JP2633227B2 - 動物インターフエロン - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に組換DNA技術、広範な種類の動物イ
ンターフェロンを見出すためのこの種の技術を利用する
手段および方法、その産生並びにこの産生の各種の産物
およびその使用に係る。
ンターフェロンを見出すためのこの種の技術を利用する
手段および方法、その産生並びにこの産生の各種の産物
およびその使用に係る。
より詳細には、本発明は、動物インターフェロンをコ
ードするDNA配列の単離および同定、発現を行なうプロ
モーター配列に作動可能に（正しく読み取られるよう
に）結合されたこの種のDNA配列を含有する組換DNA発現
ビヒクルの構築並びにこのように構築された発現ビヒク
ルに係る。他の面において、本発明は、この種の発現ビ
ヒクルにより形質転換されしたがって上記DNA配列を発
現し得る宿主培養系、たとえば各種微生物および脊椎動
物細胞培養（セルカルチャー）に係る。
ードするDNA配列の単離および同定、発現を行なうプロ
モーター配列に作動可能に（正しく読み取られるよう
に）結合されたこの種のDNA配列を含有する組換DNA発現
ビヒクルの構築並びにこのように構築された発現ビヒク
ルに係る。他の面において、本発明は、この種の発現ビ
ヒクルにより形質転換されしたがって上記DNA配列を発
現し得る宿主培養系、たとえば各種微生物および脊椎動
物細胞培養（セルカルチャー）に係る。
さらに他の面において、本発明は、この種の発現の新
規な最終産物を、動物の予防もしくは治療処置に有用な
完全体、たとえば薬剤組成物に転換する手段および方法
に係る。さらに、本発明は、前記DNA配列、発現ビヒク
ル、宿主培養系並びに最終産物及びその完全体の製造に
有用な各種の方法に係り、さらにその特定具体例および
関連具体例に係る。
規な最終産物を、動物の予防もしくは治療処置に有用な
完全体、たとえば薬剤組成物に転換する手段および方法
に係る。さらに、本発明は、前記DNA配列、発現ビヒク
ル、宿主培養系並びに最終産物及びその完全体の製造に
有用な各種の方法に係り、さらにその特定具体例および
関連具体例に係る。
本発明は、一連のウシα−インターフェロンをコード
しており且つ発現ビヒクル中へのそのin vitro（試験管
内）結合を容易にする３´−および５´−フランキング
（flanking）配列を含むDNA配列、並びにそれから推定
されるアミノ酸配列の知見に一部基づくものである。さ
らに、これらの知見は、組換DNA技術によって、充分量
の動物インターフェロンを製造する手段および方法の開
発を可能にし、その結果、その生化学的性質および生物
活性の測定を可能にし、従って、その産業上／生物学上
の開発に対して有効な生産を可能ならしめる。
しており且つ発現ビヒクル中へのそのin vitro（試験管
内）結合を容易にする３´−および５´−フランキング
（flanking）配列を含むDNA配列、並びにそれから推定
されるアミノ酸配列の知見に一部基づくものである。さ
らに、これらの知見は、組換DNA技術によって、充分量
の動物インターフェロンを製造する手段および方法の開
発を可能にし、その結果、その生化学的性質および生物
活性の測定を可能にし、従って、その産業上／生物学上
の開発に対して有効な生産を可能ならしめる。
本発明の背景を説明し、特別な場合には、その実施に
関し詳細を補足するために、刊行物およびその他の資料
をここに参考のため引用するが、これらは便宜上本明細
書中発明の詳細な説明の最後尾に掲げた番号を付して引
用する。
関し詳細を補足するために、刊行物およびその他の資料
をここに参考のため引用するが、これらは便宜上本明細
書中発明の詳細な説明の最後尾に掲げた番号を付して引
用する。
A.動物インターフェロン インターフェロン成分は、ヒトより下等な種々の系統
学的種の組織から単離されている（１、２、３）。これ
らインターフェロンを用いて行なわれた活性試験は、必
須の宿主動物（requisite host animal）において種々
の程度の抗ウイルス効果を示している（３、４、５、
６）。さらに、これらインターフェロンは必ずしも種特
異性でないことが示されている。たとえば、組織から単
離されたウシインターフェロンンの調製物は、サルおよ
びヒトの細胞に対し抗ウイルス活性を示した（７）。同
様に、ヒトインターフェロンは、系統学的により下等な
種の様々な細胞において活性であることが判明している
（７）。
学的種の組織から単離されている（１、２、３）。これ
らインターフェロンを用いて行なわれた活性試験は、必
須の宿主動物（requisite host animal）において種々
の程度の抗ウイルス効果を示している（３、４、５、
６）。さらに、これらインターフェロンは必ずしも種特
異性でないことが示されている。たとえば、組織から単
離されたウシインターフェロンンの調製物は、サルおよ
びヒトの細胞に対し抗ウイルス活性を示した（７）。同
様に、ヒトインターフェロンは、系統学的により下等な
種の様々な細胞において活性であることが判明している
（７）。
この種間相互活性は、インターフェロン間におけるア
ミノ酸組成と配列との両者における高度の相同性保存に
より疑いがない。しかしながら、今日まで、この説明は
理論上の説明に留まっている。何故なら、これまで入手
し得た動物インターフェロンの量および純度は不充分で
あったため、精製された成分の特性化および生物学的性
質を幾種かのヒトの対応する部分に関して比較する明確
な実験を行なうことができなかったからである（８、
９、10、11、12）。
ミノ酸組成と配列との両者における高度の相同性保存に
より疑いがない。しかしながら、今日まで、この説明は
理論上の説明に留まっている。何故なら、これまで入手
し得た動物インターフェロンの量および純度は不充分で
あったため、精製された成分の特性化および生物学的性
質を幾種かのヒトの対応する部分に関して比較する明確
な実験を行なうことができなかったからである（８、
９、10、11、12）。
いずれにせよ、これらの少ない量および低純度にも拘
らず、必須の動物宿主におけるインターフェロンと抗ウ
イルス活性との間の因果関係が確立されている。たとえ
ば、高収率および高純度で動物インターフェロンを生産
することは、動物バイオアッセイ実験を開始しかつ成功
裡に行なって、ウイルス感染症ならびに悪性腫瘍状態お
よび免疫抑制状態もしくは免疫欠如状態に対する動物の
治療における産業上の利用性をもたらすために、極めて
望ましいものである。さらに、単離される動物インター
フェロン類の生産は、物理的にも生物活性的にもその特
性化を可能にし、したがって対応するヒトインターフェ
ロン類に関し分類およびそれによる比較研究の基礎を与
える（８〜20）。
らず、必須の動物宿主におけるインターフェロンと抗ウ
イルス活性との間の因果関係が確立されている。たとえ
ば、高収率および高純度で動物インターフェロンを生産
することは、動物バイオアッセイ実験を開始しかつ成功
裡に行なって、ウイルス感染症ならびに悪性腫瘍状態お
よび免疫抑制状態もしくは免疫欠如状態に対する動物の
治療における産業上の利用性をもたらすために、極めて
望ましいものである。さらに、単離される動物インター
フェロン類の生産は、物理的にも生物活性的にもその特
性化を可能にし、したがって対応するヒトインターフェ
ロン類に関し分類およびそれによる比較研究の基礎を与
える（８〜20）。
動物インターフェロンを用いて本発明に至るまで行な
われた研究は、その入手が極めて困難なため粗調製物を
使用せざるを得なかったが、極めて重要な生物学的機能
を示唆している。この種の動物インターフェロンは関連
した治療上有力な抗体ウイルス活性を示すだけでなく、
ワクチンおよび／または抗生物質による治療とともに付
加的予防薬としても有効であり、極めて有望な臨床上か
つ商業上の候補物質として挙げられることは明らかであ
る。
われた研究は、その入手が極めて困難なため粗調製物を
使用せざるを得なかったが、極めて重要な生物学的機能
を示唆している。この種の動物インターフェロンは関連
した治療上有力な抗体ウイルス活性を示すだけでなく、
ワクチンおよび／または抗生物質による治療とともに付
加的予防薬としても有効であり、極めて有望な臨床上か
つ商業上の候補物質として挙げられることは明らかであ
る。
組換DNA技術の使用は、臨床的かつ産業的開発を達成
するのに必要な必須量の動物インターフェロンを提供す
る最も有効な方法であると思われた。このようにして生
産される物質が天然に生ずる物質に特徴的と思われるグ
リコシレーションを含むかどうかに関係なく、これらは
恐らく動物における広範囲のウイルス性、新生（腫瘍）
のおよび免疫抑制状態もしくは病気の治療において臨床
的にその使用を可能にする生物活性を示すであろう。
するのに必要な必須量の動物インターフェロンを提供す
る最も有効な方法であると思われた。このようにして生
産される物質が天然に生ずる物質に特徴的と思われるグ
リコシレーションを含むかどうかに関係なく、これらは
恐らく動物における広範囲のウイルス性、新生（腫瘍）
のおよび免疫抑制状態もしくは病気の治療において臨床
的にその使用を可能にする生物活性を示すであろう。
B.組換DNA技術 組換DNA技術は、或る種の高度な知識の時代に達して
いる。分子生物学者は、各種のDNA配列をかなり容易に
組換えることにより、著量の外因性（外来）蛋白質産物
を形質転換微生物中で産生しうる新規なDNA完全体を創
生することができる。一般的手段および方法は、DNAの
種々の平滑末端又は「付着」末端を有する断片のin vit
ro結合を行なって、特定生物を形質転換させるのに有用
な強力な発現ビヒクルを製造し、かくして所望の外因性
産物の効率的合成に使用することを可能にする。しかし
ながら、個々の産物に関してはその製造経路は若干面倒
であって、かかる分野の科学は常に一定の成功の予想が
なされるような段階までは進歩していない。事実、基礎
的実験に基づかずに成功を予告する者がいても、その予
告には実施不能であるという著しい危険が伴なう。
いる。分子生物学者は、各種のDNA配列をかなり容易に
組換えることにより、著量の外因性（外来）蛋白質産物
を形質転換微生物中で産生しうる新規なDNA完全体を創
生することができる。一般的手段および方法は、DNAの
種々の平滑末端又は「付着」末端を有する断片のin vit
ro結合を行なって、特定生物を形質転換させるのに有用
な強力な発現ビヒクルを製造し、かくして所望の外因性
産物の効率的合成に使用することを可能にする。しかし
ながら、個々の産物に関してはその製造経路は若干面倒
であって、かかる分野の科学は常に一定の成功の予想が
なされるような段階までは進歩していない。事実、基礎
的実験に基づかずに成功を予告する者がいても、その予
告には実施不能であるという著しい危険が伴なう。
しばしば１細胞当り複数のコピーとして細菌およびそ
の他微生物に見られるプラスミド、すなわち二重鎖DNA
の非染色体ループは、組換DNA技術の基本的要素であ
る。プラスミドDNAにコードされている情報には、娘細
胞においてプラスミドを再生するのに必要な情報（すな
わち複製のオリジン）および通常１種もしくはそれ以上
の表現型選択特性、たとえば細菌の場合、抗生物質に対
する耐性が包含され、これらは目的とするプラスミドを
含有する宿主細胞のクローンを識別しかつ優先的にこれ
を選択培地中で増殖させることを可能にする。プラスミ
ドの有用性は、それぞれプラスミドDNA上の異なる部位
を識別する１種もしくはその他の制限エンドヌクレアー
ゼすなわち「制限酵素」によって特異的に開裂しうると
いう事実にある。その後、異種遺伝子もしくは遺伝子断
片を、開裂部位またはこの開裂部位に隣接する再編成末
端において末端結合することにより、プラスミド中に挿
入することができる。このようにして、いわゆる複製可
能な発現ビヒクルが形成される。DNA組織は細胞の外部
で行なわれるが、生成する「組換体」である複製可能な
発現ビヒクルすなわちプラスミドは形質転換として知ら
れる方法により細胞中へ導入することができ、多量の組
換ビヒクルが形質転換体の増殖によって得られる。さら
に、コード化DNAメッセージの転写および翻訳を支配す
るプラスミドの部分に関し遺伝子を適切に挿入すれば、
得られる発現ビヒクルを使用して挿入遺伝子がコードす
るポリペプチド配列を実際に産生することができ、この
過程は発現と呼ばれる。
の他微生物に見られるプラスミド、すなわち二重鎖DNA
の非染色体ループは、組換DNA技術の基本的要素であ
る。プラスミドDNAにコードされている情報には、娘細
胞においてプラスミドを再生するのに必要な情報（すな
わち複製のオリジン）および通常１種もしくはそれ以上
の表現型選択特性、たとえば細菌の場合、抗生物質に対
する耐性が包含され、これらは目的とするプラスミドを
含有する宿主細胞のクローンを識別しかつ優先的にこれ
を選択培地中で増殖させることを可能にする。プラスミ
ドの有用性は、それぞれプラスミドDNA上の異なる部位
を識別する１種もしくはその他の制限エンドヌクレアー
ゼすなわち「制限酵素」によって特異的に開裂しうると
いう事実にある。その後、異種遺伝子もしくは遺伝子断
片を、開裂部位またはこの開裂部位に隣接する再編成末
端において末端結合することにより、プラスミド中に挿
入することができる。このようにして、いわゆる複製可
能な発現ビヒクルが形成される。DNA組織は細胞の外部
で行なわれるが、生成する「組換体」である複製可能な
発現ビヒクルすなわちプラスミドは形質転換として知ら
れる方法により細胞中へ導入することができ、多量の組
換ビヒクルが形質転換体の増殖によって得られる。さら
に、コード化DNAメッセージの転写および翻訳を支配す
るプラスミドの部分に関し遺伝子を適切に挿入すれば、
得られる発現ビヒクルを使用して挿入遺伝子がコードす
るポリペプチド配列を実際に産生することができ、この
過程は発現と呼ばれる。
発現は、RNAポリメラーゼにより識別されかつ結合さ
れるプロモーターとして知られた領域において開始され
る。発現の転写期において、DNAは巻戻されて、DNA配列
からメッセンジャRNAの合成を開始するための鋳型とし
てこれを露呈させる。次いで、メッセンジャRNAは、こ
のmRNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドに翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチドトリプ
レットすなわち「コドン」によってコードされ、このコ
ドンは集合して「構造遺伝子」を構成し、すなわち発現
ポリペプチド産物のアミノ酸配列をコードするような部
分を構成する。翻訳は「開始」信号において開始される
（通常ATGであって、これは生ずるメッセンジャRNAにお
いてAUGになる）。いわゆる停止コドンは翻訳の終末を
規定し、したがってその後のアミノ酸単位の生成の終末
を規定する。生ずる生産物は、必要に応じ微生物系にお
いて宿主細胞を溶菌し、かつ適当な精製法により他の蛋
白質からこの生産物を回収することにより得ることがで
きる。
れるプロモーターとして知られた領域において開始され
る。発現の転写期において、DNAは巻戻されて、DNA配列
からメッセンジャRNAの合成を開始するための鋳型とし
てこれを露呈させる。次いで、メッセンジャRNAは、こ
のmRNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドに翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチドトリプ
レットすなわち「コドン」によってコードされ、このコ
ドンは集合して「構造遺伝子」を構成し、すなわち発現
ポリペプチド産物のアミノ酸配列をコードするような部
分を構成する。翻訳は「開始」信号において開始される
（通常ATGであって、これは生ずるメッセンジャRNAにお
いてAUGになる）。いわゆる停止コドンは翻訳の終末を
規定し、したがってその後のアミノ酸単位の生成の終末
を規定する。生ずる生産物は、必要に応じ微生物系にお
いて宿主細胞を溶菌し、かつ適当な精製法により他の蛋
白質からこの生産物を回収することにより得ることがで
きる。
実際上、組換DNA技術の使用は全く異種のポリペプチ
ドを発現することができ（いわゆる直接的発現）、或い
は同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部に融合された
異種ポリペプチドを発現することもできる。後者の場
合、目的とする生物活性生産物は、しばしば菌体外環境
において開裂されるまで、融合された同種／異種ポリペ
プチド内において生物不活性にされている（21、22）。
ドを発現することができ（いわゆる直接的発現）、或い
は同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部に融合された
異種ポリペプチドを発現することもできる。後者の場
合、目的とする生物活性生産物は、しばしば菌体外環境
において開裂されるまで、融合された同種／異種ポリペ
プチド内において生物不活性にされている（21、22）。
C.細胞培養技術 遺伝学および細胞生理学を研究するための細胞培養
（セルカルチャー）および組織培養の技術は充分に確立
されている。単離された正常細胞から連続トランスファ
処理により永久細胞系を得これを維持する手段および方
法も既に知られている。研究用途のため、この種の細胞
系を液体培地中で固体支持体上に維持し、或いは増殖に
より栄養支持体を含む懸濁液中で増殖させる。大規模製
造のための規模拡大は、機械的問題のみを課すと思われ
る（一般に23、24）。
（セルカルチャー）および組織培養の技術は充分に確立
されている。単離された正常細胞から連続トランスファ
処理により永久細胞系を得これを維持する手段および方
法も既に知られている。研究用途のため、この種の細胞
系を液体培地中で固体支持体上に維持し、或いは増殖に
より栄養支持体を含む懸濁液中で増殖させる。大規模製
造のための規模拡大は、機械的問題のみを課すと思われ
る（一般に23、24）。
発明の概要 本発明は、組換DNA技術を使用して、動部インターフ
ェロンを成功裡に生産し、しかもそのそれぞれを好まし
くは直接的な形態でかつ市場で認可されるために必要と
される臨床試験を開始しかつ実施するのに充分な量で生
産しうるという知見に基づいている。この生産物はその
全ての形態において、特にウイルス感染症ならびに悪性
腫瘍状態および免疫抑制された、もしくは免疫欠如の状
態に対し動物の予防的もしくは治療的処置に使用するの
に適している。その形態は種々可能なオリゴマー形態を
包含し、関連するグリコシレションならびに個々の要素
もしくは種単位のアレル変異（allelic variation）を
包含することができる。これら生産物は、微生物もしく
