JP2584907B2 - ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼの製造方法に関するものである。

【０００２】本発明による酵素、ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼは、医農薬合成中間体として有用な
モノアセチルポリアミンの合成や、生体試料中のジアセ
チルポリアミンの定量等に使用される。

【０００３】

【従来の技術】ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは、ジアセチルポリアミンを加水分解してモノアセチ
ルポリアミンを生成する酵素で、例えば次の反応を触媒
する。

【０００４】 ジアセチルプトレッシン ＋ Ｈ₂Ｏ → モノアセチルプトレッシン ＋ ＣＨ₃ＣＯＯＨ 従来、ジアセチルポリアミンに作用するアミドヒドロラ
ーゼに関する知見はほとんどなく、従ってジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼの製造方法に関する報告が
なく、工業的に利用できる技術が確立されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の背景から、ジア
セチルポリアミンに作用し、モノアセチルポリアミンを
生成する酵素、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼを見い出し、かつ工業的にジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼを製造する技術の確立が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、アルカリゲネ
ス属、シュードモナス属、フザリウム属、キャンディダ
属、またはトリコスポロン属に属する微生物がジアセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼを多く産生することを
見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明はアルカリゲネス属、シュー
ドモナス属、フザリウム属、キャンディダ属、またはト
リコスポロン属に属し、ジアセチルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、その培養物
からジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを採取す
ることを特徴とするジアセチルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼの製造方法である。

【０００８】本発明で使用するジアセチルポリアミンは
公知なものが特に制限されず用いうる。特に好適に使用
されるものを具体的に例示すれば、ジアセチル-1,2-ジ
アミノエタン、ジアセチル - 1,3-ジアミノプロパン、
ジアセチルプトレッシン、ジアセチルカダベリン、ジア
セチル-1,6-ジアミノヘキサン、ジアセチル-1,8-ジアミ
ノオクタン、ジアセチルスペルミジン、ジアセチルスペ
ルミン等が挙げられる。

【０００９】本発明に使用される微生物は、アルカリゲ
ネス属、シュードモナス属、フザリウム属、キャンディ
ダ属、またはトリコスポロン属に属し、ジアセチルポリ
アミンアミドヒドロラーゼの生産能を有するものであれ
ば既存の菌株、自然界から新たに分離された菌株、およ
びこれらの変異株のいずれでも使用することができる。

【００１０】さらに、これらのアルカリゲネス属、シュ
ードモナス属、フザリウム属、キャンディダ属、または
トリコスポロン属に属し、ジアセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼの生産能を有する微生物からジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を単離
し、その遺伝子を同属あるいは他の属に属する微生物内
にて発現させるように導入して得られるジアセチルポリ
アミンアミドヒドロラーゼ生産菌も使用することができ
る。

【００１１】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼの製造方法は、ジアセチルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼの生産能のあるアルカリゲネス属、シュード
モナス属、フザリウム属、キャンディダ属、またはトリ
コスポロン属に属する微生物の培養物からジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼを採取する方法であるが、
アルカリゲネス属、シュードモナス属、フザリウム属、
キャンディダ属、またはトリコスポロン属に属する微生
物の菌株としては、例えば アルカリゲネス・フェカリス (Alcaligenes faecalisIF
O 1311） アルカリゲネス・フェカリス (Alcaligenes faecalisIF
O 14479） アルカリゲネス・スピーシーズ （Alcaligenes Sp. IFO
14130） シュードモナス・オーレオファシエンス （Pseudomonas
aureofacieuns IFO 3521） シュードモナス・シンザンタ （Pseudomonas synzantha
IFO 3912） シュードモナス・シンザンタ （Pseudomonas synzantha
IFO 3913） シュードモナス・アエルギノーサ （Pseudomonas aerug
inosa IFO 3080） シュードモナス・クロロラフィス （Pseudomonas chlor
oraphis IFO 3904） フザリウム・オキシスポラム （Fusarium oxysporum I
FO 7190） フザリウム・ソラニ （Fusarium solani IFO 9955） キャンディダ・トロピカリス （Candida tropicalisIFO
0007） キャンディダ・ギラモンジ （Candida guillermondii
IFO 0454） トリコスポロン・クタニウム （Trichosporon cutaneum
IFO 1198） トリコスポロン・クタニウム （Trichosporon cutaneum
IFO 0173） 等が挙げられる。

