JP2022547850A - 抗tigit免疫阻害剤及び応用 - Google Patents
抗tigit免疫阻害剤及び応用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022547850A JP2022547850A JP2022514242A JP2022514242A JP2022547850A JP 2022547850 A JP2022547850 A JP 2022547850A JP 2022514242 A JP2022514242 A JP 2022514242A JP 2022514242 A JP2022514242 A JP 2022514242A JP 2022547850 A JP2022547850 A JP 2022547850A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- cells
- fragment
- seq
- tigit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
本発明は、抗TIGIT免疫阻害剤及び応用を提供する。本発明の免疫阻害剤は、ヒトTIGIT細胞外領域に結合可能であり、当該免疫阻害剤は、がんなどの疾患の治療に用いることができる。
Description
〔技術分野〕
本発明は、免疫学の技術分野に関する。具体的には、免疫チェックポイント抗体、その調製及び免疫学的応用に関する。
本発明は、免疫学の技術分野に関する。具体的には、免疫チェックポイント抗体、その調製及び免疫学的応用に関する。
〔背景技術〕
TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)は、免疫グロブリン(Ig)とチロシン阻害剤モチーフ(ITIM)構造ドメインを有するT細胞免疫受容体であり、主に、活性化されたT細胞とNK細胞に発現されている(Yu,X.,et al.(2009).「The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells.」Nature immunology 10(1):48~57.)。TIGITは、VSIG9、VSTM3とWUCAMとも呼ばれ、その構造が1つの細胞外免疫グロブリン構造ドメイン、1つのI型膜貫通領域と2つのITIMモチーフを含むことを示している。TIGITは共刺激ネットワークの一部であり、この共刺激ネットワークは、主に、T細胞上の活性化受容体CD226と阻害性受容体TIGIT、及びAPC、腫瘍細胞、感染した細胞表面に発現されたリガンドCD155(PVRとも呼ばれ、ヒトにおけるPVR遺伝子によりコードされる灰白髄炎ウイルス受容体タンパク質の1つである)とCD112から構成される。TIGITはPVR又はCD112に結合すると、TIGIT細胞質においてTyr225がリン酸化され、TIGITが細胞自己適応成長因子受容体結合タンパク質2(GRB2)に結合することになる。GRB2は、SHIP1を動員してホスファチジルイノシトールトリキナーゼ(PI3K)とマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナルを阻害することができる。その他に、リン酸化されたTIGITは、Betaによりタンパク質2(β-arrestin2)によるSHIP1の動員を阻害するとともに、TNF受容体関連因子6(TRAF6)の自己ユビキチン化による核因子KB(NF-KB)の活性化への破壊を遮断することにより、一連のシグナル伝達は最終的に、
T細胞又はNK細胞の機能が阻害され、サイトカインの産生が阻害されることを引き起こす。PVRはTIGITのリガンドであり、CD226分子のリガンドでもあるが、CD226のPVR分子との親和力が119nMである。CD112又はCD155に結合すると、CD226の細胞内構造ドメインのSer329とTyr322はリン酸化される。Ser329のリン酸化により、プロテインキナーゼ(PKC)の活性化、及びCD226とリンパ球関連抗原1(LFA1)との相互結合が促進される。LFA1はその後、TYN仲介のTyr322リン酸化とCD226仲介の下流シグナル伝達に用いられる。一連のシグナル伝達により、最終的に、T細胞又はNK細胞の機能が活性化され、サイトカインの産生が促進される。T細胞又はNK細胞表面に存在するTIGIT分子とCD226分子との間にも相互作用が発生するが、それは、TIGIT分子が、CD226による正常な二量体の形成を直接干渉し、CD226の正常な生理的機能を破壊できることに反映されている。このことから、TIGITとCD226は、天秤の両端のように、PVRという支点を通じて、シグナルの伝達への共刺激と共阻害により体の免疫機能を巧みに調整することが分かる。
TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)は、免疫グロブリン(Ig)とチロシン阻害剤モチーフ(ITIM)構造ドメインを有するT細胞免疫受容体であり、主に、活性化されたT細胞とNK細胞に発現されている(Yu,X.,et al.(2009).「The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells.」Nature immunology 10(1):48~57.)。TIGITは、VSIG9、VSTM3とWUCAMとも呼ばれ、その構造が1つの細胞外免疫グロブリン構造ドメイン、1つのI型膜貫通領域と2つのITIMモチーフを含むことを示している。TIGITは共刺激ネットワークの一部であり、この共刺激ネットワークは、主に、T細胞上の活性化受容体CD226と阻害性受容体TIGIT、及びAPC、腫瘍細胞、感染した細胞表面に発現されたリガンドCD155(PVRとも呼ばれ、ヒトにおけるPVR遺伝子によりコードされる灰白髄炎ウイルス受容体タンパク質の1つである)とCD112から構成される。TIGITはPVR又はCD112に結合すると、TIGIT細胞質においてTyr225がリン酸化され、TIGITが細胞自己適応成長因子受容体結合タンパク質2(GRB2)に結合することになる。GRB2は、SHIP1を動員してホスファチジルイノシトールトリキナーゼ(PI3K)とマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナルを阻害することができる。その他に、リン酸化されたTIGITは、Betaによりタンパク質2(β-arrestin2)によるSHIP1の動員を阻害するとともに、TNF受容体関連因子6(TRAF6)の自己ユビキチン化による核因子KB(NF-KB)の活性化への破壊を遮断することにより、一連のシグナル伝達は最終的に、
T細胞又はNK細胞の機能が阻害され、サイトカインの産生が阻害されることを引き起こす。PVRはTIGITのリガンドであり、CD226分子のリガンドでもあるが、CD226のPVR分子との親和力が119nMである。CD112又はCD155に結合すると、CD226の細胞内構造ドメインのSer329とTyr322はリン酸化される。Ser329のリン酸化により、プロテインキナーゼ(PKC)の活性化、及びCD226とリンパ球関連抗原1(LFA1)との相互結合が促進される。LFA1はその後、TYN仲介のTyr322リン酸化とCD226仲介の下流シグナル伝達に用いられる。一連のシグナル伝達により、最終的に、T細胞又はNK細胞の機能が活性化され、サイトカインの産生が促進される。T細胞又はNK細胞表面に存在するTIGIT分子とCD226分子との間にも相互作用が発生するが、それは、TIGIT分子が、CD226による正常な二量体の形成を直接干渉し、CD226の正常な生理的機能を破壊できることに反映されている。このことから、TIGITとCD226は、天秤の両端のように、PVRという支点を通じて、シグナルの伝達への共刺激と共阻害により体の免疫機能を巧みに調整することが分かる。
TIGITとナチュラルキラー(NK)細胞機能障害の関連性についての研究によると、TIGITは、担腫瘍マウス及び結腸がん患者のNK細胞の枯渇に関連していることが明らかになる。幾つかの担腫瘍マウスモデルには、TIGITが遮断されることにより、NK細胞死を阻止するとともに、NK細胞依存性腫瘍免疫を促進することができる。さらに、TIGITの遮断はNK細胞依存性方法により、有効な腫瘍特異的T細胞免疫を引き起こし、腫瘍再投薬モデルにおいて抗PD-L1抗体の治療効果を向上させ、記憶の免疫能力を維持する。この研究から、TIGITは、NK細胞表面における過去に重視されていなかった免疫チェックポイントを構成するとともに、単独で、又は他のチェックポイント受容体と合わせてTIGITを標的とすることが有望な抗がん治療戦略であることが分かる(Zhang,Q.,et al.(2018).「Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity.」 Nature immunology.)。TIGITはT細胞表面にも、NK細胞表面にも高く発現されるのに対し、PD-1、CTLA-4などの他の免疫チェックポイントはT細胞表面のみに発現されることで、治療標的として、TIGIT標的はより大きな優位性を有することに決まっているので、この標的の薬物の開発も明るい治療の見通しと市場の見通しを有する可能性がある。
〔発明の概要〕
本発明は、ヒトTIGITタンパク質に対して高い親和力を有する抗TIGIT抗体を提供する。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、単離した抗TIGIT抗体である。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、TIGITとPVRの結合を効果的に遮断することができ、リンパ球を効果的に活性化してサイトカインを放出することもできる。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、ヒトTIGITとの親和力が高く、適当なADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity;抗体依存性細胞傷害作用)活性を有する。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、種々のがんと感染症などを治療する治療目的に用いることができ、診断と予後に用いることもできる。
本発明は、ヒトTIGITタンパク質に対して高い親和力を有する抗TIGIT抗体を提供する。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、単離した抗TIGIT抗体である。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、TIGITとPVRの結合を効果的に遮断することができ、リンパ球を効果的に活性化してサイトカインを放出することもできる。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、ヒトTIGITとの親和力が高く、適当なADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity;抗体依存性細胞傷害作用)活性を有する。幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、種々のがんと感染症などを治療する治療目的に用いることができ、診断と予後に用いることもできる。
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリン及び免疫受容体チロシン阻害モチーフを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質と特異的に結合するとともに、以下の配列のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は全てを含む:
(a)SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR1、
(b)SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR2、
(c)SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR3、
(d)SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR1、
(e)SEQ ID NO:26又は43に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR2、及び
(f)SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR3。
(a)SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR1、
(b)SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR2、
(c)SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR3、
(d)SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR1、
(e)SEQ ID NO:26又は43に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR2、及び
(f)SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR3。
幾つかの実施形態において、本発明は、単離した抗体又はその断片を提供し、前記抗体又はその断片は、免疫グロブリンと免疫受容体チロシン阻害モチーフを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質と特異的に結合するとともに、下記を含む:
(a)SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR1、
(b)SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR2、
(c)SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR3、
(d)SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR1、
(e)SEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損又は挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR2、及び
(f)SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR3。
(a)SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR1、
(b)SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR2、
(c)SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVH CDR3、
(d)SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR1、
(e)SEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損又は挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR2、及び
(f)SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列、又はそれに1部位の置換、欠損若しくは挿入を有するアミノ酸配列が含まれるVL CDR3。
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその断片は、免疫グロブリンと免疫受容体チロシン阻害モチーフを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質と特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:21に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:22に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:23に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:26又は43に示されるVL CDR2及びSEQ ID NO:27に示されるVL CDR3のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は全てを含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその断片は、免疫グロブリンと免疫受容体チロシン阻害モチーフを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質と特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:21に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:22に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:23に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:26又は43に示されるVL CDR2及びSEQ ID NO:27に示されるVL CDR3を含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその断片は、免疫グロブリンと免疫受容体チロシン阻害モチーフを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質と特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:21に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:22に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:23に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:26に示されるVL CDR2及びSEQ ID NO:27に示されるVL CDR3を含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその断片は、免疫グロブリンと免疫受容体チロシン阻害モチーフを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質と特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:21に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:22に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:23に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:43に示されるVL CDR2及びSEQ ID NO:27に示されるVL CDR3を含む。
