MX2012006443A - Anticuerpos monoclonales que se enlazan a b7h6 y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se describen los anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente al miembro B7H6 de la familia B7, incluyendo los anticuerpos capaces de inhibir la interacción de B7H6 con NKp30. También se describen los conjugados anticuerpo anti-B7HE-fármaco que comprenden un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 conjugado a un agente terapéutico. Los anticuerpos anti-B7H6 y los conjugados anticuerpo-fármacos son útiles en los métodos para ejercer efectos terapéuticos contra las células que expresan B7H6, así como métodos de diagnóstico para la detección de B7H6 o las células que expresan B7H6.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE SE ENLAZAN A B7H6 Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La invención se refiere a los anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales que se enlazan a un ligando de células tumorales, designado B7H6. La invención también se refiere a los usos de los anticuerpos.

Antecedentes de la Invención Familia B7 Las señales co-estimuladoras positivas y negativas juegan papeles críticos en la modulación de la actividad de los linfocitos y las moléculas que son mediadoras de estas señales han probado que son blancos efectivos para agentes inmunomoduladores . Por ejemplo, después de la interacción con B7-1 o B7-2 sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC) , CD28, la molécula co-estimuladora de células T prototípica, emite señales que promueven la proliferación de células T y la diferenciación en respuesta al acoplamiento del receptor de las células T (TcR) mientras que el antígeno 4 de linfocito T citotóxico, homólogo de CD28 (CTLA-4) es mediador de la inhibición de la proliferación de células T y las funciones efectoras. (Ver Chambers et al, Ann. Rev. Immunol, 19:565-594, 2001; Egen et al, Nature Immunol, 3:611-618, 2002.) REF.231208 Varias moléculas con homología a la familia B7 han sido descubiertas (Abbas et ah, Nat. ed. , 5: 1345-6, 1999; Coyle et al, Nat. Immunol, 2: 203-9, 2001; Carreno et al, Annu. Rev. Immunol, 20: 29-53, 2002; Liang et al, Curr. Opin. Immunol, 14: 384-90, 2002), y su papel en la actividad de los linfocitos está recién empezando a ser elucidado. Estos nuevos contrarreceptores coestimuladores incluyen B7h2, PD-Ll, PD-L2, B7-H3 y B7-H4.

La expresión de los miembros conocidos de la familia B7 está restringida en gran medida a las células presentadoras de antxgeno. Los estudios han revelado que los miembros de la familia B7 son contrarreceptores sobre las células linfoides que interactúan con los receptores cognados sobre los linfocitos, para proporcionar señales co-estimuladoras positivas o negativas que juegan papeles críticos de la regulación de las respuestas inmunitarias mediadas por células.

Células NK y NKp30 Las células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés) son un subgrupo de linfocitos activos en el sistema inmunitario y representan un promedio de aproximadamente 15% de las células mononucleares en sangre periférica humana. Las células NK fueron inicialmente descritas funcionalmente en 1971 por la observación de que los ratones letalmente irradiados eran capaces de rechazar los aloinjertos de células de la médula ósea de. cepas alogénicas o progenitoras (BMC, por sus siglas en inglés) . (Ver Cudowicz y Bennett, J. Exp. Med. 134:83-102, 1971; Cudowicz y Bennett, J. Exp. Med. 135:1513-1528, 1971). Cudowicz y Bennett observaron que los ratones heterocigotos H-2 híbridos Fl, irradiados (A x B) eran capaces de rechazar las BMC homocigotas H-2 progenitoras (A o B) . Esta observación entró en conflicto con las leyes clásicas del trasplante en el cual se pensaba que los antígenos de trasplante se heredaban co-dominantemente , y la progenie era obligadamente tolerante hacia los determinantes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) progenitor. (Ver Cudowicz y Bennett, J. Exp. Med. 134:83-102, 1971). Las células responsables de este fenómeno fueron encontradas como radiorresistentes e idénticas a las células linfoides, las cuales fueron caracterizadas posteriormente en 1975 por su habilidad para mediar la muerte espontánea de los tumores in vi tro de una manera no restringida a MHC. (Ver Herberman y Ortaldo, Science, 214:24-30, 1981; Ortaldo y Herberman, Annu. Rev. Immunol . 2:359-394, 1984; Trinchieri, Adv. Immunol. 47:187-376, 1989; Murphy et al, J. Nati. Cáncer Inst. 85:1475-1482, 1993). La evidencia adicional de que las células NK solas podrían ser mediadoras de la especificidad del rechazo de injerto de médula surgió en 1987, cuando se observó que los ratones con deficiencia inmunitaria combinada severa (SCID, por sus siglas en inglés)-, que no pueden desarrollar las células T y B, tienen función normal de células NK. (Ver Murphy et al, J. Exp. Med. 165:1212-1217, 1987) .

Se entiende actualmente que las células NK representan un brazo importante de la inmunidad innata y juegan un papel primario en la supervisión inmunitaria contra tumores y las células viralmente infectadas. A no ser que sean activadas, no obstante, las células NK son no efectivas en la realización de su función normal, incluso cuando están presentes en números de otro modo suficientes. Por supuesto, la actividad disminuida de las células NK está asociada con el cáncer y enfermedades infecciosas (Ver Yamazaki et al, Oncology Reports 9:359-363, 2002; Rosenberg et al, Cáncer Research 51:5074-5079 (supl.), 1991; Britteenden et al, C ncer 77:1226-1243, 1996; Patentes de los Estados . Unidos Nos. 5,082,833 y 4,883,662). De manera contraria, como se anotó anteriormente, actividad de las células NK es mediadora del rechazo agudo de los aloinjertos de BMC. Por lo tanto, los niveles de actividad de las células NK parecen jugar un papel importante en los trastornos relacionados al sistema inmunitario .

La actividad de las células NK es típicamente regulada por la interacción entre las moléculas MHC de la clase I y los receptores inhibitorios y de activación. (Ver, por ejemplo, Barao y Murphy, BB&MT 9:727-741, 2003). La hipótesis de "ausencia de lo propio" está originalmente basada en la observación de que las células tumorales que carecen de las moléculas MHC de la clase I son susceptible a muerte por las células NK. (Ver Ljunggren y Karre, Immunol. Today 11:237-244, 1990; Ohlen et al, J. Immunol. 145:52-58, 1990) . Los investigadores observaron además que las células NK humanas lisan las líneas de células linfoblastoides B transformadas con el virus de Epstein-Barr, deficientes en la clase I. (Storkus et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86:2361-2364, 1989) . También, se encontró que la transfección de los genes de la clase I en células objetivo deficientes en la clase I, provocaba que estas células fueran parcial o completamente resistentes a la lisis mediada por las células NK. (Ver Storkus et al, supra; Shimizu y DeMars, Eur. J. Immunol, 19:447-451, 1989). La clase I de MHC, no obstante, no es siempre necesaria para la protección contra la citotoxicidad mediada por las células NK, y el reconocimiento por la clase I de MHC no siempre previene la citólisis por las células NK. (Barao y Murphy, supra) . Durante años recientes, diversos receptores inhibitorios y de activación específicos de MHC de la clase I, así como diversos receptores de activación no específicos de MHC de la clase I, han sido identificados. Estos receptores son relevantes con respecto a los procedimientos terapéuticos, tales como, por ejemplo, BMT alogénico y terapia contra el cáncer (Ver id) .

Los receptores de activación no específico de MHC de la clase I, que son capaces de mediar la citotoxicidad de células NK contra objetivos negativos o deficientes en MHC de la clase I, son representados en parte por una familia heterogénea de moléculas similares a inmunoglobulina, específicas de células NK, que son conocidas como receptores de citotoxicidad natural (NCRs) . (Ver, por ejemplo, Moretta et al., Annu. Rev. Immunol. 19:197-223, 2001; Diefenbach y Raulet, Immunol. Rev., 181:170-184, 2001). En la ausencia de la expresión de la MHC de la clase I (tal como, por ejemplo, sobre células tumorales o células infectadas con virus) , la ligadura de estos receptores de activación sobre las células NK dispara la muerte de las células objetivo. Uno de tales receptores de activación es NKp30, el cual es selectiva y constitutivamente expresado sobre las células asesinas naturales (NK) maduras y las señales a través de entre otras cosas, el acoplamiento con 0?3?. (Ver Barao y Murphy, supra) . El ligando de célula objetivo al cual se enlaza NKp30 no ha sido previamente identificado.

Este sistema de reconocimiento innato por las células NK representa una herramienta potencialmente poderosa para la aplicación clínica al trasplante alogénico de médula ósea (BMT) , terapia contra el cáncer, o tratamiento de otros trastornos asociados con las células NK. (Ver, por ejemplo, Barao y Murphy, supra) . Por ejemplo, la estimulación o inhibición de la activación de NKp30 podría ser útil para modular la actividad de las células NK y para tratar trastornos o enfermedades asociadas con la actividad de las células NK. En particular, el aumento de la actividad de las células NK por disparo de NKp30 podría ser útil para el tratamiento de trastornos o enfermedades caracterizadas por actividad insuficiente de las células NK, tales como el cáncer y enfermedades infecciosas, mientras que la inhibición de la actividad de las células NK por el bloqueo de NKp30 podría ser útil para tratar los trastornos mediados por las células NK, tales como, por ejemplo, el rechazo de aloinjerto de BMC.

El miembro más nuevo de la familia B7 , B7H6, fue recientemente descubierto y caracterizado como un receptor para NKp30, un receptor selectivamente expresado sobre las células asesinas naturales (NK) maduras, y que está involucrado en la citotoxicidad natural humana como un receptor activador (Brandt et al, J. Exp . Med. , 206(7): 1495-1503, 2009) . B7H6 no fue detectado en tejidos humanos normales pero fue expresado en células tumorales humanas.

En consecuencia, existe una necesidad en la técnica para la identificación de anticuerpos capaces de inhibir la interacción de B7H6 con NKp30. Existe un potencial terapéutico para tales anticuerpos, con base en su habilidad ¦para modular las señales co-estimuladoras y las respuestas inmunitarias . Además, los anticuerpos que se enlazan a las proteínas B7H6 serán útiles cuando sean conjugadas a un agente citotóxico y utilizadas para dirigirse a una célula que expresa B7H6. Éstos y otros usos son altamente deseables . La presente invención proporciona las composiciones y los métodos para éstos y otros usos, que deben ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente.

Breve Descripción de la Invención Un aspecto de la presente invención proporciona los anticuerpos monoclonales aislados, que específicamente se enlazan al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No.: 2). En una modalidad, el anticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) . En otra modalidad más, el anticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243) . En otra modalidad más, el anticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244) . En otra modalidad más, el anticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245).

En ciertas modalidades, el anticuerpo monoclonal B7H6 descrito anteriormente es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano. En algunas modalidades, el anticuerpo competirá por el enlace, al dominio extracelular de B7H6 humano e inhibirá la interacción de B7H6 humano con NKp30. La inhibición puede ser el bloqueo completo o parcial, y puede neutralizar o reducir la interacción. Los anticuerpos adecuados incluyen además anticuerpos de cadena simple. Otras variantes ejemplificadas incluyen los anticuerpos que comprenden una región Fe que tiene al menos una actividad de ADCC y actividad de CDC. En algunas de tales variaciones, la región Fe es una Fe de cadena simple (scFc) . Cada uno de los anticuerpos monoclonales ejemplificados que se enlazan a B7H6 humano es adecuado como una composición que comprende el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales anticuerpos son adecuados para kits de diagnóstico que detectan el enlace por el anticuerpo.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco que. comprende un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 SEQ ID No . : 2) , donde el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. En algunas modalidades, la porción de anticuerpo del conjugado anticuerpo- fármaco es un anticuerpo que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244) ; o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245). El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano. Los anticuerpos adecuados incluyen además anticuerpos de cadena simple. En ciertas variaciones, el anticuerpo comprende una región Fe que tiene al menos una actividad de ADCC y actividad de CDC. En algunas de tales variaciones, la región Fe es una Fe de cadena simple (scFc) . El agente citotóxico puede ser, por ejemplo, un agente antitubulina, agente de enlace al canal menor de ADN, un agente de alquilación del canal menor de ADN, una duocarmicina, o una puromicina. Los agentes antitubulina adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatina, un alcaloide de vincapervinca, una podofilotoxina, un taxano, un derivado de bacatina, una criptofisina, un maitansinoide, o una combretastatina. En ciertas modalidades, el anticuerpo es conjugado al fármaco vía un enlazador, y en algunos casos el enlazador es escindible bajo condiciones intracelulares. Los ligadores escindibles adecuados incluyen ligadores peptídicos, incluyendo aquellos escindibles por una proteasa intracelular . Cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco ejemplificados, son adecuados como composiciones que comprenden el conjugado anticuerpo-fármaco y el vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto relacionado, la presente invención proporciona los métodos para disminuir la actividad de las células asesinas naturales (NK) contra una célula que expresa B7H6 humano, por inhibición de la interacción de B7H6 humano con NKp30 humano. Tales métodos incluyen en general poner en contacto una célula que expresa B7H6 humano, en presencia de una célula NK humana, con una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano, con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNC 1-4242) o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245), en donde el anticuerpo inhibe la interacción de B7H6 humano con NKp30 humano .

En otro aspecto relacionado, la presente invención proporciona los métodos para tratar el rechazo de aloinjertos de células de médula ósea (BMC, por sus siglas en inglés) en un sujeto, por inhibición de la interacción de B7H6 humano con NKp30 humano. Tales métodos incluyen en general administrarle al sujeto, en una cantidad efectiva para inhibir la actividad de las células NK, y con esto para tratar el receso de aloinjerto agudo de BMC, un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245), en donde el anticuerpo inhibe la interacción de B7H6 humano con NKp30 humano.

El método para disminuir la actividad de las células NK humanas y el método para tratar el rechazo del aloinjerto de BMC incluyen ciertas modalidades donde los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Los métodos también incluyen las modalidades en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple.

En otros aspectos relacionados, la presente invención proporciona los métodos para agotar o inhibir el crecimientos de las células que expresan B7H6 dentro de una población celular utilizando un conjugado anticuerpo-fármaco . Los métodos comprenden en general poner en contacto las células que expresan B7H6 con una cantidad efectiva de un conjugado anticuerpo- fármaco que comprende (a) un anticuerpo que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano, que compite (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No.: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244) ; o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245); y (b) un agente citotóxico conjugado al anticuerpo.

Otro aspecto relacionado proporciona los métodos para tratar un cáncer que expresa B7H6 en un sujeto, utilizando un conjugado anticuerpo-fármaco . Los métodos en general comprenden administrarle al sujeto una cantidad efectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende (a) un anticuerpo que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano que compite (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) ; un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243) ; un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244); o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245); y (b) un agente citotóxico conjugado a el anticuerpo. Son incluidas las modalidades donde el cáncer es un cáncer de colon, el hígado, el cérvix, el pulmón, el páncreas o la próstata. Otros cánceres adecuados que expresan B7H6 para el tratamiento incluyen leucemia prohemocítica, linfoma de células B, linfoma monocítico, eritroleucemia, linfoma de Burkitt y leucemia mielogénica crónica.

En un método para agotar o inhibir el crecimiento de las células que expresan B7H6 dentro de una población celular y/o un método de tratamiento de un cáncer que expresa B7H6 cáncer en un sujeto, anticuerpos monoclonales humanos o humanizados son adecuados para el anticuerpo que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco . Éste es también adecuado para utilizar un anticuerpo de cadena simple para el anticuerpo que comprende el conjugado anticuerpo- fármaco para estos dos métodos .

En otros aspectos relacionados, son proporcionados los métodos para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) contra una célula que expresa B7H6. Estos métodos incluyen en general poner en contacto la célula que expresa B7H6 con una cantidad efectiva de un anticuerpo que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) ; un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244) ; o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) ; donde la puesta en contacto es en presencia de una célula T NK o bien CD8+ que expresa un receptor Fe que tiene actividad de ADCC, y el anticuerpo comprende una región Fe capaz de enlazarse a la región Fe .

En otros aspectos relacionados, son proporcionados los métodos para inducir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) contra una célula que expresa B7H6. Estos métodos incluyen en general poner en contacto la célula que expresa B7H6 con una cantidad efectiva de un anticuerpo que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No.: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) ; un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNC 1-4244) ; o un anticuerpo producido por el hibridoraa del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) ; donde la puesta en contacto es en presencia de complemento, y el anticuerpo comprende una región Fe que tiene actividad de CDC.

En ambos métodos para inducir ADCC contra una célula que expresa B7H6 y/o para inducir CDC contra una célula que expresa B7H6, las modalidades incluyen los anticuerpos humanos o humanizados. También se incluyen los anticuerpos de cadena simple. Otra variación más incluye las regiones Fe en donde la región Fe es una Fe de cadena simple (scFc) . Para cualquier método, en algunas modalidades, el cáncer que expresa B7H6 es una célula cancerosa. La célula cancerosa puede ser, por ejemplo, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de próstata, una célula de leucemia prohemocítica, una célula de linfoma de células B, una célula de linfoma monocítico, una célula de eritroleucemia, una célula de linfoma de Burkitt o una célula de leucemia mielogénica crónica.

Otro aspecto relacionado proporciona los métodos para tratar un cáncer que expresa B7H6. El método comprende en general administrarle a un sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) ; un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244) ; o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) ; en donde el anticuerpo comprende una región Fe que tiene al menos una actividad de ADCC y actividad de CDC. Los anticuerpos adecuados monoclonales incluyen los anticuerpos humanos, los anticuerpos humanizados, y los anticuerpos de cadena simple. En ciertas variaciones, la región Fe es una Fe de cadena simple (scFc) . Los cánceres que expresan B7H6 adecuados para el tratamiento incluyen, por ejemplo, los cánceres de colon, hígado, cérvix, pulmón, páncreas, o próstata. Otros cánceres que expresan B7H6 adecuados incluyen, por ejemplo, leucemia prohemocítica, linfoma de células B, linfoma monolítica, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, y leucemia mielogénica crónica.

Otro aspecto relacionado proporciona los métodos para detectar la expresión celular de B7H6 donde el enlace del anticuerpo indica la presencia de B7H6 sobre una célula. En general, el método comprende (1) poner en contacto una muestra biológica que incluye una célula humana que va a ser probada con un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No.: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) ; un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244); o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245); y (2) detectar el enlace del anticuerpo, donde el enlace indica la presencia de B7H6 sobre la célula y detecta si la célula expresa B7H6. En algunas modalidades, las muestras biológicas son células humanas intactas o una fracción membranal de la célula que va a ser probada. En ciertas modalidades, el anticuerpo es marcado con un marcador detectable. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores enzimáticos o marcadores bioluminiscentes .

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona los métodos para diagnosticar a un sujeto, sospechoso de tener un cáncer que expresa B7H6. El método incluye en general (1) administrarle al sujeto un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242); un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243) ; un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1- 4244) ; o un anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) conjugado a un marcador detectable; y (2) detectar la distribución del anticuerpo dentro del sujeto. Las aplicaciones adecuadas incluyen el diagnóstico de los cánceres del colon, el hígado, el cérvix, el pulmón, el páncreas, o la próstata.

En otro aspecto más, la presente invención también proporciona una célula productora de anticuerpos seleccionada del grupo que consiste de un hibridoma del clon designación 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242); un hibridoma del clon designación 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); un hibridoma del clon designación 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244); o un hibridoma del clon designación 17B1.3 (Depósito No. CNCM I- 4245) .

Descripción Detallada de la Invención I . . Panorama General La presente invención se refiere a la identificación y a la caracterización de los anticuerpos anti-B7H6 que se enlazan a un miembro de la familia B7 de las proteínas de la superficie celular, particularmente anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humanos..

El polipéptido B7H6 fue primeramente identificado como un contra-receptor para NKp30, un receptor selectivamente expresado sobre las células asesinas naturales (NK) maduras, y está involucrado en la citotoxicidad natural humana como un receptor activador (ver Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación No. 2009/0220502) , incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Una secuencia nucleotídica ilustrativa que codifica para B7H6 humano es proporcionada por la SEQ ID No. : 1; el polipéptido codificado es mostrado en la SEQ ID No.: 2. El polipéptido B7H6 de la SEQ ID No. : 2 comprende un dominio extracelular de aproximadamente 242 residuos de aminoácidos (residuos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) , un dominio transmembranal de aproximadamente 18 residuos de aminoácidos (residuos 267-284 de la SEQ ID No. : 2) , y un dominio intracelular de aproximadamente 158 residuos de aminoácidos (residuos 285-454 de la SEQ ID No. : 2) . B7H6 también tiene un dominio de IgV de aproximadamente 117 residuos de aminoácidos (residuos 25-141 de la SEQ ID No. : 2) y un dominio de IgC de aproximadamente 97 residuos de aminoácidos (residuos 142-238 de la SEQ ID No.: 2) . Existen también varias porciones de señalización potenciales dentro del dominio intracelular de B7H6, incluyendo una porción ITIM (SaYtpL, residuos de aminoácidos 293-298 de la SEQ ID No. : 2) ; una porción de enlace a SH2 (YqlQ, residuos de . aminoácidos 229-332 de la SEQ ID No.: 2); y una porción de enlace a SH3 (PdaPilPvsP, residuos de aminoácidos 418-427 de la SEQ ID No.: 2).

La presente invención surge de la producción de anticuerpos monoclonales murinos contra la proteína B7H6 humana y la caracterización de las propiedades de estos anticuerpos . Cinco anticuerpos monoclonales de ratón contra B7H6 humano con el isotipo IgGl fueron producidos a partir de los hibridomas . Los anticuerpos han sido designados 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 y 17B1.3. Los ensayos de competencia revelaron que diferentes epitopos fueron reconocidos por ciertos anticuerpos. Dos de los mAbs anti-B7H6, 17B 1.3 y 4E5.5, bloquean parcialmente la interacción de NKp30:B7H6, como es mostrado por la inhibición del enlace a NKp30Fc y la activación de DOMSP30. Estos estudios correlacionan la estructura a la función y se describen en los Ejemplos. Los diversos anticuerpos monoclonales son mostrados como reactivos útiles en ensayos bioquímicos y de diagnóstico, así como poseedores de un valor terapéutico.

De este modo, la presente invención incluye los anticuerpos monoclonales que se enlazan a una proteína de la superficie de las células B7H6 humanas con la misma o similar especificidad y características que los mAbs 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 y/o 17B 1.3. Como se describen en la presente, los anticuerpos monoclonales de ratón anti-B7H6 humano fueron producidos y mostraron que se enlazan a diferentes epitopos en los experimentos de competencia. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención proporciona los anticuerpos que son capaces de competir con estos anticuerpos para el enlace a B7H6 (por ejemplo, un anticuerpo que es capaz de enlazarse al mismo epitopo de B7H6 que un anticuerpo seleccionado de los mAbs 4E5.5, 9G9.2, 10E2.9, y 17B1.3). Además, algunos de los anticuerpos mostraron que efectúan la interacción B7H6-NKp30. En consecuencia, en algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano de la presente invención inhiben la activación mediada por B7H6 de NKp30.

La presente invención proporciona además los anticuerpos humanizados derivados de los anticuerpos anti-B7H6 no humanos (por ejemplo, anticuerpos humanizados derivados de los anticuerpos murinos) , anticuerpos neutralizadores , anticuerpos monoclonales humanos, y fragmentos de enlace al antígeno de los mismos . Los fragmentos de anticuerpo ilustrativos incluyen F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, y las unidades de reconocimiento mínimo. Los anticuerpos neutralizadores se enlazan a B7H6 tal que su interacción con NKp30 es inhibida o bloqueada. Dentro del alcance de la invención está un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano para el uso para inhibir las respuestas mediadas por células NK tales como, por ejemplo, un rechazo agudo de aloinjerto de células de médula ósea (BMC) , en donde el anticuerpo es administrado en una cantidad efectiva para bloquear la actividad de las células NK y para tratar el rechazo del aloinjerto de BMC.

Los anticuerpos anti-B7H6 de acuerdo con la presente invención pueden ser también utilizados para dirigir los agentes citotóxicos hacia una célula que expresa B7H6, particularmente una célula cancerosa que expresa B7H6. Tales conjugados anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco producen efectos clínicamente benéficos sobre las células que expresan B7H6 cuando son administrados a un sujeto, tal como un sujeto con un cáncer que expresa B7H6. El anticuerpo es en general administrado solo, pero éste puede ser administrado en combinación con otros agentes terapéuticos. En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7HS humano es conjugado a un agente citotóxico, tal que el conjugado anticuerpo- fármaco resultante ejerce un efecto citotóxico o citostático sobre una célula que expresa B7H6 (por ejemplo, una célula cancerosa que expresa B7H6) cuando es absorbido o internalizado por la célula.

