BR112020015736A2 - Anticorpo anti-b7-h4, fragmento de ligação a antígeno do mesmo e uso farmacêutico do mesmo - Google Patents
Anticorpo anti-b7-h4, fragmento de ligação a antígeno do mesmo e uso farmacêutico do mesmo Download PDFInfo
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- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-b7-h4, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo e uso farmacêutico do mesmo. um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado compreendendo uma região cdr do anticorpo anti-b7-h4, uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-b7-h4 e o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e uso do mesmo como um medicamento anticâncer. um anticorpo anti-b7-h4 humanizado e uso do mesmo na preparação de um medicamento para tratar doenças ou condições mediadas por b7-h4.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPO ANTI-B7-H4, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO E USO FARMACÊUTICO DO MESMO".
[001] A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-B7-H4, fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tendo imunorreatividade a receptor B7-H4 humano, anticorpos quiméricos e anticorpos humani- zados compreendendo as regiões CDR do referido anticorpo anti-B7- H4, composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo anti-B7- H4 humano e fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e uso do mesmo como agentes anticâncer.
[002] A imunoterapia tumoral é uma área de pesquisa e desen- volvimento a longo prazo no campo de tratamento de câncer, e no qual a imunoterapia tumoral de células T está em uma posição central. O escape tumoral é um enorme obstáculo enfrentado pela imunoterapia tumoral. A maioria dos tumores de expressão pode ser reconhecido em graus variados pelo sistema imune do hospedeiro, mas em muitos casos, o crescimento tumoral é promovido pela inibição do sistema imune causada pelas células tumorais per se, devido à resposta imune inadequada desencadeada por ativação ineficiente de células T efeto- ras. A imunoterapia tumoral é para utilizar totalmente e recrutar células T assassinas e/ou outras células imunes em pacientes com tumor para matar tumores.
[003] Estudos sobre o receptor de CD28 e seus ligandos levaram à caracterização de moléculas relacionadas conhecidas como super- família B7. Os membros da família B7 são uma classe de imunoglobu- linas com domínio tipo imunoglobulina V (IgV) e domínio tipo imuno- globulina C (I9C), cujos membros incluem fatores coestimuladores B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86), ligando indutível para fator estimulador
(ICOS-L/B7-H2), ligando de morte-1 programada (PD-L1/B7-H1), li- gando de morte-2 programada (PD-L2/B7-DC), B7-H4 e B7-H4 etc.
[004] B7-H4 humano é uma proteína transmembranar do tipo | que consiste em 282 aminoácidos, cujo gene de codificação é locali- zado na região p11.1 do cromossomo 1 (Choi IH et al., J. Immunol., 1º de novembro de 2003; 171(9): 4650-4). B7-H4 desempenha um papel na resposta imune de células T reguladoras negativas. B7-H4 tem efei- tos extensivamente inibidores na diferenciação, desenvolvimento, pro- gressão do ciclo celular e produção de citocinas de células T CD4+ e CDB8+ (Sica GL et al. Immunity. Jun. de 2003; 18(6):849-61). Distúrbios de células imunes e fenômenos autoimunes não foram encontrados em camundongos nocaute de B7-H4 (Zhu G et al., Blood. 19 de feve- reiro de 2009; 113(8): 1759-67; Suh WK et al., Blood. Mol Cell Biol. Set. de 2006; 26(17):6403-11). Os receptores de B7-H4 e suas vias de sinalização ainda não estão claros.
[005] Estudos recentes descobriram que a proteína B7-H4 é abundantemente expressa em vários tecidos tumorais, permitindo que as células tumorais escapem do ataque do sistema imune do corpo. Como alvo para terapia tumoral, a molécula B7-H4 fornece um novo método para imunoterapia tumoral.
[006] Atualmente, sabe-se que o B7-H4 humano é expresso em várias células cancerosas, tais como câncer de mama, câncer de ová- rio, câncer de pulmão, câncer cervical, câncer de rim, câncer de bexiga e câncer de fígado. A expressão de mMRNA de B7-H4 foi encontrada no baço, pulmão, timo, fígado, músculo esquelético, rim, pâncreas, testí- culo e ovário. Baixa expressão de B7-H4 no nível de proteína foi en- contrada em tecidos, tais como mama (cateter e lobular), epitélio das trompas de falópio e glândula endometrial. Estudos relacionados tam- bém mostraram que B7-H4 é superexpresso em macrófagos associa- dos a tumor (TAM) (Kryczek, |. et al., J. Exp. Med. 2006, 203(4): 871-
881), enquanto os macrófagos constituem um componente importante do microambiente tumoral e podem ser responsáveis por até 50% da massa tumoral.
[007] Atualmente, inúmeras empresas farmacêuticas nacionais estão envolvidas no desenvolvimento de anticorpos monocionais con- tra B7-H4 e/ou seus conjugados de droga para melhorar a resposta do sistema imune do próprio paciente a tumores e alcançar a morte direta de células tumorais. Patentes relacionadas são, por exemplo, WO?2013025779, US20140322129 e similares. Os anticorpos mono- clonais anti-B7-H4 disponíveis em empresas, tais como Medimmune e FivePrime, estão atualmente em fase pré-clínica; Os conjugados de droga-anticorpo anti-B7-H4 da Genentech também estão em fase de desenvolvimento pré-clínico.
[008] A presente invenção fornece anticorpos anti-B7-H4 com alta afinidade, alta seletividade e alta atividade biológica, para uso em imunoterapia com anticorpos monoclonais para tumores e aplicações relacionadas dos mesmos. Medicamentos, composições e métodos para tratamento de tumores B7-H4 positivos também são fornecidos.
[009] A presente invenção provê um anticorpo de B7-H4 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo: região variável de cadeia leve de anticorpo compreendendo pelo menos uma LCDR selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56;
SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQID NO: 72; e região variável de cadeia pesada de anticorpo compreen- dendo pelo menos uma HCDR selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29; SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61; SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74.
[0010] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a referida região variável de cadeia pe- sada de anticorpo compreende: HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45, respectivamente;
HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 53, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69, respectivamente; ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:21, respectivamente.
[0011] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é provido, em que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende: LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56, respectivamente; LCDR1, LCDR2, e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, e SEQ ID NO: 64, respectivamente; ou LCDR1, LCDR2, e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, e SEQ ID NO: 72, respectivamente.
[0012] Um anticorpo anti-B7-H4 particularmente preferido ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo pode ser qualquer um selecio- nado do grupo que consiste nos seguintes, compreendendo uma ou mais das seguintes sequências de região CDR ou sequência(s) apre- sentando pelo menos 95% de identidade de sequência inerente:
(1) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente; e a região variável de ca- deia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 co- mo mostrado na SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5, respec- tivamente;
(2) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente;
(3) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO:21, respectivamente;
(4) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29, respectivamente;
(5) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen-
de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37, respectivamente;
(6) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45, respectivamente;
(7) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 53, respectivamente;
(8) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:61, respectivamente;
(9) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreen- de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente; e
(10) a região variável de cadeia leve de anticorpo compre-
ende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:21, respectivamente.
[0013] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é a anticorpo murino ou fragmento do mesmo.
[0014] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é provido, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo quimérico ou fragmento do mesmo.
[0015] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é a anticorpo humano ou fragmento do mesmo.
[0016] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo.
[0017] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a região variável de cadeia leve de anti- corpo humanizado é região variável de cadeia leve compreendendo a(s) sequência(s) selecionada(s) do grupo que consiste em SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80 ou SEQ ID NO:82.
[0018] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des-
crito acima, é provido, em que a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado é região variável de cadeia pesada compreen- dendo a(s) sequência(s) selecionada(s) do grupo que consiste em SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79 ou SEQ ID NO:81.
[0019] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado compreende ainda região(ões) FR de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou uma variante da(s) mesma(s), preferencialmente compreende região(ões) FR de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana; mais preferencialmente com- preende região(ões) FR de cadeia pesada de IgG1 que foi(foram) submetida(s) à mutação de aminoácido para melhorar a toxicidade ADCC.
[0020] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a cadeia leve de anticorpo humanizado é cadeia leve compreendendo a sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88 ou SEQ ID NO:90.
[0021] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a cadeia pesada de anticorpo humani- zado é cadeia pesada compreendendo a sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87 ou SEQ ID NO:89.
[0022] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a região variável de cadeia leve de anti- corpo humanizado é região variável de cadeia leve compreendendo a sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 80.
[0023] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado é região variável de cadeia pesada compreen- dendo a sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO:79
[0024] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a cadeia leve de anticorpo humanizado compreende a sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO:88.
[0025] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que a cadeia pesada de anticorpo humani- zado compreende a sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO:87.
[0026] Em uma modalidade mais preferida da invenção, o anticor- po humanizado é selecionado de qualquer um dos seguintes anticor- pos compreendendo: (1) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 76 e regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 75; (2) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 78 e uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 77; (3) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 80 e regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 79; ou (4) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 82 e regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 81.
[0027] Em outra modalidade preferida da invenção, o anticorpo humanizado é selecionado de qualquer um dos seguintes anticorpos compreendendo: (1) cadeia leve de SEQ ID NO: 84 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 83; (2) cadeia leve de SEQ ID NO: 86 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 85; (3) cadeia leve de SEQ ID NO: 88 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 87; ou (4) cadeia leve de SEQ ID NO: 90 e cadeia pesada de SEQ ID NO:89.
[0028] Um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, tendo pelo menos uma das seguintes características: (1) ligação a um epítopo compreendendo aminoácidos 41-60 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; e (2) ligação a um epítopo compreendendo aminoácidos 53-59 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4.
