JPS6058068A - 新規なアミンデヒドロゲナーゼｍ - Google Patents
新規なアミンデヒドロゲナーゼｍInfo
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- JPS6058068A JPS6058068A JP58165820A JP16582083A JPS6058068A JP S6058068 A JPS6058068 A JP S6058068A JP 58165820 A JP58165820 A JP 58165820A JP 16582083 A JP16582083 A JP 16582083A JP S6058068 A JPS6058068 A JP S6058068A
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- amine
- amines
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な酵素であるアミンデヒドロゲナーゼＭ及
びこれを利用するアミン類の酸化方法に関する。
びこれを利用するアミン類の酸化方法に関する。
一般に、アミン類は生物に対して毒性を持っており、そ
の生分解性とか自然に対する影響に問題があった。そこ
でアミン類の無毒化や自然界に残存するアミンの分析等
が望まれていた。
の生分解性とか自然に対する影響に問題があった。そこ
でアミン類の無毒化や自然界に残存するアミンの分析等
が望まれていた。
しかしながら、アミン類は微生物にとっても毒であり、
アミン類を資化する菌はこれまで例が少ない。
アミン類を資化する菌はこれまで例が少ない。
アミン類を資化する菌に含まれる酵素はアミンオキシダ
ーゼとアミンデヒドロゲナーゼが知られているが、これ
らはアミン類を酸化してアルデヒドを生成する。その中
で酵素反応で酸素の関与しないアミンデヒドロゲナーゼ
の報告例は少ない。
ーゼとアミンデヒドロゲナーゼが知られているが、これ
らはアミン類を酸化してアルデヒドを生成する。その中
で酵素反応で酸素の関与しないアミンデヒドロゲナーゼ
の報告例は少ない。
従来、アミンデヒドロゲナーゼとしてはシュードモナス
ＡＭＩから産生される酵素等が報告されており（Ｒ，Ｒ
，Ｅａｄｙ ｅｔ ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、。
ＡＭＩから産生される酵素等が報告されており（Ｒ，Ｒ
，Ｅａｄｙ ｅｔ ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、。
月■ユ２４５（１９θ８）；同旦７５７（１８７１）
、これらは低分子のアミン類しか酸化せず、基質特異性
は狭いものであった。更に、長鎖アルキルアミンの如き
分子量の大きいアミン類を酸化するアミンデヒドロゲナ
ーゼはこれまで見当らなかった。
、これらは低分子のアミン類しか酸化せず、基質特異性
は狭いものであった。更に、長鎖アルキルアミンの如き
分子量の大きいアミン類を酸化するアミンデヒドロゲナ
ーゼはこれまで見当らなかった。
本発明者らは、斯かる現状に鑑み、長鎖アルキルアミン
等の分子量の大きいアミン類をも酸化し、基質特異性の
広いアミンデヒドロゲナーゼを探索していたが、特定の
シュードモナス属に属するアミンデヒドロゲナーゼ生産
菌に含まれるアミンデヒドロゲナーゼＭが該条件を満た
すことを見出し、本発明を完成した。
等の分子量の大きいアミン類をも酸化し、基質特異性の
広いアミンデヒドロゲナーゼを探索していたが、特定の
シュードモナス属に属するアミンデヒドロゲナーゼ生産
菌に含まれるアミンデヒドロゲナーゼＭが該条件を満た
すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の目的は新規なアミンデヒドロゲナー
ゼを提供することにある。
ゼを提供することにある。
更に、もう１つの目的は該アミンデヒドロゲナーゼを利
用してアミン類を酸化する方法を提供することにある。
用してアミン類を酸化する方法を提供することにある。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に用いられるアミンデヒドロゲナーゼＭはシュー
ドモナス・エスピー・Ｋ ９５ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐ、 Ｋ９５）により生産される酵素である。
ドモナス・エスピー・Ｋ ９５ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐ、 Ｋ９５）により生産される酵素である。
該菌株は本発明者らが土壌より分離したものであって、
微工研菌寄第７０４１号として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されており、以下の菌学的性質を有して
いる。
微工研菌寄第７０４１号として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されており、以下の菌学的性質を有して