【００１２】上記の各微生物を培養するにあたって使用
する培地としては公知のものが使用される。例えばグル
コース、糖蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス、
酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、およびリン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特
に限定されないが、これらの成分の他にジアセチルプト
レッシン、ジアセチルカダベリン等のジアセチルポリア
ミンやモノアセチルプトレッシン、モノアセチル-1,6-
ジアミノヘキサン等のモノアセチルポリアミンを含有さ
せることが該酵素の生産性を高める上において有利であ
る。

【００１３】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼを生産する生産菌を培養する際の培養条件とし
ては、通気攪拌条件下で培養温度が15〜40℃の範囲、好
ましくは20〜35℃の範囲で培養する方法が好適である。
培養時のpH条件は、pH5.0〜9.0の範囲で、好ましくはpH
6.0〜8.0の範囲が適当である。培養時間は、特に限定さ
れないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増殖の後
期に達する時間から休止状態に入ってから10〜30時間以
内の範囲が適当である。

【００１４】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法や濾過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。

【００１５】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼの分離精製は、次のようにして行うことができ
る。

【００１６】菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽出
する方法としては、従来から行われている超音波による
菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダ
イノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチーム
等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊等
の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選択
して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採取
することができる。

【００１７】これらの方法で抽出された粗酵素液からジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼをさらに精製す
る必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵
素の精製手段である硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交
換カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、ヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトグラフィー法、アフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィー法、調製用電気泳動法等
の方法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことに
よって精製を行うことができる。

【００１８】本発明により得られたジアセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼは、以下の理化学的性質を有す
る。

【００１９】作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。例えば次の反応を触媒する。

【００２０】 温度安定性 pH7.5、30分間の処理条件下において、4〜35゜Ｃにおい
て80％以上の残存活性を有する。

【００２１】pH安定性 30℃で、30分間保存した時、pH5.6〜9.4において80％以
上の残存活性を有する。

【００２２】また、本発明により得られたジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼの理化学的性質をさらに詳
細にアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligensfaecalis
IFO14479）、およびキャンディダ・ギラモンジ（Candi
da guillermondii IFO 0454）を培養して得られたジア
セチルポリアミンアミドヒドロラーゼについて例示する
と、以下の通りである。

【００２３】［アルカリゲネス属由来ジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ］ 1.作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。すなわち以下の反応を触媒する。

【００２４】 ジアセチルポリアミン ＋ Ｈ₂Ｏ → モノアセチルポリアミン ＋ ＣＨ₃ＣＯＯＨ 2.基質特異性 10mMの濃度における各基質に対する本酵素の相対活性
は、ジアセチルプトレッシンに対する活性を100として
表示すると表1のようになる。

【００２５】

【表１】 ＊Ｎ^１−アセチルスペルミジン生成 3.至適pH：pH8.5〜9.5 （図1） 4.pH安定性 30℃で30分間保存した時、pH5.6〜9.4において80％以上
の残存活性を有する。（図2） 5.至適温度 pH9.0、15分間の反応において37〜42℃である。

【００２６】（図3） 6.温度安定性 pH7.5、30分間の処理条件下において、4〜55℃におい
て、80％以上の残存活性を有し、67℃、30分間の処理で
完全に失活する。（図4） ［キャンディダ属由来ジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼ］ 1.作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。すなわち以下の反応を触媒する。

【００２７】 ジアセチルポリアミン ＋ Ｈ₂Ｏ → モノアセチルポリアミン ＋ ＣＨ₃ＣＯＯＨ 2.基質特異性 10mMの濃度における各基質に対する本酵素の相対活性
は、ジアセチルプトレッシンに対する活性を100として
表示すると表2のようになる。

