssigkeitsprobe bereit, die eine selektiv präzipitierbare störende Verbindung enthält, ohne die Notwendigkeit, die Probe vorher zu zentrifugieren oder vorzubehandeln. Dieses Merkmal ist besonders nützlich zur Durchführung eines Assays hinsichtlich multipler Analyten in kleinen Volumina, die nicht mit vertretbarem Aufwand vorbehandelt werden können, um die störenden Komponenten zu entfernen. Die Methode ermöglicht insbesondere, daß ein kleines Blutvolumen, typischerweise weniger als 50 ul, in einem Multianalytassay eingesetzt werden kann, indem zumindest ein Analyt, beispielsweise HDL, das selektive Entfernen verwandter Lipoproteine verlangt.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Präparation und die Verwendung der Assayvorrichtung zum Testen auf Cholesterin und andere Lipide. Die Beispiele sind zur Erläuterung der Erfindung aber nicht zur Beschränkung von deren Umfang gedacht.

Beispiel 1

HDL-Assay

Eine Assay-Vorrichtung, wie die in Fig. 1 beschriebene, wurde unter Verwendung der bevorzugten Filtermaterialien, die in Abschnitt A beschrieben wurden, präpariert. Die Stammlösung A enthielt 2 g/100 ml von 50.000 Dalton Dextransulfat. Die Stammlösung B enthielt 1 M Magnesiumacetat. Einem Glasfaserfilter von 150 um Dicke und Abmessungen von 3,175 mm · 7,938 mm (1/8 inch · 5/16 inch) wurden jeweils 0,75 ul der Vorratslösungen A und B und 2,21 ul Wasser zugegeben. Der Filter wurde 20 Minuten lang bei 50ºC getrocknet und in die Vorrichtung als das Präzipitations-Agens enthaltende Reservoir, wie oben beschrieben, eingebaut.
Vier Testpads in der Vorrichtung enthielten die zuvor in Abschnitt B beschriebenen Reagenzien. Jedes Reaktionspad wurde von einem 150 um dicken Polysulfonfilter (TR 450; Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) präpariert, der in 2 mm · 4 mm große Rechtecke zugeschniaen war. Den beiden Reaktionspads zur Cholesterinbestimmung wurden 10 ul einer Reagenzlösung eingegeben, die 150 U/ml Cholesterinesterhydrolase, 10 U/ml Cholesterinoxidase, 80 U/ml Peroxidase und 20 mM 4-Amino-Antipyrin (4-AAP) sowie 80 mM N-ethyl-N- sulfohydroxypropyl-M-toluidin (TOOS) in reduzierter Form in einem Phosphatpuffer bei neutralem pH enthielt. Die beiden Reaktionspads für die Referenzstandards enthielten eine mit 40 U/ml D-Aminosäurenoxidase, 80 U/ml Peroxidase und 20 mM 4-Aminoantipyrin (4-AAP) und 80 mM TOOS in reduzierter Form in einem Phosphatpuffer getränkte und dann getrocknete Lage. Anschließend wurden 3 ul von 20 mM D-Aminosäure in Ethanol zugegeben und das Pad wurde getrocknet. Die Mengen der Referenzstandards wurden in einem Flüssigkeitsphasenassay mit einem definierten Reaktionspuffer und unter definierten Reaktionsbedingungen kalibriert und mit ähnlich gemessenen Cholesterinkonzentrationen von einem vorherbestimmten Volumen einer Cholesterinlösung bekannter Konzentration in einem nicht-ionischen Detergenz verglichen. Nach dem Trocknen unter reduziertem Druck wurden die Reaktionspads eingebaut und an der Reaktionspadsplatte der Vorrichtung befestigt.
Eine Vollblutprobe einer Testperson wurde konventionell erhalten und dem Reservoir in der Vorrichtung in einer hinreichenden Menge eingegeben, um die vier Testpads zu benetzen. Die benetzten Testpads wurden bei Raumtemperatur für 90 Sekunden, oder bis keine weitere Farbentwicklung mehr beobachtet wurde, inkubiert.
Das analytabhängige Signal wurde durch Reflektionsvermögensspektroskopie mit einer Beleuchtungswellenlänge von 500-700 nm abgelesen. Die Werte für die Referenzstandardpads wurden aufgetragen, um eine selbstkorngierte Zwei-Punkt- Standardkurve zu erlangen, nach der die für Cholesterin abgelesenen Werte berechnet wurden.

