JP2684204B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
- Publication number
- JP2684204B2 JP2684204B2 JP63317199A JP31719988A JP2684204B2 JP 2684204 B2 JP2684204 B2 JP 2684204B2 JP 63317199 A JP63317199 A JP 63317199A JP 31719988 A JP31719988 A JP 31719988A JP 2684204 B2 JP2684204 B2 JP 2684204B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposome
- particle size
- liposomes
- antigen
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、標識物質を封入したリポソームを用いる免
疫分析方法の改良方法に関する。
疫分析方法の改良方法に関する。
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、各種内分泌疾
患の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なもの
となつており、この方法は標識法と非標識法とに大別す
ることができる。
患の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なもの
となつており、この方法は標識法と非標識法とに大別す
ることができる。
これらの内、感度の点で優れている標識免疫測定法を
実施するためには、各種の標識物質（マーカー）、例え
ばラジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物
質等が用いられて来た。標識物質としては、感度の点か
らラジオアイソトープが従来汎用されて来たが、ラジオ
アイソトープ試薬はその半減期がある上に不安定であ
り、放射能障害や高価な施設の使用に問題点があるため
に、螢光物質や酵素を標識とする測定法がその感度向上
に関する研究と相俟つて一層注目を集めるに至つてい
る。
実施するためには、各種の標識物質（マーカー）、例え
ばラジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物
質等が用いられて来た。標識物質としては、感度の点か
らラジオアイソトープが従来汎用されて来たが、ラジオ
アイソトープ試薬はその半減期がある上に不安定であ
り、放射能障害や高価な施設の使用に問題点があるため
に、螢光物質や酵素を標識とする測定法がその感度向上
に関する研究と相俟つて一層注目を集めるに至つてい
る。
螢光物質又は酵素を標識物質とする免疫測定法には、
現在、標識物質のうち抗原抗体反応で結合したものと結
合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテロ
ジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程を
必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
現在、標識物質のうち抗原抗体反応で結合したものと結
合しなかつたものとを分離する工程を必要とするヘテロ
ジニアスな系を使用する方法と、このような分離工程を
必要としないホモジニアスな系を使用する方法とがあ
る。
ヘテロジニアスな系を使用する免疫測定法としては、
ラジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用され
ている２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応
物と既反応物とを分離することを必須とするものであ
り、この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量の迅
速化が困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモ
ジニアスな系を使用する免疫測定法は、分離工程の必要
性を廃することによる定量の簡便化、迅速化を目的とし
て提案されたものであるが、実際には感度が低く且つ測
定範囲が狭いために、抗原又は抗体の定量用として実用
化されるに至つていないのが実情である。
ラジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用され
ている２抗体法や固相法があるが、これら方法は未反応
物と既反応物とを分離することを必須とするものであ
り、この分離工程の実施が繁雑であり、従つて定量の迅
速化が困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモ
ジニアスな系を使用する免疫測定法は、分離工程の必要
性を廃することによる定量の簡便化、迅速化を目的とし
て提案されたものであるが、実際には感度が低く且つ測
定範囲が狭いために、抗原又は抗体の定量用として実用
化されるに至つていないのが実情である。
斯かる問題点を克服する方法として、近年、マーカー
を封入させたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体
を感作させ、この感作リポソームを検体と共存させて、
リポソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の
抗体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、こ
の複合体を特異的に破壊させてリポソームから流出する
マーカーを測定し、一方上記と同様の感作リポソームを
