JP2788174B2 - 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 - Google Patents
新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼ及びその製造法に関する。
ジノハイドロラーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】人間の血清中や尿中に存在するクレアチ
ン及びクレアチニンは、人間の病気の診断、特に腎疾患
の指標となることが知られている。現在までその主要な
定量法として化学的定量法であるヤッフェ法が知られて
いるが、操作法が煩雑であり、特異性が低い等の問題が
あった。そこで、クレアチニン、クレアチンの酵素的定
量法が開発された。この方法は、先ず、クレアチニンを
クレアチニンアミジノハイドロラーゼにより加水分解
し、クレアチンを生成させ、次いで、クレアチンアミジ
ノハイドロラーゼによりザルコシンと尿素を生成させ
る。最後に、ザルコシンオキシターゼをザルコシンに作
用させることで先のクレアチニンを定量するものであ
る。この方法は簡便なうえ、特異性が先の方法に比べて
高いため、臨床検査において近来急速に普及している。
ン及びクレアチニンは、人間の病気の診断、特に腎疾患
の指標となることが知られている。現在までその主要な
定量法として化学的定量法であるヤッフェ法が知られて
いるが、操作法が煩雑であり、特異性が低い等の問題が
あった。そこで、クレアチニン、クレアチンの酵素的定
量法が開発された。この方法は、先ず、クレアチニンを
クレアチニンアミジノハイドロラーゼにより加水分解
し、クレアチンを生成させ、次いで、クレアチンアミジ
ノハイドロラーゼによりザルコシンと尿素を生成させ
る。最後に、ザルコシンオキシターゼをザルコシンに作
用させることで先のクレアチニンを定量するものであ
る。この方法は簡便なうえ、特異性が先の方法に比べて
高いため、臨床検査において近来急速に普及している。
【０００３】そして、従来、上記クレアチンアミジノハ
イドロラーゼとしては、例えば、特公平3-76915号公報
記載のものが知られている。
イドロラーゼとしては、例えば、特公平3-76915号公報
記載のものが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
クレアチンアミジノハイドロラーゼは、pH安定性が4.5
〜8.5と狭く、pH8.5を超える高pH領域において不安定で
あるため、該pH領域下での精製が困難であり、又、Km値
が大きいため、試料測定のために長時間を要するなどの
欠点があった。
クレアチンアミジノハイドロラーゼは、pH安定性が4.5
〜8.5と狭く、pH8.5を超える高pH領域において不安定で
あるため、該pH領域下での精製が困難であり、又、Km値
が大きいため、試料測定のために長時間を要するなどの
欠点があった。
【０００５】本発明は、高pH領域において安定で、か
つ、Km値の小さいクレアチンアミジノハイドロラーゼを
提供することを目的とするものである。
つ、Km値の小さいクレアチンアミジノハイドロラーゼを
提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
広く自然界より上記欠点のない新規なクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼを生産しえる微生物の検索を行なった
結果、土壌中より分離したアルカリゲネス(Alcaligene
s)属に属する１菌株が、上記欠点のないクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを生産すること等の知見を得、本発
明を完成した。
広く自然界より上記欠点のない新規なクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼを生産しえる微生物の検索を行なった
結果、土壌中より分離したアルカリゲネス(Alcaligene
s)属に属する１菌株が、上記欠点のないクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを生産すること等の知見を得、本発
明を完成した。
【０００７】即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有
する新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼであり、 (a) 作用：１モルのクレアチンを加水分解し、１モルの
ザルコシンと１モルの尿素を生成する。 (b) 基質特異性：クレアチンに基質特異性を有する。 (c) 至適pH：７〜９ (d) 至適温度：35〜45℃程度。 (e) pH安定性：25℃、17時間処理により、pH5.0〜10.5
で安定。 (f) 熱安定性：pH7.5、30分間処理により、45℃程度迄
安定。 (g) 阻害剤：AgNO3、HgCl2、CuSO4等。 (h) 分子量：約80,000±5000（ゲル濾過法）。
する新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼであり、 (a) 作用：１モルのクレアチンを加水分解し、１モルの
ザルコシンと１モルの尿素を生成する。 (b) 基質特異性：クレアチンに基質特異性を有する。 (c) 至適pH：７〜９ (d) 至適温度：35〜45℃程度。 (e) pH安定性：25℃、17時間処理により、pH5.0〜10.5
で安定。 (f) 熱安定性：pH7.5、30分間処理により、45℃程度迄