幾つかの実施形態において、抗体又はその断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域又はその組み合わせをさらに含む。幾つかの実施形態において、軽鎖はκ又はλ型である。幾つかの実施形態において、軽鎖定常領域は、κ又はλ鎖定常領域である。幾つかの実施形態において、軽鎖定常領域はκ鎖定常領域である。幾つかの実施形態において、軽鎖可変領域はκ又はλ鎖可変領域である。幾つかの実施形態において、軽鎖可変領域はκ鎖可変領域である。幾つかの実施形態において、抗体又はその断片は、IgG、IgM、IgA、IgE又はIgDのうちの1つのアイソタイプである。幾つかの実施形態において、アイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である。幾つかの実施形態において、抗体又はその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体である。幾つかの実施形態において、抗体又はその断片は、ヒト化抗体である。
幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域又はその組み合わせをさらに含む。幾つかの実施形態において、前記Fc領域はヒトのFc領域である。幾つかの実施形態において、前記ヒトFc領域重鎖は、356位(EU番号)でのアミノ酸がEである。幾つかの実施形態において、前記ヒトFc領域重鎖は、386位(EU番号)でのアミノ酸がMである。幾つかの実施形態において、前記重鎖は、SEQ ID NO:28又は29に示されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、前記軽鎖は、SEQ ID NO:30に示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:20、33、35、37、39及び41からなる群から選ばれる1つのアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:20、33、35、37、39及び41からなる群のうちのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列相同性を有する1つのペプチド鎖を含む。幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:24、34、36、38、40及び42からなる群から選ばれる1つのアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:24、34、36、38、40及び42からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列相同性を有する1つのペプチド鎖を含む。
幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:35に示される重鎖可変領域及びアミノ酸配列がSEQ ID NO:36に示される軽鎖可変領域を含む。
幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は、TIGITとPVRの結合を効果的に遮断することができる。幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は、リンパ球を活性化してサイトカインを放出することができる。
幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は、ヒトTIGITとの親和力値KDが100pM以下である。幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は、ヒトTIGITとの親和力値KDが5nM以下である。
幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片はADCC活性を有する。幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片はフコースに結合している。幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片はフコースに結合していない。
別の態様において、本発明は、本発明に記載の抗体断片と、免疫細胞における分子に対して特異性を有する第2抗原結合断片とを含むことを特徴とする二重特異的抗体をさらに説明する。前記分子は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR及びCD47を含む。
別の態様において、本発明は、本発明で開示された抗体又はその断片を含む組成物をさらに提供し、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。幾つかの実施形態において、前記組成物の中の50%以下の抗体又はその断片は、フコースに結合する。幾つかの実施形態において、前記組成物の中の30%以下の抗体又はその断片は、フコースに結合する。幾つかの実施形態において、前記組成物の中の20%以下の抗体又はその断片は、フコースに結合する。幾つかの実施形態において、前記組成物の中の10%以下の抗体又はその断片は、フコースに結合する。幾つかの実施形態において、前記組成物の中の5%以下の抗体又はその断片は、フコースに結合する。幾つかの実施形態において、前記組成物の中の1%以下の抗体又はその断片は、フコースに結合する。
別の態様において、本発明は、前記抗体又はその断片をコードすることができるポリヌクレオチドをさらに提供する。幾つかの実施形態において、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドの配列はSEQ ID NO:46に示され、幾つかの実施形態において、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの配列はSEQ ID NO:47に示される。
別の態様において、本発明は、本発明で開示された抗体又はその断片をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含む細胞をさらに提供する。
別の態様において、本発明は、当該抗体又はその断片を発現するために、当該抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を培養する、ことを特徴とする前記抗体又はその断片を調製する方法をさらに提供する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、CHO細胞、HEK293細胞、Cos1細胞、Cos7細胞、CV1細胞又はマウスL細胞である。
別の態様において、本発明は、治療方法及び使用をさらに提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、患者へ有効用量の本発明で開示された抗体又はその断片を投与することを含む、必要のある患者においてがん又は感染症を治療する方法を提供する。一実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。幾つかの実施形態において、前記がんは、膀胱がん、肝がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化管がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、黒色腫、前立腺がん及び甲状腺がんである。幾つかの実施形態において、前記がんは、膀胱がん、肝がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、メルケル細胞がん、消化管がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん及び小細胞肺がんであってもよい。幾つかの実施形態において、当該方法は、患者に第2種のがん治療剤を投与することをさらに含む。幾つかの実施形態において、前記感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症又は寄生虫感染症である。
幾つかの実施形態において、本発明は、(a)体外で、本発明で開示された抗体又はその断片により細胞を処理することと、(b)処理された細胞を患者の体内に投与することとを含む、必要のある患者においてがん又は感染症を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態において、当該方法は、工程(a)の前に、個体から細胞を単離することをさらに含む。幾つかの実施形態において、患者の体内から細胞を単離する。幾つかの実施形態において、患者と異なるドナー個体から細胞を単離する。幾つかの実施形態において、前記細胞はT細胞であり、その非制限的な実例は、腫瘍浸潤Tリンパ球、CD4+T細胞、CD8+T細胞又はその組み合わせを含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、必要のある患者においてがん又は感染症を治療するための薬物の調製における抗TIGIT抗体又はその断片の応用をさらに提供する。幾つかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。幾つかの実施形態において、前記がんは、膀胱がん、肝がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化管がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、黒色腫、前立腺がん及び甲状腺がんから選ばれる。幾つかの実施形態において、前記患者に第2種のがん治療剤を投与することをさらに含む。幾つかの実施形態において、感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症又は寄生虫感染症である。
幾つかの実施形態において、本発明は、がん又は感染症を治療するための薬物の調製における細胞の応用をさらに提供し、前記応用は、(a)体外で、抗体又はその断片により前記細胞を処理することと、(b)処理された前記細胞を患者の体内に投与することと、を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、工程(a)の前に、個体から前記細胞を単離することをさらに含む。幾つかの実施形態において、前記細胞は、前記患者の体内から単離される。幾つかの実施形態において、前記細胞は、前記患者と異なるドナー個体から単離される。幾つかの実施形態において、前記細胞はT細胞である。幾つかの実施形態において、前記T細胞は、腫瘍浸潤性Tリンパ球、CD4+T細胞、CD8+T細胞又はその組み合わせである。
別の態様において、本発明は、診断方法及び使用をさらに提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、試料を抗体又はその断片と一定の条件で接触することにより、抗体又はその断片をTIGITに結合させ、試料におけるTIGITの発現であるその結合を検出することを含む、試料におけるTIGITの発現を検出する方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記試料は、腫瘍細胞、腫瘍組織、感染された組織又は血液試料を含む。
〔図面の簡単な説明〕
本願の実施例中の技術的解決手段をより明らかに説明するために、以下、実施例に使用する必要がある図面を簡単に紹介するが、無論、下記の図面は、単に本願に記載される幾つかの実施例に過ぎない。
本願の実施例中の技術的解決手段をより明らかに説明するために、以下、実施例に使用する必要がある図面を簡単に紹介するが、無論、下記の図面は、単に本願に記載される幾つかの実施例に過ぎない。
〔発明を実施するための形態〕
定義
注意すべきであることは、用語「1種」の実体は、1種又は複数種の当該実体を指し、例えば、「1種の抗体」は、1種又は複数種の抗体と理解されるべきであるので、用語「1種」(又は「1つ」)、「1種又は複数種」及び「少なくとも1種」は、本明細書で交換して使用してもよい。
定義
注意すべきであることは、用語「1種」の実体は、1種又は複数種の当該実体を指し、例えば、「1種の抗体」は、1種又は複数種の抗体と理解されるべきであるので、用語「1種」(又は「1つ」)、「1種又は複数種」及び「少なくとも1種」は、本明細書で交換して使用してもよい。
「アミノ酸」とは、α-アミノ酸のようなアミノ基とカルボキシル基を同時に含む有機化合物であり、そのまま又は前駆体の形式で核酸によりコード化することができる。単一のアミノ酸は、3つのヌクレオチド(いわゆるコドン又は塩基トリプレット)から構成される核酸によりコードされる。それぞれのアミノ酸は、少なくとも1つのコドンによりコードされる。同じアミノ酸が異なるコドンによりコードされることは、「遺伝暗号の退化性」と呼ばれている。アミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸を含む。天然アミノ酸は、アラニン(3文字符号:Ala、1文字符号:A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(Asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン(Gln、Q)、グルタミン酸(Glu、E)、グリシン(Gly、G)、ヒスチジン(His、H)、イソロイシン(Ile、I)、ロイシン(Leu、L)、リシン(Lys、K)、メチオニン(Met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(Pro、P)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)及びバリン(Val、V)を含む。
「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸残基が、化学的特性(例えば、電荷又は疎水性)が類似した側鎖(R基)を含む別のアミノ酸残基で置換されることを意味する。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変えることはあまりない。化学的特性が類似した側鎖を含むアミノ酸の種類の実例は、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン;2)脂肪族ヒドロキシ基側鎖:セリン及びトレオニン;3)アミドを含む側鎖:アスパラギン及びグルタミン;4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン;5)塩基性側鎖:リシン、アルギニン及びヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
本発明において、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」をカバーすることを意図し、アミド結合(ペプチド結合とも呼ばれる)を介して直線状に接続されたモノマー(アミノ酸)からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2つ以上のアミノ酸からなる任意の単一鎖又は複数鎖を指し、生成物の所定の長さについて触れない。従って、「ポリペプチド」の定義は、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は、2つ若しくは複数のアミノ酸鎖を指すための任意の他の用語を含み、用語「ポリペプチド」は、上記何れか1つの用語の代わりに用いられ、又は上記何れか1つの用語と交互に用いられることができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後に修飾された生成物も指し、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護・封鎖基による誘導化、タンパク質加水分解切断又は非天然発生のアミノ酸修飾を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然生物から由来し、又は組換え技術により産生することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳して得られるとは限らない。それは、化学合成を含む何れの方法により産生されてもよい。
本発明で抗体、細胞、核酸について使用される用語である「単離した」、例えば、「単離した」DNA又はRNAは、それぞれ大分子の天然由来のものに存在する他のDNA又はRNAから単離した分子を指す。本発明に使用される用語「単離した」は、組換えDNA技術により産生された場合に細胞材料、ウイルス材料若しくは細胞培地の核酸又はペプチド、或いは、化学合成された場合の化学的前駆体又は他の化学品を基本的に含まないことを指す。さらに、「単離した核酸」は、自然な状態で存在しない核酸断片を含み、自然な状態で存在することはないことを意図する。用語「単離した」は、本発明において、他の細胞タンパク質又は組織から単離した細胞又はポリペプチドを指すことにも用いられる。単離したポリペプチドは、精製された及び組換えられたポリペプチドを含むとしている。