De este modo, en algunos aspectos, la presente invención incluye los conjugados anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco . La porción de anticuerpo se enlazará a una proteína de la superficie de las células B7H6 humana con igual o similar especificidad y características descritas en • la presente, y la porción conjugada de fármaco será un agente terapéutico. El conjugado anticuerpo-anti-B7H6 humano- fármaco ejercerá un efecto clínicamente benéfico sobre las células que expresan B7H6, cuando son administrados a un sujeto con un cáncer que expresa B7H6. Típicamente, la porción conjugada del fármaco será un agente citotóxico y ejercerá un efecto citotóxico o citostático sobre una célula que expresa B7H6. Para estos conjugados anticuerpo-fármaco, la porción de anticuerpo reconocerá ciertos epitopos sobre B7H6. En ciertas variaciones, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco afecta la interacción B7H6-NKp30. Por ejemplo, en algunas modalidades, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco de acuerdo con la presente invención inhibe la activación de NKp30.

En otras modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano comprende una región Fe con función efectora utilizado para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra una célula que expresa B7H6. La presente invención incluye un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe que tiene actividad de ADCC para el uso en la inducción de ADCC. Para este uso, en general, una célula que expresa B7H6 es puesta en contacto con una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe y en presencia de una célula efectora inmunitaria citolítica que expresa un receptor Fe que tiene actividad citolítica. Las células efectoras inmunitarias que expresan receptores Fe citolíticos (por ejemplo, FcyRIIIa o CD16) incluyen, por ejemplo, las células NK así como ciertas células T CD8+. En algunas modalidades donde un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe que tiene actividad de CDC es para el uso en la inducción de CDC, en general la célula que expresa B7H6 es puesta en contacto con una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal an i-B7H6 humano que comprende una región Fe que tiene actividad de CDC, y es en presencia del complemento. Las células que expresan B7H6 que pueden ser dirigidas para la muerte utilizando los anticuerpos y métodos reclamados en la presente incluyen, por ejemplo, células cancerosas, tales como, por ejemplo, células de cáncer de colon, células de cáncer de hígado, células de cáncer cervical, células de cáncer de pulmón, células de cáncer pancreático, células de cáncer de próstata, células de leucemia prohemocítica, célula de linfomas de células B, células de linfoma monocítico, células de eritroleucemia, células de linfoma de Burkitt, y células de leucemia mielogénica crónica, por nombrar unas pocas.

Estos y otros aspectos de la invención se volverán evidentes después de la referencia a la siguiente descripción detallada. Además, diversas referencias son identificadas más adelante y son incorporadas por referencia en su totalidad.

II . Definiciones A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el que es comúnmente entendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, pertinente a los métodos de las composiciones descritas. Como se utilizan en la presente, los siguientes términos y frases tienen los significados adscritos a ellos a no ser que se especifique de otro modo.

Los términos "un", "uno", "una" y "el" y "la" como se utilizan en la presente incluyen los referentes plurales, a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea que sea producido naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente denominados como "péptidos" .

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas . Una proteína puede también comprende componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual es producida la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas son definidas en la presente en términos de sus estructuras de cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos carbohidrato son en general no especificados pero pueden no obstante estar presentes.

Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidrato, lípido, u otras impurezas proteicas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Típicamente, una preparación del polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, por ejemplo, al menos aproximadamente 80% pura, al menos aproximadamente 90% pura, al menos aproximadamente 95% pura, más de 95% pura, tal como 96%, 97%, ó 98% o más pura, o más del 99% pura. Una manera de mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por la aparición de una banda simple después de la electroforesis en gel de docecilsulfato de sodio (SDS) -poliacrilamida de la preparación de proteína, y la tinción de gel con Azul Brillante de Coomassie. No obstante, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas .

Los términos "amino- terminal" y "carboxilo-terminal" se utilizan en la presente para denotar posiciones dentro de los polipéptidos . Donde el contexto lo permita, estos términos son utilizados con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para denotar la proximidad o la posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido, está localizada proximal al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión involucra la transcripción del gen estructural en mAR y la traducción del mARN en uno o más polipéptidos.

Como se utiliza en la presente, el término " inmunomodulador" incluye la citocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas , moléculas co-estimuladoras , factores hematopoyéticos , y similares, y análogos sintéticos de estas moléculas.

El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere a los polipéptidos de inmunoglobulina y a las porciones inmunológicamente activos de los polipéptidos de inmunoglobulina, por ejemplo, los polipéptidos de la familia de inmunoglobulinas, o fragmentos de los mismos, que contienen un sitio de enlace al antígeno que se enlaza inmunoespecíficamente a un antígeno específico (por ejemplo, el dominio extracelular de B7H6) .

Un "anticuerpo anti-idiotipo" es un anticuerpo que se enlaza con el dominio de la región variable de una inmunoglobulina . En el presente contexto, un anticuerpo anti-idiotipo se enlaza con la región variable de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano, y de este modo, un anticuerpo anti-idiotipo imita a un epitopo de B7H6.

Un "fragmento de anticuerpo" es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab ' , Fab, y similares. No obstante de la estructura, un fragmento de anticuerpo se enlaza con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-B7H6 se enlaza a un epitopo de B7H6.

El término "anticuerpo" también abarca los anticuerpos intactos manipulados por ingeniería genética, o fragmentos tales como, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos 11 Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, polipéptidos que consisten de la región variable de cadena ligera, anticuerpos de cadena simple recombinantes en los cuales las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un ligador peptídico ("proteínas scFv"), unidades de reconocimiento mínimas que consisten de los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable , y similares, así como los péptidos y polipéptidos sintéticos que se enlazan al antígeno.

Un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones de determinación de la complementariedad derivadas de un anticuerpo de. roedor, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo es derivado de un anticuerpo humano.

"Anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las cuales las regiones de determinación de la complementariedad no humanas (por ejemplo, murinas) de un anticuerpo monoclonal han sido transferidas de las cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina no humana a un dominio variable humano. La construcción de los anticuerpos humanizados para el uso terapéutico en humanos que son derivados de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) , tales como aquellos que se enlazan a o neutralizan a una proteína humana, están dentro del alcance de una persona experta en la técnica.

Los términos "fragmento Fe", "región Fe", o "dominio Fe", como se utilizan en la presente, son sinónimos y se refieren a la porción de un anticuerpo que es responsable del enlace a los receptores del anticuerpo sobre las células y el componente Clq del complemento. Fe significa "fragmento cristalino", el fragmento de un anticuerpo que formará fácilmente un cristal de proteína. Distintos fragmentos de proteína, los cuales fueron originalmente descritos por digestión proteolítica, pueden definir la estructura general completa de una proteína inmunoglobulina. Como se definió originalmente en la literatura, el fragmento Fe consiste de las regiones de bisagra de cadena pesada enlazadas por puentes disulfuro. Los dominios CH2, y CH3. No obstante, más recientemente, el término ha sido aplicado a una cadena simple que consiste de CH3 , CH2, y al menos una porción de la bisagra suficiente para formar un dímero enlazado por puente disulfuro, con una segunda de tales cadenas . Para una revisión de la estructura y función de la inmunoglobulina, ver Putnam, The Plasma Proteins, Vol . V (Academic Press, Inc., 1987) , pp. 49-140; y Padlan, Mol. Immunol . 31: 169-217, 1994. Como se utiliza en la presente, el término Fe incluye las variantes de secuencias de origen natural.

Los términos "Fe de cadena simple", "dominio Fe de cadena simple", y "scFc", como se utilizan en la presente, son sinónimos y se refieren a una fusión polipeptídica que comprende dos monómeros de dominio Fe unidos por un ligador flexible, tal que los dos monómeros Fe son capaces de realizar la dimerización para formar un dominio Fe dimérico, funcional, capaz de enlazarse a los receptores Fe. Los polipéptidos Fe de cadena simple son además descritos en la Solicitud de Patente Internacional del Publicación No. O . 08/0131242, titulada "Fe de Cadena Simple, Métodos de Elaboración y Métodos de Tratamiento", la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.

El término "región Fe que tiene actividad de ADCC", como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio Fe capaz de mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) a través del enlace de un receptor Fe citolítico (por ejemplo, FcyRIIIa) sobre una célula efectora inmunitaria, citolítica que expresa el receptor Fe (por ejemplo, una célula NK o una célula T CD8+) .

El término "complemento" se refiere colectivamente a aquellos componentes en el suero normal que, junto con los anticuerpos enlazados al antígeno muestran la habilidad para lisar células. El complemento consiste de un grupo de proteínas séricas que actúan en concierto y en una secuencia ordenada para ejercer su efecto.

Los términos "vía clásica del complemento" y "sistema clásico del complemento", como se utilizan en la presente, son sinónimos y se refieren a una vía particular para la activación del complemento. La vía clásica requiere complejos antígeno-anticuerpo para el inicio, e involucra la activación, de una manera ordenada, de nueve componentes proteicos designados Cl al C9. Para varios pasos en el proceso de activación, el producto es una enzima que cataliza el paso subsiguiente. Esta cascada proporciona la amplificación y la activación de grandes cantidades del complemento por una señal inicial relativamente pequeña.

El término "región Fe que tiene actividad de CDC" , como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio Fe que sea capaz de mediar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) a través del enlace de la proteína Clq del complemento y la activación del sistema clásico del complemento .

El término "agente" como se utiliza en la presente, significa un elemento, compuesto u otra entidad molecular, que incluye, por ejemplo, un compuesto farmacéutico, terapéutico, o farmacológico. Los agentes pueden ser naturales o sintéticos o una combinación de los mismos. Un "agente terapéutico" es un agente que ejerce un efecto terapéutico (por ejemplo, benéfico) sobre una célula o un tejido (por ejemplo, sobre una célula o un tejido que expresa B7H6, tales como una célula cancerosa que expresa B7H6) , ya sea solo o en combinación con otro agente (por ejemplo, una enzima de conversión profármaco en combinación con un profármaco) . En ciertos aspectos de la presente invención, un "agente terapéutico" es un agente conjugado a un anticuerpo para producir un conjugado que es útil para terapia. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores , quelantes, agentes de boro, agentes fotoactivos o colorantes y radioisótopos. En algunas variaciones, un agente terapéutico para la conjugación a un anticuerpo es un agente que ejerce un efecto citotóxico o citostático.

"Efecto citotóxico", en referencia al efecto de un agente, sobre una célula significa la muerte de la célula. "Efecto citostático" significa una inhibición de la proliferación celular. Un "agente citotóxico" significa un agente que tiene un efecto citotóxico o citostático sobre una célula, con lo cual se agota o se inhibe el crecimiento de, respectivamente, las células dentro de una población celular.

Un "marcador detectable" es una molécula o átomo que puede ser conjugado a una porción de anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otras porciones marcadoras.

El término "marcador de afinidad" es utilizado en la presente para denotar un segmento polipeptídico que puede ser enlazado a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para el enlace del segundo polipéptido a un sustrato. En particular, cualquier péptido o proteína para la cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico esté disponible, puede ser utilizado como un marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen un tramo de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol . 198:3, 1991), la glutatión-S-transíerasa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), el marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82:7952, 1985), la sustancia P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204, 1988), péptido de enlace a la estreptavidina, u otro epitopo antigénico o dominio de enlace. Ver en general Ford et al., Protein Expresión y Purification 2:95, 1991. Las moléculas de ADN que codifican para los marcadores de afinidad están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .

Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo completo, en oposición a un fragmento de anticuerpo, el cual no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales , así como ciertos anticuerpos recombinantes , tales como los anticuerpos quiméricos y humanizados.

El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que es derivado de un clon celular simple, incluyendo cualquier clon de célula eucariótica o procariótica, o un clon fago, y no el método mediante el cual éste es producido. De este modo, el término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, no está limitado a los anticuerpos producidos a través de la terminología de hibridoma .

Un " inmunoconjugado" es un conjugado de un anticuerpo con un agente terapéutico o un marcador detectable .

El término "epitopo" se refiere a cualquier determinante proteico capaz de enlazarse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de célula T. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activos, de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y usualmente tienen características estructurales tridimensionales, específicas, así como características de carga específicas. Más específicamente, el término "epitopo de B7H6" como se utiliza en la presente, se refiere a una porción del polipéptido B7H6 que tiene actividad antigénica o inmunogenica en un animal, preferentemente un mamífero, y lo más preferentemente un ratón o un humano. Un epitopo que tiene actividad inmunogénica es una porción de un polipéptido B7H6 que promueve una respuesta de anticuerpo en un animal. Un epitopo que tiene actividad antigénica es una porción de un polipéptido B7H6 al cual se enlaza inmunoespecíficamente un anticuerpo como es determinado mediante cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayos . Los epitopos antigénicos no necesariamente necesitan ser inmunogénicos . "Epitopos discontinuos" son epitopos conformacionales formados a partir de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína B7H6. Los epitopos conformacionales pierden la habilidad para enlazarse específicamente en presencia de solventes desnaturalizantes (por ejemplo, en análisis de transferencia de Western) .

"Actividad de células NK" como se utiliza en la presente, se refiere a la actividad citolítica de las células NK. Existen numerosos ensayos bien conocidos para las personas expertas, para detectar y/o para monitorizar tal actividad, incluyendo pero no limitados a los ensayos descritos en los ejemplos proporcionados en la presente.

Como se utilizan en la presente, la frase "interacción de B7H6 y NKp30" se refiere a la interacción física directa (por ejemplo, el enlace) y/o a otra interacción directa de un receptor de B7H6 funcional con NKp30 sobre las células NK, dando como resultado la estimulación del receptor de B7H6 y/o NKp30 y la señalización intracelular asociada.

Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo bloqueador" se refiere a un anticuerpo que interfiere con (por ejemplo, inhibe) la interacción de B7H6 y NKp30, y/o que interfiere con la habilidad del B7H6 para disparar la actividad de las células NK, por ejemplo, medido por actividad citolítica. La inhibición no tiene que ser completa y puede ser "parcial", por ejemplo, una disminución de reducción en la actividad como una medición relativa a un control o estándar.

La frase "trastorno o enfermedad caracterizada por la presencia de células que expresan B7H6," como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier trastorno o enfermedad que involucre, al menos en parte, las células patogénicas que expresan B7H6. Tales células patogénicas incluyen, por ejemplo, ciertas células tumorales . En consecuencia, los trastornos o enfermedades típicos caracterizados por la presencia de las células que expresan B7H6, son algunos cánceres . Tales enfermedades o trastornos son particularmente apropiados para ciertos métodos de tratamiento para dirigirse a las células que expresan B7H6, como se describe posteriormente en la presente.

Los términos "trastorno o enfermedad mediado por células que expresan NKp30" y "trastorno o enfermedad asociado con la actividad incrementada de una célula que expresa NKp30" se utilizan sinónimamente en la presente para referirse a cualquier trastorno o enfermedad que tenga una patología que es mediada, al menos en parte, por la actividad citolítica de una célula que expresa NKp30. En algunas variaciones, la enfermedad o el trastorno mediado por las células que expresan NKp30, es una · "enfermedad o trastorno mediado por células NK" , que tiene una patología que es mediada, al menos en parte, por la actividad citolítica de las células NK. Un ejemplo de tal enfermedad o trastorno es el rechazo agudo de aloinjertos de células de médula ósea (BMC) . Tales enfermedades o trastornos son particularmente adecuados para ciertos métodos de tratamiento para la inhibición de la actividad de las células NK, como se describe posteriormente en la presente.

El término "cantidad efectiva, " en el contexto del tratamiento de un trastorno o enfermedad mediado por células que expresan NKp30, por administración de un anticuerpo de bloqueo anti-B7H6 a un sujeto como se describe en la presente, o en el contexto del tratamiento de un trastorno o enfermedad caracterizada por la presencia de células que expresan B7H6 por la administración de un anticuerpo anti-B7H6 o el conjugado anticuerpo- fármaco a un sujeto como se describe en la presente, se refiere a la cantidad de tal molécula que es suficiente para inhibir la ocurrencia o mejorar uno o más síntomas clínicos o de diagnóstico del trastorno o enfermedad en un sujeto. Una cantidad efectiva de un agente es administrada de acuerdo a los métodos de la presente invención en un "régimen efectivo" . El término "régimen efectivo" se refiere a una combinación de cantidad de agente que es administrado y a la frecuencia de dosificación adecuada para lograr el tratamiento o la prevención del trastorno o enfermedad.

Debido a la imprecisión de los métodos analíticos estándares, los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros son entendidos como valores aproximados. Cuando tal valor es expresado como "aproximadamente" X o "alrededor de" X, se entenderá que el valor establecido de X será preciso hasta ± 10%.

III . Anticuerpos para las Proteínas B7H6 En un aspecto, la presente invención proporciona los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano que se enlazan específicamente a un epitopo de B7H6 humano (por ejemplo, a un segmento polipeptídico proveniente de la secuencia de aminoácidos descrita en los residuos 25-266 de la SEQ ID No. : 2) . En algunas variaciones, los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano proporcionados, son capaces de inhibir la interacción de B7H6-NKp30. La inhibición no tiene que ser el bloqueo completo de la interacción B7H6-NKp30, y puede ser una disminución o reducción en la actividad como una medición relativa a un control o estándar. En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano de acuerdo con la presente invención, es capaz de competir al enlace al antígeno B7H6 humano con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242), 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243) , 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244), o 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245). Estos cuatro hibridomas fueron depositados en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM, Instituto Pasteur; París, Francia) el 18 de Noviembre del 2009, a nombre del Instituto Nacional De La Sante et De La Recherche Medícale (INSERM) .

Cinco anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano, de ratón fueron identificados y caracterizados, y son descritos en la presente. La caracterización de los anticuerpos demostró que algunos de estos anticuerpos monoclonales reconocen diferentes epitopos sobre la proteína B7H6, mostrado por ensayos de enlace competitivos y descritos en la presente. La caracterización de los anticuerpos demostró además que dos de los anticuerpos al menos bloquean parcialmente la interacción B7H6-NKp30.

Puede ser utilizado encajonamiento de los epitopos para identificar los anticuerpos que caen dentro del alcance de la invención reclamada. El enca onamiento de epitopos se refiere al uso de ensayo de enlaces competitivos para identificar los pares de anticuerpos que son, o que no son, capaces de enlazarse a la proteína B7H6 simultáneamente, con lo cual se identifican los pares de anticuerpos que se enlazan al mismo o a epitopos traslapados sobre una proteína. Los experimentos de encajonamiento de epitopo proporcionan evidencia de que están presentes epitopos antigénicamente distintos. Son requeridos datos adicionales para identificar, o "mapear" el epitopo a una secuencia de aminoácidos específica o a una posición específica de la molécula de proteína B7H6.

La competencia por el enlace puede ser evaluada para cualquier par de anticuerpos o de fragmentos. Por ejemplo, utilizando los reactivos de detección apropiados, la especificidad de enlace de los anticuerpos o los fragmentos de enlace provenientes de cualquier fuente puede ser comparada a la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. El encajonamiento de epitopo puede ser realizado con "anticuerpos aislados" o con sobrenadante de cultivo celular. Frecuentemente, el encajonamiento es realizado con los sobrenadantes clónales de la primera ronda, para guiar la elección de los clones que van a ser desarrollados posteriormente. Los anticuerpos que van a ser comparados deben ser dominios de enlace al antígeno, sustancialmente homogéneos. En el caso de los anticuerpos "biespecíficos " o "bifuncionales " , la especificidad de enlace de los dos diferentes sitios de enlace necesita ser evaluada o encajonada independientemente.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser evaluados para el enlace específico mediante cualquier método conocido en la técnica. Muchos diferentes formatos de ensayo de enlace competitivo pueden ser utilizados para el encajonamiento de epitopo. Los inmunoensayos que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a, sistemas de ensayo competitivos utilizando técnicas tales como trasferencia de Western, radioinmunoensayos , ELISA, inmunoensayos de "emparedado", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de precipitina, ensayos de precipitina de difusión en gel, ensayos inmunorradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, y ensayos de fijación del complemento. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 1, John iley & sons, Inc., New York) . Además, los ensayos rutinarios de bloqueo cruzado tales como aquellos descritos en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe, 1988, pueden ser realizados.

El BIACORE® (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) es únicamente uno de una variedad de formatos de ensayo de resonancia de plasmón superficial, que son rutinariamente utilizados para paneles de cajón de epitopo de los anticuerpos monoclonales . Otras referencias, por ejemplo, The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn Morris ed. Humana Press, 1996, describen los métodos alternativos que podrían ser utilizados para enlazar los anticuerpos y podría esperarse que proporcionen información comparable respecto a la especificidad de enlace de los anticuerpos al ligando B7H6. Cuando se utiliza el sistema BIACORE®, los experimentos de encajonamiento de epitopo son realizados con el antígeno soluble, nativo o recombinante . Los estudios de encajonamiento de epitopo pueden ser realizados sobre un sistema BIACORE 1000® (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . El software BIAlogue® v. 1.2 puede ser utilizado para programar los métodos de corrida. Por ejemplo, para encajonar los anticuerpos monoclonales de ratón producidos contra B7H6, el anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG Fe de ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) pueden ser covalentemente inmovilizados a un chip o sensor BIACORE® CM5m y utilizados para enlazarse (capturar) al anticuerpo monoclonal primario de las series de prueba al chip. Los sitios de enlace a Fe no ocupados sobre el chip son luego bloqueados utilizando un fragmento Fe de IgG policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories) . Subsecuentemente, la proteína B7H6 es inyectada y se deja enlazar específicamente al anticuerpo monoclonal primario capturado. El instrumento BIACORE® mide la masa de la proteína enlazada al chip sensor, y el enlace del anticuerpo primario y el antígeno B7H6 puede ser verificado para cada ciclo. Después del enlace del anticuerpo primario y el antígeno a chip, el anticuerpo secundario soluble es inyectado y se deja enlazar al antígeno pre-enlazado . Si el anticuerpo monoclonal secundario es capaz de enlazarse al antígeno B7H6 simultáneamente con el anticuerpo monoclonal primario, su enlace es detectado por el BIACORE® . No obstante, si el anticuerpo monoclonal secundario no es capaz de enlazarse al antígeno B7H6 simultáneamente con el anticuerpo monoclonal primario, no se detecta ningún enlace adicional. Cada anticuerpo monoclonal es probado contra sí mismo como un control negativo para establecer el nivel de la señal antecedente (sin enlace) .

Puede ser utilizado un formato de ELISA competitivo, libre de marcador (LFC-ELISA) para encajonar los anticuerpos. Este método es descrito por Nagata et al., J. Immunol. Methods 292:141-155, 2004, y utiliza B7H6 biotinilado. Para el ejemplo de encajonamiento de anticuerpos monoclonales de ratón producidos contra B7H6, las placas de microtitulación son recubiertas a 100 µ?/???? con 1 g/ml de un anticuerpo de cabra específico anti-IgG Fc-? de ratón (Jackson ImmunoResearch) diluido en ELISA B (PBS, 0.1% de Tween 20, 1% de BSA) . Después del enlace de este anticuerpo de recubrimiento por 3 horas a temperatura ambiente, cada medio condicionado que contiene mAb es diluido en ELISA B para producir una concentración aproximada de mAb de 0.5 µ?/?t??, y se deja enlazar a las placas recubiertas con la IgG de cabra anti-ratón, toda la noche a 4°C. (mAb # 1) . En paralelo, un segundo grupo de medios condicionados (mAb # 2) son diluidos en tubos de ensayo de poliestireno aproximadamente a 0.5 pg/ml de mAb en ELISA B, mezclado con 50 ng/ml del antígeno B7H6 biotinilado, e incubado toda la noche a 4°C. Después de la incubación del mAb # 1 con el anticuerpo de recubrimiento, las placas son bloqueadas con un anticuerpo no relacionado para saturar los sitios de enlace no ocupados sobre la placa. Las mezclas de mAb # 2-biotina-B7H6 son agregadas a la placa y se dejan enlazar. Como un control para (sin competencia) en el ensayo, 50 ng/ml de B7H6 biotinilada son agregados directamente (sin pre- incubación con mAb # 2) a los pozos que contienen el mAb # 1 inmovilizado. Después de la incubación con el complejo de B7H6 biotinilado-mAb # 2, se agrega estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, 111). a la placa a 0.5 vq/ml. Las placas son reveladas con el sustrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, Md) , y la absorbancia de los pozos individuales a 450 nm se mide con un lector de placas (Molecular Devices SPECTRAMAX 340, Sunnyvale, Calif ) . Si el mAb # 1 se enlaza a un epitopo diferente del mAb # 2, el complejo biotina-B7H6-mAb # 2, se enlazará a la placa dando como resultado una lectura de alta absorbancia. Si el mAb # 1 se enlaza al mismo epitopo que mAb#2, el complejo biotina-B7H6-MAb # 2 no se enlazará a la placa, dando como resultado una lectura de baja absorbancia.

