JP2516359B2 - 免疫分析法 - Google Patents
免疫分析法Info
- Publication number
- JP2516359B2 JP2516359B2 JP62064993A JP6499387A JP2516359B2 JP 2516359 B2 JP2516359 B2 JP 2516359B2 JP 62064993 A JP62064993 A JP 62064993A JP 6499387 A JP6499387 A JP 6499387A JP 2516359 B2 JP2516359 B2 JP 2516359B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposome
- antibody
- antigen
- μmol
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析方法に関し、更に詳細にはリポソー
ムを利用し、試料中の抗原または抗体を分析する免疫分
析方法に関する。
ムを利用し、試料中の抗原または抗体を分析する免疫分
析方法に関する。
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患
の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものと
なつており、この方法は標識法と非標識法とに大別する
ことができる。
の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものと
なつており、この方法は標識法と非標識法とに大別する
ことができる。
これらの内で感度の点で優れている標識免疫測定法を
実施するために、各種の標識物質、例えばラジオアイソ
トープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等が用いられ
て来た。標識物質としては感度の点からラジオアイソト
ープが従来汎用されて来たがラジオアイソトープ試薬は
その半減期がある上に不安定であり、放射能障害や高価
な施設の使用に問題点があるために、螢光物質や酵素を
標識とする測定法がその感度向上に関する研究と相俟つ
て一層注目を集めるに至つている。
実施するために、各種の標識物質、例えばラジオアイソ
トープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等が用いられ
て来た。標識物質としては感度の点からラジオアイソト
ープが従来汎用されて来たがラジオアイソトープ試薬は
その半減期がある上に不安定であり、放射能障害や高価
な施設の使用に問題点があるために、螢光物質や酵素を
標識とする測定法がその感度向上に関する研究と相俟つ
て一層注目を集めるに至つている。
この螢光物質又は酵素を標識物質とする免疫測定法に
は、現在、標識物の内で抗原抗体反応で結合したものと
結合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテ
ロジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程
を必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
は、現在、標識物の内で抗原抗体反応で結合したものと
結合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテ
ロジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程
を必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
ヘテロジニアスな系を使用する免疫測定法としてはラ
ジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用されて
いる２抗体法や固相法が知られているが、これら方法は
未反応物と既反応物とを分離することを必須とするもの
であり、この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量
の迅速化が困難であると謂う欠陥を有している。一方、
ホモジニアスな系を使用する免疫測定法は分離工程の必
要性を廃することによる定量の簡便化、迅速化を目的と
して提案されたものであるが、実際には感度が低く且つ
測定範囲が狭いために抗原又は抗体の定量用として実用
化されるに至つていないのが実情であつた。
ジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用されて
いる２抗体法や固相法が知られているが、これら方法は
未反応物と既反応物とを分離することを必須とするもの
