JP3471301B2 - シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及びその製造方法 - Google Patents
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及びその製造方法Info
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、シクロヘキサンカ
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及び菌体を用い
て該酵素を製造する方法に関する。
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及び菌体を用い
て該酵素を製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】フェノール性エステル加水分解酵素とし
ては、アリールエステラーゼの存在が知られており、例
えばクリニカ キミカ アクタ(Clin.Chim.Acta),7
巻、560頁(1962年)に記載のヒト血液中アリールエス
テラーゼやバイオキミカ バイオフィジカ アクタ(Bioc
him. Biophys. Acta),276巻、180頁(1972)に記載の
アリールエステラーゼ等が知られている。
ては、アリールエステラーゼの存在が知られており、例
えばクリニカ キミカ アクタ(Clin.Chim.Acta),7
巻、560頁(1962年)に記載のヒト血液中アリールエス
テラーゼやバイオキミカ バイオフィジカ アクタ(Bioc
him. Biophys. Acta),276巻、180頁(1972)に記載の
アリールエステラーゼ等が知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらアリ
ールエステラーゼは、動物の各組織から精製されたもの
であり、該酵素の生産性が低く、工業的に該酵素を供す
ることは困難であった。
ールエステラーゼは、動物の各組織から精製されたもの
であり、該酵素の生産性が低く、工業的に該酵素を供す
ることは困難であった。
【0004】また、これらアリールエステラーゼを用い
た場合には、医薬品として重要なセトラキサートや液晶
性エステル化合物を製造することができない。
た場合には、医薬品として重要なセトラキサートや液晶
性エステル化合物を製造することができない。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、フェノール性
のエステルを強く加水分解し、かつ酵素生産性の高い微
生物由来のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素を効率よく製造する方法を見い出すことが
でき、本発明を完成するに至った。
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、フェノール性
のエステルを強く加水分解し、かつ酵素生産性の高い微
生物由来のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素を効率よく製造する方法を見い出すことが
でき、本発明を完成するに至った。
【0006】即ち、本発明は、下記理化学的性質を有す
るシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解
酵素である。 〔理化学的性質〕 作用: 水の存在下で、1モルのセトラキサートか
ら1モルのトラネキサム酸と1モルのヒドロキシフェニ
ルプロピオン酸を生成せしめる。 基質特異性: N−アセチルセトラキサート、トラ
ネキサム酸フェニル、セトラキサート、4−(2−カル
ボキシエチル)フェニルシクロヘキサンカルボキシレー
ト、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用し、トラネキ
サム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチルに対しては作
用を示さない。 至適pH: pH8.0〜9.0 pH安定性: 4℃下にて24時間保存したとき、
pH6.0〜11.0において80%以上の残存活性を
有する。 至適温度: 0.1Mリン酸緩衝液(pH
7.5)において55〜60℃ 温度安定性: 0.
01Mリン酸緩衝液(pH7.5)において、各温度に
5分間保持した時、50℃以下で90%以上の残存活性
を有する。
るシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解
酵素である。 〔理化学的性質〕 作用: 水の存在下で、1モルのセトラキサートか
ら1モルのトラネキサム酸と1モルのヒドロキシフェニ
ルプロピオン酸を生成せしめる。 基質特異性: N−アセチルセトラキサート、トラ
ネキサム酸フェニル、セトラキサート、4−(2−カル
ボキシエチル)フェニルシクロヘキサンカルボキシレー
ト、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用し、トラネキ
サム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチルに対しては作
用を示さない。 至適pH: pH8.0〜9.0 pH安定性: 4℃下にて24時間保存したとき、
pH6.0〜11.0において80%以上の残存活性を
有する。 至適温度: 0.1Mリン酸緩衝液(pH
7.5)において55〜60℃ 温度安定性: 0.
