JPH0374239B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、一般に、新規オリゴヌクレオチド誘
導体に関する。さらに具体的には、本発明は、ヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基延長上に適度な長
さのスペーサーを介して一級アミノ基を導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体に関する。 先行技術 近年、核酸の科学合成は新しい保護基の導入あ
るいはトリエステル法、ホスフアイト法等の新し
い縮合法の開発により飛躍的に進歩している。ま
た、遺伝子工学の急速な進歩とあいまつて、核酸
の科学合成がこの分野でも重要な意義をもつよう
になつてきた。例えば人工遺伝子を合成し、遺伝
子組換え操作を利用して有用物質の産生が行なわ
れている(インターフエロン:Nature、.281、
544(1979)、白血球由来インターフエロン:
Nature、287、411(1980))。また、ハイブリツド
法のためのプローブ(Nucl、Acids Res.9、897
(1981))としてやmRNAあるいは一本鎖DNAか
ら逆転写酵素あるいはDNAポリメラーゼによつ
て、二本鎖DNAを合成する際に必要な鋳型DNA
に相捕的なDNA断片(プライマー)として利用
(Nucl.Acids Res.8、4057(1980))等の応用例
もある。 このように、核酸の有機化学的合成手段は、生
体から単離できない特殊の配列をもつオリゴヌク
レオチドの合成を可能にし、分子生物学、遺伝子
工学等の研究に多大な寄与をするものである。 本発明者らは現在まで、オリゴヌクレオチドの
有機化学的合成分野で固相法を有力な合成手段と
して、種々のオリゴヌクレオチドの合成を行なつ
てその応用を検討してきたが、特にアフイニテイ
クロマトグラフイー用樹脂あるいは非放射性アフ
イニテイプローブ等を開発すべく鋭意努力を重ね
た結果、これらの構造の際に有用な中間体である
オリゴヌクレオチド誘導体を見出した。 現在まで開発あるいは市販されているアフイニ
イテイクロマトグラフイー用樹脂(Arch.
Biochem.Biophys.、168、561(1974)、J.
Biochem.、83、783(1978)、特開昭52−25795号、
同53−101396号、同53−133283号および同55−
36277号各公報)は、一般に特異性、再現性が悪
く、合成がめんどうであるという共通の難点をか
かえている。 非放射性アフイニテイプローブ(Proc.Natl.
Sci.USA.78、6633−6637(1981))においては、
シトシン誘導体の合成が困難であり、任意でかつ
定められた塩基配列をもつDNAの合成が困難で
ある等の問題点がある。また、アフイニテイ樹脂
合成に際して下記に示す文献のものは、リガンド
の合成に手間がかかる等の難点がある。 J.Chromatog.、97、33(1974Biochem.
Biophys.Acta、304、231(1973)Anal.
Biochem.、71、471(1976) 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、目的物にのみ他の担体を結合できる官能基
(一級アミノ基)を、ヌクレオチドの5′−末端延
長上に適度の長さのスペーサーを介して導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体によつてこの目的
を達成しようというものである。 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、下式〔〕で示されるものであること、を
特徴とするものである。 また、本発明による下式〔〕で示されるオリ
ゴヌクレオチド誘導体の製造法は、下式〔〕で
示される化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保
護基R2、3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリ
ン酸部分の保護基をすべて除去すること、を特徴
とするものである。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ0または任意の
自然数であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の
炭化水素残基であり、Bはヌクレオチドを構成す
る塩基である(BおよびR0が複数個存在すると
きは、それらは同一でも異なつてもよい)。〕 効 果 本発明者らの合成したオリゴデオキシリボヌク
レオチドは、前記アフイニテイクロマトグラフイ
ー用樹脂あるいは核酸用非放射性アフイニテイプ
ローブの短所を回避できるものであり、下記のよ
うな長所を有するものである。 (イ) いかなる塩基配列をも有するアフイニテイ樹
脂やプローブを製造することができる。 (ロ) 合成が非常に簡単であつて、大量合成が可能
である。 (ハ) オリゴヌクレオチド中に存在する他の官能基
(水酸基、リン酸基および塩基部分のアミノ基
など)よりも反応性が高い一般アミノ基を有す
るので、脱保護したオリゴヌクレオチドを精製
せずに担体との縮合に用いることができる。す
なわち、反応条件等の設定により選択的にアミ
ノ基部分と結合可能である。 (ニ) 一級アミノ基を介して選択的に、担体、ビオ