種種既知量の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様
に流出マーカーを測定して標準検量線を予め作成してお
き、検体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合
させて、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。
を封入させたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体
を感作させ、この感作リポソームを検体と共存させて、
リポソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の
抗体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、こ
の複合体を特異的に破壊させてリポソームから流出する
マーカーを測定し、一方上記と同様の感作リポソームを
種種既知量の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様
に流出マーカーを測定して標準検量線を予め作成してお
き、検体に関する上記測定結果を上記標準検量線と照合
させて、抗体又は抗原を定量する方法が提供された。
この免疫分析方法によれば、従来存在した問題点を解
消して、均一系で被検物質を簡便に定量することができ
るが、用いるリポソームの保存安定性、測定時の相対螢
光強度等の点で未だ満足のできるものではなかつた。
消して、均一系で被検物質を簡便に定量することができ
るが、用いるリポソームの保存安定性、測定時の相対螢
光強度等の点で未だ満足のできるものではなかつた。
かかる実情において本発明者らは鋭意研究を重ねた結
果、リポソームの粒径のバラツキが上記問題点の一因で
あることを見出した。すなわち、従来測定に用いられて
いたリポソームは、製造時に粒径に関して特別留意を払
われておらず、また特別な操作も加えられていないため
粒度分布が広く、粒径0.1μｍ程度の微小なものから粒
径数十μｍ程度の巨大なものまで種々の粒径のものから
成る、平均粒径８〜12μｍ程度のものであつた。本発明
者らは、これらのうち粒径の大きいリポソームが、浸透
圧の変化等の外液の影響を受けやすく、保存安定性や相
対螢光強度を悪くするものであることを見出し、この粒
径の大きなリポソームを除去することにより上記問題点
を解決できると考え、本発明を完成した。
果、リポソームの粒径のバラツキが上記問題点の一因で
あることを見出した。すなわち、従来測定に用いられて
いたリポソームは、製造時に粒径に関して特別留意を払
われておらず、また特別な操作も加えられていないため
粒度分布が広く、粒径0.1μｍ程度の微小なものから粒
径数十μｍ程度の巨大なものまで種々の粒径のものから
成る、平均粒径８〜12μｍ程度のものであつた。本発明
者らは、これらのうち粒径の大きいリポソームが、浸透
圧の変化等の外液の影響を受けやすく、保存安定性や相
対螢光強度を悪くするものであることを見出し、この粒
径の大きなリポソームを除去することにより上記問題点
を解決できると考え、本発明を完成した。
すなわち本発明は、リン脂質及びコレステロールを主
要構成成分とし、その内部に親水性標識物質が封入さ
れ、その表面に架橋剤を介して被検物質に対する抗原又
は抗体が固定化されているリポソームを含有するリポソ
ーム試薬と、被検物質を含有する被検試料と、補体とを
反応させてリポソームを破壊し、リポソーム中から遊離
する標識物質を検出することにより被検試料中の被検物
質量を測定する免疫分析方法において、90個数％以上が
粒径10μｍ以下であり、かつ平均粒径が５μｍ以下であ
るリポソームを用いることを特徴とする免疫分析方法を
提供するものである。
要構成成分とし、その内部に親水性標識物質が封入さ
れ、その表面に架橋剤を介して被検物質に対する抗原又
は抗体が固定化されているリポソームを含有するリポソ
ーム試薬と、被検物質を含有する被検試料と、補体とを
反応させてリポソームを破壊し、リポソーム中から遊離
する標識物質を検出することにより被検試料中の被検物
質量を測定する免疫分析方法において、90個数％以上が
粒径10μｍ以下であり、かつ平均粒径が５μｍ以下であ
るリポソームを用いることを特徴とする免疫分析方法を
提供するものである。
本発明において、リポソームの粒度分布及び平均粒径
を制御する方法としては特に限定されず、いずれの方法
を用いてもよいが、ヌクレポア膜を用いるエクストルー
ダーによる押し出し法により粒径の大きな粒子を除去す
る方法が特に好ましい。なお、リポソームの平均粒径の
下限はないが、収量が低くなるため、１μｍ以上とする
のが効率的である。
を制御する方法としては特に限定されず、いずれの方法
を用いてもよいが、ヌクレポア膜を用いるエクストルー
ダーによる押し出し法により粒径の大きな粒子を除去す
る方法が特に好ましい。なお、リポソームの平均粒径の
下限はないが、収量が低くなるため、１μｍ以上とする
のが効率的である。
本発明において、リポソームはリン脂質及びコレステ
ロールを主要構成成分とするものであれば、従来使用さ
れている何れのものでもよいが、リン脂質とコレステロ
ールの比が1:1前後であるとき、特に安定なリポソーム
が得られる。
ロールを主要構成成分とするものであれば、従来使用さ
れている何れのものでもよいが、リン脂質とコレステロ
ールの比が1:1前後であるとき、特に安定なリポソーム
が得られる。
またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が12〜18
であることが好ましく、更には偶数であることがより好
ましい。
であることが好ましく、更には偶数であることがより好
