KR100506721B1

KR100506721B1 - 바실러스 리케니포미스 ｎ1 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제

Info

Publication number: KR100506721B1
Application number: KR10-2002-0058050A
Authority: KR
Inventors: 문병주; 이재필; 김현주; 송주희; 손지희; 김철승; 임은경
Original assignee: 학교법인 동아대학교; 문병주
Priority date: 2002-09-25
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2005-08-08
Also published as: KR20040026526A

Abstract

본 발명은 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항균 또는 항진균 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스, 이를 포함하는 식물 병원성 진균 방제용 미생물제제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물제제는 환경친화적인 미생물제제로 작물에 미치는 영향을 최소화하고, 잿빛곰팡이병을 포함하는 식물의 병해를 방제하는데 효과적일 뿐만 아니라 저비용으로 제조할 수 있으므로, 들깨, 토마토, 오이 및 딸기 등의 농작물의 병해 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 리케니포미스 Ｎ1 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제{Bacillus licheniformis N1 and microbial agent for preventing plant-pathogenic fungi containing the same}

본 발명은 균 또는 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 이용하는 미생물제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물병원성 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 및 이를 이용하는 식물의 진균 방제용 미생물제제에 관한 것이다.

잿빛곰팡이병원균은 화훼 및 과수 뿐만 아니라 시설원예작물인 오이, 토마토, 가지, 딸기, 수박, 참외, 호박, 고추 및 상추 등 살아있는 각종 농작물은 물론 기타 식물 잔사에서도 부생적으로 번식하며 거의 모든 농작물에 심한 피해를 주는 병원균이다. 상기 병원균은 다범성균으로서 기주 범위가 매우 넓고 변이가 심하며 농약의 다량 살포로 인한 약제저항성 균의 출현으로 방제가 어려울 뿐만 아니라 잔류독성 및 환경오염 문제를 야기시키고 있다. 화학농약 사용의 사회적 부작용이 전세계적으로 부각되면서 유기합성 농약의 성장세가 크게 둔화되고 있으며, 이에 반해 최근에는 환경친화적인 미생물농약의 개발에 대한 연구가 활기를 띄고 있고, 많은 길항 미생물 및 미생물제제가 개발되고 있다. 그 예로 약 40여 종의 미생물농약 제품이 전세계적으로 식물병의 방제용으로 시판되고 있으며, 우리나라에서도 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용한 딸기 잿빛곰팡이병의 미생물농약의 개발이 보고되었으나, 미생물농약으로서 품목이 고시되지 않고 있는 실정이다.

보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 생물학적 방제에 대한 보고로 저장성 병인 배 잿빛곰팡이병의 생물학적 방제를 위하여 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus)와 바실러스 아밀로리크엔파시엔스(B. amyloliquefaciens)를 이용한 보고가 있으며(Nari et al., 1996, Biological control 7: 30-37), 트리코델마 하지아늄(Trichoderma harzianum)을 이용한 포도나무, 콩 잿빛곰팡이병 방제(Zimand et al., 1996, Phytopathology 86: 1255-1260; Harman et al., 1996, Biological control 7: 259-266)와 글리오클라디움 로제움(Gliocladium roseum), 울로클라디움 아트룸(Ulocladium atrum)에 의한 시클라멘의 잿빛곰팡이병 방제(Kohl et al., 1998, Phytopathology 88: 568-575), 효모(Yeast)에 의한 사과 잿빛곰팡이병 방제(Filonow et al., 1996, Biological control 7: 212-220), 슈도모나스 플루오르센스(Seudomonas fluorescens)에 의한 피튜니어 잿빛곰팡이병 방제(Gould 등, 1996, Plant Dis. 80: 1029-1033), 슈도모나스 세파시아(P. cepacia)에서 분리된 항생물질인 피롤니트린(Pyrrolnitrin)을 이용한 사과, 배 및 장미의 잿빛곰팡이병 방제(Janisiewicz et al., 1988, Phytopathology 78: 1697-1700; Hammer et al., 1993, Plant Dis. 77: 283-286) 등의 생물학적 방제에 관한 보고가 있다. 또한, 딸기에 발생한 잿빛곰팡이병을 방제하기 위해 글리오클라디움 로제움(Gliocladium roseum), 페니실리움 속(Penicillium sp.). 트리코델마 비리데(Trichoderma viride)균을 이용하였으며(Sutton 등, 1993, Phytopathology 83: 615-621), 양상추 및 사과의 잿빛곰팡이병에 대해서는 바실러스 속(Bacillus spp.)을 이용한 보고가 있다(Choi, Y. C. Control of fungal diseases with antagonistic bacteria, Bacillus sp. AC-1. Proc. Int. Symp. on Biological control of plant diseases: 50-61; Li, Debao, Biological control of plant diseases with Bacillus species. Proc. Int. Symp. on Biological control of plant diseases. pp. 75-85).