チン、ハプテン、酵素、蛍光物質、化学発光物
質などの標識物質を結合でき、非放射性アフイ
ニテイプローブ、プライマーへの応用が可能で
ある。 発明の具体的説明 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕 本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前
記の式〔〕で示されるものである。 式中、記号【式】は、2′−デオキシリボヌク レオシドの3′−および5′−水素基を除いたデオキ
シリボヌクレオシド残基を示すのに慣用されてい
るものであつて、具体的には下記の構造のもので
ある。 【式】 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、具体的には、下式で示される。 置換基Bはヌクレオチドを構成する塩基を示
し、通常はアデニン、チミン、シトシンまたはグ
アニンである。化合物〔〕中にBが複数個存在
するときは、それらは同一でも異なつてもよい。 mおよびnは、それぞれ0または自然数を示
す。本発明オリゴヌクレオチド誘導体の重合度が
m+nで表示されているのは、本発明の好ましい
製造法で重合度がそれぞれmおよびnのフラクシ
ヨンを縮合させていることによるものである(詳
細後記)。その場合のmは実用的には0〜6、特
に1〜4、nは実用的には0〜40、特に0〜20、
である。 基R1は化合物〔〕のヌクレオチド部分の5′−
末端リン酸基とアミノ基部分とを連結する二価の
直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。これ
は、特に炭素数2〜20程度の直鎖または分岐鎖の
アルキレン基が適当である。好ましいR1は、炭
素数2〜6のアルキレン基である。 化合物〔〕の合成 一般的説明 化合物〔〕、すなわち本発明によるオリゴヌ
クレオチド誘導体、は合目的的な任意の方法によ
つて合成することができる。 一つの好ましい方法は、下式〔〕で示される
化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保護基R2、
3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリン酸部分
の保護基をすべて除去すること、を特徴とするも
のである。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ0または任意の
自然数であつてm+n≧1であり、R0はリン酸
基を保護する置換基で通常置換されたフエニル基
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水
素残基であり、R2はアミノ基の保護基であり、
COR4基はヌクレオチドの3′−末端水酸基の保護
基であり、B′はヌクレオチドを構成する保護さ
れた塩基であつて必要に応じて保護されたもので
あり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である
(B′またはBおよびR0が複数個存在するときは、
それらは同一でも異なつてもよい)。〕 すなわち、この方法は前記の式〔〕のオリゴ
ヌクレオチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基に基R1を介して保
護された一級アミノ基を導入し、ヌクレオチドの
塩基部分およびリン酸基部分が保護され、3′−末
端に結合した水酸基の水素原子がCOR4基で置換
されたもの、のすべての保護基を除去することか
らなるものである。 一方、式〔〕の化合物は、他の官能基部分が
保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延長
上での保護された一級アミノ基の導入からなる方
法で合成することができる。 第1図は、この好ましい合成法の一例を示すフ
ローチヤートである。フローチヤート中の記号
は、下記の意味を持つ(その意義ないし詳細は、
後記した通りである)。 R0リン酸基を保護する置換基であつて、通常
オルトクロロフエニル基が用いられる。 R1二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基で
ある。 R2アミノ基の保護基であつて、通常トリフル
オロアセチル基が用いられる。 R3他のすべての保護基が安定な条件で容易に
脱離されて、リン酸ジエステルを与えることがで
きる置換基であつて、通常シアノエチル基が用い
られる。 COR4通常のオリゴヌクレオチド合成法に用い
られる3′−水酸基の保護基である。具体的には、
R4が低級アルキル基、アリール基(特に、フエ
ニル基、またはメチル置換フエニル)、あるいは
固相合成法の際に用いられる適当なスペーサーを
持つ担体(ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂)
であるもの、がある。 R55′−末端水酸基の保護基であつて、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 m 0または任意の自然数。 n 0または任意の自然数。 B 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、N−イソブチリルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン(すな
