JP2673718B2 - 細菌による植物病害防除方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、微生物により植物の病害を抑制し、健全な
野菜を栽培する方法およびそれに用いるバチルス属に属
する新規な微生物に関する。

従来の技術 従来、農園芸用作物の病害を防除するため多くの合成
殺菌剤が用いられているが、環境への影響や薬剤耐性を
もつた病原菌の出現などの問題があり、作物農薬が注目
されている。すなわち、病原菌に対し拮抗作用を有する
微生物に植物体に直接または畑作土に添加処理して作物
の病害菌による感染、畑作土壌内での病害菌の生育ある
いは病害作用を抑制する生物防除の方法が開発されてい
る。

一方、微生物の生産する抗生物質が種々の植物病害に
硬化のあることが見出されてきている。例えば、バチル
ス属に属するある種の菌株は園芸作物の灰色かび病、菌
核病、うどんこ病、灰星病に対し顕著な防除効果を有す
る抗かび抗生物質であるプルマイシン（４−Ｎ−Ｄ−ア
ラニル−2,4−ジアミノ−2,4−ジデオキシアラビノー
ズ）を生産することが知られており、（特開昭54−1578
96号）、またバチルス属に属する他のある種の菌株は灰
色かび病、炭そ病、いもち病、紋枯病に対して高い防除
効果を有するベプチド系抗生物質イツリンＡを生産する
ことが知られている。（特開昭61−280095号、Tetrahed
ron Letters No.30,3065〜3068,1982）。

しかし、これらプルマイシンやイツリンＡの効果は微
生物より分離して施用した場合の効果であつて、微生物
自体を作物に施用し、灰色かび病やうどんこ病を防除す
る有効な微生物は知られていない。

発明が解決しようとする課題 上述のような微生物から生産される抗生物質を微生物
から単離することなく、抗生物質を生産する微生物を直
接作物に適用し得れば極めて好都合であり、そのような
微生物農薬の開発が望まれている。

本発明は、プリマイシンを生産する能力を有する微生
物を自然界より広く検索し、灰色かび病菌、うどんこ病
菌、べと病菌、赤錆病菌等に原因する病害を抑制し得る
微生物及び該微生物を利用して主として野菜類の細菌に
よる植物病害を防除する方法を提供することを課題とす
る。

課題を解決するための手段 本発明は、自然界より分離したバチルス属に属し、プ
ルマイシンを生産する能力を有する新規なバチルス・ズ
ブチルスs.p.KB−1111（Bacillus subtilis s.p.KB−11
11）株（微工研条寄第1738号）およびバチルス・ズブチ
ルスs.p.KB−1122（Bacillus subtilis s.p.KB−1122）
株（微工研菌寄第1739号）を利用するものである。

バチルス・ズブチルスs.p.KB−1111菌株（以下単にKB
−1111菌と記す）およびバチルス・ズブチルスs.p.KB−
1122菌株（以下単にKB−1122菌と記す）は後述するよう
な培養条件で培養するときプルマイシン等の抗生物質を
生産し、この生菌体を野菜に噴霧し生産させるとき灰色
かび病、うどんこ病、べと病、赤錆病等に優れた効果を
示す。

本発明者等が新潟県寺泊の土壌から分離した菌株KB−
1111菌は次のような菌学的性質を有する。

観察事項 KB−1111菌 ａ）形態 （１）形および大きさ 捍菌（両端丸みあり） （２）多形性 単一 （３）運動性とべん毛 有り （４）胞子の有無 有り 胞子の形 卵円形 胞子の形成部位 中心 （５）グラム染色性 陽性 （６）抗酸性 無し ｂ）生育状況 （１）肉汁寒天平板培養 コロニーは灰白色かクリーム
色、光沢少々あり、円形で大きさは直径２〜4mm.集落隆
起形は中凹、周縁形は波状、粘性あり （２）肉汁寒天斜面 培地表面に広がつて増殖し、色は
灰白色で光沢少々あり、粘性あり、拡散性色素はなし （３）肉汁液体培地 １〜２日目で培地表面に菌膜をつ
くり全体に覆う。混濁なく、菌体は灰白色 （４）ばれいしょ切片 拡散性で皺状の灰白色コロニー （５）肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、30℃で培養すると
液化が始まる。その形地は層状。