현재 잿빛곰팡이병원균인 보트리티스 시네리아 방제용 미생물농약으로 감귤나무와 이과류 재빛곰팡이병 방제용인 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae)를 이용한 바이오세이브(Bio-save) 110과, 딸기, 포도나무 방제용인 트리코델마 하지아늄(Trichoderma harzianum)을 이용한 트리코덱스(Trichodex)등의 제품이 시판되고 있으나, 이들은 저장성 병의 방제용 미생물농약이며 작물 살포용은 거의 개발되어 있지 않다. 특히, 바실러스 속 중에서도 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주는 타 연구에서 항생물질 분비로 마이크로스포륨 캐니스(Microsporum canis), 뮤코 뮤세도(Mucor mucedo), 뮤코 플럼베우스(M. plumbeus), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 길항력을 나타낸다는 보고는 있으나, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)에 의한 잿빛곰팡이병의 생물학적 방제에 대한 연구는 전무한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 균 또는 진균에 대해 우수한 길항능력을 갖는 균주를 선별하였고, 상기 균주를 동정한 결과 신규한 바실러스 리케니포미스 균주임을 밝혔으며, 이를 이용한 미생물제제가 잿빛곰팡이병을 비롯한 식물의 병해 방제에 효과적임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항균 또는 항진균 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스 및 상기 균주를 포함하는 식물의 균 또는 진균 방제용 미생물제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항진균 활성을 갖는 신규 바실러스 리케니포미스를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물제제 및 그의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항진균 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스를 제공한다.

본 발명에서는 토양에서 분리한 미생물 중에서 잿빛곰팡이병원균의 균사생장 및 분생포자 발아 억제 효과가 큰 균주를 1차적으로 선발하였고, 상기 길항균들의 잿빛곰팡이병 억제 효과를 검정하여 발병억제 효과가 가장 큰 균주를 최종 길항균으로 선발하였다(표 5, 표 6, 표 7 참조). 상기 길항 균주의 동정을 위해 균주의 균학적 성질을 조사한 결과, 하기 표 1과 같은 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 가지고 있음을 확인하였다.

테스트	N1 균주	바실러스 리케니포미스
그람 염색	+^a	+
내생포자(Endospore)	+	+
세포 직경 > 1.0 ㎛	-	-
혐기성 성장(Anaerobic growth)	+	+
NaCl 2%에서 성장	+	+
NaCl 5%에서 성장	+	+
NaCl 7%에서 성장	+	+
5℃에서 성장	+	-
10℃에서 성장	-	-
30℃에서 성장	+	+
40℃에서 성장	+	+
50℃에서 성장	+	+
카세인의 가수분해	+	+
젤라틴의 가수분해	+	+
전분의 가수분해	+	+
질산염 환원(Nitrate reduction)	+	+
시트르산 이용(Utilization of Citrate)	+	+
보게스-프로사카우어 테스트(Voges-prosakauer test)	+	+

^a + : 90% 이상 일치, - : 90% 이상 불일치

또한, 상기 균주의 16S rRNA 서열을 분석한 결과, 염기서열은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)와 99% 이상의 상동성을 보였으며, 상기의 염기서열은 첨부된 서열번호 1에 기재된 바와 같다. 상기 결과로부터 본 발명에서 분리한 항진균 활성 균주를 바실러스 리케니포미스로 동정하였다. 본 발명에서는 상기 균주를 "바실러스 리케니포미스 N1"이라 명명하고, 이를 2002년 7월 31일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10319BP).

또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스 N1를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물제제 및 그의 제조방법을 제공한다.

상기에서 바실러스 리케니포미스 N1은 항진균 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스이며, 구체적으로 바실러스 리케니포미스 N1(수탁번호 : KCTC 10319BP)인 것이 바람직하다.

본 발명의 미생물제제에 이용된 바실러스 리케니포미스는 진균에 대한 길항능력을 갖고 있으므로, 상기 균주를 이용하는 미생물제제는 식물의 병해를 방제하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 미생물제제는 식물병원성 진균에 대한 방제 효과를 나타내며, 구체적으로 잿빛곰팡이병원균, 균핵병균, 밑둥썩음병, 검은무늬병 및 시들음병 등과 같은 진균에 대해 방제효과를 나타낸다. 상기에서 잿빛곰팡이병원균은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)이다. 본 발명의 미생물제제를 적용할 수 있는 작물은 특별히 제한되지는 않으며, 들깨, 결구상추(양상추), 딸기, 토마토, 오이 등의 경제작물 이외에도 화훼 또는 특용작물에도 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물제제는 여러 가지 형태로 제조될 수 있으며, 구체적으로 수화제, 액제 또는 유제의 형태로 제조될 수 있다.

상기 바실러스 리케니포미스 N1은 글루코스, 전분, 솔비톨(sorbitol) 및 이노시톨(inositol)로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소원을 첨가하고, 트립톤(tryptone), 쇠고기 추출물, 효모 추출물 및 맥아정(malt extract)으로 구성된 군으로부터 선택되는 질소원을 첨가한 배지에서 배양하는 경우에 항진균 활성이 우수하게 나타난다(표 7 및 표 8 참조).