[0029] Um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, tendo pelo menos uma das seguintes características: (1) ligação a um epítopo compreendendo aminoácido 53 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (2) ligação a um epítopo compreendendo aminoá- cido 54 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (3) ligação a um epítopo com- preendendo aminoácido 56 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (4) ligação a um epítopo compreendendo aminoácido 57 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (5) ligação a um epítopo compreendendo aminoácido 58 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; e (2) ligação a um epítopo compreendendo aminoácido 59 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4.
[0030] Em uma modalidade preferida da invenção, um anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como des- crito acima, é provido, em que o fragmento de ligação a antígeno é Fab, Fv, sFv, F(ab')2, anticorpo linear, anticorpo de cadeia simples, nanocorpo, anticorpo de domínio ou anticorpo multiespeciífico.
[0031] A presente invenção ainda provê uma sequência de DNA codificando o anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como descrito acima.
[0032] A presente invenção ainda provê um vetor de expressão compreendendo a sequência de DNA como descrito acima.
[0033] A invenção ainda provê uma célula hospedeira sendo intro- duzida com ou compreendendo o vetor de expressão como descrito acima.
[0034] Em uma modalidade preferida da invenção, a célula hospe- deira, como descrito acima, é caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é bactéria, preferencialmente Escherichia coli.
[0035] Em uma modalidade preferida da invenção, a célula hospe- deira, como descrito acima, é levedura, preferencialmente Pichia pas- toris.
[0036] Em uma modalidade preferida da invenção, a célula hospe- deira, como descrito acima, é célula de mamífero, preferencialmente célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula de rim embrionário humano (HEK) 293.
[0037] A invenção também provê um método de produzir o anti- corpo de B7-HA4, incluindo cultivar a célula hospedeira como descrito acima, isolar o anticorpo da cultura e purificar o anticorpo.
[0038] A invenção também provê um anticorpo multiespecífico compreendendo região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada como descrito acima.
[0039] A invenção também provê um anticorpo de cadeia simples compreendendo região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada como descrito acima.
[0040] A invenção também provê um reagente de detecção ou agente de diagnóstico compreendendo o anticorpo de B7-H4 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo como descrito acima.
[0041] A presente invenção também provê um método para imu- nodetecção ou determinação de B7-H4, que compreende usar o anti- corpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da pre- sente invenção.
[0042] A presente invenção também provê um método para diag- nosticar doenças associadas a células positivas para B7-H4, o método compreende detectar ou medir B7-H4 ou células positivas para B7-H4 usando o anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção.
[0043] A invenção ainda provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de B7-H4 ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo, como descrito acima, e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[0044] A presente invenção ainda provê o uso do anticorpo anti- B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como descrito acima, na fabricação de um medicamento para o tratamento de doen- ça ou condição mediada por B7-H4; em que a doença é preferencial- mente um câncer; preferencialmente, a doença é câncer expressando B7-H4; o câncer é mais preferencialmente selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fíga- do, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer cervical, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e me- lanoma.
[0045] A presente invenção ainda provê um método de tratar e prevenir doenças ou condições mediadas por B7-H4, incluindo admi- nistrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade te- rapeuticamente eficaz do anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica compre- endendo o mesmo, em que a doença é preferencialmente um câncer;
preferencialmente, a doença é câncer expressando B7-H4; o câncer é mais preferencialmente selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estô- mago, câncer de cólon, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer cervical, glioblastoma e melanoma.
[0046] Figura 1: Ensaio de ligação ELISA in vitro de anticorpos, mostrando que todos os sete anticorpos quiméricos têm atividade de ligação a o antígeno de B7-H4 humano purificado, em que os anticor- pos quiméricos 2F7 e 2F8 têm ECs5o de cerca de 0,1 nM.
[0047] Figura 2: Ensaios de ligação ELISA indiretos, apresentando o epítopo antigênico ao qual o anticorpo anti-B7-H4 hu2F7 se liga.
[0048] Figura 3: Ensaio farmacológico em camundongos, mos- trando o efeito antitumoral de anticorpo anti-B7-H4 hu1C9.
[0049] Figura 4: Ensaio de função imunológica, mostrando o efeito de anticorpos anti-B7-H4 hu1C9 e hu2G6 no aumento de imunidade (proliferação de células T).
1. Terminologia
[0050] A fim de melhor entender a invenção, certos termos técni- cos e científicos são especificamente definidos abaixo. Salvo especifi- camente definido em outra parte deste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significa- do comumente entendido por um versado na técnica à qual esta in- venção pertence.
[0051] Como aqui utilizado, o código de letra única e o código de três letras para aminoácidos são os descritos em J. biol. chem, 243, (1968) p3558.
[0052] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a imuno-
globulina, uma estrutura de cadeia de quatro peptídeos formada pela conexão de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas juntas por ligação(ões) dissulfeto intercadeia. Diferentes re- giões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina exibem diferen- tes composições e sequências de aminoácido, apresentando assim antigenicidade diferente. Por conseguinte, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco categorias, ou denominadas isótipos de imuno- globulina, nomeadamente IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, suas cadeias pe- sadas são cadeia yu, cadeia 5, cadeia y, cadeia a e cadeia e, respecti- vamente. De acordo com sua composição de aminoácido da região de dobradiça e o número e localização das ligações dissulfeto de cadeia pesada, o mesmo tipo de lg pode ser dividido em diferentes subcate- gorias, por exemplo, IgG pode ser dividida em I9G1, I19G2, I19G3 e IgG4. A cadeia leve pode ser dividida em cadeia K ou À de acordo com diferentes regiões constantes. Cada uma das cinco Igs pode ter cadeia K Ou À.
[0053] Na presente invenção, a região variável de cadeia leve de anticorpo descrita neste documento ainda compreende uma região constante de cadeia leve, que compreende uma cadeia K«, À humana ou de murino ou uma variante da mesma.
[0054] Na presente invenção, a região variável de cadeia pesada de anticorpo descrita neste documento ainda compreende uma região constante de cadeia pesada, que compreende IgG1, 2, 3, 4 humana ou de murino ou uma variante da mesma.
[0055] As sequências de cerca de 110 aminoácidos localizadas perto do N-terminal das cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpo variam bastante, essa região é conhecida como região variável (região V); o restante da sequência de aminoácidos próximo ao terminal C é relativamente estável, conhecida como região constante (região C). À região variável compreende três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões de quadro de sequência relativamente conservadas (FR). As três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecidas como região de determinação de complementari- dade (CDR). Cada região variável de cadeia leve (LCVR) e cada regi- ão variável de cadeia pesada (HCVR) são compostas por três CDRs e quatro FRs, do terminal amino ao terminal carboxil sendo: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Três CDRs de cadeia leve referem-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; três CDRs de cadeia pesada se referem a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. Os números e localizações de resíduos de aminoácido de CDR em VL e VH do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno aqui estão em conformidade com os critérios de numeração de Kabat conhecidos e os critérios de definição de Kabat ou ADM (http://bioinf.org .uKk/abs/).
[0056] O termo "célula apresentadora de antígeno" ou "APC" é uma célula que exibe em sua superfície antígenos estranhos comple- xados com MHC. As células T reconhecem esse complexo pelos re- ceptores de células T (TCRs). Exemplos de APCs incluem, mas sem limitação, células dendríticas (DC), células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), monócitos, linfoblastos B e células dendríticas (DC) derivadas de monócitos. O termo "apresentação de antígeno" refere-se a um processo durante o qual as APCs capturam antígenos e permitem que sejam reconhecidos por células T, por exemplo, como um componente dos conjugados MHC-I/MHC-II.
[0057] O termo "B7-H4" refere-se a um membro da família de pro- teínas B7 humanas, também conhecido como CD276, que é uma pro- teína transmembranar tipo | tendo quatro domínios extracelulares tipo Ig. B7-H4 é uma das proteínas do ponto de verificação imune expres- sas na superfície de células apresentadoras de antígeno ou células cancerosas, e tem um efeito inibidor na ativação de células T. O termo "B7-H4" inclui qualquer variante ou isoforma de B7-H4 naturalmente expressa por células. Os anticorpos da presente invenção podem rea- gir de forma cruzada com B7-H4 obtido de espécies não humanas. Al- ternativamente, os anticorpos podem ser específicos para B7-H4 hu- mano, e podem não exibir reatividade cruzada com outras espécies. B7-H4 ou qualquer variante ou isótipo do mesmo pode ser isolado de células ou tecidos em que são naturalmente expressos ou produzidos por técnicas recombinantes, usando técnicas comumente usadas na técnica e aquelas descritas aqui. Preferencialmente, os anticorpos an- ti-B7-H4 têm como alvo B7-H4 humano com padrão de glicosilação normal.
[0058] O termo "anticorpo humano recombinante" inclui anticorpos humanos preparados, expressos, criados ou isolados por métodos re- combinantes, e as técnicas e métodos envolvidos são bem conhecidos na técnica, tais como: (1) um anticorpo isolado de um gene de imuno- globulina humana de animal transgênico ou transcromossômico (por exemplo, um camundongo), ou um hibridoma preparado; (2) um anti- corpo isolado de células hospedeiras transformadas que expressam o anticorpo, tal como um transfectoma; (3) um anticorpo isolado de uma biblioteca de anticorpo humano combinado recombinante; e (4) um an- ticorpo preparado, expresso, criado ou isolado dividindo sequências genéticas de imunoglobulina humana em outras sequências de DNA ou similares. Esse anticorpo humano recombinante compreende regi- ão variável e região constante incorporando sequências de imunoglo- bulina da linha germinativa humana específicas codificadas por genes da linha germinativa, mas também rearranjos e mutações subsequen- tes, tais como as ocorridas durante a maturação de anticorpo.
