HU220582B1

HU220582B1 - Készítmény és eljárás növénybetegségek elleni védelemhez

Info

Publication number: HU220582B1
Application number: HU9602828A
Authority: HU
Inventors: Berndt Gerhardson; Annika Gustafsson; Margareta Hökeberg; Tiiu Jerkeman; Britt-Marie Jingström; Lennart Johnsson
Original assignee: Svenska Lantmännen Riksförbund ek.för.
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2002-03-28
Also published as: AU690683B2; DE69511691T2; ATE183616T1; DK0756454T3; US5900236A; BG100919A; EE03414B1; FI119994B; SK281576B6; CA2187927C; JPH10502803A; NO964359D0; BR9507322A; CA2187927A1; CN1148791A; GR3031952T3; LV11718B; UA43366C2; JP3536180B2; PL316910A1

Abstract

A találmány tárgya a Pseudomonas chlororaphis baktériumfaj új törzse,valamint készítmény növénybetegségek leküzdésére, amely aktívkomponensként az új baktériumtörzset vagy patogénellenes aktivitástmutató anyagcseretermékeit (vagy az ilyen anyagcseretermékekszármazékait) tartalmazza. A találmány további tárgya eljárás patogéngombák okozta növénybetegségek leküzdésére, melynek során a találmányszerinti készítményeket alkalmazzák. ŕ

Description

A találmány tárgyát növényvédelmi termékek képezik. Közelebbről, a találmány tárgya a Pseudomonas chlororaphis baktériumfaj új törzse, valamint e baktériumtörzset vagy az e baktériumtörzs által termelt, antibiotikum hatású anyagokat tartalmazó készítmények alkalmazása a növénytermesztésben, a növények fitopatogén mikrobiális anyagok károsító hatása elleni védelmében.

Több olyan mikrobiális eredetű anyag létezik, amely a terménynövényekben - növényi betegségek előidézésével - jelentős károkat, és ebből adódóan, gazdasági veszteségeket okoz. Az ilyen mikrobiális anyagok közül sok a leveleket és/vagy egyéb növényi részeket támadja meg, majd légi úton teijedő spórákkal új, nem fertőzött növényekre terjed át. Más mikrobiális anyagok vetőmaggal teijednek az egyik növénygenerációról a másikra, míg több, gazdaságilag jelentős károkat okozó betegségkeltő anyag a talajban teljed, oly módon, hogy többékevésbé inaktív alakban a talajban marad mindaddig, míg újabb fogékony növény nem fejlődik ki.

A növénytermesztésben a mikrobiális betegségkeltő anyagok megfékezésére alkalmazott eljárások gyakran költségesek, de a legtöbb növénytermesztési rendszerben nélkülözhetetlenek. Az egyik, széles körben alkalmazott eljárás a biosztatikus vagy biocid vegyszerekkel végzett kezelés, melyeket a legtöbb esetben permetként juttatnak a növényre, de alkalmazhatók a vetőmagvak vagy a gyökerek kezelésére és a talaj fertőtlenítésére is. Egyéb, hagyományos eljárásnak számít a rezisztens változatok kitenyésztése és magának a művelési rendszernek a megfelelő gondozása.

A fenti hagyományos eljárások bizonyos hátrányokkal járnak. A művelési rendszer gondozása csak néhány betegség esetében hatásos, illetve alkalmas. A rezisztens terménynövények kialakítása szintén csak bizonyos esetekben lehetséges, illetve alkalmas, továbbá hosszú időt vesz igénybe, és a kapott rezisztencia bizonyos idő elteltével, új patogéntörzsek megjelenése miatt megszűnik. A vegyszerek gyakran igen hatékonyan, azonban ártalmas hatást gyakorolhatnak a környezetre, óvatos bánásmódot igényelnek (mivel a legtöbb ilyen vegyszer ártalmas az emberre is), továbbá szintén hatástalanná válhatnak, ha rezisztens patogéntörzsek jelennek meg.

A biológiai növényvédő szerek vagy biopeszticidek alkalmazása az egyéb védekezési módszereknél hatásosabb és előnyösebb lehet, így az ilyen anyagokat széles körűen vizsgálják. Több baktérium- és gombatörzsről ismert, hogy gátolják a különböző betegségeket indukáló mikrobák szaporodását. Hatékonyságuk és alkalmazhatóságuk érdekében stabilaknak kell lenniük, a szántóföldön reprodukálható eredményt kell biztosítaniuk, és szabadföldi körülmények között alkalmazhatónak kell lenniük. Napjainkig kevés ilyen biológiai növényvédő szer felelt meg valamennyi követelménynek, s így nagyüzemi felhasználásra is csak kevés alkalmas.

A találmány tárgyát biológiai növényvédő szer képezi, amely előnyösen és hatékonyan alkalmazható a termesztett növényeket károsító patogénekkel szembeni védelemben. Közelebbről, a találmány tárgya a Pseudomonas chlororaphis baktérium új törzse (MA 342), amely rendelkezik a fentebb felsorolt tulajdonságokkal. A baktériumizolátumot a Budapest Szerződés értelmében, 1994. február 14-én, NCIMB 40616 deponálási számon a National Collections of Industrial and Maríné Bacteria Limited-nél (NCIMB) helyeztük letétbe.