또한, 상기 바실러스 리케니포미스 N1을 대량으로 배양할 경우에는 비지, 밀기울, 대두박, 깻묵, 볏짚 등의 농가 부산물 및 농가 폐기물을 대량 배양용 기질로 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비지, 어묵, 밀기울, 대두박, 보리맥아, 깻묵, 미강(rice bran), 단술, 쌀가루 및 볏짚으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상을 포함하는 배지에서 바실러스 리케니포미스 N1을 배양하였다. 상기 배지 성분 중에서 비지를 이용하는 배지는 대량 배양시 길항 미생물의 밀도가 높고, 시중에서 비교적 쉽게 구할 수 있으며 염가여서 배지의 가격을 낮출 수 있을 뿐만 아니라, 식물에 영양원이 되고 농약의 잔류 독성과 같은 환경 오염에 대한 우려도 없어 환경 보호 측면에서도 유리하다(도 6 참조).

또한, 본 발명의 미생물제제는 바실러스 리케니포미스 N1의 배양액에 생체고분자물질, 천연중합체 또는 광물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기에서, 생체고분자물질은 쌀가루, 콩가루, 호박가루, 솔잎가루, 시금치가루, 밀가루 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 천연중합체는 전분, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 피브리노겐, 엘라스틴, 지방, 셀룰로스, 셀룰로스유도체, 에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 광물질은 질석, 흙, 세라믹 및 알긴산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 미생물제제는 글루코스 또는 무기질을 추가로 포함할 수 있으며, 무기질로는 CaCO₃, FeSO₄·7H₂O 또는 MnCl₂·4H₂O 를 사용할 수 있으나 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 미생물제제인 소이제제(soy formulation)는 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 배양액에 천연고분자물질인 콩가루, 쌀가루, 글루코스 또는 트립톤을 잘 혼합하고 수화제, 입제 또는 유제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 혼합후 건조하고 마쇄하여 수화제로 제조하였다.

또한, 본 발명의 미생물제제는 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 배양액에 콩가루, 쌀가루, 글루코스 및 무기질을 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 바실러스 리케니포미스의 배양액 1 ℓ에 대하여 콩가루 200∼300 g, 쌀가루 200∼300 g, 글루코스 4.0∼5.0 g, FeSO₄7H₂O 0.1∼0.3 g 및 MnCl₂H₂O 0.02∼0.01 g을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 미생물제제는 액체형 미생물 전달매체 1 ㎖ 당 바실러스 리케니포미스를 2×10⁹ 세포 이상 포함하는 것이 바람직하며, 2×10⁹∼2×10¹¹세포/㎖로 포함하는 것이 바람직하고, 2×10¹¹∼9×10¹²세포/㎖로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 미생물제제는 식물의 종자, 식물체, 식물체가 생장하고 있는 토양 중 적어도 하나에 대해 상기 미생물제제를 코팅, 혼합 또는 분무하여 처리할 수 있다. 본 발명의 미생물제제는 식물엽면살포제로서 식물 전체 또는 토양에 분무처리할 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물제제는 상기 미생물제제의 조성에 더하여 부형제(excipient), 희석제(diluent), 규조토, 제올라이트, 화이트카본 등의 광물질 담체(carrier), 각종 첨가제 또는 계면활성제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 미생물제제의 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 검정한 결과, 기존의 화학농약에 비하여 높은 방제효과를 나타내는 것으로 확인되었다(표 10 참조). 또한, 본 발명의 미생물제제는 안정성이 높아서 장기간 보관하여도 방제효과에는 변함이 없다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 잿빛곰팡이병원균 및 병원성 검정

본 발명자들은 잿빛곰팡이병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) LVF12 균주(이하 "LVF12"라 약칭한다)를 사용하였으며, 상기 균주는 1997년과 1998년에 부산시 강동지역의 들깨 재배 하우스내에서 잎마름 증상 및 줄기 정단부의 잘록 증상을 띄는 들깨로부터 순수 분리된 것으로 병원균의 특성과 병원성 검정 결과를 통해 들깨 잿빛곰팡이병원균으로 확인된 균주이다(도 1).

본 발명자들은 상기 LVF12 균주의 들깨에 대한 분생포자를 이용한 병원성 검정에 효과적인 포자부유액을 개발하기 위하여, 살균수, PDB(potato dextrose broth, Difco, USA) 및 10% 토마토 쥬스(상품명: 가야)에 PDA 배지(potato dextrose agar, Difco, USA)에서 3주간 배양하여 형성된 LVF12 균주의 분생포자를 부유하여 ㎖당 10⁶개의 농도로 조정한 포자부유액을 들깨에 접종하였다. 처리군 당 5주씩 들깨 잎에 분무접종하여 상대습도 90% 이상, 20±2℃ 생육상에 보관하였으며 처리 7일 후부터 발병도를 조사하였다.

그 결과, 살균수를 이용한 포자부유액에서는 발병이 전혀 일어나지 않았고, PDB 포자부유액에서는 76.0%의 발병도를 보인 반면, 10% 토마토 쥬스를 이용한 포자부유액에서는 85.0%의 높은 발병도를 보여 10% 토마토 쥬스를 영양원으로 사용하는 것이 가장 효과적인 것으로 나타났다(표 2).