ｃ）生理学的性質 テストの方法 １）硝酸塩の還元 硝酸塩肉汁 有り ２）脱窒反応 駒形らの方法 無し ３）MR 陰性 ４）VP 陽性 ５）インドールの生成 無し ６）硫化水素の生成 TSI寒天 無し 酢酸鉛試験紙を用いる方法 肉汁 無し 運動性検査用培地 無し ７）クエン酸の利用 Koser citrate medium 有り Christensen agar 有り ８）デンプンの分解 陽性 ９）色素の生成 じゃがいも切片 無し 10）無機窒素源の利用試験 硫酸アンモニウム 有り 硝酸ナトリウム 無し グルタミン酸ソーダ 有り カザミノ酸ｖ・free 有り 11）ウレアーゼ Christensen尿素培地 有り 12）オキシダーゼ 陽性 13）カタラーゼ 陽性 14）カゼインの分解 カゼイン２％寒天 有り 15）リトマスミルク ペプトン化と色素還元 有り 16）LV寒天 有り 17）ブドウ糖肉汁の嫌気性発育 無し 18）生育の範囲（肉汁培地） 45℃における発育 有り 65℃における発育 無し pH5〜９における発育 有り ７％ NaClにおける発育 有り 19）リゾチーム感受性0.001％ ブドウ糖肉汁 有り 20）糖から酸の生成 グルコース ◎ シュクロース ◎ マンノース ◎ グリセリン ◎ ソルビット ◎ フラクトース ◎ マンニット ◎ キシロース ◎ アラビノース ○ デンプン △ ラクトース ○ 麦芽糖 ◎ イノシット ○ トレハロース ○ ガラクトース × ラフィノース △〜○ 21）アジ化ナトリウム0.02％生育 ブイヨン 無し 22）チロシンの分解 チロシン寒天 無し 一方、本発明者が茨城県新治郡の土壌から分離した菌
株KB−1122は次のような菌学的性質を有する。

観察事項 KB−1111菌 ａ）形態 （１）形および大きさ 捍菌（両端丸みあり） （２）多形性 単一 （３）運動性とべん毛 有り （４）胞子の有無 有り 胞子の形 卵円形 胞子の形成部位 中心 （５）グラム染色性 陽性 （６）抗酸性 無し ｂ）生育状況 （１）肉汁寒天平板培養 コロニーは灰白色かクリーム
色、光沢なく不正円形で大きさは直径２〜6mm.***形で
周縁は波状 （２）肉汁寒天斜面 培地表面に広がつて増殖し、色は
灰白色かクリーム色 拡散性色素はなし （３）肉汁液体培地 １〜２日目で培地表面に菌膜をつ
くり全体に覆う。混濁なく、菌体は灰白色 （４）ばれいしよ切片 拡散性で皺状の灰白色コロニー （５）肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、30℃で培養すると
液化が始まる。その形は層状。