は細胞培養系を遺伝子工学的に処理することにより生産
される。すなわち、現在では従来可能であったよりも効
率的な方法で動部インターフェロンを製造しかつ単離す
る能力が存在する。本発明の最も好適な具体例におけ
る、本発明の１つの顕著な因子は、微生物もしくはセル
カルチャーを、この宿主細胞により成熟形態で産生され
る代表的な動部インターフェロン、すなわちウシインタ
ーフェロンを単離可能な量で産生するように遺伝子工学
的に処理することを達成するにある。
ェロンを成功裡に生産し、しかもそのそれぞれを好まし
くは直接的な形態でかつ市場で認可されるために必要と
される臨床試験を開始しかつ実施するのに充分な量で生
産しうるという知見に基づいている。この生産物はその
全ての形態において、特にウイルス感染症ならびに悪性
腫瘍状態および免疫抑制された、もしくは免疫欠如の状
態に対し動物の予防的もしくは治療的処置に使用するの
に適している。その形態は種々可能なオリゴマー形態を
包含し、関連するグリコシレションならびに個々の要素
もしくは種単位のアレル変異（allelic variation）を
包含することができる。これら生産物は、微生物もしく
は細胞培養系を遺伝子工学的に処理することにより生産
される。すなわち、現在では従来可能であったよりも効
率的な方法で動部インターフェロンを製造しかつ単離す
る能力が存在する。本発明の最も好適な具体例におけ
る、本発明の１つの顕著な因子は、微生物もしくはセル
カルチャーを、この宿主細胞により成熟形態で産生され
る代表的な動部インターフェロン、すなわちウシインタ
ーフェロンを単離可能な量で産生するように遺伝子工学
的に処理することを達成するにある。
本発明は、このように生産される動物インターフェロ
ンならびにその製造手段および方法を含む。さらに本発
明は動物インターフェロンをコードする遺伝子配列を発
現可能な形態で有する複製可能なDNA発現ビヒクルに向
けられる。さらに、本発明は上記の発現ビヒクルにより
形質転換された微生物菌株またはセルカルチャーに向け
られ、さらに動物インターフェロンを生産しうるこのよ
うに形質転換された菌株もしくはカルチャー（培養物）
からなる発酵培地に関するものである。
ンならびにその製造手段および方法を含む。さらに本発
明は動物インターフェロンをコードする遺伝子配列を発
現可能な形態で有する複製可能なDNA発現ビヒクルに向
けられる。さらに、本発明は上記の発現ビヒクルにより
形質転換された微生物菌株またはセルカルチャーに向け
られ、さらに動物インターフェロンを生産しうるこのよ
うに形質転換された菌株もしくはカルチャー（培養物）
からなる発酵培地に関するものである。
さらに、他の面において、本発明は前記インターフェ
ロン遺伝子配列、DAN発現ビヒクル、微生物菌株および
セルカルチャー（細胞培養物）を製造するのに有用な種
々の方法、ならびにその特定具体例に向けられる。さら
に、本発明は、前記微生物もしくは細胞培養物の発酵培
地の調製に向けられる。さらに、或る種の宿主系におい
て、この宿主細胞から成熟形態で分泌される所望の動物
インターフェロンを産生すべくベクターを案出すること
ができる。遺伝子本来の５´−フランキング領域から得
られるシグナル配列を含有するインターフェロンは、宿
主生物の細胞壁部に移動され、シグナル配列はこの移動
を促進する役割を果たし、この細胞壁では成熟インター
フェロン産物の分泌過程にてシグナル部分が開裂される
と信じられる。この具体例は、細胞内宿主蛋白質もしく
は細胞残骸の來雑物を除去するように設計された関連過
程に頼ることなく、目的とする成熟インターフェロンの
単離および精製を可能にする。
ロン遺伝子配列、DAN発現ビヒクル、微生物菌株および
セルカルチャー（細胞培養物）を製造するのに有用な種
々の方法、ならびにその特定具体例に向けられる。さら
に、本発明は、前記微生物もしくは細胞培養物の発酵培
地の調製に向けられる。さらに、或る種の宿主系におい
て、この宿主細胞から成熟形態で分泌される所望の動物
インターフェロンを産生すべくベクターを案出すること
ができる。遺伝子本来の５´−フランキング領域から得
られるシグナル配列を含有するインターフェロンは、宿
主生物の細胞壁部に移動され、シグナル配列はこの移動
を促進する役割を果たし、この細胞壁では成熟インター
フェロン産物の分泌過程にてシグナル部分が開裂される
と信じられる。この具体例は、細胞内宿主蛋白質もしく
は細胞残骸の來雑物を除去するように設計された関連過
程に頼ることなく、目的とする成熟インターフェロンの
単離および精製を可能にする。
さらに、本発明は、直接的発現により成熟形態で産生
される本発明に包含される動物インターフェロンの代表
的種類であるウシインターフェロンの製造に特に向けら
れる。
される本発明に包含される動物インターフェロンの代表
的種類であるウシインターフェロンの製造に特に向けら
れる。
本明細書において「成熟動物インターフェロン」とい
う表現は、動物インターフェロンmRANの翻訳に際して直
ちに行なわれる、シグナルペプチドもしくはプレ配列ペ
プチドを伴なわない動物インターフェロンの微生物的も
しくは細胞培養による生産を包含する。したがって、本
発明によれば、第１アミノ酸としてのメチオニン（構造
遺伝子の前方にATG開始信号コドンを挿入することによ
り提供される）を有する、或いはメチオニンが細胞内も
しくは細胞外で開裂される場合はその正常な第１アミノ
酸を有する成熟動物インターフェロンが提供される。さ
らに、本発明によれば、通常のシグナルポリペプチド以
外の共役蛋白質と共に成熟動物インターフェロンを産生
することもでき、ここで共役蛋白質は細胞内もしくは細
胞外環境において特異的に開裂可能である（21）。最後
に、成熟動物インターフェロンは、外因性の余分なポリ
ペプチドを開裂除去する必要なしに、直接的発現により
生産することができる。このことは、成熟インターフェ
ロンをそのシグナルペプチドと共に発現すべく発現ビク
トルを設定するような場合、或る種の宿主がシグナルペ
プチドを除去しないまたは効率的に除去しない場合、特
に重要である。このように産生された成熟インターフェ
ロンは、ウイルス感染症、悪性腫瘍状態および免疫抑制
もしくは免疫欠如状態の治療に使用するのに適するレベ
ルにまで回収かつ精製される。
う表現は、動物インターフェロンmRANの翻訳に際して直
ちに行なわれる、シグナルペプチドもしくはプレ配列ペ
プチドを伴なわない動物インターフェロンの微生物的も
しくは細胞培養による生産を包含する。したがって、本
発明によれば、第１アミノ酸としてのメチオニン（構造
遺伝子の前方にATG開始信号コドンを挿入することによ
り提供される）を有する、或いはメチオニンが細胞内も
しくは細胞外で開裂される場合はその正常な第１アミノ
酸を有する成熟動物インターフェロンが提供される。さ
らに、本発明によれば、通常のシグナルポリペプチド以
外の共役蛋白質と共に成熟動物インターフェロンを産生
することもでき、ここで共役蛋白質は細胞内もしくは細
胞外環境において特異的に開裂可能である（21）。最後
に、成熟動物インターフェロンは、外因性の余分なポリ
ペプチドを開裂除去する必要なしに、直接的発現により
生産することができる。このことは、成熟インターフェ
ロンをそのシグナルペプチドと共に発現すべく発現ビク
トルを設定するような場合、或る種の宿主がシグナルペ
プチドを除去しないまたは効率的に除去しない場合、特
に重要である。このように産生された成熟インターフェ
ロンは、ウイルス感染症、悪性腫瘍状態および免疫抑制
もしくは免疫欠如状態の治療に使用するのに適するレベ
ルにまで回収かつ精製される。
動物インターフェロンは、動物生体に対し内生的なも
のであり、ヒトインターフェロンに類似した命令法にお
いて動物α（白血球）、β（繊維芽球）およびγ（免
疫）−インターフェロンを包含する。これら３種の系統
は全て動物モデルにおいて同定されている。さらに、ウ
シの例に基づけば、動物α系統はヒトの場合と同様に一
群の蛋白質から構成され、検討された動物α系列は対応
するヒトα−インターフェロンに対する相同性（homolo
gy）の程度が、これらの動物インターフェロン自体間も
しくはヒトα−インターフェロン自体間のいずれよりも
低いものである。さらに、ウシのβ系列はヒトの場合と
は異なる一群の蛋白質から構成される。さらに、本発明
は種間および族内（intrafamily）ハイブリッドインタ
ーフェロンをも提供し、その際各種動物インターフェロ
ンの遺伝子内の共通制限部位を利用しかつ公知方法で対
応部分を再結合（組換）させる（57参照）。
のであり、ヒトインターフェロンに類似した命令法にお
いて動物α（白血球）、β（繊維芽球）およびγ（免
疫）−インターフェロンを包含する。これら３種の系統
は全て動物モデルにおいて同定されている。さらに、ウ
シの例に基づけば、動物α系統はヒトの場合と同様に一
群の蛋白質から構成され、検討された動物α系列は対応
するヒトα−インターフェロンに対する相同性（homolo
gy）の程度が、これらの動物インターフェロン自体間も
しくはヒトα−インターフェロン自体間のいずれよりも
低いものである。さらに、ウシのβ系列はヒトの場合と
は異なる一群の蛋白質から構成される。さらに、本発明
は種間および族内（intrafamily）ハイブリッドインタ
ーフェロンをも提供し、その際各種動物インターフェロ
ンの遺伝子内の共通制限部位を利用しかつ公知方法で対
応部分を再結合（組換）させる（57参照）。
いずれにせよ、本発明に包含される動物インターフェ
ロンは鳥類、牛、犬、馬、猫、山羊、羊、魚類および豚
科の動物に対し通常内生的（内因性）なものを包含す
る。特に、本発明はたとえば牛、羊、および山羊のよう
な偶蹄類動物のインターフェロンを提供する。本発明に
より提供されるインターフェロンは、夫々の宿主動物に
おける抗ウイルスおよび抗腫瘍剤としての用途がある。
たとえば、ウシインターフェロンはウシにおける呼吸器
併発症を処置する際、治療剤成分としての（それ自体公
知の）抗生物質と組合せて、或いは予防薬成分としての
ワクチンと組合せて実際に使用されるであろう。上記に
例示した種類の用途は他の牛ならびに羊、山羊、豚、
馬、犬、猫、鳥および魚類に拡張することができる。
馬、犬、猫および鳥の場合、対応するインターフェロン
の抗腫瘍効果は産業上特に重要であると予想される。
ロンは鳥類、牛、犬、馬、猫、山羊、羊、魚類および豚
科の動物に対し通常内生的（内因性）なものを包含す
る。特に、本発明はたとえば牛、羊、および山羊のよう
な偶蹄類動物のインターフェロンを提供する。本発明に
より提供されるインターフェロンは、夫々の宿主動物に
おける抗ウイルスおよび抗腫瘍剤としての用途がある。
たとえば、ウシインターフェロンはウシにおける呼吸器
併発症を処置する際、治療剤成分としての（それ自体公
知の）抗生物質と組合せて、或いは予防薬成分としての
ワクチンと組合せて実際に使用されるであろう。上記に
例示した種類の用途は他の牛ならびに羊、山羊、豚、
馬、犬、猫、鳥および魚類に拡張することができる。
馬、犬、猫および鳥の場合、対応するインターフェロン
の抗腫瘍効果は産業上特に重要であると予想される。
この種類の代表としてのウシインターフェロンに関し
記載された下記の原理を、本発明により動物インターフ
ェロンを得るために使用することができる： 1.ウシの組織、たとえばウシ膵臓組織を凍結粉末にし、
これを処理してRNAおよび蛋白質物を消化し、そして沈
澱させることにより高分子量のウシDNAを得た。
記載された下記の原理を、本発明により動物インターフ
ェロンを得るために使用することができる： 1.ウシの組織、たとえばウシ膵臓組織を凍結粉末にし、
これを処理してRNAおよび蛋白質物を消化し、そして沈
澱させることにより高分子量のウシDNAを得た。
2.この高分子量DNAを部分消化し、遺伝子部位に関しラ
ンダムに切断した。
ンダムに切断した。
3.得られたDNA断片をサイズ分画し、15〜20キロ塩基対
の断片を得た。
の断片を得た。
4.工程３で得られた断片を、λシャロン（Charon）30フ
ァージベクターを使用してクローン化させた。
ァージベクターを使用してクローン化させた。
5.このように調製されたベクターを、rDNAを含有する感
染性フアージ粒子にin vitroパッケージングして、フア
ージライブラリーを得た。これを、約106倍するまで細
菌細胞上で増殖させた。このフアージを細菌の芝上に実
質上全面成長するまで（virtual confluence）プレート
し、そして放射活性のヒトインターフェロンプローブと
のハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
染性フアージ粒子にin vitroパッケージングして、フア
ージライブラリーを得た。これを、約106倍するまで細
菌細胞上で増殖させた。このフアージを細菌の芝上に実
質上全面成長するまで（virtual confluence）プレート
し、そして放射活性のヒトインターフェロンプローブと
のハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
6.適当なクローンから対応するDNAを単離し、制限マッ
プを作成しそしてサザーンハイブリダイゼーションによ
って分析した。ウシインターフェロン遺伝子を含有する
制限断片をプラスミドビヒクル中にサブクローン化し、
次いで配列決定した。
プを作成しそしてサザーンハイブリダイゼーションによ
って分析した。ウシインターフェロン遺伝子を含有する
制限断片をプラスミドビヒクル中にサブクローン化し、
次いで配列決定した。
7.次に、配列決定したDNAを適当な発現ビヒクル中へ挿
入するようにin vitroで処理し、このビヒクルを使用し
て適当な宿主細胞を形質転換させ、次いでこの宿主細胞
を倍地中で増殖させ所望のウシインターフェロン産物を
発現させた。
入するようにin vitroで処理し、このビヒクルを使用し
て適当な宿主細胞を形質転換させ、次いでこの宿主細胞
を倍地中で増殖させ所望のウシインターフェロン産物を
発現させた。
8.かく生産されたウシインターフェロンはシステインで
始まる166個のアミノ酸をその成熟形態で有すると共
に、プレシーケンス中に23個のアミノ酸を有し、性質と
しては極めて疎水性である。そのモノマー分子量は約2
1,409と計算された。これはヒト白血球インターフェロ
ンと同様な特性を示し（８、９、10、11）、かつヒト白
血球インターフェロンに対し約60％の相同部分を有する
ことが判明した。
始まる166個のアミノ酸をその成熟形態で有すると共
に、プレシーケンス中に23個のアミノ酸を有し、性質と
しては極めて疎水性である。そのモノマー分子量は約2
1,409と計算された。これはヒト白血球インターフェロ
ンと同様な特性を示し（８、９、10、11）、かつヒト白
血球インターフェロンに対し約60％の相同部分を有する
ことが判明した。
A.微生物／セルカルチャー 1.細菌菌株／プロモータ 本明細書中に記載した実験は、特に微生物E.coli K−
12菌株294（末端（end）A,thi-,hsr-,khsm+）（25）を
用いて行なった。この菌株はアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託して、ATCC受託番号第3144
6号を受けている。しかしながら、その他種々の微生物
菌株を使用することもでき、公知のE.coli菌株、たとえ
ばE.coli B,E.coli X1776（ATCC No.31537）およびE.co
li W3110（F-,λ-,原始栄養株protrophic）（ATCC No.2
7325）、E.coli DP50 SuPF（ATCC No.39061,1982年３月
５日付で寄託）、E.coli JM83（ATCC No.39062,1982年
３月５日付で寄託）を包含し、或いはその他多くの微生
物菌株を包含し、それらの多くは寄託されて承認されか
つ微生物寄託機関、たとえばアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ATCC）から入手しうる（可能性
がある）（ATCCカタログリスト参照,26,26a参照）。こ
れらその他の微生物は、たとえば枯草菌（Bacillus sub
tilis）の如きBacilliおよびその他の腸内菌を包含し、
それらのうち、たとえばサルモネラ・チフイムリウム
（Salmonella typhimurium）およびセラチマ・マルセサ
ンス（Serratia marcesans）を挙げることができ、この
場合、これらの菌体内で異種遺伝子配列を複製しかつ発
現しうるプラスミドを利用する。
12菌株294（末端（end）A,thi-,hsr-,khsm+）（25）を
用いて行なった。この菌株はアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託して、ATCC受託番号第3144
6号を受けている。しかしながら、その他種々の微生物
菌株を使用することもでき、公知のE.coli菌株、たとえ
ばE.coli B,E.coli X1776（ATCC No.31537）およびE.co
li W3110（F-,λ-,原始栄養株protrophic）（ATCC No.2
7325）、E.coli DP50 SuPF（ATCC No.39061,1982年３月
５日付で寄託）、E.coli JM83（ATCC No.39062,1982年
３月５日付で寄託）を包含し、或いはその他多くの微生
物菌株を包含し、それらの多くは寄託されて承認されか
つ微生物寄託機関、たとえばアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ATCC）から入手しうる（可能性
がある）（ATCCカタログリスト参照,26,26a参照）。こ
れらその他の微生物は、たとえば枯草菌（Bacillus sub
tilis）の如きBacilliおよびその他の腸内菌を包含し、
それらのうち、たとえばサルモネラ・チフイムリウム
（Salmonella typhimurium）およびセラチマ・マルセサ
ンス（Serratia marcesans）を挙げることができ、この
場合、これらの菌体内で異種遺伝子配列を複製しかつ発
現しうるプラスミドを利用する。
例として、異種ポリペプチドの微生物産生を開始さ
せ、かつ持続させりには、β−ラクタマーゼおよび乳糖
プロモータ系が有利に使用されている。これらプロモー
タ系の構成および構造に関する詳細は参考文献（27）お
よび（28）により得ることができる。最近、トリプトフ
アンオペロンに基づく系、いわゆるtrpプロモータ系が
開発された。この系の構成および構造に関する詳細はゲ
デル等（12）およびクライド等（29）により公表されて
いる。その他多くの微生物プロモータが発見されかつ利
用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細