A találmány további tárgya növénybetegség leküzdésére alkalmas készítmény, amely aktív komponensként az új MA 342 baktériumtörzset, vagy patogénellenes aktivitást mutató anyagcseretermékeit (vagy az ilyen anyagcseretermékek származékait) tartalmazza. A találmány további tárgya eljárás növénybetegségek leküzdésére, melynek során az új MA 342 baktériumtörzset, annak - lényegében azonos tulajdonságokkal rendelkező - mutánsait, vagy patogén elleni aktivitást mutató anyagcseretermékeit (vagy az ilyen anyagcseretermékek származékait) alkalmazzuk.

Az 1. ábrán az MA 342 baktériumizolátum - mikrobiális azonosítórendszerrel (Microbial Identification System, MIDI; Newark Ltd., USA) végzett analízissel kapott - zsírsavprofilját mutatjuk be.

A leírás további részletében az új baktériumtörzs karakterizálását, továbbá a baktériumok szaporítási eljárásai, a találmány szerinti készítmények, valamint - szántóföldön vagy melegházban történő - alkalmazásuk előnyös megvalósítási módjait mutatjuk be.

Az új MA 342 baktériumtörzs karakterizálása

Morfológiai tulajdonságok

TSA 10 táptalajon [1000 ml vízben 10 g tripszines szója tápleves (Triptic Soy Broth) (Difco Ltd.) és 12 g technikai agar (Oxoid Ltd.)] az MA 342 törzs telepmorfológiájára kerek, fehér, mérsékelten konvex telepek jellemzők, melyek az agarban, nagy sejtsűrűség esetén, jól látható hialinkristályokat képeznek. Ez a baktérium Gram-negatív pálca, amely Kings B táptalajon [1000 ml vízben 1,5 g K₂HPO₄; 1,5 g MgSO₄.7H₂O; 20 g „Proteose Pepton” (Difco Ltd.); 10 ml glicerin és 15 g Bacto agar (Difco Ltd.)] élénksárga fluoreszcenciát mutat.

Zsírsavanalízis

A baktérium zsírsavprofilját az 1. ábrán mutatjuk be. Az analízist a mikrobiális azonosítórendszer 3.7 változatának (MIDI Ltd., Newark, USA) alkalmazásával végeztük. E tesztelőprogram szerint az MA 342 törzs a Pseudomonas chlororaphishoz hasonlít legjobban (hasonlósági index=0,705).

Biokémiai jellemzők

Az API 20 NE gyorsteszttel Az MA 342 izo(API System Ltd., Franciaország) látum reakciója vizsgált jellemző

Nitrátredukció Indoltermelés Glükózból származó sav Arginin-dihidroláz +

Ureáz Eszkulin-hidrolízis Zselatin-hidrolízis + β-galaktozidáz

Glükóz-asszimiláció +

Arabinóz-asszimiláció 2

HU 220 582 Β1

Mannózasszimiláció	_?
Mannitolasszimiláció	+
N-acetil-glükóz-amin-asszimiláció	-
Maltózasszimiláció	-
Glükonátasszimiláció	+
Kaprátasszimiláció	-
Adipátasszimiláció	-
Malátasszimiláció	+
Citrátasszimiláció	+
F enil-acetát-asszimiláció	—
Citokróm-oxidáz	+
Egyéb módszerekkel tesztelt jellemzők: Levántermelés
Xilózasszimiláció	_?
Szorbitolasszimiláció	+?

Az új baktériumtörzs szaporításának, valamint a találmány szerinti készítmények, illetve a szántóföldi vagy melegházi alkalmazás előnyös megvalósítási módjai

Az aktív törzs tenyésztését legelőnyösebben fermentációs eljárással végezzük, melynek során a törzs tiszta tenyészetéből vett mintát rázatott folyadéktenyészetbe vagy megfelelő fermentációs tápközeget tartalmazó fermentorba oltjuk. A törzs steril felületen, például agaron is növeszthető; ilyen esetben a kinőtt sejteket vízben vagy más, ismert folyékony tápközegben szuszpendáljuk. Növesztő tápközegként bármilyen ismert bakteriális növesztő tápközeget alkalmazhatunk. A fermentációt megfelelő sejtkoncentráció [a folyadéktenyészetekben például körülbelül 5-10⁹ cfu/ml (telepképző egység/ml)] eléréséig végezzük. Az így kapott fermentációs táplevest vagy bakteriális szuszpenziót további változtatás nélkül alkalmazhatjuk a növényvédelemben, illetve a felhasználás előtt tovább kezelhetjük vagy készítményt állíthatunk elő belőle.

Az említett további kezelés egyik típusaként a fermentációs táplevesben lévő baktériumsejteket elpusztítjuk (például melegítéssel) vagy lecentrifugáljuk, és a kapott (bakteriális anyagcseretermékeket tartalmazó) táplevest vagy felülúszót - előzetesen tisztítva és/vagy bekoncentrálva, vagy előkezelés nélkül - növényvédelmi célokra használhatjuk fel. A baktériumszuszpenziókat vagy a fermentációs tápleveseket, egy vagy több ismert vegyülettel vagy vegyületcsoporttal elegyíthetjük feltéve, hogy az ilyen vegyületek összeférhetőek a baktériumtörzsekkel vagy azok patogénellenes anyagcseretermékeivel, illetve az anyagcseretermékek származékaival. Az erre a célra alkalmas vegyületek közé tartoznak a por alakú adalékanyagok vagy szilárd hordozók, mint például a talkum, kaolin, bentonit vagy montmorillonit, az ismert nedvesíthető (hidrofil) porok, a szénforrásként szolgáló tápanyagok (például glükóz, szacharóz és fruktóz), a komplex baktérium tápanyagok (mint például az élesztőkivonat, a bakterológiai pepton és tripton), fémsók, zsírsavak sói, zsírsav-észterek, ionos vagy nemionos felületaktív anyagok, növényi tápanyagok, növényi növekedésregulátorok, fúngicidek, inszekticidek, baktericidek és hasonlók. A baktériumszuszpenziókat és fermentációs tápleveseket a megfelelő vegyületekkel való elegyítés előtt vagy után száríthatjuk vagy liofilizálhatjuk, és ilyen esetben az így kapott terméket alkalmazzuk a növényvédelemben. A szárítás alkalmas módja például a bakteriális fermentációs táplevessel impregnált vermikulit levegővel végzett szárítása.