安定。 (g) 阻害剤：AgNO3、HgCl2、CuSO4等。 (h) 分子量：約80,000±5000（ゲル濾過法）。
【０００８】また、本発明は、アルカリゲネス属に属
し、上記クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有
する微生物を培地に培養し、培養物から該クレアチンア
ミジノハイドロラーゼを採取することを特徴とする新規
なクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
し、上記クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有
する微生物を培地に培養し、培養物から該クレアチンア
ミジノハイドロラーゼを採取することを特徴とする新規
なクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明の新規なクレアチンアミジノハイド
ロラーゼ（以下、単に「本酵素」という。）の製造に使
用される菌株としては、アルカリゲネス（Alcaligenes)
属に属し、本酵素を生産する微生物であれば如何なる菌
でもよく、またこれらの菌の変種若しくは変異株でも良
い。そして、その微生物の具体例としては、アルカリゲ
ネス・エスピー．（Alcaligenes sp.)KS-85が挙げられ
る。
ロラーゼ（以下、単に「本酵素」という。）の製造に使
用される菌株としては、アルカリゲネス（Alcaligenes)
属に属し、本酵素を生産する微生物であれば如何なる菌
でもよく、またこれらの菌の変種若しくは変異株でも良
い。そして、その微生物の具体例としては、アルカリゲ
ネス・エスピー．（Alcaligenes sp.)KS-85が挙げられ
る。
【００１０】また、アルカリゲネス・エスピー．KS-85
株は、京都府内の土壌中より新たに検索して得た菌株
で、その菌学的性質は以下に示す通りである。菌学的性
質の同定のための実験法は、主として長谷川武治編著
「微生物の分類と同定」東京大学出版会（1975年）によ
って行なった。また分類同定の基準としてバージーズ・
マニュアル・オブ・デターミネィティブ・バクテリオロ
ジー第８版（1974年）を参考にした。 〔アルカリゲネス・エスピー． KS-85 の菌学的性質〕 (A) 形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地(pH9.0)上で、30℃、24〜4
8時間培養） (1) 細胞の形及び大きさ：0.5〜1.0×0.5〜4.0ミクロン
の直状桿菌である。 (2) 運動性の有無：周毛を有し、運動性を有する。 (3) 胞子の有無：無し (4) グラム染色性：陰性。 (5) 抗酸性：陰性。 (B) 各培地(pH8.0)における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 30℃、５日間の培養で、直径２〜３mmの淡黄色の円形コ
ロニ−を形成する。表面は円滑で脂肪様光沢があり、周
縁は透明である。（白っぽいが淡い黄色味も帯びてい
る） (2) 肉汁寒天斜面培養 30℃、９日間の静置培養で拡布状の生育を示す。色はベ
ージュ色の菌体で、色素の産生は認められない。 (3) 肉汁液体培養 30℃、９日間の静置培養で、培地液面に膜状に生育し、
下部に沈殿を生成する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、30日間の静置培養で、培地上部にのみ生育し、ゼ
ラチンを液化しない。 (5) リトマスミルク 30℃、９日間の静置培養で、リトマスミルクの凝固、液
化は認められないが、培地中でアルカリを産出し培地初
発pHを、上昇させる。 (C) 生理的性質 主に pH6.5に調整した培地を用いて試験した。 (1) 硝酸塩の還元：還元しない。 (2) 脱窒反応：無し。（好気的条件下では亜硝酸塩を生
成） (3) MRテスト：陰性。 (4) VPテスト：陰性。 (5) インドールの生成：生成しない。 (6) 硫化水素の生成：生成しない。 (7) デンプンの加水分解：加水分解しない。 (8) クエン酸の利用：利用しない。 (9) 無機窒素源の利用：利用しない（硝酸塩及びアンモ
ニウム塩）。 (10) 色素の生成：生成しない。 (11) ウレアーゼ：陰性。 (12) オキシダーゼ：陽性。 (13) カタラーゼ：陽性。 (14) 生育の範囲：温度；15〜45℃、pH；6.0〜9.0 (15) 酸素に対する態度：好気性。 (16) Ｏ〜Ｆテスト（Hugh-Leifson法）：酸化、発酵共
に無し (17) 糖類からの酸及びガスの生成：無し。（下記の糖
類について検討した） L-アラビノ−ス、D-キシロ−ス、D-グルコ−ス、D-マン
ノ−ス、D-フラクト−ス、D-ガラクト−ス、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロ−ス、D-ソルビット、D-マンニッ
ト、イノシット、グリセリン、デンプン 上記した菌学的性質から、本菌株は、アルカリゲネス属
に属するものと判定された。従って本菌株を、アルカリ
ゲネス・エスピー．（Alcaligenes sp.）KS-85と同定命
名した。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
にFERM BP-4487として寄託されている。
株は、京都府内の土壌中より新たに検索して得た菌株
で、その菌学的性質は以下に示す通りである。菌学的性
質の同定のための実験法は、主として長谷川武治編著
「微生物の分類と同定」東京大学出版会（1975年）によ