En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano de la presente invención, es capaz de inhibir la interacción de B7H6 con NKp30 humano; tales anticuerpos son útiles, por ejemplo, para inhibir los eventos celulares y otros eventos fisiológicos asociados con la interacción de B7H6 con NKp30, incluyendo, por ejemplo, la señalización intracelular mediada por B7H6 y/o por NKp30 y la función efectora asociada (por ejemplo, actividad citolitica mediada por NKp30) .

Los anticuerpos para B7H6 pueden ser obtenidos, por ejemplo, utilizando el producto de un vector de expresión de B7H6 o B7H6 aislado de una fuente natural como un antígeno. Los anticuerpos monoclonales anti- B7H6 humano, particularmente útiles, se "enlazan específicamente" a B7H6. Se considera que los anticuerpos son de enlace específico si los anticuerpos muestran al menos una de las siguientes dos propiedades: (1) los anticuerpos se enlazan a B7H6 con un nivel de umbral de la actividad de enlace, y (2) los anticuerpos no reaccionan cruzadamente de manera significativa con los polipéptxdos relacionados a B7H6.

Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se enlazan específicamente si éstos se enlazan a un polipéptido B7H6, péptido, o epitopo con una afinidad de enlace (Ka) de 106M_1 o mayor, preferentemente 107M_1 o mayor, más preferentemente ÍO8!^"1 o mayor, y lo más preferentemente 109?_1 o mayor. La afinidad de enlace del anticuerpo puede ser fácilmente determinada por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949). Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos no reaccionan cruzadamente de manera significativa con las moléculas polipeptídicas relacionadas, por ejemplo, si éstas detectan B7H6, pero no presentan polipéptidos actualmente conocidos utilizando un análisis estándar de transferencia de Western. Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen los miembros conocidos de la familia B7.

Los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano pueden ser producidos utilizando péptidos y polipéptidos que poseen el epitopo B7H6 antigénico. Los péptidos y los polipéptidos que poseen el epitopo antigénico contienen típicamente una secuencia de al menos nueve, o entre 15 a aproximadamente 30 aminoácidos, contenido dentro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 2. No obstante, los péptidos o los polipéptidos que comprenden una porción más grande de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contiene de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia completa de aminoácidos de un polipéptido B7H6, son también útiles para inducir los anticuerpos que se enlazan a con B7H6. Es deseable que la secuencia de aminoácidos del péptido que posee el epitopo, sea seleccionada para proporcionar solubilidad sustancial en solventes acuosos (por ejemplo, la secuencia incluye residuos relativamente hidrof licos, .mientras que los residuos hidrofóbicos son típicamente evitados) . Además, las secuencias de aminoácidos que contienen residuos de prolina pueden ser también deseables para la producción de anticuerpos .

Los sitios antigénicos potenciales en B7H6 pueden ser identificados utilizando el método de Jameson-Wolf, Jameson y Wolf (CABIOS 4: 181, 1988), implementado por el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI) . Los parámetros por omisión pueden ser utilizados en este análisis.

El método de Jameson-Wolf predice los determinantes antigénicos potenciales por combinación de seis subrutinas mayores para la predicción estructural de la proteína. Por ejemplo, el método de Hopp-Woods (Ver Hopp et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA 78:3824, 1981) puede ser primeramente utilizado para identificar las secuencias de aminoácidos que representan áreas de mayor hidrofilicidad local (parámetro: siete residuos promediados) . En el segundo paso, el método de Emini (Ver Emini et al., J. Virology 55:836, 1985) puede ser utilizado para calcular las probabilidades superficiales (parámetro: umbral de decisión de superficie (0.6) = 1). En tercer lugar, el método de Karplus-Schultz, Karplus y Schultz (Naturwissenschaften 72:212, 1985) puede ser utilizado para predecir la flexibilidad de la cadena de columna vertebral (parámetro: umbral de flexibilidad (0.2) = 1). En el cuarto y quinto pasos del análisis, pueden ser aplicadas las predicciones de la estructura secundaria a los datos, utilizando los métodos de Chou-Fasman (Ver Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Aminoácidos Composition, " in Prediction of Protein Structure and the Principies of Protein Conformation 549-586 (Fasman, ed. , Plenum Press 1990) y Garnier-Robson {ver Gamier et al, J. Mol. Biol. 120:97, 1978) (parámetros de Chou-Fasman: tabla de conformación = 64 proteínas; un umbral de la región a = 103; umbral de la región ß = 105; parámetros de Garnier-Robson: constantes de decisión a y ß = 0) . En una sexta subrutina, los parámetros de flexibilidad y los factores de hidropatía/accesibilidad del solvente, pueden ser combinados para determinar un valor de contorno único diseñado como el " índice antigénico" . Finalmente, una función de ensanchamiento del pico puede ser aplicada al índice antigénico, lo cual amplia los picos superficiales mayores por adición de, por ejemplo, 20, 40, 60, ó 80% del valor pico respectivo para explicar la energía libre adicional derivada de la movilidad de las regiones superficiales con relación a las regiones internas. Este cálculo, no obstante, es típicamente no aplicado a ningún pico mayor que resida en una región helicoidal, ya que las regiones helicoidales tienden a ser menos flexibles.

Los métodos para generar los anticuerpos monoclonales son bien conocidos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de roedor para antígenos específicos pueden ser conocidos por métodos específicos por aquellos expertos en la materia (ver, por ejemplo, Kohler et al, Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds) . , Current Protocols in Immunology, Vol . 1 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"] ; Picksley et al, "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli " en ADÑ Cloning 2: Expresión Systems, 2a Edición 93 (Glover et al, eds., Oxford University Press 1995) . En ciertas variaciones, los anticuerpos monoclonales son obtenidos al inyectar a los ratones con una composición que comprende un producto del gen B7H6 (por ejemplo, un polipéptido que comprende o que consiste de los residuos 25-266 de la SEQ ID No.: 2), verificando la presencia de la producción del anticuerpo al retirar una muestra de suero, retirando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con las células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen los anticuerpos para el antígeno, y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma.

Un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano puede ser también un anticuerpo monoclonal humano, o un anticuerpo derivado de éste. Los anticuerpos monoclónales humanos pueden ser obtenidos, por ejemplo, de ratones transgénicos que han sido manipulados por ingeniería para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al reto antigénico. En esta técnica, los elementos del locus de la cadena pesada y ligera humana son introducidos dentro de las cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen perturbaciones dirigidas de los locus de cadena pesada y de cadena ligera endógenos . Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden ser utilizados para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos son descritos, por ejemplo, por Green et al, Nature Genet . 7: 13, 1994; Lonberg et al, Nature 368:856, 1994; y Taylor et al, Int. Immun. 6:579, 1994.

Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, la exposición in vitro de los linfocitos a la proteína o al péptido de B7H6, y la selección de los anticuerpos a partir de las bibliotecas de visualización de anticuerpos en vectores fagos o similares (por ejemplo, a través del uso de la proteína o el péptido B7H6 inmovilizado o marcado) . Las técnicas para crear y seleccionar tales bibliotecas de visualización de anticuerpo son conocidas en la materia (ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,580,717; 5,885,793; 5,969,108; y 6,040,136).

Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados a partir de cultivos celulares por una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad con Proteína-A-Sefaróse, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico (ver, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al, " Purification of Inmunoglobulina G (IgG) , " en Methods in Molecular Biology (Vol. 10) 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).

La secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal puede ser variada a través de la aplicación de técnicas de ADN recombinante . De este modo, los anticuerpos puede ser rediseñados para obtener características deseadas. Los anticuerpos modificados pueden proporcionar, por ejemplo, estabilidad mejorada y/o eficacia terapéutica mejorada con relación a su forma no modificada. Las posibles variaciones son muchas y van desde el cambio de solo uno o unos pocos aminoácidos hasta el rediseño completo de, por ejemplo, la región variable o la región constante. Los cambios en la región constante en general, serán realizados con el fin de mejorar o alterar las características, tales como la fijación del complemento, la interacción con membranas, y otras funciones efectoras. Típicamente, los cambios en la región variable serán realizados con el fin de mejorar las características de enlace al antígeno, para mejorar la estabilidad de la región variable, o reducir el riesgo de inmunogenicidad. Las técnicas de visualización de fagos pueden ser también empleadas. Ver, por ejemplo, Huse et al, Science 246:1275-1281, 1989; Ladner et al, Patente de los Estados Unidos No. 5,571,698.

En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano es un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio de enlace al antígeno de un anticuerpo intacto (completo) . Tales fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos mediante digestión con pepsina o papaína de los anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Como una ilustración, los fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos mediante escisión enzimática de los anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede ser adicionalmente escindido utilizando un agente reductor de tiol para producir los fragmentos 3.5S Fab'. Opcionalmente , la reacción de escisión puede ser llevada a cabo utilizando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo, que resultan de la escisión de los enlaces disulfuro. Como una alternativa, una escisión enzimática utilizando pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento F0 directamente. Estos métodos son descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 4,331,647 a Goldenberg; Nisonoff et al, Arch Biochem. Biophys . 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al, en Methods in Enzymology (Vol. 1) 422 (Academic Press 1967); y Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.

Otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, la escisión adicional de los fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas pueden ser también utilizadas, siempre y cuando los fragmentos se enlacen al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como es descrito por inbar et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659, 1972. Alternativamente, las cadenas variables pueden ser ligadas por un enlace disulfuro intermolecular o reticuladas por productos químicos tales como glutaraldehído {ver, por ejemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992) .

Los fragmentos Fv pueden comprender las cadenas VH y VL que están conectadas por un ligador peptídico. Estas proteínas de enlace al antígeno, de cadena simple (scFv) son preparadas mediante la construcción de un gen estructural que comprende las secuencias de ADN que codifican para los dominios VH y VL que están conectados por un oligonucleótido. El gen estructural es insertado dentro de un vector de expresión que es subsecuentemente introducido dentro de una célula hospedera, tal como E. coli. Las células hospederas recombinantes sintetizan una cadena polipeptldica simple con un péptido ligador que une en puente los dos dominios V. Los métodos para producir scFvs son descritos, por ejemplo, por Whitlow et al, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991. (Ver también Bird et al., Science 242:423, 1988; Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778 a Ladner et al.; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993, y Sandhu, supra) . Como una ilustración, un scFv puede ser obtenido mediante la selección de una biblioteca de scFvs (por ejemplo, scFvs visualizados por fago) para el enlace específico a B7H6 (por ejemplo, la proteina o el péptido B7H6 inmovilizado o marcado) .

Otra forma más de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica para una región simple de determinación de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) . Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimas") pueden ser obtenidos mediante la construcción de los genes que codifican para la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes son preparados, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras de anticuerpo (ver, por ejemplo, Larrick et al., Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991 ; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Anticuerpos monoclonales," en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application 166 (Ritter et al, eds . , Cambridge University Press 1995) ; y ard et al, "Genetic Manipulation y Expression of Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Principies and Applications 137 (Birch et al, eds., iley-Liss, Inc. 1995)) .

Alternativamente, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano puede ser un anticuerpo monoclonal "humanizado" derivado de un anticuerpo anti-B7H6 no humano. Los anticuerpos monoclonales humanizados son producidos mediante la transferencia de regiones de determinación de la complementariedad no humanas (por ejemplo, de ratón) provenientes de las cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina no humana dentro de un dominio variable humano. Los residuos típicos de anticuerpos humanos son luego sustituidos en las regiones estructurales de las contrapartes no humanas. El uso de los anticuerpos monoclonales humanizados evita los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas . Las técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulina murina son descritos, por ejemplo, por Orlandi et al, Proc . Nat 11 Acad. Sci. USA 86:3833, 1989. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados son descritas, por ejemplo, por Jones et al, Nature 321:522, 1986; Cárter et al, Proc. Nat 11 Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed) . , Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," en Protein Engineering: Principies y Practice 399-434 (Cleland et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 1996); y Patente de los Estados Unidos No. 5,693,762 a Queen et al.

En ciertas variaciones, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano incluye una región Fe, la cual comprende los dominios CH2 y CH3 de una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) y típicamente una porción de una región de bisagra de Ig. Fe es responsable de dos de las propiedades altamente deseables de una IgG: el reclutamiento de la función efectora y una vida media en suero prolongada. La habilidad para matar células objetivo a las cuales es adherido un anticuerpo se desprende de la activación de la vía efectora inmunitaria (ADCC) y la vía del complemento (CDC) a través del enlace del Fe a los receptores de Fe y la proteína del complemento, Clq, respectivamente. El enlace es mediado por los residuos localizados principalmente en la región de bisagra inferior y en el dominio CH2 superior. (Ver, por ejemplo, Wines et al, J. Immunol. 164:5313, 2000; Woof y Burton, Nature Reviews 4: 1, 2004) . La vida media larga en suero demostrada por la IgG es mediada a través de una interacción dependiente del pH entre los aminoácidos en el domino CH2 y CH3 y el receptor Fe neonatal Fe, FcRn. (Ver, por ejemplo, Getie y ard, Immunology Today 18:592, 1997; Petkova et al., Int. Immunol. 18 : 1759, 2006) .

En consecuencia, en ciertas modalidades de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe, la región Fe tiene actividad de ADCC y/o de CDC. Tales anticuerpos son particularmente útiles para mediar la muerte de las células objetivo que expresan B7H6 tales como, por ejemplo, las células cancerosas o las células viralmente infectadas. En otra modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano comprende una región Fe que carece de una o más funciones efectoras (por ejemplo, carece de actividad de ADCC y/o de CDC) . Las regiones Fe que carecen o que tienen función efectora sustancialmente reducida, pueden ser obtenidas por ejemplo, mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos dentro de una secuencia de la región Fe nativa, tal que la región Fe no se enlaza, o tiene enlace sustancialmente reducido a los receptores de Fe citolíticos y/o a la proteína Clq del complemento. Una variedad de regiones Fe modificadas que carecen o que tienen funciones efectoras sustancialmente reducidas, son conocidas en la técnica. Las regiones Fe particularmente adecuadas que carecen o que tienen función efectora sustancialmente reducida incluyen, por ejemplo, las regiones Fe variantes como se describen en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación No. 2009/0220502.

En ciertas modalidades que comprenden una región Fe, la región Fe es una región Fe de cadena simple (scFc) , que comprende dos monómeros de dominio Fe unidos por un ligador flexible, tal que los dos monómeros Fe son capaces de realizar la dimerización para formar un dominio Fe dimérico, funcional. Por ejemplo, en algunas variaciones de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende un scFc, el anticuerpo comprende una Fv de cadena simple (scFv) fusionado a la porción de scFc, en donde la porción de scFv se enlaza específicamente a B7H6. Los polipéptidos de Fe de cadena simple, incluyendo los polipéptidos de fusión que comprende scFc y uno o más dominios de enlace al antígeno (por ejemplo, scFv) , son además descritos en la Solicitud de Patente Internacional del PCT Publicación No. O 08/0131242, titulada "Fe de Cadena Simple, Métodos de Elaboración y Métodos de Tratamiento", la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.

Además, los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano o los fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden ser PEGilados utilizando métodos descritos en la técnica y descritos en la presente.

Un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humanp puede ser conjugado con un marcador detectable para formar un inmunoconjugado anti-B7H6. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos de elaboración y detección de tales inmunoconjugados detectablemente marcados, son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, y se describen con más detalle más adelante.

El marcador detectable puede ser un radioisótopo que es detectado mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son 3H, 125L, 131I, 35S y 14C.

Los inmunoconjugados anti-B7H6 pueden también ser marcados con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcador fluorescentemente es determinada mediante la exposición del inmunoconjugado a luz de una longitud de onda apropiada, y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcación fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina .

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-B7H6 pueden ser detectablemente marcados mediante el acoplamiento de un anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente . La presencia del inmunoconjugado marcador con el compuesto quimioluminiscente, es determinada por la detección de la presencia de la luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcación quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.

Similarmente , un compuesto bioluminiscente puede ser utilizado para marcar los inmunoconjugados anti-B7H6 de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en los sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente es determinada por la detección de la presencia de la luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para la marcación incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-B7H6 pueden ser detectablemente marcados mediante el enlace de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano, a una enzima. Cuando el conjugado anti-B7H6-enzima es incubado en presencia del sustrato apropiado, la porción enzima reacciona con el sustrato para producir una porción química que puede ser detectada, por ejemplo, por medios espectrofotométricos , fluorométricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que pueden ser utilizadas para marcar detectablemente los inmunoconjugados poliespecíficos incluyen ß-galactosidasa, glucosa-oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Aquellos expertos en la técnica sabrán de otros marcadores adecuados que pueden ser empleados de acuerdo con la presente invención. El enlace de las porciones marcadoras a los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano puede ser logrado utilizando técnicas estándares conocidas en la materia. La metodología típica a este respecto descrita por Kennedy et al, Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al, Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al, Int'U. Cáncer 46: 1101, 1990; Stein et al, Cáncer Res. 50.T330, 1990; y Coligan, supra .

Además, la conveniencia y la versatilidad de la detección inmunoquímica puede ser mejorada por el uso de anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano que han sido conjugados con avidina, estreptavidina, y biotina. (Ver, por ejemplo, Wilchek et al. (eds) . , "Avidin-Biotin Technology," Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990) ; Bayer et al, " Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," en Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed. , The Humana Press, Inc. 1992)) .

Los métodos para llevar a cabo los inmunonensayos están bien establecidos. (Ver, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays, " en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, y Clinical Application 180-208 (Ritter y Ladyman, eds . , Cambridge University Press 1995) ; Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology, " en Monoclonal Antibodies: Principies y Applications 107-120 (Birch y Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)).

IV. Conjugados Anticuerpo Monoclonal Anti-B7H6-Fármaco En otro aspecto más, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco . Un "conjugado de anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano (como se describe en la Sección III, anterior) conjugado a un agente terapéutico. Tales conjugados de anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco produce efectos clínicamente benéficos sobre las células que expresan B7H6, cuando son administrados a un sujeto, tal como, por ejemplo, un sujeto con un cáncer que expresa B7H6, típicamente cuando es administrado solo pero también en combinación con otros agentes terapéuticos.

En modalidades típicas, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano es conjugado a un agente citotóxico, tal que el conjugado anticuerpo- fármaco resultante ejerce un efecto citotóxico o citostático sobre una célula que expresa B7H6 (por ejemplo, una célula cancerosa que expresa B7H6) cuando es absorbido o internalizado por la célula. Las porciones particularmente adecuadas para la conjugación de los anticuerpos son agentes quimioterapéuticos , enzimas de conversión de profármaco, isótopos compuestos radioactivos, toxinas. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano puede ser conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico (ver adelante) o una toxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de la difteria) . Los ejemplos de agentes adicionales que son útiles para conjugarse a un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano, son proporcionados más adelante.

En otras modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano es conjugado a una enzima de conversión de pro- fármaco. La enzima de conversión de pro-fármaco puede ser recombinantemente fusionada al anticuerpo o químicamente conjugada a éste utilizando métodos conocidos. La enzimas de conversión de pro- fármaco ejemplares son carboxipeptidasa G2, ß-glucuronidasa, penicilina-V-amidasa, penicilina-G-amidasa, ß-lactamasa, ß-glucosidasa, nitrorreductasa y carboxipeptidasa A.

Técnicas para conjugar agentes terapéuticos a las proteínas, y en particular a los anticuerpos, son bien conocidas. (Ver, por ejemplo, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Theraphy" , en Monoclonal Antibodies And C ncer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985) ; Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery, " en Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987) ; Thorpe, "Antibodies Carriers Of Cytotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review, " en Monoclonal Antibodies '84: Biological y Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985) ; "Analysis, Results, y Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy, " en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection y Therapy (Baldwin et al. eds., Acadetnic Press, 1985); y Thorpe et al, 1982, Immunol . Rev. 62:119-58. Ver también, por ejemplo, Publicación del PCT O 89/12624) .

En ciertas variaciones, de acuerdo con los métodos descritos en la presente, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco es internalizado y se acumula dentro de una célula que expresa B7H6, en donde el conjugado anticuerpo- fármaco ejerce un efecto terapéutico (por ejemplo, un efecto citotóxico o citostático) . Los métodos para determinar la acumulación y las proporciones de acumulación son encontrados en, por ejemplo, WO 2004/010957, titulado "Congojados de Fármaco y Su Uso para el Tratamiento del Cáncer, un Trastorno Autoinmunitario o un Trastorno Infeccioso" .

En modalidades típicas, cuando se utiliza un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano conjugado a un agente terapéutico (por ejemplo, un fármaco o una enzima de conversión de profármaco) , el agente es preferentemente activo cuando es internalizado por las células que expresan B7H6 (por ejemplo, las células de un cáncer que expresa B7H6) que van a ser tratadas. En otras modalidades, el conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco no es internalizado, y el fármaco es efectivo para ejercer un efecto terapéutico (por ejemplo, agotamiento o inhibición del crecimiento en las células que expresan B7H6) por el enlace a la membrana celular.

Para reducir al mínimo la actividad de un agente terapéutico fuera de una célula que expresa B7H6 (por ejemplo, una célula cancerosa que expresa B7H6) , un agente terapéutico es típicamente conjugado de una manera que reduce su actividad, a no ser que éste sea escindido del anticuerpo (por ejemplo, mediante hidrólisis o un agente de escisión) . En tales modalidades, el agente terapéutico es enlazado al anticuerpo con un ligador escindible que es sensible a la escisión en el ambiente intracelular de la célula que expresa B7H6, pero no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular , tal que el conjugado es escindido del anticuerpo cuando es internalizado por la célula que expresa B7H6 (por ejemplo, en el endosomal o, por ejemplo, en virtud de la sensibilidad al pH o la sensibilidad a la proteasa, en el ambiente lisosomal o en una caveolea) . (Ver Sección IV (A) , más adelante) .

Además, en ciertas modalidades, un conjugado anticuerpo- fármaco comprende un agente terapéutico que está cargado con relación a la membrana plasmática, con lo cual se reduce al mínimo adicionalmente la habilidad del agente para cruzar la membrana plasmática una vez que es internalizado por una célula. Como se utiliza en la presente, un "agente cargado" significa un agente que (a) es polarizado, tal que una región del agente tiene una carga relativa a la membrana plasmática, o (b) tiene una carga neta relativa a la membrana plasmática.

A. Ligadores Típicamente, un conjugado anticuerpo B7H6- fármaco comprende una región ligadora entre el agente terapéutico y el agente monoclonal anti-B7H6 humano. Como se anotó anteriormente, en ciertas modalidades, el ligador es escindible bajo condiciones intracelulares , tal que la escisión del ligador libera el agente terapéutico del anticuerpo en el ambiente intracelular .

Por ejemplo, en algunas modalidades, el ligador es escindible por un agente de escisión que está presente en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveolea) . El ligador puede ser, por ejemplo, un ligador peptidílico que es escindido por una peptidasa intracelular o una enzima proteasa, incluyendo, pero no limitado, a una proteasa lisosomal o endosomal. Típicamente, el ligador peptidílico es al menos de dos aminoácidos de longitud o de al menos de tres aminoácidos de longitud. Los agentes de escisión pueden incluir las catepsinas B y D y la plasmina, todas las cuales se sabe que hidrolizan los derivados de fármacos dipeptídicos dando como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células objetivo (ver, por ejemplo, Dubowchik y Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999) . Los más típicos son los ligadores peptidílicos que son escindibles por enzimas que están presentes en las células que expresan B7H6. Por ejemplo, un ligador peptidílico que es escindible por la proteasa dependiente de tiol, catepsina-B, que es altamente expresado en tejidos cancerosos, puede ser utilizado (por ejemplo, un Phe-Leu o un ligador Gly-Phe-Leu-Gly) . Otros de tales ligadores son descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,214,345. En modalidades específicas, el ligador peptidílico escindible por una proteasa intracelular es un ligador Val-Cit (valina-citrulina) o un ligador Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6,214,345, la cual describe la síntesis de la doxorrubicina con el ligador Val-Cit) . Una ventaja de utilizar la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico, es que el agente es típicamente atenuado cuando es conjugado, y las estabilidades séricas del conjugado son típicamente altas.

