JPS61250559A - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
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- JPS61250559A JPS61250559A JP9093985A JP9093985A JPS61250559A JP S61250559 A JPS61250559 A JP S61250559A JP 9093985 A JP9093985 A JP 9093985A JP 9093985 A JP9093985 A JP 9093985A JP S61250559 A JPS61250559 A JP S61250559A
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- liposome
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- substance
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
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- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明は試料中の特定の被検物質を定量分析するための
免疫分析方法に関する。
免疫分析方法に関する。
従来の免疫分析方法としては、ラジオアイソトープで標
識した抗体（または抗原）と生体よシ採取した試料中の
抗原（または抗体）との抗原抗体反応を利用して試料中
の特定の抗原（または抗体を定量分析するラジオイムノ
アッセイ法や、酵素で標識した抗体（または抗原）と生
体よシ採取した試料中の抗原（または抗体）との抗原抗
体反応により抗原抗体結合物を得、その抗原抗体結合物
に標識した酵素による酵素反応を利用して試料中の特定
の抗原（または抗体）を定量分析するエンザイムイムノ
アッセイ法等がある。
識した抗体（または抗原）と生体よシ採取した試料中の
抗原（または抗体）との抗原抗体反応を利用して試料中
の特定の抗原（または抗体を定量分析するラジオイムノ
アッセイ法や、酵素で標識した抗体（または抗原）と生
体よシ採取した試料中の抗原（または抗体）との抗原抗
体反応により抗原抗体結合物を得、その抗原抗体結合物
に標識した酵素による酵素反応を利用して試料中の特定
の抗原（または抗体）を定量分析するエンザイムイムノ
アッセイ法等がある。
しかしながら、前記ラジオイムノアッセイ法は、放射性
物質を利用するので設備が大がかりになるという欠点が
あり、また、ラジオイムノアッセイ法およびエンザイム
イムノアッセイ法のいずれにおいても、十分な検出感度
に達するまでには数時間から数十時間を要して分析に長
時間を要するという欠点があった。
物質を利用するので設備が大がかりになるという欠点が
あり、また、ラジオイムノアッセイ法およびエンザイム
イムノアッセイ法のいずれにおいても、十分な検出感度
に達するまでには数時間から数十時間を要して分析に長
時間を要するという欠点があった。
このような問題点に対して、本発明者らは先に特願昭５
８−２２４５０９号において表面に親水性の抗原又は抗
体を固定化し、内部に親水性の標識物質を封入したリポ
ソーム試薬を用いた免疫分析方法を開示した。この方法
では、まず前述したリボ６グ ンーム試薬が試料中の抗原または抗体炉別に加えられた
補体とともに反応して破壊されて、封入していた標識物
質が流出する。この流出した標識物質の量が、ある濃度
範囲において試料中の被検物質の量と対応関係にあるた
め、流出した標識物質を定量することにより、被検物質
の定量分析が行なえる。この免疫分析方法によれば、前
述の問題点を解消して、短時間のうちに均一系で試料中
の被検試料定量が簡便に行なうことができる。しか析方
法に用いる補体中に含まれた前述の反応に寄与する因子
以外の非特異溶解因子により、前記被検物質との反応に
よらずにリポソームが破壊されて、標識物質を遊出して
しまう場合があることが明らかになった。すなわち前述
したリポソーム試薬を用いた免疫分析方法では、このよ
うな非特異溶解因子が試料あるいは補体中に含まれる場
合に。
８−２２４５０９号において表面に親水性の抗原又は抗
体を固定化し、内部に親水性の標識物質を封入したリポ
ソーム試薬を用いた免疫分析方法を開示した。この方法
では、まず前述したリボ６グ ンーム試薬が試料中の抗原または抗体炉別に加えられた
補体とともに反応して破壊されて、封入していた標識物
質が流出する。この流出した標識物質の量が、ある濃度
範囲において試料中の被検物質の量と対応関係にあるた
め、流出した標識物質を定量することにより、被検物質
の定量分析が行なえる。この免疫分析方法によれば、前
述の問題点を解消して、短時間のうちに均一系で試料中
の被検試料定量が簡便に行なうことができる。しか析方
法に用いる補体中に含まれた前述の反応に寄与する因子
以外の非特異溶解因子により、前記被検物質との反応に
よらずにリポソームが破壊されて、標識物質を遊出して