ましい。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であつ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光による螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシルフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフエリンのような発光
性化合物：可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光による螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシルフルオレ
セインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフエリンのような発光
性化合物：可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。
リポソーム試薬は、例えば次の方法で製造される。ま
ずリン脂質とコレステロールをフラスコに入れ、溶媒を
加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。し
かる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標
識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、標識物質
封入リポソームを得る。次いでこれを前記粒径制御処理
に付し、目的の粒度分布及び平均粒径を有するリポソー
ムを得る。
ずリン脂質とコレステロールをフラスコに入れ、溶媒を
加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。し
かる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標
識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、標識物質
封入リポソームを得る。次いでこれを前記粒径制御処理
に付し、目的の粒度分布及び平均粒径を有するリポソー
ムを得る。
一方、被検物質に対する抗原又は抗体と架橋剤とを緩
衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要で
あれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオスレイ
トール;DTT）と更に反応させて、修飾抗体又は抗原を得
る。
衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要で
あれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオスレイ
トール;DTT）と更に反応させて、修飾抗体又は抗原を得
る。
最後に、標識物質封入リポソームと修飾抗体又は抗原
とを緩衝液中で反応せしめることにより、抗体又は抗原
結合リポソームが得られる。かかるリポソームは、通
常、標識物質を内包し、表面に固定化された抗体又は抗
原を担持したマイクロカプセルとして得られる。
とを緩衝液中で反応せしめることにより、抗体又は抗原
結合リポソームが得られる。かかるリポソームは、通
常、標識物質を内包し、表面に固定化された抗体又は抗
原を担持したマイクロカプセルとして得られる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミ
ジル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε
−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMC
S）が挙げられる。
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（SPDP）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミ
ジル４−（ｐ−マレイミドフエニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε
−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMC
S）が挙げられる。
このようにして調製したリポソーム試薬を用いて、被
検体中の抗原あるいは抗体である被検物質を測定するに
は、被検体にリポソーム試薬及び補体を加え、リポソー
ム上で抗原−抗体複合体を形成せしめ、次いで、補体依
存性リポソーム膜損傷反応を引き起こさせる。すると、
かかる反応量に比例して、リポソーム内から標識物質が
放出され、最後に、放出された標識物質に応じた分析方
法（例えば、標識物質が螢光物質であれば、螢光分析
法）により定量を行い、例えば、予め作成した検量線に
より、試料中の被検物質の量を測定することができる。
検体中の抗原あるいは抗体である被検物質を測定するに
は、被検体にリポソーム試薬及び補体を加え、リポソー
ム上で抗原−抗体複合体を形成せしめ、次いで、補体依
存性リポソーム膜損傷反応を引き起こさせる。すると、
かかる反応量に比例して、リポソーム内から標識物質が
放出され、最後に、放出された標識物質に応じた分析方
法（例えば、標識物質が螢光物質であれば、螢光分析
法）により定量を行い、例えば、予め作成した検量線に
より、試料中の被検物質の量を測定することができる。
この測定操作において使用する補体は、格別限定され
ないが、通常、モルモツト血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
ないが、通常、モルモツト血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。
本発明方法によれば、従来保存安全性、相対螢光強度
等に悪影響を与えていた粒径の大きなリポソームを除去
