JP2023523145A - リポ蛋白(a)に対するイソ型非依存性抗体 - Google Patents
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Abstract
本開示は、リポ蛋白(a)エピトープに結合する抗体及び抗体断片、及び遺伝子導入動物モデルを作製すること、及び前記断片を、Lp(a)関連の疾患及び障害を治療するための治療薬及び診断薬として使用することを含む、前記抗体及び抗体断片の使用方法を提供する。【選択図】図1D
Description
本願は、2020年4月27日に出願された米国仮出願第63/016,017号の優先権を主張し、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、リポ蛋白(a)(Lp(a))に結合するヒト及びヒト化抗体、それらの単鎖可変領域(scFv)、及びそれらの結合ドメインを提供する。本開示は、Lp(a)に関連する疾患及び障害を治療し、診断に使用するための、抗体、そのscFvs及び結合ドメインを有する患者を治療するための方法及び組成物に関する。
“Sequence-Listing_ST25.txt”と題した配列表が本願に付随されている。これは、2021年4月27日上に作成され、34,360バイトのデータを有し、IBM-PCのMS-Windows OSでフォーマットされたものである。該配列表は、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
リポ蛋白(a)[Lp(a)]は、アポリポ蛋白B-100に共有結合したアポリポ蛋白(a)からなる。該アポリポ蛋白(a)タンパク質は、個体と集団との間で可変数のクリングルIV型2(KIV2)反復により、広範囲のサイズ不均一性を示す(例えば、図1Aを参照)。アポリポ蛋白(a)は、可変数の同一コピー(1~>40)に存在するKIV2を除いて、1つのコピー中に存在する10個の独特のクリングルIV反復からなる。それはまた、KVの1つのコピー及び不活性プロテアーゼ様ドメインを含む。血漿中Lp(a)レベルは、KIV2反復数と血漿中Lp(a)レベルの逆相関を導く、少数のより効率的に分泌されるKIV2反復を含有するイソ型を用いて、肝細胞中のアポリポ蛋白(a)の産生速度によって遺伝的方法で測定される。
血漿中Lp(a)の測定には多くのアッセイが存在するが、アッセイ方法は、製造業者間で異なり、世界的に標準化されていない。KIV2における反復数の変動により、血漿中Lp(a)レベルの正確な測定に有意な方法が制限されている。全ての商業的に入手可能なアッセイは、KV2反復及びアポリポ蛋白(a)の他のセグメントに複数回結合し得る抗体の混合物であるポリクローナル抗体を使用する。さらに、アッセイ検量用試料は、多数のドナーのプールされた血漿から由来し、一般に、測定されている試料の既知のアポリポ蛋白の全てを代表することはできない。検量用試料に対して、ポリクローナル抗体は、血漿中Lp(a)が低い被験者において見出されるより大きなアポリポ蛋白(a)イソ型により頻繁に結合する傾向があり、従って、これらの値を過大評価する傾向がある。対照的に、このような抗体は、血漿中Lp(a)が高い被験者においてに見出される小さなイソ型にあまり結合せず、これらの値を過小評価する傾向がある。このサイズに依存するバイアスは、1つのプール上での連続希釈とは対照的に、ほとんどのイソ型を代表する検量用試料の別々のプールを使用することで最小化することができ、また、より正確な方法で新しい値を検量用試料に再割り当てすることもできる。
全ての人がその一生のうちに少なくとも1回Lp(a)を測定することを推奨するガイドライン及びLp(a)を実質的に低下させる新しい治療法の開発によって、Lp(a)値の試験は増加することが予想される。従って、正確な方法の開発は、従来よりも急務になっている。
本開示は、リポ蛋白(a)を認識し、それに結合する抗体または抗体断片を提供し、該抗体または抗体断片が、可変重鎖(VH)ドメイン及び/または可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで、(a)前記VHドメインが、配列番号:4またはその変異体、配列番号:6またはその変異体、及び配列番号:8またはその変異体からなる群から選択される1つ、2つ、または3つの相補性決定領域(CDR)を包含するアミノ酸配列を含み、(b)前記VLドメインが、配列番号:12またはその変異体、配列番号:14またはその変異体、及び配列番号:16またはその変異体からなる群から選択される1つ、2つ、または3つの相補性決定領域(CDR)を包含するアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体または抗体断片は、Lp(a)に結合する配列番号:4、6、8、12、14、16、及び前記いずれかの組み合わせから選択されるCDRを含む。一実施形態では、前記VHドメインは、配列番号: 4、6、及び8を含むCDRを包含するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、前記VLドメインは、配列番号:12、14、及び16を含むCDRを包含するアミノ酸配列を含む。別のまたはさらなる実施形態では、前記抗体または抗体断片は、配列番号:4、6、8、12、14、及び16の相補性決定領域を含む重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインを有する抗体またはscFvからなる群から選択される。さらにまた別の実施形態では、該重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインは、Fc領域に連結されている。さらなる実施形態では、該Fc領域は、ヒトFc領域である。別の実施形態では、前記抗体断片は、リポ蛋白(a)のKIV9のエピトープを認識する単鎖可変断片(“scFv”)を含む。さらなる実施形態では、該エピトープは、配列CSETESGVLETPTVVPVPSMEAH(配列番号:19、アミノ酸1579~1601の配列番号:20を参照)を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、該エピトープは、配列番号:19を含有し、配列番号:19のN末端及び/またはC末端に1~10個の他のアミノ酸を包含する(他のアミノ酸は、配列番号:20のアミノ酸1579の上流またはアミノ酸1601の下流に、該1~10個のアミノ酸N末端またはC末端を包含することができる)。さらに別のまたはさらなる実施形態では、前記scFvは、生理条件下で可溶である。さらに別の実施形態において、前記scFvは、配列番号:10に記載の配列と少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、前記scFvは、配列番号:2に記載の配列と少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む。
本開示はまた、前記可変軽鎖及び可変重鎖を含む抗体を提供する。一実施形態では、該抗体は、ヒト化される。別の実施形態では、該抗体は、キメラである。
本開示はまた、本開示の抗体または抗体断片、及び薬剤的に許容される担体、賦形剤、及び/または安定剤を含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、固体基質に結合された本開示の抗体または抗体断片を提供する。
本開示はまた、検出可能な標識に操作可能に連結された本開示の抗体または抗体断片を提供する。
本開示はまた、本開示の抗体、抗体断片、可変軽鎖、可変重鎖、またはscFvをコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号:1及び/または9、またはその変異体を含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号:19を含有するLp(a)のKIV9のエピトープに結合するポリペプチドをコードする。
本開示は、本開示の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む。
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供する。
本開示はまた、本開示のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
本開示はまた、本開示の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子導入動物を提供する。一実施形態では、該動物は、マウスである。別のまたはさらなる実施形態では、本開示のscFvまたは抗体は、該遺伝子導入動物の肝細胞及び/またはマクロファージから発現される。さらなる実施形態では、該遺伝子導入動物は、冠状動脈疾患または大動脈狭窄及び/またはアテローム性動脈硬化症のような障害の効果をモデル化するために使用される。
本開示はまた、冠状動脈疾患を治療または予防する方法を提供し、該方法は、本開示の抗体または抗体断片またはscFvを、冠状動脈疾患、脳卒中、末梢動脈疾患または石灰化大動脈狭窄を有するかまたは有する危険性を有する被験者に投与することを含む。
本開示はまた、上記及び本明細書のVHドメイン及び/またはVLドメインの結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供し、ここで、該CARが、Lp(a)に結合する。
本開示はまた、配列LETPTVV(配列番号:18)を含む抗原性ペプチド、または配列CSETESGVLETPTVVPVPSMEAH(配列番号:19;アミノ酸1579~1601からの配列番号:20も参照)を含む、またはそれからなる抗原性ペプチドを含む免疫学的組成物を提供する。一実施形態では、該抗原性ペプチドは、配列番号:18または配列番号:19を含み、かつ、前記N末端及び/またはC末端に1~10個の他のアミノ酸(他のアミノ酸は、配列番号:20のアミノ酸1579の上流またはアミノ酸1601の下流に、該1~10個のアミノ酸N末端またはC末端を包含することができる)を包含する、1~10個のアミノ酸N末端またはC末端を含むことができる)。一実施形態では、配列番号:18または19を含むか、またはそれからなるペプチド配列は、免疫賦活剤に連結されるか、または免疫賦活剤と共に投与される。本開示はまた、配列番号:18または19のペプチドで哺乳動物を免疫することにより得られる抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)を提供する。
本開示はまた、本開示のキメラ抗原受容体を含むCAR-T細胞を提供する。
本明細書及び添付の請求項で用いられる場合、単数形の“1つ”及び”該”は、文脈が明らかに他のことを示さない限り 、複数の参照対象を含む。従って、例えば、1つの”単鎖可変断片”または”scFv”への言及は、複数の単鎖可変断片への言及を含み、“リポ蛋白(a)” への言及は、1つ以上のリポ蛋白(a)及び当業者に公知のその等価物への言及を含む。他にも同様である。
別途に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び試薬が、開示される方法及び組成物の実施において使用され得るが、本明細書では例示的な方法及び材料が記載されている。
本明細書で言及される全ての刊行物は、本明細書の説明に関連して使用され得る刊行物に記載される方法論を説明及び開示するために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記及び本文全体で説明されている刊行物は、本願の出願日より前の開示のためにのみ提供されている。ここでは、本発明者らは、従来の開示によりそのような開示を先行させる権利を与えられていないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書において明確に定義された用語と類似している、または同一である1つまたは複数の刊行物に提示される任意の用語に関して、本明細書に明示的に提供される用語の定義は、全ての点で制御するであろう。
また、“及び”の使用について、特に明記しない限り、これは“及び/または”を意味する。同様に、“含む”、“含んでいる”、“包含する”、及び“包含している”は、交換可能であり、限定することは意図されない。
さらに理解されたいこととして、様々な実施形態の記載には”含む”という用語が用いられる場合、当業者は、いくつかの特定の場合では、実施形態が代替的に“本質的に・・・から本なる”または“・・・からなる”という表現を用いて記載することができる。
リポ蛋白(a)(Lp(a))は、ヒト集団において一般的である。現在、生体試料中のLp(a)含量を測定するための標準化された方法または組成物はない。Lp(a) の測定に使用されている現在の抗体は、クリングル反復 (タイプ2)に結合するため、存在する反復の数に依存する。これにより、測定が不明瞭になる。本開示は、組成物及び非反復エピトープに結合することによってLp(a)を測定する方法を提供する。本開示は、非反復のみに結合する抗体及び抗体断片を提供し、従って、本開示は、より正確なLp(a)含量の測定方法を提供する。
量や時間的持続等の測定可能な値を指すときの“約”という用語は、±20%、またはある場合には±10%、またはある場合には±5%、またはある場合には±1%、またはある場合には±0.1%の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示された方法を実施するのに適切であるか、または本明細書の組成物を説明するために適切である。さらに、任意の値または範囲(例えば、20未満、または類似の用語)は、そのような値の間の任意の整数またはその値までのいずれかの整数を明示的に含む。従って、例えば、“1~5回の変異”は、明示的に1回、2回、3回、4回、及び/または5回の変異を含む。
“抗体”及び“免疫グロブリン”という用語は、最も広い意味で互換的に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、それらが所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体)を含み、抗体断片も含む。抗体は、ヒト、ヒト化及び/または親和性の成熟したものであり得る。
抗体重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、5つの主要なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM、そして、これらのいくつかは、さらにサブクラス(イソ型)例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2に分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリ ンの異なるクラスのサブユニット構造と三次元配置は周知されている。
“抗体断片”は、無傷の抗体の一部のみを含み、該部分は、一般的には、無傷の抗体に存在する場合、通常その部分に関連する機能の少なくとも1つ、より一般的にはほとんどまたは全てを保持する。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子(scFv)、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は、無傷の抗体の抗原結合部位を含み、従って、その同族抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えばFc領域を含む抗体断片は、FcR結合、抗体半減期変調、ADCC機能、及び補体結合のような無傷の抗体中に存在する場合、Fc領域に通常関連する生物学的機能の少なくとも1つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、無傷の抗体と実質的に類似したin vivo半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体断片は、該断片にin vivo安定性を与えることができるFc配列に連結された抗原結合アームを含み得る。
“抗体重鎖”という用語は、天然に存在する立体配座における抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常、抗体が属するクラスを決定する。
“抗体軽鎖”という用語は、天然に存在する立体配座における抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ(κ)及びラムダ(λ)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖イソ型を指す。
“抗原”は、抗体が選択的に結合できる標的である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、小分子、または他の天然または合成化合物であり得る。本開示の一実施形態では、抗原は、Lp(a)である。別の実施態様では、前記抗体は、LETPTVV(配列番号:18)またはCSETESGVLETPTVVPVPSMEAH(配列番号:19)を含む抗原上のエピトープに結合する。
本明細書で使用される“アレイ”という用語は、一般に、結合アイランド、生体分子の所定の空間的配置、または結合アイランドまたは生体分子の空間的配置を指す。本開示による表面に固定化された生体分子を含むアレイは、“生体分子アレイ”とも呼ばれる。本開示による表面への生体分子の結合を容易にするために活性化され、適合され、調製され、または修飾された表面を含む”アレイ”は、“結合アレイ”とも呼ばれる。さらに、“アレイ”という用語は、本明細書では、表面がアレイの複数のコピーを有する場合のように、表面上に配置された複数のアレイを指すために使用され得る。複数のアレイを有するこのような表面は、“多重アレイ”または“反復配列”とも呼ばれる。本明細書における“アレイ”という用語の使用は、生体分子アレイ、結合アレイ、多重アレイ、及びそれらの任意の組み合わせを包含し得る。その適切な意味は、文脈から明らかになるであろう。生体試料は、血漿を含む体の任意の組織からの液体試料または固体試料を含むことができる。
本開示のアレイは、基材を含む。“基質”または“固体支持体”または他の文法的な等価物は、本明細書では、生体分子の付着に適した任意の材料を意味し、少なくとも1つの検出方法に適用することができる。当業者には理解されるように、可能な基材の数は、非常に多い。可能な基材には、ガラス、及び改変されたまたは機能化されたガラス、プラスチック (アクリル、ポリスチレン、及びスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン等を含む)、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカ、またはシリコン及び変性シリコン、カーボン、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミック、及びその他の様々なポリマーを含むシリカベースの材料が含まれるが、これらに限定されない。また、当該技術分野で知られているように、前記基材は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、またはアガロースのようなポリマーを含む任意の数の材料でコーティングされ得る。このようなコーティングは、血清からの生体試料でのアレイの使用を容易にすることができる。一実施形態では、前記生体分子は、本開示の抗体、抗体断片、または誘導体である。
本開示の平面アレイは、一般に、アレイフォーマットの生体分子のアドレス可能な位置(例えば、“パッド”、“アドレス”または“微小位置”)を含む。アレイのサイズは、アレイの組成及び最終用途に依存するであろう。約2個の異なる生体分子を含むアレイを作製することができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、アレイフォーマットでなくてもいい。即ち、いくつかの実施形態では、単一の生体分子を含む組成物も製造され得る。また、いくつかのアレイでは、異なる組成物または同一の組成物のいずれかの、複数の基質を使用してもよい。従って、例えば、大きな平面アレイは、複数のより小さい基質を含み得る。一実施形態では、前記生体分子は、本開示の抗体、抗体断片または誘導体である。
平面アレイの代替として、フローサイトメトリーと組み合わせたビーズベースのアッセイが、多パラメータの免疫測定を実施するために開発されている。ビーズベースのアッセイのシステムでは、生体分子をアドレス可能な微小球に固定することができる。個々の免疫測定のための各生体分子は、異なるタイプの微小球(即ち、“マイクロビーズ”)に結合され、免疫測定反応は、微小球の表面上で行われる。別個の蛍光強度を有する染色された微小球を、それらの適当な生体分子と別々に装填する。異なる捕捉プローブを有する異なるビーズセットは、カスタムビーズアレイを産生するために必要に応じてプールすることができる。次いで、単一の反応容器中でビーズアレイを試料と共にインキュベートし、免疫測定を実施する。一実施形態では、前記生体分子は、本開示の抗体、抗体断片または誘導体である。
“抗Lp(a)抗体”または“Lp(a)に結合する抗体”という用語は、Lp(a)を標的とする診断薬及び/または治療薬として適用するように十分な親和性でLp(a)に結合できる抗体を指す。本開示のいくつかの実施形態では、抗Lp(a)抗体は、KIV2またはプラスミノーゲンに結合することなく、KIV9に特異的に結合する。特定の実施態様では、前記抗体または抗体断片は、LETPTVV(配列番号:18)またはCSETESGVLETPTVVPVPSMEAH(配列番号:19)を含むかまたはそれからなるエピトープに結合する。