01Mリン酸緩衝液(pH7.5)において、各温度に
5分間保持した時、50℃以下で90%以上の残存活性
を有する。
【0007】また、他の発明は、シュードモナス属に属
するシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分
解酵素生産能を有する菌体を培養して得られた培養物か
ら採取することを特徴とする請求項1に記載のシクロヘ
キサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造
方法である。
するシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分
解酵素生産能を有する菌体を培養して得られた培養物か
ら採取することを特徴とする請求項1に記載のシクロヘ
キサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造
方法である。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明において、シクロヘキサン
カルボン酸フェニルエステルとは、シクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル及びその誘導体を意味し、具体
的には、例えば、4−(2−カルボキシエチル)フェニルト
ランス−4−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシレ
ート[一般にセトラキサートと称される]、トラネキサ
ム酸フェニル、N−アセチルセトラキサート、4−(2
−カルボキシエチル)フェニルシクロヘキサンカルボキ
シレートなどが挙げられる。
カルボン酸フェニルエステルとは、シクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル及びその誘導体を意味し、具体
的には、例えば、4−(2−カルボキシエチル)フェニルト
ランス−4−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシレ
ート[一般にセトラキサートと称される]、トラネキサ
ム酸フェニル、N−アセチルセトラキサート、4−(2
−カルボキシエチル)フェニルシクロヘキサンカルボキ
シレートなどが挙げられる。
【0009】本発明においては上記シクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステルを加水分解する酵素を製造する
が、このとき微生物としてはシュードモナス・ペルツシ
ノゲナ IFO 14163(Pseudomonas pertucinogena)、シ
ュードモナス・アエルギノサIFO 3080(Pseudomonas ae
ruginosa)等のシュードモナス(Pseudomonas)属に属
するシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分
解酵素生産能を有する微生物を使用する。
ボン酸フェニルエステルを加水分解する酵素を製造する
が、このとき微生物としてはシュードモナス・ペルツシ
ノゲナ IFO 14163(Pseudomonas pertucinogena)、シ
ュードモナス・アエルギノサIFO 3080(Pseudomonas ae
ruginosa)等のシュードモナス(Pseudomonas)属に属
するシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分
解酵素生産能を有する微生物を使用する。
【0010】本発明においては、これらシュードモナス
(Pseudomonas)属に属するシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素生産能を有する菌体を培
養し、その培養物から菌体を分離し、分離された菌体か
らシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解
酵素を抽出する。
(Pseudomonas)属に属するシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素生産能を有する菌体を培
養し、その培養物から菌体を分離し、分離された菌体か
らシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解
酵素を抽出する。
【0011】本発明におけるこれら菌体の培養は、培地
を用いて行なうことができる。菌体を培養する際に使用
する培地としては特に限定されない。例えば炭素源とし
てグルコース、糖密、可溶性でんぷん等の炭素源、窒素
源として肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン等の窒素
源、無機塩類として例えば燐酸第一カリウム、燐酸第二
カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸ア
ンモニウム等の無機塩類を適宣組み合わせたものであれ
ばよい。
を用いて行なうことができる。菌体を培養する際に使用
する培地としては特に限定されない。例えば炭素源とし
てグルコース、糖密、可溶性でんぷん等の炭素源、窒素
源として肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン等の窒素
源、無機塩類として例えば燐酸第一カリウム、燐酸第二
カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸ア
ンモニウム等の無機塩類を適宣組み合わせたものであれ
ばよい。
【0012】また、培養条件としては、通気攪はん条件
下で培養温度が15〜40℃の範囲、好ましくは25〜
35℃の範囲で培養する方法が好適である。培養時のp
H条件は、4.0〜9.0の範囲で、好ましくはpH
5.0〜8.0の範囲が適当である。培養時間は、特に
限定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増
殖の後期に達する時間から休止状態に入ってから10時
間以内の範囲が適当である。シクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素は、培養物の中の菌体内
と培養液側の両者に蓄積される。
下で培養温度が15〜40℃の範囲、好ましくは25〜
35℃の範囲で培養する方法が好適である。培養時のp
H条件は、4.0〜9.0の範囲で、好ましくはpH
5.0〜8.0の範囲が適当である。培養時間は、特に
限定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増
殖の後期に達する時間から休止状態に入ってから10時
間以内の範囲が適当である。シクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素は、培養物の中の菌体内
と培養液側の両者に蓄積される。
【0013】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法や濾過等の方法が使用出来るが、遠心分離の
方法が好適である。
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法や濾過等の方法が使用出来るが、遠心分離の