いる。
（ａ）形態
ｌ）細胞の形および大きさ：
桿菌、０．４〜０．８ ｘｌ、５ Ｘ２．０ ＃１゜２
）多形性： なし ３）運動性： 運動性があり、極鞭毛を有する４）胞子
： 形成しない ５）ダラム染色性： 陰性 ６）抗酸性： ＃１性 （ｂ）各培地における生育状態 ｌ）肉汁寒天平板培養： 生育は豊富であり、コロニーの色は 緑褐色で、にぶい光沢がある。
）多形性： なし ３）運動性： 運動性があり、極鞭毛を有する４）胞子
： 形成しない ５）ダラム染色性： 陰性 ６）抗酸性： ＃１性 （ｂ）各培地における生育状態 ｌ）肉汁寒天平板培養： 生育は豊富であり、コロニーの色は 緑褐色で、にぶい光沢がある。
２）肉汁寒天斜面培養：
生育は豊富であり、緑褐色の色素を生じる。
３）肉汁液体培養：
薄膜を形成し、全体的に混濁を生じる。
４）肉汁ゼラチン穿刺培養：
表層より液化。
５）リドマスミルク：
凝固、ペプトン化、共に陽性。
（Ｃ）生理学的性質
１〕硝酸塩の還元： 還元しない
２）脱窒反応： 陰性
３）ＭＲテスト： 陰性
４）ＶＰテスト： 陰性
５）インドールの生成： 陰性
６）硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天）： 陰性７〕デンプ
ンの加水分解： ＃Ｒ性 ８）クエン酸の利用 Ｋｏｓｅ ｒの培地： 利用する Ｇｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培Ｊ１！ｌ： 利用する８）
無機窒素源の利用 硝酸塩： 利用する アンモニウム塩： 利用する １０）色素の生成： 蛍光性色素を生成する。
ンの加水分解： ＃Ｒ性 ８）クエン酸の利用 Ｋｏｓｅ ｒの培地： 利用する Ｇｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培Ｊ１！ｌ： 利用する８）
無機窒素源の利用 硝酸塩： 利用する アンモニウム塩： 利用する １０）色素の生成： 蛍光性色素を生成する。
ＩＩ）ウレアーゼ：ｌ性
１２）オキシダーゼ： 陽性
１３）カタラーゼ： 陽性
１４）生育の範囲：
２２〜４１”Ｏ（最適２８〜３８℃）
ｐ）１５．０〜８．５（最適５．０〜７，０）１５）酸
素に対する態度： 好気性 １Ｂ）ＯＦテスト： Ｏ型（酸化型） ＊＊ １７）糖類からの酸、ガスの生成 二 に本１ｏｚペプトン水、３０℃、１４日間培養指示薬：
５ｃｐ（ブロムクレゾールパープル〕以上の菌学的性
質を有する菌について、バージｘ イ（７）Ｆ：ユフル
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ−ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８
版（１９７５年）にもとづいて検索した結果、本菌株は
シュードモナス属に属することが判明した。
素に対する態度： 好気性 １Ｂ）ＯＦテスト： Ｏ型（酸化型） ＊＊ １７）糖類からの酸、ガスの生成 二 に本１ｏｚペプトン水、３０℃、１４日間培養指示薬：
５ｃｐ（ブロムクレゾールパープル〕以上の菌学的性
質を有する菌について、バージｘ イ（７）Ｆ：ユフル
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ−ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８
版（１９７５年）にもとづいて検索した結果、本菌株は
シュードモナス属に属することが判明した。
本発明において、アミンデヒドロゲナーゼ生産菌の培養
に用いる培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用され得る。
に用いる培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用され得る。
すなわち、炭素源としては炭水化物（たとえばグルコー
ス、グリセロール、フラクトース等）、有機酸（たとえ
ばクエン酸、コハク酸等）、アミノ酸（たとえばグルタ
ミン酸、アスパラギン等）、炭化水素（たとえばｎ−ド
デカン等）、あるいは脂肪族アミン及び／又は脂肪族ジ
アミン（たとえばヘキシルアミン、ドデシルアミン、ド
デカメチレンジアミン等）などが使用できる。窒素源と
してはアンモニア、無機および有機アンモニウム塩（た
とえば塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム等
）、含窒素有機物（たとえば尿素、ペプトン、ＮＺアミ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カ
ゼイン加水分解物等）、あるいはアミノ酸（たとえばグ
ルタミン酸、アスパラギン、チロシン等）などが使用で
きる。
ス、グリセロール、フラクトース等）、有機酸（たとえ
ばクエン酸、コハク酸等）、アミノ酸（たとえばグルタ
ミン酸、アスパラギン等）、炭化水素（たとえばｎ−ド
デカン等）、あるいは脂肪族アミン及び／又は脂肪族ジ
アミン（たとえばヘキシルアミン、ドデシルアミン、ド
デカメチレンジアミン等）などが使用できる。窒素源と