“遮断”抗体または“拮抗”抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。特定の遮断抗体または拮抗抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。一実施形態では、遮断抗体は、その抗原に結合するが、FcRに結合せず、またはADCCを生じさせない。従って、一実施形態では、前記抗体または抗体断片は、その抗原に結合し、抗原の生物学的活性を防止または阻害するが、一方、該抗体または抗体断片自体が、免疫系を誘導しないか、免疫系に限られた効果を与える。
“結合親和性”は一般に、分子の結合部位(例えば、抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用する“結合親和性”は、結合ペアのメンバー(例えば、抗体と抗原)間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子“X”のパートナー“Y”に対する親和性は、一般に解離定数(Kd)で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含む当技術分野で既知の一般的な方法で測定できる。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある。一方、高親和性抗体は、一般に、抗原に速く結合し、より長く結合したままになる傾向がある。当技術分野において結合親和性を測定する様々な方法が知られており、それらのいずれも本発明の目的に使用することができる。
“・・・と同じエピトープに結合する”は、例示された抗体、scFv、または他の抗原結合ドメインと同じエピトープを有する標的抗原に結合する抗体、scFv、または他の抗原結合ドメインの能力を意味する。一例として、例示された抗体、scFv、または他の結合剤、及び他の抗体のエピトープは、標準的なエピトープマッピング技術を用いて測定することができる。当該技術分野で周知のエピトープマッピング技術には、Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyの方法におけるエピトープマッピングプロトコールが含まれる。例えば、線形エピトープは、例えば、固体支持体上に多数のペプチドを同時に合成し、前記ペプチドは、タンパク質分子の部分に対応し、該ペプチドが依然として該支持体に結合している間、該ペプチドを抗体と反応させることによって、測定され得る。このような技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第4,708,871号;Geysenら, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysenら, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysenら, (1986) Mol. lmmunol. 23: 709-715に記載されている。本開示の抗体または抗体断片により結合されたエピトープは、エピトープビニングアッセイによって測定することができる。エピトープビニングは、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体のライブラリーを特徴付けて分類するために使用される競合的免疫測定である。類似の標的に対する抗体は、ライブラリー内の他の全ての抗体に対してペアで試験され、抗体が抗原のエピトープへの互いの結合を遮断するかどうかが確認される。各抗体がライブラリー中の他の全ての抗体に対して作成されたプロフィールを有した後、ライブラリー中の他の抗体に対し、競合的な遮断プロファイルが各抗体について作成される。密接に関連したビニングプロファイルは、抗体が同一または密接に関連するエピトープを有し、一緒に“ビニング”されていることを示す。同様に、立体構造のエピトープは、例えば、水素/重水素交換、x線結晶学、及び2次元核磁気共鳴によるアミノ酸の空間的立体配座を測定することによって容易に同定される。タンパク質の抗原性領域は、例えば、オックスフォード分子グループから入手可能なOmigaバージョン1.0ソフトウェアプログラムを用いて計算されたもののような標準的抗原性及びヒドロパシープロットを用いて、同定することもできる。該コンピュータプログラムは、抗原性プロフィールの測定にHopp/Woods法(Hoppら、(1981) Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824-3828)を採用し、ヒドロパシープロットの測定にKyte-Doolittle技術(Kyteら、(1982) J. Mol. Bioi. 157:1 05-132を採用している。標的に対する選択されたモノクローナル抗体(例えば、Lp(a))が独特のエピトープに結合するかどうかを測定するために、各抗体を市販の試薬でビオチン化することができる。標識されていないモノクローナル抗体及びビオチン化されたモノクローナル抗体を用いた競合試験は、Lp(a)でコーティングされたELISAプレートを用いて行うことができる。ビオチン化mAb結合は、ストレプト-アビジン-アルカリホスファターゼプローブで検出することができる。
“生体試料”は、個体から得られた様々な種類の試料を包含し、診断またはモニタリングアッセイで用いることができる。該定義は、血液、血漿、血清、痰、脳脊髄液、尿及び生物学的起源の他の液体試料;生検試料のような固体組織試料;または組織の培養物またはそれに由来する細胞、及びそれらの子孫を包含する。該定義はまた、例えば、試薬による処理、可溶化、またはタンパク質やポリヌクレオチドのような特定の成分の濃縮、または薄片製作の目的のために半固体または固体マトリックスへの埋め込み等、調達後に何らかの方法で操作された試料も含む。生体試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び/または保存された器官または組織試料または生検または吸引からの固体組織、血液または任意の血液成分、脳脊髄液、羊水、腹膜液、または間質内液のような体液、被験者の妊娠中または発達中の任意の時点からの細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、前記生体試料は、炎症部位、腫瘍部位または冠状動脈または血管疾患の部位から得られる。前記生体試料は、保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質等のような性質的に組織と天然に混合されない化合物を含有し得る。
“保存的置換”または“保存的配列修飾”は、抗体または抗体断片のようなタンパク質の結合特性または機能を有意に影響または変化させないアミノ酸修飾を指す。例えば、“保存的配列修飾”は、抗体、抗体断片、または非免疫グロブリン結合ドメインの結合特性または機能を有意に影響または変化させないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介突然変異誘発のような、当該分野で公知の標準的な技術により、抗体または抗体断片、非免疫グロブリン結合ドメイン、または本開示の他のタンパク質またはポリペプチドに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β-分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン) を有するアミノ酸が含まれる。従って、本開示の抗Lp(a)抗体または断片内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換することができ、そして改変された抗体または抗体断片は、本明細書に記載の結合及び/または機能的アッセイを用いて試験することができる。
用語“二重特異性抗体”は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)中の軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む2つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。同じ鎖上の2つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインは、別の鎖の相補的ドメインとペアを組むことを余儀なくされ、2つの抗原結合部位を産生する。二重特異性抗体は、例えば、EP 404,097;WO 93/11161;及びHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)に、さらに詳細に記載されている。三重特異性抗体及び四重特異性抗体もまた、Hudsonら、Nat. Med. 9:129-134(2003) に記載されている。
“障害”または“疾患”は、本開示の物質/分子または方法を用いた治療または診断から利益を受ける任意の状態である。これには、哺乳動物を問題の障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患が含まれる。本明細書で治療される障害の非限定的な例には、心血管疾患、狭窄症、肝臓疾患(例えば、NASHまたはNALFD)、川崎病、老化関連疾患及び障害、老化、またはLp(a)に起因する炎症性疾患が含まれる。
本明細書で使用される“・・・から誘導された”という用語は、第1分子と第2分子との間の関係を示す。それは、一般に、第1分子と第2分子との間の構造的類似性を指し、第2分子から誘導された第1分子上のプロセスまたは供給源の制限を暗示しないかまたは含まない。例えば、抗体分子から誘導された抗体断片の場合、該抗体断片は、必要な機能、即ち抗原に結合する能力を有するように、十分な抗体構造を保持する。それは、抗体断片を産生する特定なプロセスの制限を暗示しないかまたは含まない。
抗体“エフェクター機能”は、抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指し、抗体イソ型と共に変化する。抗体エフェクター機能の例には、Clq結合及び補体依存性細胞毒性(CDC);Fc受容体結合;抗体依存の細胞媒介性細胞毒性(ADCC);貪食作用;細胞表面受容体の減少(例えば、B細胞受容体);及びB細胞活性化が含まれる。
本明細書で使用される“エピトープ”は、免疫応答を誘発できる抗原の部分、または抗体または抗体断片に結合する抗原の部分であると定義される。エピトープは、タンパク質配列またはタンパク質サブ配列であってもよい。一実施態様では、本開示のエピトープは、配列番号:18及び/または19を含むかまたはそれからなるペプチドである。
“発現ベクター”という用語は、発現されるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞またはin vitro発現系によって供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、 (例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれる)プラスミド、及びウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)を含む当該技術分野で公知の全てのベクターが含まれる。
“Fc受容体”または“FcR”は、抗体のFc領域に結合する受容体を表す。いくつかの実施形態では、FcRは、天然のヒトFcRである。他の実施形態では、FcRは、IgG抗体(ガンマ受容体)に結合し、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIサブクラスの受容体(これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライス型を含む)を含むものである。FcγRII受容体には、FcγRIIA(“活性化受容体”)及びFcγRIIB(“阻害性受容体”)が含まれる。それらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含有する。阻害性受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ(ITIM)を含有する(例えば、Daeron、Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)を参照)。FcRに関する総論としては、例えば、RavetchとKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capelら、Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Haasら、J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) がある。他のFcRは、将来特定されるものも含めて、本明細書の用語“FcR”に包含される。
Fc受容体はまた、新生児受容体であるFcRnを含み、これは、母体IgGの胎児への移行(Guyerら、J. Immunol. 117:587 (1976)及びKimら、J. Immunol. 24:249 (1994))及び免疫グロブリンの恒常性維持の調節に関与している。FcRnへの結合を測定する方法は知られている(例えば、GhetieとWard., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetieら、Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hintonら、J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hintonら)を参照)。
in vivoでのヒトFcRnへの結合及びヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトFcRnを発現する遺伝子導入のマウスまたは遺伝子導入されたヒト細胞株において、または変異Fc領域を有するポリペプチドが投与される霊長類において測定できる。WO 2000/42072(Presta)は、FcRへの結合が改善または減少した抗体変異体を記載している。例えば、Shieldsら、J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照されたい。それらのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いられる“Fc領域”という用語は、天然配列Fc領域及び変異体Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を指す。
“機能性Fc領域”は、天然配列Fc領域の“エフェクター機能”を有する。そのようなエフェクター機能は、一般に、Fc領域がドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)への結合と組み合わされることを必要とし、(本明細書に引用された参考文献に記載されているような)様々なアッセイを用いて評価され得る。
“天然配列Fc領域”は、天然に見られるFc領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトFc領域には、天然配列のヒトIgG1 Fc領域(非Aアロタイプ及びAアロタイプ);天然配列のヒトIgG2 Fc領域;天然配列のヒトIgG3 Fc領域、及び天然配列のヒトIgG4 Fc領域、ならびにそれらの天然に存在する変異体が含まれる。
“Fv”は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。双鎖Fv種では、この領域は、緊密な非共有結合の関係での1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインからなる二量体で構成される。単鎖Fv(SCFv)種では、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインを柔軟なペプチドリンカーで共有結合させることができ、これにより、該軽鎖と重鎖は、双鎖 Fv 種に類似した“二量体”構造に関連することができる。各可変ドメインの3つの超可変領域 (HVR; CDRと呼ばれることもある)が相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位を定義するのは、この構成である。まとめると、該6つのHVR(またはCDR)が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのHVRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
“Fab断片”は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1定常ドメイン(CH1)を含む抗体断片を指す。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が追加されている点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するFab'の本明細書における呼称である。F(ab')2抗体断片は元々、その間にヒンジシステインを有するFab'断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的共役も知られている。
抗体のパパイン消化は、“Fab”断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合Fab断片を生成し、それぞれに単一の抗原結合部位と、残存する“Fc”断片があり、その名前は容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位があり、かつ、依然として抗原を架橋できるF(ab')2断片が生成される。
“フレームワーク”または“FR”残基は、本明細書で定義されるHVR (またはCDR)残基以外の可変ドメイン残基である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、該レシピエントのHVR(CDR)からの残基は、所望の特異性、親和性、及び/または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種(ドナー抗体)のHVR(CDR)からの残基に置き換えられている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。抗体機能をさらに改良するために、これらの修飾を行ってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その中に、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。前記ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。さらに詳細については、例えば、Jones ら Nature 321:522-525 (1986); Riechmann ら Nature 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) を参照されたい。また、VaswaniとHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); HurleとGross, Curr. Op. Biotech, 5:428-433 (1994);及び米国特許第6,982,321及び7,087,409号も参照されたい。
“ヒト抗体”は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応し、及び/または本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための任意の技術を用いて作製されたアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、当技術分野で既知の様々な技術を用いて作製することができる。それには、ファージディスプレイ ライブラリ、HoogenboomとWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marksら、J. Mol. Biol., 222:581 (1991) が含まれ、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。また、Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、 Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boernerら、J. Immunol., 147(1):86-95 (1991) に記載された方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。また、van Dijkとvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001) も参照されたい。それらの全体が参考により本明細書に組み込まれる。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、内因性遺伝子座が無効になっている遺伝子導入動物(例えば、免疫化された異種マウス)に抗原を投与することによって調製できる(例えば、米国特許第6,075,181及び6,150,584号を参照)。また、ヒトB細胞雑種細胞技術を介して産生されたヒト抗体に関しては、例えば、Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) を参照されたい。その全体が参考により本明細書に組み込まれる。