【００２８】

【表２】 ＊Ｎ^１−アセチルスペルミジン生成 3.至適pH:pH7.0〜8.0 （図5） 4.pH安定性 30℃で30分間保存した時、pH5.2〜11.4において80％以
上の残存活性を有する。（図6） 5.至適温度 pH7.5、15分間の反応において37〜42℃である。

【００２９】（図7） 6.温度安定性 pH7.5、30分間の処理条件下において、4〜35℃において
80％以上の残存活性を有し、55℃、30分間の処理で完全
に失活する。（図8）本発明におけるジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼの酵素活性測定法および、酵素
活性の表示方法は以下の通りである。

【００３０】20mMのジアセチルプトレッシン1.0mlと、
アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ（特公昭 59-743
5）6.8ユニット、プトレッシンオキシダーゼ 0.28ユニット、パ
ーオキシダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジクロロフェノール 0.7
5mg、4ーアミノアンチピリン 0.06mgを含む 0.1Mトリス
塩酸緩衝液（pH8.0）1.0mlと、ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼを含有する被検体 50μlを混合し、30
℃で 1時間反応させた後、510nmにおける吸光度を測定
することによって行われる。

【００３１】酵素活性値は、1分間当り 1μmoleのモノ
アセチルプトレッシンを生成させる酵素を 1ユニット （μ
mole/min）として表示する。

【００３２】

【発明の効果】本発明は、アルカリゲネス属、シュード
モナス属、フザリウム属、キャンディダ属、またはトリ
コスポロン属に属し、ジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、その培養物か
らジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを採取する
ことを特徴とするジアセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼの製造方法である。

【００３３】本発明によるジアセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼは、医農薬中間体として有用なモノアセチ
ルポリアミンを純粋かつ簡便に合成する際に、大変有利
である。

【００３４】また本発明は、ジアセチルポリアミンに作
用するアミドヒドロラーゼを工業的に製造できる技術を
提供する。

【００３５】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００３６】

【実施例】実施例 １〜５ 0.5％ポリペプトン、0.01％酵母エキス、0.1％食塩、0.
2％ジアセチルプトレッシン、0.05％リン酸第一カリウ
ム、0.15％リン酸第二カリウムから成る培地（pH7.0）
各10mlを大型試験管に分注し、120℃で15分間オートク
レーブしたものに、表3に示す各種微生物を斜面培養か
ら、一白金耳接種した。28℃で48〜120時間振とう培養
を行った後、各培養液を予 め上記と同様の組成を有す
る培地 400ml（100mlｘ4）を仕込滅菌しておいた坂 口
フラスコに加えて本培養を行った。28℃で48〜120時間
振とう培養を行った後 、培養液を遠心分離機にかけて
菌体を採取した。得られた菌体を10mMリン酸緩衝液（pH
7.5）50mlに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機にかけ
て菌体破砕を行っ た。その破砕液を遠心分離機により
遠心分離し、粗酵素抽出液を得た。各粗酵素抽出液0.05
mlに、100mMリン酸緩衝液（pH7.5）0.95ml、および20mM
ジアセチルプトレッシン1.0mlを加えて30℃で1時間反応
させた。50％トリクロロ酢酸0.2mlを 添加して反応を停
止させた後、生成したモノアセチルプトレッシンを高速
液体クロマトグラフィーにより定量した結果を表３に示
した。表中の生成モノアセチルプトレッシンは、30℃、
1時間の反応で、0.05mlの粗酵素抽出液の作用により生
成したモノアセチルプトレッシン量であり、培地 1ml当
りの活性とは、粗酵素抽出液の酵素活性を元の培養液 1
ml当りに換算したものである。