は当業者がこれらを機能的にプラスミドベクター中に結
合させることを可能とし、これらについては既に発表さ
れている（30参照）。
せ、かつ持続させりには、β−ラクタマーゼおよび乳糖
プロモータ系が有利に使用されている。これらプロモー
タ系の構成および構造に関する詳細は参考文献（27）お
よび（28）により得ることができる。最近、トリプトフ
アンオペロンに基づく系、いわゆるtrpプロモータ系が
開発された。この系の構成および構造に関する詳細はゲ
デル等（12）およびクライド等（29）により公表されて
いる。その他多くの微生物プロモータが発見されかつ利
用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細
は当業者がこれらを機能的にプラスミドベクター中に結
合させることを可能とし、これらについては既に発表さ
れている（30参照）。
2.酵母菌株／酵母プロモータ 本発明の発現系は、さらにプラスミドYRp7（31,32,3
3）を使用することもでき、これはE.coliおよび酵母サ
ッカロミセス・セレビシイアエ（Saccharomyces cerevi
siae）の両者において選択かつ複製することができる。
酵母において選択するには、プラスミドはTRP1遺伝子
（31,32,33）を含有し、これは酵母の染色体IVに見られ
るこの遺伝子に突然変異を含む酵母（34）を補完する
（トリプトフアンの不存在下において成長を可能にす
る）。１種の有用な菌株は、制限なしにアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託された菌株RH21
8（35）である（ATCC No.44076）。しかしながら、細胞
をtrp1にする突然変異を含む任意のSaccharomyces cere
visiae菌株が、発現系を含むプラスミドの発現に対し有
効な環境であることが了解されるであろう。使用しうる
他の菌株の例は、pep4−１である（36）。このトリプト
フアン栄養要求菌株も、TRP1遺伝子に点突然変異を有す
る。
3）を使用することもでき、これはE.coliおよび酵母サ
ッカロミセス・セレビシイアエ（Saccharomyces cerevi
siae）の両者において選択かつ複製することができる。
酵母において選択するには、プラスミドはTRP1遺伝子
（31,32,33）を含有し、これは酵母の染色体IVに見られ
るこの遺伝子に突然変異を含む酵母（34）を補完する
（トリプトフアンの不存在下において成長を可能にす
る）。１種の有用な菌株は、制限なしにアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託された菌株RH21
8（35）である（ATCC No.44076）。しかしながら、細胞
をtrp1にする突然変異を含む任意のSaccharomyces cere
visiae菌株が、発現系を含むプラスミドの発現に対し有
効な環境であることが了解されるであろう。使用しうる
他の菌株の例は、pep4−１である（36）。このトリプト
フアン栄養要求菌株も、TRP1遺伝子に点突然変異を有す
る。
非酵母菌遺伝子の５´−側に配置すると、酵母菌遺伝
子（アルコール・デヒドロゲナーゼ１に対する）からの
５´−フランキングDNA配列（プロモータ）は、酵母を
形質転換させるべく使用したプラスミドに入れた場合、
酵母内で外因性遺伝子の発現を促進（プロモート）する
ことができる。プロモータの他、酵母における非酵母遺
伝子の適切な発現は、酵母における適切な転写終了とポ
リアデニル化とを可能にするよう、プラスミド上の非酵
母遺伝子の３´−末端に配置した第２の酵母配列を必要
とする。このプロモータも他のものと同様に本発明にお
いて適当に使用することができる（下記参照）。好適具
体例において、酵母３−ホスホグリセレートキナーゼ遺
伝子（37）の５´−フランキング配列は構造遺伝子の上
流に位置し、次いで終了−ポリアデニル化信号を有する
DNA、たとえばTRP1（31,32,33）遺伝子またはPGK（37）
遺伝子が存在する。
子（アルコール・デヒドロゲナーゼ１に対する）からの
５´−フランキングDNA配列（プロモータ）は、酵母を
形質転換させるべく使用したプラスミドに入れた場合、
酵母内で外因性遺伝子の発現を促進（プロモート）する
ことができる。プロモータの他、酵母における非酵母遺
伝子の適切な発現は、酵母における適切な転写終了とポ
リアデニル化とを可能にするよう、プラスミド上の非酵
母遺伝子の３´−末端に配置した第２の酵母配列を必要
とする。このプロモータも他のものと同様に本発明にお
いて適当に使用することができる（下記参照）。好適具
体例において、酵母３−ホスホグリセレートキナーゼ遺
伝子（37）の５´−フランキング配列は構造遺伝子の上
流に位置し、次いで終了−ポリアデニル化信号を有する
DNA、たとえばTRP1（31,32,33）遺伝子またはPGK（37）
遺伝子が存在する。
酵母５´−フランキング配列（３´−酵母終了DNAと
共に、下記参照）は酵母における外来遺伝子の発現を促
進するよう機能しうるので、高度に発現された任意の酵
母遺伝子の５´−フランキング配列は重要な遺伝子生産
物を発現するのに使用することができると思われる。或
る環境下において酵母はその可溶性蛋白質の65％までを
糖分解酵素として発現したので（38）、かつこの高レベ
ルは個々のmRNAの高レベルの生産から生ずると思われる
ので（39）、任意のその他の糖分解遺伝子の５´−フラ
ンキング配列をこの種の発現目的に使用することがで
き、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホ
スフエートデヒドロゲネーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ
ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホスホ
グリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー
スホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。これら遺伝
子の３´−フランキング配列のいずれをも、この種の発
現系において適切な終了およびmRNAポリアデニル化のた
めに使用することができる（上記参照）。或る種の他の
高度に発現された遺伝子は、酸性ホスフアターゼに対す
るもの（40）および５´−フランキング領域における突
然変異により、通常TY1転移可能要素（transposable el
ement）の存在により高レベルの生産を発現するもの
（発現を増大する突然変異体）（41）である。
共に、下記参照）は酵母における外来遺伝子の発現を促
進するよう機能しうるので、高度に発現された任意の酵
母遺伝子の５´−フランキング配列は重要な遺伝子生産
物を発現するのに使用することができると思われる。或
る環境下において酵母はその可溶性蛋白質の65％までを
糖分解酵素として発現したので（38）、かつこの高レベ
ルは個々のmRNAの高レベルの生産から生ずると思われる
ので（39）、任意のその他の糖分解遺伝子の５´−フラ
ンキング配列をこの種の発現目的に使用することがで
き、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホ
スフエートデヒドロゲネーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ
ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホスホ
グリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー
スホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。これら遺伝
子の３´−フランキング配列のいずれをも、この種の発
現系において適切な終了およびmRNAポリアデニル化のた
めに使用することができる（上記参照）。或る種の他の
高度に発現された遺伝子は、酸性ホスフアターゼに対す
るもの（40）および５´−フランキング領域における突
然変異により、通常TY1転移可能要素（transposable el
ement）の存在により高レベルの生産を発現するもの
（発現を増大する突然変異体）（41）である。
上記遺伝子の全ては、酵母RNAポリメラーゼIIによっ
て転写されると思われる（41）。リボゾームRNA、5SRNA
およびtRNAに対する遺伝子を転写するRNAポリメラーゼ
ＩおよびIII用のプロモータ（41,42）はこの発現構成に
おいて有用である。
て転写されると思われる（41）。リボゾームRNA、5SRNA
およびtRNAに対する遺伝子を転写するRNAポリメラーゼ
ＩおよびIII用のプロモータ（41,42）はこの発現構成に
おいて有用である。
最後に、多くの酵母プロモータはさらに転写制御作用
を有するので、増殖条件における変化によりこれらを切
換ることができる。この種の酵母プロモータの幾つかの
例は、次の蛋白質を生産する遺伝子である：アルコール
デヒドロゲナーゼII、イソチトクローム−ｃ、酸性ホス
フアターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼならびに
マルトースおよびガラクトース利用に関係する酵素（3
9）。この種の制御領域は、特にそれらの生産が酵母に
対し毒性である場合、蛋白質生産物の発現を調節するの
に極めて有用である。さらに、１種の５´−フランキン
グ配列の制御領域に、高度に発現された遺伝子由来のプ
ロモータを含有する５´−フランキング配列を入れるこ
ともできるであろう。これはハイブリッドプロモータを
もたらし、制御領域とプロモータとは物理的に異なるDN
A配列であると思われるため可能であろう。
を有するので、増殖条件における変化によりこれらを切
換ることができる。この種の酵母プロモータの幾つかの
例は、次の蛋白質を生産する遺伝子である：アルコール
デヒドロゲナーゼII、イソチトクローム−ｃ、酸性ホス
フアターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼならびに
マルトースおよびガラクトース利用に関係する酵素（3
9）。この種の制御領域は、特にそれらの生産が酵母に
対し毒性である場合、蛋白質生産物の発現を調節するの
に極めて有用である。さらに、１種の５´−フランキン
グ配列の制御領域に、高度に発現された遺伝子由来のプ
ロモータを含有する５´−フランキング配列を入れるこ
ともできるであろう。これはハイブリッドプロモータを
もたらし、制御領域とプロモータとは物理的に異なるDN
A配列であると思われるため可能であろう。
3.細胞培養系／細胞培養ベクター：培養（組織培養）に
おける脊椎動物細胞の増殖は近年日常の方法となった
（43参照）。サルの腎繊維芽細胞のCOS−７系を動物イ
ンターフェロンの生産用宿主として使用することができ
る（44）。しかしながら、ここに詳述する実験は、適合
性ベクターの複製および発現を可能にする任意の細胞
系、たとえばWI38、BHK、3T3、CHO、VEROおよびHela細
胞系において行なうこともできる。さらに、発現ベクタ
ーにつき必要とされるものは、複製のオリジンおよび発
現すべき遺伝子の前方に位置するプロモータならびに任
意の必要とされるリボゾーム結合部位、RNAスプライス
部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列である。
SV40のこれらの本質的要素を本発明で使用したが、本発
明は好適具体例としてここに記載するこれら配列のみに
限定されると理解すべきではない。たとえば、他のウイ
ルスベクターの複製のオリジン（たとえばポリオーマ
（polyoma）、アデノ（Adeno）、VSV、BPVなど）を使用
することができ、また非一体的状態で機能しうるDNA複
製の細胞性オリジンも使用することができる。
おける脊椎動物細胞の増殖は近年日常の方法となった
（43参照）。サルの腎繊維芽細胞のCOS−７系を動物イ
ンターフェロンの生産用宿主として使用することができ
る（44）。しかしながら、ここに詳述する実験は、適合
性ベクターの複製および発現を可能にする任意の細胞
系、たとえばWI38、BHK、3T3、CHO、VEROおよびHela細
胞系において行なうこともできる。さらに、発現ベクタ
ーにつき必要とされるものは、複製のオリジンおよび発
現すべき遺伝子の前方に位置するプロモータならびに任
意の必要とされるリボゾーム結合部位、RNAスプライス
部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列である。
SV40のこれらの本質的要素を本発明で使用したが、本発
明は好適具体例としてここに記載するこれら配列のみに
限定されると理解すべきではない。たとえば、他のウイ
ルスベクターの複製のオリジン（たとえばポリオーマ
（polyoma）、アデノ（Adeno）、VSV、BPVなど）を使用
することができ、また非一体的状態で機能しうるDNA複
製の細胞性オリジンも使用することができる。
B.ベクター系 1.E.coliにおける成熟ウシインターフェロンの直接的発
現 成熟インターフェロンポリペプチド（マイナスシグナ
ル配列）としてE.coliにおいてウシインターフェロンを
直接的に発現させるため使用する手順は、プロモータ断
片および翻訳開始信号を含有するプラスミドと、成熟イ
ンターフェロンのコード領域を含む動物ゲノムDNAの処
理断片との組合せを含む。
現 成熟インターフェロンポリペプチド（マイナスシグナ
ル配列）としてE.coliにおいてウシインターフェロンを
直接的に発現させるため使用する手順は、プロモータ断
片および翻訳開始信号を含有するプラスミドと、成熟イ
ンターフェロンのコード領域を含む動物ゲノムDNAの処
理断片との組合せを含む。
2.酵母における発現 たとえば動物インターフェロン用のDNAのような異種
遺伝子を酵母中で発現するには、４種の成分を含むプラ
スミドベクターを作成する必要がある。第１の成分は、
E.coliおよび酵母の両者の形質転換を可能にし、したが
ってどちらの生物からも選択しうる遺伝子、たとえばE.
coliからのアンピシリン耐性遺伝子および酵母からの遺
伝子TRP1を含有せねばならない部分である。この成分
は、さらに両生物においてプラスミドDNAとして維持す
べき両生物からの複製のオリジンを必要とし、たとえば
pBR32からのE.coliオリジンおよび酵母の染色体III由来
のars1オリジンを必要とする。
遺伝子を酵母中で発現するには、４種の成分を含むプラ
スミドベクターを作成する必要がある。第１の成分は、
E.coliおよび酵母の両者の形質転換を可能にし、したが
ってどちらの生物からも選択しうる遺伝子、たとえばE.
coliからのアンピシリン耐性遺伝子および酵母からの遺
伝子TRP1を含有せねばならない部分である。この成分
は、さらに両生物においてプラスミドDNAとして維持す
べき両生物からの複製のオリジンを必要とし、たとえば
pBR32からのE.coliオリジンおよび酵母の染色体III由来
のars1オリジンを必要とする。
プラスミドの第２の成分は、下流に位置する構造遺伝
子の転写を促進する高度に発現された酵母遺伝子からの
５´−フランキング配列であり、たとえば使用する５´
−フランキング配列は酵母３−ホスホグリセレートキナ
ーゼ（PGK）遺伝子からのものである。
子の転写を促進する高度に発現された酵母遺伝子からの
５´−フランキング配列であり、たとえば使用する５´
−フランキング配列は酵母３−ホスホグリセレートキナ
ーゼ（PGK）遺伝子からのものである。
この系の第３の成分は、ATG翻訳開始信号と翻訳停止
信号との両者を含有するように作成された構造遺伝子で
ある。この種の遺伝子の単離および構造は後述する。
信号との両者を含有するように作成された構造遺伝子で
ある。この種の遺伝子の単離および構造は後述する。
第４の成分は酵母遺伝子の３´−フランキング配列を
含有する酵母DNA配列であり、転写終了およびポリアデ
ニル化のための適切な信号を含んでいる。
含有する酵母DNA配列であり、転写終了およびポリアデ
ニル化のための適切な信号を含んでいる。
3.哺乳類セルカルチャーにおける発現 哺乳動物のセルカルチャーにおける免疫インターフェ
ロンの合成方法は、異種転写単位の制御下に外来遺伝子
の自律的複製と発現との両者を行ないうるベクターの開
発に依存する。組織培養におけるこのベクターの複製
は、DNA複製オリジン（SV40ウイルス由来）を提供しか
つＴ抗原を内生的に発現する細胞系中へのベクターの導
入によりヘルパー機能（Ｔ抗原）を与えることによって
達成される（46、47）。SV40ウイルスのレートプロモー
タ（late promoter）はインターフェロンの構造遺伝子
に先行して存在し遺伝子の転写を確保する。
ロンの合成方法は、異種転写単位の制御下に外来遺伝子
の自律的複製と発現との両者を行ないうるベクターの開
発に依存する。組織培養におけるこのベクターの複製
は、DNA複製オリジン（SV40ウイルス由来）を提供しか
つＴ抗原を内生的に発現する細胞系中へのベクターの導
入によりヘルパー機能（Ｔ抗原）を与えることによって
達成される（46、47）。SV40ウイルスのレートプロモー
タ（late promoter）はインターフェロンの構造遺伝子
に先行して存在し遺伝子の転写を確保する。
発現を得るための有用なベクターはpBR322配列よりな
り、これはイー・コリ（E.coli）における選択のための
選択性標識（アンピシリン耐性）ならびにDNA複製のイ
ー・コリオリゾンを与える。これらの配列はプラスミド
pML−１（46）から得られ、EcoR I制御部位とBamH I制
御部位とに及ぶ領域を包含する。SV40オリジンは、この
領域を含む342個の塩基対のPvu II−Hind III断片から
得られる（48、49）（両末端はEcoR I末端に転換され
る）。これらの配列は、DNA複製のウイルス性オリジン
を含むだけでなく、初期および後期転写単位の両者のた
めのプロモータを暗号化（コード）する。SV40オリジン
領域の方向性は、後期転写単位用のプロモータがインタ
ーフェロンを暗号化する遺伝子に対し近くに存在するよ
うなものである。
り、これはイー・コリ（E.coli）における選択のための
選択性標識（アンピシリン耐性）ならびにDNA複製のイ
ー・コリオリゾンを与える。これらの配列はプラスミド
pML−１（46）から得られ、EcoR I制御部位とBamH I制
御部位とに及ぶ領域を包含する。SV40オリジンは、この
領域を含む342個の塩基対のPvu II−Hind III断片から
得られる（48、49）（両末端はEcoR I末端に転換され