“ヒトエフェクター細胞”は、1つ以上のFcRを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。特定の実施形態では、該細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行する。ADCCを媒介したヒト白血球の例には、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、及び好中球等が含まれる。該エフェクター細胞は、天然の供給源、例えば血液から単離され得る。
本明細書で用いられる場合、“超可変領域”、“HVR”または“HV”(“CDR”と呼ばれることもある)という用語は、配列が超可変であり、かつ/または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体には6つのHVR“CDR”が含まれ、そのうち、VHに3つ(H1、H2、H3)、VLに3つ(L1、L2、L3)がある。天然抗体では、H3及びL3は、6つのHVRの中で最も多様性を示し、特にH3は、抗体に良い特異性を与える上で独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Xuら、Immunity 13:37-45 (2000); JohnsonとWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)を参照されたい。確かに、重鎖のみからなる天然のラクダ科の抗体は、軽鎖がない場合には、機能的であり、安定している。例えば、Hamers-Castermanら、Nature 363:446-448 (1993); Sheriffら、Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996) を参照されたい。
“単離された”抗体または抗体断片等は、その自然環境の成分から同定及び分離及び/または回収された抗体、抗体断片または誘導体を指す。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断または治療への使用を妨害し得る物質を含み、酵素、ホルモン、脂質、及びその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含むことがある。いくつかの実施形態では、前記抗体または抗体断片は、(1)Lowry法で測定される重量で95%を超え、通常は重量で99%を超えるまで精製され、(2)スピニングカップシーケンサーを用いて、N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るのに十分な程度まで精製され、または(3)クーマシーブルーまたはシルバー染色を用いて、還元または非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性を得るまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、単離された抗体または抗体断片には、組換え細胞内にin situの抗体または抗体断片が含まれる。しかし、通常、単離された抗体または抗体断片は、少なくとも1つの精製工程により調製される。
“単離された”核酸分子は、それが抗体核酸の天然の供給源において通常関連している少なくとも1つの汚染核酸分子から同定及び分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、それが自然に見られる形態または環境以外のものである。従って、単離された核酸分子は、天然の細胞に存在するような核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色***置にある場合、通常は抗体を発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
本明細書で用いられる“標識”という用語は、核酸プローブ、抗体または抗体断片の試薬に直接的または間接的に結合または融合され、それが結合または融合される試薬の検出を容易にする化合物または組成物を指す。標識それ自体が検出可能(例えば、放射性同位元素標識、発光または蛍光標識)であってもよく、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい。
“リポ蛋白(a)”または“Lp(a)”は、アポリポ蛋白(a)(Apo(a))と呼ばれるタンパク質を含有する低密度のリポ蛋白変異体を指す。遺伝的及び疫学的研究では、リポ蛋白(a)は、例えば冠動脈心疾患及び脳卒中のようなアテローム性動脈硬化症及び関連疾患の危険因子として同定された。リポ蛋白(a)は、LDL様粒子及び該粒子の外殻に含まれるapoBに共有結合している特定のアポリポ蛋白(a) から構成される。アポ(a)タンパク質は、サイズ多型[KIV2 VNTR]に起因してサイズが変化し、これは、LPA遺伝子における可変数のクリングルIV反復によって引き起こされる。遺伝子レベルにおけるこのサイズ変化は、タンパク質レベルでも発現され、10から50以上のクリングルIV反復(可変クリングルIVドメインの各々は、114個のアミノ酸からなる)を有するアポ(a)タンパク質を生じる。これらの可変apo(a)サイズは、“apo(a)イソ型”として知られている。apo(a)イソ型のサイズとLp(a)の血漿中濃度との間には一般的な逆相関がある。Lp(a)の濃度は、<0.2 mg/dLから>200 mg/dLまで、個人間で 1,000 以上も異なる場合がある。アジア、オセアニア、またはヨーロッパの集団と比較して、アフリカ系の集団ではLp(a)の平均血漿中濃度が、2 倍から3 倍高い。アポ(a)イソ型のサイズとLp(a)の血漿中濃度との間の一般的な逆相関は、全ての集団において観察される。Lp(a)の模式図は、図1Aに示されている。
Lp(a)は、アテローム発生のプロセスに寄与する。アポリポ蛋白(a)の構造は、プラスミノーゲン及びtPA(組織プラスミノーゲン活性化因子)と類似であり、それは、その結合部位についてプラスミノーゲンと競合し、線溶化を減少させる。また、Lp(a)は、PAI-1の分泌を刺激するので、それは、血栓形成につながる。それはまた、組織因子経路阻害剤の機能を阻害することによって凝固を増強し得る。さらに、Lp(a)は、アテローム性動脈硬化症を引き起こすコレステロールを担持し、アテローム発生性プロ-炎症性酸化リン脂質をヒト血漿中の酸化リン脂質の優先的担体として結合し、これは、炎症性細胞を血管壁に誘引し、平滑筋細胞増殖をもたらす。Lp(a)はまた、血管壁及び細胞外マトリックスの成分と相互作用することによって創傷治癒及び組織修復に関与すると仮定される。Apo (a)、Lp(a)粒子の明確な特徴は、固定化フィブロネクチンに結合し、それにより、セリン-プロテイナーゼ型タンパク質分解活性を有するLp(a)を提供する。
血液中の高Lp(a)は、冠動脈心疾患(CHD)、心血管疾患(CVD)、アテローム性動脈硬化症、血栓症、及び脳卒中と相関する。高Lp(a)は、LDLを含む他の心臓リスク因子とは無関係に、早期のアテローム性動脈硬化症と相関する。進行した心血管疾患の患者では、Lp(a)は、プラーク血栓症の凝固リスクを示す。Apo(a)は、プラスミノーゲン(PLG)と非常に類似するドメインを含む。Lp(a)は、血管壁に蓄積し、PLGの細胞表面への結合を阻害し、これにより、プラスミンの生成を減少させ、凝血を増加させる。また、Lp(a)によるPLGのこの阻害は、平滑筋細胞の増殖を促進する。Lp(a)のこれらの独特の特徴は、Lp(a)が血餅及びアテローム性動脈硬化症の発生を引き起こすことを示唆している。上昇したLp(a)と心臓病との間の強い相関関係を確認する多数の研究が、Lp(a)が心血管疾患の重要な独立した予測因子であるというコンセンサスに導かれた。動物での研究により、Lp(a)は、プラークのサイズ、炎症、不安定性、及び平滑筋細胞の成長を増加させることによってアテローム性動脈硬化損傷に直接寄与し得ることが示された。遺伝子データはまた、Lp(a)が心血管疾患を引き起こす理論をサポートする。Lp(a)は、特に 30 mg/dl を超えるレベルで、アテローム発生能の増強と関連し、特に若い被験者(60歳未満)及びLDLコレステロール値が高い被験者において、心臓血管のリスクの独立した予測因子(オッズ比:-1.5~2)であることが示されている。
Lp(a)は、アポリポ蛋白の異なるイソ型(クリングル反復ごとに)で現れる;mg/dlで測定したときのLp(a)レベルの40%の変化は、異なるイソ型に起因することができる。より軽いLp(a)も疾患に関連している。従って、簡単な定量結果を提供した試験は、リスクを完全に評価できないかもしれない。
本明細書で用いられる“モノクローナル抗体”という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を構成する個々の抗体は、起こり得る突然変異、例えば、少量で存在し得る天然に存在する突然変異を除いて、同一である。従って、修飾語“モノクローナル”は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。特定の実施形態では、そのようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含し、該標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られた。例えば、該選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン、または組換えDNAクローンのプール等複数のクローンからの単一クローンの選択であり得る。理解されるべきこととして、選択した標的結合配列は、さらに改変でき、例えば、標的への親和性を改善したり、標的結合配列をヒト化したり、細胞培養におけるその産生を改善したり、in vivoでの免疫原性を低下させたり、多重特異性抗体を産生したり等、改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本開示の目的のためのモノクローナル抗体である。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが典型的に他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。
修飾語“モノクローナル”は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って用いられるモノクローナル抗体は、様々な技術によって作製され得る。例えば、雑種細胞法(例えば、KohlerとMilstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongoら、Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerlingら、Monoclonal Antibodies 及びT-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonら、Nature, 352: 624-628 (1991); Marksら、J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhuら、J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Leeら、J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLeeら、J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)を参照)、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全てを有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生する技術(例えば、WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovitsら、Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemannら、Year in Immunol. 7:33 (1993); 米国特許第5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425;及び5,661,016号; Marksら Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonbergら、Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwildら、Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 及びLonbergとHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照)。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び/または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、一方、該鎖の残りの部分は、望ましい生物活性を示す限り、別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列、またはそのような抗体の断片と同一または相同である“キメラ”抗体を含む(例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984) を参照)。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば、対象の抗原でマカクザルを免疫することにより産生された抗体に由来するものが含まれる。
本明細書で使用される“オリゴヌクレオチド”は、一般に長さが約200ヌクレオチド未満であるが、必ずしもそうではない短い、典型的には一本鎖ポリヌクレオチドを指す。用語“オリゴヌクレオチド”及び“ポリヌクレオチド”は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての本明細書の記載は、オリゴヌクレオチドに等しくかつ完全に適用可能である。
“操作可能に連結された”という用語は、各成分が機能的であるように、第1成分と第2成分との間の機能的結合または関連を指す。例えば、操作可能に連結されているのは、調節配列と異種核酸配列との間の関連を含み、その結果、後者の発現が生じる。例えば、第1核酸配列が第2核酸配列と機能的な関係に配置される場合、第1核酸配列は、第2核酸配列と機能的に連結される。機能的に連結された2つのポリペプチドの文脈において、第1ポリペプチドは、いずれかの結合とは独立しているように機能し、第2ポリペプチドは、該2つの間の結合が存在しないように機能する。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における“パーセント同一性”は、類似度を共有する2つ以上の配列を指す。指定された領域、または指定されていない場合は配列全体において、以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または手動アライメント及び目視検査によって測定された比較ウィンドウ、または指定された領域で最大の対応を比較及びアライメントした場合に、2つの配列が、同じである(例えば、60%の同一性、任意に70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性)特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有すれば、該2つの配列は、“実質的に同一”である。必要に応じて、前記同一性は、長さが少なくとも約30個のヌクレオチド(または10個のアミノ酸)である領域にわたって、より好ましくは、長さが100~500個、1000個、またはそれ以上のヌクレオチド(または20個、50個、200個、またはそれ以上のアミノ酸)の領域にわたって存在する。
配列比較のために、一般的に、1つの配列は、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、必要な場合に、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。初期状態のプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、該プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列比較方法は、当該技術分野で周知されている。比較のための最適な配列比較は、例えば、SmithとWaterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman とWunsch, (1970) J. Mol. Bioi. 48:443の相同性配列比較アルゴリズム、PearsonとLipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)、または手動配列比較及び目視検査(例えば、Brentら、(2003) 分子生物学における現在のプロトコルを参照)によって行うことができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を測定するために使用できるアルゴリズムの2つの例は、それぞれAltschulら, (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 及びAltschulら, (1990) J. Mol. Bioi. 215:403-410に記載のBLAST 及び BLAST 2.0 アルゴリズムである。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを介して公的に入手可能である。
2つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、E. MeyersとW. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを用いて測定することができ、これは、PAM120のウェイト残基表、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティを使用して、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。また、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、NeedlemanとWunsch (1970) J. Mol. Bioi. 48:444-453のアルゴリズムを用いて測定することができ、これは、Blossom 62マトリックスまたはP AM250マトリックスのいずれかを使用し、16、14、12、10、8、6、または 4 のギャップウェイトと及び1、2、3、4、5、または6の長さウェイトを使用して、GCGソフトウェアパッケージ([www.]gcg.comで入手可能)におけるGAPプログラムに組み込まれている。
本明細書で使用される“ポリヌクレオチド”または“核酸”は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。該ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、及び/またはDNAまたはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込むことができるそれらの類似体であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体のような、修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、合成後に、例えば、標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾として、例えば“caps”、複数の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等)及び荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等)のペンダント部分を含むもの、介入物 (例えば、アクリジン、ソラレン等)、キレート化剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等)、アルキル化剤、修飾された結合(例えば、αアノマー核酸等) によるヌクレオチド間の修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾型が含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換され、標準的な保護基によって保護され、または活性化されて別のヌクレオチドへの他の結合を作って、または、固体または半固体の支持体に結合されてもよい。5'及び3'末端OHは、リン酸化されか、アミンまたは炭素原子数1~20の有機キャッピング基部分で置換されることができる。他のヒドロキシルも標準的な保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似体を含むこともできる。例えば、2'-O-メチル-、2'-O-アリール、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、アルファ-アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及びメチルリボシド等の塩基性ヌクレオシド類似体。1つ以上のホスホジエステル結合は、別の連結基によって置き換えられてもよい。これらの代替的な連結基には、リン酸塩がP(O)S(“チオエート”)、P(S)S(“ジチオエート”)、(O)NR2(“アミデート”)、P(O)R、P(O)OR'、COまたはCH2(“ホルムアセタール”)(式中、各RまたはR'は独立してHまたは任意にエーテル(--O--)結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含む置換または非置換アルキル(1-20 C)である)で置き換えられている実施形態が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド中の全ての結合は同一である必要はない。前述の説明は、RNA及びDNAを含む、本明細書中で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書で互換的に使用される“タンパク質”または“ポリペプチド”は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって互いに連結されたアミノ酸と呼ばれる化学的構築ブロックの1つ以上の鎖を含む。