って行なった。また分類同定の基準としてバージーズ・
マニュアル・オブ・デターミネィティブ・バクテリオロ
ジー第８版（1974年）を参考にした。 〔アルカリゲネス・エスピー． KS-85 の菌学的性質〕 (A) 形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地(pH9.0)上で、30℃、24〜4
8時間培養） (1) 細胞の形及び大きさ：0.5〜1.0×0.5〜4.0ミクロン
の直状桿菌である。 (2) 運動性の有無：周毛を有し、運動性を有する。 (3) 胞子の有無：無し (4) グラム染色性：陰性。 (5) 抗酸性：陰性。 (B) 各培地(pH8.0)における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 30℃、５日間の培養で、直径２〜３mmの淡黄色の円形コ
ロニ−を形成する。表面は円滑で脂肪様光沢があり、周
縁は透明である。（白っぽいが淡い黄色味も帯びてい
る） (2) 肉汁寒天斜面培養 30℃、９日間の静置培養で拡布状の生育を示す。色はベ
ージュ色の菌体で、色素の産生は認められない。 (3) 肉汁液体培養 30℃、９日間の静置培養で、培地液面に膜状に生育し、
下部に沈殿を生成する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、30日間の静置培養で、培地上部にのみ生育し、ゼ
ラチンを液化しない。 (5) リトマスミルク 30℃、９日間の静置培養で、リトマスミルクの凝固、液
化は認められないが、培地中でアルカリを産出し培地初
発pHを、上昇させる。 (C) 生理的性質 主に pH6.5に調整した培地を用いて試験した。 (1) 硝酸塩の還元：還元しない。 (2) 脱窒反応：無し。（好気的条件下では亜硝酸塩を生
成） (3) MRテスト：陰性。 (4) VPテスト：陰性。 (5) インドールの生成：生成しない。 (6) 硫化水素の生成：生成しない。 (7) デンプンの加水分解：加水分解しない。 (8) クエン酸の利用：利用しない。 (9) 無機窒素源の利用：利用しない（硝酸塩及びアンモ
ニウム塩）。 (10) 色素の生成：生成しない。 (11) ウレアーゼ：陰性。 (12) オキシダーゼ：陽性。 (13) カタラーゼ：陽性。 (14) 生育の範囲：温度；15〜45℃、pH；6.0〜9.0 (15) 酸素に対する態度：好気性。 (16) Ｏ〜Ｆテスト（Hugh-Leifson法）：酸化、発酵共
に無し (17) 糖類からの酸及びガスの生成：無し。（下記の糖
類について検討した） L-アラビノ−ス、D-キシロ−ス、D-グルコ−ス、D-マン
ノ−ス、D-フラクト−ス、D-ガラクト−ス、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロ−ス、D-ソルビット、D-マンニッ
ト、イノシット、グリセリン、デンプン 上記した菌学的性質から、本菌株は、アルカリゲネス属
に属するものと判定された。従って本菌株を、アルカリ
ゲネス・エスピー．（Alcaligenes sp.）KS-85と同定命
名した。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
にFERM BP-4487として寄託されている。
【００１１】本発明に使用する上記菌株を用いて、本酵
素を生産するには、クレアチン、クレアチニンを含む培
地での液体培養法を採用することが好ましい。そして生
産培地としては、微生物の培養に通常用いられるものが
広く使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合
物であればよく、例えばクレアチン、クレアチニン、酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカ
ー、大豆粉、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウム等が使
用される。炭素源として、同化可能な炭素化合物であれ
ば良く、例えば、クレアチン、クレアチニン、糖蜜等が
使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸第一カリウ
ム、リン酸第二カリウム、等の種々の塩類、ビタミン
類、消泡剤等が使用される。これらの栄養源は夫々単独
で用いることもでき、また、組み合わせて用いることも
できる。
素を生産するには、クレアチン、クレアチニンを含む培
地での液体培養法を採用することが好ましい。そして生
産培地としては、微生物の培養に通常用いられるものが
広く使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合
物であればよく、例えばクレアチン、クレアチニン、酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカ
ー、大豆粉、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウム等が使
用される。炭素源として、同化可能な炭素化合物であれ
ば良く、例えば、クレアチン、クレアチニン、糖蜜等が
使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸第一カリウ
ム、リン酸第二カリウム、等の種々の塩類、ビタミン
類、消泡剤等が使用される。これらの栄養源は夫々単独
で用いることもでき、また、組み合わせて用いることも
できる。
【００１２】上記の如く調製した液体培地を用いて本酵
素を生産するには、通気撹拌深部培養または振盪培養等
