KR0171599B1 - 진단시약용 면역리포좀의 제조방법 및 이를 함유한 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시료중 특정 항원 또는 항체를 정량적으로 또는 정성적으로 측정하기 위한 면역학적 분석법에 사용되는 진단시약을 제공하기 위한 면역리포좀의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

진단시약용 면역리포좀의 제조방법 및 이를 함유한 키트

제1도는 리포좀에 소혈청알부민을 결합시켜 면역리포좀을 제조하는 방법을 나타내는 모식도이다(여기에서 ○는 소혈청알부민,는 리포좀을 의미한다).

제2도는 면역리포좀으로 시료가 항체 또는 항원을 함유하는지의 여부를 검색한 결과도이다(여기에서 ○ 는 정상토끼의 혈청, ● 는 항-BSA토끼혈청을 의미한다.).

제3도는 면역리포좀으로 시료중의 보체의 전활성을 측정한 결과를 나타낸 그라프이다.

본 발명은 시료중 특정항원 또는 항체를 정량적으로 또는 정성적으로 측정하기 위한 면역학적 분석법에 사용되는 진단시약을 제공하기 위한 면역리포좀의 제조방법에 관한 것이다.특히 본 발명은 혈청중 존재하는 특정항원 또는 항체가 리포좀에 결합된 항원 또는 항체와 면역반응을 일으키며 이때 보체의 활성화로 리포좀이 파괴되는 것을 이용한 진단시약용 면역리포좀의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하여 리포좀 파괴시 봉입되어 있던 표지물질인 효소가 유리되어 반응액중에 존재하는 기질을 분해시켜 정색반응이 일어나게 되어 단시간에 복잡한 과정없이 특정항원 또는 항체를 진단하는 것이다. 지금까지 개발된 많은 진단시약들은 다음과 같은 면역학적 분석법들을 이용해 왔다.

방사성동원소이용법(RIA)은 생체시료중의 항원 및 항체의 정량을 위해 이용되어온 고감도의 방법이나 다음과 같은 한계성을 가진다.

즉, 방사성동위원소를 이용함으로 이들의 짧은 반감기가 문제시되며, 측정기 Scintillation counter 등의 특수한 시설을 필요로 하고, 방사선 취급면허 소지자만이 이를 취급할 수 있는 데다가 분석후 방사성물질 폐기시에 환경오염의 위험이 따른다. 또한 이 방법은 분석중 항체와 결합된 항원과 그렇지 않은 항원을 분리하기 위해 전해질 침전법, 분배법, 고체상을 이용하는 방법(Solid Phase Method), 크로마토그래피, 초원심분리등의 조작을 필요로 하는 번거로움이 있다.

면역전해질영동법(Immunoelectrophoresis)은 방사성물질 사용의 위험성은 피할 수 있으나 분석시 장시간이 소요되고 감도가 낮아 미량일 경우 분석이 불가능하다.

형광 또는 효소면역분석법(Fluorescent or enzymatic immunoassay)도 방사성 물질을 사용하지 않는 장점이 있고 비교적 감도도 높으나 역시 번거로운 분리조작을 거쳐야 하므로 시간이 오래 걸린다.

상기 언급한 분석법들의 단점을 개선하기 위한 관점에서 리포좀을 이용하는 면역학적 분석법이 개발되어 왔다.

킨스키(Kinsky)(Biochim. Biophys. Acta, vol. 265, pp 1-23, 1972: Antibody-complement Interaction with Lipid Model Membrane)는 표면에 항원을 결합시킨 리포좀을 항체 존재하에서 응집하며, 이에 보체를 가하면 리포좀이 파괴된다고 보고하였다. 이때 리포좀이 파괴된 정도는 리포좀 내부로부터의 표지물질의 방출정도를 측정함으로써 알 수 있다.

표지물질로서 스핀공명표지물질(Spin Resonance Label)을 이용하는 스핀리포좀면역분석법(Spin Liposome IA; US Pat. No. 3,850,578호)이 개발되었으나 이 방법은 고가의 전자스핀공명분광기(ESR Spectroscopy)를 필요로하며, 형광물질을 사용하는 방법(US Pat. No. 4,483,929호 및 EP 248,621)은 역시 형광분석기를 필요로 한다.