であり、この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量
の迅速化が困難であると謂う欠陥を有している。一方、
ホモジニアスな系を使用する免疫測定法は分離工程の必
要性を廃することによる定量の簡便化、迅速化を目的と
して提案されたものであるが、実際には感度が低く且つ
測定範囲が狭いために抗原又は抗体の定量用として実用
化されるに至つていないのが実情であつた。
本発明者らは、ホモジニアスな系を使用する免疫測定
法の欠点を解消すべく研究をおこなつた結果、上記の問
題点は、マーカを封入させたりリポソームを調製してこ
れに抗原又は抗体を感作させ、この感作リポソームと検
体とを共存させ、リポソームに結合している抗原又は抗
体と検体中の抗体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体
を形成せしめ、この複合体の形成されたリポソームを特
異的に破壊させてリポソームから流出するマーカを測定
することにより解決されることを先に見出した。
法の欠点を解消すべく研究をおこなつた結果、上記の問
題点は、マーカを封入させたりリポソームを調製してこ
れに抗原又は抗体を感作させ、この感作リポソームと検
体とを共存させ、リポソームに結合している抗原又は抗
体と検体中の抗体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体
を形成せしめ、この複合体の形成されたリポソームを特
異的に破壊させてリポソームから流出するマーカを測定
することにより解決されることを先に見出した。
上記手段においてリポソーム内に封入するマーカとし
ては、螢光色素、酵素基質、補酵素、酵素、イオン性化
合物等が用いられているが、螢光色素は測定のための特
殊機器（螢光光度計）が必要であり、酵素基質、補酵
素、酵素は、通常の分光光度計を用いての測定が可能で
あるが、酵素基質、補酵素を用いた場合、測定感度が低
く、また酵素を用いた場合には高感度な測定が可能であ
るが、酵素がリポソーム内に封入した状態では長期間、
その活性を維持できないという問題点を有している。ま
たイオン化合物を用いた場合も、測定感度が低く、また
リポソーム内に安定に保持することは困難である。した
がつて、リポソーム内に封入するマーカとしては高感度
でかつ特殊な測定機器を必要とせず、しかも比色分析が
可能であり、さらに水溶液の状態で長期間安定な物質で
あることが望まれていた。
ては、螢光色素、酵素基質、補酵素、酵素、イオン性化
合物等が用いられているが、螢光色素は測定のための特
殊機器（螢光光度計）が必要であり、酵素基質、補酵
素、酵素は、通常の分光光度計を用いての測定が可能で
あるが、酵素基質、補酵素を用いた場合、測定感度が低
く、また酵素を用いた場合には高感度な測定が可能であ
るが、酵素がリポソーム内に封入した状態では長期間、
その活性を維持できないという問題点を有している。ま
たイオン化合物を用いた場合も、測定感度が低く、また
リポソーム内に安定に保持することは困難である。した
がつて、リポソーム内に封入するマーカとしては高感度
でかつ特殊な測定機器を必要とせず、しかも比色分析が
可能であり、さらに水溶液の状態で長期間安定な物質で
あることが望まれていた。
そこで本発明者らは上記方法においてリポソーム中に
封入するマーカ物質に関し、種々検討をおこなつた結
果、マーカとして酸化還元反応に関与する電子キャリヤ
ーを用いれば前記問題点が解決されることを見出し、本
発明を完成した。
封入するマーカ物質に関し、種々検討をおこなつた結
果、マーカとして酸化還元反応に関与する電子キャリヤ
ーを用いれば前記問題点が解決されることを見出し、本
発明を完成した。
すなわち、本発明は、表面に抗原または抗体を結合
し、内部に酸化還元反応に関与する電子キヤリヤーを封
入してなるリポソームと、抗体または抗原を含む試料お
よび補体とを混合し、破壊されたリポソームから流出し
た該電子キヤリヤー量を測定することを特徴とする試料
中の抗原または抗体の分析方法を提供するものである。
し、内部に酸化還元反応に関与する電子キヤリヤーを封
入してなるリポソームと、抗体または抗原を含む試料お
よび補体とを混合し、破壊されたリポソームから流出し
た該電子キヤリヤー量を測定することを特徴とする試料
中の抗原または抗体の分析方法を提供するものである。
本発明において、リポソームの表面に結合される抗原
または抗体は、試料中の検出すべき抗体または抗原に対
応するものであることが必要である。例えば、試料中の
被検出物質が抗ヒトIgGであるとき、リポソームの表面
に結合される物質は、これに対する抗原であるヒトIgG
でなければならない。
または抗体は、試料中の検出すべき抗体または抗原に対
応するものであることが必要である。例えば、試料中の
被検出物質が抗ヒトIgGであるとき、リポソームの表面
