JPH0928375A - トレハロースホスホリラーゼおよびその調製法 - Google Patents
トレハロースホスホリラーゼおよびその調製法Info
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- JPH0928375A JPH0928375A JP7201770A JP20177095A JPH0928375A JP H0928375 A JPH0928375 A JP H0928375A JP 7201770 A JP7201770 A JP 7201770A JP 20177095 A JP20177095 A JP 20177095A JP H0928375 A JPH0928375 A JP H0928375A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、新規なトレハロースホスホリラー
ゼの調製法およびその利用に関する。 【構成】 従来、トレハロースホスホリラーゼを生産す
ることが知られていない微生物、例えばリゾプス(Rhizo
pus)属、カエトミウム(Chaetomium)属に属する菌株を培
養するトレハロースホスホリラーゼの調製方法であり、
このようにして得られるトレハロースホスホリラーゼは
熱安定性に優れており、トレハロースおよびα−D −グ
ルコース １−リン酸の製造法が提供される。
ゼの調製法およびその利用に関する。 【構成】 従来、トレハロースホスホリラーゼを生産す
ることが知られていない微生物、例えばリゾプス(Rhizo
pus)属、カエトミウム(Chaetomium)属に属する菌株を培
養するトレハロースホスホリラーゼの調製方法であり、
このようにして得られるトレハロースホスホリラーゼは
熱安定性に優れており、トレハロースおよびα−D −グ
ルコース １−リン酸の製造法が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トレハロースホスホリ
ラーゼの製造方法およびその利用、新規なトレハロース
ホスホリラーゼ、特に温度安定性に優れたトレハロース
ホスホリラーゼおよびその製造方法およびその利用に関
するものである。
ラーゼの製造方法およびその利用、新規なトレハロース
ホスホリラーゼ、特に温度安定性に優れたトレハロース
ホスホリラーゼおよびその製造方法およびその利用に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、エンザイム・ノーメンクレイチャ
ー・１９９２(Enzyme Nomenclature1992、Academic Pre
ss )に、トレハロースホスホリラーゼとして、ユーグレ
ナグラシリス(Euglena gracilis）由来のＥＣ ２．
４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼが記載報告
されている。また、フラムリナ ベルチペス (Flammuli
na velutipes)より得られる酵素がα−グルコース １
−リン酸とグルコースからトレハロースを生成させるト
レハロースホスホリラーゼとして報告されている（FEMS
Microbiology Letters, 55, 147-150 (1988))。しか
し、上記文献に記載されているフラムリナ ベルチペス
(Flammulina velutipes)由来のトレハロースホスホリ
ラーゼは、酵素精製が困難で十分精製されていない。こ
の酵素が十分に精製できない原因として、この酵素の安
定性が低いためと考えられる。従って、その酵素として
の性質の記載が十分になされているとはいいがたい。例
えば、酵素のｐＨ安定性、温度安定性、至適反応温度、
酵素の分子量に関する記載がなく、また至適反応ｐＨ、
基質特異性に関して十分な記載がなされているとはいい
がたい。また、α−グルコース １−リン酸とグルコー
スからのトレハロースの生産性も満足できるものではな
い。エンザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２ (En
zyme Nomenclature 1992、Academic Press) に記載され
ているＥＣ ２．４．１．６４のトレハロースホスホリ
ラーゼは、β−D −グルコース １−リン酸とD −グル
コースからトレハロースを生成するトレハロースホスホ
リラーゼである。
ー・１９９２(Enzyme Nomenclature1992、Academic Pre
ss )に、トレハロースホスホリラーゼとして、ユーグレ
ナグラシリス(Euglena gracilis）由来のＥＣ ２．
４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼが記載報告
されている。また、フラムリナ ベルチペス (Flammuli
na velutipes)より得られる酵素がα−グルコース １
−リン酸とグルコースからトレハロースを生成させるト
レハロースホスホリラーゼとして報告されている（FEMS
Microbiology Letters, 55, 147-150 (1988))。しか
し、上記文献に記載されているフラムリナ ベルチペス
(Flammulina velutipes)由来のトレハロースホスホリ
ラーゼは、酵素精製が困難で十分精製されていない。こ
の酵素が十分に精製できない原因として、この酵素の安
定性が低いためと考えられる。従って、その酵素として
の性質の記載が十分になされているとはいいがたい。例
えば、酵素のｐＨ安定性、温度安定性、至適反応温度、
酵素の分子量に関する記載がなく、また至適反応ｐＨ、
基質特異性に関して十分な記載がなされているとはいい
がたい。また、α−グルコース １−リン酸とグルコー
スからのトレハロースの生産性も満足できるものではな
い。エンザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２ (En
zyme Nomenclature 1992、Academic Press) に記載され
ているＥＣ ２．４．１．６４のトレハロースホスホリ
ラーゼは、β−D −グルコース １−リン酸とD −グル
コースからトレハロースを生成するトレハロースホスホ
リラーゼである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のよう
な現状に鑑み、α−D −グルコース １−リン酸とD −
グルコースからトレハロースを生成し、かつ、温度安定
性に優れたトレハロースホスホリラーゼを提供すること
を課題とし、またこのようなトレハロースホスホリラー
ゼの調製方法、さらにこれらトレハロースホスホリラー
ゼを用いたトレハロース、α−D −グルコース １−リ
ン酸の製造方法を提供することを課題とする。本発明は
各種の糸状菌からα-D- グルコース 1-リン酸とD-グル
コースからトレハロースを生産する酵素を見いだしたこ
とによりなされたものであり、β−D−グルコース １
ーリン酸とD −グルコースとからトレハロースを生産す
る上記公知の酵素とは明らかに基質特異性が異なりまっ
たく別種の酵素である。以下、本発明において述べるト
レハロースホスホリラーゼとは、α−D −グルコース１
−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成する
ことができる酵素である。すなわち、本発明は、第一
に、従来トレハロースホスホリラーゼの産生が知られて
いない微生物によるトレハロースホスホリラーゼの調製
方法に関するものである。第二に、温度安定性に優れ、
より高温で反応する二つの新規トレハロースホスホリラ
ーゼに関するものである。第三に、トレハロースホスホ
リラーゼ生産微生物により調製されたトレハロースホス
ホリラーゼまたは温度安定性に優れた新規トレハロース
ホスホリラーゼを利用してトレハロースあるいはα−D
−グルコース １−リン酸を製造する製造方法に関する
ものである。
な現状に鑑み、α−D −グルコース １−リン酸とD −
グルコースからトレハロースを生成し、かつ、温度安定
性に優れたトレハロースホスホリラーゼを提供すること
を課題とし、またこのようなトレハロースホスホリラー
ゼの調製方法、さらにこれらトレハロースホスホリラー
ゼを用いたトレハロース、α−D −グルコース １−リ
ン酸の製造方法を提供することを課題とする。本発明は
各種の糸状菌からα-D- グルコース 1-リン酸とD-グル
コースからトレハロースを生産する酵素を見いだしたこ
とによりなされたものであり、β−D−グルコース １
ーリン酸とD −グルコースとからトレハロースを生産す
る上記公知の酵素とは明らかに基質特異性が異なりまっ
たく別種の酵素である。以下、本発明において述べるト
レハロースホスホリラーゼとは、α−D −グルコース１
−リン酸とD −グルコースからトレハロースを生成する
ことができる酵素である。すなわち、本発明は、第一
に、従来トレハロースホスホリラーゼの産生が知られて
いない微生物によるトレハロースホスホリラーゼの調製
方法に関するものである。第二に、温度安定性に優れ、
より高温で反応する二つの新規トレハロースホスホリラ
ーゼに関するものである。第三に、トレハロースホスホ
リラーゼ生産微生物により調製されたトレハロースホス
ホリラーゼまたは温度安定性に優れた新規トレハロース
ホスホリラーゼを利用してトレハロースあるいはα−D
−グルコース １−リン酸を製造する製造方法に関する
ものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、α−D −
グルコース １−リン酸とD −グルコースから温度安定
性に優れた、従来知られていないトレハロースホスホリ
ラーゼ生産微生物を求め鋭意研究した結果、アクレモニ
ウム（Acremonium）属、ビソチラミス（Byssoc hlamys）
属、セルコスポーラ（Cercospora）属、カエトミウム
（Chaetomium）属、グロメレラ（Glomerella）属、フミ
コラ（Humicola）属、ミセリオフィソーラ（Myceliopht
hora）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス
（Rhizopus）属、ロゼリニア（Rosellinia）属、スクレ
ロチニア（Sclerotinia)属、スポリジオボルス（Sporid
iobolus)属、ステリグマトミセス（Sterigmatomyces)
属、サーモアスクス（Thermoasucus）属、チエラビア
（Thielavia)属およびチロミセス（Tyromyces)属に属す
る微生物を培養することにより、これら微生物がトレハ
ロースホスホリラーゼを生産することを新たに見いだし
た。また、これら微生物の培養物から得られるトレハロ
ースホスホリラーゼは、温度安定性に優れていることを
見いだし本発明を完成するに至った。
グルコース １−リン酸とD −グルコースから温度安定
性に優れた、従来知られていないトレハロースホスホリ
ラーゼ生産微生物を求め鋭意研究した結果、アクレモニ
ウム（Acremonium）属、ビソチラミス（Byssoc hlamys）
属、セルコスポーラ（Cercospora）属、カエトミウム
（Chaetomium）属、グロメレラ（Glomerella）属、フミ
コラ（Humicola）属、ミセリオフィソーラ（Myceliopht
hora）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス
（Rhizopus）属、ロゼリニア（Rosellinia）属、スクレ
ロチニア（Sclerotinia)属、スポリジオボルス（Sporid
iobolus)属、ステリグマトミセス（Sterigmatomyces)
属、サーモアスクス（Thermoasucus）属、チエラビア
（Thielavia)属およびチロミセス（Tyromyces)属に属す
る微生物を培養することにより、これら微生物がトレハ
ロースホスホリラーゼを生産することを新たに見いだし
た。また、これら微生物の培養物から得られるトレハロ
ースホスホリラーゼは、温度安定性に優れていることを
見いだし本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、従来トレハロースホ
スホリラーゼを生産することが知られていない微生物に
よるトレハロースホスホリラーゼの製造方法に関するも
のである。具体的にはアクレモニウム（Acremonium）
属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、セルコスポーラ
（Cercospora）属、カエトミウム（Chaetomium）属、グ
ロメレラ（Glomerella）属、フミコラ（Humicola）属、
ミセリオフィソーラ（Myceliophthora）属、リゾムコー
ル（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、ロゼリ
ニア（Rosellinia）属、スクレロチニア（Sclerotinia)
属、スポリジオボルス（Sporidiobolus)属、ステリグマ
トミセス（Sterigmatomyces)属、サーモアスクス（Ther
moasucus）属、チエラビア（Thielavia)属およびチロミ
セス（Tyromyces)属に属しトレハロースホスホリラーゼ
生産能を有する微生物を培養し、培養物からトレハロー
スホスホリラーゼを採取することからなるトレハロース
ホスホリラーゼの製造法である。
スホリラーゼを生産することが知られていない微生物に
よるトレハロースホスホリラーゼの製造方法に関するも
のである。具体的にはアクレモニウム（Acremonium）
属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、セルコスポーラ
（Cercospora）属、カエトミウム（Chaetomium）属、グ
ロメレラ（Glomerella）属、フミコラ（Humicola）属、
ミセリオフィソーラ（Myceliophthora）属、リゾムコー
ル（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、ロゼリ
ニア（Rosellinia）属、スクレロチニア（Sclerotinia)
属、スポリジオボルス（Sporidiobolus)属、ステリグマ
トミセス（Sterigmatomyces)属、サーモアスクス（Ther
moasucus）属、チエラビア（Thielavia)属およびチロミ
セス（Tyromyces)属に属しトレハロースホスホリラーゼ
生産能を有する微生物を培養し、培養物からトレハロー
スホスホリラーゼを採取することからなるトレハロース
ホスホリラーゼの製造法である。
【０００６】また、本発明は、従来知られているトレハ
ロースホスホリラーゼより、高温で反応する新規トレハ
ロースホスホリラーゼに関するものであり、また、他の
発明は、リゾプス（Rhizopus）属およびカエトミウム
（Chaetomium）属に属する微生物を培養し、培養物から
新規トレハロースホスホリラーゼを採取することからな
るトレハロースホスホリラーゼの製造法である。
ロースホスホリラーゼより、高温で反応する新規トレハ
ロースホスホリラーゼに関するものであり、また、他の
発明は、リゾプス（Rhizopus）属およびカエトミウム
（Chaetomium）属に属する微生物を培養し、培養物から
新規トレハロースホスホリラーゼを採取することからな
るトレハロースホスホリラーゼの製造法である。
【０００７】また本発明は上記トレハロースホスホリラ
ーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラー
ゼおよび／または温度安定性に優れた新規トレハロース
ホスホリラーゼを用い、α−D −グルコース １−リン
酸とD −グルコースからトレハロースを製造するトレハ
ロースの製造法に関するものである。また、本発明は上
記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産される
トレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性
に優れた新規トレハロースホスホリラーゼを用いトレハ
ロースからα−D −グルコース １−リン酸を製造する
α−D −グルコース １−リン酸の製造法に関するもの
である。
ーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラー
ゼおよび／または温度安定性に優れた新規トレハロース
ホスホリラーゼを用い、α−D −グルコース １−リン
酸とD −グルコースからトレハロースを製造するトレハ
ロースの製造法に関するものである。また、本発明は上
記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産される
トレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性
に優れた新規トレハロースホスホリラーゼを用いトレハ
ロースからα−D −グルコース １−リン酸を製造する
α−D −グルコース １−リン酸の製造法に関するもの
である。
【０００８】以下本発明を具体的に説明する。本発明に
おいて使用する微生物は、アクレモニウム（Acremoniu
m）属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、セルコスポ
ーラ（Cercospora）属、カエトミウム（Chaetomium）
属、グロメレラ（Glomerella）属、フミコラ（Humicol
a）属、ミセリオフィソーラ（Myceliophthora）属、リ
ゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）
属、ロゼリニア（Rosellinia）属、スクレロチニア（Sc
lerotinia)属、スポリジオボルス（Sporidiobolus)属、
ステリグマトミセス（Sterigmatomyces)属、サーモアス
クス（Thermoasucus）属、チエラビア（Thielavia)属お
よびチロミセス（Tyromyces)属に属し、トレハロースホ
スホリラーゼの生産能を有する菌株であればいかなる菌
株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよい。ま
た、これらトレハロースホスホリラーゼ生産菌由来のト
レハロースホスホリラーゼｃＤＮＡを異種の微生物の発
現ベクターに組み込み、異種の微生物にこれらトレハロ
ースホスホリラーゼを発現できるように改良した菌株を
利用することもできる。
おいて使用する微生物は、アクレモニウム（Acremoniu
m）属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、セルコスポ
ーラ（Cercospora）属、カエトミウム（Chaetomium）
属、グロメレラ（Glomerella）属、フミコラ（Humicol
a）属、ミセリオフィソーラ（Myceliophthora）属、リ
ゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）
属、ロゼリニア（Rosellinia）属、スクレロチニア（Sc
lerotinia)属、スポリジオボルス（Sporidiobolus)属、
ステリグマトミセス（Sterigmatomyces)属、サーモアス
クス（Thermoasucus）属、チエラビア（Thielavia)属お
よびチロミセス（Tyromyces)属に属し、トレハロースホ
スホリラーゼの生産能を有する菌株であればいかなる菌
株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよい。ま
た、これらトレハロースホスホリラーゼ生産菌由来のト
レハロースホスホリラーゼｃＤＮＡを異種の微生物の発
現ベクターに組み込み、異種の微生物にこれらトレハロ
ースホスホリラーゼを発現できるように改良した菌株を
利用することもできる。
【０００９】具体的なトレハロースホスホリラーゼ生産
菌としては、アクレモニウム アラバメンセ（Acremoni
um alabamense）ＩＦＯ ３２２４１、ビソチラミス
ニベア（Byssochlamys nivea)ＩＦＯ ３０５６９、セ
ルコスポーラ ベチコラ（Cercospora beticola）ＩＦ
Ｏ ７３９８、カエトミウム サーモフィルム（Chae to
mium thermophilum）ＩＦＯ ９６７９、グロメレラ
シングラタ（Glomerella cingulata)ＩＦＯ７４７８、
フミコラ グリセア（Humicola grisea）ＩＦＯ ９８
５４、ミセリオフィソーラ サーモフィラ（Myceliopht
hora thermophila)ＩＦＯ ３１８４３、リゾムコール
プシルス（Rhizomucor pusillus）ＩＦＯ ４５７
９、リゾムコール ミエヘイ (Rhizomucor miehei) Ｉ
ＦＯ ９７４０、リゾプス キネンシス（Rhizopus ch
inensis)ＩＦＯ ３０４９９、リゾプス キネンシス
（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ ４７６８、リゾプス
キネンシス（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ ４７３７、
リゾプス アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus)Ｉ
ＦＯ ３１９８９ 、リゾプス ミクロスポルス（Rhizo
pus microsporus)ＩＦＯ ３１９８８、ロゼリニア
ネカトリクス（Rosellinia necatrix）ＩＦＯ ５９５
４、スクレロチニア スクレオチオルム(Sclerotinia
sclerotiorum) ＩＦＯ ４８７６、スポリジオボルス
ジョンソニ(Sporidiobolus johnsonii)ＩＦＯ ６９０
３、ステリグマトミセス ハロフィルス(Sterigmatomyc
es halophilus）ＩＦＯ １４８８、サーモアスクス
オウランチアクス (Thermoasucus aurantiacus)ＩＦＯ
３１６９３、チエラビア テレストリス(Thielavia
terrestris）ＩＦＯ ９７３２、チエラビア アレナリ
ア(Thielavia arenaria）ＩＦＯ ３１０６０およびチ
ロミセス パルストリス(Tyromyces palustris)ＩＦＯ
３０３３９等の菌株を使用することができる。
菌としては、アクレモニウム アラバメンセ（Acremoni
um alabamense）ＩＦＯ ３２２４１、ビソチラミス
ニベア（Byssochlamys nivea)ＩＦＯ ３０５６９、セ
ルコスポーラ ベチコラ（Cercospora beticola）ＩＦ
Ｏ ７３９８、カエトミウム サーモフィルム（Chae to
mium thermophilum）ＩＦＯ ９６７９、グロメレラ
シングラタ（Glomerella cingulata)ＩＦＯ７４７８、
フミコラ グリセア（Humicola grisea）ＩＦＯ ９８
５４、ミセリオフィソーラ サーモフィラ（Myceliopht
hora thermophila)ＩＦＯ ３１８４３、リゾムコール
プシルス（Rhizomucor pusillus）ＩＦＯ ４５７
９、リゾムコール ミエヘイ (Rhizomucor miehei) Ｉ
ＦＯ ９７４０、リゾプス キネンシス（Rhizopus ch
inensis)ＩＦＯ ３０４９９、リゾプス キネンシス
（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ ４７６８、リゾプス
キネンシス（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ ４７３７、
リゾプス アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus)Ｉ
ＦＯ ３１９８９ 、リゾプス ミクロスポルス（Rhizo
pus microsporus)ＩＦＯ ３１９８８、ロゼリニア
ネカトリクス（Rosellinia necatrix）ＩＦＯ ５９５
４、スクレロチニア スクレオチオルム(Sclerotinia
sclerotiorum) ＩＦＯ ４８７６、スポリジオボルス
ジョンソニ(Sporidiobolus johnsonii)ＩＦＯ ６９０
３、ステリグマトミセス ハロフィルス(Sterigmatomyc
es halophilus）ＩＦＯ １４８８、サーモアスクス
オウランチアクス (Thermoasucus aurantiacus)ＩＦＯ
３１６９３、チエラビア テレストリス(Thielavia
terrestris）ＩＦＯ ９７３２、チエラビア アレナリ
ア(Thielavia arenaria）ＩＦＯ ３１０６０およびチ
ロミセス パルストリス(Tyromyces palustris)ＩＦＯ
３０３３９等の菌株を使用することができる。
【００１０】また、本発明により得られたリゾプス（Rh
izopus）属由来のトレハロースホスホリラーゼ（以下、
「トレハロースホスホリラーゼＲ」と呼称する）は、次
の理化学的性質を有する。 １．作用：α−D −グルコース １−リン酸とD −グル
コースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロ
ース合成反応」と呼称する）。および無機リン酸の存在
下トレハロースに作用してα−D −グルコース １−リ
ン酸とD −グルコースを生成する。 ２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としては
トレハロースに作用する。二糖合成反応においては、糖
供与体としてα−D −グルコース １−リン酸に、糖受
容体としてD −グルコースに作用する。 ３．至適作用pH：トレハロース合成反応（４５℃） 最大活性の約５０％の活性を示すpH範囲：４．７から
６．７ ４．pH安定性：トレハロース合成反応：３．５から１
２．５ （３０℃、１時間） ５．至適反応温度：トレハロース合成反応（pH５．５） 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲：４２．５か
ら５０℃ ６．温度安定性：トレハロース合成反応：４２．５℃、
３０分にて安定（pH６．５） ７．分子量：２００，０００〜２８０，０００ダルトン
（ＧＰＣによる）
izopus）属由来のトレハロースホスホリラーゼ（以下、
「トレハロースホスホリラーゼＲ」と呼称する）は、次
の理化学的性質を有する。 １．作用：α−D −グルコース １−リン酸とD −グル
コースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロ
ース合成反応」と呼称する）。および無機リン酸の存在
下トレハロースに作用してα−D −グルコース １−リ
ン酸とD −グルコースを生成する。 ２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としては
トレハロースに作用する。二糖合成反応においては、糖
供与体としてα−D −グルコース １−リン酸に、糖受
容体としてD −グルコースに作用する。 ３．至適作用pH：トレハロース合成反応（４５℃） 最大活性の約５０％の活性を示すpH範囲：４．７から
６．７ ４．pH安定性：トレハロース合成反応：３．５から１
２．５ （３０℃、１時間） ５．至適反応温度：トレハロース合成反応（pH５．５） 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲：４２．５か
ら５０℃ ６．温度安定性：トレハロース合成反応：４２．５℃、
３０分にて安定（pH６．５） ７．分子量：２００，０００〜２８０，０００ダルトン
（ＧＰＣによる）
【００１１】また、本発明により得られたカエトミウム
（Chaetomium）属由来のトレハロースホスホリラーゼ
（以下「トレハロースホスホリラーゼＣ」と呼称する）
は、次の理化学的性質を有する。 １．作用：α−D −グルコース １−リン酸とD −グル
コースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロ
ース合成反応」と呼称する）。および無機リン酸の存在
下トレハロースに作用してα−D −グルコース １−リ
ン酸とD −グルコースを生成する。 ２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としては
トレハロースに作用する。合成反応においては、糖供与
体としてα−D −グルコース １−リン酸に、糖受容体
としてD −グルコースに作用する。 ３．至適作用pH：トレハロース合成反応（４５℃） 最大活性の約５０％の活性を示すpH範囲：４．７から
６．７ ４．pH安定性：トレハロース合成反応：３．５から１
２．５ （３０℃、１時間） ５．至適反応温度：トレハロース合成反応（pH５．５） 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲：４５から５
０℃ ６．温度安定性：トレハロース合成反応：５５℃、３０
分にて安定（pH６．５） ７．分子量：３００，０００〜４００，０００ダルトン
（ＧＰＣによる）
（Chaetomium）属由来のトレハロースホスホリラーゼ
（以下「トレハロースホスホリラーゼＣ」と呼称する）
は、次の理化学的性質を有する。 １．作用：α−D −グルコース １−リン酸とD −グル
コースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロ
ース合成反応」と呼称する）。および無機リン酸の存在
下トレハロースに作用してα−D −グルコース １−リ
ン酸とD −グルコースを生成する。 ２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としては
トレハロースに作用する。合成反応においては、糖供与
体としてα−D −グルコース １−リン酸に、糖受容体
としてD −グルコースに作用する。 ３．至適作用pH：トレハロース合成反応（４５℃） 最大活性の約５０％の活性を示すpH範囲：４．７から
６．７ ４．pH安定性：トレハロース合成反応：３．５から１
２．５ （３０℃、１時間） ５．至適反応温度：トレハロース合成反応（pH５．５） 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲：４５から５
０℃ ６．温度安定性：トレハロース合成反応：５５℃、３０
分にて安定（pH６．５） ７．分子量：３００，０００〜４００，０００ダルトン
（ＧＰＣによる）
【００１２】α−D −グルコース １−リン酸とD −グ
ルコースからトレハロースを生成することができる上記
理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼは従
来報告がなく本発明において、初めて報告される。
ルコースからトレハロースを生成することができる上記
理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼは従
来報告がなく本発明において、初めて報告される。