してはアンモニア、無機および有機アンモニウム塩（た
とえば塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム等
）、含窒素有機物（たとえば尿素、ペプトン、ＮＺアミ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カ
ゼイン加水分解物等）、あるいはアミノ酸（たとえばグ
ルタミン酸、アスパラギン、チロシン等）などが使用で
きる。
無機塩としては各種燐酸塩、硫酸マグネシウムなどが使
用できる。さらに微量の重金属塩類が使用されるが、天
然物を含む培地では必ずしも添加を必要としない、また
、栄養要求を示す変異株を用いる場合には、当然その栄
養要求を満足させる物質を培地に加えなければならない
。
用できる。さらに微量の重金属塩類が使用されるが、天
然物を含む培地では必ずしも添加を必要としない、また
、栄養要求を示す変異株を用いる場合には、当然その栄
養要求を満足させる物質を培地に加えなければならない
。
培養は通常、振盪または通気撹拌培養などの好気的条件
下に行なうのがよい。水に難溶性の炭素源等を使用する
場合には、ポリオキシエチレンソルビタン等の各種界面
活性剤、あるいはアセトン、エタノール等の有機溶媒を
培地に活力Ｕすることも可能である。培地のｐＨは６．
０〜１０．０、培養温度は２０〜４０℃、培養期間は通
常１８〜９６時間であって、酵素の生産蓄積量が最高に
達する時期を見計らって培養を終了すればよい。
下に行なうのがよい。水に難溶性の炭素源等を使用する
場合には、ポリオキシエチレンソルビタン等の各種界面
活性剤、あるいはアセトン、エタノール等の有機溶媒を
培地に活力Ｕすることも可能である。培地のｐＨは６．
０〜１０．０、培養温度は２０〜４０℃、培養期間は通
常１８〜９６時間であって、酵素の生産蓄積量が最高に
達する時期を見計らって培養を終了すればよい。
培養菌体からのアミンデヒドロゲナーゼの抽出法につい
ては、一般的な菌体からの酵素の抽出法が適用できる０
例えば、得られた培養液から遠心分離などの方法により
生菌体を採取し、生菌又はその凍結乾燥菌体を磨砕、自
己消化。
ては、一般的な菌体からの酵素の抽出法が適用できる０
例えば、得られた培養液から遠心分離などの方法により
生菌体を採取し、生菌又はその凍結乾燥菌体を磨砕、自
己消化。
音波処理により菌体を破壊し、該酵素を遊離させる。更
に、この菌体処理物を遠心分離等により粗酵素を含む上
清を菌体破片より分離する。
に、この菌体処理物を遠心分離等により粗酵素を含む上
清を菌体破片より分離する。
上記粗酵素は、更にイオン交換樹脂法、ＤＥＡＥセルロ
ース、 ０Ｍセルロース、 ＤＥＡＥセファデックスＡ
−５０，ＱＡＥセフ ７デｙ りＸＡ−５ｇ又は５Ｅ−
１！７７デツクスなどのイオン交換セファデックスやセ
ファデックスＧ−１００、セファデックスＧ−２００な
どのセファデックスやトヨパールＨＷ−５５ＳＦな・ど
を用いるゲルろ適法、等電点分画法、アセテート膜蕨粉
、アクリルアミドゲルを用いる電気泳動法、その他害電
点沈殿法などの個々の手段又はこれらの適当な組み合わ
せを適宜利用することによって精製酵素とすることがで
きる。
ース、 ０Ｍセルロース、 ＤＥＡＥセファデックスＡ
−５０，ＱＡＥセフ ７デｙ りＸＡ−５ｇ又は５Ｅ−
１！７７デツクスなどのイオン交換セファデックスやセ
ファデックスＧ−１００、セファデックスＧ−２００な
どのセファデックスやトヨパールＨＷ−５５ＳＦな・ど
を用いるゲルろ適法、等電点分画法、アセテート膜蕨粉
、アクリルアミドゲルを用いる電気泳動法、その他害電
点沈殿法などの個々の手段又はこれらの適当な組み合わ
せを適宜利用することによって精製酵素とすることがで
きる。
本発明に使用するアミンデヒドロゲナーゼＭは必ずしも
純粋である必要はない、すなわち、菌体を破壊した菌体
処理物や菌体処理物より菌体破片を除去した粗酵素も使
用可能である。もちろん、これらの固定化酵素であって
も良い。
純粋である必要はない、すなわち、菌体を破壊した菌体
処理物や菌体処理物より菌体破片を除去した粗酵素も使
用可能である。もちろん、これらの固定化酵素であって
も良い。
次に１本発明において使用されるシュードモナス・エス
ピー・に９５の生産する新規酵素、アミンデヒドロゲナ
ーゼＭの理化学的性質について述べる。
ピー・に９５の生産する新規酵素、アミンデヒドロゲナ
ーゼＭの理化学的性質について述べる。
■作用及び基質特異性：
本酵素は広い基質特異性を示し、モノアミン、ジアミン
のほかに２級アミン、３級アミンにも作用する。アミン
類のアミン基に作用してアンモニアを放出し、対応する
アルデヒドを生成する。
のほかに２級アミン、３級アミンにも作用する。アミン
類のアミン基に作用してアンモニアを放出し、対応する
アルデヒドを生成する。
ＲＣＨ，ＮＨ，＋ＰＭＳ＋Ｈ，０
→ＲＣＨＯ＋ＰＭＳＨ，十ＮＨ３
ＰＭＳＨ，＋Ｏま →ＰＭＳ＋ＨｔＯ＊（非酵素的）
＊ＰＭＳ：Ｎ−メチルフェナゾニウムメソサルフェート
（補酵素） ■至適ＰＨ及び安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは７〜７．５であるが、基質によって変動する