方法が好適である。
【0014】本発明においては、分離された菌体内に蓄
積されたシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加
水分解酵素を菌体から抽出するが、抽出方法としては、
従来から行われている超音波による菌体破砕、あるいは
ガラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機によ
る菌体破砕又は、リゾチーム等の酵素やトルエン等の有
機溶媒による細胞膜の破壊等の方法を採用することがで
きる。これらの中から適当な方法を選択して菌体から酵
素の抽出を行うことにより、前記酵素を含む溶液(粗酵
素液ともいう)を得ることが出来る。
積されたシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加
水分解酵素を菌体から抽出するが、抽出方法としては、
従来から行われている超音波による菌体破砕、あるいは
ガラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機によ
る菌体破砕又は、リゾチーム等の酵素やトルエン等の有
機溶媒による細胞膜の破壊等の方法を採用することがで
きる。これらの中から適当な方法を選択して菌体から酵
素の抽出を行うことにより、前記酵素を含む溶液(粗酵
素液ともいう)を得ることが出来る。
【0015】これらの方法で抽出された粗酵素液からシ
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
をさらに精製する必要性がある場合は、通常実施されて
いる一般的な酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈
澱法、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾
過法、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法、疎水性カラ
ムクロマトグラフィー法、調製用電気泳動法等の方法を
適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことによって精
製を行うことが出来る。
クロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素
をさらに精製する必要性がある場合は、通常実施されて
いる一般的な酵素の精製手段である硫酸アンモニウム沈
澱法、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾
過法、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法、疎水性カラ
ムクロマトグラフィー法、調製用電気泳動法等の方法を
適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことによって精
製を行うことが出来る。
【0016】なお、用いる菌体の種類によっては前記培
養物の菌体以外の成分からシクロヘキサンカルボン酸フ
ェニルエステル加水分解酵素を分離することもでき、こ
の場合には、培養液を通常の酵素精製法に用いられる方
法、例えば塩析、透析等の処理を行なえばよい。
養物の菌体以外の成分からシクロヘキサンカルボン酸フ
ェニルエステル加水分解酵素を分離することもでき、こ
の場合には、培養液を通常の酵素精製法に用いられる方
法、例えば塩析、透析等の処理を行なえばよい。
【0017】このようにして得られるシクロヘキサンカ
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は、下記の特徴
的な理化学的性質を有する。該酵素は、例えば酵素生産
性の高いシュードモナス・ペルツシノゲナ(IFO14163)
によって生産される。
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素は、下記の特徴
的な理化学的性質を有する。該酵素は、例えば酵素生産
性の高いシュードモナス・ペルツシノゲナ(IFO14163)
によって生産される。
【0018】〔理化学的性質〕
作用
水存在下で、1モルのセトラキサートから1モルのトラ
ネキサム酸と1モルのヒドロキシフェニルプロピオン酸
を生成せしめる。 基質特異性 トラネキサム酸フェニル、セトラキサート、N−アセチ
ルセトラキサート、4−(2−カルボキシエチル)フェ
ニルシクロヘキサンカルボキシレート、トラネキサム酸
ヘキシルに対して作用し、トラネキサム酸ミリスチル、
トラネキサム酸メチルに対しては、作用を示さない。こ
れらのエステル類に対する作用の強さを、セトラキサー
トに対する作用を100とした相対活性値で表1に示
す。
ネキサム酸と1モルのヒドロキシフェニルプロピオン酸
を生成せしめる。 基質特異性 トラネキサム酸フェニル、セトラキサート、N−アセチ
ルセトラキサート、4−(2−カルボキシエチル)フェ
ニルシクロヘキサンカルボキシレート、トラネキサム酸
ヘキシルに対して作用し、トラネキサム酸ミリスチル、
トラネキサム酸メチルに対しては、作用を示さない。こ
れらのエステル類に対する作用の強さを、セトラキサー
トに対する作用を100とした相対活性値で表1に示
す。
【0019】
【表1】
【0020】 至適pH:pH8.0〜9.0(図1
に示す) pH安定性:4℃下にて24時間保存した時、pH
6.0〜11.0において80%以上の残存活性を有す
る。(図2に示す) 至適温度:0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)に
おいて55℃〜60℃(図3に示す) 温度安定性:0.01Mリン酸緩衝液(pH7.
5)において、各温度に5分間保持した時、50℃以下
で90%以上の残存活性を有する。(図4に示す) 分子量:220,000±20,000{(商品
名:HPLC用カラムTSK-gel G3000SWXL東ソー社製)によ
るゲル濾過法より}(図5に示す) Km値:0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.
0)の条件におけるセトラキサートに対するKm値は
0.5Mである。 阻害剤 種々の試薬及び金属イオンの濃度1mMまたは0.1m
Mでの本発明の酵素に対する影響を表2に示す。表2か
ら本発明の酵素は水銀イオンにより強く阻害を受けるこ
とがわかる。
に示す) pH安定性:4℃下にて24時間保存した時、pH
6.0〜11.0において80%以上の残存活性を有す
る。(図2に示す) 至適温度:0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)に
おいて55℃〜60℃(図3に示す) 温度安定性:0.01Mリン酸緩衝液(pH7.
5)において、各温度に5分間保持した時、50℃以下
で90%以上の残存活性を有する。(図4に示す) 分子量:220,000±20,000{(商品
名:HPLC用カラムTSK-gel G3000SWXL東ソー社製)によ
るゲル濾過法より}(図5に示す) Km値:0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.