【００１３】また、本発明者らは、リゾプス（Rhizopu
s）属およびカエトミウム（Chaetomium）属に属する微
生物がこれら新規なトレハロースホスホリラーゼを生産
することを見いだした。本菌属中にこのような酵素が存
在することは従来知られていない。該新規トレハロース
ホスホリラーゼを生産する微生物は、リゾプス（Rhizop
us）属およびカエトミウム（Chaetomium）属に属し、ト
レハロースホスホリラーゼの生産能を有する菌株であれ
ばいかなる菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株で
もよい。また、本発明においては上記理化学的性質を持
ったトレハロースホスホリラーゼを生産することができ
る任意の微生物を使用することもできる。
s）属およびカエトミウム（Chaetomium）属に属する微
生物がこれら新規なトレハロースホスホリラーゼを生産
することを見いだした。本菌属中にこのような酵素が存
在することは従来知られていない。該新規トレハロース
ホスホリラーゼを生産する微生物は、リゾプス（Rhizop
us）属およびカエトミウム（Chaetomium）属に属し、ト
レハロースホスホリラーゼの生産能を有する菌株であれ
ばいかなる菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株で
もよい。また、本発明においては上記理化学的性質を持
ったトレハロースホスホリラーゼを生産することができ
る任意の微生物を使用することもできる。
【００１４】本発明の新規トレハロースホスホリラーゼ
はまた、上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホ
リラーゼ、またはその修飾されたトレハロースホスホリ
リーゼの発現をコードする遺伝子を適当な宿主に挿入
し、そしてその宿主を培養することにより製造すること
ができる。
はまた、上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホ
リラーゼ、またはその修飾されたトレハロースホスホリ
リーゼの発現をコードする遺伝子を適当な宿主に挿入
し、そしてその宿主を培養することにより製造すること
ができる。
【００１５】また、本発明においては、上記理化学的性
質を持った新規トレハロースホスホリラーゼと免疫化学
的性質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるト
レハロースホスホリラーゼを生産する微生物を使用する
こともできる。本発明における免疫化学的性質が同一で
あるか、あるいは部分的に同一であるトレハロースホス
ホリラーゼとは、公知のオクテロニー(Ouchterlony) 二
重免疫拡散法（「免疫生化学研究法」ｐ．４０、１９８
６、東京化学同人）により本発明の理化学的性質を有す
るトレハロースホスホリラーゼとの間に完全融合あるい
は部分融合するような沈降線を与えるトレハロースホス
ホリラーゼである。
質を持った新規トレハロースホスホリラーゼと免疫化学
的性質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるト
レハロースホスホリラーゼを生産する微生物を使用する
こともできる。本発明における免疫化学的性質が同一で
あるか、あるいは部分的に同一であるトレハロースホス
ホリラーゼとは、公知のオクテロニー(Ouchterlony) 二
重免疫拡散法（「免疫生化学研究法」ｐ．４０、１９８
６、東京化学同人）により本発明の理化学的性質を有す
るトレハロースホスホリラーゼとの間に完全融合あるい
は部分融合するような沈降線を与えるトレハロースホス
ホリラーゼである。
【００１６】上記新規トレハロースホスホリラーゼ生産
菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび
上記理化学的性質を持ち温度安定性に優れた新規トレハ
ロースホスホリラーゼによるトレハロースあるいはα−
D −グルコース １−リン酸の製造法については従来知
られていない。
菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび
上記理化学的性質を持ち温度安定性に優れた新規トレハ
ロースホスホリラーゼによるトレハロースあるいはα−
D −グルコース １−リン酸の製造法については従来知
られていない。
【００１７】次に、本発明において用いる微生物を培養
する際に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無
機塩類、ビタミン、その他の栄養源からなる合成培地ま
たは天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源とし
てはグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトー
ス、グリセロール、スターチ、廃糖蜜などの一般的に使
用されるものでよく、また誘導的な株の場合はトレハロ
ースを適宜用いてもよい。
する際に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無
機塩類、ビタミン、その他の栄養源からなる合成培地ま
たは天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源とし
てはグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトー
ス、グリセロール、スターチ、廃糖蜜などの一般的に使
用されるものでよく、また誘導的な株の場合はトレハロ
ースを適宜用いてもよい。
【００１８】窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸二アンモニウ
ム、尿素等の無機窒素化合物あるいは酵母エキス、肉エ
キス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ
ー、大豆粕等の有機窒素源を使用することができる。さ
らに無機塩類として、例えば、カリウム塩、ナトリウム
塩、リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩および微量の金属
塩を使用することができる。他に種々の界面活性剤を消
泡剤として使用することもできる。
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸二アンモニウ
ム、尿素等の無機窒素化合物あるいは酵母エキス、肉エ
キス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ
ー、大豆粕等の有機窒素源を使用することができる。さ
らに無機塩類として、例えば、カリウム塩、ナトリウム
塩、リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩および微量の金属
塩を使用することができる。他に種々の界面活性剤を消
泡剤として使用することもできる。
【００１９】培養は、培養温度約２０から７０℃、好ま
しくは２５から６０℃、培地の初発pHは４．０から９．
０、好ましくは５．０から８．０として、液体振とう培
養、ジャーファーメンターによる通気撹拌培養等により
好気的に行なわれる。あるいは、静置培養、固体培養等
により行なわれる。
しくは２５から６０℃、培地の初発pHは４．０から９．
０、好ましくは５．０から８．０として、液体振とう培
養、ジャーファーメンターによる通気撹拌培養等により
好気的に行なわれる。あるいは、静置培養、固体培養等
により行なわれる。
【００２０】酵素源からのトレハロースホスホリラーゼ
の調製は以下のように行なう。酵素は主に菌体内にある
ので、まず培養物を遠心分離、あるいは濾過などの方法
で、菌体だけを分離するのが好ましい。菌体からのトレ
ハロースホスホリラーゼの分離精製は、次のようにして
行うことができる。菌体内に蓄積された該酵素を菌体か
ら抽出する方法は、培養終了後の培養菌体を遠心分離
し、緩衝液で菌体を洗浄した後、適当量の緩衝液に懸濁
し、従来から行われている超音波による菌体破砕、ワー
リングブレンダーTM（ダイナミック社、ＵＳＡ）による
菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダ
イノミル破砕機等による菌体破砕、またはリゾチーム等
の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破砕など
がある。破砕した後不溶物を分離除去して得られる液を
粗酵素液とする。粗酵素液はそのままトレハロースまた
はα−D −グルコース １−リン酸の製造に用いること
もできるが、さらに分離、精製して用いることもでき
る。
の調製は以下のように行なう。酵素は主に菌体内にある
ので、まず培養物を遠心分離、あるいは濾過などの方法
で、菌体だけを分離するのが好ましい。菌体からのトレ
ハロースホスホリラーゼの分離精製は、次のようにして
行うことができる。菌体内に蓄積された該酵素を菌体か
ら抽出する方法は、培養終了後の培養菌体を遠心分離
し、緩衝液で菌体を洗浄した後、適当量の緩衝液に懸濁
し、従来から行われている超音波による菌体破砕、ワー
リングブレンダーTM（ダイナミック社、ＵＳＡ）による
菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダ
イノミル破砕機等による菌体破砕、またはリゾチーム等
の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破砕など
がある。破砕した後不溶物を分離除去して得られる液を
粗酵素液とする。粗酵素液はそのままトレハロースまた
はα−D −グルコース １−リン酸の製造に用いること
もできるが、さらに分離、精製して用いることもでき
る。
【００２１】粗酵素液の分離、精製法としては、硫安沈
澱による塩析法、溶媒沈澱法、イオン交換樹脂による吸
着、透析膜による分離、限外濾過膜による濃縮、ハイド
ロキシアパタイトによる吸着、疎水性担体による分離、
アフィニテークロマトグラフィーによる分離等の一般的
な蛋白質の分離精製法を利用することができる。このよ
うにして得た精製酵素または粗酵素をそのまま用いても
よいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋
法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固
定化酵素としてもよい。また、生菌体をポリアクリルア
ミド、κ−カラギナン、アルギン酸、光架橋性樹脂プレ
ポリマー等を利用する包括固定化法により固定化して生
体触媒として用いることもできる。
澱による塩析法、溶媒沈澱法、イオン交換樹脂による吸
着、透析膜による分離、限外濾過膜による濃縮、ハイド
ロキシアパタイトによる吸着、疎水性担体による分離、
アフィニテークロマトグラフィーによる分離等の一般的
な蛋白質の分離精製法を利用することができる。このよ
うにして得た精製酵素または粗酵素をそのまま用いても
よいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋
法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固
定化酵素としてもよい。また、生菌体をポリアクリルア
ミド、κ−カラギナン、アルギン酸、光架橋性樹脂プレ
ポリマー等を利用する包括固定化法により固定化して生
体触媒として用いることもできる。
【００２２】酵素の活性は、以下により求めた。すなわ
ちトレハロース１０．８g 、グルタチオン８６０mg、Ｅ
ＤＴＡ・２Ｎａ１７．２mgを５７ mM リン酸カリウム緩
衝液（pH７．０）に溶解し精製水で全量を１００mlとし
た溶液１４００μｌ、２０mMＮＡＤＰ+ 水溶液１００μ
ｌ、２６ mM 塩化マグネシウム水溶液１００μｌ、１．
３４ mM グルコース １，６−二リン酸水溶液１００μ
ｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ml水溶液１００μ
ｌ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml水
溶液１００μｌ、および被検酵素液１００μｌを混合
し、５０℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３
４０ nm の吸光度によって経時的に測定する。この条件
下で１分間に１μmol のＮＡＤＰＨを生成する酵素量を
１単位とする。
ちトレハロース１０．８g 、グルタチオン８６０mg、Ｅ
ＤＴＡ・２Ｎａ１７．２mgを５７ mM リン酸カリウム緩
衝液（pH７．０）に溶解し精製水で全量を１００mlとし
た溶液１４００μｌ、２０mMＮＡＤＰ+ 水溶液１００μ
ｌ、２６ mM 塩化マグネシウム水溶液１００μｌ、１．
３４ mM グルコース １，６−二リン酸水溶液１００μ
ｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ml水溶液１００μ
ｌ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml水
溶液１００μｌ、および被検酵素液１００μｌを混合
し、５０℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３
４０ nm の吸光度によって経時的に測定する。この条件
下で１分間に１μmol のＮＡＤＰＨを生成する酵素量を
１単位とする。
【００２３】本発明のトレハロースホスホリラーゼを利
用して、α−D −グルコース １−リン酸とD −グルコ
ースからトレハロースを製造するためには、α−D −グ
ルコース １−リン酸５mMから４M 、好ましくは５０mM
から３M 、D −グルコース５mMから４M 、好ましくは５
０mMから３M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ存
在下に、pH２から１０、好ましくはpH４から９、さらに
好ましくはpH５から８、反応温度を１０から８０℃、好
ましくは１５から６０℃、さらに好ましくは２０から５
５℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラ
ーゼは基質D −グルコース１g に対して０．０１単位以
上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ま
しくは１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は
存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定さ
れる。
用して、α−D −グルコース １−リン酸とD −グルコ
ースからトレハロースを製造するためには、α−D −グ
ルコース １−リン酸５mMから４M 、好ましくは５０mM
から３M 、D −グルコース５mMから４M 、好ましくは５
０mMから３M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ存
在下に、pH２から１０、好ましくはpH４から９、さらに
好ましくはpH５から８、反応温度を１０から８０℃、好
ましくは１５から６０℃、さらに好ましくは２０から５
５℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラ
ーゼは基質D −グルコース１g に対して０．０１単位以
上、好ましくは０．１から１，０００単位、さらに好ま