本発明において、用語「組換え」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関するもので、自然に存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し、非制限的な実施例は、組み合わせにより通常存在していないポリヌクレオチド又はポリペプチドを産生することができる。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、2つのペプチド間又は2つの核酸分子間の配列類似性を指す。それぞれの配列におけるアラインメント可能な位置を比較することにより、相同性を確定することができる。比較される配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸に占められると、分子は当該位置で相同である。配列間の相同性の度合は、配列の共有するマッチング位置又は相同位置の数で構成された関数である。用語「非関連の」又は「非相同の」配列は、本発明で開示された配列の1つと40%よりも小さい同一性、例えば、25%よりも小さい同一性を有することを示す。
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域(又は、ポリペプチド若しくはポリペプチド領域)は、他の配列と一定の百分率(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%)の「配列同一性」を有するとは、配列のアラインメントの時に、比較される2つの配列に当該百分率の塩基(又はアミノ酸)が同じであることである。この分野で知られているソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al.eds.(2007)がCurrent Protocols in Molecular Biologyに記載したソフトウェアプログラムにより、当該アラインメント及び相同性の百分率又は配列同一性を確定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータを用いてアラインメントを行う。アラインメントプログラムの1つは、デフォルトパラメータを用いるBLASTである。特に、プログラムは、下記のデフォルトパラメータを用いるBLASTN及びBLASTPである:Genetic code=standard;filter=none;strand=both;cutoff=60;expect=10;Matrix=BLOSUM62;Descriptions=50 sequences;sort by=HIGH SCORE;Databases=non-redundant;GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学的に同等のポリヌクレオチドは、上記に指定された百分率の相同性を有するとともに、同様又は類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
用語「同等な核酸又はポリヌクレオチド」とは、核酸又はその相補体のヌクレオチド配列と一定の程度の相同性又は配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸である。二重鎖核酸の相同物は、それ自体又はその相補性配列と一定の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むとしている。一方、核酸の相同物は、核酸又はその相補体とハイブリダイゼーションすることができる。同様に、「同等なポリペプチド」とは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と一定の相同性又は配列同一性を有するポリペプチドである。幾つかの態様において、配列同一性は、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%である。幾つかの態様において、参照されるポリペプチド又はポリヌクレオチドと比べて、同等なポリペプチド又はポリヌクレオチドは、1つ、2つ、3つ、4つ又は5つの添加、欠損、置換とその組み合わせを有する。幾つかの態様において、同等な配列は、参照配列の活性(例えば、エピトープ結合)又は構造(例えば、塩橋)を保持する。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「厳密性」の条件で行うことができる。低厳密性のハイブリダイゼーション反応は通常、約40℃の条件で、約10×SSC又は同じイオン強度/温度の溶液にて行われる。中程度の厳密性のハイブリダイゼーション反応は通常、約50℃の条件で、約6×SSCにて行われ、高厳密性のハイブリダイゼーション反応は通常、約60℃の条件で、約1×SSCにて行われる。ハイブリダイゼーション反応は、当業者によく知られている「生理的条件」で行われてもよい。非制限的な生理的条件の実施例は、通常、細胞に存在する温度、イオン強度、pH及びMg2+濃度を指す。
ポリヌクレオチドは、4つヌクレオチド塩基の特定の配列、即ち、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)とチミン(T)からなり、ポリヌクレオチドがRNAである場合に、チミンはウラシル(U)に取り替えられる。従って、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子の文字で示される。当該文字は、中央処理装置を有するコンピュータにおけるデータベースに入力され、生物情報学的応用、例えば、機能ゲノミクスと相同性検索に用いられることができることを示す。用語「多型性」は、1つより多い形式の遺伝子又はその一部の共存を指し、少なくとも2つの異なる形式(即ち、2つの異なるヌクレオチド配列)を有する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型性領域」と呼ばれる。多型性領域は、モノヌクレオチドであってもよいが、異なる対立遺伝子において、異なる同一性を有する。
用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」が互いに交換して使用してもよいとは、デオキシリボヌクレオチドであっても、リボヌクレオチド又はその類似体であっても、任意の長さのヌクレオチドの重合形式を指す。ポリヌクレオチドは、何れの3次元構造を有してもよく、また、既知又は未知の何れの機能を実行することができる。非制限的なポリヌクレオチドの実施例は、遺伝子又は遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、EST又はSAGEラベル)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、担体、任意の配列の単離したDNA、任意の配列の単離したRNA、核酸プローブ及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含んでもよい。当該修飾がある場合に、ヌクレオチドの構造への修飾は、ポリヌクレオチドを組み立てる前でも後でも行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。重合後に、標識成分との複合などによりポリヌクレオチドをさらに修飾してもよい。この用語は、二重鎖及び単鎖分子も指す。特に説明や要求のない限り、本開示の何れのポリヌクレオチドの実施形態も、二重鎖形式、及び知られている又は予測される二重鎖形式を構成する2つの相補可能な単鎖形式のうちのそれぞれの形式を含む。
用語「コード」はポリヌクレオチドに適用される場合に、ポリペプチドを「コード」するポリヌクレオチドを指し、その自然な状態にあると、又は、当業者に公知されている方法により操作される場合、それは、ポリペプチド及び/又はその断片のmRNAが産生されるように、転写及び/又は翻訳されることができる。アンチセンス鎖はこのような核酸の相補性配列であり、そのコード配列は、その中から導き出すことができる。
本発明において、「抗体」又は「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は、完全な抗体及びその任意の抗原結合断片又はその単鎖であってもよい。従って、用語「抗体」は、分子中に、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質又はペプチドを含む。当該実施例は、重鎖又は軽鎖又はそのリガンド結合部分の相補決定領域(CDR)、重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)、重鎖定常領域(CH)又は軽鎖定常領域(CL)、フレーム(FR)領域又はその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部を含むが、これらに限定されない。CDR領域は、軽鎖のCDR領域(LCDR)及び重鎖のCDR領域(HCDR)を含む。
本発明において、用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、抗体の一部、例えば、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFvなどである。その構造に関わらず、抗体断片は、完全な抗体により認識される同一の抗原に結合する。用語「抗体断片」は、アプタマー、鏡像異性体及び2価抗体を含む。用語「抗体断片」は、特定の抗原に結合して複合体を形成して抗体作用を果たす任意の合成された又は遺伝子工学によってなされたタンパク質をさらに含む。
「単鎖可変断片」又は「scFv」とは、免疫グロブリンの重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。幾つかの態様において、これらの領域は、10個から約25個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより接続される。リンカーは、柔軟性を向上させるためにグリシンを豊かに含んでもよく、溶解性を向上させるためにセリン又はトレオニンを豊かに含んでもよく、かつ、VHのN末端及びVLのC末端に接続されてもよく、その逆もまた然りである。当該タンパク質は、定常領域が除去されてリンカーが導入されたが、元の免疫グロブリンの特異性が保たれている。この分野で知られているScFv分子については、例えば、米国特許5,892,019に記載されている。
用語「抗体」は、生物化学的に区分可能な各幅広い種類のポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖の種類は、gamma、mu、alpha、delta又はepsilon(γ、μ、α、δ、ε)を含み、さらに幾つかのサブクラス(例えば、γ1-γ4)を含むことが理解される。当該鎖の性質によって、抗体の「種類」は、それぞれIgG、IgM、IgA、IgD又はIgEと決定される。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などの免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)は、既に十分に特徴づけられ、付与された機能特異性も知られている。当業者であれば、これらの種類及びアイソタイプの中の各種の変更形式が容易に想到されるので、何れも本発明で開示された請求の範囲にあり、あらゆる免疫グロブリン種類は、本発明で開示された請求の範囲にあることが明らかである。IgGについて、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約23,000ドルトンである2本の同じ軽鎖ポリペプチド及び分子量が約53,000~70,000である2本の同じ重鎖ポリペプチドを含む。この4本の鎖は、通常、ジスルフィド結合により「Y」配置で接続され、そのうち、軽鎖は「Y」の口部から始め、引き続き可変領域を通じ重鎖を取り囲む。
本発明で開示された抗体、抗原結合断片又は誘導体は、ポリクローナル・モノクローナル・多重特異性・完全ヒト・ヒト化・霊長類化・キメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばFab、Fab’及びF(ab’)2、Fd、Fvs、単鎖Fvs(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合に接続されるFvs(sdFv)、VK又はVH構造ドメインを含む断片、Fab発現ライブラリーにより産生された断片及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明で開示されたLIGHT抗体の抗Id抗体を含む)を含むが、これらに限定されない。本発明で開示された免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリンの任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAとIgY)又はクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1とIgA2)又はサブクラスであってもよい。
軽鎖は、kappa又はlambda(κ、λ)に分けられることができる。それぞれの重鎖は、κ又はλ軽鎖に結合することができる。一般的に、ハイブリドーマ、B細胞又は遺伝子工学的宿主細胞により免疫グロブリンを製造する時に、その軽鎖及び重鎖は共有結合を介して結合し、2本の重鎖の「尾」部は、共有ジスルフィド結合又は非共有結合を介して結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Y配置の叉状末端のN末端から各本の鎖の底部のC末端へ延伸する。免疫グロブリンのκ軽鎖可変領域はVκであり、免疫グロブリンのλ軽鎖可変領域はVλである。
軽鎖及び重鎖は何れも、構造及び機能相同性の領域に分けられる。用語「定常の」及び「可変の」は、機能によって使用される。この点から、軽鎖(VL)及び重鎖(VH)部分の可変領域は、抗原認識と特異性を決定すると理解すべきである。逆に、軽鎖(CL)及び重鎖(CH1、CH2又はCH3)の定常領域は、分泌、胎盤による移動、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を付与する。慣例に従って、定常領域の番号は、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から離れるほど増加する。N末端部分は可変領域で、C末端部分は定常領域であり、CH3及びCL構造ドメインは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上述したように、可変領域により、抗体が、抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合可能になる。つまり、抗体のVL構造ドメイン及びVH構造ドメイン又は相補決定領域(CDR)のサブセット結合により、3次元抗原結合部位を限定する可変領域が形成される。当該抗体の四次構造は、Yのそれぞれのアーム末端にある抗原結合部位を形成する。より具体的に、抗原結合部位は、VH及びVL鎖の中のそれぞれの3つのCDR(即ち、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3)により定義される。幾つかの場合に、例えば、幾つかのラクダ科動物由来の免疫グロブリン分子、又はラクダ科動物の免疫グロブリンに基づいて改変された免疫グロブリン分子、完全な免疫グロブリン分子は、軽鎖無しで、重鎖のみから構成されてもよい。例えば、Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446~448(1993)が参照される。
自然に存在する抗体において、抗体が含水環境でその3次元配置を示すと、それぞれの抗原結合ドメインにおける6つの「相補決定領域」又は「CDR」は、抗原結合構造ドメインの短くて非連続的なアミノ酸配列が形成されるように、特異的に位置決めされる。抗原結合構造ドメインにおいて「フレームワーク」領域と呼ばれる残った他のアミノ酸は、小さい分子間可変性を示す。フレームワーク領域のほとんどはβ-折り畳み配座を採用し、CDRがそれに接続する環状構造を形成し、又は場合によっては、β折り畳み構造の一部を形成する。従って、フレーム領域は、ステントを形成することにより、鎖間の非共有的な相互作用でCDRを正確な方位に位置決めする。特定の位置でのCDRにより形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原におけるエピトープと相補する表面を定義しており、当該相補表面により、抗体及びその相同エピトープの非共有結合が促進される。何れの所定の重鎖又は軽鎖可変領域にも、当業者は、よく使用されている定義によって(例えば、「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)及びChothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901~917(1987))、CDRとフレーム領域を含むアミノ酸を同定することができる。
Kabat及びChothiaによって定義されたCDRは、互いに比較する時のアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。とはいえ、何れの定義で抗体又はその抗原結合断片のCDRを示しても、本発明に定義と使用される用語の範囲内にある。特定のCDRを含む確実な残基番号は、CDRの配列及び大きさによって変化される。当業者は、通常のように、抗体の可変領域のアミノ酸配列によって、どちらの残基が特定のCDRを含むかを確定することができる。