。安定ＰＨ範囲は６〜９である。
（補酵素） ■至適ＰＨ及び安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは７〜７．５であるが、基質によって変動する
。安定ＰＨ範囲は６〜９である。
■力価の測定法二
本酵素の活性は本酵素反応において生成したＰＭＳＨ，
と反応するＤＣＰ ＩＦの量を８００ｔｓ ｇの吸光度
にて測定した。
と反応するＤＣＰ ＩＦの量を８００ｔｓ ｇの吸光度
にて測定した。
ＣＤＣＰＩＰ：２．８−ジクロロフェノールインドフェ
ノール、ε工２１．５Ｘ １０３）測定に際しては、４
０鱈のトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３） 、１ ｄの
ＫＣＮ 、５＋ｓＮのＰＭＳ、０．０５＋ａｌ）ＤＣＰ
ＩＰ ｃ７）溶液を用い、１ｍＭの基質及び酵素溶液を
加え、３０℃で３０〜１２０分５間反応を行なった。反
応時間１分間当りｌルＭのアルデヒドを生成させる酵素
量を１単位とする。
ノール、ε工２１．５Ｘ １０３）測定に際しては、４
０鱈のトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３） 、１ ｄの
ＫＣＮ 、５＋ｓＮのＰＭＳ、０．０５＋ａｌ）ＤＣＰ
ＩＰ ｃ７）溶液を用い、１ｍＭの基質及び酵素溶液を
加え、３０℃で３０〜１２０分５間反応を行なった。反
応時間１分間当りｌルＭのアルデヒドを生成させる酵素
量を１単位とする。
■作用適温の範囲：
作用適温は２０〜４５℃の範囲内にあり、特に３０〜４
０℃付近が最適である。
０℃付近が最適である。
（５１ｐＨ１温度等による失活条件ニ
ア０℃、 ５分間の熱処理で完全に失活する。
ｐｉは５．５以下又は９．５以上で失活する。
■阻害、活性化および安定化：
１ ｒｉＭのカルボニル試薬（インニアシト、セミカル
バジド）で阻害され、活性化剤、安定化剤は特にない。
バジド）で阻害され、活性化剤、安定化剤は特にない。
■分子量：
５Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定した
結果、約４２０００である。
結果、約４２０００である。
■等電点：
等電点がｐＨ８，４のアルカリ蛋白質である。
■精製方法：
アミンデヒドロゲナーゼＭを含有する粗酵素液に４０ｍ
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶かした硫酸ス
トレプトマイシンを水冷下情下し、３０分静置後遠心分
離し、上清を得る。
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶かした硫酸ス
トレプトマイシンを水冷下情下し、３０分静置後遠心分
離し、上清を得る。
得られた上清に精製硫安を加え、 ＰＨ７，２にて４０
％飽和として３０分静置後遠心分離し、上清を得る。更
に、精製硫安を加えて７０１飽和にし、２Ｎアンモニア
水にてＰＨ７，８に調製する。 ３０分静置後遠心分離
して沈殿を得、４０ｄ トリス−塩＃ ＣＰＨ７，２）
−７０！硫安飽和溶液にて沈殿を集め、これを１０ｄ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）に溶かし、−夜透析
する。
％飽和として３０分静置後遠心分離し、上清を得る。更
に、精製硫安を加えて７０１飽和にし、２Ｎアンモニア
水にてＰＨ７，８に調製する。 ３０分静置後遠心分離
して沈殿を得、４０ｄ トリス−塩＃ ＣＰＨ７，２）
−７０！硫安飽和溶液にて沈殿を集め、これを１０ｄ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）に溶かし、−夜透析
する。
１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）で平衡化
したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製ＤＥ−５２
）に上記粗酵素を吸着させ、同緩衝液で沈浄し、０〜１
５０ ｄの食塩水により直線的濃度勾配で溶出し、アミ
ンデヒドロゲナーゼＭの活性画分を集め、次いでこのア
ミンデヒドロゲナーゼ画分を１０ｄリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８，８）で平衡化したＣトセルロース（ワッ
トマン社製ＣＭ−５２）のカラムに通液し、同緩衝液で
洗浄し、０〜７０ｍＭの食塩水により直線的濃度勾配で
溶出し、アミンデヒドロゲナーゼＭの活性画分を集めた
。
したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製ＤＥ−５２
）に上記粗酵素を吸着させ、同緩衝液で沈浄し、０〜１
５０ ｄの食塩水により直線的濃度勾配で溶出し、アミ
ンデヒドロゲナーゼＭの活性画分を集め、次いでこのア
ミンデヒドロゲナーゼ画分を１０ｄリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８，８）で平衡化したＣトセルロース（ワッ