しくは１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は
存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定さ
れる。
【００２４】本発明のトレハロースホスホリラーゼを利
用して、スクロースとD −グルコースからトレハロース
を製造するためには、スクロース５mMから４M 、好まし
くは５０mMから３M 、D −グルコース５mMから４M 、好
ましくは５０mMから３M を本発明のトレハロースホスホ
リラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよび無機リン酸
および／またはその塩の存在下に、pH２から１０、好ま
しくはpH４から９、さらに好ましくはpH５から８、反応
温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０℃、さ
らに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良い。ま
たトレハロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に
対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０
００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。
スクロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に対し
て０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００
単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。酵素
の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性
を考慮して決定される。
用して、スクロースとD −グルコースからトレハロース
を製造するためには、スクロース５mMから４M 、好まし
くは５０mMから３M 、D −グルコース５mMから４M 、好
ましくは５０mMから３M を本発明のトレハロースホスホ
リラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよび無機リン酸
および／またはその塩の存在下に、pH２から１０、好ま
しくはpH４から９、さらに好ましくはpH５から８、反応
温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０℃、さ
らに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良い。ま
たトレハロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に
対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０
００単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。
スクロースホスホリラーゼは基質スクロース１g に対し
て０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，０００
単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。酵素
の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性
を考慮して決定される。
【００２５】本発明のトレハロースホスホリラーゼを利
用して、スクロースからトレハロースを製造するために
は、スクロース５mMから４M 、好ましくは５０mMから３
M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ、スクロース
ホスホリラーゼ、グルコースイソメラーゼおよび無機リ
ン酸および／またはその塩の存在下に、pH２から１０、
好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５から８、
反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０
℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良
い。またトレハロースホスホリラーゼは基質スクロース
１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から
１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用
いる。スクロースホスホリラーゼは基質スクロース１g
に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，
０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用い
る。グルコースイソメラーゼは基質スクロース１g に対
して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，００
０単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。こ
れらの酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用
量は経済性を考慮して決定される。
用して、スクロースからトレハロースを製造するために
は、スクロース５mMから４M 、好ましくは５０mMから３
M を本発明のトレハロースホスホリラーゼ、スクロース
ホスホリラーゼ、グルコースイソメラーゼおよび無機リ
ン酸および／またはその塩の存在下に、pH２から１０、
好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５から８、
反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６０
℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば良
い。またトレハロースホスホリラーゼは基質スクロース
１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から
１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用
いる。スクロースホスホリラーゼは基質スクロース１g
に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，
０００単位、さらに好ましくは１から１００単位用い
る。グルコースイソメラーゼは基質スクロース１g に対
して０．０１単位以上、好ましくは０．１から１，００
０単位、さらに好ましくは１から１００単位用いる。こ
れらの酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用
量は経済性を考慮して決定される。
【００２６】スクロースホスホリラーゼは公知の酵素で
あり、スクロースと無機リン酸および／またはその塩か
らα−グルコース １−リン酸とフラクトースを生成す
る酵素であればいかなる起源の酵素でも用いることがで
きる。市販品を用いる他、これら酵素を生産する微生物
を培養して得たものを用いることもできる。具体的に
は、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc
mesenteroides)、シュードモナス サッカロフィラ(P
seudomonas saccharophila)等の微生物によって生産さ
れるスクロースホスホリラーゼを用いることができる。
あり、スクロースと無機リン酸および／またはその塩か
らα−グルコース １−リン酸とフラクトースを生成す
る酵素であればいかなる起源の酵素でも用いることがで
きる。市販品を用いる他、これら酵素を生産する微生物
を培養して得たものを用いることもできる。具体的に
は、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc
mesenteroides)、シュードモナス サッカロフィラ(P
seudomonas saccharophila)等の微生物によって生産さ
れるスクロースホスホリラーゼを用いることができる。
【００２７】グルコースイソメラーゼは、フラクトース
からグルコースを生成する酵素であればいかなる起源の
酵素でも用いることができる。市販品を用いる他、これ
ら酵素を生産する微生物を培養して得たものを用いるこ
ともできる。具体的には、ストレプトミセス（Streptom
yces）、アースロバクター（Arthrobacter）等の微生物
によって生産されるグルコースイソメラーゼを用いるこ
とができる。
からグルコースを生成する酵素であればいかなる起源の
酵素でも用いることができる。市販品を用いる他、これ
ら酵素を生産する微生物を培養して得たものを用いるこ
ともできる。具体的には、ストレプトミセス（Streptom
yces）、アースロバクター（Arthrobacter）等の微生物
によって生産されるグルコースイソメラーゼを用いるこ
とができる。
【００２８】本発明のトレハロースホスホリラーゼ酵素
を利用して、トレハロースからα−D −グルコース １
−リン酸を製造するためには、トレハロースを５mMから
３M、好ましくは５０mMから２M 、無機リン酸およびそ
の塩５mMから３M 、好ましくは５０mMから２M を本発明
のトレハロースホスホリラーゼ存在下に、pH２から１
０、好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５〜
８、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６
０℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば
良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質トレハロ
ース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１
から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単
位用いる。酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素
使用量は経済性を考慮して決定される。
を利用して、トレハロースからα−D −グルコース １
−リン酸を製造するためには、トレハロースを５mMから
３M、好ましくは５０mMから２M 、無機リン酸およびそ
の塩５mMから３M 、好ましくは５０mMから２M を本発明
のトレハロースホスホリラーゼ存在下に、pH２から１
０、好ましくはpH４から９、さらに好ましくはpH５〜
８、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から６
０℃、さらに好ましくは２０から５５℃で反応させれば
良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質トレハロ
ース１g に対して０．０１単位以上、好ましくは０．１
から１，０００単位、さらに好ましくは１から１００単
位用いる。酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素
使用量は経済性を考慮して決定される。
【００２９】本発明の方法において使用する無機リン酸
および／またはその塩としては、オルトリン酸、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム等の通常の無機リン酸および
その塩等を使用することができ、好ましくはリン酸緩衝
液の形態で用いる。
および／またはその塩としては、オルトリン酸、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム等の通常の無機リン酸および
その塩等を使用することができ、好ましくはリン酸緩衝
液の形態で用いる。
【００３０】本発明の酵素を用いてトレハロースあるい
は無機リン酸を定量することができる。反応式１に示す
ようにトレハロースと無機リンから本発明により調製し
たトレハロースホスホリラーゼによりα−D −グルコー
ス １−リン酸とグルコースを生成させる。
は無機リン酸を定量することができる。反応式１に示す
ようにトレハロースと無機リンから本発明により調製し
たトレハロースホスホリラーゼによりα−D −グルコー
ス １−リン酸とグルコースを生成させる。
【００３１】
【化１】
【００３２】さらに、反応式２、反応式３に示すように
ホスホグルコムターゼ（EC 2.7.5.1、酵素ハンドブッ
ク、朝倉書店、１９８２年による、以下同じ）およびD
−グルコース−６−リン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.49)を
組み合わせる。つまり反応式１に示す反応によって生成
したα−D −グルコース １−リン酸を反応式２に示す
反応によってD −グルコース ６−リン酸に変換し、こ
のD −グルコース ６−リン酸を反応式３に示す反応に
よって６−ホスホ−D −グルコン酸に変換する。この反
応式３に示す反応は、補酵素を必要とし、ＮＡＤ+ ある
いはＮＡＤＰ+ をそれぞれＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
に変換する。このＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの生成を
３４０nmにおける吸光度の増加を測定することによりト
レハロースあるいは無機リン酸を測定することができ
る。
ホスホグルコムターゼ（EC 2.7.5.1、酵素ハンドブッ
ク、朝倉書店、１９８２年による、以下同じ）およびD
−グルコース−６−リン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.49)を
組み合わせる。つまり反応式１に示す反応によって生成
したα−D −グルコース １−リン酸を反応式２に示す
反応によってD −グルコース ６−リン酸に変換し、こ
のD −グルコース ６−リン酸を反応式３に示す反応に
よって６−ホスホ−D −グルコン酸に変換する。この反
応式３に示す反応は、補酵素を必要とし、ＮＡＤ+ ある
いはＮＡＤＰ+ をそれぞれＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
に変換する。このＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの生成を
３４０nmにおける吸光度の増加を測定することによりト
レハロースあるいは無機リン酸を測定することができ
る。
【００３３】
【化２】
【００３４】
【化３】
【００３５】さらに、反応式１で生成したグルコース
を、ムタロターゼ（EC 5.1.3.3）、グルコースオキシダ
ーゼ（EC 1.1.3.4）およびペルオキシダーゼ（EC 1.11.
1.7)を組み合わせる公知の方法により測定し、トレハロ
ースあるいは無機リン酸を測定することもできる。
を、ムタロターゼ（EC 5.1.3.3）、グルコースオキシダ
ーゼ（EC 1.1.3.4）およびペルオキシダーゼ（EC 1.11.