분생포자 부유액	발병도(%)
살균수(SW)	0
감자액체배지(PDB)	76.0
10% 토마토쥬스(Tomato)	85.0
대조군(무처리)	0

<실험예 2> 들깨 품종간 저항성 검정

본 발명자들은 농가에서 많이 재배되면서 각종 형질이 우수한 광양, 구례3-13, 고성재래종, 진주재래종, 잎들깨 1호-1, 밀양, 추부종, 옥동, 경신, 하동, 구포 등 11 품종의 들깨를 이용하여 LVF12 균주에 의한 발병도를 조사하였다. 구체적으로, 품종간 저항성 정도를 검정하기 위하여 PDA 배지상에서 3주간 배양하여 형성된 공시 병원균 LVF12 균주의 분생포자를 병원성 검정에 효과적인 포자부유액인 것으로 확인된 10% 토마토 쥬스에 부유하여 ㎖당 1×10⁶개의 농도로 조정한 것을 접종원으로 하여 품종별로 각 3주씩 들깨 잎에 접종한 후 상대습도 90% 이상, 20±2℃의 생육상에 보관하였으며 처리 8일 후 발병도를 조사하였다.

그 결과, 공시한 11 품종 모두 높은 발병도를 보여 상기 잿빛곰팡이병에 대한 품종간 저항성은 높지 않은 것으로 확인되었으며, 그 중에서 밀양품종이 46.7%로 발병도가 가장 낮은 것으로 나타났다(표 3).

들깨 품종간 저항성 검정

품 종	발병도(%)
옥동(Okdong)	61.7
구포(Gupo)	53.3
광양(Kwangyang)	83.3
페릴라1-1(Perilla 1-1(small))	76.7
밀양(Milyang)	46.7
추부(Chubu)	75.0
구례 3-13(Gurae 3-13)	80.0
경신(Kyungsin)	58.3
고성 재래(Gosung jerae)	78.3
하동(Hadong)	56.7
진주 재래(Jinju jerae)	78.3

<실시예 1> 잿빛곰팡이병원균에 대한 길항미생물의 선발

본 발명자들은 경남 김해지역의 들깨잎과 근권토양에서 분리한 미생물 250 균주를 공시하여 잿빛곰팡이병원균 LVF12 균주의 균사생장 및 분생포자 발아 억제 효과가 큰 균주를 1차적으로 우선 선발하였으며, 상기 길항균의 발병억제 효과를 검정하여 발병억제 효과가 큰 균주를 최종 길항균으로 선발하였다. 균사생장 억제효과는 감자한천평판(PDA) 배지상에서 공시 미생물과 LVF12 균주를 대치배양하여 저지대의 크기를 조사함으로써 결정하였다. 구체적으로, 포자발아 억제 효과는 공시 미생물을 영양배지(NB, nutrient broth, Difco, USA)에서 30℃로 5일간 진탕배양하고 원심분리한 상등액을 0.22 ㎛ 필터(밀리포어)로 여과한 배양여액에 LVF12 균주의 분생포자를 혼합한 후 물한천 배지(Water agar, Difco, USA)에 1 ㎖를 도말하고 12시간 및 48시간 후에 포자 발아율을 조사하였다. 배양여액 대신 살균수와 혼합한 것을 대조군으로 사용하여 비교하였다. 또한, 상기와 동일한 방법으로 여과한 배양여액을 PDA 배지상에 도말한 후 공시병원균의 균사절편을 치상하여 균사생장에 미치는 영향도 조사하였다. 1차적으로 선발된 길항균을 이용한 발병 억제효과를 생육상 내에서 포트검정하기 위하여, 감자한천평판(PDA) 배지상에서 3주간 배양하여 형성된 LVF12 균주의 분생포자를 10% 토마토 쥬스에 부유하여 ㎖당 10⁷개의 농도로 조정한 포자부유액과 영양 배지에서 5일간 진탕배양한 선발 길항균을 병원균과 비슷한 농도로 조정하여 같은 양을 혼합한 후 각 5주씩 들깨잎에 분무 접종한 후 상대습도 90% 이상, 20±2℃의 생육상에서 보관하면서 처리 7일 후 발병도를 조사하고 병원균만을 처리한 대조군과 비교하여 방제가를 환산하였다.

그 결과, 잿빛곰팡이병원균 LVF12에 대하여 길항능력을 갖는 6개의 균주를 선별하여, 이들을 각각 N1, N2, N3, N4, N5 및 N6라 명명하였다. 상기 균주들은 모두 우수한 균사생장 억제효과를 보였으며, 그 중에서도 N1 및 N4 균주에 의한 억제효과가 가장 높았다(표 4 및 도 2).