る）。これらの配列は、DNA複製のウイルス性オリジン
を含むだけでなく、初期および後期転写単位の両者のた
めのプロモータを暗号化（コード）する。SV40オリジン
領域の方向性は、後期転写単位用のプロモータがインタ
ーフェロンを暗号化する遺伝子に対し近くに存在するよ
うなものである。
以下記載する詳細な説明は、組換DNA技術を介し種々
の動物インターフェロンを製造するための本発明の例示
であり、特に牛白血球インターフェロンの製造につき一
般的に使用しうる方法を包含しかつ示している。この方
法を細菌系に関して説明する。
の動物インターフェロンを製造するための本発明の例示
であり、特に牛白血球インターフェロンの製造につき一
般的に使用しうる方法を包含しかつ示している。この方
法を細菌系に関して説明する。
A.牛DNAの単離 動物遺伝子保存物（ライブラリ）を作成する目的で、
高分子量DNAをBlinおよびStafford法（50）の変法によ
り動物組織から単離し、遺伝子部位に関してランダムに
断片化させ、かつサイズ分画してλフアージベクター中
へクローン化させるための15−20キロ塩基断片を得た
（51）。
高分子量DNAをBlinおよびStafford法（50）の変法によ
り動物組織から単離し、遺伝子部位に関してランダムに
断片化させ、かつサイズ分画してλフアージベクター中
へクローン化させるための15−20キロ塩基断片を得た
（51）。
凍結組織、たとえば牛の膵臓を液体窒素中で微粉末ま
で磨砕し、0.25MのEDTAと１％のザルコシル（Sarkosy
l）と0.1mg/mlのプロテイナーゼＫ（25ml/g組織）とに5
0℃にて３時間可溶化させた。得られた粘性溶液をフエ
ノールで３回およびクロロホルムで１回抽出して除蛋白
し、50mMのトリスーHCl（pH8）と10mMのEDTAと10mMのNa
Clとに対し透析し、そして熱処理されたパンクレアチン
リボヌクレアーゼ（0.1mg/ml）にて37℃で２時間消化さ
せた。フエノールとエーテルとで抽出した後、DNAを２
倍容量のエタノールで沈澱させ、95％エタノール中で洗
浄し、凍結乾燥させそしてTE緩衝液（10mMのトリスーHC
l（pH7.5）と1mMのEDTA）とに最終濃度１−2mg/mlにて
４℃で１晩再溶解させた。最終のDNA調製物は、0.5％中
性アガロースゲル電気泳動で測定すると、長さにおいて
100キロ塩基より大であった。
で磨砕し、0.25MのEDTAと１％のザルコシル（Sarkosy
l）と0.1mg/mlのプロテイナーゼＫ（25ml/g組織）とに5
0℃にて３時間可溶化させた。得られた粘性溶液をフエ
ノールで３回およびクロロホルムで１回抽出して除蛋白
し、50mMのトリスーHCl（pH8）と10mMのEDTAと10mMのNa
Clとに対し透析し、そして熱処理されたパンクレアチン
リボヌクレアーゼ（0.1mg/ml）にて37℃で２時間消化さ
せた。フエノールとエーテルとで抽出した後、DNAを２
倍容量のエタノールで沈澱させ、95％エタノール中で洗
浄し、凍結乾燥させそしてTE緩衝液（10mMのトリスーHC
l（pH7.5）と1mMのEDTA）とに最終濃度１−2mg/mlにて
４℃で１晩再溶解させた。最終のDNA調製物は、0.5％中
性アガロースゲル電気泳動で測定すると、長さにおいて
100キロ塩基より大であった。
B.牛DNAの部分エンドヌクレアーゼ消化およびサイズ分
画 牛DNAの１部（0.1mg）を1.25、2.5、５および10単位
のSau3Aにて、10mMのトリスーHCl（pH7.5）と10mMのMgC
l2と2mMのジチオスレイトールとを有する反応液（1ml）
中で37℃にて60分間消化した。EDTAを25mMまで添加して
インキュベーションを停止させ、フエノールおよびエー
テルで抽出し、酢酸ナトリウム0.3Mとなし（pH5.2）、
そして３倍容量のエタノールで沈澱させた。このDNAをT
E緩衝液中に68℃で再溶解させ、ベックマンSW27型ロー
タにて27,000rpmで10−40％の線状蔗糖勾配（51）を用
いて20℃にて22時間沈降させた。これらフラクション
（0.5ml）を、分子量標準としてEcoR I消化されたシャ
ロン4A（51a）DNAを用いて0.5％ゲル上にて分析した。1
5−20キロ塩基のDNA断片を含有するフラクションを混合
し、エタノールで沈澱させ、そしてTE緩衝液中に再溶解
させた。
画 牛DNAの１部（0.1mg）を1.25、2.5、５および10単位
のSau3Aにて、10mMのトリスーHCl（pH7.5）と10mMのMgC
l2と2mMのジチオスレイトールとを有する反応液（1ml）
中で37℃にて60分間消化した。EDTAを25mMまで添加して
インキュベーションを停止させ、フエノールおよびエー
テルで抽出し、酢酸ナトリウム0.3Mとなし（pH5.2）、
そして３倍容量のエタノールで沈澱させた。このDNAをT
E緩衝液中に68℃で再溶解させ、ベックマンSW27型ロー
タにて27,000rpmで10−40％の線状蔗糖勾配（51）を用
いて20℃にて22時間沈降させた。これらフラクション
（0.5ml）を、分子量標準としてEcoR I消化されたシャ
ロン4A（51a）DNAを用いて0.5％ゲル上にて分析した。1
5−20キロ塩基のDNA断片を含有するフラクションを混合
し、エタノールで沈澱させ、そしてTE緩衝液中に再溶解
させた。
C.牛ゲノムDNA保存物の作成 15〜20kbの牛DNA非限定消化物を、フアージの２個の
内部BamH I断片の除去により生じたＧ−Ａ−Ｔ−Ｃ付着
性末端を有するλシャロン30Aベクター（52）中へクロ
ーン化させた。シャロン30Aをイーコリ菌株DP50SupF（A
TCC No.39061、1982年３月５日寄託）においてNZYDTブ
ロス中で増殖させ、ポリエチレングリコール沈澱によっ
て濃縮し、そしてCsCl濃度勾配遠心分離によって精製し
た（53）。この精製されたフアージをフエノールで２
回、フエノールとエーテルとで１回抽出し、かつDNAを
エタノール沈澱により濃縮して、フアージDNAを調製し
た。
内部BamH I断片の除去により生じたＧ−Ａ−Ｔ−Ｃ付着
性末端を有するλシャロン30Aベクター（52）中へクロ
ーン化させた。シャロン30Aをイーコリ菌株DP50SupF（A
TCC No.39061、1982年３月５日寄託）においてNZYDTブ
ロス中で増殖させ、ポリエチレングリコール沈澱によっ
て濃縮し、そしてCsCl濃度勾配遠心分離によって精製し
た（53）。この精製されたフアージをフエノールで２
回、フエノールとエーテルとで１回抽出し、かつDNAを
エタノール沈澱により濃縮して、フアージDNAを調製し
た。
シャロン30Aの末端断片を調製するため、50μｇのフ
アージDNAを50mMのトリスーHCl（pH8）と10mMのMgCl2と
0.15MのNaClとの0.25ml中で42℃にて２時間アニール
し、BamH Iにて完全に消化させ、フエノールおよびエー
テルで抽出し、そして上記と同様に10−40％蔗糖勾配に
て沈降させた。フアージの32kbのアニールされたアーム
を有するフラクションを集め、エタノール沈降させた。
アージDNAを50mMのトリスーHCl（pH8）と10mMのMgCl2と
0.15MのNaClとの0.25ml中で42℃にて２時間アニール
し、BamH Iにて完全に消化させ、フエノールおよびエー
テルで抽出し、そして上記と同様に10−40％蔗糖勾配に
て沈降させた。フアージの32kbのアニールされたアーム
を有するフラクションを集め、エタノール沈降させた。
精製されたシャロン30Aアーム（６μｇ）を42℃にて
２時間再アニールし、0.3μｇの15−20kb牛DNAおよび40
0単位のフアージT4ポリヌクレオチドリガーゼと混合
し、そして50mMのトリス−HCl（pH7.5）と10mMのMgCl2
と20mMのジチオスレイトールと50μg/mlの牛血清アルブ
ミンとを含有する反応液0.075ml中で12℃にて１晩イン
キュベートとした。次いで、この結合したDNA混合物
を、試験管内λ包封系を用いて成熟λフアージ粒子中へ
包封した（54）。
２時間再アニールし、0.3μｇの15−20kb牛DNAおよび40
0単位のフアージT4ポリヌクレオチドリガーゼと混合
し、そして50mMのトリス−HCl（pH7.5）と10mMのMgCl2
と20mMのジチオスレイトールと50μg/mlの牛血清アルブ
ミンとを含有する反応液0.075ml中で12℃にて１晩イン
キュベートとした。次いで、この結合したDNA混合物
を、試験管内λ包封系を用いて成熟λフアージ粒子中へ
包封した（54）。
この系の成分、すなわち音波抽出物（SE）、凍結−解
凍溶菌物（FTL）、蛋白質Ａおよび緩衝液ＡおよびM1と
を文献に記載されたように調製した（54）。結合したDN
A混合物の３μｌを15μｌの緩衝液Ａ、２μｌの緩衝液M
1、10μｌのSEおよび１μｌの蛋白質Ａと共に27℃にて4
5分間インキュベートした。FTLを氷上で45分間解凍さ
せ、0.1容量の緩衝液M1と混合し、35,000rpmにて４℃で
25分間遠心分離し、そして0.075mlの上澄液を上記反応
液へ加えた。27℃にてさらに２時間インキュベーション
した後、少量の包封反応物を菌株DP50SupF（上記）上で
滴定した。この手順は、全部で約1.1×106の個々の牛DP
組換体を生成した。残部包封混合物をプレート−溶菌物
法（52）により増幅させ、その際組換体をDP50SupF上に
15cmのNZYDT寒天板１枚当り10,000プラーク形成単位の
密度で接種した。
凍溶菌物（FTL）、蛋白質Ａおよび緩衝液ＡおよびM1と
を文献に記載されたように調製した（54）。結合したDN
A混合物の３μｌを15μｌの緩衝液Ａ、２μｌの緩衝液M
1、10μｌのSEおよび１μｌの蛋白質Ａと共に27℃にて4
5分間インキュベートした。FTLを氷上で45分間解凍さ
せ、0.1容量の緩衝液M1と混合し、35,000rpmにて４℃で
25分間遠心分離し、そして0.075mlの上澄液を上記反応
液へ加えた。27℃にてさらに２時間インキュベーション
した後、少量の包封反応物を菌株DP50SupF（上記）上で
滴定した。この手順は、全部で約1.1×106の個々の牛DP
組換体を生成した。残部包封混合物をプレート−溶菌物
法（52）により増幅させ、その際組換体をDP50SupF上に
15cmのNZYDT寒天板１枚当り10,000プラーク形成単位の
密度で接種した。
D.牛インターフェロン遺伝子に対するフアージライブラ
リのスクリーニング 牛インターフェロン遺伝子を有するフアージ組換体を
同定するために使用した方法は、クローン化されたヒト
白血球（８、９）、繊維芽細胞（12）および免疫（55）
インターフェロン遺伝子から調製された放射能活性プロ
ーブによりヌクレオチド相同性を検出することからなっ
ている。ハイブリダイゼーション条件は、ゲノム動物DN
Aのサウザンブロット（56）によって確立させた。ヒト
胎盤、牛膵臓および豚の顎下線からの高分子量DNA（上
記と同様に調製）のそれぞれ５μｇをEcoR Iで完全に消
化させ、0.5％アガロースゲル上で電気泳動させ、そし
てニトロセルロース紙へ移した（56）。P32−標識したD
NAプローブを、Bgl II制限部位（57）に成熟ヒト白血球
インターフェロンA/Dハイブリッドの蛋白質暗号化領域
を有する570塩基対のEcoR I断片から標準法（58）によ
って調製した。各ニトロセルロース濾紙を、５×SSC（5
6）と50mMの燐酸ナトリウム（pH6.5）と0.1mg/mlの超音
波処理した鮭***DNAと５×デンハルト溶液（Denhardt
´s solution）（59）と0.1％のドデシル硫酸ナトリウ
ムと10％、20％もしくは30％のいずれかのホルムアミド
を含有する0.1％のピロ燐酸ナトリウムとにおいて42℃
で１晩予備ハイブリダイズさせ、次いで10％のデキスト
ラン硫酸ナトリウムを含有する同じ溶液中で１分間当り
100×106カウントの標識プローブでハイブリダイズさせ
た（60）。42℃にて１晩インキュベーションした後、濾
紙を２×SSCと0.1％のSDSとにおいて室温で４回洗浄
し、２×SSCにて１回洗浄し、次いでデュポン・クロネ
ックス（Dupont Cronex）強化スクリーンを有するコダ
ックXR−5X線フイルムに１晩露出させた。第１図に見ら
れるように、多数のハイブリダイズ帯は、20％のホルム
アミドをハイブリダイゼーションの際に存在させた場
合、牛および豚のDNA消化物において最も容易に検出さ
れた。この結果は、ヒトにおいて上記に例示したものと
類似した牛および豚における白血球インターフェロン遺
伝子のマルチジエン（multigene）類に対する証明を与
える（12、61）。したがって、同じハイブリダイゼーシ
ョン条件を使用して、牛DNAライブラリにおいてインタ
ーフェロン遺伝子をスクリーニングした。
リのスクリーニング 牛インターフェロン遺伝子を有するフアージ組換体を
同定するために使用した方法は、クローン化されたヒト
白血球（８、９）、繊維芽細胞（12）および免疫（55）
インターフェロン遺伝子から調製された放射能活性プロ
ーブによりヌクレオチド相同性を検出することからなっ
ている。ハイブリダイゼーション条件は、ゲノム動物DN
Aのサウザンブロット（56）によって確立させた。ヒト
胎盤、牛膵臓および豚の顎下線からの高分子量DNA（上
記と同様に調製）のそれぞれ５μｇをEcoR Iで完全に消
化させ、0.5％アガロースゲル上で電気泳動させ、そし
てニトロセルロース紙へ移した（56）。P32−標識したD
NAプローブを、Bgl II制限部位（57）に成熟ヒト白血球
インターフェロンA/Dハイブリッドの蛋白質暗号化領域
を有する570塩基対のEcoR I断片から標準法（58）によ
って調製した。各ニトロセルロース濾紙を、５×SSC（5
6）と50mMの燐酸ナトリウム（pH6.5）と0.1mg/mlの超音
波処理した鮭***DNAと５×デンハルト溶液（Denhardt
´s solution）（59）と0.1％のドデシル硫酸ナトリウ
ムと10％、20％もしくは30％のいずれかのホルムアミド
を含有する0.1％のピロ燐酸ナトリウムとにおいて42℃
で１晩予備ハイブリダイズさせ、次いで10％のデキスト
ラン硫酸ナトリウムを含有する同じ溶液中で１分間当り
100×106カウントの標識プローブでハイブリダイズさせ
た（60）。42℃にて１晩インキュベーションした後、濾
紙を２×SSCと0.1％のSDSとにおいて室温で４回洗浄
し、２×SSCにて１回洗浄し、次いでデュポン・クロネ
ックス（Dupont Cronex）強化スクリーンを有するコダ
ックXR−5X線フイルムに１晩露出させた。第１図に見ら
れるように、多数のハイブリダイズ帯は、20％のホルム
アミドをハイブリダイゼーションの際に存在させた場
合、牛および豚のDNA消化物において最も容易に検出さ
れた。この結果は、ヒトにおいて上記に例示したものと
類似した牛および豚における白血球インターフェロン遺
伝子のマルチジエン（multigene）類に対する証明を与
える（12、61）。したがって、同じハイブリダイゼーシ
ョン条件を使用して、牛DNAライブラリにおいてインタ
ーフェロン遺伝子をスクリーニングした。
500,000個の組換体フアージをDP50SupF上に10,000pfu
/15cmプレートの密度で接種し、二重のニトロセルロー
ス濾紙レプリカ（duplicate nitrocellulose filter re
plicas）を、ベントンおよびデービスの方法（62）によ
り各プレートにつき調製した。これらフイルタを上記の
ようにヒトLeIF遺伝子プローブとハイブリダイズさせ
た。反復スクリーニングの際強力な信号を与える96個の
複製ハイブリダイズプラーク（duplicate hybridizing
plaques）が得られた。
/15cmプレートの密度で接種し、二重のニトロセルロー
ス濾紙レプリカ（duplicate nitrocellulose filter re
plicas）を、ベントンおよびデービスの方法（62）によ
り各プレートにつき調製した。これらフイルタを上記の
ようにヒトLeIF遺伝子プローブとハイブリダイズさせ
た。反復スクリーニングの際強力な信号を与える96個の
複製ハイブリダイズプラーク（duplicate hybridizing
plaques）が得られた。
牛ライブラリをさらに繊維芽細胞および免疫インター
フェロン遺伝子につきスクリーニングした。これらプロ
ーブは、全成熟ヒト繊維芽細胞インターフェロン遺伝子
を含有する502塩基対のXba I−Bgl III断片（12）およ
び318塩基対のAlu I断片（アミノ酸12−116を含有す
る）および190塩基対のMbo II断片（アミノ酸99−162を
含有）から作成し、これらはヒト免疫インターフェロン
遺伝子の成熟暗号化領域から得られたものである（5
5）。1.2×106個の組換体フアージのハイブリダイゼー
ションは、全部で26種の牛繊維芽細胞インターフェロン
クローンと10種の牛免疫インターフェロンクローンとを
生成した。
フェロン遺伝子につきスクリーニングした。これらプロ
ーブは、全成熟ヒト繊維芽細胞インターフェロン遺伝子
を含有する502塩基対のXba I−Bgl III断片（12）およ
び318塩基対のAlu I断片（アミノ酸12−116を含有す
る）および190塩基対のMbo II断片（アミノ酸99−162を
含有）から作成し、これらはヒト免疫インターフェロン
遺伝子の成熟暗号化領域から得られたものである（5
5）。1.2×106個の組換体フアージのハイブリダイゼー
ションは、全部で26種の牛繊維芽細胞インターフェロン
クローンと10種の牛免疫インターフェロンクローンとを
生成した。
E.組換体フアージの特性化 フアージDNAを、ヒト白血球インターフェロンプロー
ブとハイブリダイズした12種の組換体から上記と同様に
調製した。各DNAをEcoR I、BamH IおよびHind IIIのい
ずれか１つにより並びにその組合せによって消化し、0.
5％アガロースゲル上で電気泳動させ、ハイブリダイズ
配列の位置をサウザン法（56）によって地図化した。ク
ローン10、35、78および83からの単一消化したDNAの比
較を第２図に示す。各フアージにつき、観察された制限
断片の寸法ならびに対応するハイブリダイゼーションパ
ターンは相違しかつ重複しておらず、このことはこれら
４種のフアージのそれぞれが異なる牛インターフェロン
遺伝子を有することを示唆している。さらに、３種の酵
素のそれぞれによるクローン83の消化はそれぞれの場合
２種の異なるハイブリダイズ帯をもたらし、これはこの
組換体が２種の近接して結合したインターフェロン遺伝
子を有することを示している。
ブとハイブリダイズした12種の組換体から上記と同様に
調製した。各DNAをEcoR I、BamH IおよびHind IIIのい
ずれか１つにより並びにその組合せによって消化し、0.