しまう場合があることが明らかになった。すなわち前述
したリポソーム試薬を用いた免疫分析方法では、このよ
うな非特異溶解因子が試料あるいは補体中に含まれる場
合に。
これらの影響により被検物質の定量分析の精度が低下す
るという新たな問題が生じてきた。
るという新たな問題が生じてきた。
本発明は、このような問題点に対してなされたものであ
り、前述した非特異溶解因子を遠心分離等の方法を用い
ず、均一系で簡単に除去して、非特異溶解因子による影
響を除き、これより高い精度での被検物質の定量分析が
行なえる免疫分析方法を提供することを目的とする。
り、前述した非特異溶解因子を遠心分離等の方法を用い
ず、均一系で簡単に除去して、非特異溶解因子による影
響を除き、これより高い精度での被検物質の定量分析が
行なえる免疫分析方法を提供することを目的とする。
（発明の概要〕
本発明者らは、前記目的を達成するため、リポソーム試
薬による定量分析を行なう前に、あらかじめ試料及び補
体に前処理試薬による処理を施すことにより、被検物質
以外にリポソーム試薬を破壊して封入された標識物質を
流出させてしまう非特異溶解因子の影響を除去できるこ
とを見い出した。この前処理試薬とは、実際の被検物質
の定量に用いるリポソーム試薬を構成するリポソームと
同じ構成、すなわちリン脂質及び糖脂質の少なくとも一
方とコレステロールとからなり、さらに架橋剤を含んだ
リポソームからなるが、内部の標識物質は封入されてい
ない。これらリン脂質及び糖脂質、コレステルールそし
て架橋剤は、用いるリポソーム試薬と同径のものを同じ
割合で含有させるのが望ましい。
薬による定量分析を行なう前に、あらかじめ試料及び補
体に前処理試薬による処理を施すことにより、被検物質
以外にリポソーム試薬を破壊して封入された標識物質を
流出させてしまう非特異溶解因子の影響を除去できるこ
とを見い出した。この前処理試薬とは、実際の被検物質
の定量に用いるリポソーム試薬を構成するリポソームと
同じ構成、すなわちリン脂質及び糖脂質の少なくとも一
方とコレステロールとからなり、さらに架橋剤を含んだ
リポソームからなるが、内部の標識物質は封入されてい
ない。これらリン脂質及び糖脂質、コレステルールそし
て架橋剤は、用いるリポソーム試薬と同径のものを同じ
割合で含有させるのが望ましい。
この試料中おるいは補体中に含まれた非特異溶解因子は
、あらかじめ定量分析前に混入される前処理試薬と反応
して前処理試薬を破壊することによりそれ以上リポソー
ムを破壊する特性を失なう。
、あらかじめ定量分析前に混入される前処理試薬と反応
して前処理試薬を破壊することによりそれ以上リポソー
ムを破壊する特性を失なう。
それ故、その後混入されるリポソーム試薬に対する影響
をおよぼさず、これより試料中に含まれた被検物質の定
量分析がより精度よく行なうことができる。本発明に係
るこのような約処理過程では混入した前処理試薬を非特
異溶解因子との反応の後に除去する必要はなく、そのま
ま次の定量分析が行なえる。もちろん、本発明の免疫分
析方法で検査対象としている被検物質は、リポソーム試
薬に固定化されている抗体の少くとも一部及び補体とが
そろってはじめて抗原抗体反応によりリポソーム試薬を
破壊し、この結果内部に封入されていた標識物質を流出
するのであり、前述した前処理試薬との反応は生じない
。つまりこの前処理試薬の混入による被検物質自体への
影響はなく、これより非特異溶解因子からの作用をうけ
ずに精度高く試料中に含まれた被検物質の定量分析が行
なえる。
をおよぼさず、これより試料中に含まれた被検物質の定
量分析がより精度よく行なうことができる。本発明に係
るこのような約処理過程では混入した前処理試薬を非特
異溶解因子との反応の後に除去する必要はなく、そのま
ま次の定量分析が行なえる。もちろん、本発明の免疫分
析方法で検査対象としている被検物質は、リポソーム試
薬に固定化されている抗体の少くとも一部及び補体とが
そろってはじめて抗原抗体反応によりリポソーム試薬を
破壊し、この結果内部に封入されていた標識物質を流出
するのであり、前述した前処理試薬との反応は生じない
。つまりこの前処理試薬の混入による被検物質自体への
影響はなく、これより非特異溶解因子からの作用をうけ
ずに精度高く試料中に含まれた被検物質の定量分析が行
なえる。
以下１本発明を実施例にもとすいて詳細に説明するがこ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
実施例１
がん患者から採取した血清中のかんマーカーの１つであ
るＡＦＰを分析する際に用いる前処理試薬を以下の様に
調製した。
るＡＦＰを分析する際に用いる前処理試薬を以下の様に
調製した。
用いた試薬のうち、ジパルミトイルホス７アチジルコリ
ン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ） 及ヒジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）はシグマ社製のものを用いた。