최근에는 내부에 효소를 봉입시킨 리포좀을 이용한 분석법(US Pat. No. 4,480,041 및 EP 134,222A)이 개발되었다.

이 방법은 호스래딧쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 및 글루코스 옥시다제(glucose oxidase)등의 효소들이 해당 기질과 반응시 색깔을 내는 원리에 기초한 것으로 육안으로도 정성적 분석이 가능하며 자외분광기(UV Spectroscopy)라는 비교적 간단한 기계를 사용하여 정량적 분석을 가능케 하는 장점을 가진다.

그러나 종래의 방법으로 리포좀에 효소를 봉입시, 효소단백의 소수성 부분이 리포좀 이중막사이에 끼이게 됨으로서 외부표면에 효소의 활성부위가 일부 노출되어서, 분석시 신호대 잡음비(Signal to noise ratio)의 잡음을 증가시켰다. 따라서 리포좀 표면에 노출된 효소를 불활성화시키는 방법의 필요성이 대두되었고, 시안화브롬(CNBr)이 그러한 목적으로 사용되었으나 이 시약은 매우 독성이 강한 데다가 분자량이 너무 작아 리포좀내부로 투과해 들어가 내부의 효소까지 불활성화시켰다.

또한 리포좀 표면에 항원 또는 항체를 공유결합시켜서 면역리포좀을 제조하기 위한 종래의 방법들이 있었다. 예를들면, 글루타르알데히드(glutaraldehyde)(Torchilin. V.P., Khaw, B.A., Smirnov, V.N. and Haber, E., Preservation of antimyosin antibody activity after covalent coupling to liposomes, 1979, Biochem, Biophys. Res. Comun. 89: 1114), 카르보디이마이드(Carbodiimide)(Torchilin, V.P. and Klibanov, A. L., Immobillization of proteins in liposome surface, 1981, Enzyme Microbial Technol. 3: 297)를 반응시약으로 사용하였으나, 이 방법들의 효율이 낮아 리포좀 표면에서 항원-항체간 반응이 충분히 일어날 수 있을 정도의 량이 리포좀에 결합되지 못하였다. 또한 반응물질간의 동종다중화(homopolymerization)가 일어났으며, 리포좀과 이에 결합된 항원(또는 항체)의 거리가 너무 짧아 항원-항체 반응시 입체적 장애를 주는 요인이 되었다. 이러한 단점을 개선하기 위하여 N-하이드록시-숙신이미딜-3(2-피리딜디티오)프로피오네이트(이하 SPDP라 한다.)를 이용하여 리포좀과 항원 또는 항체간에 디설파이드 결합(-S-S-)을 생성시키는 방법은 리포좀 표면에 항원 또는 항체를 고농도로 결합시켰으나 가역적으로 결합이어서 실제로 면역학적 분석시 혈청등의 생체 시료에서의 안정성이 좋지 못했다.

본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 오랜 연구를 행한 결과 리포좀 표면에 노출된 효소는 불활성화시키면서도 고분자량이어서 리포좀내부의 효소에는 영향을 주지않는 물질로서 단백분해효소를 이용하여 리포좀 표면에 노출된 효소를 제거하였다. 이렇게 함으로서 그 반응효율도 커져서 항원-항체간에 반응이 충분히 일어나며, 그 안정성이 대단히 좋았다.

본 발명에서는 반응시약으로서 SPDP와 M-말레이도-벤조일-n-하이드록시석신이미드에스테르(이하 MBS라 한다.)를 같이 이용하였다. 이 방법은 리포좀과 항원 또는 항체간에 티오에테르결합(thioether bond)(-S-)을 거의 정량적으로 생성시켜 리포좀표면에서 항원-항체반응이 충분히 일어날 수 있게 하면서도 리포좀과 결합된 항원(또는 항체)사이에 스페이서 암(spacer-arm)이 존재하여 입체적으로 장애를 감소시켰으며, 비가역적 결합이 생성되므로 생체시료를 가하여도 안정하게 유지된다.

또한 본 발명에서는 리포좀의 인지질 이중막에 콜레스테롤을 0.0-50%(중량)을 넣어 기질등의 작은 분자에 대한 막의 불투과성을 증가시키고 막의 안정성을 높임과 동시에 표시물질인 효소의 봉입량을 극대화시켰다.