A bakteriális és anyagcseretermék-készítményeket a vetőmagvak, vegetatív szaporítóképletek, növények és a talaj kezeléséhez ismert módok bármelyikével alkalmazhatjuk. A céltól és az uralkodó környezeti feltételektől függően választhatjuk a permetezést, porlasztást, porozást, csávázási, fürdetést vagy öntözést. A magvak kezeléséhez az előnyös alkalmazási mennyiség rendszerint 10ⁿ-10¹⁴ cfú/ha (vagy a bakteriális anyagcseretermékek fentieknek megfelelő mennyisége.

1. példa

Az MA 342 mikroorganizmus izolálása

Az Empetrum nigrum növény kiásott gyökereit - a talajdarabok eltávolítása érdekében - steril csapvízben mostuk. Az egyik fiatal gyökéren, a gyökércsúcs feletti területről levágtunk egy 2-3 cm hosszú darabot, s ezt steril körülmények között kezeltük. A levágott gyökérdarabot lánggal sterilizált szikével bevagdostuk, majd TSA 10 agar felületéhez dörzsöltük. A baktériumok kinövése után az MA 342 sejteket összegyűjtöttük, és TSA 10 táptalajon tiszta tenyészetet hoztunk létre.

2. példa

Az MA 342 mikroorganizmus tartósítása

A tiszta tenyészetet kis ampullákban -70 °C-ra fagyasztottuk. Fagyvédő anyagként csapvízben oldott 10%-os glicerint (pH=7,15) alkalmaztunk (autoklávos kezelés után). A -70 °C-os fagyasztás után az ampullákat -20 °C-on tároltuk.

A hosszabb időtartamú tartósításhoz az izolátumot liofilizáltuk. A TSA 10 táptalajon végzett 48 órás növesztés után a baktérium sejtgyepet lekapartuk a táptalajról, és a sejteket liofilizáló védőanyaggal [1000 ml desztillált vízben 50 g Dextran T 70 (Pharmacia Fine Chemicals Ltd.) és 50 g Na-L-glutamát (Kebo AB)] elegyítettük, kis (20 ml-es) ampullákba töltöttük, majd az ampullákat 24 órára Hetosicc liofilizáló készülékbe (Heto Ltd., Dánia) helyeztük. A liofilizálás után az ampullákat gumidugóval légmentesen lezártuk, és 4 °C-on tároltuk.

3. példa

Az MA 342 Microdochium nivale elleni hatása az elsődleges melegházi vizsgálatokban

Az MA 342 baktériumokat búzaszemekre vittük fel, az alábbiak szerint. A 9 cm-es Petri-csészében, TSA 10 táptalajon 15 °C-on növesztett 24 órás tenyészeteket lekapartuk a táptalaj felületéről, és a sejteket 40 ml SNB tápoldattal (1000 ml vízben 18 g szacharóz; 5 g bakteriális pepton (Oxoid Ltd.); 2 g élesztókivonat (Oxoid Ltd.); 0,5 g K₂KPO₄; és 0,25 g MgSO₄.7H₂O;

HU 220 582 BI pH=7,2-7,4) és 40 ml 2 (m/V) %-os, desztillált vízben készített nátrium-(karboxi-metil)-cellulóz- (CMC) oldattal elegyítettük. A kapott elegyet a búzaszemekre öntöttük, majd 20 perc múlva a felesleges elegyet leöntöttük, és a szemeket ventilátor alatt szárítottuk.

Ebben a melegházi vizsgálatban végzett valamennyi kísérlethez két cserépbe egyenként 50 búzaszemet ültettünk. A cserepek 18 cm átmérőjűek és 4 cm magasak voltak, és kétharmad magasságig 20 (V/V)% homokkal kevert, sterilizálatlan tőzegkeverékkel (Enhetsjord K Normál) töltöttük meg őket.

A télibúzát („Kosack” fajtaváltozat) az M 342 baktériumokkal végzett kezelés előtt mesterségesen M. nivale-val fertőztük meg. A patogént szobahőmérsékleten, rázógépben hét napig burgonyadextróz táplevesben [1000 ml vízben 24 g burgonyadextróz tápleves (Difco Ltd.)] szaporítottuk. A kapott sűrű szuszpenziót konyhai robotgéppel homogenizáltuk, és a búzaszemekre öntöttük. 30 perc elteltével a folyadékot leöntöttük, és a magvakat ventilátor alatt egy éjszakán át szárítottuk. Az így megfertőzött szemeket ezután a fentiek szerint MA 342 sejtekkel kezeltük, és a cserepekbe ültettük.