ン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、ジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ） 及ヒジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）はシグマ社製のものを用いた。
Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）グロ
ビオネート（ＳＰＤＰ）及びセファデックスＧ−２５フ
アインはファルマシア社ヨリ購入した。他の試薬は市販
品（特級）を精製せずに使用した。なお、水はイオン交
換水を用いた。
ビオネート（ＳＰＤＰ）及びセファデックスＧ−２５フ
アインはファルマシア社ヨリ購入した。他の試薬は市販
品（特級）を精製せずに使用した。なお、水はイオン交
換水を用いた。
まず％ＤＰＰＥ−ジチオビリジネート（ＤＰＰＥ−ＤＴ
Ｐ）の調製をした。密役付三角フラスコに７０ｍｇのＤ
ＰＰＥを分取し、２５μｌのクロロホルム／メタノ−／
Ｌ／（５：１）溶液に溶解し、６０μｌのトリエタノー
ルアミン及び５０ｍｇの５ＰＤＰを添加後窒素置換した
。室温で１時間反応させた後、ロータリーエバポレータ
ーで溶媒を除去した。その乾燥物を５ｍｌのクロロホル
ム／メタノール（１０：ｌ）に溶解させ、シリカゲルカ
ラムを用いて精製した。生濃縮した。収率は８０〜９５
チであった。保存は窒素封入下−２０℃で行った。
Ｐ）の調製をした。密役付三角フラスコに７０ｍｇのＤ
ＰＰＥを分取し、２５μｌのクロロホルム／メタノ−／
Ｌ／（５：１）溶液に溶解し、６０μｌのトリエタノー
ルアミン及び５０ｍｇの５ＰＤＰを添加後窒素置換した
。室温で１時間反応させた後、ロータリーエバポレータ
ーで溶媒を除去した。その乾燥物を５ｍｌのクロロホル
ム／メタノール（１０：ｌ）に溶解させ、シリカゲルカ
ラムを用いて精製した。生濃縮した。収率は８０〜９５
チであった。保存は窒素封入下−２０℃で行った。
ついでリポソームの調製を行なった。
使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１ ’）に溶解した。まず５ｍＭ
ＤＰＰＣ（２００μｌ）、１０ｍＭ：ｒレスチロール（
１００／ＪＡり及び１ ｍＭ ＤＰＰＥ−ＤＴＰ （５
０ｐｌ）を―婢≠４１０ｍ１のナス型フラスコに入れ、
更に２ｍｌのクロロホルムを加えて良く混合した。水浴
中（約５０℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒
を除去した。再び２ｍｌのクロロホルムを添加し十分攪
拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発
させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄
膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移し、真
空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次
に、１００μｌのゼラチンベロナール緩衝液（以下、Ｇ
■−と略記）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した
後に密栓して、６０℃程度の水浴中に約１分間浸漬した
。続いて、 Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、壁面の脂質
薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうした
。
／メタノール（２／１ ’）に溶解した。まず５ｍＭ
ＤＰＰＣ（２００μｌ）、１０ｍＭ：ｒレスチロール（
１００／ＪＡり及び１ ｍＭ ＤＰＰＥ−ＤＴＰ （５
０ｐｌ）を―婢≠４１０ｍ１のナス型フラスコに入れ、
更に２ｍｌのクロロホルムを加えて良く混合した。水浴
中（約５０℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒
を除去した。再び２ｍｌのクロロホルムを添加し十分攪
拌後、再度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発
させた。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄
膜が形成された。フラスコをデシケータ−中に移し、真
空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次
に、１００μｌのゼラチンベロナール緩衝液（以下、Ｇ
■−と略記）を添加し、フラスコ内部を窒素で置換した
後に密栓して、６０℃程度の水浴中に約１分間浸漬した
。続いて、 Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、壁面の脂質
薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうした
。
この操作により、リポソーム懸濁液が調製された。
これにＧＶＢ−を少址添加して、リポソーム懸濁液を完
全に遠心チコーブに移した。そして４°Ｃ１１５，００
