이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 식물병 유발균에 대하여 항균 활성을 가지는 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) DBB 1501 균주 (미생물 기탁번호: KFCC-11356P) 및 이를 이용한 식물병의 효과적인 방제방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 유발균에 대한 방제용 미생물제제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 미생물제제 조성물에 함유되는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) DBB 1501 균주는 배양배지로부터 직접 분리한 균주를 사용할 수도 있지만, 바람직하게는 배양액 또는 배양액을 건조한 분말을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 미생물제제 조성물은 DBB 1501 균주를 액체배지에서 배양하는 단계; 상기 단계를 거쳐 배양된 배양물을 건조하여 분말화하여 원제를 제조하는 단계를 포함하는 제조공정으로 제조될 수 있다.
상기 액체배양은 배지성분으로(w/v% 기준) glucose 0.1~10.0%, Yeast extract 0.1~10.0%, Soybean powder 0.1~10.0%, Corn steep liquor 0.1~10.0%, Ammonium sulfate 0.1~5.0%, Potassium phosphate(dibasic) 0.1~5.0%, Calcium carbonate 0.1~5.0%를 포함하여 조성된 액체배지를 사용하여, 배양조건은 배양량 600L로 배양조내 압력 0.1~0.7 ㎏/㎤, 통기량 0.1~1.0 v/v/m, 온도 25~35 ℃, pH 5.5~8.5로 조절하여 1.2KL fermenter를 사용하여 수행될 수 있다.
상기와 같은 조건에서 44시간 배양을 거친 배양물을 분무건조기(spray dryer) 또는 동결건조기(freeze dryer) 등을 이용하여 배양액을 분말화하여 DBB 1501 원제를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 통상적인 농약 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있으며, 바람직한 한 양태로서, 본 발명의 미생물제제 조성물은 상기 DBB 1501 원제 5.0~50.0%(w/w)와 전착제, 분산제, 습윤제 등의 계면활성제 0.1~20%(w/w), 증량제 10.0~80.0%(w/w), 보존제 0.1~10%(w/w), 무기염 0.1~10.0%(w/w)를 혼합한 후, 에어밀린(air milling) 또는 헤머밀링(hammer milling) 등을 통해 수화제(WP) 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 미생물제제 조성물에 첨가되는 계면활성제는 계면활성이 큰 물질로서 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) DBB 1501 균주의 약효가 효과적으로 발현되도록 전착, 습윤, 분산 및 붕괴시키는 역할을 한다. 본 발명에 사용될 수 있는 계면활성제로는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제 등 통상적으로 사용되는 모든 종류의 계면활성제들이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 전착제, 분산제, 습윤제 중에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다.
본 발명의 미생물제제 조성물에 첨가되는 증량제는 상기 계면활성제를 흡착 및 분산화시키고, 상기 조성물의 표면을 이루는 물질로 사용될 수 있으며, 미생물과 같은 유효성분 및 기타 보조성분들이 농약 조성물의 조성에서 적절한 비율로 함유되도록 하기 위하여 전체 농약 조성물의 양을 조절하는 역할을 한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 증량제로는 소듐알기네이트, 젤라틴화 전분, 옥수수 전분, 대두박, 밀기울, 입상섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 미생물제제 조성물이 액상수화제로 제조하는 경우에는 상기 증량제로는 물이 사용될 수 있다.
본 발명의 미생물제제 조성물에 함유되는 보존제는 미생물 농약 조성물의 보존성을 향상시키기 위하여 첨가되는 성분으로서, 본 발명에서 사용될 수 있는 보존제로는 대두유, 이소프로필산포스페이트, 소듐트리폴리포스페이트 등의 통상적인 것들을 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 미생물제제 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니지만, 입제, 수화제, 액상수화제 등의 여러 가지 제형으로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 바람직한 실시예를 통하여 보다 상세히 설명할 것이나, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 기재된 바에 의해 한정되어야 할 것이다.
<실시예 1> DBB 1501 균주의 분리 및 동정
토양 샘플 1g을 100ml 증류수에 희석한 후 70℃에서 30분간 중탕한 후 다시 증류수로 1/100로 희석하였다. 희석액을 0.1ml을 Tryptic soy agar(Difco社)에 스프레더(spreader)로 도말한 후 30℃ 인큐베이터에서 24시간 배양 후 얻어진 수개의 콜로니중에서 Rhizoctonia solani(벼문고병)균주에 가장 우수한 저지원 효과를 보인 균주를 선발하여 DBB1501이라는 코드명을 부여하였다. 상기 분리 배양된 DBB1501 미생물을 한국미생물보존센터(KCCM)에 2005년 9월 7일자로 기탁하여 수탁번호 KFCC-11356P를 부여받았다. 상기 DBB 1501 균주를 KCCM에서 16S rDNA 시퀀싱(sequencing) 및 API 분석방법을 수행하여 동정하였다. 균주 동정결과, 상기 DBB 1501 균주는 Bacillus subtilis (Gene Bank Data homology search result: 99%)로 확인되었다 (표 1, 도 1 및 도 2).