したリポソームを用いて測定を行なうため、試薬の保存
安定性が良好であり、高感度に被検体中の抗体または抗
原の量を測定することが可能となる。
等に悪影響を与えていた粒径の大きなリポソームを除去
したリポソームを用いて測定を行なうため、試薬の保存
安定性が良好であり、高感度に被検体中の抗体または抗
原の量を測定することが可能となる。
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
はこれらに限定されるものではない。
実施例１ （１） リポソームの調製 10mMジパルミトイルホスフアチジルコリン（DPPC）ク
ロロホルム溶液100μ（１μmmol）、10mMコレステロ
ール（Chol.）クロロホルム溶液100μ（１μmmol）及
び1mMジチオピリジル化ジパルミトイルホスフアチジル
エタノールアミン（DTP−DPPE）クロロホルム溶液40μ
（0.04μmmol）を10ml容量のナシ型フラスコに入れ、
更にクロロホルム2mlを加えてよく混合した。次いでク
ロロホルムを約40℃の水浴上でロータリーエバポレータ
ーにより留去し、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。
これを真空デシケーターに移し、１時間アスピレーター
で吸引して溶媒を完全に除去した。このフラスコに0.1M
カルボキシフルオレセイン（CF）200μを加え、密栓
して約60℃の水浴上で約２分間加温した。続いてボルテ
ツクスミキサーで10分間激しく振とうし、フラスコ内面
の脂質薄膜を完全にはがしてCF封入リポソームを調製し
た。0.01Mヘペス緩衝液（0.15M NaCl含有,pH7.45）を加
えて遠心チューブに移し、12,000gで15分間遠心する操
作を３回繰り返すことにより未封入のCFを分離し、洗浄
されたリポソームペレットを1mlのヘペス緩衝液に懸濁
させた。得られたリポソーム（以下、large MLVとい
う）をマイクロトラツク（日機装社製）にてレーザー回
折法により粒径を測定したところ、粒径１〜30μｍの不
均一サイズを有し、平均粒径9.26μｍ、累積値90％にお
ける粒径18.72μｍであつた。この粒度分布を第１図に
示す。
ロロホルム溶液100μ（１μmmol）、10mMコレステロ
ール（Chol.）クロロホルム溶液100μ（１μmmol）及
び1mMジチオピリジル化ジパルミトイルホスフアチジル
エタノールアミン（DTP−DPPE）クロロホルム溶液40μ
（0.04μmmol）を10ml容量のナシ型フラスコに入れ、
更にクロロホルム2mlを加えてよく混合した。次いでク
ロロホルムを約40℃の水浴上でロータリーエバポレータ
ーにより留去し、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。
これを真空デシケーターに移し、１時間アスピレーター
で吸引して溶媒を完全に除去した。このフラスコに0.1M
カルボキシフルオレセイン（CF）200μを加え、密栓
して約60℃の水浴上で約２分間加温した。続いてボルテ
ツクスミキサーで10分間激しく振とうし、フラスコ内面
の脂質薄膜を完全にはがしてCF封入リポソームを調製し
た。0.01Mヘペス緩衝液（0.15M NaCl含有,pH7.45）を加
えて遠心チューブに移し、12,000gで15分間遠心する操
作を３回繰り返すことにより未封入のCFを分離し、洗浄
されたリポソームペレットを1mlのヘペス緩衝液に懸濁
させた。得られたリポソーム（以下、large MLVとい
う）をマイクロトラツク（日機装社製）にてレーザー回
折法により粒径を測定したところ、粒径１〜30μｍの不
均一サイズを有し、平均粒径9.26μｍ、累積値90％にお
ける粒径18.72μｍであつた。この粒度分布を第１図に
示す。
（２） リポソームのサイジング （１）で得られたリポソーム懸濁液を、ヌクレポア膜
（膜孔５μｍ）２枚をスリツトにはさんだエクストルー
ダー（日油リポソーム社製）に入れ、窒素ガスで強制的
に押し出す操作を５回繰り返した後、遠心洗浄を３回行
なつた。得られたオリゴラメラのリポソーム（以下、me
dium MLVという）を（１）と同様にして粒径測定を行な
つたところ、平均粒径4.86μｍ、累積値90％における粒
径8.42μｍであつた。この粒度分布を第２図に示す。
（膜孔５μｍ）２枚をスリツトにはさんだエクストルー
ダー（日油リポソーム社製）に入れ、窒素ガスで強制的
に押し出す操作を５回繰り返した後、遠心洗浄を３回行
なつた。得られたオリゴラメラのリポソーム（以下、me
dium MLVという）を（１）と同様にして粒径測定を行な
つたところ、平均粒径4.86μｍ、累積値90％における粒
径8.42μｍであつた。この粒度分布を第２図に示す。
更に膜孔３μｍのヌクレポア膜を用いて同様に上記me
dium MLVをエクストルード、遠心洗浄に付した。得られ
たリポソーム（以下、small MLVという）をBI−90（日
機装社製）にて動的散乱法により粒径を測定したとこ
ろ、平均粒径1.15μｍ、累積値90％における粒径1.34μ
ｍであつた。この粒度分布を第３図に示す。
dium MLVをエクストルード、遠心洗浄に付した。得られ
たリポソーム（以下、small MLVという）をBI−90（日
機装社製）にて動的散乱法により粒径を測定したとこ
ろ、平均粒径1.15μｍ、累積値90％における粒径1.34μ
ｍであつた。この粒度分布を第３図に示す。
上記３種のリポソームの収量をリン定量により測定
し、その収率（large MLV基準）と共に第１表に示す。
し、その収率（large MLV基準）と共に第１表に示す。
（３） リポソームへの抗体（ヤギIgG）感作 0.01Mヘペス緩衝液に透析したヤギIgG溶液（2mg/ml）
2mlに、30mM SPDPエタノール溶液10μを添加し、撹
拌後室温で30分間反応させた。引き続き過剰のSPDPを除
去するために、0.1M酢酸緩衝液（0.15M NaCl含有,pH4.