본 발명의 방법으로 제조한 면역리포좀은 궁극적으로 활성화된 보체에 의해 리포좀을 용현시켜 표지물질을 방출시킴으로 보체활성 측정법으로도 유용하다.

보체는 적어도 15종이상의 혈청단백질로 이루어져 있어서 면역방어체계에 중요한 역할을 하여, 혈청중 보체농도가 낮을 경우 류마토이드 관절염(rheumatoid arthritis), 홍반성낭창(lupus erythematosus)등의 질병의 한 요인이 된다. 따라서 혈청중의 전체 보체의 활성을 재는 방법이 이들 질병의 진단에도 중요하다. 양(sheep)의 적혈구를 이용하는 분석법(Berden JHM, Hagemann JFHM, Koene RAP;, A sensitive hemdytic assay of mouse, complement, J. Immunol Methods 1978; 23: 149)이 개발되었으나 적혈구는 불안정하여 가만히 두어도 응집하기 쉽고 분석시 4-6개의 생체시료 시험관을 필요로 한다.

본 발명에서의 적혈구의 대용제로서의 면역리포좀은 분석시 수시간 방치하여도 가라앉지 않으며 적혈구이용법처럼 원심분리를 할 필요가 없고 생체시료를 희석하지 않고 사용할 수 있으며 2개의 시험관만을 필요로 하므로 훨씬 노력이 적게 들면서도 감도가 높고 재현성있는 결과를 얻을 수 있다. 본 발명에서의 분석법은 방사성동위원소 사용시의 위험성도 없고 분리의 조작도 없이 신속하고 간편하게 소량의 면역리포좀시료(15uℓ)를 이용하여 약물, 생리활성물질, 독성물질, 항원성물질의 존재여부를 검색할 수 있으며 또한 전체보체의 활성도 분석할 수 있다.

본 발명이 진단목적의 분석시약으로 이용될 경우에는, 1) 내부에는 효소를 봉입하고 이를 단백분해효소로 처리한 후 표면에는 항체나 항원을 결합시킨 면역리포좀의 현탁액, 2) 상기 효소의 기질, 3) 보체, 4) 분석하고자하는 시료로 구성된 각기 다른 용기의 시약으로 구성될 수 있다. 이들을 같이 섞으면 10-20분내에 발색함으로써 결과분석이 가능하다.

실제로 본 발명은 다음과 같은 다양한 물질들의 분석을 위해 이용될 수 있다.

1) 호르몬 :

갑성선호르몬 : 티록신, 삼요오드화티로닌, 부갑상선호르몬, 칼시토닌,

스테로이드호르몬 : 에스트라다이올, 에스트론, 테스토스테론,

췌장호르몬 : 인슐린, 프로인슐린, 글루카곤,

뇌하수체호르몬 : 프로락틴, 티로트로핀, 아드로노토르티코트로픽 호르몬, 옥시토신, 바소프레신,

자궁 및 태반호르몬 : 코리오닉코나도트로핀, 릴렉신,

성장인자 : 유로가스트론, 신경성장인자,

2) 뉴클레오타이드류 : 뉴클레오사이드류

3) 약물과 그 유도체 및 대사물 : 바르비탈산염, 디곡신, 디기톡신, 디페닐히단토인, 메산토인, 아편알카로이드, 마리화나, 코카인, 항생제류, 암페타민,

4) 독소 : 미코톡신, 아플라톡신,

5) 거대분자항원 : B형간염표면항원(Hepatitis B surface antigen), 조직적합성 표지물(Histocompatibility marker, 알러지원(allergen), 세균성 항원(Bacterial antigen),

6) 암표지물(tumor markers): 태아단백질(alpha-fetoprotein), carcinoembryonic antigen, pancreatic oncofetal antigen)

7) 보체 :

본 발명은 이러한 목적이외에도 면역학 영역에서 인공세포인 리포좀을 이용한 면역반응연구에 이용될 수 있다.

효소를 봉입시킨 리포좀은 특정효소결핍증 환자에게로의 효소투여 매체로 이용함으로서 임상적으로 응용이 가능하고 항체를 결합시킨 리포좀은 암세포와 같은 체내특정부위로의 표적화에 이용함으로서 약물의 부작용을 줄이면서 약물방출을 지속화할 수 있는 약물전달체계(drug delivery system)의 개발에 이용될 수 있다.