[표 1] DBB 1501의 생화학적 대사능력 분석 결과 (API 분석)
|
Strain |
DBB 1501 |
|
Strain |
DBB 1501 |
API CHB |
API CHB |
0 |
Control |
-
|
25 |
Esculine |
+
|
1 |
Glycerol |
+
|
26 |
Salicine |
+
|
2 |
Ertythritol |
-
|
27 |
Cellobiose |
+
|
3 |
D-Arabinose |
-
|
28 |
Maltose |
+
|
4 |
L-Arabinose |
+
|
29 |
Lactose |
+
|
5 |
Ribose |
+
|
30 |
Melibiose |
+
|
6 |
D-Xylose |
+
|
31 |
Saccharose |
+
|
7 |
L-Xylose |
-
|
32 |
Trehalose |
+
|
8 |
Adonitol |
-
|
33 |
Inuline |
-
|
9 |
β Methyl-xyloside |
-
|
34 |
Melezitose |
-
|
10 |
Galactose |
-
|
35 |
D-Raffinose |
+
|
11 |
D-Glucose |
+
|
36 |
Amidon |
+
|
12 |
D-Fructose |
+
|
37 |
Glycogene |
+
|
13 |
D-Mannose |
+
|
38 |
Xylitol |
-
|
14 |
L-sorbose |
-
|
39 |
β Gentiobiose |
-
|
15 |
Rhamnose |
-
|
40 |
D-Turanose |
-
|
16 |
Dulcitol |
-
|
41 |
D-Lyxose |
-
|
17 |
Inositol |
+
|
42 |
D-Tagatose |
-
|
18 |
Mannitol |
+
|
43 |
D-Fucose |
-
|
19 |
Sorbitol |
+
|
44 |
L-Fucose |
-
|
20 |
α Methyl-D-mannoside |
-
|
45 |
D-Arabitol |
-
|
21 |
α Methyl-D-glucoside |
+
|
46 |
L-Arabitol |
-
|
22 |
N Acetyl glucosamine |
-
|
47 |
Gluconate |
-
|
23 |
Amygdaline |
+
|
48 |
2 ceto-gluconate |
-
|
24 |
Arbutine |
+
|
49 |
5 ceto-gluconate |
-
|
<실시예 2> DBB 1501 액체배양 및 분말원제 제조
DBB 1501을 균주를 1.2KL fermenter를 사용하여 액체배양을 진행하였다. 배지는 배지성분은(w/v% 기준) glucose 0.1~10.0%, Yeast extract 0.1~10.0%, Soybean powder 0.1~10.0%, Corn steep liquor 0.1~10.0%, Ammonium sulfate 0.1~5.0%, Potassium phosphate(dibasic) 0.1~5.0%, Calcium carbonate 0.1~5.0%를 포함하여 조성된 액체배지를 사용하였다. 배양조건은 배양량 600L로 하였으며, 배양조내 압력 0.1~0.7 ㎏/㎤, 통기 0.1~1.0 v/v/m, 온도 25~35 ℃, pH 5.5~8.5로 제어하였다. 배양 44시간 후 배양을 종료하고 배양물을 분무건조기(spray dryer) 또는 동결건조기(freeze dryer)를 이용하여 배양액을 분말화하여 원제를 제조하였다.
한편, 배양과 관련된 특성으로는 전체배양시간은 약 44시간이 소요되었으며, 최대 Optical density(A600)는 53.1을 보였다. 영양세포의 포자 생성(sporulation)은 배양 25시간 이후부터 진행되어 배양종료시 99% 이상의 모든 세포들이 포자로 전환되었다. pH값은 초기 영양세포 증식기에는 점진적으로 떨어지는 경향을 보이다가 포자가 형성되는 시기부터는 다시 증가하는 결과를 보였다. 배양과정 중에는 산소공급에 영향을 줄 정도의 다량의 폴리머(polymer)는 생성되지 않았다. 배양종료 후 배양액과 분무건조(동결건조 가능)를 한 분말원제의 생포자수를 조사한 결과, 각각 4.1×109 cfu/㎖와 2.3×1011 cfu/g의 함량을 보여 일반적인 Bacillus 균주와 유사한 생산성을 보였다 (표 2, 표 3 및 도 3).