に結合される物質は、これに対する抗原であるヒトIgG
でなければならない。
このリポソームは、リン脂質または糖脂質とコレステ
ロールから構成されるものが好ましい。例えば、リン脂
質とコレステロールからリポソームを作製する場合、こ
れらを任意に組合せることができるが、両者のモル比を
1:1前後にすると安定なリポソームが得られ、好まし
い。また、リン脂質としては、例えば、ジラウロイルホ
スフアチジルコリン（DLPC）、ジミリストイルホスフア
チジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルホスフアチジル
コリン（DPPC）、ジステアロイルホスフアチジルコリン
（DSPC）等が利用できる。さらに、リポソームに結合用
のアミノ基を導入する場合には、ホスフアチジルエタノ
ールアミン等が、また、荷電を与える場合にはジセチル
ホスフエイト、ホスフアチジン酸、ステアリルアミン等
が用いられ、これらは前記のリン脂質と混合して利用で
きる。リポソームは、ボルテツクスミキサーでの撹拌に
より得られる多重層リポソーム（MLV）及び、超音波処
理法、透析法などにより得られる単層リポソーム（SUV,
LUV）のいずいれであつても差支えない。
ロールから構成されるものが好ましい。例えば、リン脂
質とコレステロールからリポソームを作製する場合、こ
れらを任意に組合せることができるが、両者のモル比を
1:1前後にすると安定なリポソームが得られ、好まし
い。また、リン脂質としては、例えば、ジラウロイルホ
スフアチジルコリン（DLPC）、ジミリストイルホスフア
チジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルホスフアチジル
コリン（DPPC）、ジステアロイルホスフアチジルコリン
（DSPC）等が利用できる。さらに、リポソームに結合用
のアミノ基を導入する場合には、ホスフアチジルエタノ
ールアミン等が、また、荷電を与える場合にはジセチル
ホスフエイト、ホスフアチジン酸、ステアリルアミン等
が用いられ、これらは前記のリン脂質と混合して利用で
きる。リポソームは、ボルテツクスミキサーでの撹拌に
より得られる多重層リポソーム（MLV）及び、超音波処
理法、透析法などにより得られる単層リポソーム（SUV,
LUV）のいずいれであつても差支えない。
リポソームと抗原または抗体を結合させるには、２官
能性試薬、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、
Ｎ−スクシンイミジル−２−ジチオベンゾチアゾイルプ
ロピオネート（BTNOS）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロ
イルオキシ）スクシンイミド（EMCS）、Ｎ−（γ−マレ
イミドブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）等と、
ホスフアチジルエタノールアミンとの結合体を組み込ん
だリポソームを作製しておき、抗原、または抗体を必要
ならば反応基を導入した後、還元剤（例えば、ジチオス
レイトール）で処理し、これらリポソーム懸濁液と、反
応基を生じさせた抗原または抗体を適当な緩衝液中で反
応させ、リポソームと未結合の抗原または抗体を、遠心
分離またはゲル過等で除去すれば良い。
能性試薬、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、
Ｎ−スクシンイミジル−２−ジチオベンゾチアゾイルプ
ロピオネート（BTNOS）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロ
イルオキシ）スクシンイミド（EMCS）、Ｎ−（γ−マレ
イミドブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）等と、
ホスフアチジルエタノールアミンとの結合体を組み込ん
だリポソームを作製しておき、抗原、または抗体を必要
ならば反応基を導入した後、還元剤（例えば、ジチオス
レイトール）で処理し、これらリポソーム懸濁液と、反
応基を生じさせた抗原または抗体を適当な緩衝液中で反
応させ、リポソームと未結合の抗原または抗体を、遠心
分離またはゲル過等で除去すれば良い。
このリポソームの内部に封入される電子キャリヤー
は、生化学辞典（今堀ら、（株）東京化学同人、第852
頁、1985年４月１日）に、電子伝達体（electron carri
er）と記載されているように、生体の酸化還元系におい
て、電子供与体から電子を受け取って還元され、ついで
別の物質（電子受容体）に電子を渡して酸化されること
のできる物質である。すなわ電子キャリヤーは生体内に
おける酸化還元反応を触媒する性質を有する。電子キャ
リヤーの生体成分の測定への応用例としては「分析化
学」［田部一弘ら,36,82−87,（1987）］に記載のもの