리포좀기초제품의 시장규모는 1987년 6월 12일 현재 총 212백만 달러로 분석되고 있으며 1995년도의 항암제, 항감염제, 안과용제, 기관지확장제들로서 리포좀기초제품의 세계적인 시장성은 약 1,015백만달러로 추산된다.(제약기술정보 1987년 10월호, p17-19).

다음에 실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1]

1) 말레이미도 벤조일 포스패티딜 에탄올아민(이하 MBPE라 한다.)의 제조 : MBPE는 마틴(Martin)과 파파하조폴러스(Papahadjopoulos)의 방법(irreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles, 1982, J. Biol. Chem. 257: 186)에 따라서 합성하였다.

포스페티딜에탄올아민을 무수 클로르포름에 녹이고 이에 무수 에탄올에 용해시킨 MBS와 트리에틸아민을 가하였다. 질소기체하 실온에서 4시간동안 반응시킨후 실리카겔 크로마토그래피로 MBPE를 분리하였다. MBPE는 클로르포름에 용해시켜 질소치환하 -4℃에서 보관하였다.

2) 역상증발법에 의한 단층거대리포좀의 제조 : 디팔미토일 포스패티딜 콜린(DPPC)과 MBPE를 (몰비: 12:2) 0%-50%의 콜레스테롤과 함께 클로르포름에 용해시킨후 회전식 진공증발기로 감압건조시켜 플라스크내부에 지질박막을 형성시켰다. 이를 다시 이소프로필에테르와 클로르포름 혼합물(부피비: 2: 1)에 용해시킨후 5mg의 알칼라인 포스파타아제를 함유하는 pH 6.7의 TES완충액 1㎖를 가하고 보르텍싱하여 수층과 유기용매층을 혼화한 다음 이 에멀젼은 실온에서 30분간 방치하였다. 실온 감압하에서 이 혼합액의 유충을 제거하였다.(US Pat No. 4,235,871).

위와 같이 제조한 리포좀 현탁액을 원심분리하여 상등액을 제거하고 다시 1㎖로 현탁시켰다. 이에 탈이온수에 10mg/㎖의 농도로 녹인 트립신 또는 알파 키모트립신 1㎖를 37℃에서 1시간동안 몇번에 나누어 가해서 반응시켰다. 원심분리를 수회 반복하여 단백분해효소를 제거한 후 완충액에 재현탁시켰다.

3) 리포좀내 효소 봉입효율의 측정: 로우리등의 방법(Lowry, O.H.; Rosenbrough, N.J. Farr, A. H. Randall. R.J. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265-275)으로 효소봉입량을 정량하였다. 봉입된 효소의 량은 총량으로부터 상등액중 효소량을 뺀 값으로하여 계산하였으며, 그 계산결과는 다음표 1과 같다.

[실시예 2]

계면활성제 - 투석법에 의한 단층거대 리포좀의 제조 :

실시예 1과 같은 조성의 지질과 효소를 라우릴설페이트나 소디움데옥시 콜레이트와 같은 계면활성제 용액에 녹이고 반투막에 넣어 pH 6.7의 TES완충액 2ℓ중에서 24시간동안 투석시키거나 한외여과하여 계면활성제를 제거함으로서 거대리포좀을 얻었다.

[실시예 3]

1) 리포좀 표면에의 소혈청알부민의 결합 :

실시예 1이나 실시예 2의 방법으로 제조한 단층 거대 리포좀에 소혈청알부민을 제1도의 공정도와 같은 방법으로 결합시켰다.

BSA를 pH 7.5의 인산염완충액에 20mg/㎖의 농도로 녹여 이에 메탄올에 녹인 SPDP를 적가하였다. 실온에서 30분간 반응시킨후 세파덱스 G-75칼럼에서 크로마토그래피하여 PDP-BSA용액을 얻었다. 이에 0.1N의 염산을 적가하여 pH를 4.5로 맞춘후 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 넣어 실온에서 30분간 반응시켜서 PDP-BSA를 환원시켰다. 환원된 BSA를 다시 세파덱스 G-50에서의 겔크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.