0)の条件におけるセトラキサートに対するKm値は
0.5Mである。 阻害剤 種々の試薬及び金属イオンの濃度1mMまたは0.1m
Mでの本発明の酵素に対する影響を表2に示す。表2か
ら本発明の酵素は水銀イオンにより強く阻害を受けるこ
とがわかる。
【0021】
【表2】
【0022】
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
【0023】なお、各実施例におけるシクロヘキサンカ
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の活性測定方
法、及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
ルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の活性測定方
法、及び酵素活性値の表示方法は以下の通りである。
【0024】〔シクロヘキサンカルボン酸フェニルエス
テル加水分解活性の測定〕 2.0mMセトラキサート溶液{in 0.1Mクエン 酸緩衝
液(pH6.0))0.5ml、酵素溶液0.1ml、及び蒸留水0.4mlか
らなる溶液1.0mlをよく攪はん後、37℃、1時間イン
キュベートし、反応液とした。この反応液に直ちに50
%トリクロロ酢酸0.1mlを添加し、氷冷下15分間
静置後遠心分離操作をし、上清0.55mlを分取し
た。この除蛋白された上清0.55mlに0.5M酢酸
ナトリウム0.5mlと蒸留水0.45mlを添加し攪
はんした後HPLC分析サンプルとした。またブランクとし
て酵素溶液を蒸留水に代えてまったく同じ操作をした。
HPLC分析カラムはShim-pack CLC-ODS(6.0mmφ×150m
m)(商品名:島津製作所社製)を使用した。またトラ
ネキサム酸の検出は蛍光検出法により行った。このHPLC
分析により測定された酵素溶液系のトラネキサム酸の濃
度(Eμmol/l)、ブランク系のトラネキサム酸の濃度
(Bμmol/l)から酵素反応により生成したトラネキサ
ム酸の濃度をTμmol/lとするとTμmol/l=Eμmol/l
−Bμmol/lとなる。このトラネキサム酸の濃度より下
記計算式(1)により酵素活性値を算出した。
テル加水分解活性の測定〕 2.0mMセトラキサート溶液{in 0.1Mクエン 酸緩衝
液(pH6.0))0.5ml、酵素溶液0.1ml、及び蒸留水0.4mlか
らなる溶液1.0mlをよく攪はん後、37℃、1時間イン
キュベートし、反応液とした。この反応液に直ちに50
%トリクロロ酢酸0.1mlを添加し、氷冷下15分間
静置後遠心分離操作をし、上清0.55mlを分取し
た。この除蛋白された上清0.55mlに0.5M酢酸
ナトリウム0.5mlと蒸留水0.45mlを添加し攪
はんした後HPLC分析サンプルとした。またブランクとし
て酵素溶液を蒸留水に代えてまったく同じ操作をした。
HPLC分析カラムはShim-pack CLC-ODS(6.0mmφ×150m
m)(商品名:島津製作所社製)を使用した。またトラ
ネキサム酸の検出は蛍光検出法により行った。このHPLC
分析により測定された酵素溶液系のトラネキサム酸の濃
度(Eμmol/l)、ブランク系のトラネキサム酸の濃度
(Bμmol/l)から酵素反応により生成したトラネキサ
ム酸の濃度をTμmol/lとするとTμmol/l=Eμmol/l
−Bμmol/lとなる。このトラネキサム酸の濃度より下
記計算式(1)により酵素活性値を算出した。
【0025】酵素活性計算式: 生成したトラネキサム
酸の濃度をTμmol/lとすると酵素溶液1.0ml当りの酵素
活性値(u/ml)は、 酵素活性値=(3/1000)×(1/60)×(1/0.1)×T
(1) となる。ただし酵素活性単位u(ユニット)は1分間当
り1μmolのトラネキサム酸を生成することの出来る酵
素量と定義した。
酸の濃度をTμmol/lとすると酵素溶液1.0ml当りの酵素
活性値(u/ml)は、 酵素活性値=(3/1000)×(1/60)×(1/0.1)×T
(1) となる。ただし酵素活性単位u(ユニット)は1分間当
り1μmolのトラネキサム酸を生成することの出来る酵
素量と定義した。
【0026】尚、トラネキサム酸定量用HPLCの分析
条件は以下のようにした。
条件は以下のようにした。
【0027】〔HPLC分析条件〕
1. 装置
1) 液クロ本体・・・Waters 600E
2) カラム恒温槽(50゜C)・・・島津CTO-6A
3) 反応液送液ポンプ・・・Waters 510
4) 蛍光検出器・・・島津 RF-535
5) レコーダ及びデータ処理・・・島津 C-R4A
6) オートサンプラー・・・Waters 700
7) 反応槽(50℃)・・・島津 CRB-6A
8) UV検出器・・・Waters 484
2. カラム・・・島津 Shim-pack CLC-ODS(6.0mm
φ×150mm) 3. 移動相 I液 0.1M過塩素酸ナトリウム 10mMヘキサンスルホン酸ナトリウム (pH4.0) II液 I液 25% メタノール 75% (pH3.0) I液とII液による濃度勾配溶出法 4. 反応液 Brij-35・・・0.4g 炭酸二ナトリウム・・・40.0g ホウ酸・・・13.4g 硫酸カリウム・・・18.4g オルソフタルアルデヒド/12mlエタノール・・・0.80g β-メルカプトエタノール・・・2.0ml (pH10.5) 5. 流速・・・移動相:1.1ml/min 反応液:0.4ml
/min。
φ×150mm) 3. 移動相 I液 0.1M過塩素酸ナトリウム 10mMヘキサンスルホン酸ナトリウム (pH4.0) II液 I液 25% メタノール 75% (pH3.0) I液とII液による濃度勾配溶出法 4. 反応液 Brij-35・・・0.4g 炭酸二ナトリウム・・・40.0g ホウ酸・・・13.4g 硫酸カリウム・・・18.4g オルソフタルアルデヒド/12mlエタノール・・・0.80g β-メルカプトエタノール・・・2.0ml (pH10.5) 5. 流速・・・移動相:1.1ml/min 反応液:0.4ml
/min。
【0028】実施例1
1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%食塩、0.0
1%消泡剤から成る培地(pH7.2)1,000mlを5lの三角
フラスコに入れ、120 ℃で15分間オートクレーブした
後、30℃下でこの培地にシュードモナス・ペルツシノゲ
ナIFO14163(Pseudomonas pertucinogena)を植菌す
る。30℃で24時間振とう培養を行った後この培養液を、
あらかじめ上記と同様の組成を有する培地170lを仕込
みそして蒸気滅菌をしたジャー・ファーメンターに植菌
し本培養を行った。
1%消泡剤から成る培地(pH7.2)1,000mlを5lの三角
フラスコに入れ、120 ℃で15分間オートクレーブした