【００３７】

【表３】 実施例 ６ 0.5％ポリペプトン、0.01％酵母エキス、0.2％ジアセチ
ルプトレッシン、0.1％食塩、0.05％リン酸第一カリウ
ム、0.15％リン酸第二カリウム、 0.02％消泡剤から成
る培地（pH 7.0）0.5L を 2Lの三角フラスコに入れ、12
0℃で20分間オートクレーブした後、28℃以下でこの培
地にアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecal
is IFO 14479）を植菌した。28℃で48時間振とう培
養を行った後この培養液を、予め上記と同様の組成を有
する培地 20Lを仕込み減菌しておいたジャー・ファーメ
ンターに加えて本培養を行った。培養条件は28℃、攪拌
回転数100rpm、通気20L／minで、48時間培養の後、培養
液を遠心分離にかけて菌体を採取した。得られた菌体の
200g（湿菌体重量）を10mMリン酸緩衝液（pH 7.5）1Lに
懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機により菌体破砕を行
った。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、
上清液を得た。この上清液中のジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼの総活性は 1,080ユニット、比活性は 0.
014ユニット／mg-タンハ゜ク であった。

【００３８】この上清液を、予め 20mM のリン酸緩衝液
（pH 7.5）で平衡化した 600ml のDEAE-セルロースのカ
ラムに通し酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩
衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配によりジアセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵
素活性 = 950ユニット、 比活性 = 0.074ユニット／mg-タンハ゜ク］
この溶出液を限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニ
ウムを 20％となるように添加し、次いで予め 20％の硫
酸アンモニウムを含む 20mMリン酸緩衝液（pH 7.5）で
平衡化しておいた 100mlのブチルトヨパール 650M （東
ソー社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。カラム
を同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモニウム
の逆直線濃度勾配によりジアセチルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼを溶出させた。［ 総酵素活性 = 845ユニット、
比活性 = 1.6ユニット／mg-タンハ゜ク ］得られた酵素溶液を限
外濾過により濃縮した後、1.8Lのセファクリル S-300
（ファルマシア社製）を充填したカラムに通し、ゲル濾
過を行い活性画分を集めた。 ［総酵素活性 = 762ユニッ
ト、 比活性 =2.2ユニット／mg-タンハ゜ク ］この溶出液を、予め
20mMリン酸緩衝液（pH 7.5）で平衡化しておいた 40m
lの EAH-セファロース（ファルマシア社製）のカラムに
通し吸着させた。カラムを同様の緩衝液で洗浄した後、
食塩の直線濃度勾配により、ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素活性 = 670ユニッ
ト、 比活性 = 5.1ユニット／mg-タンハ゜ク ］この溶出液を限外
濾過により脱塩した後、予め 20mM リン酸緩衝液（pH7.
5）で平衡化しておいた 70ml の DEAE-トヨパール 650S
（東ソー社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。
カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の直線
濃度勾配により、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼを溶出させた。［総酵素活性 = 570ユニット、 比活性
= 8.5ユニット／mg-タンハ゜ク ］この溶出液に、硫酸アンモニウ
ムを 15％となるように添加し、次いで予め 15％の硫酸
アンモニウムを含む 20mM リン酸緩衝液（pH7.5）で平
衡化しておいた100mlのフェニル-セファロース4B （フ
ァルマシア社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。
カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモ
ニウムの逆直線濃度勾配により、ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素活性 = 480
ユニット、 比活性 = 13ユニット／mg-タンハ゜ク］こうして得られた
酵素の純度をドデシル硫酸ナトリウム存在下、および非
存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調
べた結果、両者共に一本のバンドのみが観察され、純粋
なジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼであること
が確認された。

【００３９】次に、こうして得られた精製酵素を 10mM
リン酸緩衝液（pH 7.5）により適当に希釈して調整した
酵素標品を用いて本酵素の至適pH、基質特異性、pH安定
性および温度安定性を調べた。