환원된 BSA의 농도가 0.2mg/㎖-2.23mg/㎖가 되도록 리포좀 현탁액과 섞어서 24시간동안 질소치환하에서 반응시킨후 수회 원심분리하여 결합하지 않은 단백질을 제거하였다.

리포좀에 결합된 소혈청알부민의 량은 로우리법에 의해 정량하였다.

다음 표2의 정량결과는 초기 소혈청알부민 농도의 증가에 따라 리포좀에 결합된 소 혈청알부민의 량이 거의 정량적으로 증가함을 보여주고 있다.

3) 면역리포좀을 이용한 항-BSA 항체량의 분석:

1)의 방법으로 제조한 면역리포좀 15㎕를 소혈청알부민에 대한 토끼의 항혈청을 여러 가지 농도로 함유하는 시료와 모르모트 보체와 합해 pH 7.4의 Tris 완충액으로 500㎕로 한후 25도에서 30분간 반응시켰다. 대조군으로써 토끼의 정상혈청을 사용하여 동일실험을 행하였다. 다음에 pH 9.5의 붕산염 완충액중에 1mg/㎖의 농도로 용해시킨 알카라인 포스파타아제에 대한 기질을 2㎖ 가해 25℃에서 10분간 반응시킨후 2M 수산화나트륨 용액을 같은 부피 가해 반응을 종결시켰다 410nm의 파장에서 자외분광기로 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 제2도와 같다.

[실시예 4]

면역리포좀을 이용한 전체보체활성을 측정 :

실시예 1이나 2의 방법으로 제조한 단층거대리포좀에 실시예 3의 방법으로 소혈청알부민을 결합시켜서 얻은 면역리포좀 15㎕와 소혈청알부민에 대한 토끼의 항혈청 20㎕와 161CHunits/㎖의 모르모트 보체의 5배-50배 희석액을 섞은후 Tris 완충액으로 500㎕로 희석하여 실시예 3의 방법으로 면역반응을 시행한 결과 제3도에서처럼 모르모트 보체함유혈청의 희석배수의 자연로그값과 410nm에서의 흡광도간에 직선상관계수(r)가 0.996인 표준선을 얻을 수 있었다

Claims (9)

1. 표지물질로서 효소를 봉입시키고, 표면에 노출된 효소를 불활성화한 후 인지질의 아민기를 변형시켜서 이에 항원 또는 항체를 결합시켜서 면역리포좀을 제조하는 방법.
2. 제1항에서, 아민기를 가지는 인지질로 다이팔미토일포스패티딜에탄올아민을 이용하고 이를 변형시키는 시약으로 말레이도벤조일하이드록시숙신이마이드(MBS)를 사용하는 방법.
3. 제1항에서 항원 또는 항체를 결합시켜주는 시약으로 SPDP를 사용하여 티오에테르(thioether)결합을 생성시키는 방법.
4. 제1항에서, 리포좀의 조성을 인지질과 콜레스테롤 몰비를 0.0-1.0으로하여 봉입효율을 극대화하는 방법.
5. 제1항에서, 상기조성의 리포좀내부에 표지물질로서 효소를 봉입하고 리포좀표면에 끼워서 노출된 효소의 활성부위를 불활성화시키면서도 내부효소에는 영향을 주지않는 물질로서 단백분해효소를 사용하는 방법.
6. 제5항에서, 단백분해효소로서 트립신과 알파키모트립신을 사용하는 방법.
7. 제6항에서 항원으로서 소혈청알부민을 결합시키는 방법.
8. 혈액, 뇨, 타액등과 같은 생체시료나 기타 미지시료중의 약물, 항원성물질, 알러지원을 신속, 간편하게 분석함에 있어서, 1) 제1항의 면역리포좀 ; 2) 기질; 및 3) 모르모트 보체를 각각 분리포장하였다가 분석시 시료와 혼합하여 사용하는 진단용 시약 키트.
9. 1) 제1항의 면역리포좀; 2) 기질; 및 3) 면역리포좀표면항원에 대한 항혈청을 각각 분리하여 포장하였다가 분석시에 미지활성의 보체와 혼합하여 보체활성을 측정하는 시약키트.