JP2553360B2 - 免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬 - Google Patents
免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試
薬、更に詳細には試料中に存在する特定の抗原もしくは
抗体を簡単な操作で感度よく測定することのできる免疫
分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬に関する。
薬、更に詳細には試料中に存在する特定の抗原もしくは
抗体を簡単な操作で感度よく測定することのできる免疫
分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬に関する。
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患
の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものと
なつており、この方法は標識法と非標識法とに大別する
ことができる。
の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものと
なつており、この方法は標識法と非標識法とに大別する
ことができる。
これらの内で感度の点で優れている標識免疫測定法を
実施するためには各種の標識物質（マーカー）例えばラ
ジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等
が用いられて来た。標識物質としては感度の点からラジ
オアイソトープが従来汎用されて来たがラジオアイソト
ープ試薬はその半減期がある上に不安定であり放射能障
害や高価な施設の使用に問題点があるために、螢光物質
や酵素を標識とする測定法がその感度向上に関する研究
と相俟つて一層注目を集めるに至つている。
実施するためには各種の標識物質（マーカー）例えばラ
ジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等
が用いられて来た。標識物質としては感度の点からラジ
オアイソトープが従来汎用されて来たがラジオアイソト
ープ試薬はその半減期がある上に不安定であり放射能障
害や高価な施設の使用に問題点があるために、螢光物質
や酵素を標識とする測定法がその感度向上に関する研究
と相俟つて一層注目を集めるに至つている。
螢光物質又は酵素を標識物質とする免疫測定法には、
現在、標識物質の内で抗原抗体反応で結合したものと結
合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテロ
ジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程を
必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
現在、標識物質の内で抗原抗体反応で結合したものと結
合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテロ
ジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程を
必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
ヘテロジニアスな系を使用する免疫測定法としてはラ
ジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用されて
いる２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物
と既反応物とを分離することを必須とするものであり、
この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量の迅速化
が困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモジニ
アスな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃
することによる定量の簡便化、迅速化を目的として提案
されたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲
が狭いために抗原又は抗体の定量用として実用化される
に至つていないのが実情である。
ジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用されて
いる２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物
と既反応物とを分離することを必須とするものであり、
この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量の迅速化
が困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモジニ
アスな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃
することによる定量の簡便化、迅速化を目的として提案
されたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲
が狭いために抗原又は抗体の定量用として実用化される
に至つていないのが実情である。