【００４０】［至適pH］10mM ジアセチルプトレッシン
を含む0.1M ブリットン-ロビンソン広域緩衝液（ pH 4.
4，5.7， 7.1，7.6，8.7，9.4，10.3，11.3，11.8，12.
5 ）0.95ml に0.05ml の酵素標品（0.04 ユニット）を添加
混合し、37℃下で 15分間反応を行った。この反応溶液
1.0ml に 50％トリクロロ酢酸水溶液を 0.1ml 加え、
0℃下で20分間放置し、次いで、 1M リン酸緩衝液（pH
7.5）0.9ml を加えた。この溶液 0.2ml と 10mM リン酸
緩衝液（pH 7.5） 0.8ml と、アシルポリアミンアミド
ヒドロラーゼ 6.8ユニット、プトレッシンオキシダーゼ 0.
28ユニット、パーオキシダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジクロロフェ
ノール 0.75mg、および 4-アミノアンチピリン0.06mgを
含む 0.1M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）1mlを混合し、3
7℃で 15分間反応させた後、510nm における吸光度を測
定し、それぞれの酵素活性値を算出した。以上の操作の
後、最高の酵素活性値を100％とした相対活性（Relativ
e activity）を算出し、グラフ化して図1を得た。図1よ
り、本酵素の至適 pH は 8.5〜9.5 の範囲にあることが
わかる。

【００４１】［基質特異性］酵素標品 0.05ml（1.3ユニッ
ト）を、各種ジアセチルポリアミンの100mM溶液 0.1ml、
0.1M炭酸緩衝液（pH9.0）0.85mlから成る反応液に添加
し、37゜Ｃで15分間反応させた。50％トリクロロ酢酸0.1
mlを添加して反応を停止させた後、生成したモノアセチ
ルポリアミンを高速液体クロマトグラフィーにより定量
した。これらのジアセチルポリアミンに対する作用の強
さを、それぞれジアセチルプトレッシンに対する作用を
100％とした相対活性値として表1に示す。

【００４２】［pH 安定性］0.1M ブリットン-ロビンソ
ン広域緩衝液（pH 3.7，4.4，5.7，7.1，7.6，8.7，9.
4，10.3， 11.3，11.8，12.5 ）0.95ml と酵素標品
0.05ml （0.4ユニット）を混合し、30℃で 30分間放置した
後、各溶液 0.1ml と 1M リン酸緩衝液（pH 7.5）0.9ml
を混合した。この酵素溶液 0.05mlと 20mMジアセチル
プトレッシン 1.0ml と、アシルポリアミンアミドヒド
ロラーゼ 6.8ユニット、プトレッシンオキシダーゼ 0.28ユニ
ット、パーオキシダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジクロロフェノー
ル 0.75mg、および4-アミノアンチピリン 0.06mgを含む
0.1M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）1ml を混合し、37℃
で 15分間反応させた後、直ちに 510nm における吸光度
を測定し、それぞれの酵素活性値を算出した。以上の操
作の後、最高の酵素活性値を 100％とした相対活性を算
出し、グラフ化して図2を得た。図2から明らかなよう
に、本酵素は pH 5.6〜9.4 の範囲において80％以上の
残存活性を有している。

【００４３】［温度安定性］10mM リン酸緩衝液（pH 7.
5）で希釈した酵素標品（0.8ユニット）を4、23、30、37、4
5、53、60、67、75℃の各温度で 30分間放置した。この
酵素溶液を10mM リン酸緩衝液で10倍に希釈した希釈液
0.05mlと 20mM ジアセチルプトレッシン 1mlと、アシル
ポリアミンアミドヒドロラーゼ 6.8ユニット、プトレッシン
オキシダーゼ 0.28ユニット、パーオキシダーゼ 0.9ユニット、
2,4-ジクロロフェノール 0.75mg、および4-アミノアン
チピリン 0.06mgを含む 0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH 8.
0）1ml を混合し、37℃で15分間反応させた後、510nm
における吸光度を測定し、それぞれの酵素活性値を算出
した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を100％とし
た相対活性を算出し、グラフ化して図4を得た。図4から
明らかなように、本酵素は 55℃までの温度において80
％以上の残存活性を有している。