5）で平衡化したセフアデツクスＧ−25でゲル過し
た。ゲル過により得られたタンパク分画2mlにジチオ
スレイトール（DTT）10mgを添加し、室温で30分間反応
させた後、0.01Mヘペス緩衝液で平衡化しておいたセフ
アデツクスＧ−25でゲル過し、過剰のDDTとタンパク
を分離した。こうして得られたタンパク分画1mlずつを
（１）〜（２）で調製した３種類のリポソームペレツト
に加え、４℃で16〜20時間ゆつくり撹拌しながら反応し
た。その後、リポソーム懸濁液をゼラチンベロナール緩
衝液（0.15M NaCl含有,pH7.4,GVB-）で遠心洗浄を３回
繰り返して未反応のタンパクを分離し、GVB-1mlに再懸
濁した。
2mlに、30mM SPDPエタノール溶液10μを添加し、撹
拌後室温で30分間反応させた。引き続き過剰のSPDPを除
去するために、0.1M酢酸緩衝液（0.15M NaCl含有,pH4.
5）で平衡化したセフアデツクスＧ−25でゲル過し
た。ゲル過により得られたタンパク分画2mlにジチオ
スレイトール（DTT）10mgを添加し、室温で30分間反応
させた後、0.01Mヘペス緩衝液で平衡化しておいたセフ
アデツクスＧ−25でゲル過し、過剰のDDTとタンパク
を分離した。こうして得られたタンパク分画1mlずつを
（１）〜（２）で調製した３種類のリポソームペレツト
に加え、４℃で16〜20時間ゆつくり撹拌しながら反応し
た。その後、リポソーム懸濁液をゼラチンベロナール緩
衝液（0.15M NaCl含有,pH7.4,GVB-）で遠心洗浄を３回
繰り返して未反応のタンパクを分離し、GVB-1mlに再懸
濁した。
（４） リリースアツセイ 96穴のマイクロプレート（住友ベークライト製）を用
いて測定した。
いて測定した。
（３）で調製した３種類のIgG感作リポソームをGVB2+
（GVB-に0.15mM CaCl2と0.5mM MgCl2を添加したも
の）で400倍希釈したものそれぞれ25μに、抗ヤギIgG
を102希釈から107希釈したものを25μ、モルモツト補
体（5CH50）25μを加えて、37℃１時間インキユベー
トした。その後、10mM EDTA溶液100μを加えて補体
活性を停止し、リリースされたCF量をマイクロプレート
用螢光光度計MTP−32（コロナ社製）を用いて励起光490
nm、螢光530nmで測定した。
（GVB-に0.15mM CaCl2と0.5mM MgCl2を添加したも
の）で400倍希釈したものそれぞれ25μに、抗ヤギIgG
を102希釈から107希釈したものを25μ、モルモツト補
体（5CH50）25μを加えて、37℃１時間インキユベー
トした。その後、10mM EDTA溶液100μを加えて補体
活性を停止し、リリースされたCF量をマイクロプレート
用螢光光度計MTP−32（コロナ社製）を用いて励起光490
nm、螢光530nmで測定した。
また、相対螢光強度は次式のように計算した。
FC:実測した螢光強度 FB:リポソーム補体のブランク値
FA:10％トリトンＸ−100によりリポソームを崩壊した
ときの螢光強度 この結果を第４図に示す。この図から明らかなよう
に、本発明方法（small MLV及びmedium MLV）は従来方
法（large MLV）に比べて高感度に測定できる。
FA:10％トリトンＸ−100によりリポソームを崩壊した
ときの螢光強度 この結果を第４図に示す。この図から明らかなよう
に、本発明方法（small MLV及びmedium MLV）は従来方
法（large MLV）に比べて高感度に測定できる。
（５） 保存安定性 （１）及び（２）と同様にしてDPPC1μmol、Chol.1μ
mol及びDTP−DPPE0.04μmolを含有するリポソーム３種
を調製し、GVB-1mlに懸濁し、６〜10℃で６カ月間保存
したときの経時変化を、（４）と同様に螢光強度を測定
することにより調べた。ここでリポソームの崩壊度は、
トリトンＸ−100により崩壊したときの螢光強度を100、
GVB-のみの値を０とする螢光強度で表わした。この結果
を第５図に示す。この図から明らかなように、本発明方
法で用いるリポソーム（small MLV及びmedium MLV）は
従来のリポソーム（large MLV）に比べて保存安定性に
優れている。
mol及びDTP−DPPE0.04μmolを含有するリポソーム３種
を調製し、GVB-1mlに懸濁し、６〜10℃で６カ月間保存
したときの経時変化を、（４）と同様に螢光強度を測定
することにより調べた。ここでリポソームの崩壊度は、
トリトンＸ−100により崩壊したときの螢光強度を100、
GVB-のみの値を０とする螢光強度で表わした。この結果
を第５図に示す。この図から明らかなように、本発明方
法で用いるリポソーム（small MLV及びmedium MLV）は
従来のリポソーム（large MLV）に比べて保存安定性に
優れている。
第１〜３図は、実施例で得られたリポソームの粒度分布
を示す図であり、第４図はこれらのリポソームを用いて
免疫分析を行なつたときの相対螢光強度を示す図であ
り、第５図はこれらのリポソームの保存安定性を示す図
である。
を示す図であり、第４図はこれらのリポソームを用いて
免疫分析を行なつたときの相対螢光強度を示す図であ
り、第５図はこれらのリポソームの保存安定性を示す図
である。
Claims (1)
- 【請求項１】リン脂質及びコレステロールを主要構成成
分とし、その内部に親水性標識物質が封入され、その表
面に架橋剤を介して被検物質に対する抗原又は抗体が固
定化されているリポソームを含有するリポソーム試薬
と、被検物質を含有する被検試料と、補体とを反応させ
てリポソームを破壊し、リポソーム中から遊離する標識