Kabatらはまた、任意の抗体の可変領域配列に適用される番号システムを定義した。当業者は、無論、配列そのもの以外の任意の実験データに依存することなく、当該「Kabat番号」システムを任意の可変領域配列に適用することができる。本発明に使用される「Kabat番号」は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Servicesが「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)において提出された番号システムを指す。
Kabat番号システムは、下記のようにCDR領域を説明する。HCDR1は、約31番目のアミノ酸(即ち、第1のシステイン残基の後の約9つの残基)から始まり、約5~7個のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。HCDR2は、HCDR1が終わった後の15番目の残基から始まり、約16~19個のアミノ酸残基を含み、次のアルギニン又はリシン残基で終わる。HCDR3は、HCDR2が終わった後の約33番目のアミノ酸残基から始まり、3~25個のアミノ酸を含み、配列W-G-X-Gで終わり、ただし、Xが任意のアミノ酸を示す。LCDR1は、約24番目の残基から始まり(即ち、システイン残基の後)、約10~17個の残基を含み、次のトリプトファン残基で終わる。LCDR2は、LCDR1が終わった後の約16番目の残基から始まり、約7個の残基を含む。LCDR3は、LCDR2が終わった後の約33番目の残基(即ち、システイン残基の後)から始まり、約7~11個の残基を含み、配列F又はW-G-X-Gで終わり、ただし、Xが任意のアミノ酸を示す。
本発明で開示された抗体は、鳥類と哺乳動物を含む任意の動物から由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリ由来の抗体である。他の実施形態において、可変領域は、軟骨魚綱(condricthoid)由来(例えば、サメ由来)であってもよい。
「軽鎖-重鎖対」とは、軽鎖のCL構造ドメインと重鎖のCH1構造ドメインとの間のジスルフィド結合により、二量体を形成できる軽鎖と重鎖の集合体である。
上述したように、様々な免疫グロブリン種類の定常領域のサブユニット構造及び3次元配置は、公知のものである。本発明において、用語「VH構造ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ基末端可変構造ドメインを含み、用語「CH1構造ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第1の(ほとんどのアミノ基末端)定常領域を含む。CH1構造ドメインはVH構造ドメインに隣接するとともに、CH1構造ドメインは免疫グロブリン重鎖分子ヒンジ領域のアミノ基端に接続される。
本発明において、用語「CH2構造ドメイン」は、通常の番号方案が用いられる場合に、抗体の約244番目の残基から360番目の残基まで延伸した部分の重鎖分子(244~360番目の残基、Kabat番号システム;231~340番目の残基、EU番号システム;Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)を参照)を含む。CH2構造ドメインは、他の構造ドメインと緊密にペアリングせず、完全な天然IgG分子の2つのCH2構造ドメイン間に、2つのN-で接続した分岐炭水化物鎖を挿入しているので、独特である。また、CH3構造ドメインは、CH2構造ドメインからIgG分子のC-末端まで延伸し、約108個の残基を含むと記載した文献がある。
本発明において、用語「ヒンジ領域」は、CH1構造ドメイン及びCH2構造ドメインを接続する重鎖部分を含む。前記ヒンジ領域は、約25個の残基を含むとともに柔軟性があることで、2つのN末端抗原結合領域がそれぞれ独立して移動可能になる。ヒンジ領域は、上・中・下ヒンジ構造ドメインという3つの異なる構造ドメインに細かく分けることができる(Roux et al.,J.Immunol 161:4083(1998))。
本発明において、用語「ジスルフィド結合」は、2つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。システインは、第2のチオール基とジスルフィド結合を形成し、又は架橋可能なチオール基を含む。自然に存在するIgG分子のほとんどにおいて、CH1及びCL領域はジスルフィド結合により接続され、2本の重鎖は2つのジスルフィド結合により、Kabat番号システムにおける対応する位置239及び242(位置226又は229、EU番号システム)で接続される。
本発明において、用語「キメラ抗体」は、その免疫反応性領域又は部位が第1の種から取得又は誘導され、その定常領域(本発明において、完全なもの、部分的なもの、又は修飾されたものであってもよい)が第2の種から由来する任意の抗体を指すと考えられる。幾つかの実施形態において、標的結合領域又は部位は、非ヒト(例えば、マウス又は霊長類動物)由来であり、定常領域はヒト由来である。
「特異的結合」は通常、抗体がその抗原結合構造ドメインを介して抗原エピトープに結合することを指し、当該結合は、抗原結合構造ドメインとエピトープとの間に相補性を有する必要がある。この定義によれば、抗体がその抗原結合構造ドメインを介して当該エピトープに結合する場合は、無作為・非関連のエピトープに結合する場合よりも容易であり、当該エピトープに「特異的結合」すると呼ばれる。用語「特異的」は本発明において、特定のエピトープに結合する特定の抗体の相対的親和力を限定するためである。
本発明において、用語「治療」は、治療的な治療及び予防的又は予防治療的な措置を指し、不良な生理学的変化又は障害、例えば、がんの進展を予防又は低減(減少)することを目的とする。有益な又は望ましい臨床的結果は、検出できるか否かを問わず、症状の軽減又は解消、疾患の重症度の軽減、疾患状態の安定(即ち、悪化しないこと)、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び軽減又は解消(部分的でも全体的でも)を含むが、これらに限定されない。「治療」は、さらに、治療を受けない時に予期される生存期間と比べて延ばされた生存期間を意味する。治療する必要がある者は、病気や障害に罹った者、及び病気や障害に罹りやすい者、又は当該病気や障害を予防する必要がある者を含む。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は通常、診断、予後又は治療する必要がある任意の対象、特に、哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象は、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシなどを含む。
本発明において、例えば「治療する必要がある患者」又は「治療する必要がある対象」などの連語は、検出・診断過程及び/又は治療中における本発明で開示された抗体又は組成物の投与から利益を得た対象、例えば、哺乳動物対象を含む。
抗TIGIT抗体
本発明は、ヒトTIGITタンパク質に対して高い親和力を有する抗TIGIT抗体を提供する。受検抗体は、効果的な結合及び抑制活性を示し、治療及び診断的使用に用いることができる。例えば、実施例に示されるように、これらの抗体は、TIGITとPVRの結合を効果的に遮断することができ、リンパ球を効果的に活性化してサイトカインを放出することもできる。これらの抗体は、ヒトTIGITとの親和力が高く、適当なADCC活性を有する。
本発明は、ヒトTIGITタンパク質に対して高い親和力を有する抗TIGIT抗体を提供する。受検抗体は、効果的な結合及び抑制活性を示し、治療及び診断的使用に用いることができる。例えば、実施例に示されるように、これらの抗体は、TIGITとPVRの結合を効果的に遮断することができ、リンパ球を効果的に活性化してサイトカインを放出することもできる。これらの抗体は、ヒトTIGITとの親和力が高く、適当なADCC活性を有する。
従って、本発明は、TIGITタンパク質に特異的に結合可能な抗TIGIT抗体又はその断片を提供している。
幾つかの実施形態において、本発明は、表2.1に示すようなCDR領域の重鎖及び軽鎖可変構造ドメインを含む抗体を提供する。実施例中の実験に示すように、これらのCDR領域を含む抗体は、マウス化でもヒト化でも、TIGITへの効果的結合及び抑制活性を有する。
幾つかの実施例において、本発明で開示された抗TIGIT抗体は、SEQ ID NO:20、33、35、37、39及び/又は41に示されるVH又はそれとそれぞれ80%、85%、90%、95%、98%又は99%の配列同一性を有する配列、SEQ ID NO:24、34、36、38、40及び/又は42に示されるVL又はそれとそれぞれ80%、85%、90%、95%、98%又は99%の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、全体として80%、85%、90%、95%、98%又は99%の配列同一性を有するVHは、CDR(SEQ ID NO:21~23、25~27、43又はそれに1部位の置換、欠損又は挿入を有するアミノ酸配列)を保持する。一実施例において、VHは、SEQ ID NO:35に示されるアミノ酸配列を有し、VLはSEQ ID NO:36に示されるアミノ酸配列を有する。
幾つかの実施例において、本発明で開示された抗TIGIT抗体は、ヒトのFc領域を含む。重鎖及び軽鎖の定常領域配列は、例えば、SEQ ID NO:28(又は29)及び30を有してもよい。SEQ ID NO:28と比較すると、SEQ ID NO:29は、第239位でのアミノ酸においてDがEで置換され(EU番号では第356位、Kabat番号では第377位である)、第241位でのアミノ酸においてLがMで置換された(EU番号では第358位、Kabat番号では第381位である)。
幾つかの実施例において、本発明で開示された抗TIGTI抗体は、重鎖の配列がSEQ ID NO:44に示され、軽鎖の配列がSEQ ID NO:45に示される。
当業者はさらに、本発明で開示された抗体が修飾されることができ、修飾後にそのアミノ酸配列が、当該抗体を誘導した自然に存在する結合ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なっていると理解すべきである。例えば、同一の指定されるタンパク質から誘導されたポリペプチド又はアミノ酸配列は、開始配列と類似してもよく、例えば、開始配列と一定の比率の同一性を有し、例えば、その開始配列との同一性が60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%であってもよい。
幾つかの実施形態において、抗体は、アミノ酸配列、及び通常抗体と無関係な1つ又は複数の基を含む。以下、代表的な修飾をさらに詳しく説明する。例えば、本発明で開示された抗体は、柔軟性を有するリンカー配列を含んでもよく、又は、官能基(例えば、PEG、薬物、毒素やラベル)を添加するために修飾されてもよい。
幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片はフコースに結合していない。幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片は、多くとも3つ(又は、多くとも2つ、1つ)のアミノ酸残基がフコースにより修飾される。幾つかの実施形態において、前記抗体又はその断片を含む製剤には、多くとも0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%又は5%未満のタンパク質分子がフコースにより修飾される。幾つかの実施形態において、フコースによる修飾が低減又は除去された抗体はより強いADCCを有し、一部の治療的使用に適する。
本発明で開示された抗体、変異体又は誘導体は、修飾される誘導体を含み、即ち、任意種類の分子と抗体との共有結合により修飾され、ここで、共有結合は抗体とエピトープとの結合を阻止しない。下記の実例を含むが、これらに限定されず、抗体は例えば、グリコシル化、アセチル化、ポリエチレングリコール化、リン酸化、アミド化、既知の保護/封鎖基による誘導化、タンパク質加水分解切断、細胞リガンド又は他タンパク質への接続などによって修飾されてもよい。多くの化学修飾のうちの何れの修飾も、従来技術によって行うことができ、特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない。さらに、抗体は、1つ又は複数の非典型的なアミノ酸を含んでもよい。
幾つかの実施形態において、抗体は、治療剤、薬物前駆体、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、薬剤又はPEGと複合することができる。
抗体は、治療剤と複合又は融合することができ、前記治療剤は、検出可能な標識、例えば、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光増感剤や診断薬を含んでもよく、薬物又は毒素の細胞傷害剤、超音波増強剤、非放射性標識物とその組成物、及び当分野で知られている他のこのような試薬であってもよい。
抗体は、化学発光化合物にカップリングされることにより、検出可能に標識される。そして、化学反応過程において現れた発光を検出することにより、化学発光標識された抗体の存在を確定する。特に有用な化学発光標識化合物の実例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジン塩及びシュウ酸エステルを含む。
二官能性分子
TIGITは免疫受容体の1つであり、腫瘍抗原でもある。腫瘍抗原標的分子として、TIGITと特異的に結合する抗体又は抗原結合断片を、免疫細胞特異性を有する別の抗原結合断片と組み合わせることにより、二重特異的抗体を産生することができる。
TIGITは免疫受容体の1つであり、腫瘍抗原でもある。腫瘍抗原標的分子として、TIGITと特異的に結合する抗体又は抗原結合断片を、免疫細胞特異性を有する別の抗原結合断片と組み合わせることにより、二重特異的抗体を産生することができる。
幾つかの実施形態において、前記免疫細胞は、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球及び肥満細胞からなる群から選ばれる。免疫細胞上の標的分子は、例えば、CD3、CD16、CD19、CD28及びCD64を含む。また、他の例は、PD-1、CTLA-4、LAG-3(CD223とも呼ばれる)、CD28、CD122、4-1BB(CD137とも呼ばれる)、TIM3、OX-40又はOX40L、CD40又はCD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM又はBTLA(CD272とも呼ばれる)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)及びCD47を含む。二重特異性の具体的な実例は、TIGIT/PD-1、TIGIT/LAG3及びTIGIT/CD47を含むが、これらに限定されない。実施例に示されるように、本発明のTIGIT抗体及びPD-L1抗体は、相乗効果を有する。
幾つかの実施形態において、TIGITと特異的に結合する抗体又は抗原結合断片を、腫瘍抗原特異性を有する別の抗原結合断片と組み合わせることにより、二重特異的抗体を産生することができる。「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞により産生される抗原物質の1つであり、即ち、宿主において免疫応答を引き起こすものである。腫瘍抗原は、腫瘍細胞の同定に用いることができ、がん治療の候補標的として用いることができる。体内での正常なタンパク質は抗原性のものではなく、腫瘍発生過程においてあるタンパク質が産生され、又は過剰に発現されるので、それは体にとって「外因性のもの」である。これらのタンパク質は、免疫システムによりうまく隔離された正常なタンパク質、通常に極微量で生成されたタンパク質、通常に発育の幾つかの段階のみにおいて産生されたタンパク質、又は突然変異により構造が修飾されたタンパク質を含んでもよい。
当分野では、大量の腫瘍抗原が既に発見されたとともに、選別により、新たな腫瘍抗原を容易に同定することができる。腫瘍抗原の非制限的な実例は、EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、ムコタンパク質、TAG-72、CIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、内在性タンパク、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP及びテネイシンを含む。
幾つかの態様において、対応する非腫瘍細胞と比べて、1価ユニットは、腫瘍細胞における過剰に発現されたタンパク質に対して特異性を有する。ここで使用される「対応する非腫瘍細胞」は、腫瘍細胞の由来と同様の細胞種類の非腫瘍細胞を指す。このようなタンパク質は、必ずしも腫瘍抗原と異なるとは限らないと注意すべきであり、非制限的な実例としては、ほとんどの結腸がん、直腸がん、乳がん、肺がん、膵臓がん及び胃腸管がんに過剰発現されるがん胎児性抗原(CEA)と、常に乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん及び子宮頸がんに過剰発現される神経調節タンパク質受容体(HER-2、neu又はc-erbB-2)と、乳がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん及び前立腺がんを含む一連の固形腫瘍に高く発現される上皮成長因子受容体(EGFR)と、アシアロ糖タンパク質受容体と、トランスフェリン受容体と、肝細胞に発現されるセルピン複合体受容体と、膵管腺がん細胞に過剰発現される線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)と、抗血管新生遺伝子治療用の血管内皮成長因子受容体(VEGFR)と、90%の非粘液性卵巣がんに選択的に過剰発現される葉酸受容体と、細胞表面グリコカリックスと、炭水化物受容体と、主に遺伝子を呼吸上皮細胞に送達し、嚢胞性線維症などの治療に対して潜在的な吸引力がある重合免疫グロブリン受容体とが含まれる。ここで、二重特異性の非制限的な実例は、TIGIT/EGFR、TIGIT/Her2、TIGIT/CD33、TIGIT/CD133、TIGIT/CEA及びTIGIT/VEGFを含む。