1.7)を組み合わせる公知の方法により測定し、トレハロ
ースあるいは無機リン酸を測定することもできる。
【００３６】以下、本発明を実施例によってさらに具体
的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるもの
ではない。
的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるもの
ではない。
【００３７】
【実施例１】ポテト−スクロース培地１０００mlに酵母
エキス１g とリン酸二水素ナトリウム０．５g を加え溶
解し、pHを５．６に調整した。この水溶液１００mlを３
００ml 三角フラスコに分注し滅菌し（１２０℃、１５
分間）種培養培地を調製した。滅菌後、リゾプス キネ
ンシス (Rhizopus chinensis)ＩＦＯ−３０４９９株を
接種し、２５℃、４日間往復振とう培養（１３０ｒｐ
ｍ）し種培養とした。トレハロース３０g 、リン酸二水
素ナトリウム０．５g 、硫酸マグネシウム７水和物０．
２g 、塩化カリウム１g と酵母エキス２０g を精製水に
て溶解し、１０００mlとし、pHを６．０に調整し、培地
を調製した。この培地１００mlを３００ml三角フラスコ
に分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌後、この培地
に前記調製した種培養液５ ml を接種し、２８℃、１７
０ｒｐｍにて３日間培養を行った。
エキス１g とリン酸二水素ナトリウム０．５g を加え溶
解し、pHを５．６に調整した。この水溶液１００mlを３
００ml 三角フラスコに分注し滅菌し（１２０℃、１５
分間）種培養培地を調製した。滅菌後、リゾプス キネ
ンシス (Rhizopus chinensis)ＩＦＯ−３０４９９株を
接種し、２５℃、４日間往復振とう培養（１３０ｒｐ
ｍ）し種培養とした。トレハロース３０g 、リン酸二水
素ナトリウム０．５g 、硫酸マグネシウム７水和物０．
２g 、塩化カリウム１g と酵母エキス２０g を精製水に
て溶解し、１０００mlとし、pHを６．０に調整し、培地
を調製した。この培地１００mlを３００ml三角フラスコ
に分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌後、この培地
に前記調製した種培養液５ ml を接種し、２８℃、１７
０ｒｐｍにて３日間培養を行った。
【００３８】培養後、培養液を高速遠心機により濾液と
菌体に分離し、菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．
５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび
２０%グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗
浄菌体を２０ mM トリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザ
ーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠
心により上清液２８６mlを得た。この粗酵素液を２０ m
M トリス緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM
６５０Ｃ（トーソー社）イオン交換カラム（５０ml)に
通し、１６０mlの同じ緩衝液にて洗浄後２０ mM トリス
緩衝液（３００ml) と０．５M 塩化カリウム含有２０ m
M トリス緩衝液（３００ml) を用いて直線濃度勾配溶出
を行った。酵素活性画分は１２１mlであった。この活性
画分に３０％飽和硫安濃度になるように硫安を加えた。
この酵素液を３０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液
にて平衡化したブチル−トヨパールTM（トーソー社）カ
ラム（２５ml) に通した。このカラムを７０mlの３０％
飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液にて洗浄後、３０％
から０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液（４００m
l) を用いて直線濃度勾配溶出を行った。１０mlづつ分
取した結果、フラクション２６〜３９に酵素活性が検出
された。酵素活性画分は１５０mlであった。ホローファ
イバー限外濾過濃縮装置により濃縮し、部分精製酵素液
３．６mlを得た。この部分精製酵素液のトレハロースホ
スホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ１．７単位／ml、
６．１単位であった。
菌体に分離し、菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．
５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび
２０%グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗
浄菌体を２０ mM トリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザ
ーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠
心により上清液２８６mlを得た。この粗酵素液を２０ m
M トリス緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM
６５０Ｃ（トーソー社）イオン交換カラム（５０ml)に
通し、１６０mlの同じ緩衝液にて洗浄後２０ mM トリス
緩衝液（３００ml) と０．５M 塩化カリウム含有２０ m
M トリス緩衝液（３００ml) を用いて直線濃度勾配溶出
を行った。酵素活性画分は１２１mlであった。この活性
画分に３０％飽和硫安濃度になるように硫安を加えた。
この酵素液を３０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液
にて平衡化したブチル−トヨパールTM（トーソー社）カ
ラム（２５ml) に通した。このカラムを７０mlの３０％
飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液にて洗浄後、３０％
から０％飽和硫安含有２０ mM トリス緩衝液（４００m
l) を用いて直線濃度勾配溶出を行った。１０mlづつ分
取した結果、フラクション２６〜３９に酵素活性が検出
された。酵素活性画分は１５０mlであった。ホローファ
イバー限外濾過濃縮装置により濃縮し、部分精製酵素液
３．６mlを得た。この部分精製酵素液のトレハロースホ
スホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ１．７単位／ml、
６．１単位であった。
【００３９】
【実施例２】表１から選ばれた一菌株を、ＹＭ培地（デ
フコ）にて種培養し種菌とした。酵母エキス６g 、麦芽
エキス６g 、ペプトン１０g 、グルコース１０g および
トレハロース２０g を精製水１０００mlに溶解し、pHを
６．２に調整し培地を調製した。この培地１００mlを３
００ ml 三角フラスコに入れ滅菌し、種菌を接種し、表
１に示す培養温度、培養期間にて培養を行った。このよ
うにして得た培養液から菌体を集め、２０ mM トリス緩
衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイ
トールおよび２０％グリセロール含有、以下同じ）にて
洗浄した。洗浄菌体を２０ mM トリス緩衝液に懸濁し、
ホモジナイザーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破
砕を行い、遠心により粗酵素を調製した。各菌株の粗酵
素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性を表１
に示す。
フコ）にて種培養し種菌とした。酵母エキス６g 、麦芽
エキス６g 、ペプトン１０g 、グルコース１０g および
トレハロース２０g を精製水１０００mlに溶解し、pHを
６．２に調整し培地を調製した。この培地１００mlを３
００ ml 三角フラスコに入れ滅菌し、種菌を接種し、表
１に示す培養温度、培養期間にて培養を行った。このよ
うにして得た培養液から菌体を集め、２０ mM トリス緩
衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイ
トールおよび２０％グリセロール含有、以下同じ）にて
洗浄した。洗浄菌体を２０ mM トリス緩衝液に懸濁し、
ホモジナイザーＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破
砕を行い、遠心により粗酵素を調製した。各菌株の粗酵
素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性を表１
に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【実施例３】酵母エキス１０g 、バクト−ペプトン２０
g 、トレハロース２０g を精製水１０００mlに溶解し、
pHを６．０に調整した。この培地１００mlを３００ ml
三角フラスコに分注し、滅菌した。滅菌後、この培地二
本にスポリジオボルス ジョンソニ(Sporidiobolus jo
hnsonii)ＩＦＯ ６９０３あるいはステリグマトミセス
ハロフィルス(Sterigmatomyces halophilus）ＩＦＯ
１４８８株を接種し２５℃、２日間振とう培養した。培
養後、培養液を高速遠心機により濾液と菌体に分離し、
菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴ
Ａ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０％グリセロー
ル含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌体を２０ mM
トリス緩衝液に懸濁し、超高速振動破砕装置（マイケル
社）にて１５分間細胞破砕を行い、遠心分離により不溶
物を分離し上清液をそれぞれ２０、３４mlを得た。この
粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性は
スポリジオボルス ジョンソニ(Sporidiobolus johnso
nii)ＩＦＯ ６９０３株では０．４６単位／ml、９．３
単位、ステリグマトミセス ハロフィラス(Sterigmatom
yces halophilus) ＩＦＯ１４８８株では０．１４、
４．６単位であった。
g 、トレハロース２０g を精製水１０００mlに溶解し、
pHを６．０に調整した。この培地１００mlを３００ ml
三角フラスコに分注し、滅菌した。滅菌後、この培地二
本にスポリジオボルス ジョンソニ(Sporidiobolus jo
hnsonii)ＩＦＯ ６９０３あるいはステリグマトミセス
ハロフィルス(Sterigmatomyces halophilus）ＩＦＯ
１４８８株を接種し２５℃、２日間振とう培養した。培
養後、培養液を高速遠心機により濾液と菌体に分離し、
菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．５、１ mM ＥＤＴ
Ａ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０％グリセロー
ル含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌体を２０ mM
トリス緩衝液に懸濁し、超高速振動破砕装置（マイケル
社）にて１５分間細胞破砕を行い、遠心分離により不溶
物を分離し上清液をそれぞれ２０、３４mlを得た。この
粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性は
スポリジオボルス ジョンソニ(Sporidiobolus johnso
nii)ＩＦＯ ６９０３株では０．４６単位／ml、９．３
単位、ステリグマトミセス ハロフィラス(Sterigmatom
yces halophilus) ＩＦＯ１４８８株では０．１４、
４．６単位であった。
【００４２】
【実施例４】チロミセス パルストリス(Tyromyces pa
lustris)ＩＦＯ ３０３３９株をＹＭ培地にて種培養し
た。酵母エキス７．５g 、麦芽エキス２g 、リン酸一カ
リウム０．５g 、硫酸マグネシウム７水和物０．５g 、
グルコース４０g を１０００mlに溶解し、pHを５．５に
調整した培地を３００ ml 三角フラスコに１００mlづつ
分注し滅菌した。この滅菌した三角フラスコ２本に前記
種培養を接種し、２５℃、７日間振とう培養した。培養
後実施例１と同様にして、粗酵素液を調製した。この粗
酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性は
０．１６単位／ml、７．３単位であった。
lustris)ＩＦＯ ３０３３９株をＹＭ培地にて種培養し
た。酵母エキス７．５g 、麦芽エキス２g 、リン酸一カ
リウム０．５g 、硫酸マグネシウム７水和物０．５g 、
グルコース４０g を１０００mlに溶解し、pHを５．５に
調整した培地を３００ ml 三角フラスコに１００mlづつ
分注し滅菌した。この滅菌した三角フラスコ２本に前記
種培養を接種し、２５℃、７日間振とう培養した。培養
後実施例１と同様にして、粗酵素液を調製した。この粗
酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性は
０．１６単位／ml、７．３単位であった。
【００４３】
【実施例５】表２の菌株群から選ばれた各菌株を以下の
ように、培養、粗酵素調製、部分精製酵素調製を行い、
部分精製酵素液を得た。各菌株をグルコース１０g 、ト
レハロース２０g 、酵母エキス２０g 、リン酸一カリウ
ム２g 、リン酸二カリウム０．４g および硫酸マグネシ
ウム７水和物０．２g を１０００mlの精製水に溶解しpH
を６．３に調製した。この培地を３００ ml 三角フラス
コに１００mlづつ分注し、滅菌した。この１０本の培地
に、酵母エキス６g 、麦芽エキス６g 、ペプトン１０g
、グルコース５g 、トレハロース２０g からなる種培
養培地（pH６．２）にて各菌株を種培養した種培養を接
種し、表２に示す培養温度、培養期間で培養を行った。
培養後、実施例１と同様な方法にて粗酵素液を調製し
た。その粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ酵素活
性、総活性を表２に示した。また、この粗酵素液をＤＥ
ＡＥ−トヨパールTM（トーソー）クロマトグラフィー、
ブチル−トヨパールTM（トーソー）クロマトグラフィー
により部分精製し、さらにホローファイバーを用いた限
外濾過により濃縮し、部分精製酵素液を得た。この部分
精製酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性
を表２に示す。活性はすべて５０℃で測定した。
ように、培養、粗酵素調製、部分精製酵素調製を行い、
部分精製酵素液を得た。各菌株をグルコース１０g 、ト
レハロース２０g 、酵母エキス２０g 、リン酸一カリウ
ム２g 、リン酸二カリウム０．４g および硫酸マグネシ
ウム７水和物０．２g を１０００mlの精製水に溶解しpH
を６．３に調製した。この培地を３００ ml 三角フラス
コに１００mlづつ分注し、滅菌した。この１０本の培地
に、酵母エキス６g 、麦芽エキス６g 、ペプトン１０g
、グルコース５g 、トレハロース２０g からなる種培