길항 미생물에 의한 병원균의 생육 저지효과

길항 미생물	생장 저지대 (㎜)^a
N1	35.0
N2	24.0
N3	22.0
N4	37.0
N5	25.0
N6	27.0

^a생육저지대; 배양 7일 후 조사

본 발명자들은 N1 및 N4 균주의 배양여액에 병원균 LVF12 균주의 분생포자를 혼합한 후 포자발아율을 조사한 결과, 길항세균을 처리하지 않은 살균수의 경우 분생포자 발아율은 처리 48시간 후에 90% 이었으나, N1 또는 N4 균주를 처리한 경우에는 발아가 100% 저지되었다(표 5). 또한, 배양여액이 이용된 감자한천평판(PDA) 배지상에서는 균사생장이 매우 느렸고, 균사형태도 심하게 변형되었다(도 3). 균사생장 및 포자발아 억제효과가 높아서 일차적으로 선발된 세균 6균주에 의한 발병 억제효과를 생육상내에서 포트 검정한 결과, 공시 6균주 모두 70% 이상의 방제가를 보였으며, N1 균주에 의한 방제가 95.3%, N4 균주는 90.8%로 높은 방제가를 보였다(도 4). 따라서, 본 발명자들은 가장 높은 방제효과를 보이는 N1 균주를 잿빛곰팡이병균에 대한 길항균으로 최종 선발하였다.

길항세균에 의한 병원균의 분생포자 발아 억제 효과

길항 세균	분생포자 발아율 (%±S.D)^a
길항 세균	12시간 후	48시간 후
N1	0	0
N4	0	3±2
물	72±4	90±4

^a분생포자발아율; 물한천배지상에서 현미경으로 관찰

<실시예 2> 선발된 길항균에 의한 잿빛곰팡이병의 발병예방 및 치료효과 검정

감자한천평판(PDA) 배지상에서 3주간 배양하여 형성된 LVF12 균주의 분생포자를 10% 토마토 쥬스에 부유하여 ㎖당 10⁷개의 농도로 조정한 포자부유액과 NB 배지에서 5일간 배양한 N1 및 N4 길항균을 병원균과 비슷한 농도로 조정하였으며, 병원균을 먼저 접종한 후 3일 동안 1일 간격으로 길항균을 접종하고 발병도를 조사함으로써 길항균에 의한 발병 치료 효과를 조사하였다. 또한, 길항균을 먼저 접종한 후 3일 동안 1일 간격으로 병원균을 접종하고 발병도를 조사하여 발병 예방 효과를 조사하였다. 각 5주씩 들깨잎에 처리한 후 상대습도 90% 이상, 20±2℃의 생육상에 보관하면서 처리 7일 후 발병도를 조사하여 방제가로 환산하였으며, 방제가는 하기 수학식 1과 같이 계산하였다.

그 결과, N1 및 N4 길항균과 병원균을 동시 접종한 경우는 물론, N1 및 N4 길항균을 병원균 접종 1∼3일전과 병원균 접종 1∼3일 후에 처리하여도 방제가가 N1 균주에서 100%, N4 균주에서는 100∼87.3%로 나타났다(표 6). 상기 결과로부터, N1 및 N4 균주 모두 잿빛곰팡이병의 발병예방 및 치료효과가 뛰어남을 확인하였다.

선발된 길항균에 의한 발병예방 및 치료효과 확인

세균접종 후 경과된 시간	발병도 (%)		방제가(%)
세균접종 후 경과된 시간	N1^a+Pa	Pa^b 단독	N1+Pa
3일 전	0.0	-	100
2일 전	0.0	-	100
1일 전	0.0	-	100
동시접종	0.0	73.3	100
1일 후	0.0	-	100
2일 후	0.0	-	100
3일 후	0.0	-	100

^aN1 : 길항세균 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)

^bPa 단독 : 병원균 단독 처리(Botrytis cinerea LVF12)

<실시예 3> 길항 세균의 동정

본 발명자들은 상기 실시예 1과 실시예 2에서 잿빛곰팡이병의 발병예방 및 치료효과가 확인된 N1 길항균을 동정하기 위하여, 광학현미경(x1,000) 및 전자현미경(SEM, Hitachi, Japan)으로 균주의 크기와 형태를 관찰하였으며, 버기스 메뉴얼(Bergey's manual)(Bergey's manual of Systematic Bacteriology. 1986. Williams & Wilkins)에 따라 생화학적, 배양적 및 생리적 특성을 조사하였고(표 1), 아울러 API 20E와 50CHB 킷트(bioMerieux, France)를 이용하여 동정하였다.

그 결과, 상기 N1 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 살펴보면, 상기 균주는 그람 양성이고, 내생포자를 형성하며, 세포 직경은 1 ㎛ 이하이고, 혐기성에서도 성장하며, 2 내지 7% NaCl 농도에서도 성장하였다. 또한, 카세인, 젤라틴 및 전분을 가수분해하였고, 질산염 환원, 시트르산 이용 및 보게스-프로사카우어르 테스트에서 양성을 나타내어, 바실러스 리케니포미스와 동일한 특징을 갖는 것으로 나타났다(표 1 참조).

동정의 정확성을 기하기 위하여, API 시스템으로 동정하여도 N1 균주는 바실러스 리케니포미스와 유사도가 88.8%로 버기스 메뉴얼에 의한 동정과 일치하였다. 또한 16S rRNA 분석 결과, 상기 균주는 1,508 bp의 염기서열을 가지고 있으며, 상기 염기서열은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)와 99% 이상의 상동성을 보여, N1 균주는 바실러스 리케니포미스인 것으로 동정되었다.

본 발명자들은 상기에서 선별하고 동정한 N1 균주를 "바실러스 리케니포미스 N1"이라 명명하고, 이를 2002년 7월 31일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10319BP).