En otras modalidades, el ligador escindible es sensible al pH, por ejemplo, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Típicamente, un ligador sensible al pH es hidrolizable bajo condiciones ácidas. Por ejemplo, un ligador lábil al ácido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, o similares) puede ser utilizado. (Ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,122,368; 5,824,805; ' 5,622,929; Dubowchik y alker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999; Neville et al, Biol. Chem. 264:14653-14661, 1989) . Tales ligadores son relativamente estables bajo condiciones de pH neutros, tales como aquellas en la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5.5 ó 5.0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertas modalidades, el ligador hidrolizable es un enlazador tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter enlazado al agente terapéutico vía un enlace de acilhidrazona (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5, 622, 929) ) .

En otras modalidades, el ligador es escindible bajo condiciones reductoras (por ejemplo, un ligador disulfuro) . Una variedad de ligadores disulfuro son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, aquellos que pueden ser formados utilizando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato) , SPDP (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato) , SPDB (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridilditio) tolueno) , SPDB y SMPT. (Ver, por ejemplo, Thorpe et al., Cáncer Res. 47:5924-5931, 1987; awrzynczak et al, En Immunoconjugates : Antibodies Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cáncer (C. . Vogel ed. , Oxford U. Press, 1987. Ver también Patente de los Estados Unidos No. 4,880,935).

En otras variaciones más, el ligador es un ligador de malonato (Johnson et al, Anticancer Res. 15:1387-93, 1995) , un ligador de maleimidobenzoilo (Lau et al, Bioorg-Med-Chem. 3:1299-1304, 1995), o un análogo de 3 ' -N- mida (Lau et al., Bioorg-Med-Chem. 3:1305-12, 1995).

Típicamente, el ligador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular . Como se utiliza en la presente, "no sustancialmente sensible al ambiente extracelular", en el contexto de un ligador, significa que no más de aproximadamente 20%, típicamente no más de aproximadamente 15%, más típicamente no más de aproximadamente 10%, y aún más típicamente no más de aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 3%, o no más de aproximadamente 1% de los ligadores, en una muestra de un conjugado anticuerpo-fármaco, son escindidos cuando el conjugado anticuerpo- fármaco está presente en un ambiente extracelular (por ejemplo, en el plasma) . Si un ligador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular, esto puede ser determinado, por ejemplo, mediante la incubación independientemente con plasma en (a) del conjugado anticuerpo-fármaco (la "muestra del conjugado anticuerpo-fármaco") y (b) una cantidad molar igual del anticuerpo no conjugado o el agente terapéutico (la "muestra control") por un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16, ó 24 horas) y luego comparando la cantidad del anticuerpo no conjugado o del agente terapéutico presentes en la muestra del conjugado anticuerpo-fármaco, con aquel presente en la muestra control, como se mide, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.

En algunas variaciones, el ligador promueve la internalización celular. En ciertas modalidades, el ligador promueve la internalización celular cuando es conjugado al agente terapéutico (por ejemplo, en el medio de la porción ligador-agente terapéutico del conjugado anticuerpo-fármaco) . En otras modalidades, el ligador promueve la internalización celular cuando es conjugado al agente terapéutico y al anticuerpo anti-B7H6 (por ejemplo, en el medio del conjugado anticuerpo- fármaco) .

Una variedad de ligadores que pueden ser utilizados con las presentes composiciones y métodos se describe en, por ejemplo, el documento WO 2004/010957, titulado "Conjugados de Fármaco y su Uso para Tratar el Cáncer, un Trastorno Autoinmunitario o un Trastorno Infeccioso" .

B. Agentes Terapéuticos De acuerdo con la presente invención, cualquier agente que ejerza un efecto terapéutico sobre una célula que expresa B7H6 puede ser utilizado como el agente terapéutico para la conjugación a un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano. En ciertas modalidades, tal como para el tratamiento de un cáncer que expresa B7H6, el agente terapéutico es un agente citotóxico.

Las clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas , enlazadores del canal menor de ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino, tales como cis-platino, mono (platino) , bis (platino) y complejos de platino tri-nucleares y carboplatino) , antraciclinas , antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas , etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas , platinóles, compuestos de pre- formación, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de la radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de vincapervinca, o similares.

Los agentes citotóxicos individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC) , asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU) , CC-1065 (Li et al, Cáncer Res. 42:999-1004, 1982), clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinósido de citidina, citochalasina B, dacarbazina, dactinomicina (antiguamente actinomicina) , daunorrubicina, dacarbazina, docetaxel, doxorrubicina, un estrógeno, 5 - fluordeoxiuridina, fosfato de etopósido (VP-16) , 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU) , mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol , paclitaxel, plicamicina, procarbazina, estreptozotocina, tenopósido (VM-26) , 6-tioguanina, tioTEPA, topotecan, vinblastina, vincristina, y vinorelbina.

Los agentes citotóxicos particularmente adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE) , enlazadores del canal menor de ADN (por ejemplo, enediinas y lexitropsinas) , duocarmicinas , taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel) , puromicinas, alcaloides de vincapervinca, CC-1065, SN-38 (7-etil-10-hidroxi-camptoteina) , topotecan, morfolino-doxor ubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas , ceraadotina, maitansinoides , discodermólido, eleuterobina, y mitoxantrona .

En ciertas modalidades, un agente citotóxico es un agente quimioterapéutico convencional tal como, por ejemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalan, alcaloides de vincapervinca, metotrexato, mitomicina C o etopósido. Además, los agentes potentes tales como los análogos de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina, y palitoxina pueden ser enlazados a un anticuerpo que expresa anti-B7H6.

En variaciones específicas, el agente citotóxico o citostático es auristatina E (también conocido en la técnica como dolastatina 10) o un derivado del mismo. Típicamente, el derivado de auristatina E es, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, la auristatina E puede hacerse reaccionar con el ácido paraacetilbenzoico o el ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados de auristatina típicos incluyen AFP (dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina- fenilalanina-p- fenilendiamina) , MMAF (dovalina-valina-dolaisoleucina-dolaprolina-fenilalanina) , y MAE (monometil-auristatina E) . La síntesis y la estructura de la auristatina E y sus derivados se describen en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Application Publicación No. 20030083263; las Publicaciones de Patentes Internacionales Nos. WO 2002/088172 y WO 2004/010957; y las Patentes de los Estados Unidos NOS. 6,884,869; 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; y 4,486,414.

En otras variaciones, el agente citotóxico es un agente de enlace al canal menor de ADN. (Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,130,237). Por ejemplo, en ciertas modalidades, el agente de enlace al canal menor es un agente CBI. En otras modalidades, el agente de enlace al canal menor es una enediina (por ejemplo, caliqueamicina) .

En ciertas modalidades, un conjugado anticuerpo-fármaco comprende un agente antitubulina. Los ejemplos de agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel) , Taxotere® (docetaxel) ) , T67 (Tularik) , alcaloides de vincapervinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, y vinorelbina) , y dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB) . Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (por ejemplo, epotilona A y B) , nocodazol, colchicina y colcimid, estramustina, criptofisinas , cemadotina, maitansinoides, combretastatinas , discodermólido, y eleuterobina . En algunas modalidades, el agente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo más de agentes antitubulinas . Por ejemplo, en modalidades específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; ver también Chari et ah, Cáncer Res. 52 : 127-131, 1992) .

En otras modalidades, el agente citotóxico es un antimetabolito . El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (por ejemplo, azotioprina o micofenolato mofetil) , un inhibidor de la dihidrofolato-reductasa (por ejemplo, metotrexato) , aciclovir, ganciclovir, zidovudina, vidarabina, riba virina, azidotimidina, arabinósido de citidina, amantadina, didesoxiuridina, yododeoxiuridina, poscarnet, o trifluridina .

C. Formación de Conjugados Anticuerpo An i -B7H6-Fármaco La generación de los conjugados anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco puede ser lograda mediante cualquier técnica conocida para el experto en la materia. En resumen, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano, un fármaco, y opcionalmente un ligador que une el fármaco y el anticuerpo. Un número de diferentes reacciones están disponibles para el enlace covalente de los fármacos a los anticuerpos. Esto es a menudo logrado por la reacción de los residuos de aminoácidos de la molécula de anticuerpo incluyendo los grupos amina de la lisina, los grupos ácido carboxílico libres del ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de la cisteína, y las diversas porciones de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos no específicos más comúnmente utilizados del enlace covalente es la reacción de carbodiimida para enlazar un grupo carboxilo (o amino) de un compuesto a los grupos amino (o carboxilo) del anticuerpo. Además, los agentes bifuncionales tales como los dialdehídos o imidoésteres han sido utilizados para enlazar el grupo amino de un compuesto a los grupos amino de la molécula de anticuerpo. También disponible para el enlace de los fármacos a los anticuerpos está la reacción con base de Schiff. Este método involucra la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxilo, formando de este modo un aldehido que se hace reaccionar luego con la molécula de anticuerpo. El enlace ocurre vía la formación de una base de Schiff con los grupos amino de la molécula de anticuerpo. Los isotiocianatos pueden ser utilizados como agentes de acoplamiento para enlazar covalentemente fármacos a los anticuerpos . Otras técnicas son conocidas por aquellos expertos en la materia y están dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos no limitantes de tales técnicas se describen en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,665,358; 5,643,573; y 5,556,623.

En algunas modalidades, un intermediario, el cual es el precursor del ligador, se hace reaccionar con el fármaco bajo condiciones apropiadas. En ciertas modalidades, los grupos reactivos son utilizados sobre el fármaco y/o el intermediario. El producto de la reacción entre el fármaco y el intermediario, o el fármaco derivatizado, se hace reaccionar subsecuentemente con el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano bajo condiciones apropiadas.

D. Ensayos para Actividades Citotóxicas o Citostáticas En ciertas modalidades, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano conjugado a un agente citotóxico, tal que el conjugado anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citotóxico o citostático sobre una célula que expresa B7H6 (por ejemplo, una célula cancerosa que expresa B7H6) . Las células que expresan B7H6 que pueden ser evaluadas para un efecto citotóxico o citostático de un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco pueden ser líneas celulares de cultivo tales como, por ejemplo, aquellas listadas en la Tabla 5, más adelante. Una vez que un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco es confirmado como ejecutor de un efecto citotóxico o citostático sobre las células que expresan B7H6, su valor terapéutico puede ser validado en un modelo animal apropiado.

En modalidades preferidas, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco que comprende un agente citotóxico es utilizado para tratar un cáncer que expresa B7H6. Los modelos animales ejemplares de diversos cánceres, que pueden ser utilizados para evaluar la eficacia terapéutica de un conjugado anticuerpo- fármaco de la presente invención, se describen en la Sección V(B) y en los Ejemplos X, más adelante .

Los métodos para determinar si un agente ejerce o no un efecto citostático o citotóxico sobre una célula son en general conocidos en la técnica. Los ejemplos ilustrativos de tales métodos son descritos más adelante. La determinación de cualquiera de estos efectos sobre las células que expresan B7H6 indica que un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco, es útil en el tratamiento o prevención de trastornos o enfermedades que tienen una patología mediada, al menos en parte, por el crecimiento aberrante o la activación de células que expresan B7H6, tal como, por ejemplo, un cáncer que expresa B7H6.

Para determinar si un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco ejerce un efecto citostático sobre las células que expresan B7H6, puede ser utilizado un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, las células que expresan B7H6, a una densidad de 5,000 células/pozo de una placa de 96 pozos, pueden ser cultivadas por un periodo de 72 horas y expuestas a 0.5 yCi de 3H-timmidina durante las 8 horas finales del periodo de 72 horas, y la incorporación de la 3H-timidina dentro de las células del cultivo es medida en presencia y ausencia del conjugado anticuerpo-fármaco .

Para determinar la citotoxicidad, se puede medir la necrosis o la apoptosis (muerte celular programada) . La necrosis es típicamente acompañada por permeabilidad incrementada de la membrana plasmática, hinchazón de la célula, y ruptura de la membrana plasmática. La apoptosis es típicamente caracterizada por la formación de ampollas en la membrana, condensación del citoplasma y la activación de endonucleasas endógenas.

La viabilidad celular puede ser medida médiate la determinación en una célula de la absorción de un colorante tal como rojo neutro, azul de tripan, o AlamarBlue® (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH) . Ver, también, por ejemplo, Page et al., Intl. J. of Oncology 3:473-476, 1993. En tal ensayo, las células son incubadas en medio que contiene el colorante, las células son lavadas, y el colorante remanente, que refleja la absorción celular del colorante, es medida, espectrofotométricamente . El colorante sulforrodamina B (SRB) que se enlaza a las proteínas, puede ser también utilizado para medir la citotoxicidad (Skehan et al., J. Nat'l Cáncer Inst. 82:1107-12, 1990).

Alternativamente, se utiliza una sal de tetrazolio, tal como MTT, en un ensayo calorimétrico cuantitativo para la supervivencia y proliferación celulares en mamífero, por detección de las células vivas, pero no muertas (ver, por ejemplo, Mosmann, J. Immunol . Methods 65:55-63, 1983).

La apoptosis puede ser cuantificada mediante la medición, por ejemplo, de la fragmentación del ADN. Están disponibles los métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa in vitro de la fragmentación del ADN. Los ejemplos de tales ensayos, incluyendo los ensayos TUNEL (el cual detecta la incorporación de los nucleótidos marcados en el ADN fragmentado) y ensayos basados en ELISA, son descritos en Biochemica, 1999, no. 2, pp . 34-37 (Roche Molecular Biochemicals) .

La apoptosis puede ser también determinada por la medición de los cambios morfológicos en una célula. Por ejemplo, como con la necrosis, la pérdida de la integridad de la membrana plasmática puede ser determinada por la medición de la absorción de ciertos colorantes (por ejemplo, un colorante fluorescente tal como, por ejemplo, naranja de acridinio o bromuro de etidio) . Un método para medir el número de células apoptóticas ha sido previamente descrito por Duke y Cohén, Current Protocols In Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Las células pueden ser también marcadas con un colorante de ADN (por ejemplo, naranja de acridina, bromuro de etidio o yoduro de propidio) y las células observadas para la condensación de cromatina y la marginación a lo largo de la membrana nuclear interna. Otros cambios morfológicos que pueden ser medidos para determinar la apoptosis incluyen, por ejemplo, la condensación citoplásmica, la formación incrementada de ampollas en la membrana, y el encogimiento celular.

La presencia de células apoptóticas puede ser medida en los compartimientos adheridos y "flotantes" de los cultivos. Por ejemplo, ambos compartimientos pueden ser recolectados mediante el retiro del sobrenadante, la tripsinización de las células adheridas, la combinación de las preparaciones después de un paso de lavado con centrifugación (por ejemplo, 10 minutos, 2000 rpm) , y detectando la apoptosis (por ejemplo, mediante medición de la fragmentación del ADN) . (Ver, por ejemplo, Piazza et al., Cáncer Research 55:3110-16, 1995) .

V. Métodos de Uso A. General En otro aspecto más, la presente invención proporciona los métodos para modular la actividad (por ejemplo, actividad citolítica) de una célula que expresa NKp30, incluyendo por ejemplo, las células asesinas naturales (NK) y las células T (por ejemplo, las células CD8+) . Tales métodos incluyen, por ejemplo, los métodos para el tratamiento de trastornos o enfermedades asociadas con la actividad incrementada de una célula que expresa NKp30. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos capaces de competir por el enlace a B7H6 con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de (i) el hibridoma del clon 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) ; (ii) el hibridoma del clon 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243) ; (iii) el hibridoma del clon 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244); y (iv) el hibridoma del clon 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) . En variaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico y humanizado derivado de un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (i)-(iv) anteriores.

En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son para el uso en la interferencia con la interacción de B7H6 con NKp30. Para el uso en tales modalidades, los métodos comprenden poner en contacto una célula que expresa B7H6 funcional, en presencia de una célula que expresa NKp30, con una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano u otro agente capaz de interferir con la interacción de B7H6 con NKp30. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos capaces de competir por el enlace a B7H6 con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del (i) el hibridoma del clon 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242) o (ii) el hibridoma del clon 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) . En variaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o- humanizado derivado de un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del (i) y (ii) anteriores. Tales métodos pueden ser realizados vi tro, ex vivo, o in vivo. En ciertas variaciones preferidas, la célula que expresa NKp30 es una célula NK y el uso o el método de modulación de la actividad de las células NK podría ser, por ejemplo, en el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociada con la actividad incrementada de las células NK. En otras variaciones, la célula que expresa NKp30 es una célula T que expresa NKp30 (por ejemplo, una célula T CD8+) y el uso o el método de modulación de la actividad de las células T que expresan NKp30 podría ser, por ejemplo, para el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociada con la actividad incrementada de las células T que expresan NKp30. Ciertas células T, incluyendo las células T CD8+, han mostrado que expresan NKp30. (Ver, por ejemplo, Srivastava y Srivastava, Leuk. Res. 30:37-46, 2006) .

Como se anotó anteriormente, en variaciones particulares, los anticuerpos de la presente invención son para el uso en el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociada con la actividad de las células NK. Por ejemplo, en algunas modalidades, el método de uso de los anticuerpos incluye administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano, capaz de interferir con la interacción de B7H6 con NKp30 a un sujeto que sufre de, o está en riesgo elevado de . desarrollar, un trastorno o enfermedad mediado por células NK (por ejemplo, el rechazo de aloinjerto mediado por células NK tal como, por ejemplo, el rechazo del aloinjerto de células de médula ósea (BMC) mediado por células NK. En la presente invención se ejemplifica un método que comprende un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano utilizado para suprimir el rechazo de aloinjerto de médula ósea mediado por células NK. El trasplante de médula ósea (BMT) se ha vuelto un método aceptado de terapia para el tratamiento de diversas malignidades hematológicas . La eficacia del BMT alogénico está limitado,' no obstante, por ciertos obstáculos tales como, por ejemplo, el rechazo del injerto. Existe amplia evidencia de que las células NK son una barrera para la injertación de los aloinjertos de médula ósea y que éstas solas pueden mediar la especificidad del rechazo de las BMC en ratones. (Ver, por ejemplo, Murphy et al, J. Exp. Med. 165:1212-1217, 1987; Murphy et al, J. Exp. Med. 166:1499-1509, 1987; Murphy et al, J. Immunol . 144:3305-3311, 1990; Murphy et al, Eur. J. Immunol. 20:1729-1734, 1990; Murphy et al, Immunol. Rev. 181:279-289, 2001) . Clínicamente, la resistencia al aloinjerto, observado en pacientes con SCID quienes han recibido BMTs sin concordancia de HLA, agotadas de células T, sin acondicionamiento citorreductor es atribuida a la alta actividad de las células NK provenientes del donador. (Ver O'Reilly et al, Vox. Sang. 51:81-86, 1986) . En consecuencia, los anticuerpos contra el dominio extracelular de B7H6 y capaces de inhibir la interacción de B7H6 con NKp30, como se describe en la presente, pueden ser utilizados durante BMT para inhibir la actividad citolítica de las células NK contra los aloinjertos, y con esto tratar o prevenir el rechazo del aloinjerto de BMC.

En otras modalidades adicionales, un anticuerpo monoclonal anti-B7H5 humano es utilizado para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra la células que expresan B7H6, tal como, por ejemplo, para el tratamiento de un trastorno o enfermedad caracterizada por la presencia de las células que expresan B7H6. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano es utilizado para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra las células cancerosas que expresan B7H6s. La terapia con anticuerpo ha sido particularmente exitosa en el tratamiento del cáncer, debido a que ciertos tumores muestran ya sea antígenos únicos, antígenos específicos de línea, o bien antígenos presentes en cantidades excesivas con relación a las células normales. La evidencia experimental demuestra que B7H6 es, con relación a los tejidos normales, altamente expresado por muchas líneas celulares derivadas de tumores, incluyendo las líneas celulares derivadas de cánceres del colon, hígado, cérvix, pulmón, páncreas, y próstata, así como aquellas derivadas de diversos cánceres de la sangre tales como la leucemia prohemocítica, linfoma de células B, linfoma monocítico, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, o leucemia mielogénica crónica. Esta evidencia indica que B7H6 es un novedoso antígeno específico de tumor o asociado al tumor, y que un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano puede ser utilizado como un agente terapéutico anti- tumoral . Uno de los mecanismos asociados con la actividad anti-tumoral de la terapia con el anticuerpo monoclonal, es la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . En la ADCC, los anticuerpos monoclonales se enlaza a una célula objetivo (por ejemplo, una célula de cáncer) y a células efectoras específicas que expresan los receptores para el anticuerpo monoclonal (por ejemplo, las células NK, células T CD8+, monocitos, granulocitos) se enlazan al complejo anticuerpo monoclonal/célula objetivo, dando como resultado la muerte de la célula objetivo.

En consecuencia, en algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe con función efectora, es utilizada para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra una célula que expresa B7H6. Los métodos para inducir ADCC incluyen en general poner en contacto la célula que expresa B7H6 con una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe que tiene actividad de ADCC, en donde el paso de puesta en contacto es en presencia de una célula efectora inmunitaria citolítica, que expresa un receptor Fe que tiene actividad citolítica. Las células efectoras inmunitarias que expresan receptores de Fe citolíticos (por ejemplo, FcyRIIIct o CD16) incluyen, por ejemplo, las células NK así como ciertas células T CD8+. Los métodos para inducir la CDC en general incluyen poner en contacto la célula que expresa B7H6 con una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe que tiene actividad de CDC, en donde el paso de contacto es en presencia del complemento. Las células que expresan B7H6 que puede ser objetivos para la muerte utilizando tales métodos incluyen, por ejemplo, células de cáncer, tales como, por ejemplo, células de cáncer de colon, células de cáncer de hígado, células de cáncer cervical, células de cáncer pulmonar, células de cáncer pancreático, células de cáncer de próstata, células de leucemia prohemocítica, célula de linfoma de células B, células de linfoma monocítico, células de eritroleucemia, células de linfoma de Burkitt, y células de leucemia mielogénica crónica, por nombrar unas pocas. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos capaces de competir por el enlace a B7H6 con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de (i) el hibridoma del clon 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242); (ii) el hibridoma del clon 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243) ; (iii) el hibridoma del clon 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244); y (iv) el hibridoma del clon 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245). En algunas modalidades, el anticuerpo es capaz de competir por el enlace a B7H6 con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (ii)-(iii) anteriores. En variaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado derivado de un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (i)-(iv) anteriores, o seleccionado de (ii) - (iii) anteriores.

En modalidades relacionadas, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe con función efectora, como se describe en la presente, es utilizado para tratar un cáncer que expresa B7H6 en un sujeto. Tales métodos incluyen en general administrarle a un sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano que comprende una región Fe que tiene actividad de ADCC y/o actividad de CDC. Los cánceres que expresan B7H6, particularmente adecuados para el tratamiento utilizando tales métodos incluyen, por ejemplo, cánceres del colon, hígado, cérvix, pulmón, páncreas, o próstata, así como cánceres de la sangre, tales como, 5por ejemplo, leucemia prohemocítica, linfoma de células B, linfoma monocítica, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, o leucemia mielogénica crónica.

En otras modalidades adicionales, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- fármaco (Ver Sección IV, anterior) es utilizado para distribuir un agente terapéutico a una célula que expresa B7H6, donde el agente ejerce un efecto terapéutico. Tales métodos son particularmente útiles para el tratamiento de trastornos o enfermedades caracterizadas por la presencia de las células que expresan B7H6. En ciertas variaciones preferidas utilizando un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano- ármaco, el agente terapéutico es un agente citotóxico que ejerce un efecto citotóxico o citostático sobre una célula que expresa B7H6 , tal como una célula cancerosa que expresa B7H6. Como se indicó anteriormente, la evidencia experimental demuestra que B7H6 es, con relación a los tejidos normales, altamente expresado por muchas línea celulares derivadas de tumores, incluyendo las líneas celulares derivadas de cánceres del colon, hígado, cérvix, pulmón, páncreas, y próstata, así como aquellas derivadas de los diversos cánceres de la sangre tales como la leucemia prohemocítica, linfoma de células B, linfoma monocítica, eritroleucemia, linfoma de Burkitt, o leucemia mielogénica crónica. Esta evidencia indica que B7H6 es un novedoso antígeno específico de tumor o asociado de tumor, útil para dirigir agentes que tengan eficacia terapéutica en el tratamiento del cáncer, particularmente agente citotóxicos que pueden agotar o inhibir el crecimiento de las células tumorales. En consecuencia, en algunas modalidades, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco, que comprende un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano conjugado a un agente citotóxico, es utilizado para tratar el cáncer que expresa B7H6. Los conjugados anticuerpo-fármaco adecuados, incluyen aquellos que comprenden un anticuerpo capaz de competir por el enlace a B7H6 con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de (i) el hibridoma del clon 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242); (ii) el hibridoma del clon 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); (iii) el hibridoma del clon 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244); y (iv) el hibridoma del clon 17B 1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) . En algunas modalidades, el conjugado anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo que es capaz de competir por el enlace a B7H6 con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (ii)-(iii) anteriores. En variaciones particulares, el conjugado anticuerpo- fármaco comprende un anticuerpo quimérico o humanizado derivado de un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (i)-(iv) anteriores o seleccionado de (ii)-(iii) anteriores.