ｃ）生理学的性質 テストの方法 １）硝酸塩の還元 硝酸塩肉汁 有り ２）脱窒反応 駒形らの方法 無し ３）MR 陰性 ４）VP 陽性 ５）インドールの生成 無し ６）硫化水素の生成 TSI寒天 無し 酢酸鉛試験紙を用いる方法 肉汁 無し 運動性検査用培地 無し ７）クエン酸の利用 Koser citrate medium 有り Christensen agar 有り ８）デンプンの分解 陽性 ９）色素の生成 じやがいも切片 無し 10）無機窒素源の利用試験 硫酸アンモニウム 有り 硝酸ナトリウム 有り グルタミン酸ソーダ 有り カザミノ酸ｖ・free 有り 11）ウレアーゼ Christensen尿素培地 有り 12）オキシダーゼ 陽性 13）カタラーゼ 陽性 14）カゼインの分解 カゼイン２％寒天 有り 15）リトマスミルク ペプトン化と色素還元 有り 16）LV寒天 有り 17）ブドウ糖肉汁の嫌気性発育 無し 18）生育の範囲（肉汁培地） 45℃における発育 有り 65℃における発育 無し pH5〜９における発育 有り ７％ NaClにおける発育 有り 19）リゾチーム感受性0.001％ ブドウ糖肉汁 有り 20）糖から酸の生成 グルコース ◎ シュクロース ◎ マンノース ◎ グリセリン ◎ ソルビット ◎ フラクトース ◎ マンニット ○ キシロース ○ アラビノース ○ デンプン ○ ラクトース ○ 麦芽糖 ○ イノシット ○ トレハロース ○ ガラクトース △ ラフィノース × 21）アジ化ナトリウム0.02％生育 ブイヨン 無し 22）チロシンの分解 チロシン寒天 無し 以上の菌学的性質から、バジェイズ マニュアル（Be
rgey′s manual of systematic bacteriology）を参照
として同定を行つた結果、２菌株共にバチルス・ズブチ
ルス（Bacillus subtilis）に属する菌種と同定され
た。

培養条件 上記菌株の培養は、発酵学の分野で公知の常法に従つ
て行うことができる。培地としては、この菌株が資化可
能な炭素源及び窒素源を適当量含有し、必要に応じて無
機塩、微量発育促進物質、消泡剤を添加したものが使用
される。具体的には、炭素源としては、グリコース、フ
ラクトース、マルトース、ガラクトース、リボース、サ
ッカロース、澱粉、糖蜜、廃糖蜜糖の糖類、グリセロー
ス、マンニトール等のアルコール類、ピリビン酸、酢
酸、クエン酸等の脂肪酸類、グリシン、グルタミン酸、
グルタミン、アラニン、アスパラギン等のアミノ酸類等
一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮し
て、一種又は二種以上を適宜選択し使用すればよい。

窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、
乾燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、
カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスチ−プリカ−等動
物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素化合物、ア
ムモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の
硝酸塩、尿素等、無機窒素化合物より使用微生物の資化
性を考慮し、一種又は二種以上を適宜選択して使用すれ
ばよい。

さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガ
ン、鉄、カルシウム、カリウム、等のリン酸塩、塩酸
塩、硫酸塩、酢酸塩等の一種又は二種以上を適宜添加
し、必要に応じて植物油、界面活性剤などの消泡剤を添
加してもよい。

培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振とう
培養、通気撹拌培養、牲置培養、連続培養等の通常の培
養法により使用培地成分に適した培養法を選択して行
う。

培養条件は、培地の種類、培養法により適宜選択すれ
ばよく、本菌株が増殖し、プルマイシンを生産できる条
件、あるいは本菌株が増殖しプルマイシンを生産する能
力を維持できる条件であれば特に制限はない。通常は培
開始のpHを６〜８に調整し、25〜35℃の温度条件で培養
することが好ましい。培養日数は通常２〜７日が適当で
ある。

以上のように本菌株を培養した後、得られた培養物そ
のもの、培養物から遠心分離、凝集分離等の通常の方法
によつて集菌した生菌体、または生菌体を凍結乾燥、ア
セトン乾燥等の方法によつて乾燥した乾燥菌体、あるい
はこれらを被覆剤により被覆処理したものを作物に適用
することによりべと病、赤錆病、うどんこ病、灰色かび
病等の防除を期することができる。

尚、上記の菌体の被覆剤としては、植物種子の被覆に
用いられる被覆剤、例えばメチルセルロース、アラビア
ゴム、アルギン酸塩、ポリウレタンプレポリマー、ポリ
ビニルアセテートホモポリマー等の天然もしくは合成高
分子、過酸化カルシウム、炭酸カルシウム、焼石膏、ガ
ラス綿などを用いることができる。