本発明は、異なる形式の二重特異的抗体をさらに開示する。幾つかの実施例において、抗TIGIT断片及び別の断片はそれぞれ、Fab断片、単鎖可変断片(scFv)又は単一ドメイン抗体から選ばれる。幾つかの実施例において、二重特異的抗体は、Fc断片をさらに含む。
本発明は、抗体又は抗原結合断片を除いた二官能性分子をさらに開示する。腫瘍抗原標的分子としては、本発明に記載のTIGITに特異的に結合する抗体又は抗原結合断片を免疫サイトカイン又はリガンドとペプチドリンカーを介して選択的に接続することができる。前記接続される免疫サイトカイン又はリガンドは、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT及びGITRLを含むが、これらに限定されない。このような二官能性分子は、免疫チェックポイント遮断効果を腫瘍部位の局所免疫調節と組み合わせることができる。
抗体をコードするポリヌクレオチド及び抗体の調製方法
本発明は、本発明に記載の抗体及びその抗原結合断片又は誘導体をコードする単離したポリヌクレオチド又は核酸分子をさらに開示する。本発明で開示されたポリヌクレオチドは、上記抗体又は抗原結合断片又は誘導体の重鎖及び軽鎖可変領域全体をコードすることができる。また、本発明で開示されたポリヌクレオチドは、上記抗体又は抗原結合断片又は誘導体における重鎖及び軽鎖可変領域の一部をコードすることができる。
本発明は、本発明に記載の抗体及びその抗原結合断片又は誘導体をコードする単離したポリヌクレオチド又は核酸分子をさらに開示する。本発明で開示されたポリヌクレオチドは、上記抗体又は抗原結合断片又は誘導体の重鎖及び軽鎖可変領域全体をコードすることができる。また、本発明で開示されたポリヌクレオチドは、上記抗体又は抗原結合断片又は誘導体における重鎖及び軽鎖可変領域の一部をコードすることができる。
幾つかの実施形態において、抗TIGIT抗体h10D8OFをコードするポリヌクレオチドの配列は、SEQ ID NO:46及び47に示され、そのうち、配列SEQ ID NO:46は、抗TIGIT抗体h10D8OFを産生する重鎖をコードすることができ、配列SEQ ID NO:47は、抗TIGIT抗体h10D8OFを産生する軽鎖をコードすることができる。
SEQ ID NO:46の配列は下記の通りである:
SEQ ID NO:47の配列は以下のとおりである:
幾つかの実施形態において、ハイブリドーマ技術により、本発明の抗TIGIT抗体又はその抗原結合断片を調製して産生する。例えば、ハイブリドーマ法により、Kohler及びMilstein,Nature,256:495(1975)に記載されたようなモノクローナル抗体を調製する。ハイブリドーマ法では、リンパ球が免疫剤と特異的に結合する抗体を産生する又は産生可能になるように、通常、免疫剤でマウス、ハムスター又は他の適当な宿主動物を免疫する。
免疫剤は通常、タンパク質抗原、その断片、又はその融合タンパク質を含む。通常、ヒト細胞が求められる場合は、末梢血リンパ球が使用され、非ヒトの哺乳動物由来のものが求められる場合は、脾臓リンパ球又はリンパ節細胞が使用される。幾つかの実施形態において、脾臓リンパ球が使用される。そして、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤により、リンパ球を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59~103ページ)。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、特に、齧歯動物、ウシ及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。幾つかの実施形態において、脾臓リンパ球とマウスの骨髄腫細胞を使用して融合を行う。ハイブリドーマ細胞は、適当な培地において培養することができ、当該培地は、未融合の不死化細胞の成長又は生存を阻害する1つ又は複数の物質を含むことが好ましい。例えば、親細胞にヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)が欠乏すると、ハイブリドーマの培地は通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン(「HAT培地」)を含み、前記物質はHGPRT-欠陥の細胞の成長を防止するものである。幾つかの実施形態において、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、又は、放射免疫測定(RIA)や酵素結合免疫吸着測定(ELISA)などの体外結合測定により測定される。このような技術及び測定は、当分野で知られているものである。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えば、Munson及びPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析によって測定することができる。さらに、モノクローナル抗体の治療的応用には、標的抗原に対して高い特異性と高い結合親和力を有する抗体の同定が重要である。
所望のハイブリドーマ細胞が同定されると、限界希釈工程により、前記クローンをサブクローンし、標準な方法によりそれを成長させることができる。(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59~103ページを参照)。当該目的に適用される培地は、例えば、Dulbecco改良のEagle培地及びRPMI-1640培地などを含む。
幾つかの実施形態において、例えば、タンパク質A-アガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析や親和性クロマトグラフィーのような通常の技術的手段により、サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体を単離又は精製することができる。
モノクローナル抗体はさらに、例えば、米国特許No.4,816,567に記載されたようなDNAを組換える方法で調製することができる。本明細書に記載のモノクローナル抗体をコードするDNAは、通常の方法(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用すること)により、容易に単離及び配列決定することができる。本明細書に記載のハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好適な由来とされる。本明細書に記載の抗体をコードするDNAは、さらに、通常の方法で抗体配列によって設計して合成することができる。単離又は合成されたDNAを発現担体に入れてから、それを例えば、免疫グロブリンを別に産生しないチャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞、サルCOS細胞、PER.NS0細胞、SP2/0、YB2/0や骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクションすることで、組換え宿主細胞において合成されたモノクローナル抗体を得る。
幾つかの実施形態において、ハイブリドーマ技術により、本発明の抗TIGIT抗体又はその抗原結合断片が調製されて産生されるが、TIGIT細胞外領域を含む融合タンパク質でマウスを免疫し、免疫した後に、マウスの脾臓リンパ球を取って骨髄腫細胞と融合し、TIGIT細胞外領域を含む融合タンパク質により、ハイブリドーマを選別し、陽性のハイブリドーマを限界希釈し、さらにサブクローンし、ハイブリドーマ株のTIGIT細胞外領域を含む融合タンパク質との結合能力を改めて同定することにより、抗TIGIT抗体を調製して産生する。幾つかの実施形態において、TIGIT細胞外領域を含む融合タンパク質は、TIGIT-Fcである。幾つかの実施形態において、マウスは、6~8週齢の雌Balb/cマウスである。
抗体を調製する方法は、当分野で既知であるとともに、本発明に記載されたものである。幾つかの実施形態において、本発明で開示された抗体又はその抗原結合断片の可変領域及び定常領域は、何れも完全ヒトのものである。当分野で開示された技術及び本発明に記載の技術により、完全ヒト抗体を調製することができる。例えば、特定の抗原の完全ヒト抗体は、抗原をトランスジェニック動物に投与することにより調製することができ、前記トランスジェニック動物は、抗原の攻撃に応答してこのような抗体を産生するために改良されたが、その内因性遺伝子座の使用が禁止されている。このような抗体を調製するための例示的な技術は、米国特許6,150,584、6,458,592、6,420,140が参照され、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態において、調製される抗体は、ヒトなどの治療すべき動物に、有害な免疫応答を引き起こさない。幾つかの実施形態において、本発明で開示された抗体又はその抗原結合断片又は誘導体は、当分野で認められている技術で修飾されることにより、その免疫原性を低減する。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化されてもよく、又はキメラ抗体として調製されてもよい。これらの種類の抗体は非ヒト抗体から由来し、通常、マウス類又は霊長類抗体であり、親抗体の抗原結合特性を保持又は基本的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性が低い。それは、(a)キメラ抗体を産生するために、非ヒトの可変領域全体をヒトの定常領域に移植すること、(b)重要なフレーム残基を保持し、又は保持せずに、1つ又は複数の非ヒト相補決定領域(CDR)の少なくとも一部をヒトのフレーム及び定常領域に移植すること、又は(c)非ヒトの可変領域全体を移植するが、ヒト類似の部分で表面残基を置換することによりそれらを「隠す」ことを含む様々な方法により実現可能である。
脱免疫化は、抗体の免疫原性の低減に用いることもできる。「脱免疫化」は、抗体を変更することでT細胞エピトープを修飾することを含む(例えば、国際出願開示番号:WO/9852976A1及びWO/0034317A2を参照)。例えば、開始抗体からの可変重鎖及び可変軽鎖の配列を分析し、それぞれのV領域からの、相補決定領域(CDR)及び配列における他の重要な残基に対するエピトープの位置を示すヒトT細胞エピトープ「スペクトル」を産生する。T細胞エピトープ図からの単一のT細胞エピトープを分析することにより、最終的な抗体活性を変えるリスクが低い選択可能なアミノ酸置換を同定する。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の選択可能な可変重鎖及び可変軽鎖配列を設計し、続いてこれらの配列を一連の結合ポリペプチドに組み込む。典型的には、12~24種の抗体の変異体を産生し、その結合能力及び/又は機能を検出する。そして、修飾された可変領域及びヒト定常領域を含む完全な重鎖と軽鎖の遺伝子を発現担体にクローンし、続いてプラスミドを細胞株に導入することで完全な抗体を産生する。その後、適当な生物化学及び生物学実験にて抗体を比較し、最適な変異体を同定する。
本発明で開示された抗体又は抗原結合断片の結合特異性は、免疫共沈降、放射免疫実験(RIA)や酵素結合免疫吸着実験(ELISA)などの体外実験により、検出することができる。
単鎖Fv(scFv)及び抗体の製造に使用可能な技術の実例は、米国特許4,946,778及び5,258,498、並びにHuston et al.,Methods in Enzymology 203:46~88(1991)、Shu et al.,Proc.Natl.Sci.USA 90:1995~1999(1993)、及びSkerra et al.,Science 240:1038~1040(1988)に記載されたような方法及び他の既知の方法を含む。
ヒトの体内での抗体の利用及び体外検出実験を含む幾つかの使用には、キメラ抗体、ヒト化抗体又は全ヒト抗体が好ましく使用される。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種類から由来するような分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を製造する方法は、当分野で既知のもので、Morrison,Science 229:1202(1985);Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986)、Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191~202(1989)及び米国特許5,807,715、4,816,567及び4,816,397が参照され、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
ヒト化抗体は、目標抗原に結合可能な非ヒト抗体により誘導された抗体分子であり、前記抗体は、非ヒトの1つ又は複数の相補決定領域(CDR)とヒト免疫グロブリン分子からのフレーム領域の結合を有する。通常、ヒトフレーム領域における幾つかのフレーム残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基、好ましくは、抗原の結合を改善可能な残基に置換される。これらのフレームの置換は、当分野で既知の方法で同定することができ、例えば、CDRとフレーム残基の相互作用をシミュレーションすることで、抗原結合に重要な役割を果たすフレーム残基が同定され、且つ配列を比較することで、特定の位置での異常なフレーム残基が同定される。(Queen et al.,U.S.Pat.No.5,585,089;Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)が参照され、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、CDR移植(EP 239,400、PCT publication WO91/09967、U.S.Pat.No.5,225,539、5,530,101及び5,585,089)、修復又は表面転位(EP 592,106、EP 519,596、Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)、Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)、Roguska.et al.,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))、及び鎖の転位(U.S.Pat.No.5,565,332)のような当分野で知られている種々の技術により、抗体をヒト化することができ、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトの患者の治療には、完全ヒト抗体が特に望ましい。完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列からの抗体ライブラリーを利用して行われるファージディスプレイ法を含む当分野で知られている種々の方法により、調製することができる。米国特許4,444,887及び4,716,111、及びPCT公開文書WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735及びWO91/10741を参照してもよく、それぞれの特許の内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
トランスジェニックマウスでヒト抗体を製造することもでき、前記マウスは、機能性内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子の複合体は、マウス胚性幹細胞に無作為に導入され、又は相同組換えにより導入されることができる。又は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子の他に、ヒトの可変領域、定常領域及び多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによりそれぞれ、又は同時にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより、機能を失うことができる。特に、JH領域のホモ接合体欠失は、内因性抗体の産生を防ぐことができる。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胞胚に顕微注射することにより、キメラマウスを産生する。そして、キメラマウスを育成して、ヒト抗体を発現するホモ接合体子孫を産生する。選択された抗原、例えば、所望のポリペプチド標的の全て又は一部で、通常の方法によりトランスジェニックマウスを免疫する。通常のハイブリドーマ技術により、免疫されたトランスジェニックマウスから標的抗原のモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスに持たれたヒト免疫グロブリントランスジェニックは、B細胞の分化過程において転位されてから、続いてカテゴリ変換及び体細胞の突然変異が発生される。従って、このような技術により、治療に利用可能なIgG、IgA、IgM及びIgE抗体を産生することができる。このような完全ヒト抗体を製造する技術についての概説は、Lonberg and Huszar Int.Rev.Immunol.73:65~93(1995)を参照することができる。完全ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造する当該技術についての詳細な検討及びこのような抗体を製造する工程は、PCT公開文書WO98/24893、WO96/34096、WO96/33735、及び米国特許5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318及び5,939,598が参照され、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。さらに、例えば、Abgenix(Freemont、Calif.)及びGenPharm(San Jose、Calif.)のような会社は、上記と類似した技術を利用して、選択される抗原に対する完全ヒト抗体を提供することができる。
