JPS63179254A - 抗原定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は被検体中に存在する特定の抗原を高感度で測定
することのできる抗原定量方法に関する。

〔従来の技術〕

抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患の
臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものとな
っており、この方法は標識法と非標識法とに大別するこ
とができる。

これらの内で感度の点で優れている標識免疫測定法を実
施するためには各種の標識物質（１−カー）、例えばラ
ジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質等
が用いられて来た。標識物質としては感度の点からラジ
オアイソトープが従来汎用されて来たがラジオアイソト
ープ試薬はその半減期がある上に不安定であり放射能障
害や高価な施設の使用に問題点があるために、螢光物質
や酵素を標識とする測定法がその感度向上に関する研究
と相俟って一層注目を集めるに至っている。

螢光物質又は酵素を標識物質とする免疫測定法には、現
在、標識物の内で抗原抗体反応で結合したものと結合し
なかったものとを分離する工程を必要とするヘテロゾニ
アスな系を使用する方法と、このような分離工程を必要
としないホモゾニアスな系を使用する方法とがある。

ヘテロゾニアスな系を使用する免疫測定法としてはラジ
オアイソトープ標識免疫測定法においても利用されてい
る２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応物と
既反応物とを分離することを必須とするもので１＞、こ
の分離工程の実施が繁雑でアシ、従って定量の迅速化が
困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモゾニア
スな系を使用する免疫測定法は分離工程の必要性を廃す
るととくよる定量の簡便化、迅速化を目的として提案さ
れたものであるが、実際には感度が低く且つ測定範囲が
狭いために抗原又は抗体の定量用として実用化されるに
至っていないのが実情である。

斯かる問題点を克服する方法として、近年、マーカーを
封入させたり？ソームを調製してこれに抗原又は抗体を
感作させ、この感作す？ソームを検体と共存させてリポ
ソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体
又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複
合体を特異的に破壊させてり？ソームから流出するマー
カーを測定し、一方上記と同様の感作り？ソームを種々
既知量の抗原又は抗体と共存させ且つ上記と同様に流出
マーカーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検
体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて
、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、このり？ソームを用いる免疫測定法にお
いても、検体中の抗原を定量する場合には種々の問題点
があった。

抗原感作り？ソームを用いる場合は、競合法によって行
われる。この競合法では、検体中のフリーな抗原を抗原
感作り？ソームと一定量の特異抗体存在下で競争させ、
モルモット補体添加により、す？ソームから放出される
マーカーの流出量から検体中の抗原量を測定するもので
ある。従って、これにはり一ソームに感作する抗原量や
特異抗体量など十分に考慮する必要があった。

また、抗体感作り？ソームを用いる場合は、抗体として
は、ウサギやヤギに抗原を免疫して得られる？リフロー
ナル抗体をす？ソームに感作していた。しかし、ウサギ
から得られた抗体（ＩｇＧ分画）をす？ノームに感作し
たものを用いると、す？ソームから非特異的にマーカー
の放出がみられ（モルモット補体の添加により非特異的
にマーカーが放出される）、実際の測定には不適であっ
た。又、ヤギから得られた抗体（ＩｇＧ分画）をり？ソ
ームに感作したものを用いると、す？ソーム表面で抗原
抗体複合物が形成されても、モルモット補体を活性化せ
ず、補体活性に伴うす？ソーム膜からのマーカー放出は
みられない。

これらの点を改良した測定法として、？リフローナル抗
体上用いるサンドインチ法（特開昭６０−１３８４６５
号）があるが、この方法も２種類の動物に免疫した抗体
を必要とする点、および抗体感作す？ソームと二次抗体
を同時に抗原に添加すると、競争反応によシ抗原測定に
悪影響（例えがフック現象）を及ぼすという点に問題が
あった。

〔問題点を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行った結果
、異なるエピトープを認識する２種のモノクローナル抗
体を用いるサンドイツチ法によれば上記欠点が克服され
ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、異なる工ぎトープを認識する２種
類のモノクローナル抗体のうちの一方を固定化した標識
物質封入り？ソームを、抗原を含む被検体、他方のモノ
クローナル抗体及び補体と混合し、次いでり？ノーＸ内
から溶出した標識物質を定量することを特徴とする抗原
定量方法を提供するものである。

本発明において、す献ソームとは、赤血球ゴースト膜を
も含む広義の意味を有する。かかるリポソームは、従来
から使用されているものであればいかなるものであって
もよいが、リン脂質又は糖脂質とコレステロールから構
成されるものが好ましい。例えば、リン脂質とコレステ
ロールからり？ソームを合成する場合は、これらの比が
１＝１前後にあるとき、安定なり？ソームが得られ易い
。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が１２〜
１８であることが好ましく、更には偶数であることがよ
り好ましい。