[0059] O termo "anticorpo murino" na presente invenção refere-se a anticorpo monoclional anti-B7-H4 humano preparado de acordo com os conhecimentos e habilidades na técnica. Durante a preparação, um objeto de teste é injetado com antígeno B7-H4 e, em seguida, o anti-
corpo que expressa hibridoma, que possui as características funcio- nais ou de sequência desejadas, é isolado. Em uma modalidade prefe- rida do presente pedido, o anticorpo murino B7-H4 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo ainda compreende uma região constante de cadeia leve de cadeia «, À de murino ou uma variante da mesma, ou compreende ainda uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de murino, ou uma variante da mesma.
[0060] O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos tendo regiões variáveis e constantes de sequências de imunoglobulina de linha ger- minativa humana. Anticorpos humanos da presente invenção podem incluir resíduos de aminoácido que não são codificados por sequên- cias de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticor- po humano" não inclui um anticorpo em que as sequências de CDR derivadas de outra linha germinativa de espécies de mamíferos, tal como a linha germinativa de camundongo, foram enxertadas em uma sequência de quadro humana (isto é, "anticorpo humanizado").
[0061] O termo "anticorpo humanizado", também conhecido como anticorpo enxertado em CDR, refere-se a um anticorpo gerado por se- quências de CDR de murino enxertadas em um quadro de região vari- ável do anticorpo humano. Os anticorpos humanizados evitam a forte resposta indesejada de anticorpos induzida pelos anticorpos quiméri- cos que transportam uma grande quantidade de componentes de pro- teína de murino. Para evitar uma diminuição na atividade causada pela imunogenicidade reduzida, a região variável do anticorpo humano po- de ser submetida a uma mutação reversa mínima para manter a ativi- dade.
[0062] O termo "anticorpo quimérico" é um anticorpo que é forma- do pela fusão da região variável de um anticorpo murino com a região constante de um anticorpo humano, e o anticorpo quimérico pode ali- viar a resposta imune induzida por anticorpos murinos. Para estabele- cer um anticorpo quimérico, o anticorpo monoclonal murino específico secretor de hibridoma é primeiramente estabelecido, um gene de regi- ão variável é clonado das células de hibridoma de camundongo e, em seguida, um gene de região constante de um anticorpo humano é clo- nado conforme desejado, o gene de região variável de camundongo é ligado ao gene de região constante humana para formar um gene qui- mérico que pode, então, ser inserido em um vetor humano e, finalmen- te, a molécula de anticorpo quimérico é expressa no sistema industrial eucariótico ou procariótico. A região constante de um anticorpo huma- no é selecionada da região constante de cadeia pesada de IgG1, I9G2, I9G3 ou IgG4 humana ou uma variante da mesma, preferenci- almente, é a região constante de cadeia pesada de IgG2 ou IgG4 hu- mana, ou a região constante de cadeia pesada de IgG1 que exibe ADCC aumentada (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo), devido à mutação de aminoácidos.
[0063] O termo "fragmento de ligação a antígeno" refere-se a fra- gmentos de ligação a antígeno de um anticorpo e análogos de um an- ticorpo, que geralmente incluem pelo menos uma parte da região de ligação a antígeno ou região variável (por exemplo, uma ou mais CDRs) do anticorpo de origem. Os fragmentos de anticorpo retêm pelo menos parte da especificidade de ligação do anticorpo de origem. Ge- ralmente, quando a atividade é expressa como molar, os fragmentos de anticorpo retêm pelo menos 10% de atividade de ligação do anti- corpo de origem. Preferencialmente, os fragmentos de anticorpo retêm pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais de afi- nidade de ligação do anticorpo de origem ao alvo. Exemplos de frag- mentos de ligação a antígeno incluem, mas sem limitação, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única,
nanocorpos, anticorpos de domínio e anticorpos multiespecíficos. As variantes de anticorpos manipulados são revistas em Holliger e Hud- son (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136.
[0064] O "fragmento Fab" é composto por uma cadeia leve, uma cadeia pesada CH1 e regiões variáveis. A cadeia pesada de uma mo- lécula Fab não pode formar ligação dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.
[0065] A região "Fc" contém dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios de anticorpo CH1 e CH2. Os dois frag- mentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais liga- ções dissulfeto e interação hidrofóbica do domínio CH3.
[0066] "Fragmento Fab “ contém uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada que compreende o domínio VH, o domínio CH1 e uma região entre os domínios CH1 e CH2 e, portanto, uma molécula F(ab')2 pode ser formada por duas cadeias pesadas de dois Fragmen- tos Fab' ligados por ligações dissulfeto intercadeia.
[0067] O "fragmento F(ab')2" contém duas cadeias leves e parte de cadeias pesadas compreendendo a região constante entre os do- mínios CH1 e CH2, formando assim ligações dissulfeto intercadeia en- tre as duas cadeias pesadas. Portanto, o fragmento F(ab')2 consiste em dois fragmentos Fab' mantidos juntos por ligações dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.
[0068] "Região Fv" contém regiões variáveis de cadeias pesada e leve, mas sem regiões constantes.
[0069] O termo "anticorpo multiespecífico" é utilizado no seu senti- do mais amplo e abrange anticorpos com especificidade multiepítopo. Esses anticorpos multiespecíficos incluem, mas sem limitação, anti- corpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a unidade VH-VL possui especificidade de múltiplos epítopos; anticorpos compreenden-
do duas ou mais regiões VL e VH, em que cada unidade VH-VL se liga a alvos diferentes ou a diferentes epítopos do mesmo alvo; anticorpos compreendendo duas ou mais regiões variáveis únicas, em que cada região variável única se liga a diferentes alvos ou a diferentes epítopos do mesmo alvo; anticorpos de comprimento total; fragmentos de anti- corpo; diacorpos; diacorpos e triacorpos biespecíficos, fragmentos de anticorpo que foram covalentemente ou não covalentemente ligados.
[0070] O termo "anticorpo de cadeia única" é uma proteína recom- binante de cadeia única composta por região variável de cadeia pesa- da (VH) e região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo conectada por um ligante peptídico, e o anticorpo de cadeia única é o menor fra- gmento de anticorpo com sítios de ligação a antígeno intactos.
[0071] O termo "fragmento de anticorpo de domínio" é um frag- mento de imunoglobulina tendo funções imunológicas e contém ape- nas região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia le- ve. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH são covalentemente ligadas a um ligante de peptídeo para formar um fragmento de anticor- po de domínio bivalente. As duas regiões VH de um fragmento de an- ticorpo de domínio bivalente podem ter como alvo os mesmos ou dife- rentes antígenos.
[0072] O termo "ligação a B7-H4" refere-se à interação com B7-H4 humano. O termo "sítio de ligação a antígeno", conforme aqui utilizado, refere-se a sítios tridimensionais descontínuos no antígeno, reconhe- cidos como anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do presente pedido.
[0073] O termo "epítopo" refere-se aos sítios em um antígeno que especificamente se ligam a uma imunoglobulina ou anticorpo. O epíto- po pode ser formado por aminoácidos adjacentes, ou por aminoácidos não adjacentes, mas fechado devido a dobras terciárias de uma prote- ína. O epítopo formado por aminoácidos adjacentes é tipicamente reti-
do após exposição a solventes desnaturantes, enquanto o epítopo formado por dobras terciárias é tipicamente perdido após o tratamento com solventes desnaturantes. Epítopos normalmente incluem pelo menos 3-15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os mé- todos para determinar qual epítopo é ligado por um determinado anti- corpo são bem conhecidos na técnica, incluindo ensaios de imunoblot- ting e imunoprecipitação, e semelhantes. Os métodos para determinar a conformação espacial de um epítopo incluem técnicas na área e téc- nicas descritas aqui, tais como cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional.
[0074] O termo "especificamente se liga a", "se liga seletivamente a", como aqui utilizado, refere-se à ligação de um anticorpo a um epí- topo em um antígeno predeterminado. Normalmente, quando um B7- H4 humano recombinante é usado como analito e um anticorpo é usa- do como ligando, o anticorpo se liga a um antígeno predeterminado em aproximadamente menos de 10” M ou, ainda, menos constante de dissociação de equilíbrio (Kp), e a afinidade do anticorpo para ligação ao antígeno predeterminado é pelo menos duas vezes superior ao dos antígenos não específicos (que não o antígeno predeterminado ou an- tígenos intimamente relacionados) (tais como BSA), conforme medido em um instrumento por técnicas de ressonância de plásmons de su- perfície (SPR). O termo "um anticorpo que reconhece o antígeno" pode ser usado aqui de forma intercambiável com o termo "anticorpo especi- ficamente de ligação".
[0075] O termo "reação cruzada" refere-se à capacidade do anti- corpo da presente invenção de se ligar a B7-H4 derivado de diferentes espécies. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que se liga a B7-H4 humano também pode se ligar a B7-H4 derivado de outra es- pécie. A reatividade cruzada é medida detectando a reatividade espe- cífica com antígeno purificado em ensaios de ligação (por exemplo,
SPR e ELISA), ou detectando a ligação ou interação funcional com células que fisiologicamente expressam B7-H4. Os métodos para de- terminar a reatividade cruzada incluem ensaios de ligação padrão, como descrito aqui, tais como análise por ressonância de plásmons de superfície (SPR) ou citometria de fluxo.
[0076] Os termos "inibição" ou "bloqueio" são usados de forma in- tercambiável e englobam inibição/bloqueio parcial e total. A inibi- ção/bloqueio do ligando preferencialmente reduz o nível normal de li- gação a ligando ou altera o tipo de atividade de ligação a ligando, quando comparado com o da ausência de inibição ou bloqueio. A inibi- ção e o bloqueio também pretendem incluir qualquer diminuição men- surável na afinidade de ligação, quando um ligando é contatado com um anticorpo anti-B7-H4, quando comparado com a afinidade de liga- ção na ausência de anticorpo anti-B7-H4.