5％アガロースゲル上で電気泳動させ、ハイブリダイズ
配列の位置をサウザン法（56）によって地図化した。ク
ローン10、35、78および83からの単一消化したDNAの比
較を第２図に示す。各フアージにつき、観察された制限
断片の寸法ならびに対応するハイブリダイゼーションパ
ターンは相違しかつ重複しておらず、このことはこれら
４種のフアージのそれぞれが異なる牛インターフェロン
遺伝子を有することを示唆している。さらに、３種の酵
素のそれぞれによるクローン83の消化はそれぞれの場合
２種の異なるハイブリダイズ帯をもたらし、これはこの
組換体が２種の近接して結合したインターフェロン遺伝
子を有することを示している。
F.牛白血球インターフェロン遺伝子のサブクローン化 ヒト白血球遺伝子プローブとハイブリダイズした組換
体フアージの３種からの制限断片を、pBR322誘導体すな
わちpUC9の多重制限酵素クローン化部位（multiple res
triction enzyme cloning site）にサブクローン化させ
た。このプラスミドpUC9はpBR322から、先ずテトラサイ
クリン耐性遺伝子を有する2067塩基対のEcoR I−Pvu II
断片を除去し、次いでフアージM13誘導体mP9（62a）か
らの425塩基対のHae II断片を得られたプラスミドのHae
II部位中に位置2352（pBR322表記に関し）で挿入する
ことにより誘導した。mP9からのHae II断片はイー・コ
リlacZ遺伝子のＮ−末端暗号化領域を含有し、ここで配
列の多重−制限酵素クローン化部位 CAA AGC TTG GCT
GCA GGT CGA CGG ATC CCC GGGは、β−ガクトシラーゼ
の第４番目と第５番目のアミノ酸残基の間に挿入されて
いる。これらクローン化部位への外来DNA断片の挿入
は、lacプロモータとlacZ遺伝子との間の連続性を中断
し、したがってlac+からlac-にプラスミドにより形質転
換されたJM83の表現系を変化させる。
体フアージの３種からの制限断片を、pBR322誘導体すな
わちpUC9の多重制限酵素クローン化部位（multiple res
triction enzyme cloning site）にサブクローン化させ
た。このプラスミドpUC9はpBR322から、先ずテトラサイ
クリン耐性遺伝子を有する2067塩基対のEcoR I−Pvu II
断片を除去し、次いでフアージM13誘導体mP9（62a）か
らの425塩基対のHae II断片を得られたプラスミドのHae
II部位中に位置2352（pBR322表記に関し）で挿入する
ことにより誘導した。mP9からのHae II断片はイー・コ
リlacZ遺伝子のＮ−末端暗号化領域を含有し、ここで配
列の多重−制限酵素クローン化部位 CAA AGC TTG GCT
GCA GGT CGA CGG ATC CCC GGGは、β−ガクトシラーゼ
の第４番目と第５番目のアミノ酸残基の間に挿入されて
いる。これらクローン化部位への外来DNA断片の挿入
は、lacプロモータとlacZ遺伝子との間の連続性を中断
し、したがってlac+からlac-にプラスミドにより形質転
換されたJM83の表現系を変化させる。
上記の断片は次の通りであった；（ａ）クローン83か
らの1.9kbのBamH I断片および3.7kbのEcoR I断片（これ
は同じ組換体の非重複セグメントに相当する）、（ｂ）
クローン35からの3.5kbのBamH I−EcoR I断片および、
（ｃ）クローン67からの3.2kbのEcoR I断片。それぞれ
の場合、適当に消化されたベクターの0.1μｇを10倍モ
ル過剰の精製断片と結合させ、イー・コリ菌株JM83（AT
CC No.39062、1982年３月５日付で寄託）に形質転換さ
せ、0.04mg/mlの５−ブロム−４−クロル−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシドと0.2mg/mlのアンピシリン
とを含有するM9（63）プレート上へ接種した。pUC9上の
lacZ遺伝子の暗号化領域を中断する制限部位にDNA挿入
物を有すると思われる白色のコロニーを、LBブロス＋0.
2mg/mlのアンピシリンの5ml中へ釣上げ、37℃にて数時
間増殖させ、そして挿入断片をプラスミドDNAのミニ調
整法（64）によってスクリーニングした。
らの1.9kbのBamH I断片および3.7kbのEcoR I断片（これ
は同じ組換体の非重複セグメントに相当する）、（ｂ）
クローン35からの3.5kbのBamH I−EcoR I断片および、
（ｃ）クローン67からの3.2kbのEcoR I断片。それぞれ
の場合、適当に消化されたベクターの0.1μｇを10倍モ
ル過剰の精製断片と結合させ、イー・コリ菌株JM83（AT
CC No.39062、1982年３月５日付で寄託）に形質転換さ
せ、0.04mg/mlの５−ブロム−４−クロル−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシドと0.2mg/mlのアンピシリン
とを含有するM9（63）プレート上へ接種した。pUC9上の
lacZ遺伝子の暗号化領域を中断する制限部位にDNA挿入
物を有すると思われる白色のコロニーを、LBブロス＋0.
2mg/mlのアンピシリンの5ml中へ釣上げ、37℃にて数時
間増殖させ、そして挿入断片をプラスミドDNAのミニ調
整法（64）によってスクリーニングした。
G.クローン83に関する牛白血球インターフェロン遺伝子
のDNA配列 p83BamH I1.9kb（クローン83の1.9kb断片のサブクロ
ーン）のBamH I部位から伸びるDNA配列をマキサム−ギ
ルバート化学法（65）によって決定し、これを第３図に
示す。最も長いオープン解読枠は、ヒト白血球インター
フェロンに顕著な相同性を有する189個のアミノ酸から
なるポリペプチドを暗号化する（第４図）。ヒト蛋白質
との相同性により、牛白血球インターフェロンは疎水性
の23個のアミノ酸シグナルペプチドよりなり、これは同
一配列すなわちser−leu−gly−cysにより166個のアミ
ノ酸成熟蛋白質に先行する。位置1,29,99および139にお
ける４個のシステイン残基は、種間において正確に保持
されている。牛インターフェロンとヒトインターフェロ
ンとの間の対としての相同性比較を第１表に示す。予想
通り、牛蛋白質はヒト蛋白質のそれぞれに対し、後者
（80％より大）よりも著しく相同性が低い（約60％）。
のDNA配列 p83BamH I1.9kb（クローン83の1.9kb断片のサブクロ
ーン）のBamH I部位から伸びるDNA配列をマキサム−ギ
ルバート化学法（65）によって決定し、これを第３図に
示す。最も長いオープン解読枠は、ヒト白血球インター
フェロンに顕著な相同性を有する189個のアミノ酸から
なるポリペプチドを暗号化する（第４図）。ヒト蛋白質
との相同性により、牛白血球インターフェロンは疎水性
の23個のアミノ酸シグナルペプチドよりなり、これは同
一配列すなわちser−leu−gly−cysにより166個のアミ
ノ酸成熟蛋白質に先行する。位置1,29,99および139にお
ける４個のシステイン残基は、種間において正確に保持
されている。牛インターフェロンとヒトインターフェロ
ンとの間の対としての相同性比較を第１表に示す。予想
通り、牛蛋白質はヒト蛋白質のそれぞれに対し、後者
（80％より大）よりも著しく相同性が低い（約60％）。
プラスミドサブクローンp67EcoR I3.2kb、p35EcoR I
−BamH 3.5kbおよびp83EcoR I3.7kbについて生ずる３種
の追加の牛白血球インターフェロン遺伝子に対するDNA
配列および推定アミノ酸配列を第3B図、第3C図、および
第3D図にそれぞれ示す。
−BamH 3.5kbおよびp83EcoR I3.7kbについて生ずる３種
の追加の牛白血球インターフェロン遺伝子に対するDNA
配列および推定アミノ酸配列を第3B図、第3C図、および
第3D図にそれぞれ示す。
第１表に要約したように、BoIFN−α２および３遺伝
子はBoIFN−α１とは極く僅かに異なったペプチドを暗
号化するのに対し、BoIFN−α４蛋白質は他の牛ペプチ
ドとは相違しており、後者は任意の２種の牛およびヒト
白血球インターフェロンが相違しているのと同様であ
る。
子はBoIFN−α１とは極く僅かに異なったペプチドを暗
号化するのに対し、BoIFN−α４蛋白質は他の牛ペプチ
ドとは相違しており、後者は任意の２種の牛およびヒト
白血球インターフェロンが相違しているのと同様であ
る。
α４遺伝子が他のBoIFN−αと同程度に幅広い種類の
細胞蛋白質から誘導されるかどうかを確認するため、ゲ
ノム牛DNAを数種の制限エンドヌクレアーゼで消去し、
これをα１（612bpのAva II断片、第６図）およびα４
（pBoIFN−α4trp15のEcoR I−Xmn I断片）遺伝子の蛋
白質暗号化領域を示す放射能活性DNA断片と、これら２
種の遺伝子の交差ハイブリダイゼーションを許容しない
高度の厳格な条件下（50％ホルムアミド）にてハイブリ
ダイズさせた。第６図に見られるように各遺伝子は優先
的に牛DNA断片の異なった組合せにハイブリダイズす
る。これらの結果は、総合的に２種の異なる牛白血球IF
Nペプチドの種類の存在を明らかに示し、それらのうち
α１およびα４蛋白質は代表的なものと考えられる。
細胞蛋白質から誘導されるかどうかを確認するため、ゲ
ノム牛DNAを数種の制限エンドヌクレアーゼで消去し、
これをα１（612bpのAva II断片、第６図）およびα４
（pBoIFN−α4trp15のEcoR I−Xmn I断片）遺伝子の蛋
白質暗号化領域を示す放射能活性DNA断片と、これら２
種の遺伝子の交差ハイブリダイゼーションを許容しない
高度の厳格な条件下（50％ホルムアミド）にてハイブリ
ダイズさせた。第６図に見られるように各遺伝子は優先
的に牛DNA断片の異なった組合せにハイブリダイズす
る。これらの結果は、総合的に２種の異なる牛白血球IF
Nペプチドの種類の存在を明らかに示し、それらのうち
α１およびα４蛋白質は代表的なものと考えられる。
第１表において、数値は相同性％を示し、 左側下半分は23個のアミノ酸プレシーケンスを示し、 上部右半分は166個のアミノ酸成熟蛋白質を示し、 A,B,Cなどはヒト白血球インターフェロンA,B,Cなどで
ある。
ある。
H.イー・コリにおける成熟BoIFN−α１の直接的発現 直接発現プラスミドの作成を第５図に要約する。プラ
スミドサブクローンp83BamH I1.9kbをAva IIによって完
全に消化させ、牛白血球インターフェロン遺伝子を含有
する612塩基対の断片を６％ポリアクリルアミドゲル上
での電気泳動により単離し、そして電気溶出させた。約
1.5μｇのこの断片をFnu4Hにより消化し、フエノールお
よびエーテルで抽出し、そしてエタノール沈澱させた。
得られたFnu4H付着末端を６単位のDNAポリメラーゼＩ
（クレノー断片）により20mMのトリスーHCl（pH7.5）と
10mMのMgCl2と4mMジチオスレイトールと0.1mMのそれぞ
れdATP,dGTP,dCTPおよびdTTPとを含有する20μｌ中にお
いて12℃で30分間平滑末端部まで伸長させた。フエノー
ルおよびエーテルで抽出した後、このDNAをPst Iによっ
て消化し、そして６％ゲル上で電気泳動にかけた。得ら
れた92塩基対の平滑末端Pst I断片は、成熟牛白血球イ
ンターフェロンの暗号化領域の第１ヌクレオチドから伸
びるものであり、これをゲルから電気溶出させた。
スミドサブクローンp83BamH I1.9kbをAva IIによって完
全に消化させ、牛白血球インターフェロン遺伝子を含有
する612塩基対の断片を６％ポリアクリルアミドゲル上
での電気泳動により単離し、そして電気溶出させた。約
1.5μｇのこの断片をFnu4Hにより消化し、フエノールお
よびエーテルで抽出し、そしてエタノール沈澱させた。
得られたFnu4H付着末端を６単位のDNAポリメラーゼＩ
（クレノー断片）により20mMのトリスーHCl（pH7.5）と
10mMのMgCl2と4mMジチオスレイトールと0.1mMのそれぞ
れdATP,dGTP,dCTPおよびdTTPとを含有する20μｌ中にお
いて12℃で30分間平滑末端部まで伸長させた。フエノー
ルおよびエーテルで抽出した後、このDNAをPst Iによっ
て消化し、そして６％ゲル上で電気泳動にかけた。得ら
れた92塩基対の平滑末端Pst I断片は、成熟牛白血球イ
ンターフェロンの暗号化領域の第１ヌクレオチドから伸
びるものであり、これをゲルから電気溶出させた。
残部の成熟暗号化領域を次のように単離した。p83Bam
H I1.9kbのBamH I挿入物３μｇを14単位のPst Iによ
り、10mMのトリスーHCl（pH7.5）と10mMのMgCl2と2mMの
ジチオスレイトールとを含有する45μｌの反応液中で37
℃にて10分間部分消化させ、そしてフエノールおよびエ
タノールで抽出した。成熟暗号化領域のヌクレオチド93
から伸びる所望の1440塩基対の部分Pst I−BamH I断片
を６％ポリアクリルアミドゲルから単離した。
H I1.9kbのBamH I挿入物３μｇを14単位のPst Iによ
り、10mMのトリスーHCl（pH7.5）と10mMのMgCl2と2mMの
ジチオスレイトールとを含有する45μｌの反応液中で37
℃にて10分間部分消化させ、そしてフエノールおよびエ
タノールで抽出した。成熟暗号化領域のヌクレオチド93
から伸びる所望の1440塩基対の部分Pst I−BamH I断片
を６％ポリアクリルアミドゲルから単離した。
プラスミドpdeltaR I srcはプラスミドpSRCex16（6
6）の誘導体であり、ここでtrpプロモータに近接しかつ
src遺伝子から離れているEcoR I部位はDNAポリメラーゼ
１での修復により除去されており（67）、自己補完的な
オリゴデオキシヌクレオチドAATTATGAATTCAT（ホスホト
リエステル法（68）によって合成）をXba I部位にすぐ
隣接する残余のEcoR I部位中へ挿入した。20μｇのpdel
taR I srcをEcoR Iによって完全に消化し、フエノール
およびエーテルで抽出し、そしてエタノール沈澱させ
た。次いで、このプラスミドを100単位のヌクレアーゼS
1により25mMの酢酸ナトリウム（pH4.6）と1mMのZnCl2と
0.3MのNaClとにおいて16℃にて30分間消化させ、配列AT
Gを有する平滑末端部を生成させた。フエノールおよび
エーテル抽出ならびにエタノール沈澱の後、DNAをBamH
Iで消化し、６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
させ、そして大型（4300bp）のベクター断片を電気溶出
により回収した。
6）の誘導体であり、ここでtrpプロモータに近接しかつ
src遺伝子から離れているEcoR I部位はDNAポリメラーゼ
１での修復により除去されており（67）、自己補完的な
オリゴデオキシヌクレオチドAATTATGAATTCAT（ホスホト
リエステル法（68）によって合成）をXba I部位にすぐ
隣接する残余のEcoR I部位中へ挿入した。20μｇのpdel
taR I srcをEcoR Iによって完全に消化し、フエノール
およびエーテルで抽出し、そしてエタノール沈澱させ
た。次いで、このプラスミドを100単位のヌクレアーゼS
1により25mMの酢酸ナトリウム（pH4.6）と1mMのZnCl2と
0.3MのNaClとにおいて16℃にて30分間消化させ、配列AT
Gを有する平滑末端部を生成させた。フエノールおよび
エーテル抽出ならびにエタノール沈澱の後、DNAをBamH
Iで消化し、６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
させ、そして大型（4300bp）のベクター断片を電気溶出
により回収した。
0.2μｇのベクターと0.02μｇの92bpの平滑末端−Pst
I断片と0.25μｇの1400bpの部分Pst I−BamH I断片と
を400単位のT4DNAリガーゼにより12℃で１晩結合させて
発現プラスミドを組立てた後、これを使用してイー・コ
リ菌株294（ATCC No.31446）をアンピシリン耐性に形質
転換させた。プラスミドDNAを96個のコロニーから調製
し、これをXba IおよびPst Iによって消化した。これら
プラスミドの19種は所望の103塩基対のXba I−Pst Iお
よび1050塩基対のPst I断片を含有した。DNA配列の分析
は、これらプラスミドの数種が牛インターフェロン暗号
化領域の開始部に正確に位置するATG開始コドンを有す
ることを証明した。これらプラスミドの１種、すなわち
pBoIFN−α1trp55をさらに検討するため選択した。
I断片と0.25μｇの1400bpの部分Pst I−BamH I断片と
を400単位のT4DNAリガーゼにより12℃で１晩結合させて
発現プラスミドを組立てた後、これを使用してイー・コ
リ菌株294（ATCC No.31446）をアンピシリン耐性に形質
転換させた。プラスミドDNAを96個のコロニーから調製
し、これをXba IおよびPst Iによって消化した。これら
プラスミドの19種は所望の103塩基対のXba I−Pst Iお
よび1050塩基対のPst I断片を含有した。DNA配列の分析
は、これらプラスミドの数種が牛インターフェロン暗号
化領域の開始部に正確に位置するATG開始コドンを有す
ることを証明した。これらプラスミドの１種、すなわち
pBoIFN−α1trp55をさらに検討するため選択した。
I.イー・コリにおける成熟牛白血球インターフェロン
（α−４）の第２の種類の直接的発現 ATG開始コドンを、合成DNAプライマーCATGTGTGACTTGT
CTの酵素的伸長により、成熟暗号化領域の前面に入れ
た。ヘプタデカマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ
−32P ATPとにより前記と同様に燐酸化した（12）。250
ピコモルのプライマーを、30μｌのH2O中にアミノ酸残
基S20〜102を含有する約１μｇの319bpHinc II断片と組
合せ、５分間煮沸し、そして25単位のイー・コリDNAポ
リメラーゼＩクレノー断片により37℃にて３時間伸長さ
せた。この反応の生成物をHgiA Iにより消化し、そして
得られた181bpの平滑末端−HgiA I断片を６％ポリアク
リルアミドゲルから単離した。
（α−４）の第２の種類の直接的発現 ATG開始コドンを、合成DNAプライマーCATGTGTGACTTGT
CTの酵素的伸長により、成熟暗号化領域の前面に入れ
た。ヘプタデカマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼとγ
−32P ATPとにより前記と同様に燐酸化した（12）。250
ピコモルのプライマーを、30μｌのH2O中にアミノ酸残
基S20〜102を含有する約１μｇの319bpHinc II断片と組
合せ、５分間煮沸し、そして25単位のイー・コリDNAポ
リメラーゼＩクレノー断片により37℃にて３時間伸長さ
せた。この反応の生成物をHgiA Iにより消化し、そして
得られた181bpの平滑末端−HgiA I断片を６％ポリアク
リルアミドゲルから単離した。
成熟ペプチド用の全遺伝子を、ペプチドのカルボキシ
末端部分およびEcoR Iにより予め消化したHuIFN−γ発
現プラスミドすなわちpIFN−γtrp48−13（55）を含有
する508bpのHgiA−Pst I断片と上記の断片とを酵素的に
結合することにより、trpプロモータの背後に組込み、
伸長させて末端部（flush end）をクレノーDNAポリメラ