En cada una de las modalidades de los métodos de tratamiento descritos en la presente, el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H5 humano-fármaco es distribuido de una manera consistente con las metodologías convencionales asociadas con el manejo del trastorno o enfermedad para el cual se busca tratamiento. De acuerdo con la descripción de la presente, una cantidad efectiva del anticuerpo o del conjugado anticuerpo-fármaco, es administrada a un sujeto en necesidad de tal tratamiento por un tiempo y bajo condiciones suficientes para prevenir o para tratar el trastorno o enfermedad.

Los sujetos para la administración de los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humanos o los conjugados anticuerpo-fármaco como se describen en la presente incluyen pacientes en riesgo más alto de lo normal para desarrollar un trastorno o enfermedad mediado por las células que expresan NKp30, o caracterizado por la presencia de las células que expresan B7H6, así como los pacientes que presentan un trastorno o enfermedad existente. En ciertas modalidades en donde el sujeto no está sufriendo todavía de un trastorno o enfermedad, el uso es para la selección o diagnóstico. En otras ciertas modalidades, el sujeto ha sido diagnosticado como poseedor del trastorno o enfermedad para la cual se busca tratamiento. Además, los sujetos pueden ser monitorizados durante el curso de tratamiento para cualquier cambio en el trastorno o enfermedad (por ejemplo, para un incremento o disminución en los síntomas clínicos del trastorno o enfermedad) .

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas (medicamentos) son administradas a un paciente susceptible de, o de otro modo en riesgo de, un trastorno particular en una cantidad suficiente para eliminar o para reducir el riesgo o retrasar el inicio de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un paciente sospechoso de, o que sufre ya de tal trastorno, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas del trastornos y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto es denominada como una dosis o cantidad terapéutica o farmacéuticamente efectiva. En los regímenes profilácticos y terapéuticos, un anticuerpo o el conjugado anticuerpo- fármaco es usualmente administrado en varias dosis hasta que ha sido lograda una respuesta suficiente (por ejemplo, el disparo de la actividad apropiada de las células NK o la inhibición de la actividad inapropiada de las células NK) . Típicamente, la respuesta es administrada y son administradas dosis repetidas y la respuesta deseada comienza a decaer.

Para variaciones de la presente invención donde el uso es de diagnóstico o de selección para el riesgo elevado de un sujeto que todavía no sufre del trastorno o enfermedad mediado por las células que expresan NKp30 o caracterizado por la presencia de las células que expresan B7H6, es tomada una muestra biológica del sujeto y comparada a una muestra biológica proveniente de sujetos normales o saludables, o un nivel básico predeterminado. El riesgo de desarrollar cáncer es determinado por la detección de un nivel más alto en la muestra del sujeto que la que es encontrada en la muestra biológica comparable proveniente de sujetos normales o saludables o de nivel básico. Los métodos de detección de las composiciones anticuerpos de la presente invención se describen en la Sección V.C.

Las composiciones y los métodos de la presente invención puede ser utilizados para monitorizar el progreso de la terapia en una muestra biológica proveniente de un sujeto a diversos tiempos después del trasplante de médula ósea o en diversos tiempos de haber sido administrado con un fármaco anti-canceroso o una terapia anti-cancerosa . El nivel de B7H6 detectado en una muestra biológica proveniente de un sujeto, es detectado como antes del tratamiento (TI) y comparado a una muestra biológica proveniente del mismo sujeto, tomada a un segundo tiempo (T2) ; después del tratamiento. Un nivel más alto de B7H6 general indica la progresión del trastorno y un nivel más bajo de B7H6 indica la regresión.

Para identificar a los pacientes objetivo para la selección o el tratamiento de acuerdo a los métodos de la invención, los métodos de selección aceptados pueden ser empleados para determinar los factores de riesgo asociados con trastornos o enfermedades específicas mediados por las células que expresan NKp30 o caracterizados por la presencia de las células que expresan B7H6, o para determinar el estado de un trastorno existente identificado en un sujetos. Tales métodos pueden incluir, por ejemplo, determinar si un individuo tiene parientes quienes han sido diagnosticados con un trastorno particular. Los métodos de selección pueden también incluir, por ejemplo, tratamientos convencionales para determinar el estado familiar para un trastorno particular conocido por tener un elemento heredable (por ejemplo, en el caso de BMT, los estudios clínicos han mostrado que la presencia de ciertos alelos de HLA-C correlaciona con un riesgo incrementado para el rechazo del aloinjerto de BM (Ver Scott et al., Blood 92:4864-4871, 1998) y se sabe también que diversos cánceres tienen ciertos componentes heredables) . Los componentes heredables de los cánceres incluyen, por ejemplo, mutaciones en múltiples genes que son transformantes (por ejemplo, Ras, Raf, EGFR, cMet y otros) , la presencia o ausencia e ciertas moléculas del receptor inhibitorio de HLA y de muerte (KIR, por sus siglas en inglés) , o mecanismos mediante los cuales las células cancerosas son capaces de modular la supresión inmunitaria de las células como las células NK y las células T, ya sea directamente o indirectamente (ver, por ejemplo, Ljunggren y Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton y Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007). Hacia este fin, las sondas de nucleótidos pueden ser rutinariamente empleadas para identificar los individuos que poseen marcadores genéticos asociados con un trastorno particular de interés. Además, una amplia variedad de métodos inmunológicos son conocidos en la técnica los cuales son útiles para identificar a los marcadores para trastornos específicos. Por ejemplo, diversos métodos de inmunoensayo de ELISA están disponibles y son bien conocidos en la técnica, los cuales emplean sondas de anticuerpo monoclonal para detectar los antígenos asociados con tumores específicos. La selección puede ser implementada como es indicado por la sintomatología conocida del paciente, factores de edad, factores de riesgo relacionados, etc. Estos métodos permiten al clínico seleccionar rutinariamente a los pacientes en necesidad de los métodos descritos en la presente para el tratamiento. De acuerdo con estos métodos, la modulación de la actividad de las células NK puede ser implementada con un programa de tratamiento independiente o como un régimen de tratamiento de seguimiento, adjunto o coordinado, para otros tratamientos.

B . ¦ Tratamiento del Cáncer 1. Tipos de Cáncer Como se describe y se muestra por los estudios de la presente, un anticuerpo B7H6 puede ser utilizado para dirigir la muerte de una célula que expresa B7H6 por activación de la vía de ADCC o CDC a través del enlace de Fe a los receptores de Fe y la proteína del complemento, Clq. En otras variaciones adicionales, un conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco, que comprende un agente citotóxico conjugado a un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano, puede ser utilizado para distribuir un agente citotóxico a las células cancerosas que expresan B7H6, donde el agente citotóxico ejerce un efecto terapéutico por agotamiento o inhibición del crecimiento de las células cancerosas .

La Tabla 4 siguiente lista algunos cánceres adecuados para el tratamiento de acuerdo con la presente invención , organizados predominantemente por objetivo Tabla 4 : Lista de Tipos de Cánceres Ejemplares 1. Cáncer de cabeza de cuello a . Cerebro b. Cavidad oral c . Orofaringe d. Nasofaringe e . Hipofaringe f . Cavidades nasales y senos paranasales g- Laringe h. Labios eres Pulmonares a . Carcinoma no microcítico b. Carcinoma microcítico eres del Tracto Gastrointestinal a . Cáncer colorrectal b. Cáncer gástrico c . Cáncer esofágico d. Cáncer anal e . Cáncer del conducto biliar extrahepático f . Cáncer de la ampolla de Vater g- Tumor Estromal Gastrointestinal (GIST, por sus siglas en inglés) er de Hígado a . Adenoma de células hepáticas b. Carcinoma hepatocelular er de Mama er Ginecológico a. Cáncer cervical b. Cáncer de ovario c . Cáncer vaginal d. Cáncer vulvar e . Neoplasia tromboblástica gestacional f . Cáncer uterino er del Tracto Urinario a. Carcinoma de cáncer renal b. Cáncer de próstata c . Cáncer de vejiga urinaria d. Cáncer de pene e . Cáncer de uretra áncer de la Vej iga Urinaria umores Neurológicos a . Astrocitoma y glioblastoma b. Linfoma primario del SNC c . Meduloblastoma d. Tumores de células germinales e . Retinoblastoma Neoplasmas Endocrinos a . Cáncer de tiroides b. Cáncer pancreático 1) Tumores de las células de los islotes a) Insulinomas b) Glucagonomas c . Feocromocitoma d. Carcinoma adrenal e . Tumores carcinoides f . Carcinoma de paratiroides g. Neoplasmas de glándula pineal Cánceres de piel a . Melanoma maligno b. Carcinoma de células escamosas c . Carcinoma de células básales d. Sarcoma de Kaposi Cánceres de Hueso a . Osteoblastoma b. Osteocondroma c . Osteosarcoma plasmas del Tejido Conectivo a. Condroblastoma b . Condroma ignidades Hematopoyéticas a . Linforna no Hodgkin 1) Linforna de células B 2) Linforna de células T 3) Linforna no diferenciado b. Leucemias 1) Leucemia mielogénica crónica 2) Leucemia de células pilosas 3) Leucemia linfocítica crónica 4) Leucemia mielomonocítica crónica 5) Leucemia mielocítica aguda 6) Leucemia linfoblástica aguda c. Trastornos mieloproliferativos 1) Mieloma múltiple 2) Trombocitopenia esencial 3) Mielofibrosis con metaplasia mieloide 4) Síndrome hipereosinofílico 5) Leucemia eosinofílica crónica 6) Policitemia Vera d. Linforna de Hodgkin ceres de la Niñez a. Leucemia y linfornas b. Cánceres de cerebro c. Neuroblastoma d. Tumor de Wilm (nefroblastoma) e . Rabdomiosarcoma f . Retinoblastoma 16. Cánceres Inmunoterapéuticamente Sensibles a . Melanoma b. Cáncer de riñon c . Leucemias, linfornas y mielomas d. Cáncer de mama e . Cáncer de próstata f . Cáncer colorrectal g- Cáncer cervical h. Cáncer de ovario i . Cáncer pulmonar Algunos de los cánceres listados anteriormente, incluyendo algunos de los modelos animales relevantes para evaluar los efectos de un anticuerpo anti-B7H6 o el conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la presente invención sobre las respuestas tumorales, se discuten con más detalle más adelante . a. Leucemia Mieloide Crónica D La leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés) es un tipo raro de cáncer que afecta principalmente a los adultos. Éste es un cáncer de los granulocitos (un tipo predominante de célula sanguínea blanca) . En la CML muchos granulocitos son producidos y liberados hacia la sangre cuando éstos están inmaduros y son incapaces de funcionar adecuadamente. Las células sanguíneas blancas inmaduras son conocidas como blastos . La producción de otros tipos de células sanguíneas es también perturbada. Normalmente, las células sanguíneas blancas se reparan y se reproducen por sí mismas de una manera ordenada y controlada, pero en la leucemia mieloide crónica el proceso es descontrolado y las células continúan dividiéndose y madurando anormalmente. El trastorno usualmente se desarrolla muy lentamente, y es considerada leucemia mieloide crónica.

Debido a que la CML progresa lentamente, ésta es difícil de detectar en sus etapas tempranas . Algunas veces ésta es descubierta solo cuando es realizada una prueba de sangre por otra razón. Los síntomas de CML son a menudo vagos, no específicos y provocados por el número incrementado de células sanguíneas blancas anormales en la médula ósea, y el número reducido de células sanguíneas normales, dando como resultado una sensación de saciedad o protuberancia blanda sobre el lado izquierdo del abdomen. En la CML, el bazo puede llegar a agrandarse. La hinchazón del bazo puede también provocar presión sobre el estómago, conduciendo a indigestión y apetito pobre que da como resultado anemia. Debido a un menor número de plaquetas en la sangre, algunas personas pueden percibir que ellos sangran o se magullan más fácilmente. Las "petequias" asociadas con CML, es un tipo especial de magulladura, donde pequeños puntos similares a sangre pequeña son observadas sobre las piernas o en la boca. Las mujeres pueden encontrar que sus periodos se vuelven mucho más pesados. Sin embargo, estos síntomas y signos son raros. La leucemia mieloide crónica puede ocurrir en cualquier edad, pero ésta más comúnmente afecta a personas de edad media y de edad más avanzada, y es rara en niños (National Cáncer Institute, "NTH Publicación No. 08-3775" Rockville, MD, Sept. 2008) . Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado de un anticuerpo-fármaco sobre la respuesta tumoral pueden ser evaluados, por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto tumoral humano, utilizando las células CML humanas injertadas en ratones inmunodeficientes (ver, por ejemplo, Ren, Leukemia and Lymphoma 8:1549-1561, 2002; Van Etten, Blood Cells Mol. Dis. 27:201-205, 2001; ong y Witte, Oncogene 20:5644-5659, 2001) . b. Mieloma Múltiple El mieloma múltiple es un tipo de cáncer que afecta ciertas células sanguíneas blancas llamadas células plasmáticas . En el cáncer que involucra las células plasmáticas, las células son todas anormales e idénticas y llamadas células de mieloma. Las células de mieloma tienden a recolectarse en la médula ósea y en la parte externa dura de los huesos . Algunas veces éstas se recolectan únicamente en un hueso y forman una masa simple, o tumor llamado un plasmacitoma . En la mayoría de los casos, no obstante, las células de mieloma se recolectan en muchos huesos, formando a menudo muchos tumores y provocando otros problemas . Cuando esto sucede el trastorno es llamado mieloma múltiple.

Debido a que las personas con mieloma múltiple tienen un número anormalmente grande de células plasmáticas idénticas, éstas tienen también demasiado de un tipo de anticuerpo. Estas células de mieloma y los anticuerpos pueden provocar un número de problemas médicos serios los cuales pueden incluir: (1) Conforme se incrementa el número de células de mieloma, éstas dañan y debilitan los huesos, provocando dolor y algunas veces fracturas. (2) Cuando los huesos son dañados, el calcio es liberado hacia la sangre. Esto puede conducir a hipercalcemia . La hipercalcemia puede provocar pérdida del apetito, nausea, sed, fatiga, debilidad muscular, falta de descanso y confusión. (3) Las células de mieloma previenen que la médula ósea forme células plasmáticas normales y otras células sanguíneas blancas importantes para el sistema inmunitario. Los pacientes pueden ser más susceptibles a la infección y a la enfermedad. (4) Las células cancerosas pueden también prevenir el crecimiento de nuevas células sanguíneas rojas, provocando anemia. (5) los pacientes con mieloma múltiple pueden tener problemas serios con sus ríñones . Las proteínas de anticuerpo en exceso y el calcio pueden prevenir que los ríñones filtren y limpien la sangre de manera adecuada. Los síntomas dependen de qué tan avanzada esté la enfermedad. En la etapa más temprana de la enfermedad, pueden no existir síntomas. Cuando los síntomas sí ocurren, los pacientes tienen comúnmente dolor óseo, a menudo en la espalda o en las costillas. Los pacientes también tienen huesos rotos, debilidad, fatiga, pérdida de peso o infecciones repetidas. Cuando el trastorno es avanzado los síntomas pueden incluir náusea, vómito, constipación, problemas con la micción, y debilidad o entumecimiento en las piernas (National Cáncer Institute, "NIH Publicación No. 08-1575" Rockville, MD, Sept. 2008) . Los efectos de un anticuerpo anti-B7H6 o el conjugado anticuerpo- fármaco sobre la respuesta tumoral pueden ser evaluados en un modelo de xenoinjerto de modelo humano en ratones inmunodeficientes, tal como se describe en Miyakawa et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 313:258-62, 2004. c. Linfoma No Hodgkin Existen dos tipos principales de linfoma. La enfermedad de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin. Existen aproximadamente 20 tipos diferentes del linfoma no Hodgkin. En la mayoría de los casos de la enfermedad de Hodgkin, una célula particular conocida como la célula de Reed-Sternberg es encontrada en las biopsias. Esta célula no es usualmente encontrada en otros linfornas, y da como resultado diferente tratamiento para los linfornas Hodgkin y no Hodgkin.

A menudo, el primer signo de un linfoma no Hodgkin es una hinchazón no dolorosa de un nodulo linfático en el cuello, la axila o la ingle. Otros síntomas pueden incluir cualquiera de los siguientes: sudoraciones nocturnas o fiebre inexplicable; pérdida de apetito, pérdida de peso inexplicable y cansancio excesivo; los niños pueden desarrollar una tos o insuficiencia respiratoria. Los pacientes pueden quejarse de dolor abdominal, o una hinchazón en el abdomen de un niño, o exantema persistente de la piel sobre todo el cuerpo (National Cáncer Institute, "NIH Publicación No. 07-1567" Rockville, MD, Sept . 2007). Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco sobre la respuesta tumoral pueden ser evaluados en un modelo de xenoinjerto de linfoma no Hodgkin, similar a aquel descrito en Ansell et al, Leucemia 18:616-23, 2004.

La clasificación de los linfomas no Hodgkin más comúnmente utilizada es el sistema de clasificación REAL (Ottensmeier, Chemico-Biological Interactions 135-136:653-664, 2001.) Los marcadores inmunitarios específicos han sido identificados para las clasificaciones de los linfomas. Por ejemplo, los marcadores del linfoma folicular incluyen CD20+, CD3-, CD10+, CD5-; los marcadores del linfoma linfocítico pequeño incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; los marcadores del linfoma de células B de la zona marginal incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD23-; los marcadores del linfoma de células B grandes difusas incluyen CD20+, CD3-; los marcadores del linfoma de las células epiteliales incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; los marcadores del linfoma de células T periféricas incluyen CD20-, CD3+; los marcadores del linfoma de células B grandes, mediastinales primarias incluyen CD20+, CD3-, los marcadores de linfoma linfoblástico incluyen CD20-, CD3+, Tdt+, y los marcadores del linfoma de Burkitt incluyen CD20+, CD3-, CD10+, CD5-(Decisión Resources, Non-Hodgkins Linfoma, Walt am, MA. , Feb. 2002) .