[표 2] 배양시간별 DBB 1501 균주의 생육 데이터
배양시간 (hour) |
Optical density (A600) |
pH |
온도 (℃) |
RPM |
압력 (kg/cm3) |
통기 (v/v/m) |
0 |
8.8 |
6.62 |
29.8 |
80 |
0.32 |
0.5 |
6 |
10.2 |
6.82 |
30.6 |
80 |
0.29 |
0.5 |
8 |
12.8 |
6.31 |
32.1 |
80 |
0.31 |
0.5 |
10 |
10.2 |
6.13 |
32.8 |
100 |
0.29 |
0.5 |
11 |
9.9 |
6.16 |
33.4 |
100 |
0.27 |
0.5 |
14 |
25.7 |
6.23 |
31.7 |
100 |
0.32 |
0.5 |
18 |
25 |
6.67 |
34.5 |
100 |
0.30 |
0.5 |
22 |
28.4 |
6.64 |
32.3 |
120 |
0.32 |
0.5 |
28 |
38.4 |
6.39 |
31.8 |
150 |
0.41 |
0.5 |
32 |
43.2 |
6.62 |
31.2 |
150 |
0.42 |
0.5 |
36 |
45.8 |
6.41 |
30.9 |
150 |
0.40 |
0.5 |
39 |
53.1 |
6.40 |
31.4 |
150 |
0.39 |
0.5 |
43 |
47.8 |
7.10 |
31.7 |
150 |
0.41 |
0.5 |
[표 3] DBB 1501 배양액 및 건조분말 원제의 포자수 함량 분석
구분 |
포자함량 |
DBB 1501 배양액 |
4.1 x 109 cfu/ml |
DBB 1501 분말원제 |
2.3 x 1011 cfu/g |
<실시예 3> DBB 1501을 함유하는 미생물제제 제형화
실시예 2에서 제조된 DBB 1501 원제 5.0~50.0%(w/w)와 계면활성제(전착제, 분산제, 습윤제 등) 0.1~20%(w/w), 증량제 10.0%~80.0%(w/w), 보존제 0.1%~10%(w/w), 무기염 0.1~10.0%(w/w)를 혼합 후 에어밀링(air milling) 또는 헤머밀링(hammer milling)을 통해 수화제(WP) 제형을 제조하였다.
상기와 같이 수화제로 제형화한 결과, 양호한 물리성을 확보하였다. 구체적 으로 분말도 98% 이상, 수화성 1분 15초, 현수성 93.3%의 결과를 보였다. 수화제의 DBB 1501 포자수 함량을 분석한 결과 3.8×1010 cfu/g의 함양을 보여 적합한 유효함량을 가지고 있는 것으로 판단되었다 (표 4).
[표 4] DBB 1501 수화제의 이화학적 특성 및 미생물 함량
구분 |
분말도 |
수화성 |
현수성 |
포자함량(cfu/g) |
DBB 1501 수화제 |
98% 이상 |
1분 15초 |
93.3% |
3.8 x 1010 |
<실시예 4> DBB 1501의 식물병 방제 효과
4-1.
오이흰가루병
방제효과
대전 대형 비닐하우스 조건에서 재배중인 오이(품종: 백미백다다기)를 대상으로 오이흰가루병 발생초기에 실시예 3에서 제조된 DBB 1501 WP를 물에 500배로 희석하여 동력분무기로 7일 간격으로 3회 경엽처리하였다(2006년 4/21, 4/28, 5/5). 최종 약제처리 7일 후(2006년 5/10) 오이흰가루병의 발생정도를 잎에 발생한 오이흰가루병의 병반면적율로 조사하여 방제효과를 평가하였다. 대조약제로 화학약제인 Fenarimol 12.5% EC(일반명: 훼나리 유제)를 사용하였다.
DBB 1501 수화제는 오이흰가루병에 60.3%의 방제효과를 보여 대조약제인 화학농약 Fenarimol 87.7% 유제에 비해 다소 떨어지는 수준이기는 하나 생물농약으로 적용가능성은 높은 것으로 판단되었다.
[표 5] DBB 1501 수화제의 오이흰가루병 방제효과
시험약제 |
처리방법 |
병반면적율(%) |
방제가(%) |
DBB 1501 수화제 |
별 발생초기부터 7일 간격 3회 경엽처리 |
17.7 |
60.3 |
Fenarimol 12.5% 유제 |
5.5 |
87.7 |
무처리 |
44.7 |
- |
4-2.
딸기흰가루병
방제효과
충남 논산 딸기재배농가에서 재배중인 딸기(품종: 육보)를 대상으로 딸기흰가루병 발생초기에 실시예 3에서 제조된 DBB 1501 WP를 물에 500배로 희석하여 동력분무기로 7일간격으로 3회 경엽처리하였다(2006년 2/12, 2/28, 3/7). 최종 약제처리 7일 후(2006년 3/14) 딸기흰가루병의 발생정도를 시험구 전체에 있는 딸기과실수 대비 딸기흰가루병이 발생한 과실수인 이병과율로 조사하여 방제효과를 평가하였다. 대조약제로 화학약제인 Triflumizole 30% WP(일반명: 리프졸 수화제)를 사용하였다.