が挙げられる。本発明において電子キャリヤーを用いる
最大の利点は、電子キャリヤーが触媒的に作用する為、
反応に関与する物質が存在する限り反応が続行し、結果
的に目的物質の検出感度を向上させることができること
である。このような電子キャリヤーとしては９−ジメチ
ルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライド、
１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェ
イト、フェナジンメトサルフェイト等を挙げることがで
きる。このうち、特に１−メトキシ−５−メチルフエナ
ジニウムメチルサルフエイトは水に容易にとけて、その
溶液は長期間安定であることから、リポソーム内に封入
するマーカとして有利である。
は、生化学辞典（今堀ら、（株）東京化学同人、第852
頁、1985年４月１日）に、電子伝達体（electron carri
er）と記載されているように、生体の酸化還元系におい
て、電子供与体から電子を受け取って還元され、ついで
別の物質（電子受容体）に電子を渡して酸化されること
のできる物質である。すなわ電子キャリヤーは生体内に
おける酸化還元反応を触媒する性質を有する。電子キャ
リヤーの生体成分の測定への応用例としては「分析化
学」［田部一弘ら,36,82−87,（1987）］に記載のもの
が挙げられる。本発明において電子キャリヤーを用いる
最大の利点は、電子キャリヤーが触媒的に作用する為、
反応に関与する物質が存在する限り反応が続行し、結果
的に目的物質の検出感度を向上させることができること
である。このような電子キャリヤーとしては９−ジメチ
ルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライド、
１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェ
イト、フェナジンメトサルフェイト等を挙げることがで
きる。このうち、特に１−メトキシ−５−メチルフエナ
ジニウムメチルサルフエイトは水に容易にとけて、その
溶液は長期間安定であることから、リポソーム内に封入
するマーカとして有利である。
本発明方法は、例えば次の如くして実施される。ま
ず、被検物質に対応する抗原または抗体を表面に結合
し、その内部に電子キヤリヤーを封入してなるリポソー
ム（以下「キヤリヤー封入リポソーム」と略称する）と
補体とを検体中に加え、反応させる。
ず、被検物質に対応する抗原または抗体を表面に結合
し、その内部に電子キヤリヤーを封入してなるリポソー
ム（以下「キヤリヤー封入リポソーム」と略称する）と
補体とを検体中に加え、反応させる。
反応は、適当な緩衝液（例えば、ゼラチン−ベロナー
ル緩衝液、トリス緩衝液等）を用い、反応温度は37℃で
行なうことが好ましい。
ル緩衝液、トリス緩衝液等）を用い、反応温度は37℃で
行なうことが好ましい。
また、抗体を結合したリポソームを用い、試料中の抗
原を測定する場合、リポソームに結合された抗体と試料
中の抗原が反応し、抗原抗体複合体が形成されても、補
体を活性化しないことがあるが、この場合には抗体をフ
リーの状態で加えておけば、リポソーム上で抗体−抗原
−抗体型の複合体が形成され、補体を活性化することが
可能である。
原を測定する場合、リポソームに結合された抗体と試料
中の抗原が反応し、抗原抗体複合体が形成されても、補
体を活性化しないことがあるが、この場合には抗体をフ
リーの状態で加えておけば、リポソーム上で抗体−抗原
−抗体型の複合体が形成され、補体を活性化することが
可能である。
上記反応により、キヤリヤー封入リポソームの抗原と
検体中の抗体又はキヤリヤー封入リポソーム抗原と検体
中の抗体又はキヤリヤー封入リポソームの抗体と検体中
の抗原が抗原抗体複合体を形成し、この複合体が形成さ
れたリポソームは補体により特異的に破壊され電子キヤ
リヤーが流出する。
検体中の抗体又はキヤリヤー封入リポソーム抗原と検体
中の抗体又はキヤリヤー封入リポソームの抗体と検体中
の抗原が抗原抗体複合体を形成し、この複合体が形成さ
れたリポソームは補体により特異的に破壊され電子キヤ
リヤーが流出する。
次いで、この流出した電子キヤリヤー量を測定する。
電子キヤリヤーを測定するための方法としては、例え
ば、テトラゾリウム塩とNADH（還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）またはNADPH（還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドフオスフエイト）を用
い、ホルマザン色素を生成させることによる、比色分析