[0077] O termo "inibir o crescimento" (por exemplo, no contexto de células) pretende incluir qualquer redução mensurável no crescimento celular.
[0078] Os termos "induzir uma resposta imune" e "intensificar uma resposta imune" são usados de forma intercambiável e se referem à resposta imune à estimulação de um antígeno específico (isto é, pas- sivo ou adaptativo). No que diz respeito à indução de CDC ou ADCC, o termo "induzir" significa estimular um mecanismo específico para matar células diretamente.
[0079] Como aqui utilizado, o termo "ADCC", nomeadamente cito- toxicidade mediada por células dependente de anticorpos, refere-se a células que expressam receptores Fc que matam diretamente células alvo revestidas por um anticorpo através do reconhecimento do seg- mento Fc do anticorpo. A função efetora de ADCC do anticorpo pode ser reduzida ou eliminada através da modificação do segmento Fc de IgG. A modificação refere-se à mutação(ões) da região constante da cadeia pesada de anticorpo.
[0080] Os métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmen- tos de ligação e antígeno são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Using Antibodies A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, Capítulos 5-8 e 15. Por exemplo, os camundon- gos podem ser imunizados com B7-H4 humano, ou seus fragmentos, e os anticorpos resultantes podem ser renaturados, purificados e se- quenciados usando métodos convencionais bem conhecidos na técni- ca. Os fragmentos de ligação a antígeno também podem ser prepara- dos por métodos convencionais. O anticorpo ou o fragmento de liga- ção a antígeno da presente invenção pode ser obtido introduzindo uma ou mais regiões de quadro humanas (FRs) em CDRs não derivadas de seres humanos usando engenharia genética. Sequências de linha germinativa de FR humanas podem ser obtidas em ImMunoGeneTics (IMGT) no site http://limgt.cines.fr ou em The Immunoglobulin FactsBo- ok, 2001ISBN012441351.
[0081] O anticorpo manipulado ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção pode ser preparado e purificado usando méto- dos convencionais. Por exemplo, as sequências de cDNA que codifi- cam anticorpos correspondentes podem ser clonadas e recombinadas em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobuli- na recombinante pode, então, ser transfectado de maneira estável em células CHO. Como um método mais recomendado bem conhecido na técnica, os sistemas de expressão de mamíferos podem resultar em glicosilação de anticorpos, tipicamente no terminal N altamente con- servado na região Fc. Os clones estáveis podem ser obtidos através da expressão de um anticorpo ligando-se especificamente a antígeno humano. Os clones positivos podem ser expandidos em um meio de cultura isento de soro para produção de anticorpos em biorreatores. O meio de cultura, no qual um anticorpo foi secretado, pode ser purifica-
do e coletado por técnicas convencionais. O anticorpo pode ser filtrado e concentrado usando técnicas comuns. Misturas solúveis e agrega- dos podem ser efetivamente removidos por técnicas comuns, tais co- mo peneira molecular ou troca iônica. O produto resultante deve ser imediatamente congelado, por exemplo, a -70ºC, ou pode ser liofiliza- do.
[0082] Os anticorpos da presente invenção referem-se a anticor- pos monoclionais. Anticorpo monoclonal ou mAb, como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone incluindo, mas sem limitação, cepa de clone único de eucariotas, procariotas ou fagos. Anticorpos monoclionais ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos podem ser obtidos, por exemplo, por tecnologias de hi- bridoma, tecnologias recombinantes, tecnologias de exibição de fagos, tecnologias sintéticas (por exemplo, enxerto de CDR) ou outras tecno- logias conhecidas na técnica.
[0083] "Administração" e "tratamento", como se aplica a um ani- mal, ser humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, refere-se a contatar uma composição ou agente farmacêuti- co, terapêutico, de diagnóstico exógeno com o animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de pesquisa e experimentais. O tra- tamento de uma célula abrange contatar um reagente com a célula, bem como contatar um reagente com um fluido, em que o fluido está em contato com a célula. "Administração" e "tratamento" também signi- ficam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição de ligação, ou por outra célula. "Tratamento", como se aplica um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, refere-se a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, pesquisa e aplicações de diagnóstico.
[0084] "Tratar" significa administrar um agente terapêutico, tal co- mo uma composição compreendendo qualquer um dos compostos de ligação da presente invenção, interna ou externamente, a um paciente que sofre de um ou mais sintomas de doença para os quais o agente tem atividade terapêutica conhecida. Tipicamente, o agente terapêuti- co é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintomas de doença no paciente ou população tratada, induzindo a regressão do(s) sintoma(s) ou inibindo a progressão de tal(is) sinto- ma(s) a qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma específi- co da doença (também chamada de "quantidade terapeuticamente efi- caz") pode variar de acordo com fatores, tais como estado da doença, idade e peso do paciente, e a capacidade do agente para obter uma resposta desejada no paciente. A atenuação de um sintoma da doença pode ser avaliada por qualquer medição clínica normalmente usada por médicos ou outros profissionais de saúde especializados para ava- liar a gravidade ou o status de progressão desse sintoma. Embora uma modalidade (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) da presente invenção possa não ser eficaz para aliviar o(s) sintoma(s) de doença alvo de interesse em cada paciente, deve aliviar o(s) sintoma(s) de doença alvo de interesse em um número estatisti- camente significativo de pacientes, conforme determinado por qual- quer teste estatístico conhecido na técnica, tal como o teste t de Stu- dent, teste qui-quadrado, teste U de acordo com Mann e Whitney, tes- te Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon.
[0085] O termo "consistindo essencialmente em" ou variações do mesmo usado ao longo da especificação e reivindicações significa en- volver todos os elementos ou grupos de elementos, e opcionalmente outros elementos apresentando propriedade semelhante ou proprieda-
de diferente daquela dos referidos elementos. Os referidos outros ele- mentos não alteram significativamente a propriedade substancial ou nova do referido regime de dosagem, método ou composição. Como um exemplo não limitante, um composto de ligação que consiste es- sencialmente na sequência de aminoácido descrita também pode in- cluir um ou mais aminoácidos, que não afetam significativamente as propriedades do composto de ligação.
[0086] O termo "de ocorrência natural", como aplicado a um objeto na presente invenção, refere-se ao fato de que o objeto pode ser en- contrado na natureza. Por exemplo, sequências polipeptídicas ou se- quências polinucleotídicas existentes em organismos (incluindo vírus) e que não foram artificialmente modificadas no laboratório são de ocor- rência natural, em que o referido organismo pode ser isolado de fontes naturais.
[0087] "Quantidade eficaz" abrange uma quantidade suficiente pa- ra melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal de uma condição médica. Quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um pa- ciente em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores, tais como a condição sendo tratada, a saúde geral do paci- ente, a via e a dose de administração e a gravidade dos efeitos colate- rais. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.
[0088] "Exógeno" refere-se a substâncias que são produzidas fora de um organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto. "Endógeno" refere-se a substâncias que são produzidas dentro de uma célula, organismo ou corpo humano, dependendo do contexto.
[0089] "Homologia" refere-se à similaridade de sequência entre duas sequências polinucleotídicas ou entre dois polipeptídeos. Quando uma posição dentro de duas sequências a serem comparadas é ocu-
pada pela mesma base ou subunidade de monômero de aminoácido, por exemplo, se uma posição dentro de cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, em seguida, as moléculas são homó- logas nessa posição. A porcentagem de homologia entre duas se- quências é uma função, em que o número de posições corresponden- tes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências é dividido pelo número de posições a serem comparadas e, depois, multiplicado por 100. Por exemplo, se 6 em 10 posições em duas sequências forem correspondentes ou homólogas quando as sequências são idealmente alinhadas, então, as duas sequências são consideradas 60% homólo- gas. Geralmente, a comparação é realizada quando duas sequências são alinhadas para fornecer o percentual máximo de homologia.
[0090] Como aqui utilizadas, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são usadas de forma intercambiável e todas essas designações incluem sua progênie. Assim, as expressões "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula de indiví- duo primária e culturas derivadas da mesma sem considerar o número de passagens. Também deve ser entendido que todas as progênies podem não ser precisamente idênticas no conteúdo de DNA, devido a mutações intencionais ou não intencionais. As progênies mutantes as- sim analisadas, que exibem a mesma função ou atividade biológica que a célula originalmente transformada, são também levadas em consideração. Quando designações distintas forem intencionais, será óbvio a partir do contexto.
[0091] "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância a seguir pode, mas não necessariamente acontece, e a descrição inclui a instância em que o evento ou circunstância deve ou não acontecer. Por exemplo, "opcionalmente compreende 1-3 regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo" significa que a região variá- vel de cadeia pesada de anticorpo tendo sequência específica pode estar, mas não necessariamente está presente.
[0092] "Composição farmacêutica" refere-se a uma mistura que compreende um ou mais compostos, de acordo com a presente inven- ção, ou um sal fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável ou pró- droga do mesmo, juntamente com outros componentes químicos, bem como componentes adicionais, tais como veículos e excipientes fisio- logicamente/farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêuti- ca visa promover a administração a um organismo, facilitando a absor- ção do ingrediente ativo e, assim, exercendo um efeito biológico.