DBB 1501 수화제는 딸기흰가루병에 80.3%의 방제효과를 보여 대조약제인 화학농약 Triflumizole 30% 수화제와 대등한 수준으로 적용가능성이 높은 것으로 판단되었다.
[표 6] DBB 1501 수화제의 딸기흰가루병 방제효과
시험약제 |
처리방법 |
이병과율(%) |
방제가(%) |
DBB 1501 수화제 |
별 발생초기부터 7일 간격 3회 경엽처리 |
2.8 |
80.3 |
Triflumizole 30% 수화제 |
2.1 |
84.9 |
무처리 |
14.0 |
- |
4-3.
참외흰가루병
방제효과
경북 칠곡 참외재배 농가에서 재배중인 참외(품종: 금동이)를 대상으로 참외흰가루병 발생초기에 실시예 3에서 제조된 DBB 1501 WP를 물에 500배로 희석하여 동력분무기로 7일 간격으로 3회 경엽처리하였다(2006년 5/30, 6/6, 6/13). 최종 약제처리 7일 후(2006년 6/20) 참외흰가루병의 발생정도를 잎에 발생한 참외흰가루병의 병반면적율로 조사하여 방제효과를 평가하였다. 대조약제로 화학약제인 Fenarimol 12.5% EC(일반명: 훼나리 유제)를 사용하였다.
DBB 1501 수화제는 참외흰가루병에 82.2%의 방제효과를 보여 대조약제인 화학농약 Fenarimol 12.5% 유제와 대등한 수준으로 적용가능성이 높은 것으로 판단되었다.
[표 7] DBB 1501 수화제의 참외흰가루병 방제효과
시험약제 |
처리방법 |
병반면적율(%) |
방제가(%) |
DBB 1501 수화제 |
별 발생초기부터 7일 간격 3회 경엽처리 |
4.2 |
82.2 |
Fenarimol 12.5% 유제 |
2.7 |
88.8 |
무처리 |
23.6 |
- |
4-4. 복숭아세균성
구멍병
방제효과
경기 화성 복숭아 과수원에서 재배중인 복숭아(품종: 유명)를 대상으로 복숭아세균성구멍병 발생초기에 실시예 3에서 제조된 DBB 1501 WP를 물에 500배로 희석하여 동력분무기로 7일 간격으로 3회 경엽처리하였다(2006년 5/16, 5/23, 5/30). 최종 약제처리 7일 후(2006년 6/7) 복숭아세균성구멍병의 발생정도를 복숭아 1주당 전체잎수 대비 병이 발생한 잎수인 이병엽율를 조사하여 방제효과를 평가하였다. 대조약제로 화학약제인 Streptomycin 20% WP(일반명: 농용신 수화제)를 사용하였다.
DBB 1501 수화제는 복숭아세균성구멍병에 72.7%의 방제효과를 보여 대조약제인 화학농약 Streptomycin 20% 수화제보다 월등한 수준으로 적용가능성이 매우 높은 것으로 판단되었다.
[표 8] DBB 1501 수화제의 복숭아세균성 구멍병 방제효과
시험약제 |
처리방법 |
이병엽율(%) |
방제가(%) |
DBB 1501 수화제 |
별 발생초기부터 7일 간격 3회 경엽처리 |
1.4 |
72.7 |
Streptomycin 20% 수화제 |
2.7 |
47.9 |
무처리 |
5.1 |
- |
4-5.
인삼점무늬병
방제효과
경북 풍기 인삼재배농가에서 재배중인 인삼(3년생)을 대상으로 인삼점무늬병 발생초기에 실시예 3에서 제조된 DBB 1501 WP를 물에 500배로 희석하여 동력분무기로 10일 간격으로 3회 경엽처리하였다(2006년 6/5, 6/16, 6/26). 최종 약제처리 10일 후(2006년 7/6) 인삼점무늬병의 발생정도를 발병도로 조사하여 방제효과를 평가하였다. 대조약제로 화학약제인 Difenoconazole10% WP(일반명: 디페노코나졸 수화제)를 사용하였다.
DBB 1501 수화제는 인삼점무늬병에 79.2%의 방제효과를 보여 대조약제인 화학농약 Difenoconazole 10%수화제보다 다소 낮은 수준이나 적용가능성은 높은 것으로 판단되었다.
[표 9] DBB 1501 수화제의 인삼점무늬병 방제효과
시험약제 |
처리방법 |
발병도(%) |
방제가(%) |
DBB 1501 수화제 |
별 발생초기부터 7일 간격 3회 경엽처리 |
1.5 |
79.2 |
Difenoconazole10%수화제 |
0.5 |
92.2 |
무처리 |
7.0 |
- |