“単鎖Fv”または“scFv”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、ここで、該軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、単鎖ポリペプチドとして発現させることができる。ここで、scFvは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。特定されない限り、本明細書で使用されるように、scFvは、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、いずれかの順序でvL及びvH可変領域を有してもよく、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、scFvは、vL-リンカー-vHを含んでもよく、またはvH-リンカー-vLを含んでもよい。
本明細書で用いられる“実質的に類似”または“実質的に同じ”という用語は、2つの数値間の十分に高い程度の類似性を示す(例えば、1つは本開示の抗体に関連し、もう1つは参照/比較抗体に関連する)。これにより、当業者は、2つの値の間の差が、該値によって測定される生物学的特徴(例えば、Kd値)の文脈内で生物学的及び/または統計的有意性がほとんどないか、または全くないと考えるであろう。前記2つの値の間の差は、例えば、参照/比較値の関数の約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、及び/または約10%未満である。
本明細書で用いられる“実質的に減少した”または“実質的に異なる”という語句は、2つの数値(一般に1つは分子に関連し、もう1つは参照/比較分子に関連する)間の十分に高い程度の差を示す。これにより、当業者が、2つの値の間の差が、該値によって測定された生物学的特性(例えば、Kd値)の文脈内で統計的に有意であると考えるであろう。前記2つの値の間の差は、例えば、参照/比較分子の値の関数の約10%超、約20%超、約30%超、約40%超、及び/または約50%超である。
“可変”という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に用いられるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における相補性決定領域または超可変領域(本明細書では互換的に用いられるCDRまたはHVR)と呼ばれる3つの区域に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク(FR)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ主に3シート構成をして、3つのHVRで連結される(これは3シート構造をつなげるループを形成し、いくつかの場合では3シート構造の一部を形成する。)4つのFR領域を含む。各鎖のHVRは、FR領域によって近接してまとめられ、他の鎖のHVRと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabatら、免疫学的有用なタンパク質の配列,第5版, 国立衛生研究所, Bethesda, Md. (1991)を参照)。該定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与していないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与等、様々なエフェクター機能を発揮する。
“変異体Fc領域”は、少なくとも1つのアミノ酸修飾、典型的には1つまたは複数のアミノ酸置換により、天然配列Fc領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。典型的には、変異体Fc領域は、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比べて、少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Fc領域において、または親ポリペプチドのFc領域において、約1つ~約10個のアミノ酸置換、また典型的には約1つ~約5つのアミノ酸置換を有する。本開示の変異体Fc領域は、天然配列Fc領域及び/または親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80%の相同性、それと少なくとも約90%の相同性、また典型的にはそれと少なくとも約95%の相同性を有する。
本明細書で用いられる“ベクター”という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指すことが意図されている。1種のベクターは、他のDNAセグメントが連結され得る環状の双鎖DNAループを指す“プラスミド”である。別の1種のベクターは、ファージベクターである。もう1種のベクターは、他のDNAセグメントをウイルスゲノムに連結できるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、該宿主ゲノムとともに複製することができる。さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では“発現ベクター”と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。
石灰化大動脈弁狭窄(CAVS)は、年齢75歳以上の集団の3%に存在する、獲得された弁性心疾患の一般的な形態である。危険因子は、CAVS及びアテローム性動脈硬化に類似しているが、CAVSを有する患者の約50%以上は、臨床的に有意な冠状動脈疾患を有さず、関連するが独特の病態生理学を示唆している。外科的大動脈弁置換(SAVR)は、依然として大部分の患者のゴールデン標準治療であるが、CAVSを有する症候性患者の少なくとも三分の一は、SAVRを受けないかもしれない。この臨床上の必要性を満たすために、経カテーテル大動脈弁置換(TAVR)がますます使用されているが、高齢や他の共反応のため、全体的な生存率は、わずかなままである。人口高齢化により、CAVSの有症率は急速に増加し、世界中の医療システムに医療、財政、及び倫理的な負担をもたらす前兆となっている。従って、CAVSを媒介する因果経路の同定は、疾患が最終ステージになる前の早期治療のための新規な標的を提供することができる。これらの経路の一つは、リポ蛋白(a)[Lp(a)]、リポ蛋白関連ホスホリパーゼA2(Lp-PLA2)、及びリポ蛋白(a)(Lp(a))系を含む。
本開示は、Lp(a)に結合する抗体、抗体断片、及びヒト化抗体を提供する。抗体断片は、酵素消化のような伝統的な手段または組換え技術によって産生され得る。ある状況では、抗体全体ではなく抗体断片を使用する利点がある。断片のサイズが小さいため、迅速なクリアランスが可能となり、腫瘍、プラーク及び疾患組織へアクセスが改善され得る。特定の抗体断片に関する総説について、Hudsonら、(2003) Nat. Med. 9:129-134を参照されたい。その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
抗体断片の産生のために種々の技術が開発されている。伝統的に、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化によって誘導された(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 及び Brennanら, Science, 229:81 (1985)参照)。しかし、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。Fab、Fv及びScFv抗体断片は全て、大腸菌に発現され、大腸菌から分泌され得る。従って、これらの断片を容易に量産することが可能とする。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収され、F(ab')2断片に化学的に結合することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167 (1992)、その全体が参考により本明細書に組み込まれる)。別のアプローチによれば、F(ab')2断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離される。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むin vivo半減期が増大したFab及びF(ab')2断片は、米国特許第5,869,046号に記載されている。その全体が参考により本明細書に組み込まれる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。特定の実施形態では、抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である。WO 93/16185号、米国特許第5,571,894号、及び第5,587,458号を参照されたい。その全体が参考により本明細書に組み込まれる。Fv及びscFvは、一定の領域を欠いている無傷の結合部位を有する唯一の種であり、従って、それらはin vivoでの使用中の非特異的結合を減少させるのに適していてもよい。scFv融合タンパク質は、scFvのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築することができる。Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supraを参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されているように、“線状抗体”であってもよい。このような線状抗体は、単特異的であっても二重特異性であってもよい。
また、抗体及び抗体断片の配列を知ることにより、キメラ抗原受容体(CAR)及び誘導体(例えば、第1世代、第2世代、第3世代CAR)の産生を開発することができる。CARをクローニングし、産生する方法は、当該技術分野で知られている。
本開示はまた、リポ蛋白(a)に選択的に結合する単鎖可変抗体断片(“scFv”)、VH、VL、及び相補性決定領域を提供する。本開示のscFvは、可溶性であり、容易に合成することができる。さらに、本明細書に開示されるscFvをコードする配列を含むベクターは、種々の疾患のさらなる試験及び研究のための遺伝子導入マウスモデルの産生を可能にした。
本開示は、特定の抗体配列及び生物学的活性を有する抗体配列断片を提供するが、これらの特定の配列を有するポリペプチドに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示の特定の抗体配列とパーセント配列同一性を有する変異体もまた提供される。いくつかの実施形態では、そのような変異体は、1つ以上の所望の増強された特性に基づいて使用するために選択され得る。理解すべきこととして、ある種の変異体は、1つの所望の特徴(例えば、結合親和性、望ましくない副作用の回避等)に関連する改善された機能を有し得るが、他の所望の特徴(例えば、安定性、特異性等)に関連した望ましい機能を有していない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体及び断片のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、抗体または断片の結合親和性及び/または他の生物学的性質を改善することが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような修飾には、例えば、抗体または抗体断片のアミノ酸配列内の残基からの欠失、それへの挿入、及び/またはそれの置換が含まれる。最終構築物が、少なくともLp(a)に結合することを含む所望の特性を有するならば、欠失、挿入及び置換を任意に組み合わせて、最終の構築物に到達することができる。アミノ酸の改変は、配列が産生される時に、被験者の抗体アミノ酸配列中に導入され得る。
突然変異誘発のために好ましい位置である抗体の特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、CunninghamとWellによる(1989) Science、244:1081-1085(参考により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、“アラニン走査突然変異誘発”と呼ばれる。ここで、標的残基の残基または基が同定され(例えば、Arg、Asp、His、Lys、及びGluのような荷電残基)、中性または負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置は、さらに、置換部位にさらなるまたは他の変異体を導入することによって精製される。従って、アミノ酸配列変動を導入する部位は予め測定されているが、変異の性質は、予め測定される必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の機能を分析するために、Alaスキャンまたはランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列の挿入には、1つの残基から100個またはそれ以上の残基を含むポリペプチドへの長さのアミノ酸及び/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、酵素に対する抗体のN末端またはC末端への融合(例えば、ADEPT)または、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドが含まれる。ポリヒスチジンタグも精製に有用である。
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗体断片は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはN-結合またはO-結合のいずれかである。N結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である)は、アスパラギン側鎖に炭水化物部分を酵素的に結合させるための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が産生される。O-結合グリコシル化は、糖N-アセトキシガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのいずれか1つをヒドロキシアミノ酸に、最も一般的にセリンまたはトレオニンに結合させることを指すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンを使用してもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、上記のトリペプチド配列の1つまたはそれ以上が(N-連結グリコシル化部位に対する)産生または除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって都合よく達成される。該改変はまた、1つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列(O-結合グリコシル化部位について)に付加、欠失、または置換することによっても行うことができる。
抗体がFc領域を含む場合、それに結合した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然の抗体は、典型的には、Fc領域のCH2ドメインのAsnへのN結合により一般的に結合される分枝した二重層オリゴ糖を含む。例えば、本明細書中でその全体を参照することにより本明細書の一部とする、例えば、Wrightら(1997)TIBTECH 15:26-32(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸のような種々の炭水化物、ならびにバイアンテナオリゴ糖構造の“ステム”中のGlcNAcに結合したフコースを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、ある改良された特性を有する抗体変異体を産生するために行ってもよい。
例えば、Fc領域にフコースが(直接または間接的に)結合しない炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。このような変異体は、改良されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許公開第2003/0157108号(Presta, L.);US 2004/0093621(協和発酵工業)を参照されたい。“デコシル化”または“フコース欠損”抗体変異体に関連する刊行物の例には、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazakiら、J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。それらのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。デフォルトシル化抗体を製造できる細胞系の例には、タンパク質フコシル化が欠損したLec13 CHO細胞(Ripkaら, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US特許出願第US2003/0157108A号, Presta, L;及びWO 2004/056312 A1, Adamsら, 特に実施例11)、及び例えば、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞のようなノックアウト細胞株(例えば、Yamane-Ohnukiら, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y.ら, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006);及びWO2003/085107)が含まれる。
抗体変異体は、さらに2分割されたオリゴ糖(例えば、抗体のFc領域に結合したビアンテナオリゴ糖がGlcNAcにより2分割される)を備えている。このような抗体変異体は、低減されたフコシル化及び/または改良されたADCC機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet ら); 米国特許第6,602,684号(Umanaら);及びUS2005/0123546(Umanaら)に記載されている。それらのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Fc領域に結合したオリゴ糖中の少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体もまた提供される。このような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patelら); WO 1998/58964 (Raju, S.);及びWO1999/22764 (Raju, S.))に記載され、それらのいずれも、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、抗体変異体は、ADCCをさらに改善または抑制/低減する1つ以上のアミノ酸置換を有するFc領域を含む。このような置換は、上記のいずれかの変形と組み合わせて生じ得る。