わち保護不要)より選択される。 化合物〔〕の合成 式〔〕で示される化合物は、他の官能基部分
が保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延
長上での保護された一級アミノ基の導入からなる
合目的的な任意の方法によつて合成することがで
きる。 化合物〔〕の合成法をその一実施態様(第1
図)について示せば、下記の通りである。第1図
において、5′−水酸基化合物〔0〕にリン酸化剤
(たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジク
ロリドまたはホスホベンゾトリアゾリド等)を作
用させてリン酸化し、ついでアミノ基が保護され
ているアミノアルコール化合物〔〕(この化合
物はアミノアルキレンアルコール(NH2−R1−
OH)のアミノ基をR2で保護することにより得る
ことができる)を縮合させることにより化合物
〔〕を得る。 なお、化合物〔0〕はオリゴヌクレオチドであ
つて、通常のオリゴヌクレオチド合成法で製造可
能である。 一方、通常のオリゴヌクレオチド合成法、好ま
しくは本発明者らの固相合成法(Tetrahedron
Letters1979、3635(1979)、Nucleic Acids
Research8、5473(1980)、Nucleic Acids Rese
−arch8、5491(1980)、Nucleic Acids
Research8、5507(1980)、Nucleic Acids
Research Symposium Series7、281(1980)に
従つて化合物〔〕を合成する。この5′末端の保
護基を除去した化合物〔′〕と先に合成した化
合物〔〕とを縮合剤を用いて縮合させることに
より化合物〔〕を得ることができる。縮合剤と
してはトシルクロリド、メシチレンスルホニルク
ロリド、メシチレンスルホニルテトラゾリドおよ
びメシチレンスルホニルニトロトリアゾリド等が
あるが、メシチレンスルホニルニトロトリアゾリ
ドが好ましい。なお、反応条件等の詳細は後記実
験例を参照されたい。 化合物〔〕の合成 化合物〔〕は、上記化合物〔〕の保護基を
すべて除去することによつて得ることができる。 保護基COR4基、リン酸トリエステル中のオル
トクロロフエニル基および塩基部分のアシル基
は、0.5Mのテトラメチルグアニジン−ピリジン
−2−カルボアルドキシムのジオキサン−水
(9:1(V/V))溶液で処理後、アルカリ処理
(濃アンモニア水)を行なうことにより除去され
る。R2がトリフルオロアセチル基の場合は、ア
ンモニア処理により充分脱離されるが、オルトニ
トロフエニルスルフエニル基である場合はメルカ
プトエタノール処理が必要である。R2として他
の保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチド部
分が安定な条件で、さらに別の処理を加えること
も可能である。なお、オリゴデオキシリボヌクレ
オドの合成法は既に各種のものが公知であつて、
保護基の種類およびその導入ないし除去ならびに
縮合その他について上記以外の詳細は核酸の化学
合成に関する成書や総説たとえば「ヌクレオシ
ド・ヌクレオチドの合成」(丸善1977年)、「核酸
有機化学」(化学同人1979年)、「核酸」(朝倉書店
1979年)、Tetrahedron、34、31(1978)、有合化、
34、723(1978)および化学の領域、33、566
(1979)等を参照することができる。 実施例 フローチヤート 第2図のフローチヤートに従つて、本発明の化
合物(同図の化合物を製造した。 第2図で、記号は次の意味を持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン B アデニン DMTr ジメトキシトリチル pはポリスチレンの重合度を示す。 R0 オルトクロロフエニル Et エチル CE −シアノエチル m 2 n 12 化合物〔〕(第2図の)の合成 実験1−1 ジメトキシトリチルアデノシン/樹脂〔〕
(樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目
的化合物は外観的には樹脂そのものと変らないの
で、樹脂に担持された当該化合物を以下において
単に樹脂と呼ぶことにする)300mg(0.033m
mol)をイソプロパノール−塩化メチレン(15:
85、V/V)溶液10mlで3回洗浄後、臭化亜鉛の
1.0Mのイソプロパノール−塩化メチレン溶液8
mlで5分間ずつ4回反応(脱トリチル化)させて
樹脂〔〕を得る。樹脂〔〕をイソプロパノー
ル−塩化メチレン溶液10mlで3回洗浄し、これに
ジヌクレオチド〔〕150mg(0.1mmol)のピリ
ジン溶液を添加後、共沸させて系を無水とし、メ
シチレンスルホニルニトリロトリアゾリド(以下
MSNTと記す)150mg(0.5mmol)と無水ピリジ
ン2mlとを添加して90分間反応(縮合)させる。
反応後、ピリジン10mlで3回洗浄し、触媒量(約
10mg)のジメチルアミノピリジン(以下DMAP)
を含む無水酢酸−ピリジン(1:9、(V/V))
溶液10mlを添加し10分間反応させて未反応5′−水
酸基をアセチル化して保護し、これをピリジンで
洗浄して、化合物〔′〕(n=2)を得る。以上
のような操作を6回くり返して、化合物〔〕
(n=12)を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔〕
800mg(0.71mmol)とオルトクロロフエニルホ
スホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液
(1.0mmol、6ml)中で2時間反応させ、続いて
トリフルオロアセチル−6−アミノヘキサノール
300mg(1.4mmol)および1−メチル−イミダゾ
ール115mg(1.4mmol)を加えてさらに2時間反
応させる。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をク
ロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリン酸二水
素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および5%の塩化ナトリウム水溶液でそれぞ
れ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。クロ
ロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製
(溶出液として0〜4%のメタノール含有クロロ
ホルムを使用)し、溶出液を濃縮後ペンタン中に
滴下し粉末状の化合物〔〕を得る。 上記で合成した化合物〔〕(n=12)115mg、
(3.45μmol)を前述と同様の方法で脱トリチル化
したもの〔〕に、化合物〔〕60mg(0.04m
mol)をトリエチルアミン−ピリジン−水(1:
3:1、V/V)溶液3mlで処理(脱シアノエチ
ル化)した化合物〔〕を加え、無水にしたの
ち、MSNT50mg(0.2mmol)およびピリジン1
mlを加え90分間反応(縮合)させ、反応終了後ピ
リジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥して、完
全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔〕
を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕15mgを0.5M
テトラメチルグアニジン−ピリジン−2−カルボ
アルドジキシムのジオキサン−水(9:1、
(V/V)溶液200μlを加え、遠沈管中、室温で24
時間反応させる。反応後、濃アンモニア水(2.5
ml)を加えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反
応終了後、過し、液を濃縮後、水に溶解させ
てからエーテルで抽出を行なう。水層を濃縮後、
セフアデツクスG−50(φ1.5×120cm、溶出液は
0.05Mの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液PH
7.5)で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体
〔〕を得た。 また、同様の方法で実験1−2、1−3、1−
4、1−5および1−6のオリゴヌクレオチド誘
導体を得た。実験例1−1〜1−6の化合物の塩
基配列その他を第1表に示す。 【表】 【表】 ただし、この表でAはアデニン、Tはチミン、
Gはグアニン、Cはシトシンを示す。 実験例1−1、1−2および1−4についての
セフアデツクスおよび高速液体クロマトグラフイ
ーの結果を第3〜4、5〜6および7〜8図に示
す。これらの結果より、化合物〔〕が生成して
いることがわかる。
導体に関する。さらに具体的には、本発明は、ヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基延長上に適度な長
さのスペーサーを介して一級アミノ基を導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体に関する。 先行技術 近年、核酸の科学合成は新しい保護基の導入あ
るいはトリエステル法、ホスフアイト法等の新し
い縮合法の開発により飛躍的に進歩している。ま
た、遺伝子工学の急速な進歩とあいまつて、核酸
の科学合成がこの分野でも重要な意義をもつよう
になつてきた。例えば人工遺伝子を合成し、遺伝
子組換え操作を利用して有用物質の産生が行なわ
れている(インターフエロン:Nature、.281、
544(1979)、白血球由来インターフエロン:
Nature、287、411(1980))。また、ハイブリツド
法のためのプローブ(Nucl、Acids Res.9、897
(1981))としてやmRNAあるいは一本鎖DNAか
ら逆転写酵素あるいはDNAポリメラーゼによつ
て、二本鎖DNAを合成する際に必要な鋳型DNA
に相捕的なDNA断片(プライマー)として利用
(Nucl.Acids Res.8、4057(1980))等の応用例
もある。 このように、核酸の有機化学的合成手段は、生
体から単離できない特殊の配列をもつオリゴヌク
レオチドの合成を可能にし、分子生物学、遺伝子
工学等の研究に多大な寄与をするものである。 本発明者らは現在まで、オリゴヌクレオチドの
有機化学的合成分野で固相法を有力な合成手段と
して、種々のオリゴヌクレオチドの合成を行なつ
てその応用を検討してきたが、特にアフイニテイ
クロマトグラフイー用樹脂あるいは非放射性アフ
イニテイプローブ等を開発すべく鋭意努力を重ね
た結果、これらの構造の際に有用な中間体である
オリゴヌクレオチド誘導体を見出した。 現在まで開発あるいは市販されているアフイニ
イテイクロマトグラフイー用樹脂(Arch.