養培地（pH６．２）にて各菌株を種培養した種培養を接
種し、表２に示す培養温度、培養期間で培養を行った。
培養後、実施例１と同様な方法にて粗酵素液を調製し
た。その粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ酵素活
性、総活性を表２に示した。また、この粗酵素液をＤＥ
ＡＥ−トヨパールTM（トーソー）クロマトグラフィー、
ブチル−トヨパールTM（トーソー）クロマトグラフィー
により部分精製し、さらにホローファイバーを用いた限
外濾過により濃縮し、部分精製酵素液を得た。この部分
精製酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性
を表２に示す。活性はすべて５０℃で測定した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【実施例６】グロメレラ シングラータ（Glomerella
cingulata)ＩＦＯ ７４７８株をＹＭ培地（デフコ）に
て２８℃、４日間振とう培養した。酵母エキス２０g 、
リン酸一ナトリウム０．５g 、塩化カリウム１g 、硫酸
マグネシウム７水和物０．２g およびトレハロース３０
g を１０００mlに溶解し、pHを６．３に調整し培地を調
製した。この培地に種培養を接種し、２８℃、４日間振
とう培養を行った。培養後、実施例１と同様に、菌体を
遠心により集菌、洗浄し、ホモジナイザーＨＧ−３０TM
（日立）により菌体破砕を行い、遠心により上清を粗酵
素液として得た。グロメレラ シングラータ（Glomerel
la cingulata)ＩＦＯ ７４７８株由来の粗酵素液のト
レハロースホスホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ０．
０１４単位／ml、１．５単位であった。
cingulata)ＩＦＯ ７４７８株をＹＭ培地（デフコ）に
て２８℃、４日間振とう培養した。酵母エキス２０g 、
リン酸一ナトリウム０．５g 、塩化カリウム１g 、硫酸
マグネシウム７水和物０．２g およびトレハロース３０
g を１０００mlに溶解し、pHを６．３に調整し培地を調
製した。この培地に種培養を接種し、２８℃、４日間振
とう培養を行った。培養後、実施例１と同様に、菌体を
遠心により集菌、洗浄し、ホモジナイザーＨＧ−３０TM
（日立）により菌体破砕を行い、遠心により上清を粗酵
素液として得た。グロメレラ シングラータ（Glomerel
la cingulata)ＩＦＯ ７４７８株由来の粗酵素液のト
レハロースホスホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ０．
０１４単位／ml、１．５単位であった。
【００４６】
【実施例７】ポテト−スクロース培地１０００mlに酵母
エキス１g とリン酸水素ナトリウム０．５g を加えpH
５．６に調整し種培養培地を調製した。この培地１００
mlを３００ml三角フラスコに分注し滅菌した（１２０
℃、１５分間）。滅菌後、カエトミウム サーモフィル
ム（Chaetomium thermopholum）ＩＦＯ ９６７９株を
接種し、３５℃、６日間往復振とう培養（１５０ｒｐ
ｍ）し、種培養とした。培養は、トレハロース３０g 、
リン酸水素一ナトリウム０．５g 、硫酸マグネシウム７
水和物０．２g 、塩化カリウム１g と酵母エキス２０g
を精製水にて溶解し、１０００mlとし、pHを６．０に調
整した。この本培養培地１００mlを３００ ml三角フラ
スコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌後、前培
養液５mlを接種し、３５℃、１５０ｒｐｍにて６日間培
養を行った。
エキス１g とリン酸水素ナトリウム０．５g を加えpH
５．６に調整し種培養培地を調製した。この培地１００
mlを３００ml三角フラスコに分注し滅菌した（１２０
℃、１５分間）。滅菌後、カエトミウム サーモフィル
ム（Chaetomium thermopholum）ＩＦＯ ９６７９株を
接種し、３５℃、６日間往復振とう培養（１５０ｒｐ
ｍ）し、種培養とした。培養は、トレハロース３０g 、
リン酸水素一ナトリウム０．５g 、硫酸マグネシウム７
水和物０．２g 、塩化カリウム１g と酵母エキス２０g
を精製水にて溶解し、１０００mlとし、pHを６．０に調
整した。この本培養培地１００mlを３００ ml三角フラ
スコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌後、前培
養液５mlを接種し、３５℃、１５０ｒｐｍにて６日間培
養を行った。
【００４７】培養後、培養液を高速遠心機により濾液と
菌体に分離し、菌体を２０mMトリス緩衝液（pH７．５、
１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０
％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌
体を２０mMトリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザーＨＧ
−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心分離
により不溶物を除き上清液２７５mlを得た。この粗酵素
液のトレハロースホスホリラーゼ活性は ０．０５単位
／ml、総活性１４単位であった。この粗酵素液を２０mM
トリス緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM６
５０Ｃ（５０ml）イオン交換カラムに通し、１６０mlの
同じ緩衝液にて洗浄後２０mMトリス緩衝液（３００ml）
と０．５Ｍ塩化カリウム含有トリス緩衝液（３００ml）
を用いて直線濃度勾配溶出により酵素活性画分２１５ml
を得た。この活性画分に３０％飽和硫安濃度になるよう
に硫安を加えた。この酵素液を３０％飽和硫安含有２０
mMトリス緩衝液にて平衡化したブチル−トヨパール
TM（２５ml）カラムに通した。このカラムを３０％飽和
硫安含有トリス緩衝液にて洗浄後、３０％から０％飽和
硫安含有トリス緩衝液（４００ml）を用いて直線濃度勾
配溶出を行った。９．７mlの分画を行った結果、フラク
ション３１〜４６に酵素活性が検出され、酵素活性画分
１５４mlを得た。ホローファイバー限外濾過濃縮装置に
より濃縮し、部分精製酵素液３．６mlを得た。この部分
精製酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性
はそれぞれ３．１単位／ml、１１単位であった。活性画
分を２０ mM リン酸緩衝液で平衡化したＴＳＫ gelTMＧ
３０００ＳＷ（７．５mmφ×３００mm、流速０．５ml／
分、トーソー社製）カラムを用いて高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製を行った。ＵＶ２８０nmで検出する
と９．５分に１本のピークが見られた。このピークが活
性ピークであった。この時の活性ピークの保持時間と蛋
白質標品の保持時間から分子量を見積もると、本酵素の
分子量は、約３８０，０００であった。
菌体に分離し、菌体を２０mMトリス緩衝液（pH７．５、
１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび２０
％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗浄菌
体を２０mMトリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザーＨＧ
−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心分離
により不溶物を除き上清液２７５mlを得た。この粗酵素
液のトレハロースホスホリラーゼ活性は ０．０５単位
／ml、総活性１４単位であった。この粗酵素液を２０mM
トリス緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM６
５０Ｃ（５０ml）イオン交換カラムに通し、１６０mlの
同じ緩衝液にて洗浄後２０mMトリス緩衝液（３００ml）
と０．５Ｍ塩化カリウム含有トリス緩衝液（３００ml）
を用いて直線濃度勾配溶出により酵素活性画分２１５ml
を得た。この活性画分に３０％飽和硫安濃度になるよう
に硫安を加えた。この酵素液を３０％飽和硫安含有２０
mMトリス緩衝液にて平衡化したブチル−トヨパール
TM（２５ml）カラムに通した。このカラムを３０％飽和
硫安含有トリス緩衝液にて洗浄後、３０％から０％飽和
硫安含有トリス緩衝液（４００ml）を用いて直線濃度勾
配溶出を行った。９．７mlの分画を行った結果、フラク
ション３１〜４６に酵素活性が検出され、酵素活性画分
１５４mlを得た。ホローファイバー限外濾過濃縮装置に
より濃縮し、部分精製酵素液３．６mlを得た。この部分
精製酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性
はそれぞれ３．１単位／ml、１１単位であった。活性画
分を２０ mM リン酸緩衝液で平衡化したＴＳＫ gelTMＧ
３０００ＳＷ（７．５mmφ×３００mm、流速０．５ml／
分、トーソー社製）カラムを用いて高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製を行った。ＵＶ２８０nmで検出する
と９．５分に１本のピークが見られた。このピークが活
性ピークであった。この時の活性ピークの保持時間と蛋
白質標品の保持時間から分子量を見積もると、本酵素の
分子量は、約３８０，０００であった。
【００４８】
【実施例８】リゾプス アザイゴスポルス（Rhizopus
azygosporus)ＩＦＯ ３１９８９株を酵母エキス６g 、
麦芽エキス６g 、ペプトン１０g 、グルコース５g 、ト
レハロース２０g からなる種培養培地（pH６．２）にて
種培養を行った。酵母エキス２０g 、グルコース１０g
、トレハロース２０g 、リン酸一カリウム 4 ２g 、
リン酸二カリウム０．４g および硫酸マグネシウム７水
和物０．２g を精製水１０００mlに溶解し、pH６．２に
調整し培地を作製した。この培地１００mlを３００ml三
角フラスコに入れ滅菌し、種培養を各３ ml 接種し、２
７．５℃、７日間培養をおこなった。
azygosporus)ＩＦＯ ３１９８９株を酵母エキス６g 、
麦芽エキス６g 、ペプトン１０g 、グルコース５g 、ト
レハロース２０g からなる種培養培地（pH６．２）にて
種培養を行った。酵母エキス２０g 、グルコース１０g
、トレハロース２０g 、リン酸一カリウム 4 ２g 、
リン酸二カリウム０．４g および硫酸マグネシウム７水
和物０．２g を精製水１０００mlに溶解し、pH６．２に
調整し培地を作製した。この培地１００mlを３００ml三
角フラスコに入れ滅菌し、種培養を各３ ml 接種し、２
７．５℃、７日間培養をおこなった。
【００４９】培養後、培養液を高速遠心機により濾液と
菌体に分離し、菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．
５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび
２０％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗
浄菌体を２０mMトリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザー
ＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心
分離により不溶物を除き上清液３８５ ml を得た。この
粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性は０．５６
単位／ml、総活性２１７単位であった。活性測定は反応
温度を５０℃で行った以外は前記の方法に準じた。
菌体に分離し、菌体を２０ mM トリス緩衝液（pH７．
５、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールおよび
２０％グリセロール含有、以下同じ）にて洗浄した。洗
浄菌体を２０mMトリス緩衝液に懸濁し、ホモジナイザー
ＨＧ−３０TM（日立）にて２分間細胞破砕を行い、遠心
分離により不溶物を除き上清液３８５ ml を得た。この
粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性は０．５６
単位／ml、総活性２１７単位であった。活性測定は反応
温度を５０℃で行った以外は前記の方法に準じた。
【００５０】この粗酵素液を２０ mM トリス緩衝液にて
平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM６５０Ｃ（５０ml)
イオン交換カラムに通し、１６０ ml の同じ緩衝液にて
洗浄後２０ mM トリス緩衝液（３００ml) と０．５M 塩
化カリウム含有トリス緩衝液（３００ml) を用いて直線
濃度勾配溶出により酵素活性画分を１３０ ml を得た。
この活性画分に３０％飽和硫安濃度になるように硫安を
加えた。この酵素液を３０％飽和硫安含有２０ mM トリ
ス緩衝液にて平衡化したブチル−トヨパールTM（２５m
l）カラムに通した。このカラムを３０％飽和硫安含有
トリス緩衝液にて洗浄後、３０％から０％飽和硫安含有
トリス緩衝液（４００ml) を用いて直線濃度勾配溶出を
行った。酵素活性画分１０３mlを得た。この活性画分を
透析しスーパーＱ トヨパールTMカラムによりさらに精
製し、活性１２単位／ml、総活性１１３単位の部分精製
酵素液を得た。この酵素液を２０ mM リン酸緩衝液で平
衡化したＴＳＫｇｅｌTMＧ３０００ＳＷ（７．５mmφ×
３００mm、流速０．５ml／分、トーソー社製）カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製を行っ
た。ＵＶ２８０nmで検出すると１０．３分に１本のピー
クが見られた。このピークが活性ピークであった。この
時の活性ピークの保持時間と蛋白質標品の保持時間から
分子量を見積もると、本酵素の分子量は、約２３０，０
００であった。
平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールTM６５０Ｃ（５０ml)
イオン交換カラムに通し、１６０ ml の同じ緩衝液にて
洗浄後２０ mM トリス緩衝液（３００ml) と０．５M 塩
化カリウム含有トリス緩衝液（３００ml) を用いて直線
濃度勾配溶出により酵素活性画分を１３０ ml を得た。
この活性画分に３０％飽和硫安濃度になるように硫安を
加えた。この酵素液を３０％飽和硫安含有２０ mM トリ
ス緩衝液にて平衡化したブチル−トヨパールTM（２５m
l）カラムに通した。このカラムを３０％飽和硫安含有
トリス緩衝液にて洗浄後、３０％から０％飽和硫安含有
トリス緩衝液（４００ml) を用いて直線濃度勾配溶出を
行った。酵素活性画分１０３mlを得た。この活性画分を
透析しスーパーＱ トヨパールTMカラムによりさらに精
製し、活性１２単位／ml、総活性１１３単位の部分精製
酵素液を得た。この酵素液を２０ mM リン酸緩衝液で平
衡化したＴＳＫｇｅｌTMＧ３０００ＳＷ（７．５mmφ×
３００mm、流速０．５ml／分、トーソー社製）カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製を行っ
た。ＵＶ２８０nmで検出すると１０．３分に１本のピー
クが見られた。このピークが活性ピークであった。この
時の活性ピークの保持時間と蛋白質標品の保持時間から