により好気的に培養することが好ましい。その際に、例
えば、培地の初発pHを6.5〜7.0程度に調整し、25〜37℃
好ましくは30℃前後の温度で24時間以上培養する。培養
終了後、培養物から本酵素を採取するには、通常の酵素
採取手段を用いることができる。
素を生産するには、通気撹拌深部培養または振盪培養等
により好気的に培養することが好ましい。その際に、例
えば、培地の初発pHを6.5〜7.0程度に調整し、25〜37℃
好ましくは30℃前後の温度で24時間以上培養する。培養
終了後、培養物から本酵素を採取するには、通常の酵素
採取手段を用いることができる。
【００１３】しかし、本酵素は、主に菌体内に蓄積され
るため、培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作
により菌体を分離し、洗菌した後、この菌体から本酵素
を採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま
用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレ
ス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊
する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌
体細胞壁を溶解する方法、トリトン X-100等の界面活性
剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により菌体か
ら本酵素を採取するのが好ましい。
るため、培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作
により菌体を分離し、洗菌した後、この菌体から本酵素
を採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま
用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレ
ス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊
する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌
体細胞壁を溶解する方法、トリトン X-100等の界面活性
剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により菌体か
ら本酵素を採取するのが好ましい。
【００１４】このようにして得られた粗酵素液から本酵
素を単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が
使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ
法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合
わせて行なうのが好ましい。本酵素は、ヒトの血清中又
は尿中のクレアチン量の測定に用いることができ、腎臓
病をはじめとする各種の疾患の診断薬としての利用する
ことができる。
素を単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が
使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ
法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合
わせて行なうのが好ましい。本酵素は、ヒトの血清中又
は尿中のクレアチン量の測定に用いることができ、腎臓
病をはじめとする各種の疾患の診断薬としての利用する
ことができる。
【００１５】また、本酵素は下記の酵素化学的性質、及
び理化学的性質を有する。 (1) 作用：１モルのクレアチンを加水分解し、１モルの
ザルコシンと１モルの尿素を生成する。 (2) 基質特異性：クレアチンに基質特異性を有する。 (3) 至適pH 緩衝液として、50mM酢酸ナトリウム-塩酸緩衝液（pH4.0
〜6.0）、50mMリン酸緩衝液（pH6.0〜7.5）及び50mM Tr
is-HCl緩衝液（pH 7.5〜9.0）を用い、各pHにおける本
酵素の活性測定を行なった結果、図１に示すとおりで、
本酵素の至適pHは7.0〜9.0と認められた。 (4) 至適温度 後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なっ
た結果、図２に示すとおりで、本酵素の至適温度は35〜
45℃と認められた。 (5) pH安定性 緩衝液として、50mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH4.
0〜6.0）、50mMリン酸緩衝液（pH6.0〜8.0）、50mM Tri
s-HCl緩衝液（pH8.0〜9.0）、50mMグリシン-NaOH緩衝液
（pH9.0〜10.0）及び50mM CAPS緩衝液（pH10.0〜11.0)
を用い、pH4.0〜11.0において25℃で17時間夫々処理し
た後、本酵素の残存活性を測定した結果、図３に示す通
りで、安定pH域はpH5.0-10.5であった。 (6) 熱安定性 50mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）を用いて、各温度で30
分間処理した場合の熱安定性の結果は図４に示す通りで
あり、本酵素は45℃程度迄安定であると認められた。 (7)酵素活性測定法 本酵素の活性の測定は、下記条件下において１分間に１