す？ソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１０−ｓ
Ｍ以下）で非常に強い螢光を発するカル〆キシルフルオ
レセインのような螢光性化合物；１７７ノーム外で酸化
反応によシ発光するルミノールやルシフェリンのような
発光性化合物：可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯
を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作
用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をも
たらすグルコース及びシュークロースなどの糖類；テト
ラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性
化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ　）のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとす
るラジカル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素
類は本発明においては標識物質として使用しない。これ
らの化合物は、検出方法、感度及びす？ソームの安定性
等の因子ｔａ案した上で、適宜に選択される。

本発明で使用される２種類のモノクローナル抗体は、例
えばヒ）　ＣＲＰ抗原をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、
その牌細胞とマウスミエローマ細胞株ＭＳ−１を細胞融
合して得たヒ）　ＣＲＰ抗原に対するモノクローナル抗
体中から異なるエピトープを認識するものを選択採取す
ることによって得られる。本発明において、二次抗体に
使用するモノクローナル抗体はモルモット補体を活性化
できることが必要であるが、す？ソームに感作するモノ
クローナル抗体は補体活性を有さなくてもよ（、Ｆａｂ
’でもよい。

本発明の抗体固定化す？ソームは、例えば次の方法で製
造される。まず、脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて
、リポソーム上に固定化される抗体と結合し得る官能基
を脂質分子に導入する。次いで、得られた官能性脂質と
コレステロール及び必要であれば他の脂質とをフラスコ
に入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸
引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラス
コ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振と
うし、感作り一ソームの懸濁液を得る。

一方、す？ソームに固定化すべき抗体と架橋剤とを緩衝
液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要であ
れば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオトレイト
ール；ＤＴＴ　）と更に反応させて、修飾抗体を得る。

なお、前記工程で脂質をその活性化剤で処理した場合は
、本工程は不要である。

最後に１感作り？ソームと修飾抗体と全緩衝液中で反応
せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬が得られ
る。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、表面に固
定化された抗体を担持したマイクロカブセルとして得ら
れる。

上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−スク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（５ＰＤＰ　）　、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−
マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ　）、Ｎ−
スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセ
テート（ｓＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−
マレイミドフェニル）ｆロピオネート（５ＭＰＰ　）、
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド
（ＧＭＢＳ　）　及ヒＮ　−（ε−マレイミドカシロイ
ルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣ３）が挙げられる。

本発明方法によって定量可能な抗原としては、例えば腫
瘍マーカー（ＣＲＰ　、　ＡＦＰ　、　ＢＦＰ　。

ＣＥＡ、及びＰＯＡ等）免疫グロブリン（工ｇＡ。

ＩｇＥ　、　ＩｇＧ及びＩｇＭ等）、ホルモン（イン７
ユリン、Ｔ３及びＴ４等）及び薬物等が挙げられる。

本発明方法は次の如くして実施される。すなわち、抗体
固定化リポソームを、抗原を含む被検体、他方のモノク
ローナル抗体及び補体と混合し、抗原−抗体と補体との
結合反応を引き起こさせる。すると、かかる反応量に比
例して、す？ソーム内から標識物質が放出されてくる。

次いで、この標識物質に応じた分析方法（例えば、標識
物質が螢光物質であれば、螢光分析法）により定量を行
い、例えば、予め作成した検量線により、試料中の抗体
の量を測定することができる。

定量操作において使用する補体は、格別限定されないが
、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウサギ
、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。

〔実施例〕

次に参考例及び実施例を挙げて説明する。

参考例１（モノクローナル抗体の製造）−　ヒトＣＲＰ
陽性血清から公知の方法で精製されたヒ）　ＣＲＰ抗原
をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、その牌細胞とマウスミ
エローマ細胞株ＭＳ　−１と細胞融合してヒ）　ＣＲＰ
抗原に対するモノクローナル抗体を得た。このようにし
て得られた抗体のうち、本発明に用いることのできると
思われるモノクローナル抗体は５種類であった。これら
について、競合法によるＥＩＡにより、ＣＲＰ抗原中の
エピトープ認識部位の検討を行った結果、少なくとも異
ったエピトープを認識する２つのグループに分けられた
。

これらについて、更に補体活性能を検討して次の結果を
得た。

実施例１（マーカー封入す−ソームの調製）ＤＰＰＣ（
５ｍＭ、　１００μｊ）　：Ｃｈｏｌ　（１０ｍＭ。

５０　ｕＪ）　：ＤＴＰ−ＤＰＰＥ（１ｍＭ、　１０　
ｕＪ）　＝１　：　１　：　０．０２（モル比）（ＤＴ
Ｐ−ＤＰＰＥとはゾノＱルミトイルホスファチゾルエタ
ノールアミンにアミド結合によりジチオビリゾルを導入
したもの）１０−フラスコに上記割合となるように各脂
質を装填し、溶媒のクロロホルムをエバーレータで揮散
させればフラスコ内面にフィルム状物が付着形成される
。このフィルム状物を１〜２時間に亘り真空乾燥した後
に、マーカーとして用いられるカルボキシルフルオレセ
インのＱ、ｌ　Ｎ　ＮａＯＨ溶液１００−を添加し、メ
ルチツクスミキサで５〜１０分間激しく攪拌する。