トマン社製ＣＭ−５２）のカラムに通液し、同緩衝液で
洗浄し、０〜７０ｍＭの食塩水により直線的濃度勾配で
溶出し、アミンデヒドロゲナーゼＭの活性画分を集めた
。
更に、この活性画分をトヨパールＨＷ−５５ＳＦ（東洋
曹達社製）のカラムに通液してゲルろ過を行ない、４０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）にて溶出してア
ミンデヒドロゲナーゼＭの酵素的単一標品を得る０本酵
素はディスク電気泳動及びＳＯ８電気泳動的に均一であ
った。
曹達社製）のカラムに通液してゲルろ過を行ない、４０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）にて溶出してア
ミンデヒドロゲナーゼＭの酵素的単一標品を得る０本酵
素はディスク電気泳動及びＳＯ８電気泳動的に均一であ
った。
本発明においてアミンデヒドロゲナーゼＭをアミン類に
作用させてアミン類を酸化し、相当するアルデヒドを生
成させる。生成したアルデヒドはガスクロマトグラフィ
ーで確認できる。
作用させてアミン類を酸化し、相当するアルデヒドを生
成させる。生成したアルデヒドはガスクロマトグラフィ
ーで確認できる。
本発明の酵素は基質特異性が広く、種々のアミン類に適
用できる。基質として用いるアミン類としては、例えば
１級モノアミンとして、メチルアミン、エチルアミン、
ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｉ−ブチルア
ミン、ｎ−ペンチルアミン、ｉ−ペンチルアミン、ｎ−
ヘキシルアミン、ｎ−へブチルアミン、ｎ−オクチルア
ミン、ｎ−ノニルアミン、ｎ−デシルアミン、ｎ−ウン
デシルアミン、ｎ−ドデシルアミン、ｎ−テトラデシル
アミンが挙げられる。
用できる。基質として用いるアミン類としては、例えば
１級モノアミンとして、メチルアミン、エチルアミン、
ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｉ−ブチルア
ミン、ｎ−ペンチルアミン、ｉ−ペンチルアミン、ｎ−
ヘキシルアミン、ｎ−へブチルアミン、ｎ−オクチルア
ミン、ｎ−ノニルアミン、ｎ−デシルアミン、ｎ−ウン
デシルアミン、ｎ−ドデシルアミン、ｎ−テトラデシル
アミンが挙げられる。
１級ジアミンとして、エチレンジアミン、プロピレンジ
アミン、ブチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン、
ヘキサメチレンジアミン、ヘプタメチレンジアミン、オ
クタメチレンジアミン、ノナメチレンジアミン、デカメ
チレンジアミン、ドデカメチレンジアミンなどが挙げら
れる。
アミン、ブチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン、
ヘキサメチレンジアミン、ヘプタメチレンジアミン、オ
クタメチレンジアミン、ノナメチレンジアミン、デカメ
チレンジアミン、ドデカメチレンジアミンなどが挙げら
れる。
ω−アミノ酸としては、６−７ミノヘキサン酸、８−ア
ミノオクタン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−ア
ミノドデカン酸などが挙げられる。
ミノオクタン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−ア
ミノドデカン酸などが挙げられる。
置換１級アミンとしては、ベンジルアミン、フェネチル
アミン、チラミン、１−ノルアドレナリン、ヒスタミン
などが挙げられる。
アミン、チラミン、１−ノルアドレナリン、ヒスタミン
などが挙げられる。
２級アミンとしては、ジ−ｎ−ブチルアミン、ジ−ｎ−
ヘキシルアミンなどが挙げられる。
ヘキシルアミンなどが挙げられる。
３級アミンとしては、トリエチルアミン、トリーｎ−ブ
チルアミン、トリーｎ−ヘキシルアミンなどが挙げられ
る。
チルアミン、トリーｎ−ヘキシルアミンなどが挙げられ
る。
ポリアミンとしては、スペルミン、スペルミジンなどが
挙げられる。
挙げられる。
反応系における基質としてのアミン類の量は特に制限は
ないが、通常液中濃度として０．０１〜ｌＯ重量２の範
囲で使用される。
ないが、通常液中濃度として０．０１〜ｌＯ重量２の範
囲で使用される。
而して反応に際しては、基質の他に補酵素であるＰＭＳ
等の電子受容体を微量添加することが必要である。
等の電子受容体を微量添加することが必要である。
反応系における酵素の量は、前記の酵素の分に制限はな
く、それぞれの基質の量比、酵素の活性、その他の条件
によって適宜°変更し得る。
く、それぞれの基質の量比、酵素の活性、その他の条件
によって適宜°変更し得る。
この反応における反応温度は通常２０〜４５℃の範囲で
あり、また反応時のｐＨは６〜８の範囲である。
あり、また反応時のｐＨは６〜８の範囲である。
而して反応液中に生成したアルデヒドを単離するには、
シリカゲル、イオン交換樹脂等のカラムクロマトグラフ
ィーなど通常用いられる分離手段を用いて容易に行なう