特定の実施形態では、本開示は、生体内の抗体の半減期が重要であるが、さらにあるエフェクター機能(例えば、補体及びADCC)が不必要であるか、または有害である多くの用途のために望ましい候補となる、全てのエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。特定の実施形態では、所望の特性のみが維持されるように、抗体のFc活性を測定する。in vitro及び/またはin vivo細胞毒性アッセイは、CDC活性及び/またはADCC活性の減少/枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイは、抗体が特定の結合を欠いているが、他の結合を保持することを確実にするために行うことができる。関心のある分子のADCC活性を評価するためのin vitroアッセイの非限定的な例が米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom, I.ら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83:7059-7063(1986)) 及びHellstrom, Iら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82:1499-1502(1985); 米国特許第5,821,337号 (Bruggemann, M.ら, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)に記載されている。それらのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。別法として、または他に、対象分子のADCC活性は、例えば、Clynesら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいてin vivoで評価され得る。それらのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Clq結合アッセイはまた、抗体がClqに結合することができないこと、従ってCDC活性を欠いていることを確認するために実施され得る。補体活性化を評価するためにCDCアッセイを実施することができる(例えば、Gazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S.ら, Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg M. S.とM. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照されたい)。それらのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。FcRn結合及びin vivoクリアランス/半減期の測定は、当該技術分野で公知の方法を用いて行うこともできる(例えば、Petkova, S. B.ら, Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照されたい)。
1つ以上のアミノ酸置換を有する他の抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の目的の部位には、超可変領域が含まれるが、FRの改変も考えられる。保存的置換も実施することができる。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入され得、そして、産物を、例えば、改善された抗原結合、減少した免疫原性、改善されたADCCまたはCDC等のような所望の活性についてスクリーニングされる。
本開示は、Lp(a)に結合できる抗体または抗体断片を提供し、ここで、該抗体または抗体断片は、可変重鎖(VH)ドメイン及び/または可変軽鎖(VL)ドメインを含み、ここで、
(a)該VHドメインが、
(i)配列番号:4またはその変異体;
(ii)配列番号:6またはその変異体;及び/または
(iii)配列番号:8またはその変異体
含むが、これらに限定されない1つ、2つ、または3つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含み、かつ/または
(b)該VLドメインが、
(i)配列番号:12またはその変異体;
(ii)配列番号:14またはその変異体;及び/または
(iii)配列番号:16またはその変異体
を含むが、これらに限定されない1つ、2つ、または3つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む。
(a)該VHドメインが、
(i)配列番号:4またはその変異体;
(ii)配列番号:6またはその変異体;及び/または
(iii)配列番号:8またはその変異体
含むが、これらに限定されない1つ、2つ、または3つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含み、かつ/または
(b)該VLドメインが、
(i)配列番号:12またはその変異体;
(ii)配列番号:14またはその変異体;及び/または
(iii)配列番号:16またはその変異体
を含むが、これらに限定されない1つ、2つ、または3つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記抗体または抗体断片は、配列番号:4、6、及び8を含むCDRを包含するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び/または配列番号:12、14、及び16を含むCDRを包含するアミノ酸配列を含むVLドメインを含む。
一実施形態では、本開示は、配列番号:4、6、8、12、14、及び16の相補性決定領域を含む重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインを有する抗体またはscFvからなる群から選択される抗体またはscFvを提供する。一実施態様では、該scFvは、Fc領域に連結される。
一実施形態では、本開示は、配列番号:10のアミノ酸20~約131に示される軽鎖可変領域(即ち、配列番号:10のシグナルペプチドを欠く)を含む抗体を提供する。別の実施態様では、本開示は、配列番号:2の約20~約133の配列を含む重鎖可変領域(即ち、配列番号:2のシグナルペプチドを欠く)を含む抗体を提供する。
一実施形態では、本開示は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間にリンカーを含むscFvを提供する。該リンカーは、任意の数の一般的に使用されるペプチドリンカーであり得る。一実施形態では、該リンカーは、GGGS(配列番号:17)の1つ以上の反復単位を含む。該GGGS(配列番号:17)の反復は、2回、3回、4回、またはそれ以上であってもよい。
別の実施形態では、本開示は、ペプチドリンカーによって配列番号:2の重鎖可変領域に連結された配列番号:10の軽鎖可変領域を含むscFvを含む。別の実施形態では、本開示は、配列番号:10と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖、及び配列番号:2と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖を有する(ここで、該scFvがリポ蛋白(a)に選択的に結合する)scFvを提供する。
さらに別の実施形態では、配列番号:2のアミノ酸20~約133またはその変異体を含む第1ドメインを含む融合構築物は、(i)検出可能な標識または(ii)目的のポリペプチドを含む第2ドメインに操作可能に連結されている。当業者に認識されるように、このような融合構築物は、配列番号:1の配列を含むコード配列またはその変異体を、例えば目的のポリペプチドのコード配列と連結する化学的または分子生物学的技術を使用して産生することができる。該コード配列及びドメインは、リンカーによって分離されてもよく、直接連結されていてもよい。
さらに別の実施形態では、本開示は、配列番号:2の重鎖可変領域にペプチドリンカーによって連結された配列番号:10の軽鎖可変領域を含むscFvを含む。
抗体、抗体断片及び該抗体の変異体のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、当該技術分野で公知の種々の方法によって調製される。変異体を調製するためのこのような方法には、自然の供給源からの単離(天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合)、またはオリゴヌクレオチド媒介性(または部位指向性)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及び以前に調製された変異体のカセット突然変異誘発または抗体の非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本開示は、(i)配列番号:2のポリペプチドをコードする配列、(ii)配列番号:1を含む配列、または(iii)配列番号:1からなる配列と少なくとも80%同一及び/またはハイブリダイズする配列を含む、本開示の抗体または抗体断片の重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
特定の実施形態では、本開示は、(i)配列番号:10のポリペプチドをコードする配列、(ii)配列番号:9を含む配列、または(iii)配列番号:9からなる配列と少なくとも80%同一及び/またはハイブリダイズする配列を含む、本開示の抗体または抗体断片の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本開示は、さらに、抗体の断片結晶化可能領域(“Fc”)を含む、本明細書に開示されるscFvを提供する。特定の実施形態では、該Fc領域は、ヒトまたはヒト化抗体からであり、そしてドメインの生物学的活性を調節するために修飾され得る。該Fc領域は、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する抗体のテール領域であり、補体システムのいくつかのタンパク質である。この性質は、抗体が免疫系を活性化することを可能にする。IgG、IgA、及びIgD抗体イソ型において、該Fc領域は、抗体の2つの重鎖の第2及び第3の定常ドメインに由来する2つの同一のタンパク質断片からなり、IgM及びIgE Fc領域は、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2~4)を含む。IgGのFc領域は、高度に保存されたN-グリコシル化部位を有する。Fc断片のグリコシル化は、Fc受容体媒介活性に必須である。この部位に結合したN-グリカンは、主に複合型のコア-フコシル化ジアンテナ構造である。また、少量のN-グリカンは、二等分性GlcNAc及び2,6結合シアル酸残基も担持している。Fab領域と呼ばれる抗体の他の部分は、抗体が結合し得る特異的標的を定義する可変セクションを含む。本開示のscFvは、該Fab領域からの要素からなる。対照的に、クラス内の全ての抗体のFc領域は、各種について同じであり、それらは、可変ではなく一定である。従って、該Fc領域は、“断片定常領域”と呼ばれることもある。従って、無数の種のFc領域をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、既に測定されており、当業者には公知であろう。特定の実施形態では、本開示は、配列番号:2及び/または10をコードする抗体及び抗体断片ポリヌクレオチド、またはFc領域をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むその変異体を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、Fc領域をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列(例えば、配列番号:l及び/または9)を提供する。
さらなる実施形態では、本開示は、抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供し、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号:1及び/または9、または配列番号:1及び/または9と少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、または少なくとも70%の同一性を有し、かつリポ蛋白(a)に特異的に結合するポリペプチドをコードする配列を含む。
本開示の抗体または抗体断片のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列を単離し、雑種細胞のような抗体産生細胞から配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはPCR技術を用いて合成することができる。一旦得られると、該ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現できる組換えベクターに挿入される。当該技術分野で利用可能かつ既知の多くのベクターを、本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、またはその両方)及びそれが存在する特定の宿主細胞との適合性に依存して、種々の成分を含む。該ベクター成分は、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入物、及び転写終結配列を含むが、これらに限定されない。
一般に、宿主細胞と適合性のある種から誘導されたレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。該ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換された細胞における表現型選択を提供できるマーキング配列を担持する。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリン(Amp)及びテトラサイクリン(Tet)耐性をコードする遺伝子を含み、従って形質転換された細胞を同定するための容易な手段を提供する。pBR322、その誘導体、または他の微生物プラスミドまたはバクテリオファージはまた、内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含むか、または含有するように改変され得る。特定の抗体の発現に使用されるpBR322誘導体の例は、Carterらの米国特許第5,648,237号に詳細に記載されている。
また、宿主微生物に適合するレプリコン及び制御配列を含むファージベクターを、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、バクテリオファージベクターは、大腸菌LE392のような感受性宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターの作製に利用することができる。
本開示の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする2つ以上のプロモーター-シストロン対を含むことができる。プロモーターは、その発現を調節するシストロンに上流(5')に位置する非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、誘導的な及び構成的な2つのクラスに分類される。誘導的なプロモーターは、培養条件の変化、例えば栄養素の有無、または温度変化に応答して、その制御下でシストロンの転写レベルの増加を開始するプロモーターである。
種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介してソースDNAからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって軽鎖または重鎖をコードするシストロンDNAに機能的に結合することができる。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を用いて、標的遺伝子の増幅及び/または発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、一般に、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写及びより高い収率を可能にするので、利用される。
原核生物宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、PhoAプロモーター、3-ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(Trp)プロモーター系、及びtacまたはtrcプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能する他のプロモーター(例えば、他の既知の細菌またはファージプロモーター)も好適である。それらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって、当業者は、必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを用いて、標的の軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを操作可能に連結することができる(Siebenlistら, (1980) Cell 20:269)。
一実施形態では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を横切って発現されたポリペプチドの転位を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、該シグナル配列は、ベクターの成分であってもよく、または該ベクターに挿入される標的ポリペプチドDNAの一部であってもよい(表A及びB、及び配列番号:1及び9を参照)。本開示の目的のために選択されたシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、かつ処理される(シグナルペプチダーゼによって開裂される)ものであるべきである。異種ポリペプチドに固有のシグナル配列を認識し、処理しない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定エンテロトキシンII (STII)リーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpA、及びMBPからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態では、発現系の両方のシストロンにおいて使用されるシグナル配列は、STIIシグナル配列またはその変異体である。
別の実施形態では、本開示による免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質において起こり得、従って、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点に関して、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、発現され、折り畳まれ、組み立てられて、細胞質内に機能性免疫グロブリンを形成する。ある種の宿主株(例えば、大腸菌trxB株)は、ジスルフィド結合形成にとって好ましい細胞質条件を提供し、それによって発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを可能にする。ProbaとPluckthun, Gene, 159:203 (1995)を参照されたい。
本開示の抗体を発現するのに適した原核宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物のような古細菌及び真菌が含まれる。有用な細菌の例には、大腸菌類(例えば、大腸菌)、桿菌(例えば、枯草菌)、腸内細菌、シュードモナス種(例えば、緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌、クレブシエラ、腐敗菌、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ、またはパラコッカスが含まれる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞は、本開示の宿主として使用される。大腸菌株の例には、株W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: 米国微生物学会, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325)及び株W3110を含むその誘導体(米国特許第5,639,635号)が含まれる。大腸菌294(ATCC 31,446)、大腸菌B、大腸菌X 1776(ATCC 31,537)、及び大腸菌 RV308のような他の株及びその誘導体も好適である。これらの実施例は、限定ではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上記細菌のいずれかの誘導体を構築する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Bassら, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製能を考慮して適切な細菌を選択することが重要である。例えば、pBR322、pBR325、pACYC177、またはpKN410のような周知のプラスミドを用いてレプリコンを供給する場合、大腸菌、セラチア、またはサルモネラ種を宿主として好適に使用することができる。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物に組み込むことが望ましい。
宿主細胞は、上記の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適したように改変された従来の栄養培地中で培養される。
形質転換とは、原核宿主にDNAを導入して、DNAが染色体外要素として、または染色体組み込み体によって複製可能であることを意味する。使用される宿主細胞によって、形質転換は、このような細胞に適した標準的な技術を用いて行われる。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、一般に、実質的な細胞壁障壁を含む細菌細胞に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール/DMSOを使用する。さらに使用される別の技術は、電気穿孔である。