A szemek elültetése után a cserepekre üvegfedelet helyeztünk, és a cserepeket 6 °C-on sötét helyre tettük. Öt nap múlva a fedeleket levettük, mindegyik cserepet 100 ml vízzel megöntöztük, majd két fapálcával kitámasztott 5 literes műanyag zsákba helyeztük. A cserepeket ezután 12-15 °C-on, 8 napig melegházban tartottuk.

Az alábbi kezeléseken átesett szemeket teszteltük:

1. M. nivale-val fertőzött szemek (SNB/CMC elegyben) P. choloraphis MA 342 törzzsel végzett kezelése;

2. M. nivale-val fertőzött szemek (kontroll);

3. Kezelés nélküli sejtek (egészséges kontroll).

A betegséget visszafojtó hatást az elvetett szemek közül kikelt egészséges (micéliumok nélküli) növények százalékos arányaként regisztráltuk. Egy jellemző, M. nivale-val végzett primer vizsgálat eredményeit az I. táblázatban mutatjuk be.

I. táblázat

Az MA 342 hatása az M. nivale-val fertőzött vetőmagvakból származó őszibúza kikelésére és a betegség kifejlődésére ⁴

Kezelés	Kikelési arány (%)	Egészséges növények elvetett szemekhez viszonyított %-os aránya
l.MA 342	87	81
2. Beteg kontroll	13	7
3. Egészséges kontroll	90	89

4. példa

Az MA 342 Dreschlera teres elleni hatása a másodlagos melegházi vizsgálatban Ezekhez a vizsgálatokhoz az MA 342 izolátumot órán keresztül rázógépen, 18-20 °C-on, sötétben, feles erősségű (15 g/1) tripszines szója táplevesben (Difco

Ltd.) növesztettük. A természetesen D. teres-szel fertőzött, „Golf’ fajtaváltozatú árpaszemeket műanyag zsákban a kapott baktériumszuszpenzió 300 ml-ével kevertük össze (1 kg árpaszemre számítva), majd a zsákot körülbelül 4 percig rázattuk. Az így kezelt szemeket szobahőmérsékleten, ventilátor alatt egy napig szárítottuk, majd a 3. példában leírtak szerint cserepekbe ültettük.

A beültetett cserepeket (mindegyik kezeléshez hármat) először 6 °C-on hét napra sötétszobába helyeztük, majd körülbelül 20 °C-on melegházban tartottuk (lásd 3. példa). A kezelés hatásának értékeléséhez a kibújt növények hányadát és az első levelükön elsődlegesen megtámadott növények hányadát számoltuk. A bakteriális hatást a kezeletlen kontrollra és a 4 ml/kg szem mennyiségben Panoctine Plus 400 íungiciddel (150 mg/1 guazatin + 10 g/1 imazalil) (Rhone-Poulenc Ltd.) kezelt szemekre vonatkoztattuk.

11. táblázat

Az MA 342 és a Panoctine Plus 400 D. teres elleni hatása egy árpával végzett jellemző másodlagos melegházi vizsgálatban

Kezelés	Kibújt növények %-os aránya	Az első levelükön megtámadott növények %-os aránya
Kontroll	92,5	13,0
Panoctine Plus 400*	95,5	0,0
MA 342, 300 ml/kg	96,1	0,0

*4 ml/kg

5. példa

Az MA 342 növényi patogének elleni hatása szántóföldi kísérletekben

A szántóföldi kísérleteket, melyeket véletlenszerű blokkokban és 3-8 ismétléssel végeztünk, 0,15 m² (az egyik T. caries kísérletnél) körülbelül 15 m² (a legtöbb kísérletnél) közötti nagyságú parcellákon végeztük. A kísérletekre Svédország különböző területein, a legtöbb esetben agyagos, körülbelül 3% humusztartalmú talajon került sor,

A szemek baktériummal és Panoctine Plus 400 íungiciddel végzett kezelését a 4. példában leírtak szerint végeztük. A kezelt szemeket ventilátorral megszárítottuk, különböző hosszúságú ideig, szobahőmérsékleten tároltuk, majd a szántóföldi parcellákba vetettük. Valamennyi mag, kivéve a T. caries-szel fertőzötteket, a különböző tesztelt betegségekkel természetesen fertőzött volt. A „Kosack” fajtaváltozatú őszibúzát T. caries spórákkal mesterségesen fertőztük oly módon, hogy 1 kg búzaszemmel 2 g összetört, T. caries-es kalászt kevertünk össze.

Az MA 342 Tilletia caries elleni hatása

A hatást az érett, fertőzött kalászok százalékos gyakoriságaként értékeltük. Az 1991/92-ben és 1992/93ban végzett két-két kísérlet eredményeit a III. táblázatban mutatjuk be. Az 1992/93-as kísérleteknél a bakté4

HU 220 582 Bl riumos és a fungicides kezelés eredménye között jelentős különbség volt.

III. táblázat

Az MA 342 baktériumszuszpenzió hatása a vetőmagon teijedő Tilletia caries fertőzéssel szemben

Kezelés	Fertőzött kalászok %-os aránya
1991/92	1992/93
Kontroll	23	65
Panoctine 400*, 4 ml/kg	2	24
MA 342,300 mg/kg	0	9

* Panoctine 400 (150 g/1 guazatin), Rhone-Poulenc Ltd.

Az MA 342 Dreschlera teres, D. gaminea, D. avenae és Ustilago avenae elleni hatása A felsorolt patogénekkel végzett szántóföldi kísérletekben a kibújt növények m²-enkénti számát és a fertő5 zött növények m²-enkénti számát mértük, továbbá, a legtöbb kísérletben mértük i) a szemhozamot; ii) ezer szem tömegét; és iii) a szemek hektoliterenkénti tömegét is.