斯かる問題点を克服する方法として、近年、マーカー
を封入させたエステル型リン脂質とコレステロールを構
成成分とするリポソームを調製してこれに抗原又は抗体
を感作させ、この感作リポソームを検体と共存させてリ
ポソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗
体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この
複合体を特異的に破壊させてリポソームから流出するマ
ーカーを測定し、一方上記と同様の感作リポソームを種
々既知量の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様に
流出マーカーを測定して標準検量線を予め作成してお
き、検体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合
させて、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。こ
の免疫分析方法によれば、前述の問題点を解消して、短
時間のうちに均一系で被検物質を簡単に定量することが
できる。
を封入させたエステル型リン脂質とコレステロールを構
成成分とするリポソームを調製してこれに抗原又は抗体
を感作させ、この感作リポソームを検体と共存させてリ
ポソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗
体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この
複合体を特異的に破壊させてリポソームから流出するマ
ーカーを測定し、一方上記と同様の感作リポソームを種
々既知量の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様に
流出マーカーを測定して標準検量線を予め作成してお
き、検体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合
させて、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。こ
の免疫分析方法によれば、前述の問題点を解消して、短
時間のうちに均一系で被検物質を簡単に定量することが
できる。
しかしながら、このエステル型リン脂質とコレステロ
ールで構成されるリポソームを用いる免疫分析方法にお
いては、リポソームに封入された標識物質のリポソーム
内への保持安定生が不充分であり、リポソーム保存中に
標識物質が漏出し、そのため被検物質の定量値に影響を
及ぼすという問題があつた。
ールで構成されるリポソームを用いる免疫分析方法にお
いては、リポソームに封入された標識物質のリポソーム
内への保持安定生が不充分であり、リポソーム保存中に
標識物質が漏出し、そのため被検物質の定量値に影響を
及ぼすという問題があつた。
かかる実状に鑑み、本発明者は上記問題点を解決すべ
く種々検討を重ねた結果、リポソームの構成成分である
リン脂質にアミド型リン脂質を含有せしめることによ
り、標識物質のリポソーム内への保持安定性が向上し、
被検物質の測定感度が高くなることを見い出し、本発明
を完成した。
く種々検討を重ねた結果、リポソームの構成成分である
リン脂質にアミド型リン脂質を含有せしめることによ
り、標識物質のリポソーム内への保持安定性が向上し、
被検物質の測定感度が高くなることを見い出し、本発明
を完成した。
すなわち、本発明は下記一般式（Ｉ） （式中、R1およびR2はそれぞれ炭素数11〜17のアルキル
基を示す）で表わされるアミド型リン脂質を５重量％以
上含むリン脂質およびコレステロールを必須構成成分と
するリポソームの内部に標識物質が封入され、外側に被
検物質と特異的に反応する抗原もしくは抗体を架橋剤を
介して固定化してなるリポソーム試薬と被検物質とを補
体の存在下に反応させ、該リポソーム試薬から遊離する
標識物質を測定することによつて被検物質を定量するこ
とを特徴とする免疫分析法、並びに当該リポソーム試薬
を含有する免疫分析用試薬を提供するものである。
基を示す）で表わされるアミド型リン脂質を５重量％以
上含むリン脂質およびコレステロールを必須構成成分と
するリポソームの内部に標識物質が封入され、外側に被
検物質と特異的に反応する抗原もしくは抗体を架橋剤を
介して固定化してなるリポソーム試薬と被検物質とを補
体の存在下に反応させ、該リポソーム試薬から遊離する
標識物質を測定することによつて被検物質を定量するこ
とを特徴とする免疫分析法、並びに当該リポソーム試薬
を含有する免疫分析用試薬を提供するものである。
本発明において用いられるリポーソームは、アミド型
リン脂質を含むリン脂質およびコレステロールを必須の
構成成分とするものである。アミド型リン脂質は前記一
般式（Ｉ）で表わされるものである。
リン脂質を含むリン脂質およびコレステロールを必須の
構成成分とするものである。アミド型リン脂質は前記一
般式（Ｉ）で表わされるものである。
上記アミド型リン脂質以外のリン脂質としては、通常
リポソームの調製に用いられるエステル型リン脂質、例
えばホスフアチジルコリン、ホスフアチジルエタノール
アミン、ホスフアチジン酸等が挙げられる。
リポソームの調製に用いられるエステル型リン脂質、例
えばホスフアチジルコリン、ホスフアチジルエタノール
アミン、ホスフアチジン酸等が挙げられる。
アミド型リン脂質は、リポソームを構成するリン脂質
中に５重量％以上配合するのが好ましい。