本開示のポリペプチドを産生するために使用される原核細胞は、当該技術分野で知られている培地中で増殖され、そして選択された宿主細胞の培養に適している。適当な培地の例には、ルリアブロス(LB)及び必要な栄養補助剤が含まれる。いくつかの実施形態では、該培地はまた、発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤を含み、該発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に可能にする。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために、アンピシリンは、培地に添加される。
炭素、窒素、及び無機リン酸源の他に必要な補足物も、適切な濃度で含まれていてもよく、単独で、または複合窒素源のような他の補充剤または媒体との混合物として導入されてもよい。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択される1種以上の還元剤を含有していてもよい。原核宿主細胞は、適切な温度で培養される。
一実施形態では、発現されたポリペプチドは、宿主細胞の周辺質に分泌され回収される。タンパク質回収は、典型的には、微生物を、一般に、浸透性ショック、超音波処理または溶解のような手段によって破壊することを含む。細胞が破壊されると、細胞破片または全細胞は、遠心分離または濾過によって除去され得る。該タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。あるいは、タンパク質を培養培地中に輸送し、そこで単離することができる。細胞は培養物から除去され得、そして培養上清は濾過され、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濃縮され得る。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)及びウェスタンブロットアッセイのような一般に公知の方法を用いてさらに単離及び同定され得る。
大規模または小規模の発酵を使用することができ、当該技術分野で周知の技術を用いて最適化することができる。
当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は、好適な精製法の例である:免疫親和性またはイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上またはDEAEのような陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及びゲル濾過。
本開示は、原核生物系または真核生物系において複製され得る発現ベクターをさらに提供し、該ベクターは、本明細書に開示される軽鎖及び/または重鎖をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、本開示は、配列番号:1と少なくとも100%、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、または少なくとも70%の同一性を有する第1配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、第2ベクターまたは同じベクターは、配列番号:9と少なくとも100%、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、または少なくとも70%の同一性を有する配列を含む第2ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、前記ベクターは、発現されると、可溶性形態でscFvまたは抗体を生じ、Lp(a)に結合する能力を有する。さらに別の実施形態では、発現される得られたscFvまたは抗体は、配列番号:2及び10と少なくとも100%、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも75%、または少なくとも70%の同一性を有する配列同一性を有し、ここで、該ポリペプチドは、可溶性形態で発現され、Lp(a)に結合する。
本開示はさらに、本明細書に開示されるscFvまたは抗体をコードし、適切な宿主生物に導入される発現ベクターを提供する。該適当な宿主生物は、微生物、酵母、または哺乳動物細胞系である。典型的には、哺乳動物細胞系は、単球由来(例えば、マクロファージ、単球、及び好中球)、リンパ球由来(例えば、骨髄腫、雑種細胞、及び正常な不死化B細胞)、実質細胞(例えば肝細胞)、及び非実質細胞(例えば、星細胞)である。
Fc領域をさらに含む本明細書に開示されるscFvは、多くの可能な治療用途に使用することができる。例えば、抗アテローム性動脈硬化剤として使用することができる。
本開示の一実施形態では、被験者のLp(a)量及び/または冠状動脈疾患に対する素因を測定するための方法が提供される。該方法は、被験者の血漿中Lp(a)を測定し、Lp(a)レベル制御または正常レベルを相関させることを含み、ここで、Lp(a)レベルの増加は、冠状動脈疾患に対する素因を示す。Lp(a)の量は、Lp(a)に特異的に結合する本明細書に記載の軽鎖及び重鎖のCDRを含む抗体、抗体断片または結合ドメインを用いて検出することができる。本開示はさらに、E06のようなOxPLに結合する第2抗体を使用することができる。
該方法は、被験者から得られた生体試料上で実施することができる。該生体試料は、例えば、血液、血清、または血漿であり得る。
いくつかの実施形態では、前記抗体、抗体断片または結合ドメインは、アレイを形成するために基質上に固定化される。
Lp(a)を同定するための例示的な生化学的試験は、酵素結合免疫吸着アッセイまたはELISA試験のような標準化された試験フォーマットを使用するが、本明細書に提供される情報は、他の生化学的または診断的試験の開発に適用することができ、ELISA試験の開発に限定されない。市販されている種々のELISAキットが利用可能である。
一実施形態では、免疫測定は、まず、本開示の抗体を用いてマイクロタイタープレート上のLp(a)を捕捉し、次いで、標識抗体でLp(a)を検出することによって行うことができる。
また、本開示によると、本開示のscFvまたは抗体を、心血管疾患及びCAVSを治療するための抗アテローム性動脈硬化剤として使用することができる。本開示のscFvまたは抗体は、Lp(a)の抗血栓活性により誘発される血餅形成を阻害することにより、冠状動脈疾患(“CAD”)を有する高リスク患者を治療するために使用することができる。
本明細書に開示されたscFv及び抗体は、Lp(a)に結合し、プラーク、血餅及び/または水疱の形成を阻止することができる。本開示のscFv、抗体または抗体断片のin vivo使用は、多くの異なる状況におけるLp(a)生物学的効果を遮断するために使用され得ることが予想される。
本明細書で使用される場合、“治療”は、治療される個体または細胞の自然の過程を変更しようとする試みにおける臨床的介入を指し、臨床病態の予防またはその過程のいずれかのために行うことができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、疾患の進行速度の低減、疾患の状態の改善または緩和、及び寛解または改善された予後が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のscFv、抗体または抗体断片は、疾患または障害の発生を遅延させるために使用される。
“個体”、“被験者”または“患者”は、脊椎動物である。特定の実施形態では、該脊椎動物は、哺乳動物である。該哺乳動物には、家畜(例えば、ウシ)、スポーツ動物、ペット/コンパニオン動物(例えば、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
“有効量”は、所望の治療結果または予防結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量を指す。
本開示の物質/分子、作動薬または拮抗薬の“治療的有効量”は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、及び該個体における所望の応答を引き出すための物質/分子、作動薬または拮抗薬の能力等の因子に応じて変化し得る。治療的有効量はまた、物質/分子、作動薬または拮抗薬の毒性または有害な効果が治療上有益な効果により重要であるものである。“予防的有効量”は、所望の予防結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量を指す。必ずというわけではないが、典型的には、予防的用量は、疾患の前または疾患の初期段階で被験者に使用されるので、予防的有効量は、治療的有効量よりも少ないであろう。
本開示の抗体またはその断片を含む治療用製剤は、所望の純度を有する抗体または断片を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥製剤の形態で混合することにより、貯蔵のために調製される(Remington:薬学の科学と実践、第20版(2000))。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン及び他の有機酸のような緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAのようなキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖 ナトリウム等の塩形成性対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/または非イオン性界面活性剤またはポリエチレングリコール(PEG)を含む。
本明細書の製剤はまた、治療される特定の効能に必要な場合、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する1種以上の活性化合物を含有してもよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
前記活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル(例えば、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)またはマクロエマルションにおける、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)に閉じ込められてもよい。このような技術は、Reminton:薬学の科学と実践、第20版(2000)に開示されている。
in vivo投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の好適な例には、本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、該マトリックスは、成形された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート))、ポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT (乳酸-グリコール酸コポリマー及びロイプロリドアセテートからなる注射可能な微小球)のような分解性乳酸-グリコール酸共重合体、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは、100日以上にわたって分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い時間の間タンパク質を放出する。封入された免疫グロブリンが体内に長時間残ると、37℃の水分への暴露の結果として変性または凝集し、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。必要とされるメカニズムによって、安定化のために合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集メカニズムが、チオジスルフィド交換による分子間 S--S 結合の形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、適切な添加剤を用いて水分含量を制御し、特定のポリマーマトリックス組成物を発生させることによって安定化を達成することができる。
本開示の抗Lp(a)抗体は、関心のある免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列のために遺伝子導入である哺乳動物または植物の生成と、そこから回収可能な形態での抗体の産生とによって、抗原的に産生され得る。哺乳動物における遺伝子導入産生に関連して、抗Lp(a)抗体は、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳中で産生され、そして回収され得る。例えば、米国特許第4,062,057号を参照されたい 5,米国特許第5,827,690号、同第5,756,687号、同第5,750,172号、及び同第5,741,957号を参照されたい。これらのいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非ヒト遺伝子導入動物または植物は、本開示の抗Lp(a)抗体またはその断片(例えば、配列番号:l及び/または9)をコードする1種以上の核酸分子を、標準的な遺伝子導入技術により動物または植物に導入することによって製造される。例えば、Hogan及び米国特許第6,417,429号を参照されたい。遺伝子導入動物を作製するために使用される遺伝子導入細胞は、胚性幹細胞または体細胞または受精卵であり得る。遺伝子導入非ヒト生物は、キメラ、非キメラヘテロ接合体、及び非キメラホモ接合体であり得る。例えば、Hoganら,マウス胚の操作:実験マニュアル、第2版, Cold Spring Harbor Press (1999); Jacksonら,マウスの遺伝学と遺伝子導入:実践的なアプローチ, Oxford University Press (2000); 及びPinkert, 遺伝子導入動物技術:ラボハンドブック, Academic Press (1999)を参照されたい。それらのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、前記遺伝子導入非ヒト動物は、対象の重鎖及び/または軽鎖をコードする標的構築物による標的化された破壊及び置換を有する。別の実施形態では、前記遺伝子導入動物は、Lp(a)上のエピトープに特異的に結合する重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を含み、発現する。いくつかの実施形態では、前記遺伝子導入動物は、単鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体のような修飾抗体をコードする核酸分子を含む。抗Lp(a)抗体は、任意の遺伝子導入動物において作製することができる。別の実施形態では、前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマである。前記非ヒト遺伝子導入動物は、血液、乳、尿、唾液、涙、粘液、及び他の体液において前記コードされたポリペプチドを発現する。
上記及び実施例においてさらに詳細に記載されているように、本開示は、1つのコピー中にのみ存在するアポリポ蛋白(a)のKIV9上のユニークな23-アミノ酸エピトープを検出する、新規なマウスモノクローナル抗体、LPA-KIV9を提供する。LPA-KIV9は、化学発光ELISAフォーマットで広範囲の血漿中Lp(a)レベルを首尾よく定量し、そしてヒト頸動脈内膜切除標本の染色を実証した。該抗体は、アポリポ蛋白(a)を免疫学的に検出する研究環境や血漿中Lp(a)レベルを測定する臨床環境で使用することができる。アポリポ蛋白(a)の唯一の独特なエピトープのみを結合するモノクローナル抗体であるので、Lp(a)レベルの測定における電流制限の多くを克服することができる。
益々多くの証拠は、Lp(a)が心血管疾患(CVD)の独立した遺伝的及び可能性の高い原因の危険因子であることを示唆している。上昇したLp(a)は、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈疾患、及び石灰化大動脈弁狭窄に対する高いリスクを与える。Lp(a)とCVD の危険性との関連は、ほぼ直線的であり、最高のLp(a)レベルで2~4倍高いリスクに達する。Lp(a)レベルは、<0.1から>300 mg/dL (>750 nmol/L)まで、個体間で1000倍以上変化し得る。
上昇したLp(a)は、非常に蔓延しており、集団の推定20%が50 mg/dL (>125 nmol/L)のレベル(スタチン治療を受けた患者にリスクが生じる閾値)を有する。さらに、最近の研究では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが Lp(a)を80%以上低下させる可能性があることが示され、これにより、現在進行中の第 3 相臨床試験への道が開かれた(Lp(a)HORIZON、TQJ230によるリポタンパク質(a)低下がCVD患者の主要心血管事象に及ぼす影響の評価 [https://]clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04023552)。さらに、複数の国及び国際社会は、リスク予測を強化するため、またはリスクエンハンサーとしての考慮のために、CVD のリスクが中程度から高い個人でLp(a)を測定することを提案している。EAS/ESC はまた、心血管リスクを評価するために、全ての人々の生涯に少なくとも1回はLp(a)を測定することを推奨している。そのため、診療所で Lp(a)を測定するより正確な方法を開発することが強く求められている。
2018年、NHLBIのワーキンググループは、商業的実験室に適用可能なLp(a)のグローバルに標準化された測定の開発を推奨した。Lp(a)を測定する現在の方法は、1):全Lp(a)質量[apo(a)、apoB、脂質及び炭水化物成分]の項で、標的値をアッセイ検量用試料に割り当て、mg/dLの値を表す(しかし、これらの方法は、任意の確立された基準物質に対する種々の検量用試料のトレーサビリティを有しない)、または2):世界保健機関/国際臨床化学連合及び検査医学二次標準物質 PRM-2B にトレーサブルであり、nmol/Lで値(即ち、Lp(a)粒子のモル濃度)を表すアッセイ検量用試料にターゲット値を割り当てる。NHLBIのグループは、総Lp(a)質量のmg/dLでの報告を中止し、代わりに、共通の参照システムにトレーサブルな nmol/Lで値を報告することも推奨した。さらに、異なる方法で得られた結果の調整は、精度ベースの共通キャリブレーションを実行した後に実行する必要がある。
KIV2反復またはプラスミノーゲンと交差反応しないLp(a)に対する広く利用可能な、アポリポ蛋白(a)と実質的に相同性を有するモノクローナル抗体の欠如は、Lp(a)レベルの正確な測定ならびにLp(a)アッセイのグローバル標準化の両方を阻害した。Lp(a)に対するモノクローナル抗体の産生の困難性は、限られた数の抗原部位のみがこのような抗体を産生するために利用可能であることを示唆している。記載されたこのようなモノクローナル抗体の一つは、KIV9上の未知の部位に結合し、Lp(a)を測定するELISAフォーマットで使用されているa40である。KIV2を検出する捕捉抗体と、アポリポ蛋白(a)上の1つの特異的部位にのみ結合する第2検出抗体とを用いたELISAフォーマットは、WHO/IFCC に追跡された検量用試料と共に、サイズ依存性バイアスを減少させるのに最適な方法であると考えられる。本開示は、このようなELISA及び方法を実施するための方法及び組成物を提供する。
市販のアッセイは一般にポリクローナル抗体を使用しているので、これらの抗体は、同一のKIV2反復セグメントに複数回結合するためにイソ型依存性である。いくつかのアッセイでは、アポリポ蛋白(a)サイズへのバイアスは、各々が適切なアポ(a)イソ型の分布を含み、そして別個のイソ型独立アッセイにより正確に割り当てられた値を有する独立した検量用試料を使用することによって幾分最小化され得る。これにもかかわらず、ほとんどのアッセイは、Lp(a)レベルとapo(a)イソ型サイズとの間の一貫した関係がないため、アポリポ蛋白(a)サイズに対して感受的である。このために、比較的広い範囲のアポリポ蛋白(a)サイズを有する試料において、高いまたは低いLp(a)レベルが観察され得る。サイズ不均一性バイアスを反映して、6つの市販の方法で Lp(a)レベルを評価する最近の研究では、現在の市販の免疫学的アッセイは異なる方法で較正されており、それらのバイアスは、アポリポタンパク質(a)表現型に完全に依存するわけではなく、非線形の方法で臨床的に関連する濃度範囲全体で大きく異なると結論付けられた。これらの知見に基づいて、方法論的技術のさらなる改善に伴い、方法のグローバルな調整が必要であることが示唆された。
本開示は、LPA-KIV9がLp(a)レベルを測定するために首尾よく使用され得、そして以前にバリデートされた院内の研究アッセイと比較して有利であることを示している。現在のデータはまた、“真のLp(a)”と“全apo(a)”アッセイとの間の有意な相関を示す。ほとんどの環境において、最小量の循環するフリーなアポリポ蛋白(a)が存在するので、この種の区別は、通常必要とされない。しかし、現在のPCSK9阻害剤の時代では、提案されているように、これらのアッセイが循環Lp(a)/アポリポタンパク質(a)粒子の性質を確認する方法を提供し得る。
以下の実施例は、本開示を例示するものであるが、本開示を限定するものではない。それらは、使用され得るものの典型的なものであるが、当業者に公知の他の手順を代替的に使用してもよい。
材料