[0093] A seguir, a presente invenção é ainda descrita com referên- cia a exemplos; no entanto, o escopo da presente invenção não é limi- tado aos mesmos. Nos exemplos da presente invenção, onde condi- ções específicas não são descritas, os experimentos são geralmente conduzidos sob condições convencionais, conforme descrito em Anti- bodies A Laboratory Manual, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, ou nas condições propostas pelos fabricantes de materiais ou produtos. Quando a fonte dos reagentes não é especifi- camente fornecida, os reagentes são reagentes convencionais comer- cialmente disponíveis. Exemplo 1: Preparação de antígenos e construção de linhagens celulares estáveis
[0094] A sequência codificando B7-H4 humano com etiqueta His- Flag (huB7-H4-HF) e a sequência codificando B7-H4 humano com eti- queta huFc (h-B7-H4-Fc) foram sintetizadas pela Tecnologia de DNA Integrado a CRO (IDT) (a sequência modelo para cada uma das prote- íÍnas recombinantes B7-H4 acima foi projetada pelos inventores) e fo- ram clonadas no vetor pTT5 (Biovector), respectivamente. As proteí- nas recombinantes de B7-H4 foram expressas em células 293T e puri- ficadas de acordo com o Exemplo 2.
[0095] As proteínas purificadas foram usadas nos exemplos a se-
guir. Sequência huB7-H4-Fc:
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 99 Sequência huB7-H4-his:
IKRRSHLQLLNSKADYKDDDDKGSHHHHHHHH SEQ ID NO: 100 Etapas de purificação para huB7-Há4-his:
[0096] As amostras de sobrenadante expressas pelas células fo- ram centrifugadas em alta velocidade para remover impurezas, subme- tidas a troca de tampão com PBS, e adicionadas com imidazol a uma concentração final de 5 mM. A coluna de níquel foi equilibrada com solução de PBS compreendendo 5 mM de imidazol e enxaguada com 2-5 volumes de coluna. Após a troca de tampão, as amostras de so- brenadante foram aplicadas à coluna. A coluna foi lavada com PBS compreendendo 5 mM de imidazol até a leitura de A280 retornar à li-
nha de base. A coluna foi, então, lavada com PBS + 10 mM de imi- dazol, as proteínas de impureza não especificamente ligadas foram removidas, e o efluente foi coletado. A proteína alvo foi eluída com PBS compreendendo 300 mM de imidazol, e o pico de eluição foi cole- tado. O eluato coletado foi ainda purificado por troca iônica (coluna SP). Solução Estoque A: 0,01 M de PB, pH 8,0. Solução Estoque B: Solução A + 1 M de NaCl. Para a eluição de proteína alvo, a solução de PBS-imidazo! foi substituída pela Solução A, e a coluna de SP foi equilibrada com a solução A. E, em seguida, as amostras foram apli- cadas na coluna. A coluna foi, então, lavada com a Solução B em um gradiente de concentração de O a 100%, com 10 volumes de coluna, e o pico de eluição foi coletado. A proteína resultante foi identificada co- mo proteína desejada por eletroforese, e aliquotada para uso. B7-H4 humano com etiqueta HisFlag (hu-B7-H4 his) foi obtido. Etapas de purificação para huB7-H4-Fc:
[0097] As amostras de sobrenadante expressas por células HEK293 foram centrifugadas em alta velocidade para remover impure- zas e submetidas à troca de tampão com PBS. A coluna de afinidade com Proteína A foi equilibrada com 10 mM de tampão de fosfato e en- xaguada com 2-5 volumes de coluna. Após a troca de tampão, as amostras de sobrenadante foram aplicadas na coluna. A coluna foi en- xaguada com tampão em 25 volumes de coluna até a leitura de A280 retornar à linha de base. A proteína alvo foi eluída com tampão acetato a 0,8%, pH 3,5, e o pico de eluição foi coletado. As alíquotas foram imediatamente adicionadas com tampão Tris-Cl 1M, pH 8,0 para neu- tralização. E, então, a solução foi trocada com PBS por meio de coluna de filtro Amico-15 da Millipore. A proteína resultante foi identificada por eletroforese, mapeamento de peptídeo e LC-MS, e aliquotada para uso. Construção de agrupamento de células CHO-S estável:
[0098] A sequência de comprimento total que codifica a proteína de B7-H4 humano ou cinomolgo (huB7-H4 ou cyB7-H4) foi sintetizada por Tecnologia de DNA Integrada (IDT) (as proteínas recombinantes de B7-H3 acima foram projetadas pelos presentes inventores) e foi clonada em vetor pcDNA3.1 modificado, pcDNA3.1/puro (Invitrogen *4V79020), respectivamente. Células CHO-S (ATCC) foram cultivadas em meio de cultura CD-CHO (Life Technologies, f%10743029) para atingir 0,5 x 106/ml. 10 ug do vetor que codifica o gene huB7H3 ou cyB7H3 foram misturados com 50 ul de LF-LTX (Life Technologies, HA12621) em 1 ml de meio Opti-MEM (Life Technologies, É 31985088), incubados à temperatura ambiente por 20 minutos, adicio- nados com meio de cultura para células CHO, e colocados em uma incubadora com CO» para cultivo. Após 24 horas, o meio foi trocado com meio fresco e 10 ug/ml de puromicina foram adicionados. Depois disso, o meio de cultura foi trocado a cada 2-3 dias, e agrupamento de células CHO-S estável foi obtido após 10-12 dias por análise. Exemplo 2: Obtenção de hibridomas murinos e sequências de anticor- po
[0099] Os animais foram imunizados com antígeno humano huB7- H4-Fc. Cinco camundongos Balb/c e cinco A/J (fêmeas, 10 semanas de idade) foram usados. O imunogênio e o imunoadjuvante (Adjuvante de Freund Completo Sigma (CFA) ou Adjuvante de Freund Incompleto Sigma (IFA)) foram cuidadosamente misturados em uma proporção de 1:1 e emulsificados para preparar um líquido "água em óleo" estável; A dose para injeção foi de 25 ug/200 yL/camundongo.
(sangue coletado após três tempos de imunização)
(sangue coletado após quatro tempos de imuniza- ção)
[00100] A titulação sérica e a capacidade de ligação a antígenos de superfície celular foram avaliadas com soros dos camundongos imuni- zados por método ELISA indireto e ELISA de captura, conforme des- crito no Exemplo 3. A fusão celular foi iniciada dependendo dos resul- tados do ensaio de titulação (diluição superior a 100.000 vezes). Os camundongos com forte titulação sérica, afinidade e ligação FACS fo- ram submetidos a uma imunização final e, em seguida, foram sacrifi- cados. Células do baço e células de mieloma SP2/0 foram fundidas e plaqueadas na placa para obter hibridomas, que foram analisadas por ELISA indireto e ELISA de captura para obter hibridomas alvo. Cepas de células monoclonais foram estabelecidas limitando a diluição. As cepas de anticorpo positivas resultantes foram ainda transfectadas pa- ra células CHO-S que estavelmente expressam B7-H4. Células CHO-S em branco foram usadas como controle para excluir cepas de hibrido- ma de anticorpos de ligação não específicos. Oito cepas de hibridoma que não se ligam apenas a proteínas recombinantes, mas também se ligam a antígenos expressos por células foram obtidas por triagem de fluxo. As células de hibridoma em fase de crescimento logarítmico fo- ram coletadas, os RNAs foram extraídos com Trizol (Invitrogen, 15596- 018) e transcritos reversamente (Transcriptase Reversa PrimeScript", Takara tH2680A). Os cDNAs obtidos por transcrição reversa foram am- plificados por amplificação por PCR, utilizando o conjunto de Ilg- Iniciador de camundongo (Novagen, TB326 Rev. B 0503), e sequenci- ados e, finalmente, sequências de 8 anticorpos murinos foram obtidas.
[00101] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb murino 2F7 são as seguintes: 2F7 HOCVR
MYYCTRESYSQGNYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO: 1 2F7 LOCVR
TFGAGTKLELK SEQ ID NO: 2
[00102] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00103] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de M1 são como seguem: M1 HCVR
YYCARSGFYDGYYAWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO: 9 M1 LCVR
QSTHVPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO: 10
[00104] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00105] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb 2F8 de murino são como seguem: 2F8 HCVR
YYCARDSRFSYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO: 17 2F8 LCVR
PLTFGAGTKLELK SEQ ID NO: 18
[00106] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00107] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb 2F4 de murino são como seguem: 2F4 HCVR
SEQ ID NO: 25 2F4 LCVR
RTFGGGTTLEIK SEQ ID NO: 26
[00108] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00109] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb 2A10 de murino são como seguem: 2A10 HCVR
YYCTRGRSVWGTGTTVTVSS SEQ ID NO: 33 2A10 LCVR DILMTOSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDISSNIGWLQAQKPGKSFKGL]
WTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 34
[00110] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00111] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb 2E4 de murino são como seguem: 2E4 HCVR
VYYCARDSRFADWGQGTLVTVSA SEQ ID NO: 41 2E4 LCVR
TPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO: 42
[00112] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00113] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb 1E4 de murino são como seguem: 1E4 HCVR
KYFCASQGSNHYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO: 49
164 LCVR
YTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 50
[00114] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00115] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb 2G6 de murino são como seguem: 2G6 HCVR
YYCVSQGSNYYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO: 57 2G6 LCVR
YTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 58
[00116] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00117] As sequências de região variável de cadeia leve e pesada de mAb 1C9 de murino são como seguem: 1C9 HOCVR
VYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO: 65 1C9 LCVR
PLTFGAGTQLELK SEQ ID NO: 66
[00118] Esta contém as seguintes sequências de CDR:
[00119] As regiões variáveis de cadeia leve e pesada de cada mAb de camundongo foram clonadas na região constante de cadeia pesada de IgG1 humana e na região constante de cadeia leve kapa, respecti- vamente, e depois foram purificadas, identificadas e testadas quanto à atividade, conforme descrito no Exemplo 4. Exemplo 3: Detecção de atividade de ligação in vitro dos anticor- pos (1) Ensaio de ligação ELISA indireto in vitro:
[00120] A proteína HuB7-H4 His (Sino Biological Inc., cat t10738- HO8H) foi diluída para uma concentração de 1 ug/ml com PBS, pH 7,4, adicionada a uma placa de microtitulação de 96 cavidades de alta afi- nidade, a um volume de 100 ul/capacidade, e incubada a 4ºC durante a noite (16-20 horas). A placa foi lavada com PBST (PBS compreen- dendo 0,05% de Tween-20, pH 7,4) quatro vezes, e depois adicionada com 150 ul/cavidade de solução de bloqueio de albumina de soro bo- vino (BSA) a 3% diluída em PBST, e incubada à temperatura ambiente por 1 hora para bloqueio. Depois de terminado o bloqueio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com tampão de PBST.