０ｒｐｍで２０分間遠心する操作を数回くり返した。最
後に２ｍｌのＧＶＢ″′″″及び５μｌの１０チＮａＮ
３を加え、 Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁させ、窒素封
入して前処理試薬とし、これを冷厳庫に保存した。
全に遠心チコーブに移した。そして４°Ｃ１１５，００
０ｒｐｍで２０分間遠心する操作を数回くり返した。最
後に２ｍｌのＧＶＢ″′″″及び５μｌの１０チＮａＮ
３を加え、 Ｖｏｒｔｅｘミキサーで懸濁させ、窒素封
入して前処理試薬とし、これを冷厳庫に保存した。
、次に、ＡＦＰ分析の為のリポソーム試薬を次のように
して調製した。前記前処理試薬と同組成で作成したりボ
ノームでＧＶＢ−の代りに０．２Ｍのカルボキシルフル
オレセイン（イーストマン・コダック社製、 ｐＨ７，
４，以下ＣＦと略す）を標識物質として封入した。そし
てとのσの封入されたリポソームに、以下のようにして
架橋法によりウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体の固定化を行なっ
た。
して調製した。前記前処理試薬と同組成で作成したりボ
ノームでＧＶＢ−の代りに０．２Ｍのカルボキシルフル
オレセイン（イーストマン・コダック社製、 ｐＨ７，
４，以下ＣＦと略す）を標識物質として封入した。そし
てとのσの封入されたリポソームに、以下のようにして
架橋法によりウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体の固定化を行なっ
た。
５ｍｇのウサギ抗ヒト−ＡＦＰ抗体（日本一イオテスト
研究所製）’、 −−−−ｔを２ｍｌの ０．ＯＩＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４５０，８５
％ Ｎａ（Ｊ含有）に溶解し、窒素で置換した後、１０
μｊの１０ｍＭ ５ＰＤＰ （エタノール溶液）を加え
、十分攪拌してそのまま室温で３０分間反応させた。反
応後、反応液を予め生理食塩水で飽和させたセファデッ
クスＧ−２５フアインのゲルを充填したカラム（ゲル体
積：約１５ｍ１）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，５、０，８５Ｔｏ ＮａＣ１！含有）で溶出させた
。最初のタンパ゛り質フラクシ冒ン（約２ｍ／）に更に
２ｍｌの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、ジチオトレイ
トール（約３０ｍｇ）を添加した。十分に攪拌して２０
分間室温で反応させた。反応後、予め０．０１ＭＨＥＰ
ＥＳ緩衝液で飽和させたセファデックスＧ−２５フアイ
ンのゲルを充填しであるカラム（ゲル体積：約３０ｍ１
）に反応液を展開し前記ＨＥｐｇｓ緩衝として冷蔵庫に
保存した。
研究所製）’、 −−−−ｔを２ｍｌの ０．ＯＩＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４５０，８５
％ Ｎａ（Ｊ含有）に溶解し、窒素で置換した後、１０
μｊの１０ｍＭ ５ＰＤＰ （エタノール溶液）を加え
、十分攪拌してそのまま室温で３０分間反応させた。反
応後、反応液を予め生理食塩水で飽和させたセファデッ
クスＧ−２５フアインのゲルを充填したカラム（ゲル体
積：約１５ｍ１）に展開し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，５、０，８５Ｔｏ ＮａＣ１！含有）で溶出させた
。最初のタンパ゛り質フラクシ冒ン（約２ｍ／）に更に
２ｍｌの酢酸緩衝液を加え、窒素置換後、ジチオトレイ
トール（約３０ｍｇ）を添加した。十分に攪拌して２０
分間室温で反応させた。反応後、予め０．０１ＭＨＥＰ
ＥＳ緩衝液で飽和させたセファデックスＧ−２５フアイ
ンのゲルを充填しであるカラム（ゲル体積：約３０ｍ１
）に反応液を展開し前記ＨＥｐｇｓ緩衝として冷蔵庫に
保存した。
そして、前述のようにして調製したリポソーム窒素置換
後密橙して室温でゆっくり振とうしなか化リポソーム試
薬に、反応に用−九リポソーム懸濁液の量に相当するＧ
■−及び５μｌの１０ ％ ＮａＮ３を最後に添加し、
懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。
後密橙して室温でゆっくり振とうしなか化リポソーム試
薬に、反応に用−九リポソーム懸濁液の量に相当するＧ
■−及び５μｌの１０ ％ ＮａＮ３を最後に添加し、
懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。
これらの試薬を用いて血清中のリポソームに対する非特
異溶解因子を調べた。
異溶解因子を調べた。
し九Ｇ■−）希釈した前処理試薬５μｌを添加して１０
分間３７℃でインキユベートした０次に同様試薬５μｌ
とを添加して、３７℃で１時間インキエベートシた後、
０．ＯＩＭ ＥＤＴＡ−ペロナール緩衝液２５μノで反
応を停止して遊出したσ量を励起４９０ｎｍ螢光５２０
ｎｍにて測定した。なお、測定値はあらかじめ試料及び