後、30℃下でこの培地にシュードモナス・ペルツシノゲ
ナIFO14163(Pseudomonas pertucinogena)を植菌す
る。30℃で24時間振とう培養を行った後この培養液を、
あらかじめ上記と同様の組成を有する培地170lを仕込
みそして蒸気滅菌をしたジャー・ファーメンターに植菌
し本培養を行った。
【0029】22時間培養の後、培養物中のシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解活性を測定した
結果、0.03ユニット/ml-培養物であった。
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解活性を測定した
結果、0.03ユニット/ml-培養物であった。
【0030】培養物を遠心分離機にかけて菌体を採取し
た。得られた菌体の100g(湿菌体重量)を1lの0.01M
リン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、その懸濁液をダイノ
ミル細胞破砕機に連続的に通過させて菌体破砕を行っ
た。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、上
清液を得た。この上清液中のシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素の総活性は352ユニッ
ト、比活性は0.009ユニット/mg-タンパクであった。こ
の上清液を、あらかじめ0.01Mのリン酸緩衝液(pH7.5)
にて平衡化したDE52イオン交換樹脂(商品名:ワットマ
ン社製)を充填したカラム(9.0ラ30cm)に負荷させた。
カラムを2lの0.01Mリン酸緩衝液(pH7.5)で充分に洗
浄後、食塩濃度が0.1Mから0.5Mである直線濃度勾配(総
容量:16l)にて吸着されたタンパク質を溶出せしめ、
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解活
性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は、230
ユニット、比活性は0.04ユニット/mg-タンパクであっ
た。
た。得られた菌体の100g(湿菌体重量)を1lの0.01M
リン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、その懸濁液をダイノ
ミル細胞破砕機に連続的に通過させて菌体破砕を行っ
た。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、上
清液を得た。この上清液中のシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素の総活性は352ユニッ
ト、比活性は0.009ユニット/mg-タンパクであった。こ
の上清液を、あらかじめ0.01Mのリン酸緩衝液(pH7.5)
にて平衡化したDE52イオン交換樹脂(商品名:ワットマ
ン社製)を充填したカラム(9.0ラ30cm)に負荷させた。
カラムを2lの0.01Mリン酸緩衝液(pH7.5)で充分に洗
浄後、食塩濃度が0.1Mから0.5Mである直線濃度勾配(総
容量:16l)にて吸着されたタンパク質を溶出せしめ、
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解活
性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサンカル
ボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性は、230
ユニット、比活性は0.04ユニット/mg-タンパクであっ
た。
【0031】この溶出液を限外濾過により脱塩濃縮後、
氷冷下飽和硫酸アンモニウム溶液をゆっくり混ぜながら
20%飽和硫酸アンモニウム溶液になるまで添加した。約
1時間静置後遠心分離操作をした。この上清を同様にさ
らに50%飽和硫酸アンモニウム溶液とした。約1時間静
置後遠心分離操作をした。この沈澱物に氷冷した0.01M
リン酸緩衝液(pH7.5)100mlを加え溶解した。この溶液
を限外濾過により脱塩後シクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解活性画分とした。本活性画分中の
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素の総活性は、210ユニット、比活性は0.18ユニット/mg
-タンパクであった。
氷冷下飽和硫酸アンモニウム溶液をゆっくり混ぜながら
20%飽和硫酸アンモニウム溶液になるまで添加した。約
1時間静置後遠心分離操作をした。この上清を同様にさ
らに50%飽和硫酸アンモニウム溶液とした。約1時間静
置後遠心分離操作をした。この沈澱物に氷冷した0.01M
リン酸緩衝液(pH7.5)100mlを加え溶解した。この溶液
を限外濾過により脱塩後シクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解活性画分とした。本活性画分中の
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素の総活性は、210ユニット、比活性は0.18ユニット/mg
-タンパクであった。
【0032】次いであらかじめ0.01Mのリン酸緩衝液(p
H7.5)で平衡化したDEAE−トヨパール(商品名:東
ソー社製)を充填したカラム(3.2ラ28cm )に通した。1
lの0.1Mの食塩を含むリン酸緩衝液(pH7.5)でカラム
を洗浄後、食塩濃度が 0.1Mから0.35Mである直線濃度勾
配(総容量:6l)にて吸着されたタンパク質を溶出せ
しめ、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水
分解活性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性
は、182ユニット、比活性は0.42ユニット/mg-タンパク
であった。
H7.5)で平衡化したDEAE−トヨパール(商品名:東
ソー社製)を充填したカラム(3.2ラ28cm )に通した。1
lの0.1Mの食塩を含むリン酸緩衝液(pH7.5)でカラム
を洗浄後、食塩濃度が 0.1Mから0.35Mである直線濃度勾
配(総容量:6l)にて吸着されたタンパク質を溶出せ
しめ、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水
分解活性画分を回収した。本活性画分中のシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の総活性
は、182ユニット、比活性は0.42ユニット/mg-タンパク
であった。
【0033】この活性画分を限外濾過装置を用いて、脱
塩及び濃縮した後、あらかじめ0.1Mの食塩を含有する0.
01Mリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したセファクリルS
−300(商品名:ファルマシア社製)を充填したカラム
(2.2ラ120cm)に負荷しゲル濾過を行った。シクロヘキ
サンカルボン酸フェニルエステル加水分解活性画分を回
収した。本活性画分中のシクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解酵素の総活性は、142ユニット、
比活性は4.73ユニット/mg-タンパクであった。この活性
画分を回収し、限外濾過装置にて脱塩後、20%飽和硫酸
アンモニウム溶液とした。これをあらかじめ20%飽和硫
酸アンモニウムを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.5)で平
衡化したフェニルセファロースCL−4B(商品名:フ
ァルマシア社製)を充填したカラム(2.2ラ20cm)に負荷
した。1lの20%飽和硫酸アンモニウムを含む0.01Mリン
酸緩衝液(pH7.5)でカラムを洗浄後、硫安濃度が20%
から0%である直線濃度勾配(総容量:2l)にて吸着さ
れたタンパク質を溶出せしめ、シクロヘキサンカルボン
酸フェニルエステル加水分解活性画分を回収した。本活
性画分中のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素の総活性は、127ユニット、比活性は12.5
ユニット/mg-タンパクであった。次いで限外濾過装置に
て脱塩後、あらかじめ0.01Mのリン酸緩衝液(pH7.5)で
平衡化したDEAE−トヨパール(商品名:東ソー社
製)を充填したカラム(2.0ラ20cm )に通した。300ml
の0.15Mの食塩を含むリン酸緩衝液 (pH7.5)でカラム
を洗浄後、食塩濃度が0.15Mから0.35Mである直線濃度勾
配(総容量:2l)にて吸着されたタンパク質を溶出せ
しめ、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水
分解活性画分を回収して精製酵素溶液を得た。この精製
酵素溶液中のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステ
ル加水分解酵素の総活性は102ユニット、比活性は18.3
ユニット/mg-タンパクであった。
塩及び濃縮した後、あらかじめ0.1Mの食塩を含有する0.
01Mリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したセファクリルS
−300(商品名:ファルマシア社製)を充填したカラム
(2.2ラ120cm)に負荷しゲル濾過を行った。シクロヘキ
サンカルボン酸フェニルエステル加水分解活性画分を回
収した。本活性画分中のシクロヘキサンカルボン酸フェ
ニルエステル加水分解酵素の総活性は、142ユニット、
比活性は4.73ユニット/mg-タンパクであった。この活性
画分を回収し、限外濾過装置にて脱塩後、20%飽和硫酸
アンモニウム溶液とした。これをあらかじめ20%飽和硫
酸アンモニウムを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.5)で平
衡化したフェニルセファロースCL−4B(商品名:フ
ァルマシア社製)を充填したカラム(2.2ラ20cm)に負荷
した。1lの20%飽和硫酸アンモニウムを含む0.01Mリン
酸緩衝液(pH7.5)でカラムを洗浄後、硫安濃度が20%
から0%である直線濃度勾配(総容量:2l)にて吸着さ
れたタンパク質を溶出せしめ、シクロヘキサンカルボン
酸フェニルエステル加水分解活性画分を回収した。本活
性画分中のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル
加水分解酵素の総活性は、127ユニット、比活性は12.5
ユニット/mg-タンパクであった。次いで限外濾過装置に
て脱塩後、あらかじめ0.01Mのリン酸緩衝液(pH7.5)で
平衡化したDEAE−トヨパール(商品名:東ソー社
製)を充填したカラム(2.0ラ20cm )に通した。300ml
の0.15Mの食塩を含むリン酸緩衝液 (pH7.5)でカラム
を洗浄後、食塩濃度が0.15Mから0.35Mである直線濃度勾
配(総容量:2l)にて吸着されたタンパク質を溶出せ
しめ、シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水
分解活性画分を回収して精製酵素溶液を得た。この精製
酵素溶液中のシクロヘキサンカルボン酸フェニルエステ
ル加水分解酵素の総活性は102ユニット、比活性は18.3
ユニット/mg-タンパクであった。
【0034】こうして得られた酵素の純度をポリアクリ
ルアミド・ゲル電気泳動によって調べた結果、一本のバ
ンドのみが観察され、純粋なシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素であることが確認され
た。得られた精製酵素を使って本酵素の基質特異性、至
適pH、pH安定性、至適温度、温度安定性、分子量を
調べた。
ルアミド・ゲル電気泳動によって調べた結果、一本のバ
ンドのみが観察され、純粋なシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素であることが確認され
た。得られた精製酵素を使って本酵素の基質特異性、至
適pH、pH安定性、至適温度、温度安定性、分子量を
調べた。
【0035】〔基質特異性〕
前記表1に示す各種基質を50mMリン酸緩衝液に2mMにな
る様溶解した。この基質溶液0.9mlに対し0.1mlの酵素液
を添加し、攪拌後37℃5分間反応させた。その後の処理
は通常の酵素活性測定法と同様にした。但し各々の反応
に対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を添
加したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は通
常のHPLC分析とした。分析後酵素液系のトラネキサ
ム酸またはヒドロキシフェニルプロピオン酸生成量から
蒸留水系のトラネキサム酸またはヒドロキシフェニルプ
ロピオン酸生成量を差引き酵素活性を計算した。その時
の結果をセトラキサートを基質とした場合の活性を100
として相対活性で前出の表1に示した。
る様溶解した。この基質溶液0.9mlに対し0.1mlの酵素液
を添加し、攪拌後37℃5分間反応させた。その後の処理