物質を検出することにより被検試料中の被検物質量を測
定する免疫分析方法において、90個数％以上が粒径10μ
ｍ以下であり、かつ平均粒径が５μｍ以下であるリポソ
ームを用いることを特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63317199A JP2684204B2 (ja) | 1988-12-15 | 1988-12-15 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63317199A JP2684204B2 (ja) | 1988-12-15 | 1988-12-15 | 免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02162259A JPH02162259A (ja) | 1990-06-21 |
| JP2684204B2 true JP2684204B2 (ja) | 1997-12-03 |
Family
ID=18085567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63317199A Expired - Lifetime JP2684204B2 (ja) | 1988-12-15 | 1988-12-15 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2684204B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104012986B (zh) * | 2014-06-27 | 2016-06-15 | 淄博夸克医药技术有限公司 | 一种蜂蜜口味的补血冲剂的生产工艺 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63293470A (ja) * | 1987-05-27 | 1988-11-30 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 補体価測定用試薬およびこれを用いた補体価測定法 |
-
1988
- 1988-12-15 JP JP63317199A patent/JP2684204B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02162259A (ja) | 1990-06-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4704355A (en) | Assay utilizing ATP encapsulated within liposome particles | |
| AU551950B2 (en) | Immunoassay products and methods | |
| US4483929A (en) | Liposomes with glycolipid-linked antibodies | |
| US4743560A (en) | Solid phase assay | |
| US4483921A (en) | Immunoassay with antigen or antibody labeled liposomes sequestering enzyme | |
| US4703017A (en) | Solid phase assay with visual readout | |
| JPS61225658A (ja) | 検出可能なマーカーを含む小袋およびアツセイにおけるその使用 | |
| JPS60117159A (ja) | 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法 | |
| JPH0355790B2 (ja) | ||
| Rongen et al. | Development of a liposome immunosorbent assay for human interferon-y | |
| JP2684204B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JP2527434B2 (ja) | 測定用液体単一試薬 | |
| JPH0346074B2 (ja) | ||
| JP2604171B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JP2652881B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| JPH07113639B2 (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPS60159652A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JP2516359B2 (ja) | 免疫分析法 | |
| JP2553360B2 (ja) | 免疫分析法およびこれに用いる免疫分析用試薬 | |
| JPS63158461A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JP2623325B2 (ja) | 免疫分析用試薬 | |
| JPS63179254A (ja) | 抗原定量方法 | |
| JP2668403B2 (ja) | Ａｔｌ抗体測定試薬 | |
| JP2717711B2 (ja) | 免疫測定試薬 | |
| JP2869792B2 (ja) | 抗体結合リポソームの製造法 |