ことができる。
シリカゲル、イオン交換樹脂等のカラムクロマトグラフ
ィーなど通常用いられる分離手段を用いて容易に行なう
ことができる。
本発明の酸化方法は、有害なアミン類の分解や臨床分析
等への応用、更に有用なアルデヒドの製造法への応用な
ど幅広い分野に応用できるものである。
等への応用、更に有用なアルデヒドの製造法への応用な
ど幅広い分野に応用できるものである。
次に、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらによって限定されるものではない。
発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１
シュードモナス・エスピー−Ｋ−９５株を下記組成の液
体培地２０文を仕込んだジャーファーメンタ−にテ３０
℃、θ００ ｒｐｍ、 Ｉ ＶＶＭ（通気量） テ８０
時間培養を行なった。
体培地２０文を仕込んだジャーファーメンタ−にテ３０
℃、θ００ ｒｐｍ、 Ｉ ＶＶＭ（通気量） テ８０
時間培養を行なった。
液体培地 組成
Ｎａ３ ＨＰＯ４” １２ Ｈｌ ０ １．５ ｇＮａ
ｆｆｉｓｏ４ｏ、ｅ ｇ ＭｇＳＯ４拳 ７Ｈｔ０ ０．１ ｇ ＦｅＳＯ４＠ ７Ｈ１０５ｔｓｇ ＭｎＳＯ４＠ ４Ｈ１０５ｍｇ ＺｎＳＯ４ｍ ７ Ｈｌ ＯＱ、８ ｍｇＣｕＳＯ４−
５Ｈｌ ０ ０．０６１ｇＮａ２Ｍｏ０４ ＊ ４）１
ｔ０ ０．０３ ｍｇＮａｐ Ｂ ４０７ ｅ １０
Ｈｔｏ ０．０３ ｔｓｇＣａｌｌ＠ ＊ ２）１ＢＯ
ｆ（Ｏｍｇ酵母エキス ５ ｒａｇ イオン交換水 １文 培養後遠心分離機にて集菌し、更に菌体をフレンチプレ
ス（２００００ＰＳＩ）にて破砕し、超遠心処理して細
胞破片などを除去し、上清を粗酵素画分とした。
ｆｆｉｓｏ４ｏ、ｅ ｇ ＭｇＳＯ４拳 ７Ｈｔ０ ０．１ ｇ ＦｅＳＯ４＠ ７Ｈ１０５ｔｓｇ ＭｎＳＯ４＠ ４Ｈ１０５ｍｇ ＺｎＳＯ４ｍ ７ Ｈｌ ＯＱ、８ ｍｇＣｕＳＯ４−
５Ｈｌ ０ ０．０６１ｇＮａ２Ｍｏ０４ ＊ ４）１
ｔ０ ０．０３ ｍｇＮａｐ Ｂ ４０７ ｅ １０
Ｈｔｏ ０．０３ ｔｓｇＣａｌｌ＠ ＊ ２）１ＢＯ
ｆ（Ｏｍｇ酵母エキス ５ ｒａｇ イオン交換水 １文 培養後遠心分離機にて集菌し、更に菌体をフレンチプレ
ス（２００００ＰＳＩ）にて破砕し、超遠心処理して細
胞破片などを除去し、上清を粗酵素画分とした。
次に、粗酵素画分をストレプトマイシン処。
理、硫安沈殿（４０〜７０％画分）、ｌ１ＥＡＥ−セル
ロースカラムクロマトグラフィー、 Ｃトセルロースカ
ラムクロマトグラフイー、ゲルろ過（トヨバールＨＷ−
５５ＳＦ）を行ないアミンデヒドロゲナーゼＭを精製し
た。
ロースカラムクロマトグラフィー、 Ｃトセルロースカ
ラムクロマトグラフイー、ゲルろ過（トヨバールＨＷ−
５５ＳＦ）を行ないアミンデヒドロゲナーゼＭを精製し
た。
結果を表１、図１．２．３に示した。以上の操作により
ディスク電気泳動、ＳＤＳ電気電気的動的一となった。
ディスク電気泳動、ＳＤＳ電気電気的動的一となった。
実施例２
基質としてｎ−ヘキシルアルデヒドいた。５ ｍＭのＰ
ＭＳを含む５１ｍＭのリン酸バッファー溶液（ｐＨ”０
） １００＋Ｊｌ中にＩＯＢのｎ−ヘキシルアミン及
びアミンデヒドロゲナーゼＭ２０単位を含む溶液を３０
０＋Ｊｊ容三角フラスコに入れ、３０”Ｏにて１２０分
反応を行なった。
ＭＳを含む５１ｍＭのリン酸バッファー溶液（ｐＨ”０
） １００＋Ｊｌ中にＩＯＢのｎ−ヘキシルアミン及
びアミンデヒドロゲナーゼＭ２０単位を含む溶液を３０
０＋Ｊｊ容三角フラスコに入れ、３０”Ｏにて１２０分
反応を行なった。
反応終了後、ジエチルエーテルにて抽出し、ガスクロマ
トグラフィーにてｎ−ヘキシルアルデヒドの定量を行な
ったところ５．７＋ｗｇ得られた。
トグラフィーにてｎ−ヘキシルアルデヒドの定量を行な
ったところ５．７＋ｗｇ得られた。
本市はガスクロマトグラフィーにより標品と一致し、ｎ
−ヘキシルアルデヒドであると同定された。
−ヘキシルアルデヒドであると同定された。
実施例３
基質として表２に示すような各種アミン類をｌｓＮ用い
、４０１１％（７） ） ！Ｊ スー塩酸（ｐＨ７，３
） 、１ ｍＨのＫＣＮ、５ｍＭのＰＭＳ 、 ０．０
５ｍＭのＤＣＰＩＰ及びアミンデヒドロゲナーゼＭ１単
位を含む１０ ｆｆ１ｎを大型試験管に取り、３０℃に
て１２０分反応を行なった。
、４０１１％（７） ） ！Ｊ スー塩酸（ｐＨ７，３
） 、１ ｍＨのＫＣＮ、５ｍＭのＰＭＳ 、 ０．０
５ｍＭのＤＣＰＩＰ及びアミンデヒドロゲナーゼＭ１単
位を含む１０ ｆｆ１ｎを大型試験管に取り、３０℃に
て１２０分反応を行なった。
酵素活性は反応するＤＣＰＩＰ量を８００ｍ ｇの吸光
度によって測定した。表２にドデカメチレンジアミンを
基質とした場合の活性を１００ としてその比活性を結
果として示した。
度によって測定した。表２にドデカメチレンジアミンを
基質とした場合の活性を１００ としてその比活性を結
果として示した。
図１は実施例１における本酵素のＤＥＡＥ−セルロース
によるカラムクロマトグラムであり、図２は同じ酵素の
ＣＭ−セルロースによるカラムクロマトグラムである。 更に、図３はゲルろ過よるカラムクロマトグラムである