は通常の酵素活性測定法と同様にした。但し各々の反応
に対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を添
加したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は通
常のHPLC分析とした。分析後酵素液系のトラネキサ
ム酸またはヒドロキシフェニルプロピオン酸生成量から
蒸留水系のトラネキサム酸またはヒドロキシフェニルプ
ロピオン酸生成量を差引き酵素活性を計算した。その時
の結果をセトラキサートを基質とした場合の活性を100
として相対活性で前出の表1に示した。
【0036】〔至適pH〕
精製酵素標品を蒸留水にて0.1u/ml程度まで希釈し、サ
ンプルとした。酵素反応のpHは次に示す緩衝液を使って
調製した。酵素反応は通常の方法により行った。但し反
応時間は30分とし、各々の反応に対しコントロールとし
て酵素液の代わりに蒸留水を添加したものを用意し同様
に操作した。反応後の分析は通常のHPLC分析とし
た。分析後酵素液系のトラネキサム酸生成量から蒸留水
系のトラネキサム酸生成量を差引き酵素活性を計算し
た。
ンプルとした。酵素反応のpHは次に示す緩衝液を使って
調製した。酵素反応は通常の方法により行った。但し反
応時間は30分とし、各々の反応に対しコントロールとし
て酵素液の代わりに蒸留水を添加したものを用意し同様
に操作した。反応後の分析は通常のHPLC分析とし
た。分析後酵素液系のトラネキサム酸生成量から蒸留水
系のトラネキサム酸生成量を差引き酵素活性を計算し
た。
【0037】反応系に用いた各種緩衝液(全ての緩衝液
は0.1Mとした。) クエン酸緩衝液:pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液:pH:6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液:7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液:8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図1に示した。
は0.1Mとした。) クエン酸緩衝液:pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液:pH:6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液:7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液:8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図1に示した。
【0038】〔pH安定性〕
精製酵素標品を各緩衝液中に一定量取り4℃、24時間静
置保存した。その後酵素の残存活性を通常の酵素活性測
定法で測った。但し反応時間は30分とした。
置保存した。その後酵素の残存活性を通常の酵素活性測
定法で測った。但し反応時間は30分とした。
【0039】保存に用いた各種緩衝液(全ての緩衝液は
0.1Mとした。) クエン酸緩衝液:pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液:pH:6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液:7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液:8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図2で示す。
0.1Mとした。) クエン酸緩衝液:pH2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,
6.5 燐酸緩衝液:pH:6.1,6.6,7.1,7.5,8.0 トリス緩衝液:7.4,8.0,8.5,9.0 グリシン緩衝液:8.3,8.6,9.0,9.4,9.7,10.9,11.8 この時の結果を図2で示す。
【0040】〔至適温度〕
精製酵素標品を蒸留水にて0.1u/ml程度まで希釈し、サ
ンプルとした。酵素反応は通常の方法により行った。但
し反応温度は20、30、40、50、55、60、70、80、℃でそ
れぞれ行った。また反応時間は5分とし、各々の反応に
対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を添加
したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は通常
のHPLC分析とした。分析後酵素液系のトラネキサム
酸生成量から蒸留水系のトラネキサム酸生成量を差引き
酵素活性を計算した。この時の結果を図3に示す。
ンプルとした。酵素反応は通常の方法により行った。但
し反応温度は20、30、40、50、55、60、70、80、℃でそ
れぞれ行った。また反応時間は5分とし、各々の反応に
対しコントロールとして酵素液の代わりに蒸留水を添加
したものを用意し同様に操作した。反応後の分析は通常
のHPLC分析とした。分析後酵素液系のトラネキサム
酸生成量から蒸留水系のトラネキサム酸生成量を差引き
酵素活性を計算した。この時の結果を図3に示す。
【0041】〔温度安定性〕
酵素精製標品を10mM燐酸緩衝液(pH7.5)中で20、30、4
0、50、55、60、80、℃に5分間保持した。その後直ち
に氷冷した。このサンプルを10mM燐酸緩衝液(pH7.5)
で50倍希釈し、残存酵素活性測定サンプルとした。酵素
活性の測定は通常の方法により行った。但し反応時間は
30分とした。この時の結果をに図4に示した。分子量ゲ
ル濾過法による分子量の測定を行った。カラムはHPLC用
カラムTSK-gel G3000SWXLを使用した。移動相は50mM燐
酸緩衝液(pH7.1)、0.2M硫酸ナトリウムを使用した。
流速は0.5ml/minとした。マーカー蛋白は図5に示した
ものを使用した。HPLCの検出はUV280nmで行い、
また標品の溶出位置はその酵素活性の測定も併せて行っ
た。その結果を図5に示した。
0、50、55、60、80、℃に5分間保持した。その後直ち
に氷冷した。このサンプルを10mM燐酸緩衝液(pH7.5)
で50倍希釈し、残存酵素活性測定サンプルとした。酵素
活性の測定は通常の方法により行った。但し反応時間は
30分とした。この時の結果をに図4に示した。分子量ゲ
ル濾過法による分子量の測定を行った。カラムはHPLC用