[00121] Os anticorpos a serem testados foram diluídos com PBST compreendendo BSA a 3%, obtendo-se um gradiente de 10 vezes de diluição, a partir de 1 UM com um total de 10 doses. As diluições foram adicionadas à placa a 100 ul/cavidade e incubadas à temperatura am- biente por 1 hora. Após o término da incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, adicionada com 100 ul/cavidade de anticorpo se- cundário anti-humano de cabra marcado com HRP (Abeam, catttab97225) diluído em PBST compreendendo BSA a 3% e incubado à temperatura ambiente por 1 hora. A placa foi lavada 4 vezes com PBST, adicionada com 100 ul/cavidade de substrato cromogênico TMB (Cell Signaling Technology, cattt7004S8), incubada em temperatu- ra ambiente no escuro por 1 minuto, e adicionada com 100 ul/cavidade de Solução de Paragem (Cell Signaling Technology, catt70028S) para finalizar a reação. A absorbância foi lida a 450 nm usando um leitor de microplacas (BioTek, modelo Synergy H1), e os dados foram analisa- dos. A curva de concentração vs. valor de sinal foi plotada e os resul- tados foram analisados, como mostrado na tabela a seguir:
humano (nM) [LEE e (2) Ensaio ELISA Competitivo:
[00122] A proteina HuB7-H4 His (Sino Biological Inc., cattt10738- HO8H) foi diluída para uma concentração de 1 ug/ml com PBS, pH 7,4, adicionada a uma placa de microtitulação de 96 cavidades de alta afi- nidade, a um volume de 100 ul/cavidade, e incubado a 4ºC durante a noite (16-20 horas). A placa foi lavada 4 vezes com PBST (PBS com- preendendo 0,05% de Tween-20, pH 7,4), adicionada com 150 ul/cavidade de solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 3% diluída em PBST e incubada à temperatura ambiente por 1 hora. Após o término do bloqueio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com tampão PBST.
[00123] 0,1 nM de anticorpo quimérico de referência foi preparado com PBST compreendendo BSA a 3%, e foi usado como solução de diluição para diluir os anticorpos murinos a serem testados, obter um gradiente de 10 vezes de diluição, a partir de 100 nM com um total de doses. Os anticorpos diluídos foram adicionados à placa a 100 ul/cavidade e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Após o término da incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, e 100 ul/cavidade de anticorpo secundário anti-humano de cabra marcado com HRP (Abcam, catitab97225) diluído em PBST compreendendo BSA a 3% foram adicionados e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada 4 vezes com PBST e, em seguida, 100 ul/cavidade de substrato cromogênico TMB (Cell Signaling Techno- logy, cattt70048S) foram adicionados, e incubados à temperatura ambi- ente por 1 minuto no escuro. 100 ul/cavidade de Solução de Paragem (Cell Signaling Technology, cattt7002S) foram adicionados para finali- zar a reação, e a absorbância foi lida a 450 nm usando um leitor de microplacas (BioTek, modelo Synergy H1). Os dados foram analisa- dos. Taxa de inibição competitiva = ((absorbância de anticorpo de refe- rência - absorbância de anticorpo competitiva)/absorbância de anticor- pos Abv) * 100.
(3) Ensaio de ligação ELISA de captura in vitro:
[00124] O anticorpo secundário de IgG de cabra anticamundongo (Jackson Immuno Research, catit115-006-071) foi diluído para uma concentração de 2 ug/ml com tampão PBS, pH 7,4, adicionado a uma placa de microtitulação de 96 cavidades a um volume de 100 ul/cavidade, e incubado em uma incubadora a 37ºC por 2 horas. À placa foi lavada uma vez com PBST, adicionada com solução de blo- queio de leite desnatado a 5% (Bright Dairy, Skim Milk Powder) diluída em PBST a 200 ul/cavidade, e incubada a 37ºC por 2 horas ou a 4ºC durante a noite (16-18 horas) para bloqueio. Após o término do blo- queio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 ve- zes com PBST.
[00125] Os soros de camundongo ou anticorpos recombinantes pu- rificados a serem testados foram diluídos para várias concentrações com diluição de amostra compreendendo 5% de NHS (PBST com 2,5% de leite desnatado), incubados por 40 minutos à temperatura ambiente, adicionados a uma placa a 100 ul/cavidade, e incubados em uma incubadora por 40 minutos a 37ºC. Após o término da incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, adicionada com 100 ul/cavidade de solução de proteína huB7-H4-his biotinilada (Sino Biological f10738-H08H) diluída em solução de diluição de amostra e incubada a
37ºC por 40 minutos. Após o término da incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, adicionada com 100 ul/cavidade de estreptavidina marcada com HRP (Jackson Immuno Research, catf£016-030-084) di- luída em PBST e incubada a 37ºC por 40 minutos. Após a placa ter sido lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de substrato cromo- gênico TMB (InnoReagents Biotechnology Co., Ltd.) foram adiciona- dos, incubados em temperatura ambiente por 10-15 minutos no escu- ro, 50 ul/cavidade de H2SO.4 a 1 um foram adicionados para parar a reação. A absorbância foi lida a 450 nm usando um leitor de micropla- cas (Beijing Perlong New Technology Co., Ltd., modelo DNM-9602) e os dados foram analisados. (4) Ensaio de ligação celular in vitro:
[00126] As células SK-BR3 cultivadas ou células estavelmente transfectadas com CHO-huB7-H4 foram coletadas e, depois, plaquea- das em uma placa de fundo em U de 96 cavidades com densidade ce- lular de 1 x 105 a 2 x 10º células por cavidade. O sobrenadante foi re- movido por centrifugação a 1200g por 5 min, 100ul de soluções de an- ticorpo diluídas em série ou soro imune de camundongo foram adicio- nados e incubados a 4ºC por 60min, e o sobrenadante foi removido por centrifugação a 1200g por 5min. As células foram lavadas duas vezes com PBS, adicionadas com anticorpo secundário marcado com fluorescência (PE-GAM ou PE-GAH) a 100 ul por cavidade, incubadas por 60 min a 4ºC e centrifugadas a 1200 g por 5 min para remover o sobrenadante. As células foram lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, foram novamente suspensas em PBS. Os sinais foram detec- tados usando citômetro de fluxo, e a curva de concentração foi plotada e os resultados foram analisados. Exemplo 4: Construção e expressão de anticorpos quiméricos re- combinantes anti-B7-H4
[00127] As mutações de aminoácido direcionadas a sítio foram fei-
tas na(s) região(ões) FR (regiões de quadro) da região variável de ca- deia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL) para cada anticorpo murino da presente invenção. Diferentes cadeias leves e pe- sados de anticorpo humanizado foram projetadas de acordo com dife- rentes combinações de mutação de aminoácido. Células transfectadas com plasmídeos de várias combinações de cadeias pesadas e leves seriam usadas para produzir anticorpos humanizados.
[00128] O vetor de cadeia pesada foi projetado da seguinte manei- ra: peptídeo sinal + sequência de região variável de cadeia pesada mutada + sequência de região constante de IgG1 humana.
[00129] O vetor de cadeia leve foi projetado da seguinte forma: pep- tídeo sinal + sequência de região variável de cadeia leve mutada + se- quência de região constante Kapa humana.
[00130] As sequências acima foram inseridas no vetor pCEP4, res- pectivamente. Os vetores de expressão foram sintetizados de acordo com o desenho acima, os plasmídeos de vetor resultantes foram extra- ídos com o kit de extração máxima, e foram validados por sequencia- ção. Os plasmídeos validados foram transfectados em células 293F humanas com PEI e cultivados continuamente. As células 293F foram cultivadas em meio isento de soro (Shanghai opmbiosciences, OPM- 293CDO03) até a fase de crescimento logarítmico para transfecção ce- lular. 21,4 ug do plasmídeo de cadeia leve de anticorpo humanizado e 23,6 ug do plasmídeo de cadeia pesada de anticorpo humanizado fo- ram dissolvidos em 10 ml de meio de soro reduzido Opti-MEMO | (GIBCO, 31985-070), bem misturados e depois adicionados com 200 ug de PEI, bem misturados, incubados por 15 min à temperatura am- biente, e adicionados em 50 mL de células. As condições de cultura celular foram as seguintes: 5% de CO, 37ºC, 125 rom/min. Durante o período de cultura, o meio foi reabastecido nos dias 1 e 3, até a viabili- dade celular atingir menos de 70%. O sobrenadante celular foi coleta-
do e centrifugado para filtração. Após a centrifugação, a cultura celular foi aplicada a uma coluna de afinidade para purificação de anticorpo. Os anticorpos quiméricos purificados foram finalmente obtidos após a lavagem da coluna com tampão de fosfato, eluição com tampão de cloridrato de glicina (0,1 M de GIy-HCI, pH 2,7), neutralizados com 1 M de ácido clorídrico Tris pH 9,0 e dialisados contra tampão de fosfato. Exemplo 5: Afinidade de ligação e ensaio cinético in vitro:
[00131] O método Biacore é reconhecido como um método para a detecção objetiva da afinidade e cinética entre proteínas. As afinidades e cinética de ligação dos anticorpos B7-H4 da invenção a serem testa- dos foram analisadas por Biacore T200 (GE).