Az MA 342 Dreschlera teres elleni hatása 10 Az 1991-1993-ban végzett szántóföldi kísérletekben az MA 342 árpa D. teres fertőzése elleni hatását teszteltük. Az eredményeket a IV., V. és VI. táblázatban mutatjuk be. A táblázatokban Pan. Plus jelentése Panoctine Plus 400 (4 ml/kg); MA 342 jelentése pedig

MA 342 baktériumszuszpenzió (300 ml/kg, ha másképpen nem jelezzük).

IV. táblázat

Dreschlera teres-szel fertőzött árpával 1991-ben végzett négy szántóföldi kísérlet eredményei (az alnarpi, lannai, strángnási és ultunai kísérletek eredményeinek átlaga)

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Növények száma/m²	Fertőzött növények/m²	Tömeg/hektoliter (kg)²	1000 szem tömege (g)
Kontroll	4970	361	47	64,7	41,5
Pan. Plus	5390	353	1	66,3	43,8
MA 342	5480	353	1	66,0	43,7

V. táblázat

Dreschlera teres-sz&l fertőzött árpával 1992-ben végzett öt szántóföldi kísérlet eredményei (a svalövi, nygárdi, kölbácki, ultunai és röbácksdaleni kísérletek eredményeinek átlaga)

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Növények száma/m²	Fertőzött növények/m²	Tömeg/hektoliter (kg)	1000 szem tömege (g)
Kontroll	4290	358	48	67,9	51,7
Pan. Plus	4380	378	1	67,8	50,5
MA 342	4300	380	1	68,3	52,6

VI. táblázat

Dreschlera teres-szel fertőzött árpával 1993-ban végzett két szántóföldi kísérlet eredményei 45 (a kölbácki és ultunai kísérlet eredményeinek átlaga) táblázatban mutatjuk be. A táblázatokban Pan. Plus jelentése Panoctine Plus 400 (4 ml/kg); MA 342 jelentése pedig MA 342 baktériumszuszpenzió (300 ml/kg, ha másképpen nem jelezzük).

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Fertőzött növények/m²
Kontroll	6310	74
Pan. Plus 400,4 ml/kg	6730	1
MA 342 200 ml/kg	6720	5

Az MA 342 Dreschlera graminea elleni hatása A D. graminea-val fertőzött magvakkal 1991-1993ban végzett kísérletek eredményeit a VII., VIII. és IX.

VII. táblázat

AD. graminea-val fertőzött árpával 1991-ben, Uppsala-ban végzett szántóföldi kísérlet eredményei

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Fertőzött növények/m²
Kontroll	3440	31
Pan. Plus 400,4 ml/kg	4160	2
MA 342,200 ml/kg	4390	1

HU 220 582 Bl

Vili. táblázat

A D. graminea-vaX fertőzött árpával 1992-ben végzett öt szántóföldi kísérlet eredményei (a svalövi, nygárdi, kölbácki, ultunai és röbácksdaleni kísérletek eredményeinek átlaga)

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Növények száma/m²	Fertőzött növények/m²	Tömeg/hektoliter (kg)	1000 szem tömege (g)
Kontroll	2590	383	101	66,2	40,2
Pan. Plus	3470	381	5	66,6	39,9
MA 342	3460	368	7	66,2	39,8

X. táblázat

IX. táblázat

A D. graminea-val fertőzött árpával 1993-ban végzett két szántóföldi kísérlet eredményei (a kölbácki és ultunai kísérletek eredményeinek átlaga)

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Fertőzött növények/m²
Kontroll	2810	46
Pan. Plus 400,4 ml/kg	4160	1
MA 342,200 ml/kg	3990	8

Az MA 342 Dreschlera avenae elleni hatása A D. avenae-\a\ fertőzött zabbal 1991-1993-ban végzett szántóföldi kísérletek eredményeit a X., XI. és XII. táblázatban mutatjuk be.

D. avenae-vaX fertőzött („Puhti”) zabbal 1991-ben, Uppsala-ban végzett szántóföldi kísérlet eredményei

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Fertőzött növények/m²
Kontroll	4940	74
Pan. Plus 400,4 ml/kg	4860	32
MA 342, 300 ml/kg	5090	17

XI. táblázat

D. avenae-vaX fertőzött „Puhti” és „Vitai” zabbal 1992-ben végzett négy szántóföldi kísérlet eredményei (a svalövi és ultunai kísérletek eredményeinek átlaga)

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Növények száma/m²	Fertőzött növények/m²	Tömeg/hektoliter (kg)	1000 szem tömege (g)
Kontroll	3990	428	22	57,5	35,4
Pan. Plus	4080	456	13	57,8	35,5
MA 342	4000	445	3	57,4	35,0

XII. táblázat 40

D. avenae-vaX fertőzött „Vitai” zabbal 1993-ban, Uppsala-ban végzett szántóföldi kísérlet eredményei

Kezelés	Hozam (kg/ha)	Fertőzött növények/m²
Kontroll	7570	79
Pan. Plus 400,4 ml/kg	7870	14
MA 342,200 ml/kg	7680	27

Az MA 342 Ustilago avenae elleni hatása Az U. avenae-vaX végzett szántóföldi kísérletekben a kalászok érésekor az üszkös kalászok m²-enkénti számát vagy az üszkös kalászok százalékos arányát értékeltük. Az 1991-1993-ban végzett három kísérletből ka- 55 pott eredményeket a XIII. táblázatban mutatjuk be.