カラムTSK-gel G3000SWXLを使用した。移動相は50mM燐
酸緩衝液(pH7.1)、0.2M硫酸ナトリウムを使用した。
流速は0.5ml/minとした。マーカー蛋白は図5に示した
ものを使用した。HPLCの検出はUV280nmで行い、
また標品の溶出位置はその酵素活性の測定も併せて行っ
た。その結果を図5に示した。
【0042】
【発明の効果】 本発明の製造方法によれば、セトラキ
サート等のフェノール性エステル類の加水分解、あるい
は(逆の酵素反応を利用した)合成に好適に使用できる
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素を含む溶液を工業的に生産することが可能となる。
サート等のフェノール性エステル類の加水分解、あるい
は(逆の酵素反応を利用した)合成に好適に使用できる
シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵
素を含む溶液を工業的に生産することが可能となる。
【図1】 実施例1のシクロヘキサンカルボン酸フェニ
ルエステル加水分解酵素のpH活性曲線を示す図である
ルエステル加水分解酵素のpH活性曲線を示す図である
【図2】 同酵素のpH安定性を示す図である。
【図3】 同酵素の温度活性曲線を示す図である。
【図4】 同酵素の温度安定性を示す図である。
【図5】 同酵素の分子量を示す図である。(●:実施
例1の酵素、○:マーカータンパク)
例1の酵素、○:マーカータンパク)
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
C12R 1:38)
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 9/00 - 9/99
C12N 1/00 - 1/38
BIOSIS/MEDLINE/WPID
S(STN)
Claims (2)
- 【請求項1】 下記理化学的性質を有するシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素。〔理化学的性質〕 作用: 水の存在下で、1モルのセトラキサートか
ら1モルのトラネキサム酸と1モルのヒドロキシフェニ
ルプロピオン酸を生成せしめる。 基質特異性: N−アセチルセトラキサート、トラ
ネキサム酸フェニル、セトラキサート、4−(2−カル
ボキシエチル)フェニルシクロヘキサンカルボキシレー
ト、トラネキサム酸ヘキシルに対して作用し、トラネキ
サム酸ミリスチル、トラネキサム酸メチルに対しては作
用を示さない。 至適pH: pH8.0〜9.0 pH安定性: 4℃下にて24時間保存したとき、
pH6.0〜11.0において80%以上の残存活性を
有する。 至適温度: 0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)
において55〜60℃ 温度安定性: 0.01Mリン酸緩衝液(pH7.
5)において、各温度に5分間保持した時、50℃以下
で90%以上の残存活性を有する。 - 【請求項2】 シュードモナス属に属するシクロヘキサ
ンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素生産能を有
する菌体を培養して得られた培養物から採取することを
特徴とする請求項1に記載のシクロヘキサンカルボン酸
フェニルエステル加水分解酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000252654A JP3471301B2 (ja) | 2000-08-23 | 2000-08-23 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000252654A JP3471301B2 (ja) | 2000-08-23 | 2000-08-23 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及びその製造方法 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP27749792A Division JP3118331B2 (ja) | 1992-10-15 | 1992-10-15 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001078758A JP2001078758A (ja) | 2001-03-27 |
JP3471301B2 true JP3471301B2 (ja) | 2003-12-02 |
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ID=18741858
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000252654A Expired - Fee Related JP3471301B2 (ja) | 2000-08-23 | 2000-08-23 | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素及びその製造方法 |
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AU2010328744B2 (en) | 2009-12-09 | 2016-06-02 | Auckland Uniservices Limited | Fungicidal compounds and methods of their use |
CN108148769B (zh) * | 2018-03-19 | 2020-11-27 | 临沂大学 | 一种常温保存节菱孢属真菌菌种的培养基及其制备方法和应用 |
CN113234601B (zh) * | 2021-04-01 | 2023-04-25 | 新疆农业科学院微生物应用研究所(中国新疆—亚美尼亚生物工程研究开发中心) | 一株海洋真菌新种及其在植物抗干旱胁迫中的应用 |
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2000
- 2000-08-23 JP JP2000252654A patent/JP3471301B2/ja not_active Expired - Fee Related
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