中に５重量％以上配合するのが好ましい。
コレステロールの使用量は、安定なリポソームを得る
ためには、全リン脂質量の0.5〜２倍であることが好ま
しい。
ためには、全リン脂質量の0.5〜２倍であることが好ま
しい。
リポーム内に封入される標識物質は、親水性であつ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシルフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフエリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酵素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシユークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシルフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフエリンのような発光
性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酵素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシユークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。
リポソームの外側に固定化される抗原もしくは抗体
は、被検物質が抗原である場合にはそれに対する抗体で
あり、被検物質が抗体である場合にはその抗原である。
ここで用いられる抗体は、その抗原に特異的に反応性を
有すれば、ポリクローナルとモノクローナルとを問わな
い。
は、被検物質が抗原である場合にはそれに対する抗体で
あり、被検物質が抗体である場合にはその抗原である。
ここで用いられる抗体は、その抗原に特異的に反応性を
有すれば、ポリクローナルとモノクローナルとを問わな
い。
本発明で用いる内部に標識物質が封入され、外側に被
検物質と特異的に反応する抗原もしくは抗体を架橋剤を
介して固定化してなるリポソーム試薬（以下、単にリポ
ソーム試薬と称す）は、例えば次の如くして製造され
る。まず、リン脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて、
リポソーム上に固定化される抗原もしくは抗体と結合し
得る官能基をリン脂質分子に導入する。次いで、得られ
た官能性リン脂質とコレステロール及び必要であれば他
の脂質とをフラスコに入れ、溶媒を加えて反応させた
後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄
膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の溶液を加
え、密栓をして振とうし、官能性リポソームの懸濁液を
得る。
検物質と特異的に反応する抗原もしくは抗体を架橋剤を
介して固定化してなるリポソーム試薬（以下、単にリポ
ソーム試薬と称す）は、例えば次の如くして製造され
る。まず、リン脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて、
リポソーム上に固定化される抗原もしくは抗体と結合し
得る官能基をリン脂質分子に導入する。次いで、得られ
た官能性リン脂質とコレステロール及び必要であれば他
の脂質とをフラスコに入れ、溶媒を加えて反応させた
後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄
膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物質の溶液を加
え、密栓をして振とうし、官能性リポソームの懸濁液を
得る。
一方、リポソーム上に固定化すべき抗原もしくは抗体
と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、し
かる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬（例え
ばジチオトレイトール;DTT）と更に反応させて、修飾抗
原もしくは修飾抗体を得る。なお、前記工程で脂質をそ
の活性化剤で処理した場合は、本工程は不要である。
と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、し
かる後、必要であれば、該架橋基を還元する試薬（例え
ばジチオトレイトール;DTT）と更に反応させて、修飾抗
原もしくは修飾抗体を得る。なお、前記工程で脂質をそ
の活性化剤で処理した場合は、本工程は不要である。
最後に、官能性リポソームと修飾抗体とを緩衝液中で
反応せしめることにより、リポソーム試薬が得られる。
反応せしめることにより、リポソーム試薬が得られる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミ
ジル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε
−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMC
S）が挙げられる。
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミ
ジル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε
−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMC
S）が挙げられる。
本発明の免疫分析法は、上記リポソーム試薬を用いて
次のようにして行なわれる。まず、リポソーム試薬、被
検物質を含む試料及び補体を適当な緩衝液中で混合す
る。すると、リポソーム試薬中の抗原もしくは抗体と被
検物質とが反応し、この抗原抗体反応により補体が活性
化され、抗原抗体反応量に比例してリポソーム内から標
識物質が放出されてくる。次いで、この標識物質に応じ
た分析方法（例えば、標識物質が螢光物質であれば、螢
光分析法）により定量を行い、例えば、予め作成した検
量線により、試料中の被検物質の量を測定することがで
きる。
次のようにして行なわれる。まず、リポソーム試薬、被
検物質を含む試料及び補体を適当な緩衝液中で混合す
る。すると、リポソーム試薬中の抗原もしくは抗体と被
検物質とが反応し、この抗原抗体反応により補体が活性
化され、抗原抗体反応量に比例してリポソーム内から標
識物質が放出されてくる。次いで、この標識物質に応じ
た分析方法（例えば、標識物質が螢光物質であれば、螢
光分析法）により定量を行い、例えば、予め作成した検
量線により、試料中の被検物質の量を測定することがで
きる。
なお、本発明の分析を実施する前に予め試料を、ホス
フアチジン酸、ジセチルホスフエイト、ホスフアチジル
セリン、ホスフアチジルグリセロール、カルジオリピン
およびリピツドＡから選ばれるリン脂質、コレステロー
ルおよび架橋剤を構成成分とするリポソームで処理する
ことにより、試料中に含まれる補体成分を除去しておく
ことが好ましい。
フアチジン酸、ジセチルホスフエイト、ホスフアチジル
セリン、ホスフアチジルグリセロール、カルジオリピン
およびリピツドＡから選ばれるリン脂質、コレステロー
ルおよび架橋剤を構成成分とするリポソームで処理する
ことにより、試料中に含まれる補体成分を除去しておく
ことが好ましい。
本方法において使用する補体は、格別限定されない
が、モルモツト、ウサギ、マウス、ヒト等の血清、特に
モルモツト血清が好ましい。
が、モルモツト、ウサギ、マウス、ヒト等の血清、特に
モルモツト血清が好ましい。
本発明方法により定量可能な被検物質としては、例え
ば腫瘍マーカー（CRP、AFP、BFP、CEA及びPOA等）、免
疫グロブリン（IgA、IgE、IgG及びIgM等）、ホルモン
（インシユリン、T3及びT4等）及び薬物等が挙げられ
る。
ば腫瘍マーカー（CRP、AFP、BFP、CEA及びPOA等）、免
疫グロブリン（IgA、IgE、IgG及びIgM等）、ホルモン
（インシユリン、T3及びT4等）及び薬物等が挙げられ
る。
本発明方法を実施する上で、上記被検物質に対応する
抗原もしくは抗体を固定化したリポソーム試薬、または
該リポソーム試薬と補体を免疫分析試薬として予め調製
しておくのが好都合である。
抗原もしくは抗体を固定化したリポソーム試薬、または
該リポソーム試薬と補体を免疫分析試薬として予め調製
しておくのが好都合である。
本発明によれば、リポソームの構成脂質としてアミド
型リン脂質が含まれていることから、リポソーム膜を形
成する際、水素結合によりリポソーム膜が安定化され、
その結果標識物質のリポソーム内への保持安定性が向上
した。従つて、本発明方法は従来リポソーム試薬の保存
中に見られた標識物質の自然漏出が改善され、その結果
測定の精度が向上し、免疫診断において極めて有用であ
る。
型リン脂質が含まれていることから、リポソーム膜を形
成する際、水素結合によりリポソーム膜が安定化され、
その結果標識物質のリポソーム内への保持安定性が向上
した。従つて、本発明方法は従来リポソーム試薬の保存
中に見られた標識物質の自然漏出が改善され、その結果
測定の精度が向上し、免疫診断において極めて有用であ
る。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１（標識物質のリポソームへの封入） ジミリストイルホスフアチジルコリン（DMPC）、コレ
ステロール（Chol）、ジチオピリジル化ジパルミトイル
ホスフアチジルエタノールアミン（DTP−DPPE）および
1,2−ジミリストイルアミド−1,2−デオキシホスフアチ
ジルコリンCDDPC）の各クロロホルム溶液を表１の組成
となるように各々10mlナシ型フラスコに添加した。
ステロール（Chol）、ジチオピリジル化ジパルミトイル
ホスフアチジルエタノールアミン（DTP−DPPE）および
1,2−ジミリストイルアミド−1,2−デオキシホスフアチ
ジルコリンCDDPC）の各クロロホルム溶液を表１の組成
となるように各々10mlナシ型フラスコに添加した。
これらから、ロータリーエバポレーターにて溶媒のク
ロロホルムを揮散させ、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成
させ、さらにデジケーター中で１時間減圧乾燥を行つ
た。この各フラスコに250μの0.05M1−メトキシ−５
−メチルフエナジニウムサルフエイト含有0.1Mトリス塩
酸緩衝液pH7.4を添加し、55℃で１〜２分間加温後、ボ
ルテツクスミキサーで10分間激しく撹拌した。次いで、
フラスコ内容物を遠心管に移し、0.15M塩化ナトリウム
0.02％アジ化ナトリウム含有0.05Mトリス塩酸緩衝液pH
7.4（TBS）を加え、12,000×ｇで15分遠心し、上清をア
スピレーターで除去した。この操作を３回くり返した
後、ペレツトを500μの0.15M塩化ナトリウム含有の0.