XIII. táblázat

Kezelés	1991	1992	1993
Üszkös (fertőzött) kalászok
száma/m²	%-os aránya	száma/m²
Kontroll	7	10,6	95
Panoctine Plus 400*	3	8,7	nem teszteltük
MA 342**	1	1,7	15

* 4 ml/kg ** 1991-1992-ben 300 ml/kg; 1993-ban 200 ml/kg

HU 220 582 Bl

6. példa

Az MA 342 felvitele a magvakra és egyéb növényi részekre

MA 342 baktériumokat tartalmazó vizes elegyek felvitele magvakra

A 3. vagy 4. példában leírtak szerint előállított baktériumszuszpenziókat az alábbi anyagokkal, illetve vegyületekkel elegyítettük:

Talkumpor (Kebo Láb AB), a baktériumszuszpenzió térfogatára vonatkoztatva 48 g/1 koncentrációban;

Bakteriológiai pepton (Oxoid Ltd.), a baktériumszuszpenzió térfogatára vonatkoztatva 5 g/1 koncentrációban;

Tween 20 (Merck Ltd.), a baktériumszuszpenzió térfogatára vonatkoztatva 20 ml/1 koncentrációban;

Metocel (cellulóz-éter; Sveda Kemi AB), a baktériumszuszpenzió térfogatára vonatkoztatva 12 g/1 koncentrációban;

Lissapol (ICI Agrochemicals Ltd.), a baktériumszuszpenzió térfogatára vonatkoztatva 1 g/1 koncentrációban;

Bond (Newman Agrochemicals Ltd.), a baktériumszuszpenzió térfogatára vonatkoztatva 1 g/1 koncentrációban;

Más kísérletekben a baktériumszuszpenziókat 10 OOOxg-vel körülbelül 10 percig centrifugáltuk, és a kapott üledéket 0,1 M MgSO₄-oldatban vagy peptonvíz elegyben [1000 ml csapvízben 5 g bakteriológiai pepton (Oxoid Ltd.)] újraszuszpendáltuk. Alapos keverés után az elkészített szuszpenziókat - a 4. példában a nem elegyített baktériumszuszpenziókhoz leírtak szerint - vittük fel a magvakra.

Liofilizált baktériumok felvitele növényi magvakra

A 4. példában leírtak szerint rázatott tenyészetben növesztett MA 342 baktériumokat lecentrifugáltuk, és a kapott üledéket - liofilizáló védőanyagként - sovány tejporoldatban [1000 ml steril, desztillált vízben 200 g sovány tejpor (Semper AB, Svédország)] újraszuszpendáltuk. A kapott szuszpenziót üvegedényekben fagyasztottuk, majd ugyanezekben az edényekben, Hetosicc liofilizáló készülékben (Heto Ltd., Dánia) 48 óra hosszat liofilizáltuk. A kapott port felhasználásig műanyag tasakokban vagy csavaros fedelű műanyag palackokban, 4 °Con tároltuk. A magvak kezeléséhez a port vízben vagy egyéb vizes oldatokban elkevertük, és a magvakat a 4. példában a baktériumszuszpenziókhoz leírt módon kezeltük. Más módon, a magvakat műanyag edényben, száraz körülmények között alaposan összeráztuk a porral (egy kilogramm magra számítva körülbelül 10 g por felhasználásával).

Az MA 342 baktériummal kezelt magvak csávázása

A 4. példában leírtak szerint, rázatott tenyészetben növesztett MA 342 baktériumokat 1:1 térfogatarányban tapadást elősegítő anyaggal (2 m/V %-os nátriumkarboxi-metil-cellulóz vagy 50 m/V %-os vizes gumiarábikum oldat) elegyítettük. A magvakat ezzel az eleggyel a 4. példában leírtak szerint kezeltük. A műanyag zsákba ezután felesleges mennyiségben bentonitot (Dresser Minerals Inc.) vagy talkumport (Kebo Láb AB) tettünk, a zsákot felfújtuk, és néhány percig élénken ráztuk. A magvakat ventilátor alatt, nagy tálcákon szétterítettük, és szobahőmérsékleten száradni hagytuk.

A növények hajtásainak permetezése baktériumszuszpenzióval

A 4. példában leírtak szerint, rázatott tenyészetben növesztett MA 342 baktériumokat műanyag kézi permetezőbe vagy motoros permetezőgépbe töltöttük, és lepermeteztük a növények leveleit és hajtásait. Más módon, a baktériumokat először körülbelül 10 OOOxg-vel 10 percig centrifugáltuk, az üledéket csapvízben újraszuszpendáltuk, s az így kapott baktériumszuszpenziót használtuk a levelek és hajtások permetezéséhez.

7. példa

Az MA 342 baktériumokból származó, tisztított anyagcseretermékek Dreschlera teres okozta betegségek elleni hatásának vizsgálata melegházi kísérletekben

Az MA 342 izolátumot rázógépen, feles erősségű (15 g/1) tripszines szója táplevesben (Difco Ltd.), 18-20 °C-on, sötétben, 48 óra hosszat növesztettük. A kapott baktériumszuszpenziót 48 000 χ g-vel 30 percig centrifugáltuk, és a felülúszóban lévő anyagcseretermékeket Sep-pak C 18 töltetű oszlop (Waters Associates) alkalmazásával tovább tisztítottuk, az alábbiak szerint:

1) A felülúszó 80 ml-ét 10 ml metanollal aktivált Sep-pak oszlopra töltöttük;

2) A Sep-pak oszlopot először 5 ml 30%-os etanollal, majd 5 ml 40%-os etanollal mostuk;

3) Az anyagcseretermékeket 5 ml 70%-os etanollal eluáltuk;

4) A 70%-os etanollal kapott eluátumot rotációs párologtatón körülbelül 1,5 ml vizes oldat visszamaradásáig bepároltuk. A kapott oldatot csapvízzel 6,5 ml-re egészítettük ki.