La clasificación clínica del linfoma no Hodgkin (NHL) por la International Working Formulation divide la enfermedad en subtipos: (1) la enfermedad de grado bajo (indolente) que incluye la linfocítica pequeña, consistente con la leucemia linfocítica crónica (SC) ; folicular, célula desintegrada predominantemente pequeña (FSC) ; folicular, célula desintegrada pequeña y grande mixtas (FM) ; (2) enfermedad de grado intermedio que incluye folicular, células predominantemente grandes (FL) ; difusa, células desintegradas pequeñas (DSC) ; células pequeñas y grandes mixtas, difusas (DM) ; células difusas, grandes desintegradas o no desintegradas (DL) ; y (3) enfermedad de alto grado que incluye células grandes, inmunoblásticas (IBL) ; linfoblástica, células convolucionadas o no convolucionadas (LL) ; y células no desintegradas pequeñas, Burkitt o no Burkitt (SNC; The Non-Hodgkin ' s Linfoma Pathologic Classification Project, Cáncer 49:2112-35, 1982). El sistema de Ann Arbor Staging es comúnmente utilizado para clasificar pacientes con NHL. La Etapa I significa el involucramiento de una región del nodo linfático simple o el involucramiento localizado de un órgano o sitio extralinfático simple. La Etapa II significa el involucramiento de dos o más regiones del nodulo linfático sobre el mismo lado del diafragma o el involucramiento localizado de un sitio u órgano extranodal y una o más regiones de nodulos linfáticos sobre el mismo lado del diafragma. La Etapa III significa el involucramiento de las regiones de los nodulos linfáticos sobre ambos lados del diafragma, posiblemente acompañado por el involucramieno localizado de un órgano o sitio extranodal. La Etapa IV significa involucramiento difuso o diseminado de uno o más órganos extranodales distantes o sin el involucramiento asociado del nodulo linfático ("Neoplasmas linfoides", En American Joint Committee on Cáncer. : AJCC Cáncer Staging Manual 6th ed. New York, NY: Springer, 2002, pp. 393-406). Se ha mostrado que el rituximab es efectivo en el tratamiento de los linfornas indolente y folicular (Boye et al, Annals of Oncol. 14:520-535, 2003). d. Cáncer cervical El cérvix es el cuello del útero que se abre hacia la vagina. El cáncer cervical, también denominado carcinoma cervical, se desarrolla a partir de células anormales sobre la superficie del cérvix y es uno de los cánceres más comunes que afectan a las mujeres. El cáncer cervical es usualmente precedido por displasia, cambios pre-cancerosos en las células sobre la superficie del cérvix. Estas células anormales pueden progresar a cáncer invasor. Una vez que el cáncer aparece, éste puede progresar a través de cuatro etapas. Las etapas son definidas por el grado de dispersión del cáncer. Entre más esté disperso el cáncer, más probable es que el tratamiento sea más extenso. Existen 2 tipos principales de cáncer cervical: (1) Tipo escamoso (cáncer epidermoide) : Éste es el tipo más común, que representa aproximadamente 80% a 85% de los cánceres cervicales. Este cáncer puede ser provocado por enfermedades sexualmente transmitidas. Una de las tales enfermedades sexuales es el papilomavirus humano, el cual provoca arrugas venéreas. El tumor canceroso se desarrolla sobre y en el cérvix. El cáncer comienza en general sobre la superficie del cérvix y es diagnosticado en una etapa temprana por un frotis de Papanicolaou. (2) Adenocarcinoma: Este tipo de cáncer cervical se desarrolla a partir del tejido en las glándulas cervicales en el canal del cérvix. La enfermedad temprana usualmente no provoca síntomas. El cáncer puede ser detectado usualmente por un frotis de Papanicolaou y examen pélvico. Las etapas tardías de la enfermedad provocan sangrado vaginal anormal o una descarga teñida sanguinolenta a tiempos inesperados, tal como entre periodos menstruales, después del coito o después de la menopausia. La descarga vaginal anormal puede ser turbia o sanguinolenta o puede contener moco con mal olor. Las etapas avanzadas del cáncer pueden provocar dolor (National Cáncer Institute, "NTH Publicación No. 08-2407" Rockville, MD, Sept. 2008) . Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco sobre la respuesta inmunitaria pueden ser evaluados en un modelo de xenoinjerto de tumor humano similar a aquel descrito en Downs et al., Gynecol. Oncol. 98:203-10, 2005; y Li et al, Int. J. Gynecol. Cáncer 15:301-7, 2005. e. Tumores de Cabeza y Cuello La mayoría de los cánceres de la cabeza y cuello son de un tipo denominado carcinoma (en particular carcinoma de células escamosas) . Los carcinomas de la cabeza y cuello comienzan en las células que forman el revestimiento de la boca, nariz, garganta u oreja, o la capa superficial que cubre la lengua. No obstante, los cánceres de cabeza y cuello pueden desarrollarse a partir de otros tipos de células. El linfoma se desarrolla a partir de las células del sistema linfático. El sarcoma se desarrolla a partir de las células de soporte que constituyen los músculos, el cartílago o los vasos sanguíneos. El melanoma comienza a partir de las células llamadas melanocitos, que dan color a los ojos y a la piel. Los síntomas de un cáncer de cabeza y cuello dependerán de donde esté - por ejemplo, el cáncer de la lengua puede provocar alguna distorsión de la voz. Los síntomas más comunes son una úlcera o llagas en las cabeza o en cuello que no sana dentro de unas pocas semanas, dificultad en tragar, o dolor cuando se mastica o se traga, problemas con la respiración o el habla, tales como respiración ruidosa persistente, voz distorsionada o una voz ronca; una sensación de entumecimiento en la boca; una nariz bloqueada persistente o sangrados nasales; dolor de oídos persistente, formación de anillos en la oreja, o dificultad para oír; hinchazón o inflamación de la boca o cuello; dolor en la cara o en la mandíbula superior; en personas quienes fuman o mascan tabaco, los cambios pre-cancerosos pueden ocurrir en el revestimiento de la boca, o sobre la lengua. Éstos pueden aparecer como parches blancos persistentes (leucoplaquia) o parches rojos (eritroplaquia) . Éstos son usualmente indoloros pero pueden algunas veces estar ulcerados o pueden sangrar (National Cáncer Institute, "NTH Publicación No. 09-1574" Rockville, MD, Sept . 2009) . Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco sobre la respuesta tumoral pueden ser evaluados en un modelo de xenoinjerto tumoral de cabeza y cuello humano, similar a aquel descrito en Kuriakose et al, Head Neck 22:57-63, 2000; Cao et al, Clin. Cáncer Res. 5:1925-34, 1999; Braakhuis et al, Cáncer Res. 51 :211-4, 1991; y Baker, Laryngoscope 95:43-56, 1985. f. Cáncer de Cerebro Los tumores que comienzan en el tej ido cerebral son conocidos como tumores primarios del cerebro y son nombrados de acuerdo al tipo de las células o la parte del cerebro en las cuales éstos comienzan. Los tumores cerebrales primarios más comunes comienzan en las células gliales, denominados gliomas. Existen muchos tipos de gliomas: (1) Astrocitoma -El tumor surge de las células gliales en forma de estrella llamados astrocitos. En adultos, los astrocitomas más frecuentes surgen en el cerebro. En niños, éstos aparecen en el tallo cerebral, el cerebro y el cerebelo. Un astrocitoma grado III es algunas veces llamado astrocitoma anaplástico. Un astrocitoma grado IV es usualmente llamado un glioblastoma multiforme. (2) Glioma del tallo cerebral - El tumor ocurre en la parte más baja del cerebro. Los gliomas en el tallo cerebral más a menudo son diagnosticados en niños pequeños y en adultos de edad media. (3) Ependimoma - El tumor surge de las células que revisten los ventrículos o el canal central de la médula espinal, y éstos son más comúnmente encontrados en niños y en adultos jóvenes. (4) Oligodendroglioma - Este tumor raro surge de las. células que constituyen la sustancia grasa que cubre y protege los nervios. Estos tumores usualmente aparecen en el cerebro. Éstos se desarrollan lentamente y usualmente no se dispersan hacia el tejido cerebral circunvecino. Éstos son más comunes en adultos de edad media. Los síntomas de los tumores cerebrales dependen del tamaño del tumor, del tipo y la localización del mismo. Los síntomas pueden ser provocados cuando un tumor presiona sobre un nervio o daña una cierta área del cerebro. Éstos pueden ser provocados cuando el cerebro se hincha o se acumula fluido dentro del cráneo. Los síntomas más comunes de los tumores cerebrales incluyen dolores de cabeza (usualmente peores en la mañana) ; náusea o vómito; cambios en la voz, la visión o el oído; problemas de balance o para caminar, cambios en el humor, la personalidad o en la habilidad para concentrase, problemas con la memoria; tirón o crispamiento espasmódico de los músculos (ataques o convulsiones) ; y entumecimiento o hormigueo en los brazos o piernas (National Cáncer Institute, "NTH Publicación No. 09-1558" Rockville, MD, Mayo 2009) . Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco sobre la respuesta del tumor pueden ser evaluados en un modelo de xenoinjerto de glioma humano similar a aquel descrito en Bello et ah, Clin. Cáncer Res. 8:3539-48, 2002. g. Cáncer de Tiroides Los cánceres de tiroides papilares y foliculares representan 80 a 90 por ciento de todos los cánceres de tiroides. Ambos tipos comienzan en las células foliculares de la tiroides . La mayoría de los cánceres de tiroides papilares y foliculares tienden a crecer lentamente. Si éstos son detectados tempranamente, la mayoría pueden ser tratados exitosamente. El cáncer de tiroides medular presenta 5 a 10 por ciento de los casos de cáncer de tiroides, y éste surge en células C, células no foliculares. El cáncer de tiroides anaplástico es el tipo menos común del cáncer de tiroides (únicamente 1 a 2 por ciento de los casos), y éste surge en las células foliculares. Las células cancerosas son altamente anormales y difíciles de reconocer. Este tipo de cáncer es usualmente muy difícil de controlar debido a que las células cancerosas tienden a desarrollarse y a dispersarse muy rápidamente. El cáncer temprano de tiroides a menudo no provoca síntomas. Pero conforme el cáncer crece, los síntomas pueden incluir: una protuberancia, ó nodulo, en la parte frontal del cuello cerca de la manzana de Adán; ronquera o dificultad para hablar con una voz normal; nodulos linfáticos hinchados, especialmente del cuello; dificultad para tragar o respirar; o dolor en la garganta o el cuello (National Cáncer Institute, "NTH Publicación No. 07-4994" Rockville, MD, Sept . 2007) . Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco sobre la respuesta tumoral pueden ser evaluados en un modelo de xenoinjerto tumoral humano, similar a aquel descrito en Quidville et al., Endocrinology 145:2561-71, 2004. h. Cáncer de Hígado Existen dos tipos diferentes de cáncer primario de hígado. El tipo más común es llamado hepatoma o carcinoma hepatocelular (HCC, por sus siglas en inglés) , y surge de las células principales del hígado (los hepatocitos) . Este tipo está usualmente confinado al hígado, aunque ocasionalmente éste se dispersa a otros órganos. Existe también un subtipo más raro y no relacionado del hepatoma llamado hepatoma fibrolaminar, el cual puede ocurrir en gente más joven. El otro tipo de cáncer hepático primario comienza en células de los conductos biliares y es llamado colangiocarcinoma o cáncer de los conductos biliares. La mayoría de las personas quienes desarrollan hepatoma usualmente tienen también una condición llamada cirrosis del hígado. Ésta es una cicatrización fina a todo lo largo del hígado, que es debida a una variedad de causas que incluyen infección y por beber a menudo alcohol en un periodo prolongado de tiempo. No obstante, únicamente una pequeña proporción de las personas que tienen cirrosis del hígado desarrollan cáncer hepático primario. La infección con el virus de la hepatitis B o bien de la hepatitis C puede conducir a cáncer de hígado, y puede provocar cirrosis, lo cual incrementa el riesgo de desarrollar hepatoraa. Las personas que tienen una condición rara llamada hemocromatosis , que provoca depósitos excesivos de hierro en el cuerpo, tienen una probabilidad más alta de desarrollar hepatoma. Un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco puede ser utilizado para tratar, prevenir, inhibir la progresión de, o retardar el inicio de, y/o reducir la severidad o inhibir al menos una de las condiciones o síntomas asociados con el carcinoma hepatocelular . El carcinoma hepatocelular puede o no estar asociado con una infección por hepatitis (por ejemplo, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C y hepatitis D) . Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco sobre la respuesta tumoral pueden ser evaluados sobre un modelo de xenoinjerto de tumor humano, similar a aquel descrito en Zhou et al., Clin. Cáncer Res. 9:6030-7, 2003; y Huynh et al, J. Cell Mol. Med. 2008 (E-Publicación 10.1111/j. 1582-4934.2008.00364., 2008, Blackwell Synergy) . i . Cáncer de Pulmón Los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco sobre la respuesta tumoral pueden ser evaluados en un modelo de xenoinjerto de carcinoma pulmonar microcítico/no microcítico humano. En resumen, los tumores humanos son injertados en ratones inmunodeficientes y estos ratones son tratados con un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco, solo o en combinación con otros agentes. La eficacia del tratamiento puede ser demostrada por la evaluación del crecimiento tumoral (Nemati et al, Clin Cáncer Res. 6:2075-86, 2000; y Hu et . Al., Clin. Cáncer Res. 10 : 7662-70, 2004) . 2. Puntos Finales y Actividad Anti-Tumoral para los Tumores Sólidos Mientras que cada protocolo puede definir las evaluaciones de la respuesta tumoral de manera diferente, los criterios de RECIST (Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos) son actualmente considerados como el lineamiento recomendado para la evaluación de la respuesta tumoral por el National Cáncer Institute (Ver Therasse et al, J. Nati. Cáncer Inst . 92:205-216, 2000) . De acuerdo a los criterios de RECIST, la respuesta tumoral significa una reducción o eliminación de todas las metástasis o lesiones mensurables. La enfermedad es en general considerada mensurable, si ésta comprende lesiones que pueden ser medidas de manera precisa en al menos una dimensión como > 20 mm con técnicas convencionales o > 10 mm con barrido CT en espiral con márgenes claramente definidos por fotografía médica o rayos X, tomografía axial computarizada (CT, por sus siglas en inglés) , formación de imagen de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) , o examen clínico (si las lesiones son superficiales) . La enfermedad no mensurable significa que la enfermedad comprende lesiones de < 20 mm con técnicas convencionales o < 10 mm con barrido CT en espiral, o lesiones verdaderamente no medibles (demasiado pequeñas para medirse de manera exacta) . Las enfermedades no mensurables incluyen efusiones pleurales, ascitis, y trastornos documentados por evidencia indirecta.

Los criterios para el estado objetivo son requeridos para que los protocolos evalúen la respuesta de los tumores sólidos. Los criterios representativos incluyen los siguientes: (1) Respuesta Completa (CR, por sus siglas en inglés) , definida como la desaparición completa de todos la enfermedad mensurable; ausencia de nuevas lesiones; ausencia de síntomas relacionados a la enfermedad; ninguna evidencia de enfermedad no mensurable; (2) Respuesta Parcial (PR) definida como disminución del 30% en la suma del diámetro más largo de las lesiones objetivo; (3) Enfermedad Progresiva (PD) , definida como incremento del 20% en la suma del diámetro más largo de las lesiones objetivo o aparición de cualquier nueva lesión; (4) Respuesta Estable o Ausencia de Respuesta, definida como la que no califica para CR, PR, o PD. (Ver Therasse et al., supra.) Los puntos finales adicionales que son aceptados dentro de la técnica oncológica incluyen la supervivencia general (OS) , la supervivencia libre de enfermedad (DFS) , la tasa de respuesta objetiva (ORR) , el tiempo para la progresión (TTP) , y la supervivencia libre de progresión (PFS) (Ver Lineamientos para la Industria: Puntos Finales de Prueba Clínica para la Aprobación de Fármacos y Agentes Biológicos para el Cáncer, Abril 2005, Center for Drug Evaluation y Research, FDA, Rockville, MD. ) 3. Terapia en Combinación para el Cáncer Como se discutió previamente, en ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco es utilizado en combinación con un segundo agente para el tratamiento de un trastorno o enfermedad. Cuando se utiliza para el tratamiento del cáncer, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco de la presente invención puede ser utilizado en combinación con las terapias convencionales para el cáncer tales como, por ejemplo, cirugía, radioterapia, quimioterapia, o combinaciones de las mismas. En ciertos aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia en combinación contra el cáncer con un anticuerpo anti-B7H6 o el conjugado anticuerpo- fármaco de acuerdo con la presente invención incluyen agentes anti-angiogénicos . En algunos otros aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia en combinación incluyen un antagonista de ciertos factores que están involucrados en el crecimiento tumoral tales como, por ejemplo, EGFR, ErbB2 (Her2), ErbB3, ErbB4 , o TNF. En algunos aspectos, un anticuerpo o el conjugado anticuerpo- fármaco de acuerdo con la presente invención es co-administrado con una citocina (por ejemplo, una citocina que estimula una respuesta inmunitaria contra un tumor) . Las terapias en combinación ejemplares particularmente adecuadas para el tratamiento de cáncer se describen con más detalle más adelante. a. Anticuerpos que se Dirigen a los Antigenos Asociados al Tumor Como se anotó previamente, la terapia con anticuerpo ha sido particularmente exitosa en el tratamiento del cáncer, debido a que ciertos tumores muestran ya sea antígenos únicos, antígenos específicos de línea, o bien antígenos presentes en cantidades excesivas con relación a las células normales. Uno de los mecanismos asociados con la actividad anti-tumoral de la terapia con anticuerpos monoclonales es la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . En la ADCC, los anticuerpos monoclonales se enlazan a una célula objetivo (por ejemplo, la célula cancerosa) y células efectoras específicas que expresan receptores para el anticuerpo monoclonal (por ejemplo, las células NK, monocitos, granulocitos ) se enlazan al complejo anticuerpo monoclonal/célula objetivo dando como resultado la muerte de la célula objetivo. En consecuencia, en ciertas variaciones de la presente invención, un anticuerpo monoclonal anti- B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco que tiene eficacia contra un cáncer, es co-administrado con un anticuerpo monoclonal contra un segundo antígeno asociado al tumor (por ejemplo, un antígeno asociado al tumor diferente de B 7H6 ) . La dosis y el esquema de los MAbs está basado en las propiedades farmacocinéticas y toxicocinéticas adscritas al anticuerpo específico co-administrado , y deben optimizar estos efectos, al tiempo que reduzcan al mínimo cualquier toxicidad que pueda, estar asociada con la administración de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco .

La terapia en combinación con un anticuerpo monoclonal anti- B7H6 o el conjugado anticuerpo- fármaco como se describen en la presente y un segundo anticuerpo monoclonal contra un antígeno asociado al tumor, puede ser indicada cuando un tratamiento de primera línea ha fallado, y puede ser considerado como un tratamiento de segunda línea. La presente invención también proporciona el uso de la combinación como un tratamiento de primera línea en poblaciones de pacientes que están recién diagnosticados y no han sido previamente tratados con agentes anti-cancerosos ("pacientes de novo") y pacientes que no han recibido previamente ninguna terapia con anticuerpos monoclonales ("pacientes intactos") .

Un anticuerpo anti-B7H6 o un conjugado anticuerpo- fármaco como se describe en la presente, es también útil en terapia en combinación con anticuerpos monoclonales contra los antígenos asociados al tumor en ausencia de cualquier ADCC o CDC mediado por anticuerpo directo, de las células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos que bloquean una señal inhibitoria en el sistema inmunitario pueden conducir a respuestas inmunitarias aumentadas. Los ejemplos incluyen (1) anticuerpos contra las moléculas de la familia B7R que tienen función inhibitoria tales como el antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), muerte programada 1 (PD-1), atenuador de linfocitos B y T (BTLA) ; (2) anticuerpos contra citocinas inhibitorias como IL-10, TGF; y (3) anticuerpos que agotan o inhiben las funciones de las células supresoras como anti-CD25 o CTLA-4. Por ejemplo, se piensa que los MAbs anti-CTLA4 en ratones y en humanos suprimen la función de las células T reguladoras inmunosupresoras (Tregs) o bien inhiben la señal inhibitoria transmitida a través del enlace de CTLA-4 sobre las células T a las moléculas B7-1 o B7-2 sobre los APCs o las células tumorales.

La Tabla 6 es un lista no exclusiva de anticuerpos monoclonales aprobados o que son probados, para los cuales es posible la terapia en combinación de acuerdo con la presente invención.

Tabla 6: Terapias con Anticuerpos Monoclonales para el Uso en Combinación con los Anticuerpos anti-B7H6 o los Conjugados Anticuerpo-Fármaco b. Inhibidores de la Tirosina-Cinasa En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-f rmaco como se describen en la presente es utilizado en combinación con un inhibidor de la tirosina-cinasa . Las tirosinas-cinasas son enzimas que catalizan la transferencia del grupo fosfato ? del trifosfato de adenosina a las proteínas objetivo. Las tirosinas-cinasas pueden ser clasificadas como tirosinas-cinasas de proteínas receptoras y no receptoras. Éstas juegan un papel esencial en diversos procesos celulares normales incluyendo la activación a través de los receptores del crecimiento y afectan la proliferación, la supervivencia y el crecimiento de diversos tipos celulares. Además, se piensa que éstas promueven la proliferación de las células tumorales, inducen efectos anti-apoptóticos y promueven la angiogénesis y la metástasis. Además de la activación a través de los factores de crecimiento, la activación de la proteína cinasa a través de la mutación somática es un mecanismo común de tumorigénesis . Algunas de las mutaciones identificadas están en la cinasa B-Raf, cinasa FLt3, cinasa BCR-ABL, cinasa c-KIT, factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las vías de PDGFR. La Her2 , VEGFR y c-Met son otras vías de tirosina-cinasa de receptores, significativas (RTK) implicadas en la progresión del cáncer y la tumorigénesis. Debido a que un gran número de procesos celulares son iniciados por las tirosinas-cinasas, éstos han sido identificados como objetivos clave para los inhibidores.

Los inhibidores de tirosina-cinasa (TKIs) son moléculas pequeñas que actúan dentro de la célula, compitiendo con el trifosfato de adenosina (ATP) para el enlace al dominio catalítico de tirosina-cinasa de las tirosinas-cinasas receptoras y no receptoras. Este enlace competitivo bloquea el inicio de la señalización corriente abajo, conduciendo a las funciones efectoras asociadas con estos eventos de señalización como el crecimiento, la supervivencia y la angiogénesis . Utilizando una estructura y un procedimiento computacional , un número de compuestos provenientes de bibliotecas combinatorias de química médica, fueron identificados, los cuales inhiben las tirosinas-cinasas .

Se piensa que la mayoría de las TKls inhiben el crecimiento de los tumores a través de la inhibición directa de la célula tumoral o a través de la inhibición de la angiogénesis. Además, ciertas TKls afectan la señalización a través de los receptores de la familia VEGF, incluyendo sorafenib y sunitinib. En algunos casos, se ha mostrado que las TKls activan las funciones de las células dendríticas u otras células inmunitarias innatas, como las células NK. Esto ha sido reportado recientemente en modelos animales para el imatinib. El imatinib es una TKI que ha mostrado que aumenta la actividad asesina por las células dendríticas y las células NK (para revisión, ver Smyth et al, NEJM 354 :2282, 2006) .

BAY 43-9006 (sorafenib, Nexavar®) y SU11248 (sunitinib, Sutent®) son dos de tales TKls que han sido recientemente probadas para el uso en el carcinoma metastático de células renales (RCC) . Un número de otras TKls están en el desarrollo de etapa tardía y temprana para el tratamiento de diversos tipos de cánceres . Otras TKls incluyen, pero no están limitadas a: mesilato de imatinib (Gleevec®, Novartis) ; Gefitinib (Iressa®, AstraZeneca) ; clorhidrato de erlotinib (Tarceva®, Genentech) ; Vandetanib (Zactima®, AstraZeneca) , Tipifarnib (Zarnestra®, Janssen-Cilag) ; Dasatinib (Sprycel®, Bristol Myers Squibb) ; Lonafarnib (Sarasar®, Schering Plough) ; succinato de vatalanib (Novartis, Schering AG) ; Lapatinib (Tykerb®, Glaxo SmithKline) Nilotinib (Novartis) ; Lestaurtinib (Cephalon) ; clorhidrato de pazopanib (Glaxo SmithKline) ; Axitinib (Pfizer) diclorhidrato de canertinib (Pfizer) ; Pelitinib (National Cáncer Institute, Wyeth) ; Tandutinib (Millennium) ; Bosutinib (Wyeth) ; Semaxanib (Sugen, Taiho) ; AZD-2171 (AstraZeneca) ; VX-680 (Merck, Vértex) ; EXEL-0999 (Exelixis) ; ARRY-142886 (Array BioPharma, AstraZeneca) ; PD-0325901 (Pfizer) ; AMG-706 (Amgen) ; BIBF-1120 (Boehringer Ingelheim) ; SU-6668 (Taiho); CP-547632 (OSI) ; (AEE-788 (Novartis); BMS-582664 (Bristol-Myers Squibb) ; JNK-401 (Celgene) ; R-788 (Rigel) ; AZD-1152 HQPA (AstraZeneca) ; NM-3 (Genzyme Oncology) ; CP-868596 (Pfizer) ; BMS-599626 (Bristol-Myers Squibb) ; PTC-299 (PTC Therapeutics) ; ABT-869 (Abbott) ; EXEL-2880 (Exelixis) ; AG-024322 (Pfizer) ; XL-820 (Exelixis) ; OSI-930 (OSI) ; XL-184 (Exelixis) ; KRN-951 (Kirin Brewery) ; CP-724714 (OSI) ; E-7080 (Eisai) ; HKI-272 (Wyeth) ; CHIR-258 (Chiron) ; ZK-304709 (Schering AG) ; EXEL-7647 (Exelixis) ; BAY-57-9352 (Bayer) ; BIBW-2992 (Boehringer Ingelheim) ; AV-412 (AVEO) ; YN-968D1 (Advenchen Laboratories) ; Midostaurin (Novartis) ; Perifosina (AEterna Zentaris, eryx, National C ncer Institute) ; AG-024322 (Pfizer) ; AZD-1152 (AstraZeneca) ; ON-01910Na (Onconova) y AZD-0530 (AstraZeneca) . c. Combinaciones de Quimioterapia En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco es administrado en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos . Los agentes quimioterapéuticos tienen diferentes modos de acción, por ejemplo, al influir ya sea el ADN o el RNA e interfiriendo con la replicación del ciclo celular. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos que actúan al nivel del ADN o al nivel del ARN son los anti-metabolitos (tales como Azatioprina, Citarabina, Fosfato de Fludarabina, Fludarabina, Gemcitabina, Citarabina, Cladribina, Capecitabina 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, metotrexato, 5-fluoroouracilo e hidroxiurea; agentes alquilantes (tales como Melfalan, Busulfan, Cis-platino, Carboplatino, Ciclofosfamida, Ifosfamida, Dacarabazina, Procarbazina, Clorambucilo, Tiotepa, Lomustina, Temozolamida) ; agentes anti-mitóticos (tales como Vinorelbina, Vincristina, Vinblastina, Docetaxel, Paclitaxel) ; los inhibidores de topoisomerasa (tales como Doxorrubincina, Amsacrina, Irinotecan, Daunorrubicina, Epirrubicina, itomicina, Mitoxantrona, Idarrubicina, Tenipósido, Etopósido, Topotecan) ; antibióticos (tales como actinomicina y bleomicina) ; asparaginasa; antraciclinas o taxanos . d. Combinaciones de Radioterapia En algunas variaciones, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco es administrado en combinación con radioterapia. Ciertos tumores pueden ser tratados con radiación o productos radiofarmacéuticos . La terapia con radiación es en general utilizada para tratar tumores no resectables o no operables y/o las metástasis tumorales. La radioterapia es típicamente distribuida de tres maneras. La irradiación con haces externos es administrada a distancia del cuerpo e incluye rayos gamma (60Co) y rayos X. La braquiterapia utiliza fuentes, por ejemplo 60Co, 137Cs, 192Ir, o 125I, con o en contacto con un tejido objetivo, e. Combinaciones de Agentes Hormonales En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano monoclonal o conjugado anticuerpo- fármaco es administrado en combinación con una hormona o antihormona. Ciertos cánceres están asociados con dependencia hormonal que incluyen, por ejemplo, cáncer de ovario, cáncer de mama y cáncer de próstata. El tratamiento para el cáncer dependiente de hormonas puede comprender el uso de compuestos antiandrógenos o antiestrógenos . Las hormonas y antihormonas utilizadas en la terapia para el cáncer incluyen fosfato de Estramustina, fosfato de Poliestradiol , Estradiol, Anastrozol, Exemestano, Anastrozol, Letrozol, Tamoxifeno, acetato de Megestrol, acetato de Medroxiprogesterona, Octreótido, acetato de Ciproterona, Bicalutamida, Flutamida, Tritorelina, Leuprorelina, Buserelina y Goserelina.

Para la administración, el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano y el conjugado anticuerpo- fármaco es formulado como una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco puede ser formulada de acuerdo a los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, con lo cual la molécula terapéutica es combinada en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es una "portador farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente o recipiente. La solución salina amortiguada con fosfato, estéril, es un ejemplo de un portador farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (Ver, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995) ) . Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizadores, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas sobre las superficies del vial, etc.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco es administrada a un sujeto en una cantidad efectiva. De acuerdo a los métodos de la presente invención, el anticuerpo o el 1 conjugado anticuerpo-fármaco puede ser administrado a sujetos mediante una variedad de modos de administración, incluyendo, por ejemplo, por la vía intramuscular, subcutánea, intravenosa, intra-atrial , intra-articular, perenteral, intranasal, intrapulmonar, transdérmica, intrapleural , intratecal y oral. Para fines de prevención y tratamiento, el anticuerpo o el conjugado anticuerpo- fármaco puede ser administrado a un sujeto en una distribución de bolo simple, vía la distribución continua (por ejemplo, distribución transdérmica continua) en un periodo prolongado de tiempo, o en un protocolo de administración repetida (por ejemplo, en una base cada hora diaria o semanal) .