「ガイド選択」と呼ばれる技術により、選択的エピトープを認識する完全ヒト抗体を製造することもできる。当該方法では、マウス抗体などの選択された非ヒトモノクローナル抗体により、同じエピトープの完全ヒト抗体を認識する選別をガイドする。(Jespers et al.,Bio/Technology 72:899~903(1988)及び米国特許5,565,332で、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる)。
別の幾つかの実施形態において、通常の方法(例えば、マウス抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用すること)により、所望のモノクローナル抗体をコードするDNAを容易に単離し、配列決定することができる。単離及びサブクローンしたハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好適な由来となる。単離されると、DNAは、発現担体に置かれ、そして原核又は真核宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は免疫グロブリンを別に産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクションされることができる。更に特に、単離したDNA(本明細書に記載されるように、合成であってもよい)は、抗体を調製するための定常領域及び可変領域の配列のクローンに用いることができ、例えば、Newman et al及び1995年1月25日に公表された米国特許5,658,570に記載される通りであり、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。実際に、これは、選択された細胞からRNAを抽出してcDNAに形質転換してから、Ig特異性プライマーを利用してPCR技術により増幅する必要がある。この目的に適用される適当なプローブは、米国特許5,658,570において言及されたこともある。下記でさらに詳しく記載されるように、免疫グロブリンの臨床的及び商業的な需要に応じるために、所望の抗体を発現する形質転換細胞を相対的に大量培養することができる。
さらに、通常の組換えDNA技術により、本発明の抗体又は抗原結合断片の1つ又は複数のCDRをフレーム領域に挿入し、例えば、ヒトフレーム領域に挿入することで、ヒト化非完全ヒト抗体を構築することができる。フレーム領域は、自然存在又は共通のフレーム領域であってもよいが、ヒトフレーム領域が好ましい(Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457~479(1998)が参照され、その中に一連のヒトフレーム領域が挙げられている)。好ましくは、フレーム領域とCDRを組み合わせて産生されたポリヌクレオチドにより、所望のポリペプチド(例えば、LIGHT)の少なくとも1つのエピトープと特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、フレーム領域において1つ又は複数のアミノ酸置換を行うが、抗体とその抗原との結合を改善可能なアミノ酸置換が好ましい。また、この方法で鎖間ジスルフィド結合の形成に関与する1つ又は複数の可変領域におけるシステイン残基の置換又は欠損を行うことにより、1つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合が欠乏した抗体分子を産生することができる。当分野の技術的範囲でポリヌクレオチドに対して行われた他の変更も、本発明に含まれる。
さらに、キメラ抗体技術(Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:851~855(1984)、Neuberger et al.,Nature 372:604~608(1984)、Takeda et al.,Nature 314:452~454(1985))は、マウス抗分子由来で適当な抗原特異性を有する遺伝子、及び適当な生物学的活性を有する利用可能なヒト抗分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる。本発明において、キメラ抗体は、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を含むキメラ抗体のような、その異なる部分が異なる動物種から由来する分子である。
さらに、Newman,Biotechnology 10:1455~1460(1992)には、組換え抗体を製造する他の効率的方法が開示されており、特に、当該技術は、サル可変領域及びヒト定常領域配列を含む霊長類抗体を産生することができ、当該参照文献の内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。さらに、当該技術は、共に譲渡される米国特許5,658,570、5,693,780及び5,756,096にも言及されており、それぞれの特許の内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
抗体は、通常の組換えDNA技術により調製することができる。当業者に知られている技術により、抗体を製造する担体及び細胞株などを選択・構築・培養することができる。これらの技術は何れも、Recombinant DNA Technology for Production of Protein Therapeutics in Cultured Mammalian Cells,D.L.Hacker,F.M.Wurm,in Reference Module in Life Sciences,2017などの種々のラボマニュアル及び主な出版物に記載されており、追加内容を含むその内容の全ては参照により全文に組み込まれる。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の抗体をコードするDNAは、通常の方法に従って抗体アミノ酸配列によって設計合成し、発現担体に置いてから、宿主細胞にトランスフェクションし、培地にトランスフェクションされた宿主細胞を培養してモノクローナル抗体を産生することができる。幾つかの実施形態において、発現抗体担体は、少なくとも1つのプロモーター要素、抗体コード配列、転写終止シグナル及びpolyA尾部を含む。他の要素はエンハンサー、Kozak配列及び挿入配列の両側のRNAスプライシングに用いられるドナーと受容体部位を含む。SV40の初期及び後期プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復配列、例えば、RSV、HTLV1、HIVI、及びサイトメガロウイルスの早期プロモーターにより効果的な転写を取得することができるが、アクチンプロモーターのような他の細胞のプロモーターを適用してもよい。適当な発現担体は、pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、又はPlncx、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)、pcDNA3.1/Hygro(+/-)、PSVL、PMSG、pRSVcat、pSV2dhfr、pBC12MI及びpCS2などを含んでもよい。常用の哺乳動物宿主細胞は、293細胞、Cos1細胞、Cos7細胞、CV1細胞、マウスL細胞及びCHO細胞などを含む。
幾つかの実施形態において、挿入遺伝子断片は、選別標識を含む必要があり、よく見られる選別標識には、トランスフェクションに成功した細胞が選別単離されるように、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン合成酵素、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性などの選別遺伝子が含まれる。構築されたプラスミドを上記遺伝子無しの宿主細胞にトランスフェクションし、選択的に培地で培養し、トランスフェクションに成功した細胞が大量増殖し、所望の目的タンパク質が産生される。
さらに、当業者に知られている標準的な技術により、本発明に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列に、突然変異が導入されてもよく、アミノ酸置換になる部位特異的突然変異及びPCR仲介の突然変異を含むが、これらに限定されない。好ましくは、変異体(誘導体を含む)は、参照される重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、HCDR3及び軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2又はLCDR3に対して50個よりも少ないアミノ酸の置換、40個よりも少ないアミノ酸の置換、30個よりも少ないアミノ酸の置換、25個よりも少ないアミノ酸の置換、20個よりも少ないアミノ酸の置換、15個よりも少ないアミノ酸の置換、10個よりも少ないアミノ酸の置換、5個よりも少ないアミノ酸の置換、4個よりも少ないアミノ酸の置換、3個よりも少ないアミノ酸の置換、又は2個よりも少ないアミノ酸の置換をコードしたである。又は、全て又は一部に沿って配列をコードする時に無作為に突然変異を導入し、例えば、飽和突然変異によってもよく、得られた突然変異体の生物活性を選別することにより、活性を保持した突然変異体を同定してもよい。
がんの治療
本発明において、本発明の抗体、抗原結合断片又は誘導体は、幾つかの治療と診断方法に用いることができる。
本発明において、本発明の抗体、抗原結合断片又は誘導体は、幾つかの治療と診断方法に用いることができる。
本発明は、抗体に基づく療法をさらに説明するが、本発明に記載の抗体を動物、哺乳動物やヒトなどの患者に投与することにより、本明細書に記載の1つ又は複数の障害又は病気を治療する。本発明の治療化合物は、本発明に記載の抗体(本発明に記載の抗原結合断片と誘導体を含む)及び本発明に記載の抗体(本発明に記載の抗原結合断片と誘導体を含む)をコードする核酸又はポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
本発明に記載の抗体は、がんの治療又は阻害に用いられてもよい。TIGITは、腫瘍細胞に過剰発現することができる。腫瘍由来のTIGITは、免疫細胞におけるPD-1に結合することにより、抗腫瘍T細胞の免疫を制限することができる。マウス腫瘍モデルにおいてTIGITを標的とする小分子阻害剤又はモノクローナル抗体を使用した結果から、TIGITを標的とする療法は、腫瘍の増殖を効果的に制御する重要な取替方法及び現実的な方法であることが明らかになる。実施例で確認されたように、抗TIGIT抗体は、適応免疫応答機構を活性化することにより、がん患者の生存率を向上させることができる。
従って、幾つかの実施形態において、この必要がある患者のがんを治療するための方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、患者へ有効用量の本発明に記載の抗体を投与する必要がある。幾つかの実施形態において、患者の体内での少なくとも1種のがん細胞(例えば、マトリクス細胞)は、TIGITを発現、過剰発現又は誘導発現する。例えば、TIGITの誘導発現は、腫瘍ワクチンの投与又は放射線療法により達成することができる。
TIGITタンパク質を発現した腫瘍は、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎がん、乳がん、尿道がん、結腸がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、メルケル(Merkel)細胞がん、胃腸管がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、及び小細胞肺がんを含む。従って、本発明で開示された抗体は、何れか1つ又は複数のこのようながんの治療に用いることができる。
本発明において、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法などの細胞療法をさらに提供する。適当な細胞を使用して本発明に記載の抗TIGIT抗体と接触する(又は選択的に、工学的に改変することで本発明に記載の抗TIGIT抗体を発現する)ことができる。このような接触又は工学的改変により、細胞は、治療を必要とするがん患者の体内に導入されることができる。がん患者は、本明細書に記載の任意種類のがんを有する可能性がある。細胞(例えば、T細胞)は、下記の種類、例えば、腫瘍浸潤Tリンパ球、CD4+T細胞、CD8+T細胞及びその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、細胞は、がん患者自身の体内から単離される。幾つかの実施形態において、細胞は、ドナー又は細胞バンクによって提供される。細胞はがん患者から単離されると、免疫反応の有害反応を最低に低下させることができる。
本発明に記載の抗体又は抗原結合断片又はその誘導体により、細胞生存率の増加に関連する他の疾患又は病気を治療、予防、診断及び/又は予測することができ、悪性腫瘍及び/又は関連疾患障害の進展又は転移が含まれるが、これらに限定されず、前記疾患障害は、白血病{急性白血病[例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病(骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病を含む)]及び慢性白血病[例えば、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病及び慢性リンパ性白血病]を含む}、真性赤血球増加症、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び固形腫瘍を含み、前記固形腫瘍は例えば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵臓がん、乳がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胚性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫や網膜芽細胞腫のような肉腫及びがんを含むが、これらに限定されない。
併用療法
別の幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤又は抗生物質剤又は抗真菌剤と併用投与される。当分野で知られている何れの前記薬剤も、本発明の組成物に投与することができる。
別の幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤又は抗生物質剤又は抗真菌剤と併用投与される。当分野で知られている何れの前記薬剤も、本発明の組成物に投与することができる。
別の幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与可能な化学療法剤は、抗生物質誘導体(例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン及びアクチノマイシンD)、抗エストロゲン剤(例えば、タモキシフェン)、代謝拮抗物質(例えば、フルオロウラシル、5-FU、メトトレキサート、フルオロウリジン、インターフェロンα-2b、グルタミン酸、ミトラマイシン、メルカプトプリン及び6-チオグアニン)、細胞傷害剤(例えば、カルムスチン、BCNU、ロムスチン、CCNU、シタラビン、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン及び硫酸ビンクリスチン)、ホルモン(例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン及びテストラクトン)、ナイトロジェンマスタード誘導体(例えば、メルファラン、クロラムブシル、ジクロロメチルジエチルアミン(メクロレタミン)及びチオテパ)、ステロイドとその組み合わせ(例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム)、及び他の化合物(例えば、ダカルバジン、アスパラギン酵素、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン及びエトポシド)を含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本発明の組成物はサイトカインと併用投与される。本発明の組成物と共に投与可能なサイトカインは、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、CD40、CD40L及びTNF-αを含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、放射性療法などの他の治療又は予防計画と併用投与される。