補体の代わりに１０ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ −１００及
びσｖｆ“をそれぞれ２５μ！及び５０μｊ添加した場
合の螢光と、試料の代わりに２５μｌのＧＶＢ””を添
加したものの差を１００ Ｔｏとした相対値で示した。
分間３７℃でインキユベートした０次に同様試薬５μｌ
とを添加して、３７℃で１時間インキエベートシた後、
０．ＯＩＭ ＥＤＴＡ−ペロナール緩衝液２５μノで反
応を停止して遊出したσ量を励起４９０ｎｍ螢光５２０
ｎｍにて測定した。なお、測定値はあらかじめ試料及び
補体の代わりに１０ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ −１００及
びσｖｆ“をそれぞれ２５μ！及び５０μｊ添加した場
合の螢光と、試料の代わりに２５μｌのＧＶＢ””を添
加したものの差を１００ Ｔｏとした相対値で示した。
前処理試薬を添加した場合と添加しなかった場合のＣＦ
遊出量を第１表に示合４す。
遊出量を第１表に示合４す。
第１表
第１表からも明らかなように、前処理を行なった場合の
ＣＦの相対遊出率の値が、非特異性溶解因子の影響を受
けずに被検物質だけによって補体とともに反応して生じ
たものである。よって同一試料における前処理を行なわ
なかった場合のσの相対遊出率の値と前処理を行なった
場合のＣＦの相対遊出率の値との差が非特異性溶解因子
による測定誤差であり、試料によってはかなり大きな測
定誤差が生ずる場合があることがわかる。これより本発
明の前処理を施すことにより非常な測定精度の向上がな
されることが確認された。なおこうして得られた相対遊
出率の値はあらかじめ既知の濃度の試料を用いて得られ
た検量線を使って被検物質の濃度に換算される。
ＣＦの相対遊出率の値が、非特異性溶解因子の影響を受
けずに被検物質だけによって補体とともに反応して生じ
たものである。よって同一試料における前処理を行なわ
なかった場合のσの相対遊出率の値と前処理を行なった
場合のＣＦの相対遊出率の値との差が非特異性溶解因子
による測定誤差であり、試料によってはかなり大きな測
定誤差が生ずる場合があることがわかる。これより本発
明の前処理を施すことにより非常な測定精度の向上がな
されることが確認された。なおこうして得られた相対遊
出率の値はあらかじめ既知の濃度の試料を用いて得られ
た検量線を使って被検物質の濃度に換算される。
この表に示されているように試料によっては前処理を行
なわないためにある程度の非特異溶解因子によるものと
思われる測定値の増大が見受けられる。これに対して本
発明による定量とＥＩＡ法による定量とは高い一致性を
示している。
なわないためにある程度の非特異溶解因子によるものと
思われる測定値の増大が見受けられる。これに対して本
発明による定量とＥＩＡ法による定量とは高い一致性を
示している。
また、本発明の変形例として以上述べたような標識物質
を含まないリポソームからなる前処理試薬に、定量に用
いるリポソーム試薬に固定化する抗体を得た免疫動物と
同種類でかつ異なる個体から得た免疫グロブリン（Ｉｇ
Ｇ）を固定化してなる前処理試薬を用いた場合の実施例
を以下に示す。
を含まないリポソームからなる前処理試薬に、定量に用
いるリポソーム試薬に固定化する抗体を得た免疫動物と
同種類でかつ異なる個体から得た免疫グロブリン（Ｉｇ
Ｇ）を固定化してなる前処理試薬を用いた場合の実施例
を以下に示す。
実施例３
ＤＰＰＣ：コレステロール： ＤＰＰＥ−ＤＴＰ ＝
１ ： １ ： ０．６の組成で実施例１と同様にして
リポソームを作製しウサギＩｇＧを固定化し、内部にゼ
ラチンペロナール緩衝液を封入した前処理試薬を調製し
た。また同様のリポソームを用いてさらに内部に０．２
Ｍのカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を封入１５表面
にウサギ抗ヒ）−ＡＦＰ抗体を固定化したリポソームを
試薬を調製した。被検試料としてヒト血清腐１〜腐８を
用いて実施例１と同様な方法で比較を行なった。すなわ
ち、被検試料及び補体として前処理試薬で処理したもの
を用いた場合と、そのような前処理を施さなかった場合
とのＣＦの相対遊出率を測定し、これよりＭ２の定量分
析を行なったこの結果を第３表に示す。
１ ： １ ： ０．６の組成で実施例１と同様にして
リポソームを作製しウサギＩｇＧを固定化し、内部にゼ
ラチンペロナール緩衝液を封入した前処理試薬を調製し
た。また同様のリポソームを用いてさらに内部に０．２
Ｍのカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を封入１５表面
にウサギ抗ヒ）−ＡＦＰ抗体を固定化したリポソームを
試薬を調製した。被検試料としてヒト血清腐１〜腐８を
用いて実施例１と同様な方法で比較を行なった。すなわ
ち、被検試料及び補体として前処理試薬で処理したもの
を用いた場合と、そのような前処理を施さなかった場合
とのＣＦの相対遊出率を測定し、これよりＭ２の定量分
析を行なったこの結果を第３表に示す。
実施例２
実施例１と同様の方法を用いて、１瘍マーカーであるガ
ン胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定を行なった。