<실시예 4> 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 탄소원이 미치는 영향

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 영향을 주는 탄소원에 대하여 조사하였다. 길항균을 제제화하여 미생물제제를 만들기 위해 우선 균주의 길항력을 제고할 수 있는 탄소원과 질소원을 조사해야 하는데 먼저 바실러스 리케니포미스 N1에 의한 잿빛곰팡이병균의 균사생장 억제효과가 어느 탄소원에서 영향이 큰지를 조사하였다. 구체적으로, 콩가루 1%, FeSO₄·7H₂O 0.05%, MnCl₂·4H₂O 0.005%를 기본배지로 하고 여기에 공시 탄소원 1%를 첨가하여 멸균한 다음 길항세균을 접종하고 30℃에서 5일간 진탕배양하여 원심분리 하였다. 상기 상등액을 0.22 ㎛ 필터(밀리포어)로 여과한 후 5.0 ㎜ 페이퍼 디스크(paper disk)에 50 ㎕를 적시고 PDA 배지에 병원균과 페이퍼 디스크를 치상한 후 대치배양하여 병원균의 억제효과를 저지대로 표시하였다. 공시한 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 락토스, 말토스, 갈락토스, 전분(starch), 솔비톨(sorbitol), 이노시톨(inositol) 및 글리세롤이며, 이를 각각 1%씩 첨가하여 길항세균을 접종한 후 30℃, 160 rpm에서 진탕배양하였다. 48시간 배양 후, 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상등액을 여과(Milipore filter, 0.22 ㎛, USA)하고, 살균 페이퍼 디스크(직경 5.0 ㎜)에 여과액 50 ㎕를 처리하고, 자연건조시켜 PDA 배지에 병원균 절편(직경 8.0 ㎜)과 대치배양하여 잿빛곰팡이병원균의 균사생장 저지대의 직경을 조사하여 탄소원 종류에 따른 균사생장 저지효과를 비교하였다.

그 결과, 글루코스를 탄소원으로 사용하여 배양하였을 때 5.3 ㎜의 저지대를 보여 가장 높은 효과를 보였으며, 전분, 솔비톨 및 이노시톨을 탄소원으로 사용하여 배양하였을 때에서 억제효과를 보였다. 그러나 프럭토스, 락토스, 말토스 및 갈락토스를 탄소원으로 사용하여 배양하였을 때에는 전혀 억제효과가 없었다(표 7).

바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 탄소원이 미치는 영향

탄소원(1.0%)	생육저지대 (㎜)
글루코스	5.3
프럭토스	-
락토스	-
말토스	-
갈락토스	-
전분	3.2
솔비톨	2.3
이노실톨	2.1
글리세롤	-

<실시예 5> 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 질소원이 미치는 영향

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 영향을 주는 질소원에 대하여 조사하였다. 구체적으로, 잿빛곰팡이병균의 균사생장 억제효과가 어느 질소원에서 영향이 큰가를 조사하기 위해 글루코스 1%, FeSO₄·7H₂O 0.05%, MnCl₂·4H₂O 0.005%를 기본배지로 하고 여기에 공시 질소원 0.5%를 첨가하여 멸균한 다음 본 발명의 N1 균주를 접종하고 30℃에서 5일간 진탕배양하여 여과하였다. 저지대 조사방법은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다. 공시한 질소원은 (NH₄)₂SO₄, 카자민산(casamino acid), 트립신, 쇠고기 추출물(beef extract), 맥아정(malt extract), 효모 추출물(yeast extract)이고, 이를 각각 0.5% 첨가하였다.

그 결과, 공시한 질소원 중에서는 트립신에서 4.5 ㎜의 저지대를 보여 가장 효과적이었고, 다음은 쇠고기 추출물, 효모 추출물 및 맥아정 순이었으나, (NH₄)₂SO₄및 카자민산에서는 전혀 억제 효과가 없었다(표 8).

바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 질소원이 미치는 영향

질소원(0.5%)	생육 저지대(㎜)
(NH₄)₂SO₄	-
카자민산(casamino acid)	-
트립신	4.5
쇠고기 추출물(beef extract)	2.9
맥아정(malt extract)	2.3
효모 추출물(yeast extract)	2.8

<실시예 6> 바실러스 리케니포미스의 대량배양

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주를 대량배양하여 항진균 활성물질의 생산이 최적인 배지를 선발하였다. 구체적으로, 250 ㎖의 플라스크에 증류수 100 ㎖를 넣고, 대량배양 배지로서 시중에서 쉽게 구할 수 있고 염가인 비지, 밀기울, 대두박, 깻묵, 볏짚 등의 농가 부산물 및 농가 폐기물을 각각 5%씩 첨가하고 여기에 영양배지(Nutrient broth, Difco, USA)에서 24시간 배양된 N1 균주 2 ㎖(1×10⁷ 세포/㎖)를 접종하였다. 30℃, 160 rpm으로 72시간 배양하여 4시간 간격으로 세균의 밀도를 흡광광도계(spectrophotometer, 660 nm)로 측정하여 세균의 밀도가 최고에 도달하는 시점에서 세균밀도를 측정하였다. 비지가루는 시장에서 폐기하는 비지를 구하여 오븐에서 수분을 완전히 제거하여 말린 것을 사용하였으며 옥수수전분, 쌀가루, 보리맥아, 밀기울 등은 시중에서 판매하는 것을 구입하여 사용하였고, 미강, 볏집, 대두박 등은 농가에서 수집한 것과 수입품을 사용하였다. 간장생산부산물은 간장을 제조하고 남은 찌꺼기를 사용하였고, 어묵은 생선혼합물을 사용하였다. 단술을 제외한 모든 기질은 60℃에서 24시간 건조한 후 블랜더(Blender, Waring, USA)로 분쇄하여 사용하였다.