がある。また、テトラゾリウム塩とNAD+（酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド）またはNADP+（酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエイ
ト）および脱水素酵素とその基質を共存させることによ
つてもホルマザン色素が生成し、電子キヤリヤーの比色
分析が可能である。
電子キヤリヤーを測定するための方法としては、例え
ば、テトラゾリウム塩とNADH（還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）またはNADPH（還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドフオスフエイト）を用
い、ホルマザン色素を生成させることによる、比色分析
がある。また、テトラゾリウム塩とNAD+（酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド）またはNADP+（酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエイ
ト）および脱水素酵素とその基質を共存させることによ
つてもホルマザン色素が生成し、電子キヤリヤーの比色
分析が可能である。
このようにして電子キヤリヤー量が求められ、この電
子キヤリヤー量から更に検体中の抗原または抗体量を容
易に求めることができる。
子キヤリヤー量から更に検体中の抗原または抗体量を容
易に求めることができる。
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。
実施例１ １−メトキシ−５−メチルフエナジニウムサルフエイト
のリポソームへの封入： ジパルミトイルフオスフアチジルコリン（DPPC）、コ
レステロール（Chol）、ジチオピリジル化ジパルミトイ
ルフオスフアチジルエタノールアミン（DTP−DPPE）及
びジパルミトイルフオスフアチジン酸（DPPA）の各クロ
ロホルム溶液を以下の（１）〜（４）の組成となるよう
に各々10mlナス型フラスコに添加した。
のリポソームへの封入： ジパルミトイルフオスフアチジルコリン（DPPC）、コ
レステロール（Chol）、ジチオピリジル化ジパルミトイ
ルフオスフアチジルエタノールアミン（DTP−DPPE）及
びジパルミトイルフオスフアチジン酸（DPPA）の各クロ
ロホルム溶液を以下の（１）〜（４）の組成となるよう
に各々10mlナス型フラスコに添加した。
（１）DPPC:1μmol,Chol:1μmol （２）DPPC:1μmol,Chol:1μmol,DPPA:0.05μmol （３）DPPC:1μmol,Chol:1μmol,DTP−DPPE:0.05μmol （４）DPPC:1μmol,Chol:1μmol,DTP−DPPE:0.05μmol,
DPPA:0.05μmol これらからロータリーエバポレーターにて溶媒のクロ
ロホルムを揮散させ、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成さ
せ、さらにデシケーター中で１時間減圧乾燥を行なつ
た。この各フラスコに250μの0.05M 1−メトキシ−５
−メチルフエナジニウムサルフエイト含有0.1Mトリス塩
酸緩衝液pH7.4を添加し、55℃で１〜２分間加温後、ボ
ルテツクスミキサーで10分間激しく撹拌した。次いで、
フラスコ内容物を遠心管に移し、0.15M塩化ナトリウ
ム、0.02％アジ化ナトリウム含有0.05Mトリス塩酸緩衝
液pH7.4（TBS）を加え、12,000×ｇで15分遠心し、上清
をアスピレータで除去した。この操作を３回くり返した
後、沈澱を1.0mlのTBSに懸濁させ４種類の１−メトキシ
−５−メチルフエナジニウムサルフエイト封入リポソー
ムを作製した。
DPPA:0.05μmol これらからロータリーエバポレーターにて溶媒のクロ
ロホルムを揮散させ、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成さ
せ、さらにデシケーター中で１時間減圧乾燥を行なつ
た。この各フラスコに250μの0.05M 1−メトキシ−５
−メチルフエナジニウムサルフエイト含有0.1Mトリス塩
酸緩衝液pH7.4を添加し、55℃で１〜２分間加温後、ボ
ルテツクスミキサーで10分間激しく撹拌した。次いで、
フラスコ内容物を遠心管に移し、0.15M塩化ナトリウ
ム、0.02％アジ化ナトリウム含有0.05Mトリス塩酸緩衝
液pH7.4（TBS）を加え、12,000×ｇで15分遠心し、上清
をアスピレータで除去した。この操作を３回くり返した
後、沈澱を1.0mlのTBSに懸濁させ４種類の１−メトキシ
−５−メチルフエナジニウムサルフエイト封入リポソー
ムを作製した。
TBSで500倍に希釈した、これらのリポソーム懸濁液10
0μと５％トリトンＸ−100溶液又はTBS100μとを混