マイクロモルの黄色色素を生成する酵素活性を１単位と
する。 （試薬調整） １液；基質液） クレアチン6.63ｇを50mMリン酸緩衝液、pH7.7、500mlに
溶解する。 ２液；発色液） ρ−ジメチルアミノベンズアルデヒド10ｇを500mlの特
級エタノールに溶解し、レジン水575ml、濃塩酸75mlを
混合したものと混合する。 （測定手順） １）１液 0.9ml を37℃にて５分間プレインキュベーシ
ョンする。 ２）酵素液（1〜2U/ml程度に調整）0.1ml を混合し、37
℃において10分間反応させる。 ３）10分間の反応後、上記２液 ２mlを混合する。 ４）２液と混合後、25℃にて20分間放置し、後に 435nm
の吸光度を測定する。(OD sample） ５）ブランク値の測定は１液 0.9mlを37℃にて10分間イ
ンキュベーションした後、上記２液２mlを混合し、更に
酵素液0.1mlを混合、25℃にて20分間放置し、後に 435n
mの吸光度を測定する。（OD blank） （活性の計算） U/ml ＝ΔOD×18.06*×希釈倍率 （*尿素検量線より算
出した係数） (8) 阻害剤 活性測定法における反応液に、夫々第１表に示す金属塩
を添加して、その影響を調べた結果、第１表に示すとお
りで、AgNO3、HgCl2、CuSO4等により本酵素は強く阻害
された。
び理化学的性質を有する。 (1) 作用：１モルのクレアチンを加水分解し、１モルの
ザルコシンと１モルの尿素を生成する。 (2) 基質特異性：クレアチンに基質特異性を有する。 (3) 至適pH 緩衝液として、50mM酢酸ナトリウム-塩酸緩衝液（pH4.0
〜6.0）、50mMリン酸緩衝液（pH6.0〜7.5）及び50mM Tr
is-HCl緩衝液（pH 7.5〜9.0）を用い、各pHにおける本
酵素の活性測定を行なった結果、図１に示すとおりで、
本酵素の至適pHは7.0〜9.0と認められた。 (4) 至適温度 後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なっ
た結果、図２に示すとおりで、本酵素の至適温度は35〜
45℃と認められた。 (5) pH安定性 緩衝液として、50mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH4.
0〜6.0）、50mMリン酸緩衝液（pH6.0〜8.0）、50mM Tri
s-HCl緩衝液（pH8.0〜9.0）、50mMグリシン-NaOH緩衝液
（pH9.0〜10.0）及び50mM CAPS緩衝液（pH10.0〜11.0)
を用い、pH4.0〜11.0において25℃で17時間夫々処理し
た後、本酵素の残存活性を測定した結果、図３に示す通
りで、安定pH域はpH5.0-10.5であった。 (6) 熱安定性 50mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）を用いて、各温度で30
分間処理した場合の熱安定性の結果は図４に示す通りで
あり、本酵素は45℃程度迄安定であると認められた。 (7)酵素活性測定法 本酵素の活性の測定は、下記条件下において１分間に１
マイクロモルの黄色色素を生成する酵素活性を１単位と
する。 （試薬調整） １液；基質液） クレアチン6.63ｇを50mMリン酸緩衝液、pH7.7、500mlに
溶解する。 ２液；発色液） ρ−ジメチルアミノベンズアルデヒド10ｇを500mlの特
級エタノールに溶解し、レジン水575ml、濃塩酸75mlを
混合したものと混合する。 （測定手順） １）１液 0.9ml を37℃にて５分間プレインキュベーシ
ョンする。 ２）酵素液（1〜2U/ml程度に調整）0.1ml を混合し、37
℃において10分間反応させる。 ３）10分間の反応後、上記２液 ２mlを混合する。 ４）２液と混合後、25℃にて20分間放置し、後に 435nm
の吸光度を測定する。(OD sample） ５）ブランク値の測定は１液 0.9mlを37℃にて10分間イ
ンキュベーションした後、上記２液２mlを混合し、更に
酵素液0.1mlを混合、25℃にて20分間放置し、後に 435n
mの吸光度を測定する。（OD blank） （活性の計算） U/ml ＝ΔOD×18.06*×希釈倍率 （*尿素検量線より算
出した係数） (8) 阻害剤 活性測定法における反応液に、夫々第１表に示す金属塩
を添加して、その影響を調べた結果、第１表に示すとお
りで、AgNO3、HgCl2、CuSO4等により本酵素は強く阻害
された。
【００１６】
【表１】
【００１７】(9) Km値 ラインウエーバー・バークのプロットから、Km値は1.3
×10-2Ｍ（基質クレアチンpH7.7、37℃）であった。 (10) 分子量 TSKgel G3000SWXLによるゲル濾過法で、80,000±5000で
あった。
×10-2Ｍ（基質クレアチンpH7.7、37℃）であった。 (10) 分子量 TSKgel G3000SWXLによるゲル濾過法で、80,000±5000で
あった。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 〔実施例１〕クレアチン 1.6％、ポリペプトン 2.0％、
酵母エキス 0.8％、KH2PO4 0.03％、K2HPO4 0.07％、Mg
SO4 7H2O 0.02％、MnSO4 4H2O 0.02％、及び水道水から
なる培地（pH6.7）100mlを坂口コルベンに分注し、120
℃で10分間殺菌した。初発pHを確認した後、アルカリゲ
ネス・エスピー KS-85（FERM BP-4487）の保存スラント
より１白金耳接種し、これを振盪機にて 30℃で約24時