本発明に係るKB−1111菌及びKB−1122菌がプルマイシ
ンを生産することは次のことから知ることができる。

すなわち、KB−1111菌およびKB−1122菌のそれぞれの
培養液から菌体を除いた上清をpH3.0に調整し、陽イオ
ン交換樹脂アンバーライトIRC−50（オルガノ社製）で
処理し、その吸着成分を0.5N−アンモニア水で溶出し、
中和後アンバーライトCG−50（オルガノ社製）で吸着処
理し、その吸着成分を0.5Nアンモニア水で溶出し中和
後、CM−セファデックス（フアルマシア社製）で吸着処
理し、その吸着成分を0.6モル／の食塩水で溶出し、
さらにセファデックスLH−60（フアルマシア社製）で処
理し、吸着成分を水で溶出して濃縮することにより白色
結晶を得た。この結晶は分析の結果プルマイシンであつ
た。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１（生菌体製造例） 肉エキス3g、ペプトン10g、塩化ナトリウム5g、を精
製水1000mlに溶かし、pHを7.0〜7.3に調整しオートクレ
ーブ滅菌後KB−1111菌およびKB−1122菌を各々別々に接
種し、30℃、１日間培養する。この前培養液を１〜５％
下記本培養培地に接種する。本培養は、30℃、５日間振
盪培養する。培養後、菌体を集菌し凍結乾燥する。

本培養培地組成 酵母エキス0.5g、燐酸水素−カリウム2g、燐酸水素二
カリウム、硫酸マグネシウム・７水塩0.5g、硫酸第一鉄
・７水塩2mg、ファーマメデア20g、ラクトース20g、に
水道水1000mlを加え、pH7.2に調整し、120℃、20分オー
トクレーブで滅菌する。

実施例２ 実施例１によつて得た凍結乾燥菌体を、イソゲンを用
いた灰色かび病防除試験を下記の方法にしたがつて行つ
た。

イソゲン子葉灰色かび病検定方法 所定濃度に調製しておい薬液（KB−1111またはKB−11
22乾燥菌体10〜15ml/イソゲン１個体）をイソゲン子葉
（発芽後薬10日）に均一に散布する。薬液を風乾後にポ
テト・サッカロース寒天培地上に生育させておいた灰色
かび菌（Botrytiscinerea）のコロニー先端部をコルク
ボーラーにて抜き打ち（アガーピース）１葉当り２個、
計４個を子葉上に接種する。その後イソゲンポットを20
℃、高湿にたもち、３〜４日後に発病程度を調査する。
発病程度は、イソゲン葉上に形成される病斑面積の、無
処理区のイソゲン葉上に形成される病斑面積に対する百
分率で表わす。

結果は表１に示す。また、市販の防除剤を用いた結果
も比較として示した。

なお、以下の表２〜４にも市販の防除剤を用いた結果
を比較として併せて示した。

実施例３ キュウリベと病防除効果試験 径10cmの素焼鉢を用いて栽培した第２本葉時のキュウ
リ葉（品種；相模半白、１本播き／鉢、３鉢／処理区使
用）にKB−1111、KB−1122培養菌体を0.7％（乾燥菌体
重量％）に水で希釈懸濁し、１鉢当り5ml散布した。散
布葉を風乾後、り病葉から採取したキュウリベと病菌胞
子への懸濁液を噴霧接種し、20〜22℃高湿度条件下に24
時間保ち、その後は温室内に放置した。接種後５〜７日
目にキュウリベと病の病斑面積率を調査し、下記式によ
り防除価を算出した。

結果は表２に示す。

実施例４ コムギうどんこ病防除効果試験 径10cmの素焼鉢を用いて栽培した第２葉期の幼苗コム
ギ（品種；農林64号、16本／鉢、３鉢／処理区使用）に
KB−1111、KB−1122培養菌体を0.7％（乾燥菌体重量
％）に水で希釈懸濁し、１鉢当り5ml散布した。散布葉
を風乾後、り病葉から採取したこむぎうどんこ病菌胞子
の懸濁液を噴霧採取し、20〜24℃高温度条件下に24時間
保ち、その後は温室内に放置した。接種後９〜11日目に
コムギうどんこ病の病斑面積率を調査し、下記式により
防除価を算出した。