ーゼと整列させ、Pst Iにより消化し、そして最後に６
％ポリアクリルアミドゲルで単離した。得られた混合物
をイー・コリ294に形質転換させる際、数種のクローン
が同定され、これらは親発現ベクターのtrpプロモータ
ーリボソーム結合部位領域と成熟牛IFN（pBoIFN−α4tr
p15）の完全暗号化領域との間にEcoR I識別部位を備え
た。
末端部分およびEcoR Iにより予め消化したHuIFN−γ発
現プラスミドすなわちpIFN−γtrp48−13（55）を含有
する508bpのHgiA−Pst I断片と上記の断片とを酵素的に
結合することにより、trpプロモータの背後に組込み、
伸長させて末端部（flush end）をクレノーDNAポリメラ
ーゼと整列させ、Pst Iにより消化し、そして最後に６
％ポリアクリルアミドゲルで単離した。得られた混合物
をイー・コリ294に形質転換させる際、数種のクローン
が同定され、これらは親発現ベクターのtrpプロモータ
ーリボソーム結合部位領域と成熟牛IFN（pBoIFN−α4tr
p15）の完全暗号化領域との間にEcoR I識別部位を備え
た。
J.牛繊維芽細胞インターフェロン遺伝子のサブクローン
化 ヒトIFN−βDNAプローブとハイブリダイズしたフアー
ジ組換体の６種を精製し、そしてそれらのDNAを上記し
たように次の分析用として単離した。サウザンハイブリ
ダイゼーション分析と組合せた制限地図化が示すところ
によれば、６種の単離物は牛ゲノムの３種の異なる領域
からなり、したがって多重遺伝子（multigene）BoIFN−
β類（family）を意味する。これらの結果を、第７図に
示した制限地図により要約する。それぞれ異なる種類の
組換体に対する一層詳細な制限地図およびヌクレオチド
配列を得るため、ハイブリダイズ断片をプラスミドベク
ター中へサブクローン化させた。特に、フアージλβ１
の5kbBgl II断片とフアージλβ２の5kbBamH I断片とを
個々にBamH I部位にてpBR322中へクローン化し、フアー
ジλβ３の重複する4.5kbEcoR I−Xho Iおよび1.4kbPst
I−Hpa I断片をそれぞれpUC9（EcoR I−Sal I部位から
削除したもの）とpLeIF87（10）（Hpa I−Pst Iから削
除したもの）中へ挿入した。
化 ヒトIFN−βDNAプローブとハイブリダイズしたフアー
ジ組換体の６種を精製し、そしてそれらのDNAを上記し
たように次の分析用として単離した。サウザンハイブリ
ダイゼーション分析と組合せた制限地図化が示すところ
によれば、６種の単離物は牛ゲノムの３種の異なる領域
からなり、したがって多重遺伝子（multigene）BoIFN−
β類（family）を意味する。これらの結果を、第７図に
示した制限地図により要約する。それぞれ異なる種類の
組換体に対する一層詳細な制限地図およびヌクレオチド
配列を得るため、ハイブリダイズ断片をプラスミドベク
ター中へサブクローン化させた。特に、フアージλβ１
の5kbBgl II断片とフアージλβ２の5kbBamH I断片とを
個々にBamH I部位にてpBR322中へクローン化し、フアー
ジλβ３の重複する4.5kbEcoR I−Xho Iおよび1.4kbPst
I−Hpa I断片をそれぞれpUC9（EcoR I−Sal I部位から
削除したもの）とpLeIF87（10）（Hpa I−Pst Iから削
除したもの）中へ挿入した。
K.3種の異なる牛繊維芽細胞IFN遺伝子のDNA配列 第８図は、サブクローン化した３種の牛IFN−β遺伝
子のそれぞれに対する制限地図を示している。これら
は、それぞれに独特な開裂部位の存在により容易に区別
される。各遺伝子に対するペプチド暗号化領域ならびに
そのすぐ上流および下流の配列をマキサム−ギルバート
化学法により決定し、これらを第9a図，第9b図および第
9c図に示す。ヒト繊維芽インターフェロン遺伝子につき
決定された配列とのヌクレオチド相同性（12）は、各牛
遺伝子生成物に対する正確な解読枠と全アミノ酸配列と
を予想させ、これは21個のアミノ酸よりなる疎水性シグ
ナルペプチドとそれに続く185個の残基の成熟蛋白質と
を含む。牛蛋白質は互いに全く異なるが（第２表、第10
図）、ヒトペプチドに対しずっと大きな差（約60％）を
示す。
子のそれぞれに対する制限地図を示している。これら
は、それぞれに独特な開裂部位の存在により容易に区別
される。各遺伝子に対するペプチド暗号化領域ならびに
そのすぐ上流および下流の配列をマキサム−ギルバート
化学法により決定し、これらを第9a図，第9b図および第
9c図に示す。ヒト繊維芽インターフェロン遺伝子につき
決定された配列とのヌクレオチド相同性（12）は、各牛
遺伝子生成物に対する正確な解読枠と全アミノ酸配列と
を予想させ、これは21個のアミノ酸よりなる疎水性シグ
ナルペプチドとそれに続く185個の残基の成熟蛋白質と
を含む。牛蛋白質は互いに全く異なるが（第２表、第10
図）、ヒトペプチドに対しずっと大きな差（約60％）を
示す。
牛繊維芽細胞インターフェロンのマルチジエン特性
を、さらに第11図に示されたサウザンブロットをpBoIFN
−β1trpから誘導された415bpのEcoR I−Pvu I断片から
調製された放射能活性プローブと再ハイブリダイズする
ことにより示した（下記）。第11図に示すように、この
実験は追加の同族IFN−β遺伝子の存在に対する証明を
与えた。より少ないハイブリダイズ帯は実際に一層明確
に関連する遺伝子を示し、これら遺伝子はより明確なβ
−IFNを暗号化する。
を、さらに第11図に示されたサウザンブロットをpBoIFN
−β1trpから誘導された415bpのEcoR I−Pvu I断片から
調製された放射能活性プローブと再ハイブリダイズする
ことにより示した（下記）。第11図に示すように、この
実験は追加の同族IFN−β遺伝子の存在に対する証明を
与えた。より少ないハイブリダイズ帯は実際に一層明確
に関連する遺伝子を示し、これら遺伝子はより明確なβ
−IFNを暗号化する。
各対の暗号化配列における同一アミノ酸の数を示す。
21個のアミノ酸シグナルペプチドを下方左側部分で比較
し、166個のアミノ酸成熟IFN−βを表の上方右側部分で
比較する。各対における同一アミノ酸の総数を最初に示
し、次いで相同性％を示す。
21個のアミノ酸シグナルペプチドを下方左側部分で比較
し、166個のアミノ酸成熟IFN−βを表の上方右側部分で
比較する。各対における同一アミノ酸の総数を最初に示
し、次いで相同性％を示す。
L.イー・コリにおける３種の牛IFN−βの直接的発現 ３種の牛IFN−β遺伝子は多くの共通のDNA配列と制限
部位とを共有するので（第８図参照）、３種の全ての遺
伝子の発現につき一般的図式が可能である。２個のAlu
I部位を含有する最初の５個のアミノ酸を暗号化するDNA
配列はそれぞれの場合同一であったので、２種の補完的
合成オリゴヌクレオチドを設計し、これらはATG翻訳開
始コドンを組込み、成熟牛IFN−βの最初の４個のアミ
ノ酸に対するコドンを復帰し、かつtrpプロモータ配列
の後に挿入するための付着性のEcoR Iを生成する。発現
プラスミドの作成を第12図に図示する。BoIFN−βサブ
クローンプラスミドから生ずる85bpAlu I−Xho I断片に
対する合成オリゴマーの結合、およびそれに続くEcoR I
およびXho Iによる消化は、EcoR IおよびXho I付着末端
によりフランキングした104bp断片を生成する。次い
で、全暗号化を、104bpの断片を各BoIFN−β蛋白質の残
部を暗号化する約700bpのXho I−Pst断片および予め内
部EcoR I−Pst I断片が除去されているプラスミドpIFN
−γtrp48−13（55）と結合することにより、trp発現ベ
クター中へ組込んだ。得られたプラスミド、すなわちpB
oIFN−β1trp、pBoIFN−β2trpおよびpBoIFN−β3trpは
全て、IFN−β遺伝子の適切な転写および翻訳がイー・
コリtrpオペロンの制御下で行なわれるように構成され
ていた。
部位とを共有するので（第８図参照）、３種の全ての遺
伝子の発現につき一般的図式が可能である。２個のAlu
I部位を含有する最初の５個のアミノ酸を暗号化するDNA
配列はそれぞれの場合同一であったので、２種の補完的
合成オリゴヌクレオチドを設計し、これらはATG翻訳開
始コドンを組込み、成熟牛IFN−βの最初の４個のアミ
ノ酸に対するコドンを復帰し、かつtrpプロモータ配列
の後に挿入するための付着性のEcoR Iを生成する。発現
プラスミドの作成を第12図に図示する。BoIFN−βサブ
クローンプラスミドから生ずる85bpAlu I−Xho I断片に
対する合成オリゴマーの結合、およびそれに続くEcoR I
およびXho Iによる消化は、EcoR IおよびXho I付着末端
によりフランキングした104bp断片を生成する。次い
で、全暗号化を、104bpの断片を各BoIFN−β蛋白質の残
部を暗号化する約700bpのXho I−Pst断片および予め内
部EcoR I−Pst I断片が除去されているプラスミドpIFN
−γtrp48−13（55）と結合することにより、trp発現ベ
クター中へ組込んだ。得られたプラスミド、すなわちpB
oIFN−β1trp、pBoIFN−β2trpおよびpBoIFN−β3trpは
全て、IFN−β遺伝子の適切な転写および翻訳がイー・
コリtrpオペロンの制御下で行なわれるように構成され
ていた。
M.牛免疫インターフェロン（BoIFN−γ）遺伝子の特性
化およびサブクローン化 ヒトIFN−γプローブとハイブリダイズした10種のフ
アージ組換体を精製し、そしてDNAを上記と同様に調製
した。10種のDNA試料は全て、サウザンブロット分析に
より特定のハイブリダイズ帯を与えた。クローンλγ４
およびλγ７を、それらが異なるハイブリダイズ帯パタ
ーンを有するので、その後の分析のために選択した。こ
れら２種のクローンの制限地図は、互いに重複するDNA
配列を示す。重複領域は制限部位Xba I,EcoR VおよびNc
o Iを含有する。これら２種のクローンのDNA配列分析
は、ヒト免疫インターフェロン遺伝子（70）に全体的に
類似の遺伝子構造を示し、かつλγ７が４番目のエキソ
ンを暗号化する配列を含みかつλγ４がヒトIFN−γ遺
伝子とのDNA配列相同性に基づく牛IFN−γ遺伝子の最初
の３つのエキソンを暗号化する配列を含有することを示
す。BoIFN−γを示唆するアミノ酸配列を、第13図にお
いて、HuIFN−γ（55）およびねずみIFN−γのそれと比
較する。
化およびサブクローン化 ヒトIFN−γプローブとハイブリダイズした10種のフ
アージ組換体を精製し、そしてDNAを上記と同様に調製
した。10種のDNA試料は全て、サウザンブロット分析に
より特定のハイブリダイズ帯を与えた。クローンλγ４
およびλγ７を、それらが異なるハイブリダイズ帯パタ
ーンを有するので、その後の分析のために選択した。こ
れら２種のクローンの制限地図は、互いに重複するDNA
配列を示す。重複領域は制限部位Xba I,EcoR VおよびNc
o Iを含有する。これら２種のクローンのDNA配列分析
は、ヒト免疫インターフェロン遺伝子（70）に全体的に
類似の遺伝子構造を示し、かつλγ７が４番目のエキソ
ンを暗号化する配列を含みかつλγ４がヒトIFN−γ遺
伝子とのDNA配列相同性に基づく牛IFN−γ遺伝子の最初
の３つのエキソンを暗号化する配列を含有することを示
す。BoIFN−γを示唆するアミノ酸配列を、第13図にお
いて、HuIFN−γ（55）およびねずみIFN−γのそれと比
較する。
DNAの連続セグメントに対する全牛IFN−γ遺伝子を組
立てるため、λγ４から生ずる牛IFN−γ遺伝子の最初
の３つのエキソンを離間する3000bpのBamH I−Nco I断
面と、λγ７から生ずる最後のエキソンを離間する2500
bpのNco I−Hind III断片とを単離した。これら２つのD
AN断片を、次いで３つの部分結合を介してpBR322から生
ずるBamH I−Hind IIIベクター中へクローン化させた。
立てるため、λγ４から生ずる牛IFN−γ遺伝子の最初
の３つのエキソンを離間する3000bpのBamH I−Nco I断
面と、λγ７から生ずる最後のエキソンを離間する2500
bpのNco I−Hind III断片とを単離した。これら２つのD
AN断片を、次いで３つの部分結合を介してpBR322から生
ずるBamH I−Hind IIIベクター中へクローン化させた。
N.哺乳類系における牛IFN−γ遺伝子の発現 たとえばイー．コリのような原子核系においてこの遺
伝子を発現しうるようBoIFN−γのイントロンのないも
のを得る目的で、遺伝子を動物細胞発現系において高レ
ベルの発現を得るよう処理し、著量の特定mRNAを得た。
全牛IFN−γ遺伝子を離間する5500bpのBamH I−Hind II
I断片を、COS細胞における発現のためSV40ベクター中へ
挿入した（44）。特に、BamH I−Hind III牛IFN−λ遺
伝子断片を2800bpのSV40プラスミドベクターpDLΔR1に
クローン化させた［（後期転写の方向に選択的な複製の
SV40オリジンから上流のEcoR I部位を酵素的に削除する
ことにより、HBV抗原発現プラスミドpHBs348−Ｌから生
ずる。発現プラスミドpHBs348−Ｌは、HBV（71）（これ
はHBsAgを暗号化する遺伝子を離間する）のEcoR Iおよ
びBgl II消化物から生ずる1986塩基対の断片をプラスミ
ドpML（72）中へEcoR IおよびBamH I部位においてクロ
ーン化させることにより作成した（pMLは猿細胞におけ
るプラスミド複製に抑制的な配列を除去する削除部を有
するpBR322の誘導体である（72）］。次いで、生じたプ
ラスミド（pR I−Bgl）をEcoR Iにより線状化し、そし
てSV40オリジン領域を示す348塩基対の断片をpR I−Bgl
のEcoR I部位に導入した。オリジン断片はいずれの方向
でも挿入することができる。この断片は複製のオリジン
の他に初期および後期のSV40プロモータの両者を暗号化
するので、この方向性によっていずれかのプロモータの
制御下に（pHBs348−Ｌは後期プロモーターの制御下に
おいて発現されるHBsを示す）BamH IおよびSal I部位と
の間に、pBR322から生じた600bpのHind III−Sal I変換
断片の存在下で３種の部分結合を介してHBV遺伝子を発
現することができるであろう。COS細胞中への得られた
プラスミドのトランスフエクションは、SV40後期プロモ
ータの制御下に牛IFN−γの効率的発現をもたらす。
伝子を発現しうるようBoIFN−γのイントロンのないも
のを得る目的で、遺伝子を動物細胞発現系において高レ
ベルの発現を得るよう処理し、著量の特定mRNAを得た。
全牛IFN−γ遺伝子を離間する5500bpのBamH I−Hind II
I断片を、COS細胞における発現のためSV40ベクター中へ
挿入した（44）。特に、BamH I−Hind III牛IFN−λ遺
伝子断片を2800bpのSV40プラスミドベクターpDLΔR1に
クローン化させた［（後期転写の方向に選択的な複製の
SV40オリジンから上流のEcoR I部位を酵素的に削除する
ことにより、HBV抗原発現プラスミドpHBs348−Ｌから生
ずる。発現プラスミドpHBs348−Ｌは、HBV（71）（これ
はHBsAgを暗号化する遺伝子を離間する）のEcoR Iおよ
びBgl II消化物から生ずる1986塩基対の断片をプラスミ
ドpML（72）中へEcoR IおよびBamH I部位においてクロ
ーン化させることにより作成した（pMLは猿細胞におけ
るプラスミド複製に抑制的な配列を除去する削除部を有
するpBR322の誘導体である（72）］。次いで、生じたプ
ラスミド（pR I−Bgl）をEcoR Iにより線状化し、そし
てSV40オリジン領域を示す348塩基対の断片をpR I−Bgl
のEcoR I部位に導入した。オリジン断片はいずれの方向
でも挿入することができる。この断片は複製のオリジン
の他に初期および後期のSV40プロモータの両者を暗号化
するので、この方向性によっていずれかのプロモータの
制御下に（pHBs348−Ｌは後期プロモーターの制御下に
おいて発現されるHBsを示す）BamH IおよびSal I部位と
の間に、pBR322から生じた600bpのHind III−Sal I変換
断片の存在下で３種の部分結合を介してHBV遺伝子を発
現することができるであろう。COS細胞中への得られた
プラスミドのトランスフエクションは、SV40後期プロモ
ータの制御下に牛IFN−γの効率的発現をもたらす。
ポリA+mRNAをトランスフエクションされたCOS細胞か
ら調製し、次いで標準法（55）によりcDNAを調製するた
めに使用した。牛IFN−γ遺伝子プローブとハイブリダ
イズするcDNAクローンを単離した。最も長いPst I挿入
物を有するcDNAクローンをその後の分析のために選択し
た。このcDNAクローンのDNA配列の分析は、牛IFN−γゲ
ノムクローンから予想される全てのイントロン配列が正
確に除去されたことを示している。
ら調製し、次いで標準法（55）によりcDNAを調製するた
めに使用した。牛IFN−γ遺伝子プローブとハイブリダ
イズするcDNAクローンを単離した。最も長いPst I挿入
物を有するcDNAクローンをその後の分析のために選択し
た。このcDNAクローンのDNA配列の分析は、牛IFN−γゲ
ノムクローンから予想される全てのイントロン配列が正
確に除去されたことを示している。
cDNAを上記のプライマ修復法によりイー・コリ中で発
現させるために処理した。
現させるために処理した。
O.細菌抽出物の調製 0.02mg/mlのアンピシリンまたは0.005mg/mlのテトラ
サイクリンを含有するLBブロスで増殖させた１晩培養物
を、1:100の希釈率にて0.2％のグルコースと0.5％のカ
ザミノ酸と適当な薬剤とを含有する50mlのM9培地（63）
中に接種し、そして振とうしながら37℃にてA550＝1.0
となるまで増殖させた。10mlの試料を遠心分離により収
穫し、そして直ちにドライアイス−エタノール浴中で迅
速に凍結させた。凍結したペレットを1mlの7Mグアニジ
ン中に再懸濁させ、氷上で５分間インキュベートし、そ
してPBS中に希釈して分析した。或いは、凍結ペレット
を、0.2mlの20％蔗糖と100mMのトリスーHCl（pH8.0）と
20mMのEDTAと5mg/mlのリゾチームとの添加により溶菌さ
せた。氷上にて20分間後、0.8mlの0.3％トリトンＸ−10
0と0.15MのトリスーHCl（pH8.0）と2.0MのEDTAと0.1mM
のPMSFとを添加した。19,000rpmにて15分間遠心分離す
ることにより溶菌物を清澄させ、そして上澄液をPBS中
に希釈した後に分析した。
サイクリンを含有するLBブロスで増殖させた１晩培養物
を、1:100の希釈率にて0.2％のグルコースと0.5％のカ
ザミノ酸と適当な薬剤とを含有する50mlのM9培地（63）
中に接種し、そして振とうしながら37℃にてA550＝1.0
となるまで増殖させた。10mlの試料を遠心分離により収
穫し、そして直ちにドライアイス−エタノール浴中で迅
速に凍結させた。凍結したペレットを1mlの7Mグアニジ
ン中に再懸濁させ、氷上で５分間インキュベートし、そ
してPBS中に希釈して分析した。或いは、凍結ペレット
を、0.2mlの20％蔗糖と100mMのトリスーHCl（pH8.0）と
20mMのEDTAと5mg/mlのリゾチームとの添加により溶菌さ
せた。氷上にて20分間後、0.8mlの0.3％トリトンＸ−10