Beispiel 2

Serum HDL Assay

Die verwendete Assay-Vorrichtung war ähnlich zu der im Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebenen und wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Reservoirs präpariert, das ein Dextransulfat (MW 50.000)-Mg Präzipitations-Agens bei neutralem pH enthielt. Die Reaktionspadzubereitungen waren, wie in Beispiel 1 beschrieben, zur enzymatischen Bestimmung von Cholesterin. Die 3,175 mm · 7,938 mm (1/8 inch · 5/16 inch) 150 um dicken Glasfaserfilter wurden mit 5 Gew.-% Polyvinylalkohol beschichtet und ansonsten wie in Beispiel 1 verwendet.
Fünf Proben menschlichen Serums wurden präpariert, um bekannte Mengen von HDL Cholesterin zu enthalten, wobei die Konzentrationen über einen Bereich von 15-100 mg/dL mit gleichmäßig beabstandeten Verdünnungen variierten. Das HDL Cholesterin aller Proben wurde dreifach in der Assayvorrichtung mit den in Tabelle 2 wiedergegebenen Ergebnissen gemessen: Tabelle 2
Die errechneten oder theoretischen Werte (y-Achse) wurden, wie in Fig. 11 gezeigt, gegen die Ergebnisse für die Proben aufgetragen, die bei Messung mit der erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung erhalten wurden.
Wie durch dieses Beispiel gezeigt wird, liefert die erfindungsgemäß verbesserte Assay-Vorrichtung HDL-Messungen, die die gleiche Genauigkeit haben wie Flüssigkeitsphasentests, die im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung venöse Blutproben und Flüssigkeitsprobenbehandlungen erfordern.

Beispiel 3

Serum Lipid-Assay

Die Assay-Vorrichtung ist ähnlich zu der im Zusammenhang mit Fig. 9 beschriebenen und mit einem Präzipitationsreagenzreservoir in dem Probeneintragsbereich, das nur an das halbe unterliegende Siebpad angrenzt, wobei die Vorrichtung unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionstestpadzubereitung präpariert wurde.
Die Werte für die Reaktionspads werden bei 500-700 nm wie oben gemessen. Die Messung des Reflektionsvermögens von dem fünften Pad wird verwendet, um eine Standardkurve zu konstruieren, und diese Kurve ist, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf bekannte Cholesterin und Triglyzeridkonzentrationen standardisiert. Die Signale von den ersten vier Testpads sind auf dieser Kurve aufgetragen und die korrigierte Analytkonzentration wird von der entsprechenden Position auf der Konzentrationsachse ausgelesen.
Das gesamte Serumcholesterin, HDL, freies Cholesterin und Triglyzeride werden nach der Standardkurve bestimmt und diese Werte werden verwendet, um LDL, wie oben beschrieben, zu berechnen.

Claims

1. Assay-Vorrichtung (14) zur Messung von mit Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) assoziiertem Serum-Cholesterin in einer Blutflüssigkeitsprobe, die ebenfalls Lipoproteine geringer Dichte (LDL) und Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) enthält, wobei die Vorrichtung umfaßt

eine Matrix (26, 76, 78) aus Glasfasern (38, 50), die sich dafür eignet, lösliche Lipoproteine hoher Dichte von gefällten Lipoproteinen geringer Dichte und Lipoproteinen sehr geringer Dichte in der Blutflüssigkeitsprobe zu trennen, wenn das flüssige Material durch die Matrix von einem Probeneintragsort (28) zu einem Probensammelort (30, 32) in der Matrix fließt,

ein Fällungsmittel, das sich dafür eignet, selektiv LDL und VLDL aus der Flüssigkeitsprobe auszufällen, wenn das Probenmaterial in die Matrix fließt, und

einen Assay-Pad (64, 66, 68, 70), in den eine an dem Probensammelort gesammelte Flüssigkeit übergeführt werden kann,

dadurch gekennzeichnet, daß die Fasern der Matrix mit einem hydrophilen Silylierungsmittel (54) der allgemeinen Form R-Si(OX)n, wobei R für eine hydrophile Gruppe, X für niederes Alkyl und n für 2 oder 3 steht, oder einem hydrophilen Polymer (56) beschichtet sind, wobei Art und Menge so gewählt sind, daß die Oberflächen-Silanolgruppen auf den Glasfasern im wesentlichen maskiert sind, wodurch verhindert wird, daß sich die Lipoproteine hoher Dichte in Gegenwart des Fällungsmittels unspezifisch an die Fasern binden.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Glasfasern mit dem Fällungsmittel beschichtet sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Fällungsmittel eine polyanionische Verbindung und ein Kation eines Metalls der Gruppe II umfaßt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der man die polyanionische Verbindung aus der Gruppe bestehend aus sulfatierten Polysacchariden, Heparin und Wolframphosphorsäure und das Metall der Klasse II aus der Gruppe bestehend aus Mg²&spplus;, Mn²&spplus; und Ca²&spplus; auswählt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1-4, bei der man das hydrophile Polymer aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyethylenimin, Polyvinylsulfonsäure, Poly-(3-hydroxybuttersäure), Polyacrylsäure, Poly-(3-hydroxyvaleriansäure), Poly-(4-styrolsulfonsäure), Poly-(2-acrylamidosulfonsäure) und Poly-L-glutamat auswählt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1-4, bei der die Silylierungsmittelbeschichtung aus Silylethern besteht.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der die Beschichtung aus Silylmono- oder -diethern von Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan besteht.

8. Verfahren zur Trennung von Lipoproteinen hoher Dichte von Lipoproteinen geringer Dichte und Lipoproteinen sehr geringer Dichte in einer Blutflüssigkeitsprobe, bei dem man die Flüssigkeitsprobe am Probeneintragsort einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-7 einträgt und durch den Eintrag eine Trennung der Lipoproteine hoher Dichte von den Lipoproteinen geringer Dichte und den Lipoproteinen sehr geringer Dichte in der Probe erzielt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man weiterhin die Menge des mit HDL assoziierten Cholesterins in der getrennten Probe aus Lipoproteinen hoher Dichte bestimmt.