【００４４】実施例 7 0.5％ポリペプトン、0.01％酵母エキス、0.2％ジアセチ
ルプトレッシン、0.1％食塩、0.05％リン酸第一カリウ
ム、0.15％リン酸第二カリウム、 0.02％消泡剤から成
る培地（pH 7.0）0.5Lを 2Lの三角フラスコに入れ、120
℃で20分間オートクレーブした後、28℃以下でこの培地
にキャンディダ・ギラモンジ（Candidaguilliermondii
IFO 0454）を植菌した。28℃で24時間振とう培養を行っ
た後この培養液を、予め上記と同様の組成を有する培地
20Lを仕込み減菌しておいたジャー・ファーメンターに
加えて本培養を行った。培養条件は28℃、攪拌回転数10
0rpm、通気20L／minで、24時間培養の後、培養液を遠心
分離にかけて菌体を採取した。 得られた菌体の460g
（湿菌体重量）を10mMリン酸緩衝液（pH 7.5）1Lに懸濁
し、その懸濁液をダイノミル破砕機により菌体破砕を行
った。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、
上清液を得た。この上清液中のジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼの総活性は 220ユニット 、比活性は0.003
ユニット／mg-タンハ゜ク であった。

【００４５】この上清液を、予め 20mM のリン酸緩衝液
（pH7.5）で平衡化した 1.5LのDEAE-セルロースのカラ
ムに通し酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝
液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配によりジアセチル
ポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素
活性 = 170ユニット、 比活性 = 0.087ユニット／mg-タンハ゜ク ］こ
の溶出液を限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウ
ムを 25％となるように添加し、次いで予め 25％の硫酸
アンモニウムを含む 20mMリン酸緩衝液（pH 7.5）で平
衡化しておいた 100mlのブチルトヨパール 650M（東ソ
ー社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。カラムを
同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモニウムの
逆直線濃度勾配によりジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼを溶出させた。［ 総酵素活性 = 160ユニット、比
活性 = 0.87ユニット／mg-タンハ゜ク ］得られた酵素溶液を限外
濾過により濃縮した後、1.8Lのセファクリル S-300（フ
ァルマシア社製）を充填したカラムに通し、ゲル濾過を
行い活性画分を集めた。［総酵素活性 = 130ユニット、比活
性 = 2.0ユニット／mg-タンハ゜ク ］この溶出液を、予め 20mM
リン酸緩衝液（pH 7.5）で平衡化しておいた 40mlの E
AH-セファロース（ファルマシア社製）のカラムに通し
吸着させた。カラムを同様の緩衝液で洗浄した後、食塩
の直線濃度勾配により、ジアセチルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼを溶出させた。［総酵素活性 = 77ユニット、比
活性 = 2.7ユニット／mg-タンハ゜ク］この溶出液を限外濾過によ
り脱塩した後、予め20mM リン酸緩衝液（pH 7.5）で平
衡化しておいた70ml の DEAE-トヨパール 650S（東ソー
社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。 カラムを
同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配
により、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶
出させた。［総酵素活性 = 54ユニット、 比活性 = 5.2ユニット
／mg-タンハ゜ク ］この溶出液を限外濾過により脱塩した
後、次いで予め 20mM リン酸緩衝液（pH7.5）で平衡化
しておいた 20mlのDEAE-セルロースのカラムに通し、酵
素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄し
た後、食塩の逆直線濃度勾配により、ジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素活性 =
33ユニット、 比活性 =15ユニット／mg-タンハ゜ク ］こうして得ら
れた酵素の純度をドデシル硫酸ナトリウム存在下、およ
び非存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て調べた結果、両者共に一本のバンドのみが観察され、
純粋なジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼである
ことが確認された。

【００４６】次に、こうして得られた精製酵素を 10mM
リン酸緩衝液（pH 7.5）により適当に希釈して調整した
酵素標品を用いて本酵素の至適pH、基質特異性、pH安定
性および温度安定性を調べた。