TRIzol(登録商標)試薬(Ambion, カタログ番号:15596-026);PrimeScript(商標)第1鎖cDNA合成キット(Takara, カタログ番号:6110A)。全RNAを、TRIzol(登録商標)試薬の技術マニュアルに従って雑種細胞から単離した。次いで、全RNAを、PrimeScript(商標) 第1鎖cDNA合成キットの技術マニュアルに従って、イソ型特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーのいずれかを用いてcDNAに逆転写した。重鎖及び軽鎖の抗体断片を、GenScriptのcDNA末端(RACE)の迅速増幅の標準操作手順書(SOP)に従って増幅した。増幅された抗体断片を、標準クローニングベクター中に別々にクローン化した。コロニーPCRを、正しいサイズの挿入物を有するクローンをスクリーニングするために行った。一致した配列を提供した。
TRIzol(登録商標)試薬(Ambion, カタログ番号:15596-026);PrimeScript(商標)第1鎖cDNA合成キット(Takara, カタログ番号:6110A)。全RNAを、TRIzol(登録商標)試薬の技術マニュアルに従って雑種細胞から単離した。次いで、全RNAを、PrimeScript(商標) 第1鎖cDNA合成キットの技術マニュアルに従って、イソ型特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーのいずれかを用いてcDNAに逆転写した。重鎖及び軽鎖の抗体断片を、GenScriptのcDNA末端(RACE)の迅速増幅の標準操作手順書(SOP)に従って増幅した。増幅された抗体断片を、標準クローニングベクター中に別々にクローン化した。コロニーPCRを、正しいサイズの挿入物を有するクローンをスクリーニングするために行った。一致した配列を提供した。
免疫原及び抗原の産生
免疫原を産生するために、2つのアプローチを使用した:第1に、免疫原として使用するために、いくつかの切断されたアポリポ蛋白(a)タンパク質を産生した。1つの構築物は、全体のKIV10-KV配列を及び、その産生及び精製について以下に説明する。8K-IVと命名された第2大のアポリポ蛋白(a)構築物は、前述したように、KIV1の1コピー、KIV2の1つのコピー、KIV3及びKIV5の融合体、及び個々のクリングルKIV6~KIV10、KV、及びプロテアーゼ様ドメインを含有した(Schneiderら、J. Lipid Res. 46:769-778, 2005)。第2戦略として、アポリポ蛋白(a)から誘導されたがプラスミノーゲン上には存在しないいくつかのユニークな短いペプチドが産生され、これは免疫化のためにキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合された。これらには、KIV9上の1つのコピーに存在するペプチドGDGRSYRGISSTTVT(配列番号:32)及びKV上の1つのコピーに存在するペプチドMNPRKLFDYC(配列番号:33)が含まれる。
免疫原を産生するために、2つのアプローチを使用した:第1に、免疫原として使用するために、いくつかの切断されたアポリポ蛋白(a)タンパク質を産生した。1つの構築物は、全体のKIV10-KV配列を及び、その産生及び精製について以下に説明する。8K-IVと命名された第2大のアポリポ蛋白(a)構築物は、前述したように、KIV1の1コピー、KIV2の1つのコピー、KIV3及びKIV5の融合体、及び個々のクリングルKIV6~KIV10、KV、及びプロテアーゼ様ドメインを含有した(Schneiderら、J. Lipid Res. 46:769-778, 2005)。第2戦略として、アポリポ蛋白(a)から誘導されたがプラスミノーゲン上には存在しないいくつかのユニークな短いペプチドが産生され、これは免疫化のためにキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合された。これらには、KIV9上の1つのコピーに存在するペプチドGDGRSYRGISSTTVT(配列番号:32)及びKV上の1つのコピーに存在するペプチドMNPRKLFDYC(配列番号:33)が含まれる。
KIV10-KV構築物の産生
KIV10-KV構築物を産生するために、プライマーのセンス 5'-TCCACTCCCAGGTCCAACTGCACCT-3' (配列番号:34) 及びアンチセンス 5'-GAACCGTTACAGAGAGGATATCACAGTAGTCA -3' (配列番号:35)を使用し、pRK5haKIV10-Pプラスミドをapo(a)シグナル配列からKVの末端まで増幅することにより、KIV10及びKV ドメイン全体にわたる配列をコードする発現プラスミドを産生した。センスオリゴヌクレオチドは、シグナル配列をコードする配列に先行するEcoRI部位の上流に結合する。アンチセンスオリゴヌクレオチド中の下部ケース文字は、目的プラスミドのカルボキシル末端6×HisタグとKIV10-KVコード配列のインフレーム融合を可能にするAgeI制限消化部位を産生するために導入された置換を示す。PCR反応は、BioRad CFX96サーモサイクラー中で、Q5高フィデリティーDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて次の条件下で実施した:98℃で(10秒間)変性、62℃で(30秒間)徐冷、及び72℃で(20秒間)伸長、合計40サイクルを行った。PCR産物をEcoRI-HF及びAgeI-HF(New England Biolabs)で消化し、これらの酵素で消化されたpcDNA4/myc-His発現プラスミド (最終構築物からmyc-タグを削除した)に連結した。該プラスミドを、10 μg DNA/l00mmプレートでMegaTranl.0を用いてHEK293細胞に遺伝子導入し、生存可能な個体群が観察されるまで、遺伝子導入後48時間で150 μg/mL Zeocin による選択に供した。KIV10KVタンパク質を、安定に発現する細胞系の馴化培地(CM)から精製した。該CMを20 mM Tris pH8.0、0.5 M NaCl 0.2 mMβ-メルカプトエタノール、5 mMイミダゾール、及び2%グリセロールに調整し、Ni2+-セファロースエクセル(GEヘルスケア)カラムに適用した。該カラムを洗浄し、12 mM及び300 mMイミダゾールをそれぞれ含む緩衝液で溶出した。溶出した試料をPEG-20,000(Sigma)で濃縮し、HEPES緩衝生理食塩水(HBS;20 mM HEPES pH7.4、150 mM NaCl)に対して透析した。タンパク質濃度は、BSAを標準として使用したビシンコニン酸アッセイ(BCAアッセイ;Pierce)を用いて測定した。KIV10KVの純度をSDS-PAGE、続いて銀染色により評価した。
KIV10-KV構築物を産生するために、プライマーのセンス 5'-TCCACTCCCAGGTCCAACTGCACCT-3' (配列番号:34) 及びアンチセンス 5'-GAACCGTTACAGAGAGGATATCACAGTAGTCA -3' (配列番号:35)を使用し、pRK5haKIV10-Pプラスミドをapo(a)シグナル配列からKVの末端まで増幅することにより、KIV10及びKV ドメイン全体にわたる配列をコードする発現プラスミドを産生した。センスオリゴヌクレオチドは、シグナル配列をコードする配列に先行するEcoRI部位の上流に結合する。アンチセンスオリゴヌクレオチド中の下部ケース文字は、目的プラスミドのカルボキシル末端6×HisタグとKIV10-KVコード配列のインフレーム融合を可能にするAgeI制限消化部位を産生するために導入された置換を示す。PCR反応は、BioRad CFX96サーモサイクラー中で、Q5高フィデリティーDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて次の条件下で実施した:98℃で(10秒間)変性、62℃で(30秒間)徐冷、及び72℃で(20秒間)伸長、合計40サイクルを行った。PCR産物をEcoRI-HF及びAgeI-HF(New England Biolabs)で消化し、これらの酵素で消化されたpcDNA4/myc-His発現プラスミド (最終構築物からmyc-タグを削除した)に連結した。該プラスミドを、10 μg DNA/l00mmプレートでMegaTranl.0を用いてHEK293細胞に遺伝子導入し、生存可能な個体群が観察されるまで、遺伝子導入後48時間で150 μg/mL Zeocin による選択に供した。KIV10KVタンパク質を、安定に発現する細胞系の馴化培地(CM)から精製した。該CMを20 mM Tris pH8.0、0.5 M NaCl 0.2 mMβ-メルカプトエタノール、5 mMイミダゾール、及び2%グリセロールに調整し、Ni2+-セファロースエクセル(GEヘルスケア)カラムに適用した。該カラムを洗浄し、12 mM及び300 mMイミダゾールをそれぞれ含む緩衝液で溶出した。溶出した試料をPEG-20,000(Sigma)で濃縮し、HEPES緩衝生理食塩水(HBS;20 mM HEPES pH7.4、150 mM NaCl)に対して透析した。タンパク質濃度は、BSAを標準として使用したビシンコニン酸アッセイ(BCAアッセイ;Pierce)を用いて測定した。KIV10KVの純度をSDS-PAGE、続いて銀染色により評価した。
スクリーニング抗原は、前述のように単一ドナーから精製されたLp(a)(Van der Valkら、Circulation,134:611-624、2016)、ヒトプラスミノーゲン(R&D、Minneapolis, MN)、及び3つまたは5つのコピーを含有する2つのKIV2構築物を含む種々の組換えアポリポ蛋白(a)構築物、それぞれKIV6からプロテアーゼドメインまで連続的に及ぶ構築物(それぞれKIV6-P, KIV7-P, KIV8-P, KIV9-P, KIV10-P)、8KIV2反復を有する17Kヒト構築物、プロテアーゼドメイン(17KΔP)を含まない17K構築物、及びKV(17KΔP)を含まない17K構築物を含む。
apoB-100とアポリポ蛋白(a)との間のジスルフィド結合は、apoB-100のシステイン4236及びアポリポ蛋白(a)上のシステイン4057から構成される。MB47のapoB上のエピトープが残基3350と3506との間にあるヒトapoB-100に特異的なマウスモノクローナル抗体MB47をELISAフォーマットで用いて、Lp(a)を測定した。同様に、アポリポタンパク質(a)のKIV5、KIV7、及びKIV8に存在する14-アミノ酸エピトープTRNYCRNPDAEIRPに結合するマウスモノクローナル抗体LPA4を化学発光ELISAで使用した。LPA4によって検出されたNYCRNPDAの部分配列は、KIV2上にも存在し、LPA4もKIV2に結合するので、免疫学的に支配的である。
マウスの免疫化及びモノクローナル抗体の産生と精製
全ての動物実験は、施設動物ケア及び使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。BALB/Cマウスを、KLH-共役ペプチドGDGRSYRGISSTTVT及びMNPRKLFDYC、並びにアポリポ蛋白(a)構築物KIV10-KVを用いて腹腔内(IP)で免疫し、これらの免疫原は、特異的な抗体を産生しないか、または得られた抗体は、KIV2及び/またはプラスミノーゲンに結合した。従って、それらを用いた更なる作業は行われず、結果は提示されない。
全ての動物実験は、施設動物ケア及び使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。BALB/Cマウスを、KLH-共役ペプチドGDGRSYRGISSTTVT及びMNPRKLFDYC、並びにアポリポ蛋白(a)構築物KIV10-KVを用いて腹腔内(IP)で免疫し、これらの免疫原は、特異的な抗体を産生しないか、または得られた抗体は、KIV2及び/またはプラスミノーゲンに結合した。従って、それらを用いた更なる作業は行われず、結果は提示されない。
次いで、BALB/Cマウスを、125 μgの精製された8K-IVアポリポ蛋白(a)の1次追加免疫を用いてIPで免疫し、続いて、不完全フロイント免疫賦活剤(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)と混合した(75 mg)の3IP追加免疫で2週間の間隔で免疫した。3回目の追加免疫の 2 週間後に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の 8K-IV (25 μg)の最終抗原追加免疫を静脈内投与した。その3日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を回収し、Clonacell(商標)-HY雑種細胞キット(StemCell Technologies, Cambridge, MA)を用いて、骨髄腫細胞(p3X63Ag8.653)と融合させた。該融合細胞を半固体のHAT雑種細胞選択培地に再懸濁した。その10~14日後、可視のコロニーを、Clonacell(商標)-HY増殖培地(DMEM、予め選択された血清、HT、ゲンタマイシン、及びサプリメント)に移した。
プラスミノーゲンまたはKIV2に結合せず、Lp(a)に特異的な抗体を発現するコロニーを選択するために、雑種細胞からの馴化培地を下記のようにELISAによりスクリーニングした。単クローン性を確実にするために、Lp(a)に結合するがKIV2またはプラスミノーゲンに結合しない選択されたクローンを、HATを用いずに半固体ゲル中での希釈を制限することにより2回サブクローン化し、ELISAにより再試験した。得られた2つのコロニーの重鎖及び軽鎖を、配列において同一であったGenscript(Piscataway, NJ)により配列決定した。該細胞は、1% 胎仔クローン3 (Life Technologies, Carlsbad, CA) を添加した雑種細胞-SFM培地を用いた撹拌タンク発酵での組織培養において、BioXCell(West Lebanon, NH)によって増殖され、プロテインA/G樹脂上でのクロマトグラフィーで抗体を精製した。抗体イソ型の決定は、IsoStripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(Roche Diagnostics, Vilvoorde, Belgium)を用いて行った。該モノクローナル抗体を“LPA-KIV9”と命名した。
雑種細胞生成抗体の結合を評価するための直接抗原プレーティングによるELISA
免疫化マウス血漿中に存在する抗体の滴定、雑種細胞馴化培地のスクリーニング及び精製されたモノクローナル抗体の試験を、化学発光ELISAにより行った。簡単に説明すると、96ウェルマイクロタイタープレート(Brand, Germany)を、PBS中5 μg/mlのLp(a)、アポリポ蛋白(a)KIV2、またはプラスミノーゲンで直接に、4℃で終夜コートした。非特異的部位をトリス緩衝生理食塩水(TBS (1% BSA-TBS)中の1%ウシ血清アルブミン(Gemini Bio-products, CA, USA)で遮断し、室温で30分間インキュベートした。続いて、1%BSA-TBSまたは雑種細胞馴化培地(未希釈)中のマウス血漿の連続希釈液(1:50~1:400)を加え、室温で60分間インキュベートした。結合IgG抗体を、抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ(ALP)抱合体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、Lumi-Phos 530基質(Lumigen, Southfield, MI)、及び発光プレートリーダー(Bioteek, Vermont)を用いて検出した。抗体結合は、100ミリ秒(RLU/l00ms)にわたって検出された相対光単位として表された。
免疫化マウス血漿中に存在する抗体の滴定、雑種細胞馴化培地のスクリーニング及び精製されたモノクローナル抗体の試験を、化学発光ELISAにより行った。簡単に説明すると、96ウェルマイクロタイタープレート(Brand, Germany)を、PBS中5 μg/mlのLp(a)、アポリポ蛋白(a)KIV2、またはプラスミノーゲンで直接に、4℃で終夜コートした。非特異的部位をトリス緩衝生理食塩水(TBS (1% BSA-TBS)中の1%ウシ血清アルブミン(Gemini Bio-products, CA, USA)で遮断し、室温で30分間インキュベートした。続いて、1%BSA-TBSまたは雑種細胞馴化培地(未希釈)中のマウス血漿の連続希釈液(1:50~1:400)を加え、室温で60分間インキュベートした。結合IgG抗体を、抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ(ALP)抱合体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、Lumi-Phos 530基質(Lumigen, Southfield, MI)、及び発光プレートリーダー(Bioteek, Vermont)を用いて検出した。抗体結合は、100ミリ秒(RLU/l00ms)にわたって検出された相対光単位として表された。
イムノブロット分析
apo(a)構築物の配列をゲル電気泳動及びLPA-KIV9によるイムノブロット分析に供した。簡単に述べると、試料を還元負荷緩衝液に負荷し(250 ng/ウェル)、4~12%Bis-Trisゲル(Life Technologies)上で実行した。ゲルをPVDF膜(Life Technologies)に移した。一次抗体(1%BSA-TBST中1 μg/ml)と4℃で一晩インキュベートする前に、膜をTris緩衝生理食塩水及びTween(TBST)中の5%脱脂粉乳で1時間遮断した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)と結合した二次抗体と室温で1時間インキュベートし、KPL-TMB膜ペルオキシダーゼ基質(Serrack, Milford, MA, USA)で検出した。また、膜上に直接担持されたPBS中の抗原(25 ng/ドット)を用いてドットブロットを行った。遮断及びイムノブロッティングは、上記のように行われ、スーパーシグナルウェスト硬膜基材(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)及びOptiChem HRイメージングシステム(UVP, Upland, CA)によって検出した。
apo(a)構築物の配列をゲル電気泳動及びLPA-KIV9によるイムノブロット分析に供した。簡単に述べると、試料を還元負荷緩衝液に負荷し(250 ng/ウェル)、4~12%Bis-Trisゲル(Life Technologies)上で実行した。ゲルをPVDF膜(Life Technologies)に移した。一次抗体(1%BSA-TBST中1 μg/ml)と4℃で一晩インキュベートする前に、膜をTris緩衝生理食塩水及びTween(TBST)中の5%脱脂粉乳で1時間遮断した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)と結合した二次抗体と室温で1時間インキュベートし、KPL-TMB膜ペルオキシダーゼ基質(Serrack, Milford, MA, USA)で検出した。また、膜上に直接担持されたPBS中の抗原(25 ng/ドット)を用いてドットブロットを行った。遮断及びイムノブロッティングは、上記のように行われ、スーパーシグナルウェスト硬膜基材(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)及びOptiChem HRイメージングシステム(UVP, Upland, CA)によって検出した。
LPA-KIV9のペプチド抗原を測定するためのペプチドライブラリー配列
100個の重複部分、1つのアミノ酸残基だけで異なる15個のアミノ酸ペプチドからなる、KIV9にまたがるペプチドライブラリー配列を、セルロース膜(JPT, Germany)上で合成した。LPA-KIV9結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗マウスIgG抗体とSuperSignal West Dura HRP化学発光基質(Thermo Scientific, USA)を用いて検出した。スイスモデル構造のオンライン分析ソフトウェアを用いて、KIV9、KIV9、KIV10の三次元構造モデル上のエピトープ位置をシミュレートした。配列テンプレートSMTL IDは、61.79%の配列同一性を有する4dur.2.A,プラスミノーゲンであった。アポリポ蛋白(a)の配列モデリング配列は、A3866~V4190であった。
100個の重複部分、1つのアミノ酸残基だけで異なる15個のアミノ酸ペプチドからなる、KIV9にまたがるペプチドライブラリー配列を、セルロース膜(JPT, Germany)上で合成した。LPA-KIV9結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗マウスIgG抗体とSuperSignal West Dura HRP化学発光基質(Thermo Scientific, USA)を用いて検出した。スイスモデル構造のオンライン分析ソフトウェアを用いて、KIV9、KIV9、KIV10の三次元構造モデル上のエピトープ位置をシミュレートした。配列テンプレートSMTL IDは、61.79%の配列同一性を有する4dur.2.A,プラスミノーゲンであった。アポリポ蛋白(a)の配列モデリング配列は、A3866~V4190であった。
ヒト試料における血漿Lp(a)を測定するためのサンドイッチ型Lp(a)化学発光ELISA
抗apoB-100捕捉抗体及び“全apo(a)”を有する“真のLp(a)”を、抗アポリポ蛋白(a)捕捉抗体を用いて測定した以前に確認されたLp(a)ELISAは、比較のために利用した(Tsimikasら、J. Clin. Lipidol.12:1313-1323、2018)。これらのアッセイは、1:400での血漿希釈で、Lp(a)レベルのほとんどの範囲で適切な直線性を有し、分析範囲1~250 nmol/L、検出下限約1 nmol/Lであり、高いレベルの再現性、アッセイ内及びアッセイ間変動性、及び5~10%(Id)の変動係数を有することが以前に報告された。