그 결과, 공시한 14종의 배지 중 비지 배지에서 10¹¹ 세포/㎖ 이상으로 세균 밀도가 가장 높았으며, 다음은 어묵, 밀기울, 대두박, 보리맥아, 깻묵, 미강(Rice bran), 단술, 쌀가루 및 볏짚 등에서도 효과적이었다(도 6).

<실시예 7> 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 제제화

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주를 이용하는 잿빛곰팡이병 방제용 미생물제제를 제조하였다. 구체적으로, 길항력 제고에 효과적인 것으로 확인된 글루코스 1.0%와 트립신 0.5%를 첨가한 영양배지(NB broth)에 본 발명의 N1 균주를 접종하여 30℃, 200 rpm에서 5일간 진탕배양한 후 배양액 1ℓ에 예비실험에서 콩가루, 쌀가루, 옥수수전분, 밀가루 등 여러 종류의 고분자 재료 중 방제효과가 확인된 콩가루, 쌀가루, 글루코스, FeSO₄·7H₂O 및 MnCl₂·4H₂O를 첨가하여 잘 섞은 다음 철판에 엷게 깔고 55℃에서 48시간 동안 건조시킨 후 블랜더로 분쇄하여 공시 길항세균을 포함하는 수화형 미생물제제를 제조하고, 이를 "소이(soy) 제제"라 명명하였다. 상기 제제의 구성성분을 하기 표 9에 정리하였다.

잿빛곰팡이병 방제용 소이 제제의 구성성분

대상 작물	제제명	구성성분/배양액 1 L
들깨	소이 제제	콩가루 200 g쌀가루 200 g글루코스 4.0 gFeSO₄7H₂O 0.1 gMnCl₂4H₂O 0.02 g

<실시예 8> 소이 제제에 의한 잿빛곰팡이병의 방제효과 검정

본 발명자들은 상기 실시예 7에서 제조한 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 소이 제제에 의한 들깨 잿빛곰팡이병의 방제효과를 하우스내에서 검정하였다. 구체적으로, 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 생균을 살균수에 부유한 생균부유액(10⁷세포/㎖), 영양배지(NB broth)에서 5일간 배양한 N1 균주의 배양액(10⁷세포/㎖), 부추 잿빛곰팡이병의 방제 약제로 품목 고시된 벤지미다졸계, 베노밀 수화제 2000배(농약사용지침서, 2000) 및 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 소이 제제 50배액(4×10⁸세포/㎖)과 비교하였는데, 이들을 각각 하우스내에 포트 재배한 10엽기의 들깨 잎 앞뒷면에 충분히 살포하고 건조한 후에 잿빛곰팡이 병원균 LVF12 균주의 분생포자 부유액(10% 토마토 쥬스에 10⁷세포/㎖로 조정)을 잎 앞뒷면에 골고루 살포하였으며, 상대습도 90% 이상, 20±2℃의 하우스내에서 보관하면서 7일 후 발병도를 조사하고 방제가로 환산하였다. 방제가는 하기 수학식 2에 의해 계산하였다. 또한 들깨는 감수성이 높은 것으로 확인된 광양품종을 사용하였다.

그 결과, 소이 제제의 방제가는 93.1%로, 배양액 처리(90.4%) 및 베노밀 수화제(86.1%) 보다 높았으며, 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 생균부유액 처리에서는 70.4%의 방제가를 보였다(표 10 및 도 7).

소이 제제의 방제효과 검정

처리 예	발병도 (%)	방제가 (%)
B 부유액^a	24.3	70.4b^f
N 부유액^b	7.9	90.4a
베노밀(화학농약)^c	11.4	86.1a
소이 제제^d	5.7	93.1a
병원균 단독 처리^e	82.1	0c

^a살균수로 제조한 세균부유액(1×10⁷ 세포/㎖)

^b5일간 배양한 세균배양액(1×10⁷ 세포/㎖)

^c2,000배 희석하여 살포한 화학농약 베노밀수화제

^d소이 제제: 바실러스 리케니포미스 N1 균주로 제조한 수화형제제 (4×10⁸ 세포/㎖).