。 特許出願人：花王石鹸株式会社 代 理 人：望 月 孜 部 ロのの−
によるカラムクロマトグラムであり、図２は同じ酵素の
ＣＭ−セルロースによるカラムクロマトグラムである。 更に、図３はゲルろ過よるカラムクロマトグラムである
。 特許出願人：花王石鹸株式会社 代 理 人：望 月 孜 部 ロのの−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有するアミンデヒドロゲナーゼ
Ｍ。 ０作用及び基質特異性： 本酵素は広い基質特異性を示し、モノアミン、ジアミン
のほかに２１Ｉ＆アミン、３級アミンにも作用する。ア
ミン類のアミノ基に作用してアンモニアを放出し、対応
するアルデヒドを生成する。 ＲＣＨｔ Ｎ Ｈｔ ＋ Ｐ Ｍ Ｓ ＋ Ｈｔ Ｏ→
ＲＣＨＯ＋ Ｐ Ｍ Ｓ Ｈ２＋ Ｎ ＨｓＰＭＳＨ，
＋Ｏ，＋ＰＭＳ＋Ｈｔ Ｏ。 （非酵素的） ＊ＰＭＳ：Ｎ−メチルフェナゾニウムメソサ■至適ｐＨ
及び安定ＰＨ範囲： 至適ＰＨは７〜７．５であるが、基質によって変動する
。安定ＰＨ範囲は６〜８である。 ■力価の測定法： 本酵素の活性は本酵素反応において生成したＦＭＳＨ，
と反応するＤＣＰＩＦの量を８００ｙｓμの吸光度にて
測定した。 ＣＤＣＰＩＰ：２．８−ジクロロフェノールインドフェ
ノール、９ｇ２１．５ＸＩＯ’ ）測定に際しては、４
０ｄのトリス−塩＃緩衝液（ｐＨ７，３） 、１ ｔａ
ＭのＫＧＮ 、５ｍＨのＰＮＳ、０．０５ｍＮのｎｃｐ
ｒｐ （７）溶液を用い、１１Ｎ（７１基質及び酵素溶
液を加え、３０℃で３０〜１２０分間反応を行なった０
反応時Ｍ１分間当りｌルＮのアルデヒドを生成させる酵
素量を１単位とする。 ■作用適温の範Ｈ： 作用適温は２０〜４５℃の範囲内にあり、特に！？ｎ〜
ｉｎ”ｔ’ｒｍ：ＦＦ−１ｓ＜ａ：ａ−ｔａＭス−■ｐ
Ｈ１温度等による失活条件ニ ア０℃、５分間の熱処理で完全に失活する。 ｐＨは５．５以下又は８．５以上で失活する。 ■阻害、活性化および安定化： １ ｍＨのカルボニル試薬（イソニアシト、セミカルバ
ジド）で阻害され、活性化剤、安定化剤は特にない。 ■分子量： Ｓ［１ｌＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定
した結果、約４２０００である。 ■等電点： 等電点がＰＨ８，４のアルカリ蛋白質である。 ■精製方法： アミンデヒドロゲナーゼＭを含有する粗酵素液に４０ｍ
Ｍ１リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶かした硫酸ス
トレプトマイシンを水冷下滴下し、３０分静置後遠心分
離し、上＃を得る。 得られた上清に精製硫安を加え、ｐＨ７，２にて４０Ｘ
飽和として３０分静置後遠心分離し、上清を得る。更に
、精製硫安を加えて７０％飽和にし、２Ｎアンモニア水
にてｐＨ７，ｆ３に調製する。３０分静置後遠心分離し
て沈殿を得、４ｈＭ トリス−塩酸ＣＰＨ７，２） −
７０Ｘ硫安飽和溶液にて沈殿を集め、これを１０ｄトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）に溶かし、−夜透析する
。 １０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．３ ）で平
衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製ＤＥ−
５２）に上記粗酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄し、０
〜１５０ ｍＭの食塩水により直線的濃度勾配で溶出し
、アミンデヒドロゲ、ナーゼＭの活性画分を集め、次い
でこのアミンデヒドロゲナーゼ画分を１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，８）で平衡化したＣトセルロ
ース（ワットマン社製０Ｎ−５２）のカラムに通液し、
同緩衝液で洗浄し、０〜７０ｍＭの食塩水により直線的
濃度勾配で溶出し、アミンデヒドロゲナーゼＭの活性画
分を集めた。 更に、この活性画分をトヨパールＨＷ−５５ＳＦ（東洋
曹達社製）のカラムに通液してゲルろ過を行ない、４０
履ｘトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）にて溶出してア
ミンデヒドロゲナーゼＭの酵素的単一標品を得る０本酵
素はディスク電気泳動及びＳＤＳ電気電気的動的一であ
った。 ２、 アミン類にアミンデヒドロゲナーゼＭを作用させ
ることを＃徴とするアミン類の酸化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58165820A JPS6058068A (ja) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | 新規なアミンデヒドロゲナーゼｍ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58165820A JPS6058068A (ja) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | 新規なアミンデヒドロゲナーゼｍ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6058068A true JPS6058068A (ja) | 1985-04-04 |