01M HEPES緩衝液（pH7.4）に懸濁させ、６種類の１−
メトキシ−５−メチルフエナジニウムサルフエイト封入
リポソームを調製した。
ロロホルムを揮散させ、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成
させ、さらにデジケーター中で１時間減圧乾燥を行つ
た。この各フラスコに250μの0.05M1−メトキシ−５
−メチルフエナジニウムサルフエイト含有0.1Mトリス塩
酸緩衝液pH7.4を添加し、55℃で１〜２分間加温後、ボ
ルテツクスミキサーで10分間激しく撹拌した。次いで、
フラスコ内容物を遠心管に移し、0.15M塩化ナトリウム
0.02％アジ化ナトリウム含有0.05Mトリス塩酸緩衝液pH
7.4（TBS）を加え、12,000×ｇで15分遠心し、上清をア
スピレーターで除去した。この操作を３回くり返した
後、ペレツトを500μの0.15M塩化ナトリウム含有の0.
01M HEPES緩衝液（pH7.4）に懸濁させ、６種類の１−
メトキシ−５−メチルフエナジニウムサルフエイト封入
リポソームを調製した。
実施例２（ヤギIgG感作リポソーム試薬の調製） 0.15M塩化ナトリウム含有の0.01M HEPES緩衝液（pH
7.4）で平衡化したヤギIgG（2.0mg/ml）2.0mlに７μ
の30mM N−ヒドロキシスクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネートのエタノール溶液を添加
し、室温で30分間反応させた。次いで0.15M塩化ナトリ
ウム含有の0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化したセフ
アデツクスＧ−25カラムを用い、ジチオピリジル化され
たヤギIgGを回収すると共に、緩衝液の交換も同時に行
つた。回収したジチオピリジル化されたヤギIgG溶液2.0
mlに15mgのジチオスレイトールを添加し、室温で20分間
反応させた。その後、0.15M塩化ナトリウム含有の0.01M
HEPES緩衝液（pH7.4）で平衡化したセフアデツクスＧ
−25カラムを用い、チオール化ヤギIgG（1.5mg/ml）を
分離した。
7.4）で平衡化したヤギIgG（2.0mg/ml）2.0mlに７μ
の30mM N−ヒドロキシスクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネートのエタノール溶液を添加
し、室温で30分間反応させた。次いで0.15M塩化ナトリ
ウム含有の0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化したセフ
アデツクスＧ−25カラムを用い、ジチオピリジル化され
たヤギIgGを回収すると共に、緩衝液の交換も同時に行
つた。回収したジチオピリジル化されたヤギIgG溶液2.0
mlに15mgのジチオスレイトールを添加し、室温で20分間
反応させた。その後、0.15M塩化ナトリウム含有の0.01M
HEPES緩衝液（pH7.4）で平衡化したセフアデツクスＧ
−25カラムを用い、チオール化ヤギIgG（1.5mg/ml）を
分離した。
このようにして得られるチオール化ヤギIgG（1.0mg/m
l）500μを実施例１で調製した６種類のリポソーム懸
濁液500μにそれぞれ添加し、冷所（４−10℃）に
て、20時間反応させた後、12,000×ｇで15分遠心し、上
清をアスピレーターで除去した。この操作を３回くり返
した後、ペレツトを1mlの0.1％ゼラチン含有TBS（GTB
S-）に懸濁し、ヤギIgG感作リポソーム試薬を調製し
た。
l）500μを実施例１で調製した６種類のリポソーム懸
濁液500μにそれぞれ添加し、冷所（４−10℃）に
て、20時間反応させた後、12,000×ｇで15分遠心し、上
清をアスピレーターで除去した。この操作を３回くり返
した後、ペレツトを1mlの0.1％ゼラチン含有TBS（GTB
S-）に懸濁し、ヤギIgG感作リポソーム試薬を調製し
た。
実施例３（標識物質保持安定性の検討） 実施例２で調製したヤギIgG感作リポソーム試薬６種
類をTBSで200倍に希釈し、これらのリポソーム懸濁液25
μと10％トリトンＸ−100溶液またはTBS25μとを混
合し、37℃で20分間加温した。次いで1.5mMニトロテト