【００４７】［至適pH］10mM ジアセチルプトレッシン
を含む0.1M ブリットン-ロビンソン広域緩衝液（ pH 4.
5，5.0， 5.6，6.5，7.0，7.5，8.2，8.7，9.0，9.5，1
0.1，11.0，11.3，11.5，11.9 ）0.95mlに 0.05mlの酵
素標品（0.03 ユニット）を添加混合し、37℃下で 15分間反
応を行った。この反応溶液 1.0mlに50％トリクロロ酢酸
水溶液を0.1ml加え、 0℃下で 20分間放置し、次いで、
1M リン酸緩衝液（pH 7.5）0.9mlを加えた。この溶液
0.4mlと 10mMリン酸緩衝液（pH 7.5）0.6mlと、アシル
ポリアミンアミドヒドロラーゼ 6.8ユニット、プトレッシン
オキシダーゼ 0.28ユニット、パーオキシダーゼ 0.9ユニッ
ト、 2,4-ジクロロフェノール 0.75mg、および4-アミノ
アンチピリン 0.06mgを含む 0.1M トリス塩酸緩衝液（p
H 8.0）1mlを混合し、37℃で15分間反応させた後、510n
m における吸光度を測定し、それぞれの酵素活性値を算
出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を 100％と
した相対活性（Relativeactivity）を算出し、グラフ化
して図5を得た。図5より、本酵素の至適pHは 7.0〜8.0
の範囲にあることがわかる。

【００４８】［基質特異性］酵素標品 0.05ml（0.05ユニッ
ト）を、各種ジアセチルポリアミンの100mM 溶液 0.1m
l、0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.5）0.85mlから成る反応液
に添加し、37℃で15分間反応を行った。50％トリクロロ
酢酸0.1mlを添加して反応を停止させた後、生成したモ
ノアセチルポリアミンを高速液体クロマトグラフィーに
より定量した。これらのジアセチルポリアミンに対する
作用の強さを、それぞれジアセチルプトレッシンに対す
る作用を100％とした相対活性値として表2に示す。

【００４９】［pH 安定性］0.1M ブリットン-ロビンソ
ン広域緩衝液（pH 4.5，5.0，5.6，6.5，7.0，7.5，8.
2，8.7，9.0，9.5，10.1，11.0，11.3，11.5，11.9 ）
0.95ml と酵素標品 0.05ml（0.4ユニット）を混合し、30℃
で 30分間放置した後、各溶液 0.1mlと 1M リン酸緩衝
液（pH 7.5）0.9mlを混合した。この酵素溶液 0.05mlと
20mMジアセチルプトレッシン 1.0mlと、アシルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ 6.8ユニット、プトレッシンオキシ
ダーゼ 0.28ユニット、パーオキシダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジ
クロロフェノール 0.75mg、および4-アミノアンチピ
リン 0.06mgを含む0.1M トリス塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）
1ml を混合し、37℃で 15分間反応させた後、直ちに 51
0nm における吸光度を測定し、それぞれの酵素活性値を
算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を100％
とした相対活性を算出し、グラフ化して図6を得た。図6
から明らかなように、本酵素は pH 5.2〜11.4 の範囲
において 80％以上の残存活性を有している。

【００５０】［温度安定性］10mM リン酸緩衝液（pH 7.
5）で希釈した酵素標品（0.03ユニット）を 4、25、30、3
7、40、43、45、55、65℃ の各温度で 30分間放置し
た。この酵素溶液を10mMリン酸緩衝液で10倍に希釈した
希釈液0.05mlと 20mMジアセチルプトレッシン 1mlと、
アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ 6.8ユニット、プトレ
ッシンオキシダーゼ 0.28ユニット、パーオキシダーゼ 0.9
ユニット、2,4-ジクロロフェノール 0.75 mg、および4-アミ
ノアンチピリン 0.06mgを含む 0.1Mトリス塩酸緩衝液
（pH 8.0）1mlを混合し、 37℃で15分間反応させた後、
510nm における吸光度を測定し、それぞれの酵素活性値
を算出した。 以上の操作の後、最高の酵素活性値を10
0％とした相対活性を算出し、グラフ化して図8を得た。
図8から明らかなように、本酵素は 35℃までの温度にお
いて 80％以上の残存活性を有している。