合し、37℃で５分間加温した。次いで0.5mMニトロテト
ラゾリウムブルー、1mM NADHを含有したTBSを0.5ml加
え、37℃で10分間加温した後、0.2N塩酸、0.2％トリト
ンＸ−100を1.0ml加えて反応を停止し、波長570nmで吸
光度を測定した。その結果、第１表に示す通り、１−メ
トキシ−５−メチルフエナジニウムサルフエイトが、リ
ポソーム内に封入されており、トリトンＸ−100でリポ
ソーム膜を溶解すると、外部に流出し比色分析が可能で
あることが確認された。
0μと５％トリトンＸ−100溶液又はTBS100μとを混
合し、37℃で５分間加温した。次いで0.5mMニトロテト
ラゾリウムブルー、1mM NADHを含有したTBSを0.5ml加
え、37℃で10分間加温した後、0.2N塩酸、0.2％トリト
ンＸ−100を1.0ml加えて反応を停止し、波長570nmで吸
光度を測定した。その結果、第１表に示す通り、１−メ
トキシ−５−メチルフエナジニウムサルフエイトが、リ
ポソーム内に封入されており、トリトンＸ−100でリポ
ソーム膜を溶解すると、外部に流出し比色分析が可能で
あることが確認された。
実施例２ 山羊IgG感作リポソームの作製および抗山羊IgG抗体の測
定： DPPC:1μmol、Chol:1μmol、DTP−DPPE:0.05μmolの
組成で、実施例１に記載の方法に従い、１−メトキシ−
５−メチルフエナジニウムサルフエイト封入リポソーム
を作製し、これを0.15M塩化ナトリウム含有HEPES緩衝液
（pH7.4）0.5mlに懸濁した。
定： DPPC:1μmol、Chol:1μmol、DTP−DPPE:0.05μmolの
組成で、実施例１に記載の方法に従い、１−メトキシ−
５−メチルフエナジニウムサルフエイト封入リポソーム
を作製し、これを0.15M塩化ナトリウム含有HEPES緩衝液
（pH7.4）0.5mlに懸濁した。
また、0.15M塩化ナトリウム含有HEPES緩衝液に溶解し
た山羊IgG（2.0mg/ml）溶液2.0mlに、７μの30mM N−
ヒドロキシスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート−エタノール溶液を添加し、室温で
30分間反応させた。次いでセフアデツクスＧ−25カラム
を用い、0.15M塩化ナトリウム含有0.1M酢酸緩衝液（pH
4.5）でジチオピリジル化山羊IgGを分離した。さらにジ
チオピリジル化抗体溶液2.0mlに15mgのジチオスレイト
ールを加え室温で20分間反応させた。その後、反応液か
らセフアデツクスＧ−25を用い、0.15M塩化ナトリウム
含有HEPES緩衝液（pH7.4）でチオール化抗体を分離し
た。このチオール化抗体（1.5mg/ml）0.5mlを先に作製
したリポソーム懸濁液0.5mlに添加し、冷所（４〜10
℃）にて、20時間反応させた後、12,000×ｇで20分間遠
心し、未結合の山羊IgGを除去し、さらに0.1％ゼラチン
含有TBS（GTBS-）1.0mlに懸濁した。
た山羊IgG（2.0mg/ml）溶液2.0mlに、７μの30mM N−
ヒドロキシスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート−エタノール溶液を添加し、室温で
30分間反応させた。次いでセフアデツクスＧ−25カラム
を用い、0.15M塩化ナトリウム含有0.1M酢酸緩衝液（pH
4.5）でジチオピリジル化山羊IgGを分離した。さらにジ
チオピリジル化抗体溶液2.0mlに15mgのジチオスレイト
ールを加え室温で20分間反応させた。その後、反応液か
らセフアデツクスＧ−25を用い、0.15M塩化ナトリウム
含有HEPES緩衝液（pH7.4）でチオール化抗体を分離し
た。このチオール化抗体（1.5mg/ml）0.5mlを先に作製
したリポソーム懸濁液0.5mlに添加し、冷所（４〜10
℃）にて、20時間反応させた後、12,000×ｇで20分間遠
心し、未結合の山羊IgGを除去し、さらに0.1％ゼラチン
含有TBS（GTBS-）1.0mlに懸濁した。
この懸濁液を、0.5mM塩化マグネシウム及び0.15mM塩
化カルシウム含有GTBS-（GTBS++）で300倍に希釈したリ
ポソーム希釈液100μ、モルモツト補体（10CH50）200
μ、および抗山羊IgG抗体（家兎IgG分画）をGTBS++で
1000倍に希釈したものより２倍希釈系列を組んだ試料10
0μに混合し、37℃で30分間反応させた。次いで0.5mM
ニトロテトラゾリウムブルー、1mM NADH含有GTBS-を0.5
ml加え、37℃で20分間反応させた後、0.2N塩酸、0.2％
トリトンＸ−100を1.0ml加え反応を停止させ、波長570n
mにて吸光度を測定した。その結果、図１に示す通り抗
山羊IgG抗体量の増加に伴い、吸光度も増加することが
示された。
化カルシウム含有GTBS-（GTBS++）で300倍に希釈したリ