A „Golf’ fajtaváltozatba tartozó árpa (D. teres-szei természetesen fertőzött) magvait 30 percig az anyagcseretermékek fenti, 6,5 ml térfogatú vizes oldatában áztattuk, majd cserepekbe ültettük (cserepenként 50 magot). A cserepeket üvegtetőkkel lefedtük, és 6 °C-on sötétbe helyeztük. Kilenc nap elteltével az üvegtetőket levettük, és a cserepeket körülbelül két hétre melegházba tettük (15-22 °C). A kicsírázott növények arányát és a megtámadott növények arányát a 4. példában leírtak szerint értékeltük. Kontrollként kezelés nélküli magvakat, illetve a Sep-pak oszlopon nem tisztított (és MA 342 sejteket tartalmazó) felülúszóval kezelt magvakat alkalmaztunk.

XIV. táblázat

Az MA 342 sejtek tisztított anyagcseretermékei, illetve az MA 342 sejteket tartalmazó felülúszó, árpa D. teres fertőzése elleni hatása egy jellemző melegházi tesztben

Kezelés	Kicsírázott növények %-os aránya	Az első levelükön megtámadott növények %-os aránya
Kezeletlen kontroll	97,0	21,6
Felülúszó MA 342 sejtekkel	99,0	1,0
Bepárolt, sejtmentes eluátum	99,0	0,0

HU 220 582 Bl

8. példa

Az MA 342 izolátummal és különböző tenyészeti gyűjteményekből származó 11 másik Pseudomonas chlororaphis izolátummal végzett összehasonlító tesztek eredményei

A találmány szerinti MA 342 izolátummal együtt 11 különböző, nem Svédországból származó Pseudomonas chlororaphis izolátumot (jelöléseket lásd a XV. táblázatban) árpa levélfoltosodása elleni hatásukra, illetve az API 20 NE tesztben biokémiai reakciók indukálására teszteltünk. Ezen felül, összehasonlítottuk az izolátumok agarlemezen mutatott telepmorfológiát és kristályképzését is. A 11 nem svédországi izolátum különböző országokból származott, melyeket négy különböző, neves tenyészeti gyűjteménynél helyeztek letétbe (lásd XV. táblázat).

A betegség kialakulását gátló képesség vizsgálata melegházi tesztekben

A teszteket Dreschlera teres-szel fertőzött árpával a

4. példában leírtak szerint végeztük. Annak érdekében, 20 hogy megfelelő összehasonlítást kapjunk, valamennyi izolátumot egyszerre teszteltük. Amint a XV. táblázat eredményeiből látható, az MA 342 izolátum a Dreschlera teres fertőzést gátló képesség szempontjából egyedülálló, mivel ebben a tesztben a többi tesztelt izolátum 25 egyike sem rendelkezett az MA 342 izolátuméhoz hasonló képességgel.

XV. táblázat

Az MA 342 és 11 másik P. chlororaphis izolátum jelölése, származási országa és árpa Dreschlera teres fertőzése elleni, melegházban tesztelt hatása

Izolátum jelölése	Származási ország	A levélfoltosodás elleni hatás melegházi tesztekben* (fertőzött növények %-os aránya)
MA 342	Svédország	9
USDA B2075	Csehszlovákia	53

Izolátum jelölése	Származási ország	A levélfoltosodás elleni hatás melegházi tesztekben* (fertőzött növények %-os aránya)
USDAB1869	Új-Zéland	60
USDA B14874	USA, Colorado	56
USDA B14869	USA, Illinois	58
USDA B1854	USA, Louisiana	43
NCTC 10686	Anglia	54
NCTC 7357	Anglia	58
DSM 6508	Németország	56
ATCC 9446	USA	61
ATCC 17414	USA	50
ATCC 17811	USA	58
Kezeletlen kontroll	71

* A fertőzött növények százalékos aránya a szóban forgó izolátummal végzett kezelés után.

Az API 20 NE tesztelő rendszer szerint végzett biokémiai tesztekben indukált reakciók

A teszteket a fentebb leírtak szerint végeztük. A XVI. táblázatban bemutatott eredményekből látható, hogy az MA 342 ebben a vonatkozásban is egyedülál30 ló, és megkülönböztethető a másik 11 tesztelt izolátumtól. Az általunk végzett teszt szerint a tesztelt izolátumok közül néhány a Pseudomonas chlororaphis fajon belül nem központi jelentőségű.