結果は表２に示す。

実施例５ キュウリうどんこ病防除効果試験 径10cmの素焼鉢を用いて栽培した第２本葉時のキュウ
リ（品種；相模半白、１本／鉢、３鉢／処理区使用）に
KB−1111、KB−1122培養菌体を0.7％（乾燥菌体重量
％）に水で希釈懸濁し、１鉢当り5ml散布した。散布葉
を風乾後、り病葉より筆で胞子をふりかけて接種し、ガ
ラス温室内で発病させた。接種後９〜11日目にキュウリ
うどんこ病の病斑面積率を調査し、下記式により防除価
を算出した。

結果は表２に示す。

実施例６ コムギ赤さび病防除効果試験 径10cmの素焼鉢を用いて栽培した第２本葉時の幼苗コ
ムギ（品種；農林64号、16本／鉢）にKB−1111、KB−11
22培養菌体を0.7％（乾燥菌体重量％）に水で希釈懸濁
し、5ml/鉢の割合で散布した。散布葉を風乾後、り病葉
から採取したコムギ赤さび病菌胞子の懸濁液を噴霧接種
し、20〜23℃高温度条件下に24時間保つた。その後ガラ
ス温室内に放置し、接種から７〜10日後にコムギ赤さび
病の病斑面積率を調査し、下記式により防除価を算出し
た。

結果は表２に示す。

実施例７ レタス灰色かび病防除効果試験 径10cmの素焼鉢を用いて播種後、温室（15〜25℃）で
約５週間栽培したレタス（品種：キングクラウン）の葉
にKB−1111、KB−1122培養菌体を所定濃度に水で希釈懸
濁し、１鉢当り5ml散布した。散布葉を風乾後、予め灰
色かび病菌をふすま培地（ふすま5g、籾がら1g、水5m
l）で20℃、８日間培養し、つくつた菌糸の塊を16メッ
シュの篩にかけて、レタスの上から直接に接種し、20〜
22℃高湿度条件下に保つた。接種後５日目にレタスの灰
色かび病の病斑面積率を調査し、下記式により防除価を
算出した。

結果は表３に示す。

実施例８ イチゴの灰色かび病防除効果試験 イチゴパックを用いて、いちご（品種：女峰）の実を
並べ、KB−1111、KB−1122培養菌体を0.7％（乾燥菌体
重量％）に水で希釈した懸濁液を、１パック5mlの割合
で散布した。風乾後、予め砂糖加用馬鈴薯煎汁寒天培地
を用いて20℃で14日間培養した灰色かび病菌の胞子を１
パックク当り1/4シャーレ相当量付着させ、20〜22℃高
湿度条件下に保つた。接種後４日目にイチゴの灰色かび
病の病斑面積率を調査し、下記式により防除価を算出し
た。

結果を表４に示す。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バチルス・ズブチルスs.p.KB−1111（Baci
   llus subtilis s.p.KB−1111）株（微工研条寄第1738
   号）及び／又はバチルス・ズブチルスs.p.KB−1122（Ba
   cillus subtilis s.p.KB−1122）株（微工研条寄第1739
   号）を野菜類に噴霧・生育させることを特徴とする細菌
   に対する植物病害防除方法。
2. 【請求項２】細菌による植物病害防除性を有するバチル
   ス・ズブチルスs.p.KB−1111（Bacillus subtilis s.p.
   KB−1111）株（微工研条寄第1738号）。
3. 【請求項３】細菌による植物病害防除性を有するバチル
   ス・ズブチルスs.p.KB−1122（Bacillus subtilis s.p.
   KB−1122）株（微工研条寄第1739号）。