0と0.15MのトリスーHCl（pH8.0）と2.0MのEDTAと0.1mM
のPMSFとを添加した。19,000rpmにて15分間遠心分離す
ることにより溶菌物を清澄させ、そして上澄液をPBS中
に希釈した後に分析した。
P.インターフェロン分析 牛インターフェロン活性を96ウエルマイクロ測定板で
行なわれる細胞病理的効果（CPE）抑制分析により次の
ように分析した： 1.96ウエルマイクロ測定板のそれぞれのウエルに（８横
列×12縦列）、10％の胎児牛血清を含有する培地中の細
胞の懸濁物100μｌを加える。細胞濃度を調整して、翌
日に融合単一層を与える。
行なわれる細胞病理的効果（CPE）抑制分析により次の
ように分析した： 1.96ウエルマイクロ測定板のそれぞれのウエルに（８横
列×12縦列）、10％の胎児牛血清を含有する培地中の細
胞の懸濁物100μｌを加える。細胞濃度を調整して、翌
日に融合単一層を与える。
2.固定プラットフォーム上へプレートを緩和に10分間固
定して、一様に細胞を分配させる。翌日： 3.第１の縦列の各ウエルに80μｌの追加培地を加える。
定して、一様に細胞を分配させる。翌日： 3.第１の縦列の各ウエルに80μｌの追加培地を加える。
4.第１の縦列のウエルに、インターフェロン活性につき
分析すべき試料の20μｌを加える。
分析すべき試料の20μｌを加える。
5.100μｌピペットによりウエルの内容物100μｌを数回
抜取りかつ注入することにより、ウエルにおける試料お
よび培地を混合する。
抜取りかつ注入することにより、ウエルにおける試料お
よび培地を混合する。
6.第１の縦列におけるウエルの内容物100μｌを水平に
第２の縦列のウエルへ移行させる。
第２の縦列のウエルへ移行させる。
7.工程３におけると同様に混合する。
8.全部で11回の移行が行なわれるまで縦列から次の縦列
までウエルの内容物100μｌの移動を続ける。
までウエルの内容物100μｌの移動を続ける。
9.第12番目の縦列におけるウエルの内容物100μｌを取
出して捨てる。この過程は順次の２倍希釈をもたらす。
出して捨てる。この過程は順次の２倍希釈をもたらす。
10.各分析プレートは適当なNIH標準を含有する。
11.CO2インキュベーションにおいてプレートを37℃にて
24時間インキュベートする。
24時間インキュベートする。
12.各分析プレートは100μｌの細胞懸濁物と100μｌの
培地とを収容して細胞増殖比較として役立つウエルと、
100μｌの細胞懸濁物と100μｌの培地と50μｌのウイル
ス懸濁物とを収容してウイルス誘発性細胞病原性比較と
して役立つウイルスとを含む。
培地とを収容して細胞増殖比較として役立つウエルと、
100μｌの細胞懸濁物と100μｌの培地と50μｌのウイル
ス懸濁物とを収容してウイルス誘発性細胞病原性比較と
して役立つウイルスとを含む。
13.50μｌのウイルス懸濁物を含む細胞比較を除き、全
てのウエルを攻撃する。使用した感染の倍数は、24時間
以内における特定の細胞系に対する100％の細胞病理的
効果をもたらすウイルスの量である。
てのウエルを攻撃する。使用した感染の倍数は、24時間
以内における特定の細胞系に対する100％の細胞病理的
効果をもたらすウイルスの量である。
14.CO2インキュベーションで37℃にて24時間プレートを
再インキュベートする。
再インキュベートする。
15.プレートから液体を取出し、細胞を0.5％クリスタル
ヴアイオレットで染色する。細胞を２〜５分間染色させ
る。
ヴアイオレットで染色する。細胞を２〜５分間染色させ
る。
16.プレートウエルを水道水にて洗浄し、乾燥させる。
17.試料に関するインターフェロンのタイター（力価）
は、50％の生存細胞が残存する希釈率の逆数である。
は、50％の生存細胞が残存する希釈率の逆数である。
18.全ての試料の活性を、次の式から計算される比較単
位変換ファクタにより規格化する： （69参照）。pBoIFN−α1trp55で形質転換させたイー・
コリ菌株294（ATCC No.31446）から調製された抽出物
は、VSウイルス（インジアナ菌株）で攻撃される牛腎臓
細胞系（MDBK）に対し顕著な活性を示すが、猿腎臓（VE
RO）、ヒト頚部癌（HeLa）、うさぎ腎臓（RK−13）また
はねずみ（L929）細胞系（同様にして攻撃される）に対
し顕著な活性を示さなかった。pBR322により形質転換さ
れた菌株294から調製された比較抽出物は、MDBK細胞に
対し活性を示さなかった。第３表は、種々の攻撃された
動物およびヒト細胞系に対する試験管内の抗ウイルス活
性BoIFN−α１を要約している。BoIFN−α１は、攻撃と
してVSウイルスを使用する牛細胞に対する活性に関し、
ヒト細胞に対する抗ウイルス活性を明らかに欠如するこ
とによりヒト白血球IFNとは容易に区別される。第４表
は、発現プラスミドpBoIFN−α4trp15、pBoIFN−β1tr
p、pBoIFN−β2trpおよびpBoIFN−β3trpにより形質転
換されたイー・コリW3110から調製される抽出物で得ら
れるインターフェロン活性のレベルを示している。特に
顕著なことは、牛繊維芽細胞インターフェロンは牛腎臓
細胞系に対しヒト羊膜細胞系よりも約30倍活性であるの
に対し、逆比関係がヒト繊維芽IFNにつき見出された（1
2）。
位変換ファクタにより規格化する： （69参照）。pBoIFN−α1trp55で形質転換させたイー・
コリ菌株294（ATCC No.31446）から調製された抽出物
は、VSウイルス（インジアナ菌株）で攻撃される牛腎臓
細胞系（MDBK）に対し顕著な活性を示すが、猿腎臓（VE
RO）、ヒト頚部癌（HeLa）、うさぎ腎臓（RK−13）また
はねずみ（L929）細胞系（同様にして攻撃される）に対
し顕著な活性を示さなかった。pBR322により形質転換さ
れた菌株294から調製された比較抽出物は、MDBK細胞に
対し活性を示さなかった。第３表は、種々の攻撃された
動物およびヒト細胞系に対する試験管内の抗ウイルス活
性BoIFN−α１を要約している。BoIFN−α１は、攻撃と
してVSウイルスを使用する牛細胞に対する活性に関し、
ヒト細胞に対する抗ウイルス活性を明らかに欠如するこ
とによりヒト白血球IFNとは容易に区別される。第４表
は、発現プラスミドpBoIFN−α4trp15、pBoIFN−β1tr
p、pBoIFN−β2trpおよびpBoIFN−β3trpにより形質転
換されたイー・コリW3110から調製される抽出物で得ら
れるインターフェロン活性のレベルを示している。特に
顕著なことは、牛繊維芽細胞インターフェロンは牛腎臓
細胞系に対しヒト羊膜細胞系よりも約30倍活性であるの
に対し、逆比関係がヒト繊維芽IFNにつき見出された（1
2）。
細胞抽出物を調製し、公表された方法に従がい攻撃物
として牛腎臓MDBK細胞系およびヒト羊膜WISH細胞系およ
びVSVを用いてインターフェロン活性につき分析した
（ウエック等、1981）。
として牛腎臓MDBK細胞系およびヒト羊膜WISH細胞系およ
びVSVを用いてインターフェロン活性につき分析した
（ウエック等、1981）。
医薬組成物 本発明の化合物を公知の方法により調合して医薬上有
用な組成物を調製することができ、この場合動物インタ
ーフェロン生成物を許容しうるキャリアビヒクルと組合
せることができる。適するビヒクルおよびその調合物は
記載されている。この種の組成物は有効量のインターフ
ェロン蛋白質を適当量のビヒクルと共に含有して、公知
のルートたとえば非経口的に宿主に有効投与するのに適
した許容しうる組成物を調製する。
用な組成物を調製することができ、この場合動物インタ
ーフェロン生成物を許容しうるキャリアビヒクルと組合
せることができる。適するビヒクルおよびその調合物は
記載されている。この種の組成物は有効量のインターフ
ェロン蛋白質を適当量のビヒクルと共に含有して、公知
のルートたとえば非経口的に宿主に有効投与するのに適
した許容しうる組成物を調製する。
本発明に包含される動物インターフェロンは天然の対
立遺伝子（allelic variation）と共に存在することが
了解されよう。これらは全配列におけるアミノ酸の相
違、或いは削除、置換、挿入、逆転、または前記配列に
おけるアミノ酸の添加によって示すことができる。これ
ら全ての対立遺伝子は本発明の範囲内に包含される。
立遺伝子（allelic variation）と共に存在することが
了解されよう。これらは全配列におけるアミノ酸の相
違、或いは削除、置換、挿入、逆転、または前記配列に
おけるアミノ酸の添加によって示すことができる。これ
ら全ての対立遺伝子は本発明の範囲内に包含される。
以上特定の好適具体例につき記載したが、本発明はこ
れのみに限定されないことが了解されよう。
れのみに限定されないことが了解されよう。
文 献 1.リナルド（Rinaldo）他、インフエクション アンド
イミユニテイ（Infectoin and Immunity）、14巻、66
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3巻、113頁、1978年 49.レデイ（Reddy）他、サイエンス（Science）、200
巻、494頁、1978年 50.ブリン（Blin）及びスタフオード（Stafford）、ヌ
クレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Rese
arch）、３巻、2303頁、1976年 51.マニアテイス（Maniatis）他、セル（Cell）、15
巻、687頁、1978年 51a.ブラトナー（Blattner）他、サイエンス（Scienc
e）、196巻、161頁、1977年 52.リム（Rimm）他、ジエン（Gene）、12巻、301頁、19
80年 53.ブラトナー（Blattner）他、1978年、プロセデユレ
ス フオー ユウス オブ チャロン フアージス イ
ン レコンビナント デイーエヌエー リサーチ，リサ
ーチ リソウセス ブランチ（Procedures for Use of
Char on Phages in Recombinant DNA Research,Researc
h Resources Branch）、ナショナル インスチチユウト
オブ アレルギイ アンド インフエクシヨウス デ
ジイズ（National Institute of Allergy and Infectio
us Diseases）、ベセスダ（Bethesda）、メリイランド
（Maryland） 54.ブラトナー（Blattner）他、サイエンス（Scienc
e）、202巻、1279頁、1978年 55.グレイ（Gray）他、ネイチャー（Nature）、295巻、
503頁、1982年 56.サウセルン（Southern）、ジエイ．モル．バイオ
ル．（J.Mol.Biol.）、98巻、503頁、1975年 57.ウエック（Weck）他、ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucleic Acids Research）、９巻、6153頁 58.テイラー（Taylor）他、バイオケム．バイオフイ
ジ．アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、442巻、324頁、
1976年 59.デンハート（Denhardt）、バイオケム．バイオフイ
ジ．レス．コム．（Biochem.Biophys.Res.Comm.）、23
巻、641頁、1966年 60.ワール（Wahl）他、プロク．ナト．アカデ．サイ．
（Proc.Nat.Acad.Sci.）76巻、3683頁、1979年 61.ナガタ（Nagata）他、ネイチャー（Nature）、287
巻、401頁、1980年 62.ベントン（Benton）及びデイビス（Davis）、サイエ
ンス（Science）196巻、180頁、1977年 62a.メシング（Messing）他、ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucleic Acids Research）、９巻、309
頁、1981年 63.ミラー（Miller）1972年、エクスペリメンツ イン
モレキュラージ エネテイックス（Experiments in M
olecular Genetics）、コールド スプリング ハーバ
ー ラボラトリイ（Cold Spring Harbor Laborator
y）、コールド スプリング ハーバー（Cold Spring H
arbor）、ニューヨーク 64.ビルンボイム（Birnboim）他、ヌクレイック アシ
ッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、７巻、15
13頁、1979年 65.マキサム（Maxam）及びギルベルト（Gilbert）、プ
ロク．ナト．アカデ．サイ．（Proc.Nat.Acad.Sci.）、
74巻、560頁、1977年 66.マクグラス（McGrath）及びレビンソン（Levinso
n）、ネイチャー（Nature）、295巻、423頁、1982年 67.イタクラ（Itakura）他、サイエンス（Science）、1
98巻、1056頁、1977年 68.クレア（Crea）他、プロク．ナトル．アカデ．サ
イ．（Proc.Natl.Acad.Sci.）、75巻、5765頁、1978年 69.ステワルト（Stewart）1979年、ザ インターフェロ
ン システム（The Interferon System）、スプリンガ
ー−フエルラグ（Springer−Verlag）、ニューヨーク、
17頁参照 70.グレイ（Gray）及びゲデル（Goeddel）、ネイチャー
（Nature）、298巻、859頁、1982年 71.アニマル ウイルス ジエネテイクス（Animal Viru
s Genetics）、（フイールズ（Fields）他編）、５章57
頁、アカデミック プレス（Academic Press）、エヌ．
ワイ．（N.Y.）、1980年 72.ラスキイ（Lusky）及びボッチャン（Botchan）、ネ
イチャー（Nature）、293巻、79頁、1981年
イミユニテイ（Infectoin and Immunity）、14巻、66
0頁、1976年 2.フルトン（Fulton）及びローゼンクイスト（Rosenqui
st）、アム．ジエイ．ベト．レス．（Am.J.Vet.Re
s.）、37巻、1497頁、1976年 3.バブリック（Babrick）及びロウズ（Rouse）、インフ
エクション アンドイミユニテイ（Infection and Immu
nity）、13巻、1567頁、1976年 4.トッド（Todd）他、インフエクション アンド イミ
ユニテイ（Infection and Immunity）、５巻、699頁、1
972年 5.アール（Ahl）及びランプ（Rump）、インフエクショ
ン アンド イミユニテイ（Infection and Immunit
y）、14巻、603頁、1976年 6.バブリック（Babrick）及びロウズ（Rouse）、インタ
ービロロジイ（Intervirology）、８巻、250頁、1977年 7.トベイ（Tovey）他、ジエイ．ジエン．ビロル．（J.G
en.Virol.）、36巻、341頁、1977年 8.ゲデル（Goeddel）他、ネイチャー（Nature）、287
巻、411頁、1980年 9.ゲデル（Goeddel）他、ネイチャー（Nature）、290
巻、20頁、1981年 10.エルベルトン（Yelverton）他、ヌクレイツク アシ
ッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、９巻、73
1頁、1981年 11.グッターマン（Gutterman）他、アナルス オブ イ
ント．メド．（Annals of Int.Med.）、93巻、399頁、1
980年 12.ゲデル（Goeddel）他、ヌクレイツク アシッズ リ
サーチ（Nucleic Acids Reseach）、８巻、4057頁、198
0年 13.イップ（Yip）他、プロク．ナトル．アカデ．サイ．
（ユーエスエー）（Proc.Natl.Acad.Sci.（USA））、78
巻、1601頁、1981年 14.タニグチ（Taniguchi）他、プロク．ナトル．アカ
デ．サイ．（ユーエスエー）（Proc.Natl.Acad.Sci.（U
SA））、78巻、3469頁、1981年 15.ブルーム（Bloom）、ネイチャー（Nature）298巻、5
93頁、1980年 16.ソネンフエルト（Sonnenfeld）他、セルラーイムノ
ル．（Cellular Immunol）、40巻、285頁、1978年 17.フライシュマン（Fleishmann）他、インフエクショ
ン アンド イミユニテイ（Infection and Immunti
y）、26巻、248頁、1979年 18.ブラロック（Blalock）他、セルラー イムノロジイ
（Cellular Immunology）、49巻、390頁、1980年 19.ルジン（Rudin）他、プロク．ナトル．アカデ．サ
イ．（ユーエスエー）（Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A））、77巻、5928頁、1980年 20.クラン（Crane）他、ジエイ．ナトル．キャンサー
インスト．（J.Natl.Cancer Inst.）、61巻、871頁、19
78年 21.英国特許公開第2007676号公報 22.ウエツエル（Wetzel）、アメリカン サイエンテイ
スト（American Scientist）、68巻、664頁、1980年 23.ミクロバイオロジイ（Microbiology）、第２版、ハ
ーパー アンド ロウ パブリッシャーズ、インク．
（Harper and Row Publishers,Inc.）、ハゲルストウン
（Hagerstown）、メリイランド（Maryland）、1973年、
特に1122頁参照 24.サイエンテイフイック アメリカン（Scientific Am
erian）、245巻、66頁、1981年参照 25.英国特許公開第2055382号公報 26.***特許公開第2644432号公報 26a.レーダー（Leder）他、サイエンス（Science）、19
6巻、175頁、1977年 27.チャン（Chang）他、ネイチャー（Nature）、275
巻、617頁、1978年 28.イタクラ（Itakura）他、サイエンス（Science）、1
98巻、1056頁、1977年 29.欧州特許公開第0036776号公報 30.ジイベンリスト（Siebenlist）他、セル（Cell）、2
0巻、、269頁、1980年 31.スチンクコンブ（Stinchcomb）他、ネイチャー（Nat
ure）,282巻、39頁、1979年 32.キングスマン（Kingsman）他、ジエン（Gene）、７
巻、141頁、1979年 33.チャンパー（Tschumper）他、ジエン（Gene）、10
巻、157頁、1980年 34.モルチマー（Mortimer）他、マイクロバイオロジカ
ル レビュー（Microbiological Reviews）、44巻、519
頁、198年 35.ミオザリ（Miozzari）他、ジャーナル オブ バク
テリオロジー（Journal of Bacteriology）、134巻、48
頁、1978年 36.ジョーンズ（Jones）、ジエネステイックス（Geneti
cs）、85巻、23頁、1977年 37.ヒツツエマン（Hitzeman）、ジエイ．バイオル．ケ
ム．（J.Biol.Chem.）、255巻、12073頁、1980年 38.ヘス（Hess）他、ジエイ．アドブ．エンザイム．レ