Biochem.Biophys.、168、561(1974)、J.
Biochem.、83、783(1978)、特開昭52−25795号、
同53−101396号、同53−133283号および同55−
36277号各公報)は、一般に特異性、再現性が悪
く、合成がめんどうであるという共通の難点をか
かえている。 非放射性アフイニテイプローブ(Proc.Natl.
Sci.USA.78、6633−6637(1981))においては、
シトシン誘導体の合成が困難であり、任意でかつ
定められた塩基配列をもつDNAの合成が困難で
ある等の問題点がある。また、アフイニテイ樹脂
合成に際して下記に示す文献のものは、リガンド
の合成に手間がかかる等の難点がある。 J.Chromatog.、97、33(1974Biochem.
Biophys.Acta、304、231(1973)Anal.
Biochem.、71、471(1976) 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、目的物にのみ他の担体を結合できる官能基
(一級アミノ基)を、ヌクレオチドの5′−末端延
長上に適度の長さのスペーサーを介して導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体によつてこの目的
を達成しようというものである。 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、下式〔〕で示されるものであること、を
特徴とするものである。 また、本発明による下式〔〕で示されるオリ
ゴヌクレオチド誘導体の製造法は、下式〔〕で
示される化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保
護基R2、3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリ
ン酸部分の保護基をすべて除去すること、を特徴
とするものである。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ0または任意の
自然数であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の
炭化水素残基であり、Bはヌクレオチドを構成す
る塩基である(BおよびR0が複数個存在すると
きは、それらは同一でも異なつてもよい)。〕 効 果 本発明者らの合成したオリゴデオキシリボヌク
レオチドは、前記アフイニテイクロマトグラフイ
ー用樹脂あるいは核酸用非放射性アフイニテイプ
ローブの短所を回避できるものであり、下記のよ
うな長所を有するものである。 (イ) いかなる塩基配列をも有するアフイニテイ樹
脂やプローブを製造することができる。 (ロ) 合成が非常に簡単であつて、大量合成が可能
である。 (ハ) オリゴヌクレオチド中に存在する他の官能基
(水酸基、リン酸基および塩基部分のアミノ基
など)よりも反応性が高い一般アミノ基を有す
るので、脱保護したオリゴヌクレオチドを精製
せずに担体との縮合に用いることができる。す
なわち、反応条件等の設定により選択的にアミ
ノ基部分と結合可能である。 (ニ) 一級アミノ基を介して選択的に、担体、ビオ
チン、ハプテン、酵素、蛍光物質、化学発光物
質などの標識物質を結合でき、非放射性アフイ
ニテイプローブ、プライマーへの応用が可能で
ある。 発明の具体的説明 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕 本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前
記の式〔〕で示されるものである。 式中、記号【式】は、2′−デオキシリボヌク レオシドの3′−および5′−水素基を除いたデオキ
シリボヌクレオシド残基を示すのに慣用されてい
るものであつて、具体的には下記の構造のもので
ある。 【式】 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、具体的には、下式で示される。 置換基Bはヌクレオチドを構成する塩基を示
し、通常はアデニン、チミン、シトシンまたはグ
アニンである。化合物〔〕中にBが複数個存在
するときは、それらは同一でも異なつてもよい。 mおよびnは、それぞれ0または自然数を示
す。本発明オリゴヌクレオチド誘導体の重合度が
m+nで表示されているのは、本発明の好ましい
製造法で重合度がそれぞれmおよびnのフラクシ
ヨンを縮合させていることによるものである(詳
細後記)。その場合のmは実用的には0〜6、特
に1〜4、nは実用的には0〜40、特に0〜20、
である。 基R1は化合物〔〕のヌクレオチド部分の5′−
末端リン酸基とアミノ基部分とを連結する二価の
直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。これ
は、特に炭素数2〜20程度の直鎖または分岐鎖の
アルキレン基が適当である。好ましいR1は、炭
素数2〜6のアルキレン基である。 化合物〔〕の合成 一般的説明 化合物〔〕、すなわち本発明によるオリゴヌ
クレオチド誘導体、は合目的的な任意の方法によ
つて合成することができる。 一つの好ましい方法は、下式〔〕で示される
化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保護基R2、
3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリン酸部分
の保護基をすべて除去すること、を特徴とするも