ポソーム希釈液100μ、モルモツト補体（10CH50）200
μ、および抗山羊IgG抗体（家兎IgG分画）をGTBS++で
1000倍に希釈したものより２倍希釈系列を組んだ試料10
0μに混合し、37℃で30分間反応させた。次いで0.5mM
ニトロテトラゾリウムブルー、1mM NADH含有GTBS-を0.5
ml加え、37℃で20分間反応させた後、0.2N塩酸、0.2％
トリトンＸ−100を1.0ml加え反応を停止させ、波長570n
mにて吸光度を測定した。その結果、図１に示す通り抗
山羊IgG抗体量の増加に伴い、吸光度も増加することが
示された。
実施例３ 脱水素酵素を共役させた、リポソームより流出する電子
キヤリヤーの測定： 実施例１に記載の方法にて、DPPC:1μmol,Chol:1μmo
lからなる１−メトキシ−５−メチルフエナジニウムサ
ルフエイト封入リポソームを作製し、GTBS-1.0mlに懸濁
した。
キヤリヤーの測定： 実施例１に記載の方法にて、DPPC:1μmol,Chol:1μmo
lからなる１−メトキシ−５−メチルフエナジニウムサ
ルフエイト封入リポソームを作製し、GTBS-1.0mlに懸濁
した。
このリポソーム懸濁液を500倍,1000倍,2000倍にGTBS-
で希釈したものの各々100μと、５％トリトンＸ−100
またはGTBS-100μとを混合し、37℃で５分間加温し
た。次いで、これに0.5mMニトロテトラゾリウムブル
ー、10mMグルコース−６−リン酸、0.02mM NADP及び1mM
EDTA含有GTBS-0.5mlを加えた後、150U/mlのグルコース
−６−リン酸脱水素酵素−GTBS-溶液50μを加え、37
℃で20分間加温した。その後、0.2N塩酸、0.2％トリト
ンＸ−100を1.0ml加え、反応を停止し、波長570nmで吸
光度を測定した。
で希釈したものの各々100μと、５％トリトンＸ−100
またはGTBS-100μとを混合し、37℃で５分間加温し
た。次いで、これに0.5mMニトロテトラゾリウムブル
ー、10mMグルコース−６−リン酸、0.02mM NADP及び1mM
EDTA含有GTBS-0.5mlを加えた後、150U/mlのグルコース
−６−リン酸脱水素酵素−GTBS-溶液50μを加え、37
℃で20分間加温した。その後、0.2N塩酸、0.2％トリト
ンＸ−100を1.0ml加え、反応を停止し、波長570nmで吸
光度を測定した。
その結果、第２表に示す通り、脱水素酵素（グルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素）とその基質（グルコース−
６−リン酸）およびNADPを共役させることによつても、
リポソームより流出する１−メトキシ−５−メチルフエ
ナジニウムサルフエイトを測定することが可能であるこ
とが示された。
ス−６−リン酸脱水素酵素）とその基質（グルコース−
６−リン酸）およびNADPを共役させることによつても、
リポソームより流出する１−メトキシ−５−メチルフエ
ナジニウムサルフエイトを測定することが可能であるこ
とが示された。
〔発明の効果〕 本発明の免疫分析法によれば、リポソーム内に封入す
るマーカとして、電子キヤリヤーを用いることにより、
検体中の種々の抗原又は抗体の定量分析が、吸光度を測
定する簡単で高感度な測定系によつて行うことができ
る。したがつて、本発明方法は、医療及び臨床検査の分
野において有用なものである。
るマーカとして、電子キヤリヤーを用いることにより、
検体中の種々の抗原又は抗体の定量分析が、吸光度を測
定する簡単で高感度な測定系によつて行うことができ
る。したがつて、本発明方法は、医療及び臨床検査の分
野において有用なものである。
第１図は、山羊IgG感作リポソームを用いて、抗山羊IgG
抗体の測定を行なつた場合の抗山羊IgG抗体と吸光度の
関係を示す図面である。
抗体の測定を行なつた場合の抗山羊IgG抗体と吸光度の
関係を示す図面である。
Claims (1)
- 【請求項１】表面に抗原または抗体を結合し、内部に酸
化還元反応に関与する電子キャリヤーを封入してなるリ
ポソームと、抗体または抗原を含む試料および補体とを
混合し、破壊されたリポソームから流出した該電子キャ
リヤー量を測定することを特徴とする試料中の抗原また
は抗体の分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62064993A JP2516359B2 (ja) | 1987-03-19 | 1987-03-19 | 免疫分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62064993A JP2516359B2 (ja) | 1987-03-19 | 1987-03-19 | 免疫分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63231267A JPS63231267A (ja) | 1988-09-27 |