間振盪培養し、種培養液とした。そして、別に上記と同
様にして調製、殺菌し、更に初発pHを6.7に調整した培
地20Lを含む30L容ジャーへ上記種培養液100ml（坂口コ
ルベン１本分）を接種し、回転数450rpm、通気量20L／m
in、30℃で約24時間培養した。
明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 〔実施例１〕クレアチン 1.6％、ポリペプトン 2.0％、
酵母エキス 0.8％、KH2PO4 0.03％、K2HPO4 0.07％、Mg
SO4 7H2O 0.02％、MnSO4 4H2O 0.02％、及び水道水から
なる培地（pH6.7）100mlを坂口コルベンに分注し、120
℃で10分間殺菌した。初発pHを確認した後、アルカリゲ
ネス・エスピー KS-85（FERM BP-4487）の保存スラント
より１白金耳接種し、これを振盪機にて 30℃で約24時
間振盪培養し、種培養液とした。そして、別に上記と同
様にして調製、殺菌し、更に初発pHを6.7に調整した培
地20Lを含む30L容ジャーへ上記種培養液100ml（坂口コ
ルベン１本分）を接種し、回転数450rpm、通気量20L／m
in、30℃で約24時間培養した。
【００１９】培養終了後、培養液20Lからマイクローザ
（旭化成社製、PW-303）を用いて菌体を集め、20mMリン
酸緩衝液（pH7.5）にて菌体を洗浄した後、菌体を同緩
衝液約10Lに懸濁した。 ステップ１（粗酵素液の調製）：上記菌体懸濁液（10
L）に、リゾチーム 20g(50mMリン酸緩衝液 pH8.0、100m
l) と0.55M EDTA、pH8.0、１L添加、混合し、30℃で一
晩放置した後、５％プロタミン水溶液（pH8.0）500mlを
撹拌しながら滴下して除核酸処理を行った。この上澄液
を限外濾過膜を用いて10mM CAPS-NaOH緩衝液（pH10.0)
〔以下、緩衝液Ａと略称する〕に対して透析した。
（旭化成社製、PW-303）を用いて菌体を集め、20mMリン
酸緩衝液（pH7.5）にて菌体を洗浄した後、菌体を同緩
衝液約10Lに懸濁した。 ステップ１（粗酵素液の調製）：上記菌体懸濁液（10
L）に、リゾチーム 20g(50mMリン酸緩衝液 pH8.0、100m
l) と0.55M EDTA、pH8.0、１L添加、混合し、30℃で一
晩放置した後、５％プロタミン水溶液（pH8.0）500mlを
撹拌しながら滴下して除核酸処理を行った。この上澄液
を限外濾過膜を用いて10mM CAPS-NaOH緩衝液（pH10.0)
〔以下、緩衝液Ａと略称する〕に対して透析した。
【００２０】ステップ２（DEAE-セルロース処理）：透
析液（約28L）に、湿重量で約９kgのDEAE-セルロースを
添加、混合して、本酵素を吸着させた後、５％グリセリ
ンと0.005％ ２-メルカプトエタノール含有緩衝液Ａに
てDEAE-セルロースを洗浄し、次に、0.5M KCl含有緩衝
液Ａにて本酵素を溶出して、限外濃縮した。ステップ３
（DEAE-セファロース-CL6B処理):濃縮液（約1.0L）に、
緩衝液Ａで緩衝化させた湿重量で約1.0kgのDEAE-セファ
ロース-CL6Bを添加、混合して、本酵素を吸着させ0.05M
KCl含有緩衝液ＡにてDEAE-セファロース-CL6Bを洗浄
し、次に、緩衝Ａにて本酵素を溶出して、限外濃縮し
た。
析液（約28L）に、湿重量で約９kgのDEAE-セルロースを
添加、混合して、本酵素を吸着させた後、５％グリセリ
ンと0.005％ ２-メルカプトエタノール含有緩衝液Ａに
てDEAE-セルロースを洗浄し、次に、0.5M KCl含有緩衝
液Ａにて本酵素を溶出して、限外濃縮した。ステップ３
（DEAE-セファロース-CL6B処理):濃縮液（約1.0L）に、
緩衝液Ａで緩衝化させた湿重量で約1.0kgのDEAE-セファ
ロース-CL6Bを添加、混合して、本酵素を吸着させ0.05M
KCl含有緩衝液ＡにてDEAE-セファロース-CL6Bを洗浄
し、次に、緩衝Ａにて本酵素を溶出して、限外濃縮し
た。
【００２１】ステップ４（セファクリルS-200処理）：
濃縮液（約1.0L）をカラムに積めたセファクリルS-200
にて分子ふるいを行ない、活性画分（2.2g）を収集し
た。活性画分の比活性は9.0U/OD280nmであった。 実施例２ 本酵素の基質特異性及び反応性における優位性を示すた
め、本酵素と既存のクレアチンアミジノハイドロラーゼ
（東洋紡社製、ＣＲＨ−211）の一定量を一定量の基質
と反応させ、その反応経過を経時的に追うことで両者の
比較を行なった。この測定においてはクレアチンのクレ
アチンアミジノハイドロラーゼによる生成物ザルコシン
をザルコシンオキシターゼにより分解、生成される過酸
化水素を発色試薬により発色させ、510nm の吸光度によ
り定量している。ここで用いられている基質液のクレア
チン濃度は希薄であるために、10〜20分間の反応で完全
に分解され、OD 510nmは最終的に一定値に達することと
なる。従って、OD 510nmが一定値に達する迄の時間が短
ければ短いほどその基質特異性、及び酵素反応性は優れ
ているといえる。 １．試薬の調製 本実施例に用いる試薬及びその濃度を表２に示す。
濃縮液（約1.0L）をカラムに積めたセファクリルS-200
にて分子ふるいを行ない、活性画分（2.2g）を収集し
た。活性画分の比活性は9.0U/OD280nmであった。 実施例２ 本酵素の基質特異性及び反応性における優位性を示すた
め、本酵素と既存のクレアチンアミジノハイドロラーゼ
（東洋紡社製、ＣＲＨ−211）の一定量を一定量の基質
と反応させ、その反応経過を経時的に追うことで両者の