のである。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ0または任意の
自然数であつてm+n≧1であり、R0はリン酸
基を保護する置換基で通常置換されたフエニル基
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水
素残基であり、R2はアミノ基の保護基であり、
COR4基はヌクレオチドの3′−末端水酸基の保護
基であり、B′はヌクレオチドを構成する保護さ
れた塩基であつて必要に応じて保護されたもので
あり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である
(B′またはBおよびR0が複数個存在するときは、
それらは同一でも異なつてもよい)。〕 すなわち、この方法は前記の式〔〕のオリゴ
ヌクレオチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基に基R1を介して保
護された一級アミノ基を導入し、ヌクレオチドの
塩基部分およびリン酸基部分が保護され、3′−末
端に結合した水酸基の水素原子がCOR4基で置換
されたもの、のすべての保護基を除去することか
らなるものである。 一方、式〔〕の化合物は、他の官能基部分が
保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延長
上での保護された一級アミノ基の導入からなる方
法で合成することができる。 第1図は、この好ましい合成法の一例を示すフ
ローチヤートである。フローチヤート中の記号
は、下記の意味を持つ(その意義ないし詳細は、
後記した通りである)。 R0リン酸基を保護する置換基であつて、通常
オルトクロロフエニル基が用いられる。 R1二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基で
ある。 R2アミノ基の保護基であつて、通常トリフル
オロアセチル基が用いられる。 R3他のすべての保護基が安定な条件で容易に
脱離されて、リン酸ジエステルを与えることがで
きる置換基であつて、通常シアノエチル基が用い
られる。 COR4通常のオリゴヌクレオチド合成法に用い
られる3′−水酸基の保護基である。具体的には、
R4が低級アルキル基、アリール基(特に、フエ
ニル基、またはメチル置換フエニル)、あるいは
固相合成法の際に用いられる適当なスペーサーを
持つ担体(ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂)
であるもの、がある。 R55′−末端水酸基の保護基であつて、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 m 0または任意の自然数。 n 0または任意の自然数。 B 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、N−イソブチリルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン(すな
わち保護不要)より選択される。 化合物〔〕の合成 式〔〕で示される化合物は、他の官能基部分
が保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延
長上での保護された一級アミノ基の導入からなる
合目的的な任意の方法によつて合成することがで
きる。 化合物〔〕の合成法をその一実施態様(第1
図)について示せば、下記の通りである。第1図
において、5′−水酸基化合物〔0〕にリン酸化剤
(たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジク
ロリドまたはホスホベンゾトリアゾリド等)を作
用させてリン酸化し、ついでアミノ基が保護され
ているアミノアルコール化合物〔〕(この化合
物はアミノアルキレンアルコール(NH2−R1−
OH)のアミノ基をR2で保護することにより得る
ことができる)を縮合させることにより化合物
〔〕を得る。 なお、化合物〔0〕はオリゴヌクレオチドであ
つて、通常のオリゴヌクレオチド合成法で製造可
能である。 一方、通常のオリゴヌクレオチド合成法、好ま
しくは本発明者らの固相合成法(Tetrahedron
Letters1979、3635(1979)、Nucleic Acids
Research8、5473(1980)、Nucleic Acids Rese
−arch8、5491(1980)、Nucleic Acids
Research8、5507(1980)、Nucleic Acids
Research Symposium Series7、281(1980)に
従つて化合物〔〕を合成する。この5′末端の保
護基を除去した化合物〔′〕と先に合成した化
合物〔〕とを縮合剤を用いて縮合させることに
より化合物〔〕を得ることができる。縮合剤と
してはトシルクロリド、メシチレンスルホニルク
ロリド、メシチレンスルホニルテトラゾリドおよ
びメシチレンスルホニルニトロトリアゾリド等が
あるが、メシチレンスルホニルニトロトリアゾリ
ドが好ましい。なお、反応条件等の詳細は後記実
験例を参照されたい。 化合物〔〕の合成 化合物〔〕は、上記化合物〔〕の保護基を
すべて除去することによつて得ることができる。 保護基COR4基、リン酸トリエステル中のオル
トクロロフエニル基および塩基部分のアシル基
は、0.5Mのテトラメチルグアニジン−ピリジン
−2−カルボアルドキシムのジオキサン−水
(9:1(V/V))溶液で処理後、アルカリ処理
(濃アンモニア水)を行なうことにより除去され
る。R2がトリフルオロアセチル基の場合は、ア
ンモニア処理により充分脱離されるが、オルトニ