ギユル．（J.Adv.Enzyme Regul.）、７巻、149頁、1968
年 39.ホランド（Holland）他、バイオケミストリイ（Bioc
hemistry）、17巻、4900頁、1978年 40.ボステイアン（Bostian）他、プロク．ナトル．アカ
デ．サイ．（ユーエスエー）（Proc.Natl.Acad.Sci.（U
SA））、77巻、4504頁、1980年 41.ザ モレキュラー バイオロジイ オブ イースト
（The Molecular Biology of Yeast）（1981年８月11日
〜18日）、コールド スプリング ハーバー ラボラト
リイ（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド
スプリング ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニュー
ヨーク 42.チャムボン（Chambon）、アン．レブ．バイオケミス
トリイ（Ann.Rev.Biochemistry）、44巻、613頁、1975
年 43.テイッシュ カルチャー（Tissue Culture）、アガ
テミック プレス（Academic Press）、クルス（Krus
e）及びパターソン（Patterson）編、1973年 44.グルツマン（Gluzman）、セル（Cell）、23巻、175
頁、1981年 45.ゲデル（Goeddel）他、ネイチャー（Nature）、281
巻、544頁、1979年 46.ラスキイ（Lusky）他、ネイチャー（Nature）、293
巻、79頁、1981年 47.グルツマン（Gluzman）他、コールド スプリング
ハーバー シンプ．クオント．バイオル．（Cold Sprin
g Harbor Symp.Quant.Biol.）、44巻、293頁、1980年 48.フアイアス（Fiers）他、ネイチャー（Nature）、27
3巻、113頁、1978年 49.レデイ（Reddy）他、サイエンス（Science）、200
巻、494頁、1978年 50.ブリン（Blin）及びスタフオード（Stafford）、ヌ
クレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Rese
arch）、３巻、2303頁、1976年 51.マニアテイス（Maniatis）他、セル（Cell）、15
巻、687頁、1978年 51a.ブラトナー（Blattner）他、サイエンス（Scienc
e）、196巻、161頁、1977年 52.リム（Rimm）他、ジエン（Gene）、12巻、301頁、19
80年 53.ブラトナー（Blattner）他、1978年、プロセデユレ
ス フオー ユウス オブ チャロン フアージス イ
ン レコンビナント デイーエヌエー リサーチ，リサ
ーチ リソウセス ブランチ（Procedures for Use of
Char on Phages in Recombinant DNA Research,Researc
h Resources Branch）、ナショナル インスチチユウト
オブ アレルギイ アンド インフエクシヨウス デ
ジイズ（National Institute of Allergy and Infectio
us Diseases）、ベセスダ（Bethesda）、メリイランド
（Maryland） 54.ブラトナー（Blattner）他、サイエンス（Scienc
e）、202巻、1279頁、1978年 55.グレイ（Gray）他、ネイチャー（Nature）、295巻、
503頁、1982年 56.サウセルン（Southern）、ジエイ．モル．バイオ
ル．（J.Mol.Biol.）、98巻、503頁、1975年 57.ウエック（Weck）他、ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucleic Acids Research）、９巻、6153頁 58.テイラー（Taylor）他、バイオケム．バイオフイ
ジ．アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、442巻、324頁、
1976年 59.デンハート（Denhardt）、バイオケム．バイオフイ
ジ．レス．コム．（Biochem.Biophys.Res.Comm.）、23
巻、641頁、1966年 60.ワール（Wahl）他、プロク．ナト．アカデ．サイ．
（Proc.Nat.Acad.Sci.）76巻、3683頁、1979年 61.ナガタ（Nagata）他、ネイチャー（Nature）、287
巻、401頁、1980年 62.ベントン（Benton）及びデイビス（Davis）、サイエ
ンス（Science）196巻、180頁、1977年 62a.メシング（Messing）他、ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucleic Acids Research）、９巻、309
頁、1981年 63.ミラー（Miller）1972年、エクスペリメンツ イン
モレキュラージ エネテイックス（Experiments in M
olecular Genetics）、コールド スプリング ハーバ
ー ラボラトリイ（Cold Spring Harbor Laborator
y）、コールド スプリング ハーバー（Cold Spring H
arbor）、ニューヨーク 64.ビルンボイム（Birnboim）他、ヌクレイック アシ
ッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、７巻、15
13頁、1979年 65.マキサム（Maxam）及びギルベルト（Gilbert）、プ
ロク．ナト．アカデ．サイ．（Proc.Nat.Acad.Sci.）、
74巻、560頁、1977年 66.マクグラス（McGrath）及びレビンソン（Levinso
n）、ネイチャー（Nature）、295巻、423頁、1982年 67.イタクラ（Itakura）他、サイエンス（Science）、1
98巻、1056頁、1977年 68.クレア（Crea）他、プロク．ナトル．アカデ．サ
イ．（Proc.Natl.Acad.Sci.）、75巻、5765頁、1978年 69.ステワルト（Stewart）1979年、ザ インターフェロ
ン システム（The Interferon System）、スプリンガ
ー−フエルラグ（Springer−Verlag）、ニューヨーク、
17頁参照 70.グレイ（Gray）及びゲデル（Goeddel）、ネイチャー
（Nature）、298巻、859頁、1982年 71.アニマル ウイルス ジエネテイクス（Animal Viru
s Genetics）、（フイールズ（Fields）他編）、５章57
頁、アカデミック プレス（Academic Press）、エヌ．
ワイ．（N.Y.）、1980年 72.ラスキイ（Lusky）及びボッチャン（Botchan）、ネ
イチャー（Nature）、293巻、79頁、1981年
第１図は、EcoR Iにより消化しかつ種々異なるホルムア
ミド濃度にてヒト白血球インターフェロンA/Dハイブリ
ッドの暗号化領域を含む32P−標識570塩基対EcoR I断片
でハイブリダイズされた（ａ）ヒト、（ｂ）牛および
（ｃ）豚のゲノムDNAのサウザンハイブリダイゼーショ
ンを示している。20％ホルムアミドにおけるハイブリダ
イゼーションは、マルチジエン牛および豚白血球インタ
ーフェロン遺伝子類の最も明瞭なパターンを示してい
る。 第２図は、EcoR I,BamH IまたはHind IIIにより消化さ
れかつ32P−標識したヒト白血球遺伝子プローブでハイ
ブリダイズされた４種の異なる牛ゲノムDNAフアージ組
換体のサウザンハイブリダイゼーションを示している。
クローン83は、各制限酵素により２種のハイブリダイズ
断片を与える。 第3A図は、プラスミドサブクローンp83BamH I1.9kbから
のヌクレオチド配列の一部ならびにそこに暗号化された
牛白血球インターフェロンのための推定アミノ酸配列を
示している。シグナルペプチドはアミノ酸残基S1〜S23
によって示される。 第3B図は、プラスミドサブクローンp67EcoR I3.2kbから
の第２の牛白血球インターフェロン（α２）のためのヌ
クレオチド配列および推定アミノ酸配列を示している。 第3C図は、プラスミドサブクローンp35EcoR I−BamH I
3.5kbからの第３の牛白血球インターフェロン（α３）
に対する完全成熟ヌクレオチド配列および推定アミノ酸
配列を示している。 第3D図は、プラスミドサブクローンp83EcoR I−BamH I
2.9kbからの第４の牛白血球インターフェロンに対する
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示してい
る。シグナルペプチドはアミノ酸残基S1〜S23によって
示される。成熟蛋白質は172個のアミノ酸残基からなっ
ている。６個のアミノ酸残基よりなる最終の長さは位置
511におけるヌクレオチド塩基変化に基因し、次の同位
相停止信号の前に６個の追加翻訳コドンを許容する。 第4a図、第4b図、第4c図は、BoIFN−α1,α2,α３およ
びα４のアミノ酸配列と、11種の公知のヒト白血球イン
ターフェロンに対する配列との比較を示している。さら
に、全てのヒト白血球インターフェロンと全ての牛白血
球インターフェロンで保持されているアミノ酸、並びに
牛α１およびα４については大多数のヒト白血球インタ
ーフェロンとの相同性が生ずる位置が示されている。 第５図は、牛白血球インターフェロン発現プラスミドpB
oIFN−α1trp55の作成を示す略図である。出発材料はtr
p発現ベクターpdeltaR Isrcおよびプラスミドサブクロ
ーンp83BamH I1.9kbからのBamH I断片である。 第６図は、EcoR I,Hind III,BamH I,Bgl IIおよびPvu I
Iのいずれかで消化された牛DNAと、BoIFN−α１またはB
oIFN−α４遺伝子断片から調製された放射能活性プロー
ブとのサウザンハイブリダイゼーションを示している。
各IFN遺伝子は、BoIFN−α遺伝子の異なるサブフアミリ
（Subfamily）と優先的にハイブリダイズする。 第７図は、ヒト繊維芽細胞ヒトインターフェロン遺伝子
プローブをハイブリダイズする３種のフアージ組換体か
らのゲノム牛DNA挿入物の制限地図を示している。各BoI
FN−βの位置および配向は黒四角形によって示されてい
る。星印により示された制限部位は、部分制限地図化情
報を示している。 第８図は、第７図に示した３種の遺伝子に対する一層詳
細な分解制限地図を示している。ハッチングはシグナル
配列を示し、成熟配列を陰影化している。 第9a図、第9b図、第9c図は、BoIFN−β1,2および３遺伝
子に対するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を
示している。 第10図は、３種のBoIFN−βに対するアミノ酸配列とHuI
FN−βとの比較を示している。 第11図は、ヒトゲノムDNAとHuIFN−β遺伝子（９）とを
用いて同様な実験を行なった際、単一のハイブリダイズ
断片のみが一般に明らかとなるような条件下でBoIFN−
β１遺伝子プローブで再ハイブリダイズさせた第６図の
サウザンブロットである。 第12図は、イー．コリのtrpオペロンの制限下で３種の
全てのBoIFN−βを発現するため使用した方法の略図で
ある。 第13図は、BoIFN−γ,HuIFN−γおよびねずみIFN−γの
推定アミノ酸配列の比較を示している。
ミド濃度にてヒト白血球インターフェロンA/Dハイブリ
ッドの暗号化領域を含む32P−標識570塩基対EcoR I断片
でハイブリダイズされた（ａ）ヒト、（ｂ）牛および
（ｃ）豚のゲノムDNAのサウザンハイブリダイゼーショ
ンを示している。20％ホルムアミドにおけるハイブリダ
イゼーションは、マルチジエン牛および豚白血球インタ
ーフェロン遺伝子類の最も明瞭なパターンを示してい
る。 第２図は、EcoR I,BamH IまたはHind IIIにより消化さ
れかつ32P−標識したヒト白血球遺伝子プローブでハイ
ブリダイズされた４種の異なる牛ゲノムDNAフアージ組
換体のサウザンハイブリダイゼーションを示している。
クローン83は、各制限酵素により２種のハイブリダイズ
断片を与える。 第3A図は、プラスミドサブクローンp83BamH I1.9kbから
のヌクレオチド配列の一部ならびにそこに暗号化された
牛白血球インターフェロンのための推定アミノ酸配列を
示している。シグナルペプチドはアミノ酸残基S1〜S23
によって示される。 第3B図は、プラスミドサブクローンp67EcoR I3.2kbから
の第２の牛白血球インターフェロン（α２）のためのヌ
クレオチド配列および推定アミノ酸配列を示している。 第3C図は、プラスミドサブクローンp35EcoR I−BamH I
3.5kbからの第３の牛白血球インターフェロン（α３）
に対する完全成熟ヌクレオチド配列および推定アミノ酸
配列を示している。 第3D図は、プラスミドサブクローンp83EcoR I−BamH I
2.9kbからの第４の牛白血球インターフェロンに対する
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示してい
る。シグナルペプチドはアミノ酸残基S1〜S23によって
示される。成熟蛋白質は172個のアミノ酸残基からなっ
ている。６個のアミノ酸残基よりなる最終の長さは位置
511におけるヌクレオチド塩基変化に基因し、次の同位
相停止信号の前に６個の追加翻訳コドンを許容する。 第4a図、第4b図、第4c図は、BoIFN−α1,α2,α３およ
びα４のアミノ酸配列と、11種の公知のヒト白血球イン
ターフェロンに対する配列との比較を示している。さら
に、全てのヒト白血球インターフェロンと全ての牛白血
球インターフェロンで保持されているアミノ酸、並びに
牛α１およびα４については大多数のヒト白血球インタ
ーフェロンとの相同性が生ずる位置が示されている。 第５図は、牛白血球インターフェロン発現プラスミドpB
oIFN−α1trp55の作成を示す略図である。出発材料はtr
p発現ベクターpdeltaR Isrcおよびプラスミドサブクロ
ーンp83BamH I1.9kbからのBamH I断片である。 第６図は、EcoR I,Hind III,BamH I,Bgl IIおよびPvu I
Iのいずれかで消化された牛DNAと、BoIFN−α１またはB
oIFN−α４遺伝子断片から調製された放射能活性プロー
ブとのサウザンハイブリダイゼーションを示している。
各IFN遺伝子は、BoIFN−α遺伝子の異なるサブフアミリ
（Subfamily）と優先的にハイブリダイズする。 第７図は、ヒト繊維芽細胞ヒトインターフェロン遺伝子
プローブをハイブリダイズする３種のフアージ組換体か
らのゲノム牛DNA挿入物の制限地図を示している。各BoI
FN−βの位置および配向は黒四角形によって示されてい
る。星印により示された制限部位は、部分制限地図化情
報を示している。 第８図は、第７図に示した３種の遺伝子に対する一層詳
細な分解制限地図を示している。ハッチングはシグナル
配列を示し、成熟配列を陰影化している。 第9a図、第9b図、第9c図は、BoIFN−β1,2および３遺伝
子に対するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を
示している。 第10図は、３種のBoIFN−βに対するアミノ酸配列とHuI
FN−βとの比較を示している。 第11図は、ヒトゲノムDNAとHuIFN−β遺伝子（９）とを
用いて同様な実験を行なった際、単一のハイブリダイズ
断片のみが一般に明らかとなるような条件下でBoIFN−
β１遺伝子プローブで再ハイブリダイズさせた第６図の
サウザンブロットである。 第12図は、イー．コリのtrpオペロンの制限下で３種の
全てのBoIFN−βを発現するため使用した方法の略図で
ある。 第13図は、BoIFN−γ,HuIFN−γおよびねずみIFN−γの
推定アミノ酸配列の比較を示している。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−150100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−131598（ＪＰ，Ａ) 米国特許4262090（ＵＳ，Ａ) 国際公開80／2375（ＷＯ，Ａ１) 国際公開82／588（ＷＯ，Ａ１) Ａｃｔａ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｇｅ ｒ．38（５−６）（1979）Ｐ．759〜763 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1980 ［255］Ｐ．7521−7524 Ｎａｔｕｒｅ，1982［295］Ｐ．423
Claims (9)
- 【請求項１】次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−172アミノ酸、 のいずれかのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれ
かの天然のウシのアレル変異体を含有し、他のヒト以外
の動物インターフェロンを伴なっておらず、かつ天然環
境中では付随している不純物を実質的に含まないヒト以
外の動物インターフェロン。 - 【請求項２】天然のグリコシル化を伴わない特許請求の
範囲第１項に記載のインターフェロン。 - 【請求項３】正常な第１アミノ酸のＮ末端に結合してい
るメチオニンアミノ酸を有する第１項に記載のインター
フェロン。 - 【請求項４】正常な第１アミノ酸のＮ末端に結合してい
る開裂可能な会合タンパク質又はシグナルタンパク質を
有する第１項に記載のインターフェロン。 - 【請求項５】次式： に示される２−165アミノ酸、 次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−172アミノ酸、 のいずれかのアミノ酸配列を含有する成熟ウシ白血球イ
ンターフェロンである第１項に記載のインターフェロ
ン。 - 【請求項６】次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−166アミノ酸、 次式： に示される２−172アミノ酸、 のいずれかのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれ
かの天然のウシのアレル変異体を含有し、他のヒト以外
の動物インターフェロンを伴なっておらず、かつ天然環
境中では付随している不純物を実質的に含まないヒト以
外の動物インターフェロンの製造方法であって、該方法
は該インターフェロンをコードするDNAを作動可能に担
持する複製できる発現ベクターで形質転換した微生物培
養物または細胞培養物を作成し、該培養物を増殖させて
該インターフェロンを生産し、それを回収することを特
徴とする方法。 - 【請求項７】該ヒト以外の動物インターフェロンが天然
のグリコシル化を伴わないものである、第６項に記載の
方法。 - 【請求項８】該ヒト以外の動物インターフェロンが成熟
型である第６項又は第７項に記載の方法。 - 【請求項９】該ヒト以外の動物インターフェロンがその
正常な第１アミノ酸のＮ末端に結合している開裂可能な
会合タンパク質又はシグナルタンパク質を含有するもの
である第６項又は第７項に記載の方法。
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