比較を行なった。この測定においてはクレアチンのクレ
アチンアミジノハイドロラーゼによる生成物ザルコシン
をザルコシンオキシターゼにより分解、生成される過酸
化水素を発色試薬により発色させ、510nm の吸光度によ
り定量している。ここで用いられている基質液のクレア
チン濃度は希薄であるために、10〜20分間の反応で完全
に分解され、OD 510nmは最終的に一定値に達することと
なる。従って、OD 510nmが一定値に達する迄の時間が短
ければ短いほどその基質特異性、及び酵素反応性は優れ
ているといえる。 １．試薬の調製 本実施例に用いる試薬及びその濃度を表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】２．測定方法 クレアチン基質液 0.2ml、2-4ジクロロフェノール 0.1m
l、4-アミノアンチピリン 0.1ml、ザルコシンオキシダ
ーゼ 0.4ml、ペルオキシダーゼ 0.2mlを混合し、37℃で
３分間インキュベーションを行った。次に、この混合液
にクレアチンアミジノハイドロラーゼ（20U/ml）を１ml
加え、15秒間放置した後、分光光度計（日立U-2000）に
より37℃下でOD 510nmを30秒おきに測定した。
l、4-アミノアンチピリン 0.1ml、ザルコシンオキシダ
ーゼ 0.4ml、ペルオキシダーゼ 0.2mlを混合し、37℃で
３分間インキュベーションを行った。次に、この混合液
にクレアチンアミジノハイドロラーゼ（20U/ml）を１ml
加え、15秒間放置した後、分光光度計（日立U-2000）に
より37℃下でOD 510nmを30秒おきに測定した。
【００２４】以上の結果を図５に記す。図５において本
酵素が反応開始後、400秒で一定値に達しているのに対
し、既存のクレアチンアミジノハイドロラーゼは、反応
開始後、600秒においても一定値に達していないことが
判る。この結果は、本酵素が既存のクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼより基質特異性、基質との反応性の点で
優れていることを示している。
酵素が反応開始後、400秒で一定値に達しているのに対
し、既存のクレアチンアミジノハイドロラーゼは、反応
開始後、600秒においても一定値に達していないことが
判る。この結果は、本酵素が既存のクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼより基質特異性、基質との反応性の点で
優れていることを示している。
【００２５】
【発明の効果】本発明は、新規なクレアチンアミジノハ
イドロラーゼを提供するものである。本発明の酵素は、
高pH領域でも精製が可能であるため、従来の酵素にくら
べ容易にかつ簡便に製造することができる。また、Km値
が小さいため、１試料当たりの測定時間の短縮化、使用
する酵素量の低減化を図ることもできる。従って、本発
明のクレアチンアミジノハイドロラーゼは産業上極めて
有用である。
イドロラーゼを提供するものである。本発明の酵素は、
高pH領域でも精製が可能であるため、従来の酵素にくら
べ容易にかつ簡便に製造することができる。また、Km値
が小さいため、１試料当たりの測定時間の短縮化、使用
する酵素量の低減化を図ることもできる。従って、本発
明のクレアチンアミジノハイドロラーゼは産業上極めて
有用である。
【図１】 本酵素の至適pHを示す図である。
【図２】 本酵素の至適温度を示す図である。
【図３】 本酵素のpH安定性を示す図である。
【図４】 本酵素の熱安定性を示す図である。
【図５】 本酵素と既存酵素基質特異性、反応性の違い
を示すため一定量の酵素で一定量の基質を分解する過程
を経時的に追った図である。
を示すため一定量の酵素で一定量の基質を分解する過程
を経時的に追った図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＣＨＥＭ ＰＨＡＲＭ ＢＵＬＬ （ＴＯＫＹＯ），34（５） （1986）, Ｐ．2155−2160 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有する新規なクレア
チンアミジノハイドロラーゼ。 (a) 作用：１モルのクレアチンを加水分解し、１モルの
ザルコシンと１モルの尿素を生成する、 (b) 基質特異性：クレアチンに基質特異性を有する、 (c) 至適 pH ：７〜９、 (d) 至適温度： 35 〜45℃程度、 (e) pH安定性： 25 ℃, 17時間処理により、pH 5.0〜1
0.5で安定、 (f) 熱安定性： pH 7.5 、30分間処理により、45℃程度
迄安定、 (g) 阻害剤：AgNO3、HgCl2、CuSO4 等、 (h) 分子量：約80,000±5000（ゲル濾過法）、(i) Km値：1.3 ×10 -2 Ｍ 。 - 【請求項２】アルカリゲネス属に属し、請求項１記載の
クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する微生
物を培地に培養し、培養物から該クレアチンアミジノハ
イドロラーゼを採取することを特徴とする新規なクレア
チンアミジノハイドロラーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5318675A JP2788174B2 (ja) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
| US08/343,972 US5451520A (en) | 1993-12-17 | 1994-11-18 | Creatine amidinohydrolase from alkaligenes sp. ks-85 ferm bp-4487 |