本発明は、1つ又は複数の本発明の抗TIGIT抗体及び第2抗がん剤(化学療法剤)を使用することを含む併用療法をさらに提供する。化学療法剤の実例は、免疫治療剤を含み、患者の治療に適用される治療的な抗体を含むが、これらに限定されない。治療的な抗体の幾つかの実例は、シムツズマブ(simtuzumab)、アバゴボマブ(abagovomab)、アデカツムマブ(adecatumumab)、アフツズマブ(afutuzumab)、アレムツズマブ(alemtuzumab)、アルツモマブ(altumomab)、アマツキシマブ(amatuximab)、アナツモマブ(anatumomab)、アルシツモマブ(arcitumomab)、バビツキシマブ(bavituximab)、ベクツモマブ(bectumomab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、ビバツズマブ(bivatuzumab)、ブリナツモマブ(blinatumomab)、ブレンツキシマブ(brentuximab)、カンツズマブ(cantuzumab)、カツマキソマブ(catumaxomab)、セツキシマブ(cetuximab)、シタツズマブ(citatuzumab)、シクスツムマブ(cixutumumab)、クリバツズマブ(clivatuzumab)、コナツムマブ(conatumumab)、ダラツムマブ(daratumumab)、ドロジツマブ(drozitumab)、デュリゴツマブ(duligotumab)、デュシジツマブ(dusigitumab)、デツモマブ(detumomab)、ダセツズマブ(dacetuzumab)、ダロツズマブ(dalotuzumab)、エクロメキシマブ(ecromeximab)、エロツズマブ(elotuzumab)、エンシツキシマブ(ensituximab)、エルツマキソマブ(ertumaxomab)、エタラシズマブ(etaracizumab)、ファルレツズマブ(farletuzumab)、フィクラツズマブ(ficlatuzumab)、フィジツムマブ(figitumumab)、フランボツマブ(flanvotumab)、フツキシマブ(futuximab)、ガニツマブ(ganitumab)、ジェムツズマブ(gemtuzumab)、ジレンツキシマブ(girentuximab)、グレムバツムマブ(glembatumumab)、イブリツモマブ(ibritumomab)、イゴボマブ(igovomab)、イムガツズマブ(imgatuzumab)、インダツキシマブ(indatuximab)、イノツズマブ(inotuzumab)、インテツムマブ(intetumumab)、イピリムマブ(ipilimumab)、イラツムマブ(iratumumab)、ラベツズマブ(labetuzumab)、レクサツムマブ(lexatumumab)、リンツズマブ(lintuzumab)、ロルボツズマブ(lorvotuzumab)、ルカツムマブ(lucatumumab)、マパツムマブ(mapatumumab)、マツズマブ(matuzumab)、ミラツズマブ(milatuzumab)、ミンレツモマブ(minretumomab)、ミツモマブ(mitumomab)、モキセツモマブ(moxetumomab)、ナルナツマブ(narnatumab)、ナプツモマブ(naptumomab)、ネシツムマブ(necitumumab)、ニモツズマブ(nimotuzumab)、ノフェツモマブ(nofetumomab)、オカラツズマブ(ocaratuzumab)、オファツムマブ(ofatumumab)、オララツマブ(olaratumab)、オナルツズマブ(onartuzumab)、オポルツズマブ(oportuzumab)、オレゴボマブ(oregovomab)、パニツムマブ(panitumumab)、パルサツズマブ(parsatuzumab)、パトリツマブ(patritumab)、ぺムツモマブ(pemtumomab)、ぺルツズマブ(pertuzumab)、ピンツモマブ(pintumomab)、プリツムマブ(pritumumab)、ラコツモマブ(racotumomab)、ラドレツマブ(radretumab)、リロツムマブ(rilotumumab)、リツキシマブ(rituximab)、ロバツムマブ(robatumumab)、サツモマブ(satumomab)、シブロツズマブ(sibrotuzumab)、シルツキシマブ(siltuximab)、ソリトマブ(solitomab)、タカツズマブ(tacatuzumab)、タプリツモマブ(taplitumomab)、テナツモマブ(tenatumomab)、テプロツムマブ(teprotumumab)、ティガツズマブ(tigatuzumab)、トシツモマブ(tositumomab)、トラスツズマブ(trastuzumab)、ツコツズマブ(tucotuzumab)、ユブリツキシマブ(ublituximab)、ベルツズマブ(veltuzumab)、ボルセツズマブ(vorsetuzumab)、ボツムマブ(votumumab)、ザルツムマブ(zalutumumab)、CC49及び3F8を含む。リツキシマブは、辺縁帯リンパ腫、WM、CLL及び小リンパ球性リンパ腫を含む不活性B細胞がんの治療に用いることができる。リツキシマブと化学療法薬の組み合わせは、非常に効果的である。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の化合物及び組成物は、1つ又は複数の他の治療剤と共に使用し、又は組み合わせることができる。前記1つ又は複数の治療剤は、Abl阻害剤、活性化したCDCキナーゼ(ACK)、アデノシンA2B受容体(A2B)、アポトーシスシグナル調節キナーゼ(ASK)、Auroaキナーゼ、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)、BRD4などのBET-ブロモ構造ドメイン(BRD)、c-Kit、c-Met、CDK活性化キナーゼ(CAK)、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMK)、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)、カゼインキナーゼ(CK)、ジスコイジンドメイン受容体(DDR)、上皮成長因子受容体(EGFR)、焦点接着キナーゼ(FAK)、Flt-3、FYN、グリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)、HCK、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)、IKKβεなどのIKK、IDH1などのイソクエン酸脱水素酵素(IDH)、Janusキナーゼ(JAK)、KDR、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)、リシルオキシダーゼタンパク質、リシルオキシダーゼ様タンパク質(LOXL)、LYN、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、MEK、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、NEK9、NPM-ALK、p38キナーゼ、血小板由来成長因子(PDGF)、ホスホリラーゼキナーゼ(PK)、polo様キナーゼ(PLK)、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)、プロテインキナーゼA、B及び/又はCなどのプロテインキナーゼ(PK)、PYK、脾チロシンキナーゼ(SYK)、セリン/トレオニンキナーゼTPL2、セリン/トレオニンキナーゼSTK、シグナル伝達及び転写(STAT)、SRC、TBK1などのセリン/トレオニンプロテインキナーゼ(TBK)、TIE、チロシンキナーゼ(TK)、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)又は上記の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本発明の抗TIGIT抗体は、免疫チェックポイント阻害剤と共に使用することができる。免疫チェックポイントは、免疫システムにおける分子の一種であり、アップレギュレーションシグナル(共刺激分子)であっても、ダウンレギュレーションシグナル(共阻害分子)であってもよい。多くのがんは、共阻害分子のアゴニスト又は共刺激分子の拮抗剤によりT細胞シグナルを阻害することで、免疫システムの攻撃から自分を保護する。免疫チェックポイントアゴニスト又は拮抗剤は、このような保護機構の阻止に寄与することができる。免疫チェックポイントアゴニスト又は拮抗剤は、PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG-3(CD223とも呼ばれる)、CD28、CD122、4-1BB(CD137とも呼ばれる)、TIM3、OX-40/OX40L、CD40/CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM又はBTLA(CD272とも呼ばれる)というチェックポイント分子のうちの何れか1つ又は複数を標的にすることができる。幾つかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体である。幾つかの実施形態において、抗PD-1抗体は、Pembrolizumab、Nivolumab、Toripalimab、Sintilimab、Tislelizumab、Camrelizumab及びGenolimzumabのうちの1つ又は複数である。幾つかの実施形態において、抗PD-1抗体はPembrolizumabである。幾つかの実施形態において、抗PD-L1抗体は、Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab、Envafolimab及びCosibelimabのうちの1つ又は複数である。幾つかの実施形態において、抗PD-L1抗体はAtezolizumabである。
任意の上記組み合わせ治療に対して、抗TIGIT抗体は、別の抗がん剤と同時又は別々に投与することができる。単独投与の場合に、別の抗がん剤の投与前又は投与後に、抗TIGIT抗体を投与することができる。
感染症の治療
実験の実施例で確認されたように、本発明の抗体は、免疫応答を活性化することができるので、感染症の治療に用いられる。
実験の実施例で確認されたように、本発明の抗体は、免疫応答を活性化することができるので、感染症の治療に用いられる。
感染は、病原因子の生体組織への侵入、それらの繁殖、及び前記生体とそれらによる毒素への宿主組織の反応によるものである。感染は、例えば、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、寄生性回虫や蟯虫などの線虫、ダニ、コナダニ、ノミやシラミなどの節足動物、癬などの真菌、及び条虫と他の蠕虫などの他の大寄生虫のような感染源により引き起こす恐れがある。ある態様において、感染源は、グラム陰性菌のような細菌である。ある態様において、感染源は、DNAウイルス、RNAウイルスとレトロウイルスなどのウイルスである。ウイルスの非制限的な実例は、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、EBウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、HIV、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、灰白髄炎ウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルスを含む。
本発明の抗体は、微生物による感染病の治療に用いることもでき、又は微生物と免疫細胞に標的結合して微生物を殺すことにより、微生物を除去する目的が達成される。ある態様において、微生物は、RNA及びDNAウイルスを含むウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、原生動物又は真菌である。表4は、感染性疾患及び関連する微生物の非制限的な実例を提供する。
治療方法
任意の特定の患者の具体的な用量及び治療計画は、使用される特定の抗体及びその抗原結合断片又は誘導体、患者の年齢と体重、一般的健康状態、性別と飲食、及び投与時間、***頻度、薬物の組み合わせ、並びに治療される特定の疾患の重症度を含む様々な要因によって決められる。当業者の範囲に含まれる医療関係者により、これらの要因を判断する。前記用量は、さらに、治療すべき個体患者、投与経路、製剤種類、使用される化合物の特性、疾患の重症度及び所望の効果によって決められる。使用される用量は、当分野でよく知られている薬理学及び薬物動態学的原理によって決定することができる。
任意の特定の患者の具体的な用量及び治療計画は、使用される特定の抗体及びその抗原結合断片又は誘導体、患者の年齢と体重、一般的健康状態、性別と飲食、及び投与時間、***頻度、薬物の組み合わせ、並びに治療される特定の疾患の重症度を含む様々な要因によって決められる。当業者の範囲に含まれる医療関係者により、これらの要因を判断する。前記用量は、さらに、治療すべき個体患者、投与経路、製剤種類、使用される化合物の特性、疾患の重症度及び所望の効果によって決められる。使用される用量は、当分野でよく知られている薬理学及び薬物動態学的原理によって決定することができる。
抗体及びその抗原結合断片の投与方法は、真皮内、筋肉、腹腔、静脈、皮下、鼻腔、脊髄硬膜外注射及び経口投与を含むが、これらに限定されない。抗体又は組成物は、輸注や押し注入などの任意の便利な経路により投与され、上皮又は皮膚の粘膜(例えば、口腔粘膜、直腸と腸粘膜など)を介して吸収されてもよく、他の生物活性剤と共に投与されてもよい。従って、本発明の抗体を含む薬物組成物は、経口投与、直腸投与、腸胃外投与、大脳内投与、経膣投与、腹腔内投与、外用(例えば、粉末、軟膏、ドロップ剤又は経皮パッチ剤による)、口腔投与、又は経口や鼻内噴霧投与が可能である。
本発明に使用される用語「腸胃外」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下と関節内注射及び輸注を含む投与方式である。
投与方式は、全身投与又は局所投与であってもよい。さらに、脳室内注射及び髄腔内注射を含む任意の適当な経路により、本発明の抗体を中枢神経系に導入する必要があり得るが、脳室内注射は、脳室内カテーテルを介して液体カプセルのようなもの(Ommaya液体カプセルであってもよい)に接続されることで、注射を補助することができる。肺部投与によってもよく、例えば、吸入器又は噴霧器を使用すること、及び霧化された製剤を使用することによってもよい。
本発明の抗体ポリペプチド又は組成物を治療すべき領域に局所投与する必要があり得るが、手術期間の局所輸注、例えば、手術後の創傷被覆材と併用する局所応用により、注射により、カテーテルにより、坐剤で又はインプラント体で実現されることができるが、これらの方式に限定されず、前記インプラント体は、多孔質、無孔又はゲル状の材料であり、膜(例えば、シリコンゴム膜)又は繊維を含む。好ましくは、本発明のタンパク質(抗体を含む)を投与する場合に、タンパク質を吸収しない材料を使用するように注意しなければならない。
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、タンパク質をコードする核酸又はポリヌクレオチドを含み、それを適当な核酸発現担体の一部として構築することで、前記核酸を体内投与して、それによりコードされるタンパク質の発現を促進し、そして、下記の方式、例えば、レトロウイルス担体を使用すること(米国特許4,980,286を参照)、又は直接注射、又は微粒子銃法を使用すること(例えば、遺伝子銃;Biolistic、Dupont)、又はリポソーム若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション試薬被覆、又は既知の細胞核に入ったホメオボックスペプチドとの接続投与(例えば、Joliot et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868を参照)などにより、上記部分担体を、細胞内部分になるように投与することができる。選択的に、核酸は、相同組換えにより細胞内に導入されて宿主細胞DNAに整合されて発現に用いることができる。
標準的な臨床技術により本発明の抗体の用量を決定することができ、当該用量は、炎症、免疫若しくは悪性疾患、障害又は病気を効果的に治療、阻害及び予防する。さらに、任意選択的に体外実験により、最適用量範囲の決定を補助してもよい。製剤に使用される正確な用量は、投与経路及び疾患、障害又は病気の重症度によっても決められ、かつ、医師の判断及び各患者の具合によって决定すべきである。有効用量は、体外又は動物モデル検査システムから得られた用量反応曲線によって推測することができる。
幾つかの実施形態において、患者へ投与する本発明の抗体の用量は通常、0.1mg/kg~100mg/kg、0.1mg/kg~20mg/kg、又は1mg/kg~10mg/kgである。通常、外因性ポリペプチドに対する免疫応答のために、ヒト抗体は、ヒト体内での半減期が他の種の抗体よりも長い。従って、低い用量のヒト抗体及び少ない投与頻度は通常、実現可能である。さらに、例えば、リポソーム化などの修飾で抗体の摂取及び組織透過能力(例えば、脳内に入る)を向上させることにより、本発明の抗体の投与用量及び頻度を低減することができる。
通常、感染性又は悪性疾患、障害又は病気を治療するために体外検査を行う方法には、本発明に記載の抗体、抗原結合断片又は誘導体を投与し、そして許容可能な動物モデルにおいて所望の治療的又は予防的活性を体内検査し、最後にヒトに投与することが含まれる。好適な動物モデル(トランスジェニック動物を含む)は、当業者に知られているものである。例えば、本発明に記載される抗体又は抗原結合断片の治療的使用を確認するための体外測定は、抗体又は抗原結合断片による細胞株又は患者組織試料への影響を含む。抗体又は抗原結合断片による細胞株及び/又は組織試料への作用は、当業者に知られている技術、例えば、本発明の他の部分で開示される技術により検出することができる。本発明の内容により、特異的抗体又は抗原結合断片を投与するか否かを決定することに利用可能な体外測定実験は、体外細胞培養実験を含み、そのうち、患者組織試料は培養物において培養され、かつ化合物に暴露され、又は他の方式で投与され、このような化合物による組織試料への影響を観察する。
種々の輸送システムは既知のもので、本発明の抗体又は本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドの投与、例えばリポソーム体、微粒子、マイクロカプセルに封入され、前記化合物を発現可能な組換え細胞の、受容体仲介のエンドサイトーシス作用(例えば、Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432を参照)、レトロウイルス又は他の担体の一部としての核酸の構築などに用いることができる。
診断方法
幾つかの腫瘍試料にはTIGITの過剰発現が観察され、かつ、TIGITを過剰発現した細胞を有する患者は、本発明の抗TIGIT抗体による治療に対して応答があり得る。従って、本発明の抗体は、診断及び予後に用いることもできる。
幾つかの腫瘍試料にはTIGITの過剰発現が観察され、かつ、TIGITを過剰発現した細胞を有する患者は、本発明の抗TIGIT抗体による治療に対して応答があり得る。従って、本発明の抗体は、診断及び予後に用いることもできる。