トロフエニルスルフエニル基である場合はメルカ
プトエタノール処理が必要である。R2として他
の保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチド部
分が安定な条件で、さらに別の処理を加えること
も可能である。なお、オリゴデオキシリボヌクレ
オドの合成法は既に各種のものが公知であつて、
保護基の種類およびその導入ないし除去ならびに
縮合その他について上記以外の詳細は核酸の化学
合成に関する成書や総説たとえば「ヌクレオシ
ド・ヌクレオチドの合成」(丸善1977年)、「核酸
有機化学」(化学同人1979年)、「核酸」(朝倉書店
1979年)、Tetrahedron、34、31(1978)、有合化、
34、723(1978)および化学の領域、33、566
(1979)等を参照することができる。 実施例 フローチヤート 第2図のフローチヤートに従つて、本発明の化
合物(同図の化合物を製造した。 第2図で、記号は次の意味を持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン B アデニン DMTr ジメトキシトリチル pはポリスチレンの重合度を示す。 R0 オルトクロロフエニル Et エチル CE −シアノエチル m 2 n 12 化合物〔〕(第2図の)の合成 実験1−1 ジメトキシトリチルアデノシン/樹脂〔〕
(樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目
的化合物は外観的には樹脂そのものと変らないの
で、樹脂に担持された当該化合物を以下において
単に樹脂と呼ぶことにする)300mg(0.033m
mol)をイソプロパノール−塩化メチレン(15:
85、V/V)溶液10mlで3回洗浄後、臭化亜鉛の
1.0Mのイソプロパノール−塩化メチレン溶液8
mlで5分間ずつ4回反応(脱トリチル化)させて
樹脂〔〕を得る。樹脂〔〕をイソプロパノー
ル−塩化メチレン溶液10mlで3回洗浄し、これに
ジヌクレオチド〔〕150mg(0.1mmol)のピリ
ジン溶液を添加後、共沸させて系を無水とし、メ
シチレンスルホニルニトリロトリアゾリド(以下
MSNTと記す)150mg(0.5mmol)と無水ピリジ
ン2mlとを添加して90分間反応(縮合)させる。
反応後、ピリジン10mlで3回洗浄し、触媒量(約
10mg)のジメチルアミノピリジン(以下DMAP)
を含む無水酢酸−ピリジン(1:9、(V/V))
溶液10mlを添加し10分間反応させて未反応5′−水
酸基をアセチル化して保護し、これをピリジンで
洗浄して、化合物〔′〕(n=2)を得る。以上
のような操作を6回くり返して、化合物〔〕
(n=12)を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔〕
800mg(0.71mmol)とオルトクロロフエニルホ
スホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液
(1.0mmol、6ml)中で2時間反応させ、続いて
トリフルオロアセチル−6−アミノヘキサノール
300mg(1.4mmol)および1−メチル−イミダゾ
ール115mg(1.4mmol)を加えてさらに2時間反
応させる。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をク
ロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリン酸二水
素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および5%の塩化ナトリウム水溶液でそれぞ
れ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。クロ
ロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製
(溶出液として0〜4%のメタノール含有クロロ
ホルムを使用)し、溶出液を濃縮後ペンタン中に
滴下し粉末状の化合物〔〕を得る。 上記で合成した化合物〔〕(n=12)115mg、
(3.45μmol)を前述と同様の方法で脱トリチル化
したもの〔〕に、化合物〔〕60mg(0.04m
mol)をトリエチルアミン−ピリジン−水(1:
3:1、V/V)溶液3mlで処理(脱シアノエチ
ル化)した化合物〔〕を加え、無水にしたの
ち、MSNT50mg(0.2mmol)およびピリジン1
mlを加え90分間反応(縮合)させ、反応終了後ピ
リジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥して、完
全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔〕
を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕15mgを0.5M
テトラメチルグアニジン−ピリジン−2−カルボ
アルドジキシムのジオキサン−水(9:1、
(V/V)溶液200μlを加え、遠沈管中、室温で24
時間反応させる。反応後、濃アンモニア水(2.5
ml)を加えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反
応終了後、過し、液を濃縮後、水に溶解させ
てからエーテルで抽出を行なう。水層を濃縮後、
セフアデツクスG−50(φ1.5×120cm、溶出液は
0.05Mの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液PH