La determinación de las dosis efectivas en este contexto está típicamente basada en estudios de modelo animal seguidos por pruebas clínicas en humanos, y está guiado por la determinación de las dosis efectivas y los protocolos de administración que reducen significativamente la aparición o la severidad del trastorno o enfermedad de interés en sujetos modelo. Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico, así como la actividad específica de la composición misma y su habilidad para promover la respuesta deseada en el individuo. Usualmente, el paciente es un humano, pero en algunos trastornos, el paciente puede ser un mamífero no humano. Típicamente, los regímenes de dosificación son ajustados para proporcionar una respuesta terapéutica óptima, por ejemplo, para optimizar la seguridad y la eficacia. En consecuencia, una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva es también una en la cual cualesquiera efectos colaterales no deseados son ponderados por los efectos benéficos de la modulación de la actividad de las células NK, mediada por NKp30. Para la administración de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco, una dosis típicamente está en el intervalo de aproximadamente 0.1 µ? a 100 mg/kg o 1 ug/kg a aproximadamente 50 mg/kg, y más usualmente 10 yg a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto. En modalidades más específicas, una cantidad efectiva del agente está entre aproximadamente 1 pg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, entre aproximadamente 10 pg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, o entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 5 rog/kg. Las dosis dentro de este intervalo pueden ser logradas por administraciones simples o múltiples, incluyendo, por ejemplo, administraciones múltiples por día o diariamente, semanalmente, bisemanalmente o mensualmente . Por ejemplo, en ciertas variaciones, un régimen consiste de una administración inicial seguida por administraciones subsecuentes múltiples, a intervalos semanales o bisemanales. Otro régimen más consiste de una administración inicial seguida por múltiples administraciones subsiguientes a intervalos mensuales o bimensuales. Alternativamente, las administraciones pueden ser en una base irregular como es indicado por el monitoreo de la actividad de las células NK y/o los síntomas clínicos de la enfermedad o el trastorno.

La dosis de la composición farmacéutica puede ser variada por el médico que atiende para mantener una concentración deseada en un sitio objetivo. Por ejemplo, si se selecciona un modo intravenoso de administración, la concentración local del agente en la corriente sanguínea en el sitio objetivo puede estar entre aproximadamente 1-50 nanomoles de la composición por litro, algunas veces entre aproximadamente 1.0 nanomol por litro y 10, 15, o 25 nanomoles por litro dependiendo del estado del sujeto y de la respuesta medida proyectada. Concentraciones más altas o más bajas pueden ser seleccionadas con base en el modo de administración, por ejemplo, la distribución transdérmica versus la distribución a una superficie mucosal. La dosis debe también ser ajustada con base en la velocidad de liberación de la formulación administrada, por ejemplo, rocío nasal versus polvo, partículas orales de liberación sostenida o inyectadas, formulaciones transdérmicas , etc. Para lograr el mismo nivel de concentración en suero, por ejemplo, las partículas de liberación lenta con una velocidad de liberación de 5 nanomolar (bajo condiciones estándares) serían administradas aproximadamente a dos veces la dosis de las partículas con una velocidad de liberación de 10 nanomolar.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o la composición del conjugado anticuerpo- fármaco puede ser proporcionada en forma líquida, o en un aerosol, o en forma sólida. Las formas líquidas son ilustradas por soluciones inyectables, aerosoles, gotitas, soluciones topológicas y suspensiones orales. Las formas sólidas ejemplares incluyen cápsulas, tabletas y formas de liberación controlada. La última forma es ilustrada por bombas miniosmóticas e implantes (Ver, por ejemplo, Bremer et al, Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997; Ranade, "Implants in Drug Delivery, " en Drug Delivery Systems 95-123 (Ranade and Hollinger, eds . , CRC Press 1995); Bremer et al, "Protein Delivery with Infusión Pumps," en Protein Delivery: Physical Systems 239-254 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Yewey et al, "Delivery of Proteins f om a Controlled Reléase Injectable Iraplant, " en Protein Delivery: Physical Systems 93-117 (Sanders and Hendren, eds . , Plenum Press 1997)). Otras formas sólidas incluyen cremas, pastas, otras aplicaciones tópicas y similares.

Los liposomas proporcionan un medio para distribuir las composiciones terapéuticas a un sujeto, por ejemplo, intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutáneamente, o vía la administración oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten de una o más bicapas lipídicas que rodean los compartimientos acuosos. (Ver en general, Bakker-Woudenberg et al, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 7>:S61, 1993; Kim, Drugs 46:618, 1993; Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers, " en Drug Delivery Systems 3-24 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y como resultado, los liposomas pueden ser administrados de manera segura y son biodegradables . Dependiendo del método de preparación, los liposomas pueden ser unilaminares o multilaminares, y los liposomas pueden variar en tamaño con los diámetros en el intervalo de 0.02 µ?? a más de 10 um. Una variedad de agentes pueden ser encapsulados en liposomas: los agentes hidrofóbicos se reparten en las bicapas y los agentes hidrofílicos se reparten dentro del o de los espacios acuosos internos. (Ver, por ejemplo, Machy et al, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) ; Ostro et al, American J. Hosp. Pharm. 46: 1576, 1989) . Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado al variar el tamaño del liposoma, el número de bicapas, la composición lipídica, así como la carga y las características superficiales de los liposomas.

Los liposomas pueden adsorber virtualmente cualquier tipo de célula y luego liberar lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma adsorbido puede ser sometido a endocitosis por las células que son fagocíticas. La endocitosis es seguida por degradación intralisosomal de los lípidos liposomales y la liberación de los agentes encapsulados (ver Scherphof et al, Ann. N. Y. Acad. Sci. 446:368, 1985). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0.1 a 1.0 m) son típicamente absorbidos por las células del sistema reticuloendotelial, localizado principalmente en el hígado y el bazo, mientras que los liposomas mayores de 3.0 \m son depositados en el pulmón. Esta absorción preferencial de los liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial, ha sido utilizada para distribuir agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado.

El sistema reticuloendotelial puede ser evitado por varios métodos que incluyen la saturación con dosis grandes de partículas de liposomas, o la inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (ver Claassen et al, Biochim. Biophys. Acta 802:428, 1984). Además, la incorporación de los fosfolípidos derivatizados con glucolípido y polietilenglicol en membranas liposomales, han mostrado que dan como resultado una absorción significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (ver Alien et al, Biochim. Biophys. Acta 1068: 133, 1991; Alien et al, Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993) . ' Los liposomas pueden también ser preparados para dirigirse a las células u órganos particulares al variar la composición de los fosfolípidos o mediante inserción de los receptores o contrarreceptores dentro de los liposomas . Por ejemplo, los liposomas, preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico, han sido utilizados para dirigirse al hígado. (Ver, por ejemplo, la Patente Japonesa 04-244,018 to Hayakawa et al.; Kato et al, Biol. Pharm. Bull. 16:960, 1993). Estas formulaciones fueron preparadas al mezclar la fosfatidilcolina de soya, a-tocoferol, y aceite de ricino hidrogenado, etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío, y luego reconstituyendo la mezcla con agua. Una formulación liposomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de estearilglucósido derivado de soya (SG) y colesterol (Ch) ha mostrado también que se dirige al hígado. (Ver Shimizu et al, Biol. Pharm. Bull. 20:881, 1997.) Alternativamente, diversos contrarreceptores de dirección al objetivo pueden ser enlazados a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, carbohidratos, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, para dirigirse al hígado los liposomas pueden ser modificados con derivados de galactosil-lípido tipo ramificado, para dirigirse a los receptores de asialoglucoproteína (galactosa) , que son exclusivamente expresados sobre la superficie de las células del hígado (Ver Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997; urahashi et al, Biol. Pharm. Bull.20:259, 1997). En un procedimiento más general para la dirección a los tejidos, las células objetivo son premarcadas con anticuerpos biotinilados específicos para un contrarreceptor expresado por la célula objetivo (Ver Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998). Después de la eliminación plasmática del anticuerpo libre, los liposomas conjugados con estreptavidina son administrados. En otro procedimiento más, los anticuerpos de dirección al objetivo son directamente enlazados a los liposomas (Ver Harasym et al . , supra) .

Los anticuerpos o conjugados anticuerpo- fármaco pueden ser encapsulados dentro de liposomas utilizando técnicas estándares de microencapsulamiento de proteínas (Ver, por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099, 1981; Anderson et al., Cáncer Res. 50:1853, 1990; Cohén et al., Biochim.

Biophys. Acta 1063:95, 1991; Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes en Immunological Studies," en Liposome Technology (Vol. III) 317 (Gregoriadis, ed. , CRC Press, 2nd ed. 1993); assef et al, Meth. Enzymol. 149:124, 1987) . Como se anotó anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipidíeos de poli (etilenglicol) . (Ver Alien et al, Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993.) Las microesferas poliméricas degrada les han sido diseñadas para mantener altos niveles sistémicos de proteínas terapéuticas . Las microesferas son preparadas a partir de polímeros degradables tales poli (láctido-co-glicólido) (PLG) , polianhídridos, poli (orto ésteres) , polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los cuales las proteínas son atrapadas en el polímero (Ver, por ejemplo, Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 1995; Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery, " en Drug Delivery Systems 51-93 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Reléase Systems Useful for Protein Delivery," en Protein Delivery: Physical Systems 45-92 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Bartus et al, Science 281: 1161, 1998; Putney and Burke, Nature Biotechnology 16: 153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998). Las nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) pueden también proporcionar portadores para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (Ver, por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167, 1997.) Otras formas de dosis pueden ser consideradas por aquellos expertos en la técnica, como es mostrado por, por ejemplo, Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lea & Febiger, 5th ed. 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995) , y Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) .

Las composiciones f rmacéuticas como se describen en la presente pueden también ser utilizadas en el contexto de terapia en combinación. El término "terapia en combinación" es utilizado en la presente para denotar que un sujeto es administrado con una dosis al menos terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o un conjugado anticuerpo-fármaco en combinación con un segundo agente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. El anticuerpo anti-B7H6 o el conjugado anticuerpo-fármaco y el segundo agente pueden ser, por ejemplo, coadministrados conjuntamente (por ejemplo, como una composición simple que comprende ambos agentes, o simultáneamente como composiciones separadas en el mismo o sustancialmente en el mismo sitio) o, alternativamente, administradas separadamente (por ejemplo, a tiempos diferentes y/o en sitios de administración diferentes) .

Las composiciones farmacéuticas pueden ser suministradas como un kit que comprende un recipiente que incluye un polipéptido terapéutico o un polinucleótido terapéutico como se describe en la presente. Una molécula terapéutica puede ser proporcionada, por ejemplo, en la forma de una solución inyectable para dosis simples o múltiples, o como un polvo estéril que será reconstituido antes de la inyección. Alternativamente, tal kit puede incluir un surtidor de polvo seco, un generador de aerosol líquido, o un nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico o polinucleótido terapéutico. Tal kit puede comprender además la información escrita sobre las indicaciones y uso de la composición farmacéutica. Por ejemplo, tal información puede incluir una declaración de que una composición del anti-B7H6 está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a B7H6.

C. Métodos de Detección de la Expresión de B7H6 Los anticuerpos descritos en la presente tienen también usos en los métodos de detección de la expresión de B7H6, incluyendo los usos de diagnóstico. La detección de la expresión de B7H6 puede ser importante por múltiples razones. Por ejemplo, la expresión de B7H6 en células o tejidos puede ser utilizada en la detección del cáncer. La detección puede ser utilizada como parte de la selección, el diagnóstico o el pronóstico del cáncer. El método de detección puede ser utilizado para comparar el nivel de expresión de B7H6 en una muestra biológica proveniente de un sujeto, con un estándar o referencia como parte de la determinación de la severidad o la etapa del cáncer o el monitoreo del tratamiento. El método de detección puede tener lugar una vez o ser utilizado múltiples veces para usos tales como el monitoreo, por ejemplo, para monitorizar el progreso de un sujeto durante el tratamiento, para indicar si el cáncer es recurrente.

En ciertas modalidades, un método de detección de la expresión celular de B7H6 incluye poner en contacto una muestra biológica que va a ser probada con un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 y luego detectando el enlace del anticuerpo. El enlace del anticuerpo indica la presencia de B7H6 sobre la célula. El anticuerpo B7H6 forman un complejo anticuerpo-antígeno y las condiciones bajo las cuales se forma el complejo serán dependientes de la muestra biológica y de los métodos utilizados, y son determinaciones fácilmente realizadas por aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos que compiten por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de (i) el hibridoma del clon 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242); (ii) el hibridoma del clon 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243); (iii) el hibridoma del clon 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244); y (iv) el hibridoma del clon 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245) .

La muestra biológica puede comprender células humanas intactas o una fracción membranal de la célula que va a ser probada. Por ejemplo, las células probadas con los métodos reclamados incluirán las células sospechosas de expresar B7H6 y asociadas con el cáncer en un sujeto, tal como por ejemplo, células de cáncer de colon, células de cáncer de hígado, células de cáncer cervical, células de cáncer de pulmón, células de cáncer pancreático, células de cáncer de próstata, células de leucemia prohemocítica, células de linfoma de células B, células de linfoma monocít co, células de critroleucemia, células de linfoma de Burkitt, y células de leucemia mielogénica crónica, por nombrar unas pocas.

La detección del enlace por el anticuerpo para indicar la presencia de una célula que expresa B7H6 incluye los ensayos para el enlace específico mediante cualquier método conocido en la técnica. Existen muchos formatos de ensayo de enlace diferentes que son bien conocidos. Por ejemplo, los sistemas de ensayo de enlace pueden ser directos o indirectos, utilizando técnicas tales como transferencia de western, radioinmunoensayo, ELISA, inmunoensayos de "emparedado", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de precipitina, ensayos de precipitina de difusión en gel, ensayos inmunorradiom trieos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, ensayos de fijación del complemento, por nombrar solo unos pocos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Para aumentar la detección, el anticuerpo es marcado con un marcador detectable tal como un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, o un marcador bioluminiscente . Los métodos de conjugación de los marcadores a los anticuerpos son conocidos en la técnica y puede ser utilizado cualquier método apropiado.

La presente invención proporciona además un método para diagnosticar a un sujeto sospechoso de tener un tipo de cáncer que expresa B7H6. El método comprende administrarle al sujeto, en general un humano (pero puede ser otro mamífero tal como un primate no humano, perro, gato, cerdo, etc.), un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano conjugado a un marcador detectable, tales como aquellos descritos anteriormente. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos que compiten por el enlace al dominio extracelular del B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (i) el hibridoma del clon designación número 4E5.5; (ii) el hibridoma del clon designación número 9G9.2 (iii) el hibridoma del clon designación número 10E2.9; y (iv) el hibridoma del clon designación número 17B1.3. En algunas modalidades, el anticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (ii)-(iii) anteriores. En variaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado derivado de un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado de (i) - (iv) anteriores y de (ii)-(iii) anteriores. Después de la administración del anticuerpo, la distribución del anticuerpo dentro del sujeto es detectada. Los métodos para detectar la distribución de cualquier marcador específico son conocidos por aquellos expertos en la técnica y cualquier método apropiado puede ser utilizado. Algunos ejemplos no limitantes incluyen, tomografía computarizada (CT) , tomografía de emisión de positrones (PET) , formación de imagen de resonancia magnética (MRI) , fluorescencia, quimioluminiscencia, y sonografía.

La invención es además ilustrada por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1; Producción y Selección de Anticuerpos Monoclonales de Ratón Anti-B7H6 Humano A. Inmunización Un ratón Balb/c fue inmunizado de acuerdo al siguiente protocolo: DO: inyección i.v. de 100 µg de B7H6 soluble (el dominio extracelular de B7H6 humano con una fusión Fe murina C-terminal (hB7H6/mFc2 ; forma madura como se muestra en los residuos 25 a 500 de la SEQ ID NO: 3)) D15: inyección i.v. de 100 iq de B7H6 soluble D25: refuerzo i.p. con 100 g de B7H6 soluble Tres días después de la tercera inmunización, el bazo fue cosechado. Los esplenocitos fueron aislados y fusionados con las células de mieloma y sembrados en 40 placas de 96 pozos. Después de 3 semanas en cultivo, los sobrenadantes de 3840 hibridomas fueron seleccionados para la presencia de los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano. B. Primera selección de los Hibridomas Para seleccionar los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano, las células P815 que expresan B7H1, y las células P815 que expresan B7H6 fueron teñidas con el sobrenadante de los 3840 hibridomas. La tinción sobre los hibridomas fue revelada mediante análisis de FACS utilizando una Ig anti-ratón conjugada a Cy5. Con el fin de diferenciar los dos transíectantes de P815, las células P815 B7-H1 fueron primeramente teñidas con CFSE. Los resultados mostraron que 114 de los 3840 sobrenadantes de hibridoma eran positivos para la tinción de las células P815 que expresan B7H6 con relación a las células P815 que expresan B7H1, con lo cual se indica la producción de los mAbs anti-B7H6 por los hibridomas correspondientes. C. Segunda Selección de los Hibridomas Se realizó una segunda selección para seleccionar los anticuerpos de bloqueo. Con el fin de identificar estos hibridomas, fue evaluada la habilidad de cada uno de los 114 sobrenadantes para bloquear el enlace de NKp30Fc a las células P815.B7H6. Los hibridomas seleccionados fueron verificados en paralelo para confirmar que éstos estaban todavía produciendo los mAbs anti-B7H6 mediante tinción de P815.B7H6. Además, un anticuerpo policlonal (pAb) anti-B7H6, que mostró previamente que inhibe el enlace de NKp30 a las células P815 que expresan B7H6, fue utilizado como un control positivo .

Los resultados mostraron que las células P815.B7-H6 fueron teñidas por NKp30Fc y el pAb anti-B7H6 inhibió la tinción cuando fue incubado a 10 vq/ml. Los 114 sobrenadantes fueron divididos en 4 grupos de acuerdo a los resultados: (1) los hibridomas que producen los mAbs anti-B7H6 que bloquearon el enlace a NKp30Fc (1/114); (2) los hibridomas que producen los mAbs anti-B7H6 que bloquearon el enlace a NKp30Fc (27/114) ; (3) los hibridomas que producen los mAbs anti-B7H6 que bloquearon parcialmente el enlace a NKp30Fc (1/114) ; (4) los hibridomas que ya no produjeron mAbs anti-B7H6 (85/114) . En conclusión, los 29 hibridomas produjeron eficientemente los mAbs anti-B7H6 y únicamente 2 de ellos pudieron ser mAbs de bloqueo. Los 29 hibridomas que producen los mAbs anti-B7H6 fueron clonados.

D. Clonación de los hibridomas Después de clonar 29 hibridomas seleccionados, 11 hibridomas no se desarrollaron, 5 hibridomas únicamente produjeron clones negativos, y 13 generaron clones positivos. La amplificación en matraces dio como resultado únicamente 9 clones derivados de 5 diferentes hibridomas produciendo todavía el mAb anti-B7H6. Los siguientes clones fueron caracterizados y todos fueron identificados como IgGl: 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9, y 17B1.3 de ratón.

Los hibridomas que expresan los anticuerpos monoclonales para B7H6 fueron depositados con la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur; Paris, Francia) como depositaría de patentes como depósitos originales bajo el Tratado de Budapest y se les dieron los siguientes números de acceso depositarios de la CNCM: clon 4E5.5 (Depósito No. CNCM 1-4242, depositado el 18 de Noviembre del 2009); clon 9G9.2 (Depósito No. CNCM 1-4243, depositado el 18 de Noviembre del 2009); clon 10E2.9 (Depósito No. CNCM 1-4244, depositado el 18 de Noviembre del 2009); y clon 17B1.3 (Depósito No. CNCM 1-4245, depositado el 18 de Noviembre del 2009) .

Ejemplo 2: Caracterización de los anticuerpos monoclonales de ratón anti-B7H6 humano A. Reactividad del anticuerpo monoclonal de ratón anti-B7H6 humano hacia las líneas de células tumorales Cada mAb anti-B6H7 humano (4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9, y 17B1.3) fue comparado al anticuerpo policlonal anti-B7-H6 para la tinción de las siguientes líneas de células tumorales: HEK-293, HeLa EV2 , K562, y Raj i . Las células P815.B7H6 y las células P815.B7-H1 fueron utilizadas como un control positivo y un control negativo, respectivamente. Cada uno de los cinco mAbs fue positivo para la tinción sobre cada una de las líneas de células tumorales, con algunas variaciones en el perfil de intensidad de tinción para cada mAb. Por ejemplo, 17B1.3 tiñó a P815.B7-H6 con la misma intensidad que el pAb, sin embargo éste no tiñó las células Ra i con la misma eficacia. También, la tinción de las células HEK-293 y las células HeLa EV2 fue ligeramente menos intensa que 17B1.3 que con el pAb, mientras que la tinción de K562 fue ligeramente menor con 4E5.5 que con el pAb.

C. Diferenciación de epitopos por el ensayo de competencia Para definir si los diferentes epitopos se dirigen a los mAbs 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 y 17B1.3, fue realizado un ensayo de competencia entre los mAbs. El único clon directamente conjugado con un fluorocromo (Alexa 647, Molecular Probes) fue 9G9.2. Por lo tanto, este anticuerpo fue utilizado en la evaluación del enlace de 9G9.2-Alexa 647 a las células HEK 293 después de la incubación con los otros mAbs anti-B7H6 purificados. Las células HEK-293 fueron primeramente incubadas con los mAbs purificados a 30 yg/ml, luego con 9G9.2 Alexa 647 a 10 g/ml. La tinción de HEK-293 con 9G9.2-Alexa 647 fue luego evaluada por FACS® (BD Sciences, Inc., Franklin Lakes, NJ) . Los resultados de este análisis mostraron que la preincubación de las células HEK-293 con los mAbs 10E2.9, 4E5.5, o 9G9.2 disminuyeron sustancialmente la intensidad de la tinción con 9G9.2-Alexa 547. La pre-incubación con 10E2.9, 4E5.5, o 9G9.2 disminuyó sustancialmente la intensidad de tinción con 9G9.2-Alexa 647, mientras que la pre-incubación con 5E1.4 únicamente disminuyó ligeramente la intensidad de la tinción. La preincubación con 17B1.3 no tuvo efecto significativo sobre la tinción de 9G9.2-Alexa 647. Estos resultados muestran que 10E2.9, 4E5.5, y 9G9.2 se dirigen a epitopos traslapados (si no es que son sustancialmente los mismos o similares) . En contraste, 17B1.3 y 9G9.2 (y posiblemente 5E1.4 y 9G9.2) reconocieron epitopos no traslapados.

D. los anticuerpos monoclonales de ratón anti-B7H6 humano bloquean parcialmente el enlace a NKp30Fc Para identificar los mAbs que tuvieron algún bloqueo del enlace a NKp30Fc, se realizó un ensayo de competencia. NKp30Fc es una forma soluble de NKp30 humano que consiste del dominio extracelular de NKp30 humano con una fusión Fe C-terminal. Fue evaluado el enlace de NKp30Fc a las células HEK 293 después de la incubación con el anticuerpo policlonal B7H6 , mlgGl, el control, y los mAbs anti-B7-H6 purificados 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 y 17B1.3,. Las células HEK-293 fueron primeramente incubadas con los mAbs purificados a 30 µ?/ml, lavadas, luego incubadas con el complejo preformado NKp30Fc (5 µ?/p??) /anti-hulg conjugado a PE (5 pg/ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) . Las tinciones fluorescentes fueron analizadas sobre un BD FACSCalibur™ (BD Sciences Inc.) utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc. Ashland, OR) . Los resultados mostraron que 4E5.5 y 17B1.3 bloquearon parcialmente el enlace a NKp30Fc.

E. los anticuerpos monoclonales de ratón anti-B7H6 humano bloquean parcialmente el enlace a DOMSP30 Para confirmar que 17B1.3 y 4E5.5 eran mAbs de bloqueo, se realizó un ensayo funcional con las células reporteras DOMSP30. Las células DOMSP30 fueron utilizadas como un sistema celular reportero para evaluar si B7H6 era capaz de inducir la señalización directamente a través de NKp30. (Ver Schleinitz et al. Arthritis Rheum. 58:32156-3223, 2008, para las células DOMSP30) . La activación de DOMSP30 pudo ser detectada ya sea por la producción de IL-2 después de 24 horas de estimulación o por la suprarregulación de CD69 después de 4 horas de estimulación. Las células DOMSP30 fueron cocultivadas ya sea con cualquiera de la línea celular HeLa EV2 o HeLa PF en presencia o ausencia del anticuerpo policlonal anti-NKp30, anti-NKp46, anti-B7H6, IgGl de ratón o uno de los anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano, 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2, 10E2.9 y 17B1.3 (a 10 pg/ml). Después de 4 horas de cocultivo, se midió el número (porcentaje) de células CD69+ DO SP30.