[00132] O anticorpo anti-B7-H4 da presente invenção a ser testado foi covalentemente ligado a chip CM5 (GE) pelo método de acopla- mento amino padrão NHS, usando um Kit fornecido pela Biacore. Em seguida, a) 50 nM de proteína huB7-H4-his humana (Sino Biological f410738-H08H) diluída pelo mesmo tampão foi carregada a uma taxa de fluxo de 10 uL/min, e o chip foi regenerado com o reagente de re- generação fornecido no Kkit. A cinética de ligação antígeno-anticorpo foi registrada por 3 minutos e a cinética de dissociação foi registrada por minutos. Os dados resultantes foram analisados pelo Software Bl- Aevaluation da GE usando o modelo de ligação 1:1 (Langmuir). Os dados de kd (koff) de cada anticorpo murino estimados por esse méto- do foram mostrados na tabela a seguir. huB7-H4-his 3,98E-05
Emo ares b) Uma série de concentrações de proteína huB7-H4-his humana diluída pelo mesmo tampão foi carregada respectivamente na taxa de fluxo de 10 uL/min e o chip foi regenerado com o reagente de regeneração fornecido no kit. A cinética de ligação antígeno-anticorpo foi registrada por 3 minutos e a cinética de dissociação foi registrada por 10 minutos. Os dados resultantes foram analisados pelo Software BlAevaluation da GE usando o modelo de ligação 1:1 (Langmuir). Os valores de ka (kon), kd (koff) e Ko para cada anticorpo quimérico esti- mados por esse método foram mostrados na tabela a seguir.
Anticorpo | antígeno enciação e eiação Afinidade quimérico Ka(1/M's) ka (1/s) Ko Exemplo 6: Humanização de anticorpos de camundongo
[00133] A humanização de anticorpos monoclonais B7-H4 anti- humanos murinos foi realizada como divulgado em muitas literaturas na técnica. Resumidamente, o domínio constante de origem (anticorpo murino) foi substituído por domínio constante humano, e as sequên- cias de anticorpo humano foram selecionadas com base na homologia entre o anticorpo murino e o anticorpo humano. Na presente invenção, as moléculas candidatas de murino 2F7, 2F8, 2G6 e 1C9 foram sub- metidas à humanização.
[00134] Com base na estrutura típica do anticorpo murino VH/VL CDR resultante, as sequências variáveis de cadeia leve e pesada fo-
ram comparadas com o banco de dados da linha germinativa de anti- corpo humano para obter o modelo de linha germinativa humano com alta homologia.
[00135] As regiões CDR dos anticorpos murinos 2F7, 2F8, 2G6 e 1C9 foram enxertadas no modelo humanizado correspondente seleci- onado. Para 2F8, a região HCDR1 (GYTFTNSWMN, SEQ ID NO: 19) e a região HCDR2 (GIYPNSGNIEYNEKFKG, SEQ ID NO: 20) foram substituídas por GYTFTSSWMN (SEQ |D NO: 73) e GIYPNRGNIEY- NEKFKG (SEQ ID NO: 74), respectivamente, para remover potenciais sítios de desacetilação instáveis. As regiões variáveis humanizadas foram substituídas e recombinadas com a região constante de IgG (preferencialmente IgG1 para a cadeia pesada e K« para a cadeia leve). Em seguida, com base na estrutura tridimensional do anticorpo muri- no, foram realizadas mutações reversas nos resíduos incorporados, resíduos que interagiram diretamente com as CDRs e resíduos que têm um impacto importante na conformação de VL e VH. Os resíduos de aminoácido quimicamente instáveis nas regiões CDR foram otimi- zados. Os anticorpos resultantes da combinação de sequências de região variável de cadeia leve e pesada humanizadas foram obtidos e detectados.
[00136] As moléculas de anticorpo hu2F7, hu2F8, hu2G6 e hu1C9 humanizado foram finalmente selecionadas por teste de expressão e comparação do número de mutações reversas, e as respectivas se- quências de região variável de cadeia leve e pesada foram mostradas na SEQ ID NOs: 75-82, e as respectivas sequências de cadeia leve e pesada foram mostradas na SEQ ID NOs: 83-90. hu2F7 HCVR
SEQ ID NO: 75
AVYYCARESYSQGNYFDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 91 hu2F7 LCVR
TFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 76
TFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 92
TFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 93
TFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 94 hu2F8 HCVR
VYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 77
VYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 95
VYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 96 hu2F8 LCVR
LTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 78
LTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 97
LTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 98 hu2G6 HCVR
VYYCVSQGSNYYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 79 hu2G6 LCVR DIRMTOSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKAL]|
YTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 80 hu1C9 HCVR
VYYCARDSRFSYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 81 hu1C9 LCVR
LTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 82 hu2F7 HC
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 83 hu2F7 LC
VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 84 hu2F8 HC
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 85 hu2F8 LC
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 86 hu2G6 HC
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 87 hu2G6 LC DIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKAL!
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 88 hu1C9 HC
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 89 hu1C9 LC
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 90
[00137] Os fragmentos de cDNA foram sintetizados com base nas sequências de aminoácido das cadeias leve e pesada de anticorpo humanizado acima, e inseridos nos vetores de expressão de pcD- NA3.1 (Life Technologies Cat. Nº. V790-20). Os vetores de expressão e o reagente de transfecção PEI (Polysciences, Inc. Cat. Nº. 23966) foram transfectados para células HEK293 (Life Technologies Cat. Nº 11625019) em uma proporção de 1:2 e incubados em uma incubadora de CO» por 4 a 5 dias. Os anticorpos expressos foram recuperados por centrifugação, e a purificação de anticorpo foi realizada de acordo com o método do Exemplo 4 para obter as proteínas anticorpo humanizado hu2F7 e hu2F8 da presente invenção. Exemplo 7: Determinação de atividade de anticorpos humaniza- dos
[00138] Os seguintes ensaios in vitro foram realizados em anticor- pos humanizados hu2F7 e hu2F8:
1. Ensaio de ligação celular in vitro:
[00139] As células MX-1 cultivadas foram coletadas, a densidade celular foi ajustada com PBS pH 7,4 e depois plaqueadas em uma pla- ca de fundo em forma de V de 96 cavidades com 1 x 10º células por cavidade, e centrifugadas a 2000 rpm por 5 minutos para remover o sobrenadante. 100 ul da solução anticorpo quimérico diluída em série foram adicionados (diluída com BSA a 0,5% em PBS para obter um gradiente com diluições de 3 vezes, a partir de 1 UM, com um total de doses) em cada cavidade, misturados e incubados por 1 hora a 4ºC com agitação; a cultura foi centrifugada a 2000 rpm por 5 minutos para remover o sobrenadante, e as células foram lavadas duas vezes com PBS, e cada cavidade foi adicionada com 100 ul de anticorpo secun- dário anti-humano de cabra marcado com FITC (Abeam, catttab97224) diluído com BSA a 0,5% em PBS, bem misturados e incubados por 30 minutos a 4ºC em um agitador. A centrifugação foi realizada a 2000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi removido. As células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em PBS. Os sinais fo- ram detectados usando citômetro de fluxo (BECKMANCOULTER, mo- delo DXFLEX), a curva de concentração foi plotada e os resultados fo-
ram analisados. Conforme indicado na tabela e figura, os anticorpos humanizados 2F7, 2F8, 2G6 e 1C9 mostram ligações positivas a célu- las MX-1 em que B7-H4 foi altamente expresso.