抗apoB-100捕捉抗体及び“全apo(a)”を有する“真のLp(a)”を、抗アポリポ蛋白(a)捕捉抗体を用いて測定した以前に確認されたLp(a)ELISAは、比較のために利用した(Tsimikasら、J. Clin. Lipidol.12:1313-1323、2018)。これらのアッセイは、1:400での血漿希釈で、Lp(a)レベルのほとんどの範囲で適切な直線性を有し、分析範囲1~250 nmol/L、検出下限約1 nmol/Lであり、高いレベルの再現性、アッセイ内及びアッセイ間変動性、及び5~10%(Id)の変動係数を有することが以前に報告された。
次いで、ELISAの類似のフォーマット及び条件を、ビオチン-LPA-KIV9(EZ-link (商標)NHS-PEG4-ビオチン化キット、Thermo Scientific, Rockford, 1L)を用いて開発した。アッセイ方法の概略図を図1に示す。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、ヒトapoB-100に結合するMB47またはアポリポ蛋白(a)に結合するLPA4のいずれかで PBS中5μg/mlで、一晩4℃でコーティングし、続いて 1% BSA-TBSで、室温で30分間遮断した。Lp(a)または全apo(a)を、ビオチン-LPA4またはビオチン-LPA-KIV9のいずれかでそれぞれ検出した。血漿試料の400倍希釈が線形範囲内であること、及び添加したLp(a)の95~105%の回収が得られたことが再確認された。
-70℃で1年未満保存され、以前に測定されたLp(a)が広範囲である既存のヒト血漿試料(n=100)を4つのアッセイでLp(a)レベルの測定に使用した。アポリポ蛋白(a)イソ型のサイズは、これらの対象には利用できなかった。プロトコルは、ヒト被験者保護プログラムによって承認され、全ての研究被験者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。簡単に述べると、血漿試料を1%BSA-TBSで400倍希釈し、捕獲抗体を含有するマイクロタイタープレートに添加し、室温で60分間インキュベートした。ウェルを洗浄した後、ビオチン-LPA4(2 μg/ml)またはビオチン-LPA-KIV9(5 μg/ml)を加え、ウェルを再び洗浄し、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ(Thermo Fisher, USA)を添加した。最終洗浄工程の後、Lumi-Phos 530(Southfield, Michigan)を添加した。世界保健機関/国際臨床化学及び臨床検査医学連合標準にトレースされたnmol/Lで割り当てられた値を持つ単一の検量用試料の連続希釈を使用した標準曲線を使用した。
免疫組織化学
頸動脈内膜切除手術から頸動脈内膜切除標本を得た。パラフィン包埋された頸動脈内膜切除標本を7μm厚の切片に切断し、帯電したスライド上に載置した。該切片をヒストクリアーで脱パラフィンし、段階的なエタノールを介して再水和した。抗原回収のために、切片を水浴中のクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)と共に95~100℃で20分間インキュベートし、次いで、5%正常ヤギ血清/1%BSA/TBSで、室温で30分間遮断した。LPA4またはLPA-KIV9モノクローナル抗体(遮断用緩衝液で5 μg/ml及び20 μg/mlに希釈したもの)を使用して、加湿チャンバー内で切片を4℃で終夜染色した。次いで、切片を遮断用緩衝液で、50倍希釈した抗マウスIgG-ALP(Sigma A3438)と共に、室温で30分間インキュベートし、次いでベクターレッド基質(ベクターSK-5100)で可視化した。切片をヘマトキシリンで30秒間対比染色し、Simpo-Mount(IHCWorld E03-18)でマウントした。
頸動脈内膜切除手術から頸動脈内膜切除標本を得た。パラフィン包埋された頸動脈内膜切除標本を7μm厚の切片に切断し、帯電したスライド上に載置した。該切片をヒストクリアーで脱パラフィンし、段階的なエタノールを介して再水和した。抗原回収のために、切片を水浴中のクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)と共に95~100℃で20分間インキュベートし、次いで、5%正常ヤギ血清/1%BSA/TBSで、室温で30分間遮断した。LPA4またはLPA-KIV9モノクローナル抗体(遮断用緩衝液で5 μg/ml及び20 μg/mlに希釈したもの)を使用して、加湿チャンバー内で切片を4℃で終夜染色した。次いで、切片を遮断用緩衝液で、50倍希釈した抗マウスIgG-ALP(Sigma A3438)と共に、室温で30分間インキュベートし、次いでベクターレッド基質(ベクターSK-5100)で可視化した。切片をヘマトキシリンで30秒間対比染色し、Simpo-Mount(IHCWorld E03-18)でマウントした。
一次Abs非存在下での連続切片の免疫染色を陰性対照として使用した。20Xレンズを備えたHamamatsu Nanozoomer 2.0HTスライドスキャナーを用いて画像を撮影した。
統計
記述統計分析及び相関分析は、SPSSバージョン26を使用したスピアマンのローテストで実行した。
記述統計分析及び相関分析は、SPSSバージョン26を使用したスピアマンのローテストで実行した。
モノクローナル抗体の産生及び特徴付け
8K-IV apo(a)構築物を用いた免疫プロトコルに続いて、マウス血漿を、Lp(a)に結合するIgGモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングした。血漿は、8K-IV構築物及びLp(a)に強力な結合を含み、K(IV2)3構築物へのバックグラウンドレベルの結合を有した(図2A)。次いで、雑種細胞を産生し、576個のコロニーを収集し、増殖し、そしてLp(a)に対するIgG抗体の産生するためのELISAによりスクリーニングし、88個の陽性コロニーを得て、これを増殖し、再試験した。K(IV2)3ではなく、Lp(a)に対する耐性IgG結合について2つのコロニーを選択した(図2B)。両方のコロニーを、単クローン性を確実にするために限界希釈の2サイクルに供した。さらなる分析において、これらは、それらの重鎖及び軽鎖中に同一のCDR3配列を有することが見出され(表A)、従って、同じクローンから誘導された。全ての娘クローンは、Lp(a)との結合に陽性であったが、K(IV2)3またはプラスミノーゲンには結合しなかった(図2C)。1つのコロニーのみを培養物中で増殖させ、抗体LPA-KIV9を精製し、IgG1イソ型であることが示された。精製されたLPA-KIV9の直接ELISAによる試験は、Lp(a)との用量依存性の特異的反応性を示し、K(IV2)3またはプラスミノーゲンとの交差反応性は示さなかった(図2D)。
8K-IV apo(a)構築物を用いた免疫プロトコルに続いて、マウス血漿を、Lp(a)に結合するIgGモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングした。血漿は、8K-IV構築物及びLp(a)に強力な結合を含み、K(IV2)3構築物へのバックグラウンドレベルの結合を有した(図2A)。次いで、雑種細胞を産生し、576個のコロニーを収集し、増殖し、そしてLp(a)に対するIgG抗体の産生するためのELISAによりスクリーニングし、88個の陽性コロニーを得て、これを増殖し、再試験した。K(IV2)3ではなく、Lp(a)に対する耐性IgG結合について2つのコロニーを選択した(図2B)。両方のコロニーを、単クローン性を確実にするために限界希釈の2サイクルに供した。さらなる分析において、これらは、それらの重鎖及び軽鎖中に同一のCDR3配列を有することが見出され(表A)、従って、同じクローンから誘導された。全ての娘クローンは、Lp(a)との結合に陽性であったが、K(IV2)3またはプラスミノーゲンには結合しなかった(図2C)。1つのコロニーのみを培養物中で増殖させ、抗体LPA-KIV9を精製し、IgG1イソ型であることが示された。精製されたLPA-KIV9の直接ELISAによる試験は、Lp(a)との用量依存性の特異的反応性を示し、K(IV2)3またはプラスミノーゲンとの交差反応性は示さなかった(図2D)。
表A:
LPA-KIV9重鎖(IGHV1-15*01)(ポリヌクレオチド配列 = 配列番号:1;ポリペプチド配列 = 配列番号:2;CDR1 = 配列番号:3(核酸)及び4(ペプチド);CDR2 = 配列番号:5(核酸)及び6(ペプチド);CDR3 = 配列番号:7(核酸)及び8(ペプチド))
LPA-KIV9重鎖(IGHV1-15*01)(ポリヌクレオチド配列 = 配列番号:1;ポリペプチド配列 = 配列番号:2;CDR1 = 配列番号:3(核酸)及び4(ペプチド);CDR2 = 配列番号:5(核酸)及び6(ペプチド);CDR3 = 配列番号:7(核酸)及び8(ペプチド))
表B:
LPA-KIV9軽鎖(IGKV1-110*01)(ポリヌクレオチド配列 = 配列番号:9;ポリペプチド配列 = 配列番号:10;CDR1 = 配列番号:11及び12;CDR2 = 配列番号:13及び14;CDR3 = 配列番号:15及び16
LPA-KIV9軽鎖(IGKV1-110*01)(ポリヌクレオチド配列 = 配列番号:9;ポリペプチド配列 = 配列番号:10;CDR1 = 配列番号:11及び12;CDR2 = 配列番号:13及び14;CDR3 = 配列番号:15及び16
アポリポ蛋白(a)上のLPA-KIV9の結合ドメインの決定
LPA-KIV9が結合したアポリポ蛋白(a)上の部位を決定するために、結合を、ドットブロット(図3A)及びウエスタンブロット(図3B)によるアポリポ蛋白(a)組換え構築物の配列に試験した。ドットブロット法により、LPA-KIV9は、それぞれKIV6、KIV7、KIV8、及びKIV9からプロテアーゼドメインの末端までの配列を含む KIV6-P、KIV7-P、KIV8-P、及びKIV9-Pを含む様々な数のクリングルセグメントを含有する全ての試験構築物と反応した。それはまた、17K全長ヒト構築物、KVを欠く17KdeltaV構築物、及びプロテアーゼ様ドメインを欠く17KdeltaP 構築物を認識した(図3A)。しかし、LPA-KIV9は、KIV9上に存在するエピトープと一致するKIV10-P及びKIV2)5と反応しなかった(即ち、KIV9を含まない唯一の構築物)。この特異的な結合パターンをウエスタンブロッティングで複製したが、LPA-KIV9免疫反応性にはKIV9の存在が必要であったことを示した(図3B)。
LPA-KIV9が結合したアポリポ蛋白(a)上の部位を決定するために、結合を、ドットブロット(図3A)及びウエスタンブロット(図3B)によるアポリポ蛋白(a)組換え構築物の配列に試験した。ドットブロット法により、LPA-KIV9は、それぞれKIV6、KIV7、KIV8、及びKIV9からプロテアーゼドメインの末端までの配列を含む KIV6-P、KIV7-P、KIV8-P、及びKIV9-Pを含む様々な数のクリングルセグメントを含有する全ての試験構築物と反応した。それはまた、17K全長ヒト構築物、KVを欠く17KdeltaV構築物、及びプロテアーゼ様ドメインを欠く17KdeltaP 構築物を認識した(図3A)。しかし、LPA-KIV9は、KIV9上に存在するエピトープと一致するKIV10-P及びKIV2)5と反応しなかった(即ち、KIV9を含まない唯一の構築物)。この特異的な結合パターンをウエスタンブロッティングで複製したが、LPA-KIV9免疫反応性にはKIV9の存在が必要であったことを示した(図3B)。
LPA-KIV9によって認識されるエピトープ上のペプチド配列の決定
それぞれ長さが15個のアミノ酸である100個の重複ペプチドからなるKIV9 にまたがるペプチドライブラリーを設計した(図4A)。抗体LPA-KIV9は、23個のアミノ酸のエピトープCSETESGVLETPTVVPVPSMEAHを含むKIV9上の9つの重複ペプチド断片に結合した(図4B)。該エピトープは、apoB-100 のシステイン4236 とのジスルフィド結合を産生するアポリポ蛋白(a)上のシステイン4057下流の11個のアミノ酸である(図4C中ピンク色で表示)。アポリポ蛋白(a)上のエピトープの三次元構造は、スイスモデルサーバによって予測され、そのエピトープは、KIV9のC末端に向かって、KIV10から3個のアミノ酸から離れているループ表面エピトープであることを示す(図4C中緑色で表示)。
それぞれ長さが15個のアミノ酸である100個の重複ペプチドからなるKIV9 にまたがるペプチドライブラリーを設計した(図4A)。抗体LPA-KIV9は、23個のアミノ酸のエピトープCSETESGVLETPTVVPVPSMEAHを含むKIV9上の9つの重複ペプチド断片に結合した(図4B)。該エピトープは、apoB-100 のシステイン4236 とのジスルフィド結合を産生するアポリポ蛋白(a)上のシステイン4057下流の11個のアミノ酸である(図4C中ピンク色で表示)。アポリポ蛋白(a)上のエピトープの三次元構造は、スイスモデルサーバによって予測され、そのエピトープは、KIV9のC末端に向かって、KIV10から3個のアミノ酸から離れているループ表面エピトープであることを示す(図4C中緑色で表示)。
LPA-KIV9の、血漿Lp(a)レベル測定への応用
確立された 2つの院内化学発光ELISAと、並列方法論を使用したLPA-KIV9 による2つの新規ELISAを使用して、100人の被験者におけるLp(a)を“真のLp(a)”または“全apo(a)”モル濃度として測定した。表1は、記述統計を示し、それぞれ16.4~19.7 nmol/Lの範囲のアッセイ間の中央値及び0~314.1 nmol/Lの範囲の絶対値を示している。
確立された 2つの院内化学発光ELISAと、並列方法論を使用したLPA-KIV9 による2つの新規ELISAを使用して、100人の被験者におけるLp(a)を“真のLp(a)”または“全apo(a)”モル濃度として測定した。表1は、記述統計を示し、それぞれ16.4~19.7 nmol/Lの範囲のアッセイ間の中央値及び0~314.1 nmol/Lの範囲の絶対値を示している。
表1 4つのLp(a)酵素結合免疫測定のLp(a)値(nmol/L)の記述統計
b-LPA4/MB47は、MB47でapoB-100を捕捉し、ビオチン-LPA4で検出することを表し、b-LPA4/LPA4は、LPA4でアポリポ蛋白(a)を捕捉し、ビオチン-LPA4で検出することを表し、b-LPA-KIV9/MB47は、MB47でapoB-100を捕獲し、ビオチン-LPA-KIV9で検出することを表し、また、b-LPA-KIV9/LPA4は、LPA4でアポリポ蛋白(a)を捕捉し、ビオチン-LPA-KIV9で検出することを表す。
b-LPA4/MB47は、MB47でapoB-100を捕捉し、ビオチン-LPA4で検出することを表し、b-LPA4/LPA4は、LPA4でアポリポ蛋白(a)を捕捉し、ビオチン-LPA4で検出することを表し、b-LPA-KIV9/MB47は、MB47でapoB-100を捕獲し、ビオチン-LPA-KIV9で検出することを表し、また、b-LPA-KIV9/LPA4は、LPA4でアポリポ蛋白(a)を捕捉し、ビオチン-LPA-KIV9で検出することを表す。
類似の捕捉/検出抗体フォーマットを有するアッセイを比較すると、真のLp(a)アッセイ(b-LPA4/BM47対b-LPA-KIV9/MB47、r=0.85、p<0.001)と全apo(a)アッセイ(b-LPA4/LPA4対b-LPA-KIV9/LPA4(r=0.94、p<0.001)との間に有意な相関が存在した。また、真のLp(a)と“全apo (a)”との間に有意な相関が存在した(表2)。
免疫組織化学
一塊として取り出された(プラークのみで中膜/外膜なし)ヒト頚動脈内膜切除標本をLPA-KIV9で染色し、比較のためにモノクローナル抗体LPA4で染色した。両方の抗体は、主にアテロームの中心を検出する類似の染色パターンを有し、深い中間領域への染色がより少なかった(図5)。一次抗体の非存在下では染色は認められなかった。
一塊として取り出された(プラークのみで中膜/外膜なし)ヒト頚動脈内膜切除標本をLPA-KIV9で染色し、比較のためにモノクローナル抗体LPA4で染色した。両方の抗体は、主にアテロームの中心を検出する類似の染色パターンを有し、深い中間領域への染色がより少なかった(図5)。一次抗体の非存在下では染色は認められなかった。
いくつかの実施形態が本明細書に記載されている。それにもかかわらず、本開示の主旨及び範囲から逸脱することなく種々の改変が可能であることが理解されるであろう。従って、他の実施形態は、以下の請求の範囲の範囲内にある。
Claims (30)
- リポ蛋白(a)を認識し、それに結合する抗体または抗体断片であって、該抗体または抗体断片が、可変重鎖(VH)ドメイン及び/または可変軽鎖(VL)ドメインを含み、(a)該VHドメインが、配列番号:4またはその変異体、配列番号:6またはその変異体、及び配列番号:8またはその変異体からなる群から選択される相補性決定領域(CDR)を包含するアミノ酸配列を含み、(b)該VLドメインが、配列番号:12またはその変異体、配列番号:14またはその変異体、及び配列番号:16またはその変異体からなる群から選択される相補性決定領域(CDR)を包含するアミノ酸配列を含む、抗体または抗体断片。
- 前記VHドメインが、配列番号:2のアミノ酸配列を含み、および/または前記VLドメインが、配列番号:10のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体または抗体断片。
- 前記抗体または抗体断片が、配列番号:4、6、8、12、14、及び16の相補性決定領域を含む重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインを有する抗体またはscFvからなる群から選択される、請求項1または2に記載の抗体または抗体断片。
- 前記重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインが、Fc領域に連結されている、請求項1、2または3に記載の抗体または抗体断片。
- リポ蛋白(a)のKIV9のエピトープを認識する単鎖可変断片(“scFv”)を含む、請求項1に記載の抗体断片。
- 前記scFvが、生理条件下で可溶である、請求項5に記載のscFv。
- 前記scFvが、配列番号:10に記載の配列と少なくとも95%同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項5または6に記載のscFv。
- 前記scFvが、配列番号:2に記載の配列と少なくとも95%同一である配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項7に記載のscFv。
- 請求項1に記載の可変軽鎖及び可変重鎖を含む、抗体。
- 前記抗体が、キメラである、請求項9に記載の抗体。
- 請求項9または10の抗体、及び担体、賦形剤、または安定剤を含む、医薬組成物。
- 固体基質に結合された、請求項1に記載の抗体または抗体断片。
- 検出可能な標識に操作可能に連結された、請求項1に記載の抗体または抗体断片。
- 請求項1または5に記載の抗体、抗体断片、可変軽鎖、可変重鎖、またはscFvをコードする、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、(i)配列番号:1及び/または9からなる核酸にハイブリダイズする配列を含み、Lp(a)のKIV9に結合する抗体をコードし、(ii)配列番号:2及び/または10の配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む、請求項14に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドで形質転換された、宿主細胞。
- 請求項16記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子導入動物。
- 前記動物が、マウスである、請求項19に記載の遺伝子導入動物。
- 前記scFvまたは抗体が、肝細胞及び/またはマクロファージから発現される、請求項19または20に記載の遺伝子導入動物。
- 前記遺伝子導入動物が、冠状動脈疾患または障害及び/またはアテローム性動脈硬化症の効果をモデル化するために使用される、請求項19または20に記載の遺伝子導入動物。
- 冠状動脈疾患を有するかまたは冠状動脈疾患を有する危険性のある被験者に、請求項1または5に記載の抗体または抗体断片またはscFvを投与することを含む、冠状動脈疾患または石灰化大動脈狭窄を治療または予防する方法。
- 請求項1に記載のVHドメイン及び/またはVLドメインを含有する結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体。
- 請求項24に記載のキメラ抗原受容体を含む、CAR-T細胞。
- N末端またはC末端に1~10個のアミノ酸が結合した配列番号:18(LETPTVV)からなる、単離されたペプチド配列。
- 配列番号:18または19のペプチド及び免疫賦活剤を含む、免疫学的組成物。
- 請求項26に記載の単離されたペプチドを含む、医薬組成物。
- モノクローナル抗体により特異的に認識される抗原性エピトープであって、該モノクローナル抗体が、配列番号:4、6、8、12、14、及び16の相補性決定領域を含む、抗原エピトープ。
- 配列番号:18または19の配列を含有する、抗原エピトープ。
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