ラゾリウムブルー（NTB）、6mM NADHを含有したTBSを1
25μ加え、37℃で10分間加温した後、2N塩酸、２％ト
リトンＸ−100を50μ加えて反応を停止し、波長570nm
で吸光度を測定した。その結果、図１に示した通り、S/
N比（TBS25μを添加した時に得られる吸光度/10％ト
リトンＸ−100 25μを添加した時に得られる吸光
度）が、リポソームへのDDPCの添加比（モル比）に比例
して改善された。
類をTBSで200倍に希釈し、これらのリポソーム懸濁液25
μと10％トリトンＸ−100溶液またはTBS25μとを混
合し、37℃で20分間加温した。次いで1.5mMニトロテト
ラゾリウムブルー（NTB）、6mM NADHを含有したTBSを1
25μ加え、37℃で10分間加温した後、2N塩酸、２％ト
リトンＸ−100を50μ加えて反応を停止し、波長570nm
で吸光度を測定した。その結果、図１に示した通り、S/
N比（TBS25μを添加した時に得られる吸光度/10％ト
リトンＸ−100 25μを添加した時に得られる吸光
度）が、リポソームへのDDPCの添加比（モル比）に比例
して改善された。
さらに、TBS25μのかわりにモルモツト血清（補体
源）または、10％トリトンＸ−100溶液をリポソーム懸
濁液と混合し、上記と同様の実験を行つた。その結果、
図２に示した通り、補体添加によつて引き起こされる非
特異的な標識物質のリポソームからの漏出も改善され
た。
源）または、10％トリトンＸ−100溶液をリポソーム懸
濁液と混合し、上記と同様の実験を行つた。その結果、
図２に示した通り、補体添加によつて引き起こされる非
特異的な標識物質のリポソームからの漏出も改善され
た。
実施例４（リポソーム試薬の保存安定性） 実施例２で調製したヤギIgG感作リポソーム試薬を、
４〜６℃で懸濁液のまま保存した。そして実施例３と同
様な方法で保存中、漏出する１−メトキシ−５−メチル
フエナジニウムサルフエイトによる発色を測定し、S/N
比を求めた。その結果、表２に示す通り、リポソーム
に比べ、アミド結合を有するリン脂質を含むリポソーム
〜に保存安定性の改善が認められた。
４〜６℃で懸濁液のまま保存した。そして実施例３と同
様な方法で保存中、漏出する１−メトキシ−５−メチル
フエナジニウムサルフエイトによる発色を測定し、S/N
比を求めた。その結果、表２に示す通り、リポソーム
に比べ、アミド結合を有するリン脂質を含むリポソーム
〜に保存安定性の改善が認められた。
実施例５（抗ヤギIgG抗体価の測定） 実施例２で調製したヤギIgG感作リポソーム試薬６種
類を用いて抗ヤギIgG抗体価の測定を行つた。６種類の
リポソーム懸濁液は、0.5mM塩化マグネシウムおよび0.1
5mM塩化カルシウム含有GTBS-（GTBS ）で200倍に希釈
した。これらリポソーム希釈液25μ、モルモツト補体
（2CH50）25μ、および抗ヤギIgG抗体（ウサギIgG分
画）をGTBS で1000倍希釈したものより２倍希釈系列を
組んだ試料25μを混合し、37℃、20分間反応させた。
次いで、1.5mM NTB、6mM NADH含有GTBS-を125μ加
え、10分間反応させた後、2N塩酸、２％トリトンＸ−10
0を50μ加え反応を停止させ、波長570nmにて吸光度を
測定した。その結果、図３に示す通り、抗ヤギIgG抗体
量に比例して、吸光度も増加した。
類を用いて抗ヤギIgG抗体価の測定を行つた。６種類の
リポソーム懸濁液は、0.5mM塩化マグネシウムおよび0.1
5mM塩化カルシウム含有GTBS-（GTBS ）で200倍に希釈
した。これらリポソーム希釈液25μ、モルモツト補体
（2CH50）25μ、および抗ヤギIgG抗体（ウサギIgG分
画）をGTBS で1000倍希釈したものより２倍希釈系列を
組んだ試料25μを混合し、37℃、20分間反応させた。
次いで、1.5mM NTB、6mM NADH含有GTBS-を125μ加
え、10分間反応させた後、2N塩酸、２％トリトンＸ−10
0を50μ加え反応を停止させ、波長570nmにて吸光度を
測定した。その結果、図３に示す通り、抗ヤギIgG抗体
量に比例して、吸光度も増加した。
図１は本発明リポソーム成分中のDDPC（アミド結合を有
するリン脂質）のモル比と、該リポソームの実施例３に
おけるS/N比との関係を示す図面である。図２は実施例
３における添加した補体の補体価とリポソーム〜の