| JPH0440988B2 JPH0440988B2 (ja) | 1992-07-06 |
Family
ID=15819613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58165820A Granted JPS6058068A (ja) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | 新規なアミンデヒドロゲナーゼｍ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6058068A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000018892A1 (fr) * | 1998-09-25 | 2000-04-06 | Kikkoman Corporation | Histamine deshydrogenase, procede de production, procede de decelement quantitatif de l'histamine et reactif de decelement quantitatif |
| EP1020515A2 (en) * | 1999-01-18 | 2000-07-19 | DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, Ltd. | Amino alcohol dehydrogenase, its production and use |
| WO2011031147A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Preparation of a compound comprising an amine group from an alpha-keto acid |
| WO2010104390A3 (en) * | 2009-03-11 | 2011-04-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Preparation of alpha-ketopimelic acid |
-
1983
- 1983-09-08 JP JP58165820A patent/JPS6058068A/ja active Granted
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000018892A1 (fr) * | 1998-09-25 | 2000-04-06 | Kikkoman Corporation | Histamine deshydrogenase, procede de production, procede de decelement quantitatif de l'histamine et reactif de decelement quantitatif |
| EP1020515A2 (en) * | 1999-01-18 | 2000-07-19 | DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, Ltd. | Amino alcohol dehydrogenase, its production and use |
| EP1020515A3 (en) * | 1999-01-18 | 2002-08-07 | DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, Ltd. | Amino alcohol dehydrogenase, its production and use |
| WO2010104390A3 (en) * | 2009-03-11 | 2011-04-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Preparation of alpha-ketopimelic acid |
| WO2011031147A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Preparation of a compound comprising an amine group from an alpha-keto acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0440988B2 (ja) | 1992-07-06 |
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