7.5)で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体
〔〕を得た。 また、同様の方法で実験1−2、1−3、1−
4、1−5および1−6のオリゴヌクレオチド誘
導体を得た。実験例1−1〜1−6の化合物の塩
基配列その他を第1表に示す。 【表】 【表】 ただし、この表でAはアデニン、Tはチミン、
Gはグアニン、Cはシトシンを示す。 実験例1−1、1−2および1−4についての
セフアデツクスおよび高速液体クロマトグラフイ
ーの結果を第3〜4、5〜6および7〜8図に示
す。これらの結果より、化合物〔〕が生成して
いることがわかる。
第1図は、本発明の化合物を合成する方法の一
例を示すフローチヤートである。第2図は、実験
例で示した本化合物のフローチヤートである。第
3、5および7図は、化合物〔〕(それぞれ実
験例1−1、1−2および1−4)についてのセ
フアデツクスG−50での溶出パターンを示したも
のである。第4,6および8図は、化合物〔〕
(それぞれ実験例1−1、1−2および1−4)
についての高速液体クロマトグラフイーの溶出パ
ターンを示したものである。
例を示すフローチヤートである。第2図は、実験
例で示した本化合物のフローチヤートである。第
3、5および7図は、化合物〔〕(それぞれ実
験例1−1、1−2および1−4)についてのセ
フアデツクスG−50での溶出パターンを示したも
のである。第4,6および8図は、化合物〔〕
(それぞれ実験例1−1、1−2および1−4)
についての高速液体クロマトグラフイーの溶出パ
ターンを示したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 下式〔〕で示されるものであることを特徴
とする、オリゴヌクレオチド誘導体。 〔ただし、mおよびnはそれぞれ0または任意の
自然数であつてm+n≧1であり、R1は二価の
直鎖または分岐鎖の炭化水素残基であり、Bはヌ
クレオチドを構成する塩基である(Bが複数個存
在するときは、それらは同一でも異なつてもよ
い。)〕 2 塩基Bがアデニン、チミン、シトシンおよび
グアニンからなる群より選ばれたものである、特
許請求の範囲第1項記載のオリゴヌクレオチド誘
導体。 3 R1が炭素数2〜20の直鎖または分岐鎖のア
ルキレン基である、特許請求の範囲第1項または
第2項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。 4 mが0または6までの自然数、nが0または
40までの自然数である、特許請求の範囲第1〜3
項のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘
導体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58204306A JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58204306A JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57138136A Division JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1982-08-09 | 固定化オリゴヌクレオチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5993100A JPS5993100A (ja) | 1984-05-29 |
JPH0374239B2 true JPH0374239B2 (ja) | 1991-11-26 |
Family
ID=16488294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58204306A Granted JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5993100A (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
JP4823310B2 (ja) | 2006-06-06 | 2011-11-24 | パナソニック株式会社 | ヌクレオチド鎖修飾方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57106696A (en) * | 1980-12-25 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | 1-(beta-d-arabinofuranosyl)cytosine derivative and its preparation |
-
1983
- 1983-10-31 JP JP58204306A patent/JPS5993100A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57106696A (en) * | 1980-12-25 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | 1-(beta-d-arabinofuranosyl)cytosine derivative and its preparation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5993100A (ja) | 1984-05-29 |
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