【００５１】実施例 ８〜１０ 実施例2、3、5で培養して得られた、各粗酵素抽出液
を、DEAE-セルロース（100ml）、ブチルトヨパール（10
0ml）およびセファクリル S-300（500ml）の各カラムク
ロマトグラフィーにより精製した。得られた酵素の純度
をドデシル硫酸ナトリウム存在下、および非存在下での
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べた結果、
両者共に1本のバンドのみが観察され、純粋なジアセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼであることが確認され
た。こうして得られた精製酵素を10mMリン酸緩衝液（pH
7.5）により適当に希釈して調製した酵素標品を用い
て、pH安定性、温度安定性および至適pHを調べた。

【００５２】［pH安定性］0.1M ブリットン-ロビンソン
広域緩衝液の各pHが、4.6、5.4、6.2、7.5、8.5、9.2、
10.0、10.8、であること以外は、実施例6と全く同様にp
H安定性を調べた。実施例6と同様にグラフ化して、図
9、10、11を得た。図9、10、11より明らかなように、シ
ュウドモナス属由来、フザリウム属由来およびトリコス
ポロン属由来のジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは、それぞれpH5.2〜9.6、pH 5.4〜10.2、pH5.6〜1
0.4の範囲において80％以上の残存活性を有している。 ［温度安定性］30分間放置する温度が、それぞれ4、3
0、37、 43、 50、56℃であること以外は、実施例6と全
く同様に温度安定性を調べた。実施例6と同様にグラフ
化して、図12、13、14を得た。図12、13、14より明らか
なように、シュウドモナス属由来、フザリウム属由来お
よびトリコスポロン属由来のジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼは、それぞれ45℃、40℃、38℃までの温
度において80％以上の残存活性を有している。 ［至適pH］0.1M ブリットン-ロビンソン広域緩衝液の各
pHが、5.6、6.3、7.2、8.6、9.4、11.0であること以外
は、実施例6と全く同様に至適pHを調べた。実施例6と同
様にグラフ化して、図15、 16、17を得た。図15、16、1
7より明らかなように、シュウドモナス属由来、フザリ
ウム属由来およびトリコスポロン属由来のジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼの至適pHは、それぞれpH8.
1〜9.1、pH8.9〜 9.9、pH5.8〜6.8である。

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリゲネス属由来ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼのpH活性曲線を示す図である。

【図２】同酵素のpH安定性を示す図である。

【図３】同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図４】同酵素の温度安定性を示す図である。

【図５】キャンディダ属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのpH活性曲線を示す図である。

【図６】同酵素のpH安定性を示す図である。

【図７】同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図８】同酵素の温度安定性を示す図である。

【図９】シュードモナス属由来ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼのpH安定性を示す図である。

【図１０】フザリウム属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのpH安定性を示す図である。

【図１１】トリコスポロン属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼのpH安定性を示す図である。

【図１２】シュードモナス属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼの温度安定性を示す図である。

【図１３】フザリウム属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼの温度安定性を示す図である。

【図１４】トリコスポロン属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼの温度安定性を示す図である。

【図１５】シュードモナス属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼのpH活性曲線を示す図である。

【図１６】フザリウム属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのpH活性曲線を示す図である。

【図１７】トリコスポロン属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼのpH活性曲線を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:72）

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルカリゲネス（Alcaligenes）属、シ
   ュードモナス（Pseudomonas）属、フザリウム（Fusariu
   m）属、キャンディダ（Candida）属、またはトリコスポ
   ロン（Trichosporon）属に属しジアセチルポリアミンア
   ミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、その
   培養物からジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを
   採取することを特徴とするジアセチルポリアミンアミド
   ヒドロラーゼの製造方法。