次いで、過剰のカル〆キシフルオレセインを１００ＯＯ
ＸＧで遠心除去すれば、カルボキシフルオレセインがマ
ーカーとして封入されたり一ソーム（ＭＬ、Ｖ　屋）が
得られる。

このす？ソームは０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（０，
１５Ｍ　ＮａＣＪ、　ｐＨ７，４５）　５００　ｘｌ中
に懸濁させて保存しておく。

実施例２（す？ソームの抗体感作） （ａ）参考例１で得たマウスモノクローナル抗体ム１を
予めα０１　Ｍ　ｏＨＥＰＥＳ緩衝液で透析処理して得
られる抗体ＡＩ　（２，０即／ｘｉ）Ｌａ−にＱ、　ｌ
　ｍＭとなるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−
３−（２−ｆリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ
）のエタノール溶液を添加し、時々攪拌しながら室温で
３０分間反応させる。次いで、セファデックスＧ−２５
カラムを用いて過剰の５ＰＤＰと抗体とを分離させるが
、この際Ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｍ酢酸緩衝液（αｌｓＭＮａＣｊ
、　ｐＨ４５）Ｋ：緩衝液交換を行うと共に分光光度計
によシ波長２８０ｎｍで抗体の溶出を確認する（分画量
は１１Ｒｔづつン。

ゾチオピリゾル化した抗体溶液に、５０ｍＭになるよう
にジテオスレイトール（ＤＴＴ　）を固形のイ尽添加し
、室温で３０分間反応させる。

その後、反応溶液をセファデックスＧ−２５カラムを用
いて処理し過剰の「げと抗体とを分離させるが、この際
に０．ＯＩＭのｆｆＰＥ５緩衝液（ｐＨ７，５）Ｋよシ
緩衝液交換を行うと共に分光光度計によシ波長２８０ｎ
ｍで抗体の溶出を確認する（分画量は１ゴづつ）。

次いで、得たるチオール化抗体溶液（１肩９／ｄ）５０
０μｊを、実施例１で得られたり？ソーム懸濁液５００
μノに添加して緩徐に１５〜２０時間に亘シ攪拌し、遠
心処理すれば、マウスモノクローナル抗体煮１感作り？
ソームが得られる。

斯くして得た抗体感作り一ソームは、１７！のゼラチン
−ベロナール緩衝液に懸濁して、４℃にて保存する。

実施例３（ＣＲＰの定量） 希釈には、ゼラチン−ベロナール緩衝液（ＧＶＢ　−）
　Ｋ　Ｏ，１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ及び０．０３　ｍＭ　Ｃ
ａＣｊ２を添加した緩衝液（ＧＶＢ”）を使用した。測
定には、実施例２で調製した抗体感作り？ソーム保存液
をＧＶＢ”＋で１００倍希釈して用いた。

又、モルモット補体はＧＶＢ！＋で１〜５単位になるよ
うに希釈した。二次抗体（マウスモノクローナル抗体Ｉ
ｇＧ分画；タンノｑり濃度ｚＯη／−）は、１０００倍
希釈して用いた。測定は次の様に行われた。９６穴マイ
クロプレートに、検体（ＣＲＰ抗原）２５μｊＸｔ−分
注し、引き続き１００倍希釈したり？ソーム懸濁液５μ
ｌに次抗体２５μ！、補体（２単位）２５μｌの順で分
注する。３７℃、１時間反応させた後、補体反応を停止
させるため、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ペロナール緩衝
液１００μ！を加える。検体中の抗原量は、す？ソーム
から放出されたカルボキシフルオレセイン量に比例する
ので、４９０圓で励起し、５３０ｎｍのケイ光放出量を
測定する。尚、ケイ光強度は、界面活性剤です？ソーム
を破壊して得られるケイ光量を１００％として、それに
対するマーカーリリース量で表わした。

このようＫして得られた検量線は第１図のとおりである
。第１図中、・−・は本発明方法、−一１はり？ソーム
感作抗体にマウスモノクローナル抗体、二次抗体にウサ
ギＩｇＧ（ポリクローナル抗体）を使用した方法、ムー
ムはす？ソーム感作抗体にヤギポリクローナル抗体、二
次抗体にウサギポリクローナル抗体を使用した方法の検
量線を示す。

第１図から明らかな如く、本発明方法の場合が最も高感
度であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法によってＣＲＰ抗原を測定したとき
の検量線である。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナ
   ル抗体のうちの一方を固定化した標識物質封入リポソー
   ムを、抗原を含む被検体、他方のモノクローナル抗体及
   び補体と混合し、次いでリポソーム内から溶出した標識
   物質を定量することを特徴とする抗原定量方法。