分子量を見積もると、本酵素の分子量は、約２３０，０
００であった。
【００５１】
【実施例９】実施例７および８により得られた精製酵素
を用いて酵素の基質特異性、至適pH、pH安定性、至適温
度、温度安定性を調べた。トレハロースの定量は以下の
方法により行なった。
を用いて酵素の基質特異性、至適pH、pH安定性、至適温
度、温度安定性を調べた。トレハロースの定量は以下の
方法により行なった。
【００５２】トレハロースの定量法：反応液をポリアミ
ンカラム（ＹＭＣ ＰａｃｋTM Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ I
I ４．６mmφ×２５０mm、ＹＭＣ社製）、溶離液アセト
ニトリル：水＝７０：３０、流速１ml／分、カラム温度
３５℃、示差屈折計（セル温度３５℃）による高速液体
クロマトグラフィーにより測定しトレハロース濃度を求
めた。このＨＰＬＣ条件においてトレハロースの保持時
間は１５．７分であった。
ンカラム（ＹＭＣ ＰａｃｋTM Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ I
I ４．６mmφ×２５０mm、ＹＭＣ社製）、溶離液アセト
ニトリル：水＝７０：３０、流速１ml／分、カラム温度
３５℃、示差屈折計（セル温度３５℃）による高速液体
クロマトグラフィーにより測定しトレハロース濃度を求
めた。このＨＰＬＣ条件においてトレハロースの保持時
間は１５．７分であった。
【００５３】トレハロースホスホリラーゼＣおよびトレ
ハロースホスホリラーゼＲ ［基質特異性］ 加リン酸分解反応：本酵素を用いて各種糖類の加リン酸
分解反応を行なった。トレハロースからはα−D −グル
コース １−リン酸とD −グルコースが生成した。 二糖合成反応：本酵素を用いて各種単糖とα−D −グル
コース １−リン酸による二糖合成反応を行なった。D-
グルコース以外のL −グルコース、D −ガラクトース、
D −マンノース、D −キシロース、D −フラクトース、
D −ソルビトール、D −マンニトール、D −フコースは
反応しなかった。
ハロースホスホリラーゼＲ ［基質特異性］ 加リン酸分解反応：本酵素を用いて各種糖類の加リン酸
分解反応を行なった。トレハロースからはα−D −グル
コース １−リン酸とD −グルコースが生成した。 二糖合成反応：本酵素を用いて各種単糖とα−D −グル
コース １−リン酸による二糖合成反応を行なった。D-
グルコース以外のL −グルコース、D −ガラクトース、
D −マンノース、D −キシロース、D −フラクトース、
D −ソルビトール、D −マンニトール、D −フコースは
反応しなかった。
【００５４】［至適pH］緩衝液として酢酸緩衝液（pH
３．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（pH５．０から７．
０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．０から８．０）、トリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（７．５から９．０）、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５から１２．０）を用い
た。各pHにおいて４５℃、１２時間反応を行ない生成し
たトレハロース量を上述の方法により定量し酵素活性を
求めた。このようにして得たトレハロースホスホリラー
ゼＣおよびＲの至適pH範囲をそれぞれ図１および２に示
す。
３．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（pH５．０から７．
０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．０から８．０）、トリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（７．５から９．０）、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５から１２．０）を用い
た。各pHにおいて４５℃、１２時間反応を行ない生成し
たトレハロース量を上述の方法により定量し酵素活性を
求めた。このようにして得たトレハロースホスホリラー
ゼＣおよびＲの至適pH範囲をそれぞれ図１および２に示
す。
【００５５】［pH安定性］緩衝液として酢酸緩衝液（pH
３．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（pH５．０から７．
０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．０から８．０）、トリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（７．５から９．０）、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５から１２．０）を用い
た。各トレハロースホスホリラーゼを各pHに、３０℃、
１時間放置した。放置後、４５℃、１２時間反応させ生
成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し各
pHにおける酵素活性を求めた。このようにして得たトレ
ハロースホスホリラーゼＣおよびＲのｐＨ安定性の範囲
をそれぞれ図３および４に示す。
３．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（pH５．０から７．
０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．０から８．０）、トリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（７．５から９．０）、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５から１２．０）を用い
た。各トレハロースホスホリラーゼを各pHに、３０℃、
１時間放置した。放置後、４５℃、１２時間反応させ生
成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し各
pHにおける酵素活性を求めた。このようにして得たトレ
ハロースホスホリラーゼＣおよびＲのｐＨ安定性の範囲
をそれぞれ図３および４に示す。
【００５６】［至適温度］ＭＥＳ緩衝液（pH５．５）を
用い、温度３０℃から５５℃の所望の温度で５時間反応
させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したトレハ
ロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求め
た。このようにして得たトレハロースホスホリラーゼＣ
およびＲの至適温度範囲をそれぞれ図５に示す。
用い、温度３０℃から５５℃の所望の温度で５時間反応
させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したトレハ
ロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求め
た。このようにして得たトレハロースホスホリラーゼＣ
およびＲの至適温度範囲をそれぞれ図５に示す。
【００５７】［温度安定性］トレハロースホスホリラー
ゼを２０ mM リン酸緩衝液（pH７．０）中、温度４２．
５℃から５５℃の所望の温度に３０分間放置した。放置
後、４５℃、５時間反応させ、加熱処理により酵素を失
活させ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法によ
り定量し酵素活性を求めた。このようにして得たトレハ
ロースホスホリラーゼＣ、Ｒの温度安定性の範囲をそれ
ぞれ図６に示す。
ゼを２０ mM リン酸緩衝液（pH７．０）中、温度４２．
５℃から５５℃の所望の温度に３０分間放置した。放置
後、４５℃、５時間反応させ、加熱処理により酵素を失
活させ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法によ
り定量し酵素活性を求めた。このようにして得たトレハ
ロースホスホリラーゼＣ、Ｒの温度安定性の範囲をそれ
ぞれ図６に示す。
【００５８】
【実施例１０】実施例７、８により得た部分精製酵素を
用いてα−D −グルコース １−リン酸とグルコースか
らトレハロースの生成の検討を行った。α−D −グルコ
ース１−リン酸１００mM、グルコース１００mM、１００
mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）および部分精製酵素４単
位／mlを用いて、トレハロース合成反応を各温度で、２
４時間行った。その結果を表３に示す。
用いてα−D −グルコース １−リン酸とグルコースか
らトレハロースの生成の検討を行った。α−D −グルコ
ース１−リン酸１００mM、グルコース１００mM、１００
mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）および部分精製酵素４単
位／mlを用いて、トレハロース合成反応を各温度で、２
４時間行った。その結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
【実施例１１】実施例７、８により得た部分精製酵素を
用いてトレハロースと無機リン酸からα−D −グルコー
ス １−リン酸の生成の検討を行った。トレハロース１
００mM、１００ mM リン酸緩衝液（pH７．０）および部
分精製酵素４単位／mlを用いて、α−D −グルコース
１−リン酸の生成反応を４５℃、２４時間行った。その
結果、カエトミウム サーモフィルム（Chaetomium th
ermophilum）ＩＦＯ９６７９株およびリゾプス アザイ
ゴスポルス(Rhizopus azygosporus) ＩＦＯ３１９８９
株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精製酵素にお
いて、それぞれ６０mM、５４mMのα−D −グルコース
１−リン酸が生成した。α−D −グルコース １−リン
酸の定量は以下の方法により行った。
用いてトレハロースと無機リン酸からα−D −グルコー
ス １−リン酸の生成の検討を行った。トレハロース１
００mM、１００ mM リン酸緩衝液（pH７．０）および部
分精製酵素４単位／mlを用いて、α−D −グルコース
１−リン酸の生成反応を４５℃、２４時間行った。その
結果、カエトミウム サーモフィルム（Chaetomium th
ermophilum）ＩＦＯ９６７９株およびリゾプス アザイ
ゴスポルス(Rhizopus azygosporus) ＩＦＯ３１９８９
株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精製酵素にお
いて、それぞれ６０mM、５４mMのα−D −グルコース
１−リン酸が生成した。α−D −グルコース １−リン
酸の定量は以下の方法により行った。
【００６１】α−D −グルコース １−リン酸の定量
法：０．５M リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０μｌ、
１．０M ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μｌ、
１４．８ mM ＮＡＤＰ+ 水溶液５０μｌ、２６ mM塩化
マグネシウム水溶液５０μｌ、１．３４ mM α−D −グ
ルコース １，６−二リン酸水溶液５０μｌ、ホスホグ
ルコムターゼ３１単位／ml水溶液２５μｌ（０．７８単
位）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml
水溶液２５μｌ（０．８８単位）、精製水９８０μｌ、
および被検液５０μｌを混合し、３０℃、３０分間反応
させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０ nm で吸光度
測定しα−D −グルコース １−リン酸量とした。
法：０．５M リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０μｌ、
１．０M ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μｌ、
１４．８ mM ＮＡＤＰ+ 水溶液５０μｌ、２６ mM塩化
マグネシウム水溶液５０μｌ、１．３４ mM α−D −グ
ルコース １，６−二リン酸水溶液５０μｌ、ホスホグ
ルコムターゼ３１単位／ml水溶液２５μｌ（０．７８単
位）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml
水溶液２５μｌ（０．８８単位）、精製水９８０μｌ、
および被検液５０μｌを混合し、３０℃、３０分間反応
させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０ nm で吸光度
測定しα−D −グルコース １−リン酸量とした。
【００６２】
【実施例１２】実施例５により得た部分精製酵素を用い
てα−D −グルコース １−リン酸とグルコースからト
レハロースの生成の検討を行った。α−D −グルコース
１−リン酸１００mM、グルコース１００mM、１００ m
M ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）および実施例５により得た
部分生成酵素４単位／mlを用いて、トレハロース合成反
応を各温度、２４時間行った。その結果を表４に示す。
てα−D −グルコース １−リン酸とグルコースからト
レハロースの生成の検討を行った。α−D −グルコース
１−リン酸１００mM、グルコース１００mM、１００ m
M ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）および実施例５により得た
部分生成酵素４単位／mlを用いて、トレハロース合成反
応を各温度、２４時間行った。その結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
【００６４】
【実施例１３】実施例７により得たカエトミウム サー
モフィルム（Chaetomium thermophilum) ＩＦＯ ９６
７９株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精製酵
素、実施例５により得たアクレモニウム アラバメンセ
(Acremonium alabamense) ＩＦＯ ３２２４１および
チエラビア アレナリア(Thielavia arenaria) ＩＦＯ
３１０６０株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精
製酵素を用いてトレハロース合成反応を行った。３３０
mM グルコース、３３０ mM スクロース、２００mM Ｍ
ＥＳ緩衝液、２０ mM リン酸緩衝液および各トレハロー
スホスホリラーゼ酵素液１単位／ml、市販のスクロース
ホスホリラーゼ（シグマ社）１単位／mlからなる反応組
成液を表５に示す反応温度および反応ｐＨにて反応させ
た。反応時間２０および３０時間後のトレハロース生成
量を表５に示す。
モフィルム（Chaetomium thermophilum) ＩＦＯ ９６
７９株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精製酵
素、実施例５により得たアクレモニウム アラバメンセ
(Acremonium alabamense) ＩＦＯ ３２２４１および
チエラビア アレナリア(Thielavia arenaria) ＩＦＯ
３１０６０株由来のトレハロースホスホリラーゼ部分精