ン胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定を行なった。
八〇
ジバルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）：
コレステロール：ジパルミトイルフォスファチム内に０
１−を封入した前処理試薬を調製した。また、同様な組
成よりなるリポソームの内部に標識物質としてカルボキ
シフルオレセイン（ＣＦ）を封入り し、表面に妄すギ抗ヒ） −ＣＥＡ抗体を固定化してな
るリポソーム試薬を調製した。セしてがん患者１０人よ
り採取された試料層１〜／ｌ６１０を用いて、試料中に
含まれたＣ鳳の定量を行なった。この時試料及び補体は
あらかじめ前処理試薬を用いて、３７℃で１５分間イン
キ？ ）することにより非特異性溶解因子を除去した
。その後前記処理のおわった試料と補体及びリポソーム
試薬を混合して、３７℃で１．５時間インキエベートし
た。そしてリポソーム試薬から流出した。ＣＦを励起４
９０ｎｆｌ螢光５２０ｎｍの波長により測定した。得ら
れた測定値をあらかじめ作製した検量線と比較すること
により被検物質の定量を行なった。結果を第２表に示す
。この時間−の試料を用いてエンディイムノアッセイ法
（ＥＩＡ）により測定した。この結果も第２表に示した
。
コレステロール：ジパルミトイルフォスファチム内に０
１−を封入した前処理試薬を調製した。また、同様な組
成よりなるリポソームの内部に標識物質としてカルボキ
シフルオレセイン（ＣＦ）を封入り し、表面に妄すギ抗ヒ） −ＣＥＡ抗体を固定化してな
るリポソーム試薬を調製した。セしてがん患者１０人よ
り採取された試料層１〜／ｌ６１０を用いて、試料中に
含まれたＣ鳳の定量を行なった。この時試料及び補体は
あらかじめ前処理試薬を用いて、３７℃で１５分間イン
キ？ ）することにより非特異性溶解因子を除去した
。その後前記処理のおわった試料と補体及びリポソーム
試薬を混合して、３７℃で１．５時間インキエベートし
た。そしてリポソーム試薬から流出した。ＣＦを励起４
９０ｎｆｌ螢光５２０ｎｍの波長により測定した。得ら
れた測定値をあらかじめ作製した検量線と比較すること
により被検物質の定量を行なった。結果を第２表に示す
。この時間−の試料を用いてエンディイムノアッセイ法
（ＥＩＡ）により測定した。この結果も第２表に示した
。
以下余白
表かられかるように、前処理を施すことにより、被検物
質以外にリポソーム試薬を破壊していれば非特異溶解因
子を除去することができる。また同じ試料をエンザイイ
ムノアツセイ（ＥＩＡ）法により定量した値と、前処理
を施した場合のＣＦ相対遊出率から換算した定量値とは
、良い相関を示していることが確認された。
質以外にリポソーム試薬を破壊していれば非特異溶解因
子を除去することができる。また同じ試料をエンザイイ
ムノアツセイ（ＥＩＡ）法により定量した値と、前処理
を施した場合のＣＦ相対遊出率から換算した定量値とは
、良い相関を示していることが確認された。
本発明に係る免疫分析方法は、リポソーム試薬を用いた
定量分析を行なう前に、あらかじめ被検試料及び補体に
含まれた非特異性溶解因子を前処理試薬を用いて除去す
ることにより、均一系でより精度高く被検試料中の被検
物質の定量が行なえる。
定量分析を行なう前に、あらかじめ被検試料及び補体に
含まれた非特異性溶解因子を前処理試薬を用いて除去す
ることにより、均一系でより精度高く被検試料中の被検
物質の定量が行なえる。
手 続 補 正 書（自発）
昭和ｅｆ：９．ジ 日
Claims (5)
- （１）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコレステ
ロールとからなるリポソームと、架橋法により前記リポ
ソーム上に固定化された親水性の抗体の少なくとも一部
と、前記リポソーム内に封入された親水性の標識物質と
からなる免疫分析用のリポソーム試薬と補体とを被検試
料中の被検物質と反応させ、これより前記リポソーム試
薬から遊出した標識物質を測定することで前記被検物質
を定量する免疫分析方法において、 前記リン脂質及び糖脂質の少くとも一方とコレステロー
ルとさらに前記架橋法に用いた架橋剤とからなる前処理
試薬を、リポソーム試薬との反応前にあらかじめ被検試
料及び補体に混入して反応させることにより、前記被検
試料及び補体中に含まれた非特異溶解因子を除去する過
程を有することを特徴とする免疫分析方法。 - （２）架橋法に使用する架橋剤を、Ｎ−サクシンイミジ
ル３−（２−ピトジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−サクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ
）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）プロピオネート（ＳＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミ
ドブチリルオキシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−
（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（
ＥＭＣＳ）の中より選んだことを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の免疫分析方法。 - （３）リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質に対し
て１０〜５００モル％のコレステロールを含むことを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。 - （４）分析時に共に用いられる補体の活性（補体価）が
０．１〜１０ＣＨ＿５＿０であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。 - （５）標識物質が螢光性化合物、発光性化合物、吸光性
化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素類または
ラジカル化合物であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093985A JPS61250559A (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093985A JPS61250559A (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61250559A true JPS61250559A (ja) | 1986-11-07 |
Family
ID=14012418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9093985A Pending JPS61250559A (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61250559A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6459157A (en) * | 1987-08-31 | 1989-03-06 | Nissui Seiyaku Co | Immunological analysis and reagent for immunological analysis using the same |
| JPH01123151A (ja) * | 1987-11-06 | 1989-05-16 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
| JPH01240860A (ja) * | 1988-03-23 | 1989-09-26 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
| JPH03152466A (ja) * | 1989-11-09 | 1991-06-28 | Nitsusui Seiyaku Kk | イムノアッセイにおける非特異反応の吸収法 |
| JPH08114590A (ja) * | 1994-09-23 | 1996-05-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | 測定すべき物質の定性的または／および定量的検出法 |
-
1985
- 1985-04-30 JP JP9093985A patent/JPS61250559A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6459157A (en) * | 1987-08-31 | 1989-03-06 | Nissui Seiyaku Co | Immunological analysis and reagent for immunological analysis using the same |
| JPH01123151A (ja) * | 1987-11-06 | 1989-05-16 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
| JPH01240860A (ja) * | 1988-03-23 | 1989-09-26 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
| JPH03152466A (ja) * | 1989-11-09 | 1991-06-28 | Nitsusui Seiyaku Kk | イムノアッセイにおける非特異反応の吸収法 |
| JPH08114590A (ja) * | 1994-09-23 | 1996-05-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | 測定すべき物質の定性的または／および定量的検出法 |
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