| DE4445084A DE4445084B4 (de) | 1993-12-17 | 1994-12-16 | Neue Kreatinamidinohydrolase und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5318675A JP2788174B2 (ja) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07170979A JPH07170979A (ja) | 1995-07-11 |
| JP2788174B2 true JP2788174B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=18101777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5318675A Expired - Fee Related JP2788174B2 (ja) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5451520A (ja) |
| JP (1) | JP2788174B2 (ja) |
| DE (1) | DE4445084B4 (ja) |
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| JP3325128B2 (ja) * | 1994-09-29 | 2002-09-17 | キッコーマン株式会社 | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 |
| US5780239A (en) * | 1994-11-23 | 1998-07-14 | Carter; Jesse M. | Method for the determination of cast in urine |
| JP3075390B2 (ja) * | 1996-02-13 | 2000-08-14 | 東洋紡績株式会社 | 新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、その製法およびその用途 |
| JP3206894B2 (ja) * | 1996-07-25 | 2001-09-10 | 理化学研究所 | 酵素を熱活性化する方法 |
| US5908864A (en) * | 1998-05-28 | 1999-06-01 | Dymatize Enterprises | Creatine gel |
| JP2000157279A (ja) | 1998-11-25 | 2000-06-13 | Kikkoman Corp | クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
| JP3773160B2 (ja) * | 1999-01-01 | 2006-05-10 | キッコーマン株式会社 | 耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
| CA2404293C (en) * | 2001-09-20 | 2007-05-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Variants of an erwinia-type creatinase |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122248A1 (de) * | 1971-05-05 | 1973-04-12 | Universal Trocknungsanlagen Gm | Schnelloesliches milchkoagulumagglomerat und verfahren zu dessen herstellung |
| DE2167120C2 (de) * | 1971-05-05 | 1980-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von löslicher Creatin-amidinohydrolase |
-
1993
- 1993-12-17 JP JP5318675A patent/JP2788174B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-11-18 US US08/343,972 patent/US5451520A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-16 DE DE4445084A patent/DE4445084B4/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣＨＥＭ ＰＨＡＲＭ ＢＵＬＬ （ＴＯＫＹＯ），３４（５） （１９８６），Ｐ．２１５５−２１６０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07170979A (ja) | 1995-07-11 |
| US5451520A (en) | 1995-09-19 |
| DE4445084A1 (de) | 1995-06-22 |
| DE4445084B4 (de) | 2006-02-09 |
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