2. Ensaio cinético de afinidade (os procedimentos do méto- do foram os mesmos que os descritos no Exemplo 5). Os resultados foram mostrados na tabela abaixo. Todos os humanizados hu2F7, hu2F8, hu2G6 e hu1C9 mostram forte afinidade pela proteína de antí- geno B7-H4 humana. mo [E EEE ka(1/M'"s) ka (1/s) Ko 1) 247005 | 112004 | 250010 | Exemplo 8: Determinação de epítopos de ligação reconhecidos pelos anticorpos humanizados
[00140] Os procedimentos do método foram os mesmos que os descritos no Exemplo 3 (1): Ensaio de ligação ELISA indireto in vitro. O B7-H4 da SEQ ID NO: 100 foi degradado em fragmentos de antígeno de 20 aminoácidos de comprimento, e o fragmento de antígeno P12 (sequência de aminoácido: TVASAGNIGEDGILSCTFEP) foi especifi-
camente ligado pelo anticorpo anti-B7-H4 humanizado hu2F7, no en- saio de ligação ELISA indireto in vitro. Os resultados foram mostrados na Figura 2. Para adicionalmente confirmar o epítopo ao qual o anti- corpo se liga, varredura de alanina foi realizada no fragmento de antí- geno P12, ou seja, cada aminoácido simples localizado em P12 foi mutado para alanina, respectivamente. Foi verificado no ensaio de |li- gação ELISA indireto in vitro que as mutações na porção de sequência de aminoácido ILSCTFE atenuaram significativamente a ligação do anticorpo ao fragmento de antígeno, mostrando que o epítopo de liga- ção a anticorpo estava localizado na porção de sequência de aminoá- cido de ILSCTFE (SEQ ID NO: 109) incluída na sequência de aminoá- cido TVASAGNIGEDGILSCTFEP. Os resultados foram mostrados na tabela a seguir: (nM)
[00141] Verificou-se no ensaio de ligação ELISA indireto in vitro que o fragmento de antígeno P12 (sequência de aminoácido: TVASAGNI- GEDGILSCTFEP) foi especificamente ligado pelo anticorpo anti-B7-H4 humanizado, hu1C9. Os resultados foram mostrados na tabela abaixo. Para adicionalmente confirmar o epítopo ao qual o anticorpo se liga, varredura de alanina foi realizada no fragmento de antígeno P12, ou seja, cada aminoácido localizado em P12 foi mutado para alanina, respectivamente. Verificou-se no ensaio de ligação ELISA indireto in vitro que as mutações na porção de sequência de aminoácido LSCTF atenuaram significativamente a ligação do anticorpo ao fragmento de antígeno, mostrando que o epítopo de ligação a anticorpo estava loca- lizado na porção de sequência de aminoácido de LSCTF (SEQ ID NO: 110) incluída na sequência de aminoácido TVASAGNIGEDGILSCT- FEP. Os resultados foram mostrados na tabela a seguir: (nM)
[00142] Verificou-se no ensaio de ligação ELISA indireto in vitro que o fragmento de antígeno P12 (sequência de aminoácido: TVASAGNI- GEDGILSCTFEP) estava especificamente ligado pelo anticorpo anti- B7-H4 humanizado, hu2G6. Os resultados foram mostrados na tabela abaixo. Para adicionalmente confirmar o epítopo ao qual o anticorpo se liga, varredura de alanina foi realizada no fragmento de antígeno P12, ou seja, cada aminoácido único localizado em P12 foi mutado para alanina, respectivamente. Foi verificado no ensaio de ligação ELISA indireto in vitro que mutações na porção de sequência de ami- noácido ILSCTFEP atenuaram significativamente a ligação do anticor- po ao fragmento de antígeno, mostrando que o epítopo de ligação a anticorpo estava localizado na porção de sequência de aminoácido de ILSCTFEP (SEQ ID NO: 111) incluída na sequência de aminoácido TVASAGNIGEDGILSCTFEP. Os resultados foram mostrados na tabe- la a seguir: (nM)
Sequência de fragmento de antígeno [SEQIDNO:| Afinidade EC5o (nM) TVASAGNIGEDGILSATFEP 3480 TVASAGNIGEDGILSCAFEP 2289 TVASAGNIGEDGILSCTAEP 2600 TVASAGNIGEDGILSCTFEA 2372 Exemplo 9: Efeito antitumoral de anticorpos humanizados
[00143] As células tumorais MC38 foram implantadas em camun- dongos no gene B7-H4 humano, que foi introduzido pela tecnologia de edição de genes. Quando o tumor atingiu uma média de 100 mm?, os camundongos foram injetados com anticorpo B7-H4 controle ou hu- manizado hu1C9 (10mg/kg ou 30mg/kg) a cada 3 dias. Observando o tamanho do tumor, verificou-se que hu1C9 tem um efeito significativo na inibição do crescimento de tumor e tem um efeito antitumoral. Os resultados específicos foram mostrados na Figura 3 e na tabela a se- guir: [LL voiumedotumerímédizmem | = | piao | Diaz | Dia6 | Diao | Dia12 | Dia1s | Dia1s | Grupo con- [136,2979|290,2921 526,7519/820,9497 1689,954|/3625,686|/5913,385 trole em branco 1C9 146,5273/231,8861 /404,833 [794,0959/1519,589|1717,092/2326,687 (10mg/kg) 1C9 139,3148/256,9988 437,9834 702,0555/1190,775/2008,451 /2744,415 (30mg/kg) Exemplo 10: Efeito de anticorpos humanizados no aumento da imunidade
[00144] O efeito antitumoral de anti-B7-H4 pode ser mediado au- mentando os efeitos imunes contra tumores. Para validar esse meca- nismo, as células T CD4 positivas foram extraídas do sangue periférico humano. Várias concentrações de anticorpos anti-B7-H4, incluindo o anticorpo humanizado hu2G6 e hu1C9, foram adicionadas às células T cultivadas. Os resultados específicos foram mostrados na Figura 4 e na tabela abaixo.
O anticorpo humanizado hu2G6 e o anticorpo huma- nizado hu1C9 têm um efeito sobre o aumento da proliferação de célu- las T, e podem obter um efeito antitumoral melhorando os efeitos imu- nes contra tumores. [ ] FProieração de céluias T (porcentagem média) |
Claims (34)
1. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: região variável de cadeia leve de anticorpo compreendendo pelo menos uma LCDR selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56; SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 SEQID NO: 72; e região variável de cadeia pesada de anticorpo compreen- dendo pelo menos uma HCDR selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29; SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61; SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:74.
2. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia pesada de anticorpo com- preende:
HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 53, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61, respectivamente; HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69, respectivamente; ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:21, respectivamente.
3. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende: LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente;
LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, respectivamente; LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56, respectivamente; LCDR1, LCDR2, e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, e SEQ ID NO: 64, respectivamente; ou LCDR1, LCDR2, e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, e SEQ ID NO: 72, respectivamente.
4, Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5, respectivamente.
5. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente.
6. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO:21, respectivamente.
7. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29, respectivamente.
8. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37, respectivamente.
9. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo compre- ende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45, respectivamente.
10. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo com- preende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR?2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 53, respectivamente.
11. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo com- preende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:61, respectivamente.
12. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo com- preende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:69, respectivamente.
13. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia leve de anticorpo com- preende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e
HCDR3 mostrado na SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:21, respectivamente.
14. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado do grupo que consiste em anticorpo murino ou fragmento do mesmo, anticorpo quimérico ou fragmento do mesmo, anticorpo humano ou fragmento do mesmo e anticorpo huma- nizado ou fragmento do mesmo.
15. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada de anticorpo humani- zado compreende ainda região(ões) constante(s) de cadeia pesada de I9G1, I9G2, I9G3 ou IgG4 humana ou uma variante da(s) mesma(s), preferencialmente compreende região(ões) constante(s) de cadeia pe- sada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana; mais preferencialmente compre- ende região(ões) constante(s) de cadeia pesada de IgG1 que foi(foram) submetida(s) à mutação de aminoácido para melhorar a to- xicidade ADCC.
16. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado é uma região variável de cadeia leve compreendendo sequência sele- cionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 82, preferencialmente SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 80.
17. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada de anticorpo humani- zado é uma região variável de cadeia pesada compreendendo se-
quência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79 ou SEQ ID NO: 81, preferencialmente SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 79.
18. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de anticorpo humanizado é uma cadeia leve compreendendo sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 90, preferencialmente SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 88.
19. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada de anticorpo humanizado é uma cadeia pesada compreendendo sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 89, preferencialmente SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 87.
20. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende: (1) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 76 e regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 75; (2) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 78 e regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 77; (3) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 80 e regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 79; ou (4) região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 82 e regi- ão variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 81.
21. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende: (1) cadeia leve de SEQ ID NO: 84 e cadeia pesada de SEQ
ID NO: 83; (2) cadeia leve de SEQ ID NO: 86 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 85; (3) cadeia leve de SEQ ID NO: 88 e cadeia pesada de SEQ ID NO: 87; ou (4) cadeia leve de SEQ ID NO: 90 e cadeia pesada de SEQ ID NO:89.
22. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, caracterizado pelo fato de ter pelo menos uma das se- guintes características: (1) ligação a um epítopo compreendendo ami- noácidos 41-60 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; e (2) ligação a um epí- topo compreendendo aminoácidos 53-59 na SEQ ID NO: 100 de B7- H4.
23. Anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, caracterizado pelo fato de ter pelo menos uma das se- guintes características: (1) ligação a um epítopo compreendendo ami- noácido 53 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (2) ligação a um epítopo compreendendo aminoácido 54 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (3) li- gação a um epítopo compreendendo aminoácido 56 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (4) ligação a um epítopo compreendendo aminoácido 57 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; (5) ligação a um epítopo compreen- dendo aminoácido 58 na SEQ ID NO: 100 de B7-H4; e (6) ligação a um epítopo compreendendo aminoácido 59 na SEQ ID NO: 100 de B7- Ha.
24. Sequência de DNA, caracterizada pelo fato de que codi- fica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.
25. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de DNA, como definida na reivindicação 24.
26. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é in-
troduzida com ou compreende o vetor de expressão, como definido na reivindicação 25.
27. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira é bactéria, preferencialmente Escherichia coli.
28. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é levedura, prefe- rencialmente Pichia pastoris.
29. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é célula de mamiífe- ro, preferencialmente célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula de rim embrionário humano (HEK) 293.
30. Método de produzir um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar a célula hospedeira, como definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 29, isolar o anticorpo da cul- tura e purificar o anticorpo.
31. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a an- tígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a23,e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitá- vel.
32. Reagente de detecção, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
23.
33. Agente de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
23.
34. Uso do anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, ou da composição farmacêutica, como definida na reivin- dicação 31, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença ou condição mediada por B7-H4; sendo que a doença é preferencialmente um cân- cer; preferencialmente, a doença é câncer expressando B7-H4; o cân- cer é mais preferencialmente selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer cervical, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.
<< -— M (o) A 2010 — wW 10 ++ 274 S a 2F7 o 8 + 2F8 SS os + 2G6 = o
Ó o < oo 10% 104 10? 10º 10? 10º Concentração de anticorpo quimérico (nM) Fig |
2.5
2.0 Pá o o o 1.5 [= o o 1.0 3 o 0.5 <
0.0 o 1 2 3 4 5 Concentração de fragmento de antígeno P12 (nM) Fig 2 E 10000 E —* Controle E som + 1C910me/ke 2 —. + 1C930mg/kg 2 2 a4omo
E 3 200 o > o o Ss 10 15 20 Dias após a administração Fig 3
Pr o $ 10 Ss Em ico = Em 266 & 50. DD Grupo de controle Ss 2 Ss 2 o is SP " o? ” : ..2 ” = —— " — — [=> 19 266 Grupo de controle ug/ml Fig 4
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