^ePa : 병원균 단독처리(보트리티스 시네리아 LVF12)

^f 0.05 수준에서 DMRT

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 바실러스 리케니포미스는 잿빛곰팡이병원균에 대하여 우수한 항진균 활성을 갖고 있으며, 상기 균주를 이용한 미생물제제는 잿빛곰팡이병을 비롯하여 균핵병균, 밑둥썩음병, 검은무늬병 및 시들음병을 유발하는 작물병을 방제하는데 효과적일 뿐만 아니라, 저비용으로 미생물제제를 제조할 수 있으므로, 들깨, 토마토, 오이 및 딸기 등의 농작물의 병해 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 병원균 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 의한 들깨 잿빛곰팡이병의 병징을 나타낸 사진이다.

A, B, C : 자연발생된 잿빛곰팡이병의 병징 모습,

D, E : 인공접종된 잿빛곰팡이병의 병징 모습

도 2는 본 발명에서 선발한 길항세균 N1 및 N4 균주에 의해 잿빛곰팡이 병원균 생육이 억제되는 사진이다.

A : N1 균주, B : N4 균주

도 3은 본 발명에서 선발한 길항세균 N1 균주에 의해 잿빛곰팡이 병원균이 변형된 것을 현미경으로 관찰한 사진이다.

A : 정상적인 잿빛곰팡이병원균의 균사(X 400),

B : N1 균주에 의해 변형된 잿빛곰팡이병원균의 균사(X 400)

도 4는 들깨 포트재배에서 길항 균주 종류에 따른 잿빛곰팡이병의 방제효과를 나타낸 사진이다.

N1, N2, N3, N4, N5, N6 : 본 발명에서 선발한 길항 균주,

Pa : 보트리티스 시네리아 (잿빛곰팡이병원균)

도 5는 본 발명에 따른 바실러스 리케니포미스 N1을 전자현미경으로 관찰한 사진이다.

도 6은 본 발명의 바실러스 리케니포미스 N1을 쌀가루(A), 미강(B), 밀기울(C), 대두박(D), 깻묵(E), 보리맥아(F), 볏짚(G), 비지(H), 어묵(I), 단술(J), 간장생산부산물(K), 사과껍질(L), 귤껍질(M) 또는 뉴트리언트 배지(N)에서 배양하였을 때의 세포 밀도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 소이 제제에 의한 잿빛곰팡이병의 방제효과를 나타낸 사진이다.

A : 본 발명의 바실러스 리케니포미스 N1와 잿빛곰팡이병원균 보트리티스 시네리아를 함께 처리한 들깨 잎

B : 보트리티스 시네리아만을 처리한 들깨 잎

<110> Dong A university <120> Bacillus licheniformis N1 and microbial agent for preventing plant-pathogenic fungi containing the same <130> 2p-07-11 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1508 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis N1 <400> 1 agagtttgat tggctcaggc gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga 60 cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct 120 gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatagt tgtttgaacc 180 gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat 240 tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt 300 gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa 360 tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg 420 atcgtaaaac tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc caatagggcg gcaccttgac 480 ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540 gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat 600 gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa 660 gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt 720 ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac 780 aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt 840 ccgcccttta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag 900 actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960 gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaacccta gagatagggc 1020 ttccccttcg ggggcagcgt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg 1140 gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa 1260 ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg 1320 actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1380 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag 1440 gtaacctttt ggagccagcc gccgaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaacaa 1500 ggtagccg 1508

Claims

항진균 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스 N1(Bacillus licheniformis N1)(수탁번호: KCTC 10319BP).
삭제
제 1항의 바실러스 리케니포미스 N1를 포함하는 식물 병원성 진균 방제용 미생물제제.
제 3항에 있어서, 상기 진균은 잿빛곰팡이병원균인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 4항에 있어서, 상기 잿빛곰팡이병원균은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 3항에 있어서, 상기 식물은 들깨, 토마토, 오이, 딸기 및 양상추로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 3항에 있어서, 상기 미생물제제는 수화제인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 3항에 있어서, 상기 바실러스 리케니포미스는 글루코스, 전분, 솔비톨 및 이노시톨로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소원 및 트립톤, 쇠고기 추출물, 효모 추출물 및 맥아정으로 구성된 군으로부터 선택되는 질소원을 첨가한 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 3항에 있어서, 비지, 어묵, 밀기울, 대두박, 보리맥아, 깻묵, 미강, 단술, 쌀가루 및 볏짚으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 3항에 있어서, 상기 미생물제제는 바실러스 리케니포미스 N1의 배양액에 생체고분자물질, 글루코스, FeSO₄7H₂O 및 MnCl₂H₂O를 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 10항에 있어서, 상기 생체고분자물질은 쌀가루, 콩가루, 호박가루, 솔잎가루, 시금치가루 및 밀가루로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 10항에 있어서, 상기 미생물제제는 바실러스 리케니포미스의 배양액 1 리터에 대하여 콩가루 200∼300 g, 쌀가루 200∼300 g, 글루코스 4.0∼5.0 g, FeSO₄7H₂O 0.1∼0.3 g 및 MnCl₂H₂O 0.02∼0.01 g을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 1항의 바실러스 리케니포미스 N1를 배양하고, 상기 배양액에 생체고분자물질, 글루코스, FeSO₄7H₂O 및 MnCl₂H₂O를 첨가하는 것을 특징으로 하는 제 3항의 식물의 병원성 진균 방제용 미생물제제의 제조방법.