XVI. táblázat

A különböző izolátumok API 20 NE rendszerben végzett biokémiai tesztekben mutatott reakciói

Biokémiai tulajdonság	Tesztelt izolátum
MA	B	B	B	B	B
342	2075	1869	14 874	14 869	1854
Nitrátredukció	-	-	+	-	-	+
Indoltermelés	-	-	-	-	-	-
Glükózból származó sav	-	-	-	-	-	-
Arginin-dihidroláz	+	+	+	+	-	+
Ureáz	-	-	-	-	-	-
Eszkulin-hidrolízis	-	-	-	-	-	-
Zselatin-hidrolízis	+	+	-	-	-	+

HU 220 582 Bl

XVI. táblázat (folytatás)

Biokémiai tulajdonság	Tesztelt izolátum
MA	B	B	B	B	B
342	2075	1869	14 874	14 869	1854
β-galaktozidáz	-	-	-	-	-	-
Glükózasszimiláció	+	+	+	4-	+	4-
Arabinózasszimiláció	-	+	+	-	-	-
Mannózasszimiláció	-	+	+	-	+	+
Glükóz-amin-asszimiláció	-	+	+	-	-	4-
Maltózasszimiláció	-	-	-	-	-	-
Glükonátasszimiláció	+	-t-	+	+	+	4-
Kaprátasszimiláció	-	4-	+	+	+	+
Adipátasszimiláció	-	-	-	-	-	+
Malátasszimiláció	+	+	+	+	+	+
Citrátasszimiláció	+	+	4-	4-	+	4-
F enil-acetát-asszimiláció	-	-	+	+	+
Citokróm-oxidáz	+	-	+	+	+	+
	NCTC	NCTC	DSM	ATCC	ATCC	ATCC
	10 686	7357	6508	9446	17 414	17811
Nitrátredukció	+	+	+	+	+	+
Indoltermelés	-	-	-	-	-	-
Glükózból származó sav	-	-	-	-	-	-
Arginin-dihidroláz	+	+	4-	+	+	4-
Ureáz	-	-	-	-	-	-
Eszkulin-hidrolízis	-	-	-	-	-	-
Zselatin-hidrolízis	+	+	-	+	+	+
β-galaktozidáz	-	-	-	-	-	-
Glükózasszimiláció	+	+	+	+	+	+
Arabinózasszimiláció	+	-	+	-	-	-
Mannózasszimiláció	4-	+	+	+	+	4-
Glükóz-amin-asszimiláció	+	+	+		+	+
Maltózasszimiláció	-	-	-	-	-	-
Glükonátasszimiláció	+	+	+	4-	+	+
Kaprátasszimiláció	+	+	+	+	+	+
Adipátasszimiláció	-	-	-	-	-	-
Malátasszimiláció	+	+	4-	+	+	4-
Citrátasszimiláció	+	+	+	+	+	+
Fenil-acetát-asszimiláció	4-	+	+	-	-
Citokróm-oxidáz	-	+	4-	4-	+	+

A „+” jelek pozitív reakciót, a „-jelek negatív reakciót/a reakció hiányát mutatják.

HU 220 582 Bl

Az agarlemezen mutatott telepmegjelenés és kristályképzés összehasonlítása

Az izolátumokat a fentebb leírtak szerint, Petri-csészékben, TSA 10 táptalajon tenyésztettük. Valamennyi izolátum telepmorfológiái között voltak kis különbségek, azonban ezek alapján az izolátumok egyike sem volt elkülöníthető. Az MA 342 izolátum volt az egyetlen, amely agaron tipikus hialin kristályokat hozott létre, így e tulajdonsága alapján megkülönböztethető volt a többi izolátumtól.

Claims

1. Pseudomonas chlororaphis törzs, melyet a „The National Collections of Industrial and Maríné Bacteria Limited”-nél (Aberdeen, Skócia) NCIMB 40 616 deponálási számon helyeztünk letétbe, vagy e törzs biológiailag tiszta tenyészetei, amelyek patogénellenes aktivitással rendelkező anyagcseretermékek termelésére képesek.

2. Készítmény patogén gombák okozta növénybetegségek leküzdésére, azzal jellemezve, hogy aktív alkotórészként az 1. igénypont szerinti mikroorganizmust vagy annak patogénellenes aktivitással rendelkező anyagcseretermékeket tartalmazó tenyésztő tápközegét tartalmazza.

3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett patogén a Dreschlera teres nevű gomba.

4. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett patogén a Dreschlera graminea nevű gomba.

5. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett patogén a Dreschlera avenae nevű gomba.

6. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett patogén a Microdochium nivale nevű gomba.

7. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett patogén a Tilletia caries nevű gomba.

8. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett patogén az Ustilago avenae nevű gomba.

9. A 2-8. igénypontok szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórészt egy, a mezőgazdasági gyakorlatban elfogadott vivőanyag-készítménnyel keverve tartalmazza.

10. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórészt folyékony hordozóval elegyítve tartalmazza.

11. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórészt szilárd, porózus anyagba impregnálva tartalmazza.

12. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a fenti komponenseken kívül tapadást elősegítő anyagként szolgáló adalékot is tartalmaz.

13. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a fenti komponenseken kívül tápanyagforrást is tartalmaz.

14. Eljárás patogén gombák okozta növénybetegségek leküzdésére, melynek során egy aktív alkotórész hatásos dózisát a betegséget kiváltó anyag gátlásához alkalmas környezetbe juttatjuk, azzal jellemezve, hogy aktív alkotórészként az 1. igénypont szerinti mikroorganizmust vagy annak - patogénellenes aktivitással rendelkező anyagcseretermékeket vagy anyagcseretermékek származékait tartalmazó - tenyésztő tápközegét alkalmazzuk.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórészt a magvakra visszük fel.

16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórészt a növény szaporítóképleteire visszük fel.

17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórészt a növényekre visszük fel.

18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktív alkotórészt olyan növesztő tápközegbe tesszük, amelyben növényt nevelünk vagy növényt kívánunk nevelni.