製酵素を用いてトレハロース合成反応を行った。３３０
mM グルコース、３３０ mM スクロース、２００mM Ｍ
ＥＳ緩衝液、２０ mM リン酸緩衝液および各トレハロー
スホスホリラーゼ酵素液１単位／ml、市販のスクロース
ホスホリラーゼ（シグマ社）１単位／mlからなる反応組
成液を表５に示す反応温度および反応ｐＨにて反応させ
た。反応時間２０および３０時間後のトレハロース生成
量を表５に示す。
【００６５】
【表５】
【００６６】
【発明の効果】本発明により、従来トレハロースホスホ
リラーゼの生産が知られていない微生物によるトレハロ
ースホスホリラーゼの調製法が提供される。また、従来
のトレハロースホスホリラーゼと比較して高い温度で反
応できる新規なトレハロースホスホリラーゼが提供され
る。また、カエトミウム（Chaetomium）属またはリゾプ
ス (Rhizopus) 属に属する微生物を培養することにより
該新規トレハロースホスホリラーゼの調製法が提供され
る。さらに、これらトレハロースホスホリラーゼを利用
したα−D −グルコース １−リン酸およびトレハロー
スの製造法が提供される。
リラーゼの生産が知られていない微生物によるトレハロ
ースホスホリラーゼの調製法が提供される。また、従来
のトレハロースホスホリラーゼと比較して高い温度で反
応できる新規なトレハロースホスホリラーゼが提供され
る。また、カエトミウム（Chaetomium）属またはリゾプ
ス (Rhizopus) 属に属する微生物を培養することにより
該新規トレハロースホスホリラーゼの調製法が提供され
る。さらに、これらトレハロースホスホリラーゼを利用
したα−D −グルコース １−リン酸およびトレハロー
スの製造法が提供される。
【図１】本発明トレハロースホスホリラーゼＣの至適pH
範囲を示すグラフである。
範囲を示すグラフである。
【図２】本発明トレハロースホスホリラーゼＲの至適pH
範囲を示すグラフである。
範囲を示すグラフである。
【図３】本発明トレハロースホスホリラーゼＣのpH安定
性範囲を示すグラフである。
性範囲を示すグラフである。
【図４】本発明トレハロースホスホリラーゼＲのpH安定
性範囲を示すグラフである。
性範囲を示すグラフである。
【図５】本発明トレハロースホスホリラーゼＣおよびト
レハロースホスホリラーゼＲの至適反応温度範囲を示す
グラフである。
レハロースホスホリラーゼＲの至適反応温度範囲を示す
グラフである。
【図６】本発明トレハロースホスホリラーゼＣおよびト
レハロースホスホリラーゼＲの温度安定性範囲を示すグ
ラフである。
レハロースホスホリラーゼＲの温度安定性範囲を示すグ
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 幸内 裕 東京都町田市能ケ谷町1480−２−Ａ−404
Claims (23)
- 【請求項１】 アクレモニウム（Acremonium）属、ビソ
チラミス（Byssochlamys）属、セルコスポーラ（Cercos
pora）属、カエトミウム（Chaetomium）属、グロメレラ
（Glomerella）属、フミコラ（Humicola）属、ミセリオ
フィソーラ（Myceliophthora）属、リゾムコール（Rhiz
omucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、ロゼリニア（Ro
sellinia）属、スクレロチニア（Sclerotinia)属、スポ
リジオボルス（Sporidiobolus)属、ステリグマトミセス
（Sterigmatomyces)属、サーモアスカス（Thermoascus)
属、チエラビア（Thielavia)属およびチロミセス（Tyro
myces)属のいずれかに属し、トレハロースホスホリラー
ゼを産生することができる菌株を炭素源、窒素源および
無機塩を含有する適当な栄養培地で培養し、次いで培養
物からトレハロースホスホリラーゼを回収することから
なるトレハロースホスホリラーゼの調製法。 - 【請求項２】 トレハロースホスホリラーゼを産生する
ことができる菌株が、アクレモニウム アラバメンセ
（Acremonium alabamense）、ビソチラミスニベア（By
ssochlamys nivea)、セルコスポーラ ベチコラ（Cerc
ospora beticola）、カエトミウム サーモフィルム
（Chaetomium thermophilum）、グロメレラ シングラ
タ（Glomerella cingulata)、フミコラ グリセア（Hu
micolagrisea）、ミセリオフィソーラ サーモフィラ
（Myceliophthora thermophila)、リゾムコール プシ
ルス（Rhizomucor pusillus）、リゾムコール ミエヘ
イ（Rhizomucor miehei）、リゾプス キネンシス（Rh
izopus chinensis)、リゾプス アジゴスポルス (Rhiz
opus azygosporus)、リゾプス ミクロスポルス（Rhiz
opus microsporus)、ロゼリニア ネカトリクス（Rose
llinia necatrix）、スクレロチニア スクレオチオル
ム(Sclerotinia sclerotiorum）、スポリジオボルス
ジョンソニ(Sporidiobolus john sonii)、ステリグマ
トミセス ハロフィルス(Sterigmatomyces halo phil
us）、サーモアスカス オウランチアクス(Thermoascus
aurantiacus)、チエラビア テレストリス(Thielavia
terrestris）、チエラビア アレナリア(Thielavia
arenaria）およびチロミセスパルストリス(Tyromyces
palustris)種に属するいずれかの菌株である請求項１記
載のトレハロースホスホリラーゼの調製法。 - 【請求項３】 トレハロースホスホリラーゼを産生する
ことができる菌株が、アクレモニウム アラバメンセ
（Acremonium alabamense）ＩＦＯ ３２２４１、ビソ
チラミス ニベア（Byssochlamys nivea)ＩＦＯ ３０
５６９、セルコスポーラ ベチコラ（Cercospora beti
cola）ＩＦＯ ７３９８、カエトミウムサーモフィルム
（Chaetomium thermophilum）ＩＦＯ ９６７９、グロ
メレラシングラタ（Glomerella cingulata)ＩＦＯ７４
７８、フミコラ グリセア（Humicola grisea）ＩＦＯ
９８５４、ミセリオフィソーラ サーモフィラ（Myce
liophthora thermophila)ＩＦＯ ３１８４３、リゾム
コール プシルス（Rhizomucor pusillus）ＩＦＯ ４
５７９、リゾムコール ミエヘイ（Rhizomucormiehei）
ＩＦＯ ９７４０、リゾプス キネンシス（Rhizopus
chinensis)ＩＦＯ ３０４９９、リゾプス キネンシス
（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ ４７６８、リゾプス
キネンシス（Rhizopus chinensis)ＩＦＯ ４７３７、
リゾプス アジゴスポルス (Rhizopus azygosporus)Ｉ
ＦＯ ３１９８９、リゾプスミクロスポルス（Rhizopus
microsporus)ＩＦＯ ３１９８８、ロゼリニア ネカ
トリクス（Rosellinia necatrix）ＩＦＯ ５９５４、
スクレロチニア スクレオチオルム(Sclerotinia scle
rotiorum）ＩＦＯ ４８７６、スポリジオボルス ジョ
ンソニ(Sporidiobolus johnsonii)ＩＦＯ ６９０３、
ステリグマトミセス ハロフィルス(Sterigmatomyces
halophilus）ＩＦＯ １４８８、サーモアスカス オウ
ランチアクス(Thermoascus aurantiacus)ＩＦＯ ３１
６９３、チエラビア テレストリス(Thielavia terres
tris）ＩＦＯ ９７３２、チエラビア アレナリア(Thi
elavia arenaria）ＩＦＯ ３１０６０およびチロミセ
スパルストリス(Tyromyces palustris)ＩＦＯ ３０３
３９のいずれかの菌株である請求項２記載のトレハロー
スホスホリラーゼの調製法。 - 【請求項４】 α−D −グルコース １−リン酸とD −
グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成
し、以下の理化学的性質を有するトレハロースホスホリ
ラーゼＲ。 至適pH：pH５．０から６．０（４５℃） pH安定性：３０℃でそれぞれのpHで１時間処理したとき
pH３．５から１２．５の範囲で安定。 至適温度：４２．５から５０℃（pH６．５） 温度安定性：pH５．５、３０分間処理したとき４２．５
℃以下で安定。 - 【請求項５】 リゾプス（Rhizopus）属の菌株によって
生産されトレハロースと無機リン酸またはその塩に作用
して、α−D −グルコース １−リン酸とD−グルコー
スを生成し、およびα−D −グルコース １−リン酸と
D −グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を
生成する請求項４に記載のトレハロースホスホリラーゼ
Ｒ。 - 【請求項６】 リゾプス（Rhizopus）属に属する菌株が
リゾプス アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus）種
の菌株である請求項５記載のトレハロースホスホリラー
ゼＲ。 - 【請求項７】 リゾプス アジゴスポルス（Rhizopus a
zygosporus）種の菌株がリゾプス アジゴスポルス（Rh
izopus azygosporus）ＩＦＯ ３１９８９株である請求
項６記載のトレハロースホスホリラーゼＲ。 - 【請求項８】 トレハロースホスホリラーゼＲ生産菌株
がリゾプス（Rhizopus）属に属する菌株の変異株または
トレハロースホスホリラーゼＲの遺伝子を遺伝子操作に
よって導入した形質転換株である請求項４に記載のトレ
ハロースホスホリラーゼＲ。 - 【請求項９】 炭素源、および窒素源並びに無機塩を含
有する適当な栄養培地にリゾプス（Rhizopus）属に属す
るトレハロースホスホリラーゼＲ生産株あるいはトレハ
ロースホスホリラーゼＲの遺伝子により形質転換された
トレハロースホスホリラーゼＲ生産株を培養しトレハロ
ースホスホリラーゼＲを産生せしめ、次いで培養物から
トレハロースホスホリラーゼＲを回収することからなる
トレハロースホスホリラーゼＲの調製法。 - 【請求項１０】 α−D −グルコース １−リン酸とD
−グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生
成し、以下の理化学的性質を有するトレハロースホスホ
リラーゼＣ。 至適pH：pH５．０から６．０（４５℃） pH安定性：３０℃でそれぞれのpHで１時間処理したとき
pH３．５から１２．５の範囲で安定。 至適温度：４５から５０℃（pH６．５） 温度安定性：pH６．５、３０分間処理したとき５５℃以
下で安定。 - 【請求項１１】 カエトミウム（Chaetomium）属の菌株
によって生産されトレハロースと無機リン酸またはその
塩に作用して、α−D −グルコース １−リン酸とD −
グルコースを生成し、およびα−D −グルコース １−
リン酸とD −グルコースに作用してトレハロースと無機
リン酸を生成する請求項１０に記載のトレハロースホス
ホリラーゼＣ。 - 【請求項１２】 カエトミウム（Chaetomium）属の菌株
がカエトミウム サーモフィルム（Chaetomium thermo
philum）種の菌株である請求項１１記載のトレハロース
ホスホリラーゼＣ。 - 【請求項１３】 カエトミウム サーモフィルム（Chae
tomium thermophilum）種の菌株がカエトミウム サー
モフィルム（Chaetomium thermophilum）ＩＦＯ ９６
７９株である請求項１２記載のトレハロースホスホリラ
ーゼＣ。 - 【請求項１４】 トレハロースホスホリラーゼＣ生産菌
株がカエトミウム（Chaetomium）属に属する菌株の変異
株またはトレハロースホスホリラーゼＣの遺伝子を遺伝
子操作によって導入した形質転換株である請求項１０に
記載のトレハロースホスホリラーゼＣ。 - 【請求項１５】 炭素源、および窒素源並びに無機塩を
含有する適当な栄養培地にカエトミウム（Chaetomium）
属に属するトレハロースホスホリラーゼＣ生産株あるい
はトレハロースホスホリラーゼＣの遺伝子により形質転
換されたトレハロースホスホリラーゼＣ生産株を培養し
てトレハロースホスホリラーゼＣを産生せしめ、次いで
培養物からトレハロースホスホリラーゼＣを回収するこ
とからなるトレハロースホスホリラーゼＣの調製法。 - 【請求項１６】 請求項１〜３、９および１５に記載の
いずれかの方法により調製されたトレハロースホスホリ
ラーゼの存在下、水性媒体中でα−D −グルコース １
−リン酸とグルコースを反応させ、水性媒体中にトレハ
ロースを産生せしめ、これを回収することよりなるトレ
ハロースの製造法。 - 【請求項１７】 請求項１〜３、９および１５に記載の
いずれかの方法により調製されたトレハロースホスホリ
ラーゼとスクロースホスホリラーゼの存在下、水性媒体
中でスクロース、グルコース、無機リン酸および／また
はその塩とを反応させ、水性媒体中にトレハロースを産
生せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの
製造法。 - 【請求項１８】 請求項１〜３、９および１５に記載の
いずれかの方法により調製されたトレハロースホスホリ
ラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよびグルコースイ
ソメラーゼの存在下、水性媒体中でスクロース、無機リ
ン酸および／またはその塩とを反応させ、水性媒体中に
トレハロースを産生せしめ、これを回収することよりな
るトレハロースの製造法。 - 【請求項１９】 請求項１〜３、９および１５に記載の
いずれかの方法により調製されたトレハロースホスホリ
ラーゼの存在下、水性媒体中でトレハロースと無機リン
酸および／またはその塩からα−D −グルコース １−
リン酸を生成せしめ、これを回収することよりなるα−
D −グルコース １−リン酸の製造法。 - 【請求項２０】 請求項４〜８および１０〜１４に記載
のいずれかのトレハロースホスホリラーゼの存在下、水
性媒体中でα−D −グルコース １−リン酸とグルコー
スを反応させ、水性媒体中にトレハロースを生成せし
め、これを回収することよりなるトレハロースの製造
法。 - 【請求項２１】 請求項４〜８および１０〜１４に記載
のいずれかのトレハロースホスホリラーゼとスクロース
ホスホリラーゼの存在下、水性媒体中でスクロース、グ
ルコース、無機リン酸および／またはその塩とを反応さ
せ、水性媒体中にトレハロースを製造せしめ、これを回
収することよりなるトレハロースの製造法。 - 【請求項２２】 請求項４〜８および１０〜１４に記載
のいずれかのトレハロースホスホリラーゼ、スクロース
ホスホリラーゼおよびグルコースイソメラーゼの存在
下、水性媒体中でスクロース、無機リン酸および／また
はその塩とを反応させ、水性媒体中にトレハロースを生
成せしめ、これを回収することよりなるトレハロースの
製造法。 - 【請求項２３】 請求項４〜８および１０〜１４に記載
のいずれかのトレハロースホスホリラーゼからなる酵素
源の存在下、トレハロースと無機リン酸および／または
その塩からα−D −グルコース １−リン酸を生成せし
め、これを回収することよりなるα−D −グルコース
１−リン酸の製造法。
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