Los resultados mostraron que anti-NKp30 bloqueó completamente la activación de DOMSP30 y que 4E5.5 y 17B1.3 inhibieron parcialmente la activación de DOMSP30. En resumen, en ausencia del anticuerpo, aproximadamente 75% de las células DOMSP30 fueron CD69+, en comparación a los siguientes porcentajes de CD69+ con el cocuitivo del anticuerpo: menos de 10% con anti-NKP30; aproximadamente 20% con el pAb anti-B7H6; y aproximadamente 45% con cada uno de los mAbs 4E5.5 y 17B1.3. En contraste, anti-NKp46 y cada uno de los mAbs 9G9.2, 10E2.9, y 5E1.4 no mostraron efectos sobre la activación de DOMSP30.

F. El anticuerpo monoclonal de ratón 17B1.3 anti-B7H6 humano, es un anticuerpo de transferencia La habilidad de los mAbs anti-B7H6 para actuar como anticuerpos de transferencia fue probada por la realización de los experimentos de inmunotransferencia con los extractos de proteina provenientes de tres diferentes líneas celulares: KHYG-1, la cual no expresa B7H6, y P815.B7-H6 y HEK293, las cuales cada una expresan B7H6. El pAb B7H6 fue utilizado como un control positivo. Las células fueron recolectadas, lavadas en PBS IX frío, suspendidas en amortiguador de Lisis (10 mM Tris-HCl pH 7.6; cloruro de sodio 150 mM; 1 % de Tritón X; IX de Inhibidor de Proteasa (Roche Applied Science, Indianapolis , IN) a una concentración de 20 x 106 células/mL y se dejaron sobre hielo por 30 minutos. Los lisados fueron •luego centrifugados 10 minutos, a 13 200 rpm, a 4 °C. El sobrenadante fue recolectado y la concentración de proteína fue medida con el kit de BCA de Pierce y ajustado a 1.5 mg/ml. 30 µ? de cada lisado celular fueron mezclados con 10 µ? del amortiguador de carga 4X y calentados durante 10 minutos a 95 °C. Estos fueron luego cargados sobre un gel prevaciado (Gel Precise Protein al 2-20 % de Thermo Scientific) y corrido a 110 V. Después de la electroforesis, las muestras fueron transferidas sobre una membrana utilizando Nitrocelulosa de Apilamiento de Transferencia en Gel iBlot, kit Regular (Invitrogen, San Diego, CA) . La membrana fue saturada en IX TBST (Tris HC1 100 mM pH=7.5 + 0.9 % de HC1 + 0.05 % de Tween) + 5 % de leche durante una hora a temperatura ambiente, y luego se incubaron con cada uno de los mAbs anti-B7H6 a 2 g/mL en TBST IX + 5 % de leche toda la noche a 4 °C. La membrana fue lavada dos veces 10 minutos en TBST IX e incubado durante 1 hora a RT con un anticuerpo de oveja anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa de rábano, diluido en TBST IX + 5 % de leche. La membrana fue luego lavada 4 veces 20 minutos en TBST y revelada con el kit ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ) .

Entre los cinco mAbs, únicamente el mAb 10E2.9 (10 g/ml) fue capaz de funcionar como un mAb de inmunotransferencia bajo las condiciones probadas. Estos resultados sugieren que los epitopos de B7H6 para los mAbs 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2 , y 17B1.3 pueden no ser lineales, sino más bien pueden comprender regiones discontinuas del polipéptido B7H6.

G. Tres de los cinco anticuerpos monoclonales anti-B7H6 humano son eficientes para la inmunoprecipitación Para evaluar si 4E5.5, 5E1.4, 9G9.2 , 10E2.9 y 17B1.3 pudieron ser eficientes para las imunoprecipitaciones , los extractos de proteína P815.B7-H6 fueron preparados y las imunoprecipitaciones fueron realizadas con los diferentes mAbs . Los imunoprecipitados fueron corridos sobre un gel de SDS y se observó la presencia de B7H6 utilizando el anticuerpo policlonal anti-B7H6 y el anticuerpo anti-Ig de ratón conjugado a HRP. Los resultados mostraron que 4E5.5, 9G9.2 y 10E2.9 immunoprecipitaron B7H6 a partir de los extractos de proteína P815.B7-H6, mientras que 5E1.4 y 17B1.3 no lo hicieron.

Ejemplo 3: Modelo de carcinoma pancreático BxPC3 para evaluar la eficacia de un anticuerpo anti-B7H6 o el conjugado anticuerpo-fármaco contra el crecimiento tumoral Para probar si un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano-fármaco tiene actividad sobre el crecimiento tumoral en ratones, grupos de ratones son inyectados s.c con el tumor pancreático BxPC3 en el día 0. Una vez que los tumores crecen hasta 150-200 mm3, grupos de ratones (n=10/gp) son inyectados con 1 mg/Kg hasta 30 mg/Kg de reactivo control, anticuerpo anti-B7H6, o el conjugado anticuerpo anti-B7H6-fármaco lX-3X/semana por 3 semanas. El volumen tumoral es monitorizado 3X/semana por 5 semanas. Tumores significativamente más pequeños en ratones inyectados con un anticuerpo anti-B7H6 o el conjugado anticuerpo-fármaco en comparación a los ratones inyectados con el reactivo control', indican la eficacia del antagonista para la inhibición del crecimiento tumoral.

Diseño de estudio: ratones hembra C.B-17 SCID de diez semanas de edad (Charles River Laboratories) son inyectados subcutáneamente sobre el flanco derecho con 2 x 106 células BxPC-3 en el día 0. Comenzando con un tamaño tumoral de 150-200 mm3, grupos de ratones (n=l0/grupo) son inyectados i.p. con 1 mg/Kg a 30 mg/Kg del reactivo control, anticuerpo anti-B7H6, o el conjugado anticuerpo anti-B7H6-fármaco lX-3X/semana por 3 semanas. El crecimiento tumoral es monitorizado 3X/semana por 5 semanas utilizando mediciones con calibrador. El volumen tumoral es calculado utilizando la fórmula ½*(B)2*L (mm3) .

Ejemplo 4: Inhibición del crecimiento de células de carcinoma hepatocelular humano in vivo utilizando el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco Para evaluar la actividad anti-tumoral de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco contra las células de carcinoma hepatocelular humano in vivo, grupos de ratones BALB/c desnudos son inyectados ya sea con las células de carcinoma hepatocelular HuH7 o C3A en el día 0. Los grupos (n=10/grupo) de ratones que poseen tumores reciben 5-75 yg del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco mediante inyección i. p. o peritumoral cada tercer día (EOD, por sus siglas en inglés) desde los días 5-33. El volumen del tumor es monitorizado 3X/semana por 6 semanas. La inhibición del crecimiento tumoral por el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco indica que la proteína respectiva tiene efectos inhibitorios sobre el carcinoma hepatocelular humano in vivo.

Diseño de estudio: Ratones hembra BALB/c desnudos de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) son inyectados s.c. sobre el flanco derecho con 6 x 106 células HuH7 o C3A en el día 0. Grupos de ratones (n=10/grupo) son inyectados i.p. o peritumoralmente con 5 µ?-75 yg de un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o conjugado anticuerpo- fármaco de los días 5-33. Las inyecciones son administradas en un volumen total de 200 µ?. El crecimiento tumoral es monitorizado 3X/semana por 6 semanas utilizando mediciones con calibrador. El volumen tumoral fue calculado utilizando la fórmula ½*(B)2*L (mm3) .

Ejemplo 5; Inhibición del crecimiento de células de carcinoma de próstata humana in vivo utilizando el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco Para evaluar la actividad tumoral del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco contra las células de carcinoma de próstata humano in vivo, grupos de ratones BALB/c desnudos son inyectados ya sea con cualquiera de las células de carcinoma de próstata PC-3 o DU-145 en el día 0. Grupos (n=10/grupo) de ratones que poseen tumores reciben 5-75 yg del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco mediante inyección i.p. o peritumoral cada tercer día (EOD) desde los días 5-33. El volumen tumoral es monitorizado 3X/semana por 6 semanas. La inhibición del crecimiento tumoral (volumen o peso) por un anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco indica que la proteína respectiva tiene efectos inhibitorios sobre el carcinoma de próstata humano in vivo .

Diseño de estudio: ratones desnudos hembras BALB/c desnudos de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) son inyectadas s.c. sobre el flanco derecho u ortotópicamente en el lóbulo de la próstata con 10 x 106 células PC-3 o 6 x 106 células DU-145 en el día 0. Grupos de ratones (n=10/grupo) son inyectados i.p. o peritumoralmente (modelo s.c únicamente) con 5-75 µ? del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco de . los días 5-33. Las inyecciones son dadas en un volumen total de 200 µ?. Para tumores s.c, el crecimiento tumoral es monitorizado 3X/semana por 6 semanas utilizando mediciones con calibrador. El volumen tumoral es calculado utilizando la fórmula ½*(B)2*L (mm3) . Para los tumores ortotópicos, los ratones son sacrificados al final del estudio y el tumor se pesa para hacer posible la evaluación de la carga tumoral.

Ejemplo 6: Inhibición de las células de carcinoma de colon humano in vivo utilizando el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco Para evaluar la actividad tumoral del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco contra las células de carcinoma de colon humano in vivo, grupos de ratones BALB/c desnudos son inyectados ya sea con cualquiera de las células de carcinoma de colon DLD-1 o HCT-116 en el día 0. Grupos (n=10/grupo) de los ratones que poseen tumor reciben 5-75 yg del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco por inyección i.p. o peritumoral cada tercer día (EOD) de los días 5-33. El volumen del tumor es monitorizado 3X/semana por 6 semanas. La inhibición del crecimiento tumoral (volumen o peso) por el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco sugiere que la proteína respectiva tiene efectos inhibitorios sobre el carcinoma de colon humano in vivo.

Diseño de estudio: ratones desnudos hembras BALB/c desnudos de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) son inyectadas s.c. sobre el flanco derecho u ortotópicamente en la pared pancreática con 10 x 106 células DLD-1 o HCT-116 en el día 0. Grupos de ratones (n=10/grupo) son inyectados i.p. o peritumoralmente (modelo s.c únicamente) con 5-75 pg del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco de los días 5-33. Las inyecciones son dadas en un volumen total de 200 µ?. Para tumores s.c, el crecimiento tumoral es monitorizado 3X/semana por 6 semanas utilizando mediciones con calibrador. El volumen tumoral es calculado utilizando la fórmula ¾*(B)2*L (mm3) . Para los tumores ortotópicos, los ratones son sacrificados al final del estudio y el tumor se pesa para hacer posible la evaluación de la carga tumoral.

Ejemplo 7: Inhibición de las células de carcinoma pancreático humano in vivo utilizando el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco Para evaluar la actividad tumoral del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco contra las células de carcinoma de colon humano in vivo, grupos de ratones BALB/c desnudos son inyectados ya sea con cualquiera de las células de carcinoma pancreático BxPC-3 o HPAF-116 en el día 0. Grupos (n=10/grupo) de los ratones que poseen tumor reciben 5-75 del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco por inyección i.p. o peritumoral cada tercer día (EOD) de los días 5-33. El volumen del tumor es monitorizado 3X/semana por 6 semanas. La inhibición del crecimiento tumoral (volumen o peso) por el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco sugiere que la proteína respectiva tiene efectos inhibitorios sobre el carcinoma pancreático humano in vivo.

Diseño de estudio: ratones desnudos hembras BALB/c desnudos de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) son inyectadas s.c. sobre el flanco derecho u ortotópicamente en el lóbulo pancreático con 10 x 106 células BxPC-3 o HPAF-II en el día 0. Grupos de ratones (n=10/grupo) son inyectados i.p. o peritumoralmente (modelo s.c únicamente) con 5-75 pg del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco de los días 5-33. Las inyecciones son dadas en un volumen total de 200 µ? . Para tumores s.c, el crecimiento tumoral es monitorizado 3X/semana por 6 semanas utilizando mediciones con calibrador. El volumen tumoral es calculado utilizando la fórmula ½* (B) 2*L (mm3) . Para los tumores ortotópicos, los ratones son sacrificados al final del estudio y el tumor se pesa para hacer posible la evaluación de la carga tumoral.

Ejemplo 8: Inhibición del linfoma de células B in vivo utilizando el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco Las líneas celulares de linfoma B humano son mantenidas in vitro mediante el pase en medio de crecimiento. Las células son lavadas perfectamente en PBS para eliminar los componentes de cultivo.

Ratones SCID son inyectados con (típicamente) 1 x 106 células de linfoma humano vía la vena de la cola en un volumen de 100 microlitros. El número óptimo de células inyectadas es determinado empíricamente en un estudio piloto para producir la toma de tumores consistentemente con la cinética deseada. El tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco es comenzado al siguiente día mediante implantación subcutánea de una minibomba osmótica ALZET® (ALZET, Cupertino, CA) o por inyección i.p. diaria del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco, o el vehículo. Los ratones son monitorizados para la supervivencia y la morbididad significativa. Los ratones que pierden más de 20% de su peso corporal inicial son sacrificados, así como los ratones que muestran morbididad sustancial tal como parálisis de las extremidades posteriores . Dependiendo de la línea de células de linfoma empleada, los ratones no tratados típicamente mueren en 3 a 6 semanas. Para linfomas de células B que secretan IgG o IgM, la progresión de la enfermedad puede también ser monitorizada mediante muestreo semanal de sangre y medición de los niveles séricos de inmunoglobulina humana mediante ELISA.

Respuesta a la dosis del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco/modelo IM-9 Los ratones son inyectados con 1 x 106 células I -9, y minibombas osmóticas de 28 días implantadas al siguiente día. Las bombas son cargadas con las siguientes concentraciones del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco para distribuir: 0, 0.12, 1.2, o 12 microgramos por día con 8 ratones por grupo de dosis. La protección incrementada de los ratones a partir de la línea celular tumoral con la dosis incrementada del anticuerpo o el conjugado anticuerpo- fármaco indica que los efectos del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco son dependientes de la dosis. Los ratones sobrevivientes al final del experimento no tienen signos de enfermedad y ninguna IgG humana detectable en su suero .

Estos datos demuestran que la eficacia del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco en modelos de linfoma de ratón SCID correlaciona con la habilidad para inhibir el crecimiento de la líneas celulares de linfoma in vivo.

Ejemplo 9: Inhibición de los tumores derivados de células B in vivo utilizando el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo-fármaco La administración del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o · del conjugado anticuerpo-fármaco mediante infusión constante con bombas miniosmóticas, da como resultado concentraciones séricas en estado de reposo proporcionales a la concentración del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco contenido en la bomba. 0.22 mi del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco contenido en la solución salina amortiguada con fosfato (pH 6.0) a una concentración de 2 mg/ml o 0.2 mg/ml es cargada bajo condiciones estériles en bombas miniosmóticas Alzet (modelo 2004 ; Alza Corporation Palo Alto, CA) . Las bombas son implantadas subcutáneamente en ratones a través de una incisión de 1 cm en la piel dorsal, y la piel es cerrada con cierres de heridas estériles. Estas bombas están diseñadas para distribuir sus contenidos a una velocidad de 0.25 µ? por hora en un periodo de 28 días. El método- de administración da como resultado el incremento significativo en la supervivencia en los ratones inyectados con las células tumorales (ver más adelante) .

Efecto del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco sobre los tumores derivados de células B in vivo Los efectos del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo- fármaco son probados in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor en ratón descrito en la presente. El modelo de xenoinjerto va a ser probado es la línea celular linfoblastoide humana IM-9. Los ratones C.B-17 SCID (hembras C . ?-17/IcrHsd- scid; Harían, Indianapolis, Indiana) son divididos en 4 grupos. En el día 0, las células IM-9 son cosechadas del cultivo e inyectadas intravenosamente, vía la vena de la cola, a todos los ratones (aproximadamente 1,000,000 de células por ratón) . En el día 1, las bombas mini-osmóticas que contienen el artículo de prueba o el artículo control son implantadas subcutáneamente en los ratones. Los ratones en los grupos 1-3 (n=9 por grupo) son administrados con el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o ei conjugado anticuerpo-fármaco: el grupo 1 contiene 2.0 mg/mL del anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o del conjugado anticuerpo-fármaco y es administrado con 12 g por día; el grupo 2 contiene 0.20 mg/mL y es administrado con 1.2 por día; el grupo 3 contiene 0.02 mg/mL y es administrado con 0.12 µg por día. Los ratones en el grupo 4 (n = 9) son un control y son tratados con vehículo (PBS pH 6.0).

La supervivencia incrementada de los grupos de tratamiento (por ejemplo, ya sea 12 µ?/día o 1.2 µ?/día) en comparación a los ratones tratados con vehículo, muestra que el anticuerpo monoclonal anti-B7H6 humano o el conjugado anticuerpo- fármaco reduce los efectos de las células tumorales de células B in vivo.

A partir de lo anterior, se apreciará que aunque han sido descritas las modalidades específicas de la invención en la presente para fines de ilustración, pueden ser realizadas diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad, para todos los propósitos.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (47)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) . con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo caracaterizado porque consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242) ; y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245) ; en donde el anticuerpo monoclonal inhibe la interacción del B7H6 humano con NKp30 humana e inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo humano.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo murino seleccionado del grupo que consiste de: a) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM -1-4242) o un fragmento de enlace al antígeno del mismo; y b) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245) o un fragmento de enlace al antígeno del mismo.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: a) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242); y b) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245) .

5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4, caracterizado porque es un anticuerpo de cadena simple.

6. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, caracterizado porque comprende una región Fe que tiene al menos una de actividad de ADCC y actividad de CDC.

7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la región Fe es una Fe de cadena simple (scFc) .

8. Un kit de diagnóstico, caracterizado porque comprende : el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y los medios para detectar el enlace por ese anticuerpo .

9. Una composición caracterizada porque comprende: el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Un conjugado anticuerpo- fármaco caracterizado porque comprende : un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242) ; y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245) ; en donde el anticuerpo monoclonal inhibe la interacción del B7H6 humano con NKp30 humana e inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6, y en donde el anticuerpo está conjugado a un agente citotóxico.

11. El conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo humano.

12. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: a) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242; y b) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245).

13. El conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con las reivindicaciones 10 o 12, caracterizado porque es un anticuerpo de cadena simple.

14. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 10 o 12, caracterizado porque comprende una región Fe que tiene al menos una de actividad de ADCC y actividad de CDC.

15. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la región Fe es una Fe de cadena simple (scFc) .

16. El conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un agente antitubulina, un agente de enlace al canal menor de ADN, a un agente de alquilación del canal menor de ADN, una duocarmicina, y una puromicina.

17. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente antitubulina se selecciona del grupo que consiste de una dolastatina, un alcaloide de vincapervinca, una podofilatoxina, un taxano, un derivado de baccatina, una criptofisina, un maitansinoide, y una combretastatina.

18. El conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es conjugado al agente citotóxico vía un ligador.

19. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el ligador es escindible bajo condiciones intracelulares .

20. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el ligador escindible es un ligador peptídico escindible por una proteasa intracelular .

21. Una composición caracterizada porque comprende: el conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20 ; y un portador farmacéuticamente aceptable .

22. Un método para disminuir la actividad de las células asesinas naturales humanas (NK, por sus siglas en inglés) contra una célula que expresa B7H6 humano, el método esta caracterizado porque comprende: poner en contacto una célula que expresa B7H6 humano, en presencia de una célula NK humana, con una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242); y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245); en donde el anticuerpo inhibe la interacción de B7H5 humano con NKp30 humana y en donde el anticuerpo monoclonal inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6.

23. Un anticuerpo monoclonal para el uso en el tratamiento del rechazo agudo del aloinjerto de células de médula ósea (BMC, por sus siglas en inglés) , en donde el anticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242) ; y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito NO. CNCM 1-4245); en donde el anticuerpo inhibe la interacción de B7H6 humano con NKp30 humana y en donde el anticuerpo monoclonal inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6.

24. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.

25. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: a) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242); y b) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245).

26. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple.

27. Un método para agotar o inhibir el crecimiento de las células que expresan B7H6 humano dentro de una población celular que comprende las células que expresan B7H6 humano, caracterizado porque comprende: poner en contacto las células que expresan B7H6 humano, con una cantidad efectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242); y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245); en donde el anticuerpo monoclonal inhibe la interacción del B7H6 humano con NKp30 humana, y en donde el anticuerpo monoclonal inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6 y en donde el anticuerpo está conjugado a un agente citotóxico.

28. Un conjugado anticuerpo- fármaco para el uso en el tratamiento de un cáncer que expresa B7H6 en a sujeto, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242) ; y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245); en donde el anticuerpo monoclonal inhibe la interacción del B7H6 humano con NKp30 humana y en donde el anticuerpo monoclonal inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6 y en donde el anticuerpo está conjugado a un agente citotóxico.

29. El conjugado anticuerpo- fármaco para el uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el cáncer que expresa B7H6 es un cáncer del colon, hígado, cérvix, pulmón, páncreas, o próstata.

30. El conjugado anticuerpo- fármaco para el uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el cáncer que expresa B7H6 es una leucemia prohemocítica, un linfoma de células B, un linfoma de células T, un linfoma monocítico, una eritroleucemia, linfoma de Burkitt, una leucemia mielogénica crónica, o una leucemia linfoblástica aguda.

31. El conjugado anticuerpo- fármaco para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.

32. El conjugado anticuerpo- fármaco para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: a) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242); y b) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 17B 1.3 (depósito No. CNCM 1-4245) .

33. El conjugado anticuerpo- fármaco para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde el un anticuerpo de cadena simple.

34. Un anticuerpo monoclonal para el uso en el tratamiento de un cáncer que expresa B7H6 en a sujeto, en donde el anticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito NO. CNCM 1-4242) ; y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245) ; en donde el anticuerpo comprende una región Fe que tiene al menos una de actividad de ADCC y actividad de CDC, y en donde el anticuerpo inhibe la interacción del B7H6 humano con NKp30 humana y en donde el anticuerpo monoclonal inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6.

35. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.

36. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: a) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242); y b) el anticuerpo producido por el hibridoma del clon designación número 17B 1.3 (depósito No. CNCM 1-4245).

37. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple.

38. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde la región Fe es una Fe de cadena simple (scFc)

39. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde el cáncer que expresa B7H6 es un cáncer del colon, hígado, cérvix, pulmón, páncreas o próstata .

40. El anticuerpo para el uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde el cáncer que expresa B7H6 es una leucemia prohemocí ica, un linfoma de células B, un linfoma de células T, un linfoma monocítico, una eritroleucemia, linfoma de Burkitt, una leucemia mielogénica crónica, o una leucemia linfoblástica aguda.

41. Un método para detectar la expresión celular de B7H6, caracterizado porque comprende: (1) poner en contacto una muestra biológica que comprende una célula humana que va a ser probada, con un anticuerpo monoclonal que compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242) ; y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245) ; (2) detectar el enlace del anticuerpo, en donde el enlace del anticuerpo indica la presencia B7H6 sobre la célula, para detectar con esto si la célula expresa o no B7H6, y en donde el anticuerpo inhibe la interacción de B7H6 humano con NKp30 humana y en donde el anticuerpo monoclonal inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la muestra biológica comprende células humanas intactas .

43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la muestra biológica comprende una fracción membranal de la célula que va a ser probada.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, caracterizado porque está marcado con un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste de un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, y un marcador bioluminiscente .

45. Un anticuerpo monoclonal para el uso en el diagnóstico de un cáncer que expresa B7H6 en un sujeto, por administración del anticuerpo monoclonal conjugado a un marcador detectable, en donde el aticuerpo compite por el enlace al dominio extracelular de B7H6 humano (residuos de aminoácidos 25-266 de la SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242) ; y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245); y en donde es detectada la distribución del anticuerpo dentro del sujeto y en donde el anticuerpo monoclonal inhibe el reconocimiento celular de las células objetivo que expresan B7H6.

46. El anticuerpo monoclonal para el uso de conformidad con la reivindicación 41, en donde el cáncer es un cáncer del colon, hígado, cérvix, pulmón, páncreas o próstata.

47. Una célula productora de anticuerpo, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: a) el hibridoma del clon designación número 4E5.5 (depósito No. CNCM 1-4242); y b) el hibridoma del clon designación número 17B1.3 (depósito No. CNCM 1-4245).