S/N比との関係を示す図面である。図３は、実施例５に
おける抗体の希釈倍率とリポソーム〜を用いた場合
の吸光度との関係を示す図面である。
するリン脂質）のモル比と、該リポソームの実施例３に
おけるS/N比との関係を示す図面である。図２は実施例
３における添加した補体の補体価とリポソーム〜の
S/N比との関係を示す図面である。図３は、実施例５に
おける抗体の希釈倍率とリポソーム〜を用いた場合
の吸光度との関係を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉川 和明 東京都豊島区巣鴨２丁目11番１号 日水 製薬株式会社内 (56)参考文献 特開 昭61−225190（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】下記一般式（Ｉ） （式中、R1およびR2はそれぞれ炭素数11〜17のアルキル
基を示す）で表わされるアミド型リン脂質を５重量％以
上含むリン脂質およびコレステロールを必須構成成分と
するリポソームの内部に標識物質が封入され、外側に被
検物質と特異的に反応する抗原もしくは抗体を架橋剤を
介して固定化してなるリポソーム試薬と被検物質とを補
体の存在下に反応させ、該リポソーム試薬から遊離する
標識物質を測定することによって被検物質を定量するこ
とを特徴とする免疫分析法。 - 【請求項２】下記一般式（Ｉ） （式中、R1およびR2はそれぞれ炭素数11〜17のアルキル
基を示す）で表わされるアミド型リン脂質を５重量％以
上含むリン脂質およびコレステロールを必須構成成分と
するリポソームの内部に標識物質が封入され、外側に被
検物質と特異的に反応する抗原もしくは抗体を架橋剤を
介して固定化してなるリポソーム試薬を含有する免疫分
析用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62216796A JP2553360B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62216796A JP2553360B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6459157A JPS6459157A (en) | 1989-03-06 |
| JP2553360B2 true JP2553360B2 (ja) | 1996-11-13 |
Family
ID=16694011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62216796A Expired - Lifetime JP2553360B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2553360B2 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50100225A (ja) * | 1974-01-14 | 1975-08-08 | ||
| DE3583015D1 (de) * | 1984-12-28 | 1991-07-04 | Technicon Instr | Phospholipidkonjugate und deren herstellung. |
| JPS61250559A (ja) * | 1985-04-30 | 1986-11-07 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
| JPS63106561A (ja) * | 1986-05-31 | 1988-05-11 | Toshiba Corp | 免疫分析試薬 |
| JPS63118658A (ja) * | 1986-11-07 | 1988-05-23 | Toshiba Corp | 免疫分析方法及び免疫分析用試薬 |
-
1987
- 1987-08-31 JP JP62216796A patent/JP2553360B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6459157A (en) | 1989-03-06 |
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