| JP2516359B2 true JP2516359B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=13274095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62064993A Expired - Lifetime JP2516359B2 (ja) | 1987-03-19 | 1987-03-19 | 免疫分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2516359B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2087397A1 (en) * | 1992-01-22 | 1993-07-23 | Kazuhisa Kubotsu | Immunoassay and reagents used therefor |
-
1987
- 1987-03-19 JP JP62064993A patent/JP2516359B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63231267A (ja) | 1988-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU551950B2 (en) | Immunoassay products and methods | |
| US4483929A (en) | Liposomes with glycolipid-linked antibodies | |
| US4704355A (en) | Assay utilizing ATP encapsulated within liposome particles | |
| US4622294A (en) | Liposome immunoassay reagent and method | |
| US4483921A (en) | Immunoassay with antigen or antibody labeled liposomes sequestering enzyme | |
| US4804625A (en) | Assay procedures | |
| JPS60117159A (ja) | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 | |
| JP2516359B2 (ja) | 免疫分析法 | |
| JPH079428B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JP2604171B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPH0346074B2 (ja) | ||
| JP2527434B2 (ja) | 測定用液体単一試薬 | |
| JPS60159652A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JP2684204B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JP2652881B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPS63179253A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JP2553360B2 (ja) | 免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬 | |
| JP2623325B2 (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JP2707334B2 (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPS63293470A (ja) | 補体価測定用試薬およびこれを用いた補体価測定法 | |
| JP2668403B2 (ja) | Ａｔｌ抗体測定試薬 | |
| JP2869792B2 (ja) | 抗体結合リポソームの製造法 | |
| KR900005339B1 (ko) | 리포솜을 이용한 신규의 면역분석방법 | |
| JPS6166963A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JP3239456B2 (ja) | リポソーム膜溶解方法及びそれを利用した免疫測定法 |