好ましくは、細胞を含む試料は患者の体内から得ることができ、当該患者はがん患者又は診断すべき患者であってもよい。細胞は、腫瘍組織又は腫瘍ブロック、血液サンプル、尿液サンプル又は患者からの任意のサンプルの細胞である。選択的に試料に対して前処理を行った後、抗体と試料にあり得るTIGITタンパク質との相互作用が許容される条件で、試料を本発明の抗体と共にインキュベーションすることができる。ELISAのような方法により、抗TIGIT抗体を利用して試料におけるTIGITタンパク質の存在を検出することができる。
試料におけるTIGITタンパク質の存在(任意の含有量又は濃度)は、がんの診断に用いることができ、それは、患者が抗体治療に適用される指示としてもよく、又は患者ががんの治療に反応した(又は反応していない)指示としてもよい。予後方法は、治療の進行を指示するために、がんの治療を始めた時に特定の段階で1回、2回以上検出することができる。
組成物
本発明は、薬物組成物をさらに提供する。このような組成物は、有効用量の抗体及び許容可能な担体を含む。幾つかの実施形態において、組成物は、第2抗がん剤(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)をさらに含む。
本発明は、薬物組成物をさらに提供する。このような組成物は、有効用量の抗体及び許容可能な担体を含む。幾つかの実施形態において、組成物は、第2抗がん剤(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)をさらに含む。
具体的な一実施形態において、用語「薬学的に許容可能な」は、薬局方に挙げられた動物用、特にヒト用の資材を指す。さらに、「薬学的に許容可能な担体」は、通常、任意種類の無毒な固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材料や製剤添加物である。
用語「担体」とは、治療のために投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又は担体である。このような薬物担体は、滅菌液体であってもよく、例えば、水、及び石油、動植物又は合成由来の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油などを含む油である。薬物組成物が静脈内投与される場合に、水は、好ましい担体である。生理食塩水溶液とグルコース水溶液とグリセリン溶液は、液体担体として用いられてもよく、特に注射用溶液に用いられる。好適な薬用賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどを含む。必要があれば、組成物は湿潤剤若しくは乳化剤、又は酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩のようなpH緩衝剤をさらに少量に含んでもよい。ベンジルアルコールやp-ヒドロキシ安息香酸メチルなどの抗菌剤、アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、及び塩化ナトリウムやデキストロースなどの張力を調節する試薬も予測可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤などの形式を採用してもよい。当該組成物は、従来の接着剤及びトリグリセリドなどの担体により坐剤として調製されてもよい。経口製剤は、薬物レベルのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含んでもよい。好適な薬物担体の実例は、E.W.MartinのRemington’s Pharmaceutical Sciencesにおいて記載されており、ここで参照により本発明に組み込まれる。このような組成物は、臨床的有効用量の抗体を含み、好ましくは精製された形式で、適当な数量の担体と合わせることにより、患者に適する投与形式を提供する。当該製剤は、投与モードに適用すべきである。親製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又は、ガラスやプラスチックで作製される多用量のバイアルにパッケージされてもよい。
幾つかの実施形態において、通常の工程によって、組成物を、ヒトへの静脈内注射に適する薬物組成物に調製する。代表的に、静脈内投与用の組成物は、滅菌などの透水性緩衝液における溶液である。必要な場合に、組成物は、可溶化剤と、リドカインのような局所麻酔薬をさらに含んでもよく、これにより、注射部位の痛みが緩和される。一般的に、有効成分は、単位用量の形式で単独で供給され、又は混合して供給され、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末又は無水濃縮物の形式で活性剤量を指示可能な密封容器(例えば、アンプル又は小袋)に入れられる。輸注で組成物を投与する場合に、滅菌医療用水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルで組成物を分割包装してもよい。注射で組成物を投与する場合に、投与する前に有効成分が混合できるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを使用してもよい。
本発明の化合物は、中性又は塩の形式に調製されてもよい。薬学的に許容可能な塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるアニオンと形成される塩と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるカチオンと形成される塩と、を含む。
下記の実施例において、明らかに説明しないと、使用される試薬及び機器は何れも当分野で通常の試薬及び機器であり、商業的に取得することができ、使用される方法は何れも当分野で通常の技術であり、当業者は実施例により記載された内容に基づき、間違いなく前記実施例を実施して対応する結果を得ることができる。
一部の細胞の構築:
参照文献:Yu,X.,et al.(2009).「The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells.」Nature immunology 10(1):48~57.及びNeumann,F.,et al.(1995).「Human ribosomal protein L7 inhibits cell-free translation in reticulocyte lysates and affects the expression of nuclear proteins upon stable transfection into Jurkat T-lymphoma cells.」Nucleic acids research 23(2):195~202.の技術により、ヒトTIGITを過剰発現するJurkat細胞、sAPC細胞及びCTI-Jurkat細胞が構築される。
参照文献:Yu,X.,et al.(2009).「The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells.」Nature immunology 10(1):48~57.及びNeumann,F.,et al.(1995).「Human ribosomal protein L7 inhibits cell-free translation in reticulocyte lysates and affects the expression of nuclear proteins upon stable transfection into Jurkat T-lymphoma cells.」Nucleic acids research 23(2):195~202.の技術により、ヒトTIGITを過剰発現するJurkat細胞、sAPC細胞及びCTI-Jurkat細胞が構築される。
sAPC細胞の構築:マウス抗ヒトCD3単鎖抗体をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO.51)、リンカー(SEQ ID NO.52)、マウス抗ヒトCD3単鎖抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO.53)及びPVRをコードするヌクレオチド配列(SEQ ID NO.54)をCHO-K1細胞(ATCC、CCL-61)にトランスフェクションし、細胞膜においてヒトPVR及びマウス抗ヒトCD3単鎖抗体を安定して発現する細胞株sAPCを得る。
CTI-Jurkat細胞の構築:ヒト全長TIGIT遺伝子(SEQ ID NO.55)、ヒト全長CD226遺伝子(SEQ ID NO.56)、IL-2応答要素(SEQ ID NO.57)、ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドpNFκB-TA-luc(碧雲天、D2207)をJurkat細胞株(ATCC、Clone E6-1、TIB-152TM)にトランスフェクションし、ヒトTIGIT及びヒトCD226分子を安定して発現可能な細胞株CTI-Jurkatを得る。
ヒトTIGITを過剰発現するJurkat細胞の構築:ヒト全長TIGIT遺伝子(SEQ ID NO.55)をJurkat細胞株(ATCC、Clone E6-1、TIB-152TM)にトランスフェクションし、ヒトTIGITを安定して発現可能な細胞株Jurkat-hTIGIT 2E6を得る。
実施例
実施例1 PVR-Fc及びTIGIT-Fc融合タンパク質の発現と精製
PVR細胞外領域アミノ酸残基配列(SEQ ID NO:1)は、ヒトコドン選択的特徴に従って配列を最適化し、最適化した後、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:2を得た。酵素切断部位を加え、リンカー(linker、SEQ ID NO:6及び7)を介して、ヒトIgG1定常領域配列(SEQ ID NO:28、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO:46の下線部に示される)と融合し、模式図(図1)に示すように、融合された配列は、pCDNA3.1+担体(Invitrogen、V790-20)に挿入された後、293F細胞が一過性トランスフェクションされた。培養済みの細胞上清は、ProteinA親和クロマトグラフィーにより精製され、精製されて得られた融合タンパク質はPVR-Fcと名付けられた。
実施例1 PVR-Fc及びTIGIT-Fc融合タンパク質の発現と精製
PVR細胞外領域アミノ酸残基配列(SEQ ID NO:1)は、ヒトコドン選択的特徴に従って配列を最適化し、最適化した後、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:2を得た。酵素切断部位を加え、リンカー(linker、SEQ ID NO:6及び7)を介して、ヒトIgG1定常領域配列(SEQ ID NO:28、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO:46の下線部に示される)と融合し、模式図(図1)に示すように、融合された配列は、pCDNA3.1+担体(Invitrogen、V790-20)に挿入された後、293F細胞が一過性トランスフェクションされた。培養済みの細胞上清は、ProteinA親和クロマトグラフィーにより精製され、精製されて得られた融合タンパク質はPVR-Fcと名付けられた。
TIGIT細胞外領域アミノ酸残基配列(SEQ ID NO:3)は、ヒトコドン選択的特徴に従って配列を最適化し、最適化した後、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:48を得た。酵素切断部位を加え、リンカー(linker、SEQ ID NO:6及び7)を介して、ヒトIgG1定常領域配列(SEQ ID NO:28、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO:46の下線部に示される)と融合し、模式図(図2)に示すように、融合された配列は、pCDNA3.1+担体に挿入された後、293F細胞が一過性トランスフェクションされた。培養済みの細胞上清は、ProteinA親和クロマトグラフィーにより精製され、精製されて得られた融合タンパク質はTIGIT-Fcと名付けられた。
実施例2 マウス抗ヒトTIGIT抗体の産生
ヒトTIGIT細胞外領域とヒトIgG-Fcを融合したタンパク質である実施例1に記載されたTIGIT-Fcで6~8週齢の雌性Balb/cマウス(広東省医学実験動物センター)を免疫し、初回免疫してから2~3週間後に再び免疫し、そして約3週間後に追加免疫を行った後、脾臓を取り除いて脾臓リンパ球を調製し、脾臓リンパ球と骨髄腫細胞(Sp2/0細胞、中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞バンク、製品番号TCM18)を融合した。TIGIT-Fcと効果的に結合するか否かによってハイブリドーマを選別し、陽性のハイブリドーマを限界希釈によりさらにサブクローンしてから、改めてTIGIT-Fcとの結合能力を同定し、かつTIGIT-FcのPVR-Fcとの結合能力を遮断し、最終的に6株のモノクローナルハイブリドーマを得たが、そのうちの1株は各方面の特徴の表現が良く、この株のモノクローナルハイブリドーマは10D8である。
ヒトTIGIT細胞外領域とヒトIgG-Fcを融合したタンパク質である実施例1に記載されたTIGIT-Fcで6~8週齢の雌性Balb/cマウス(広東省医学実験動物センター)を免疫し、初回免疫してから2~3週間後に再び免疫し、そして約3週間後に追加免疫を行った後、脾臓を取り除いて脾臓リンパ球を調製し、脾臓リンパ球と骨髄腫細胞(Sp2/0細胞、中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞バンク、製品番号TCM18)を融合した。TIGIT-Fcと効果的に結合するか否かによってハイブリドーマを選別し、陽性のハイブリドーマを限界希釈によりさらにサブクローンしてから、改めてTIGIT-Fcとの結合能力を同定し、かつTIGIT-FcのPVR-Fcとの結合能力を遮断し、最終的に6株のモノクローナルハイブリドーマを得たが、そのうちの1株は各方面の特徴の表現が良く、この株のモノクローナルハイブリドーマは10D8である。
文献に記載された方法(Bradbury,A.(2010).Cloning Hybridoma cDNA by RACE.Antibody Engineering.R.Kontermann and S.Dubel.Berlin,Heidelberg,Springer Berlin Heidelberg:15-20)により、特異的プライマーを合成し、ハイブリドーマ細胞抗体目的遺伝子をクローンした。ハイブリドーマの配列決定プロセスは、下記の通りである。1)ハイブリドーマ細胞を蘇生させ、T25細胞培養フラスコに入れ、培地をRPMI1640(10%のFBS)とし、そして2代継代した。2)500万のハイブリドーマ細胞を取り、EasyPure RNA kit(北京全式金生物技術有限公司、製品番号:ER101)でRNAを抽出した。3)抽出されたRNAをテンプレートとし、逆転写試薬キット(北京全式金生物技術有限公司、製品番号:AT321)でcDNAを合成した。4)その後、cDNAをテンプレートとして、合成された特異的プライマーで抗体配列の目的バンドを増幅した。増幅中に突然変異が発生されないように、FastPfu(北京全式金生物技術有限公司、製品番号:AP221)を使用した。5)増幅された重鎖及び軽鎖の目的断片を平滑末端クローン担体(北京全式金生物技術有限公司、製品番号:CB111)にそれぞれクローンしてから、それぞれ平板に塗布した。6)クローンが成長した後、5つの重鎖クローン及び5つの軽鎖クローンをそれぞれ選択し、生工生物工程(上海)株式会社へ配列決定するように送った。7)配列決定結果をNCBI blast tool、NCBI IGBlast Toolなどの分析プログラムにより分析し、抗体の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を見つけた。8)マウス抗ヒトTIGIT抗体の可変領域配列に対してマウスコドン選択に基づいてコドンの最適化を行い、配列を合成した。合成された可変領域配列及びマウスIgG2a重鎖定常領域フレーム(SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:49)及びマウスkappa軽鎖定常領域(SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:50)フレームを融合し、pCDNA3.1+担体にクローンした後、それぞれ重鎖プラスミド及び軽鎖プラスミドを1:1の割合でCHO-S細胞(Bibco、製品番号:A29133)に一過性トランスフェクションし、得られた抗体は、組換えマウス抗ヒトTIGIT抗体となり、m10D8と名付けられた。
m10D8重鎖V領域の配列はSEQ ID NO:20に示され、軽鎖V領域配列はSEQ ID NO:24に示される。m10D8抗体HCDR1配列はSSYGMS(SEQ ID NO:21)、HCDR2配列はTINSNGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:22)、HCDR3配列はLGTGTLGFAY(SEQ ID NO: 23)であり、LCDR1配列はKASQDVKTAVS(SEQ ID NO:25)、LCDR2配列はWASTRHT(SEQ ID NO:26)、LCDR3配列はQQHYSTPWT(SEQ ID NO:27)である。
組換え発現して得られた抗体は、ELISAにより、さらにそのヒトTIGIT(図3参照)、サルTIGIT(図4参照)、マウスTIGIT(図5参照)との結合能力が検証され、陽性対照抗体は、10A7抗体(ハムスター抗マウスTIGITで、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)である。その結果から、m10D8は、ヒトTIGIT及びサルTIGITとうまく結合することができるが、マウスTIGITとは結合しないことが明らかになる。Biacore-SPR機器により、このm10D8抗体に対して親和力を測定したところ、その結合定数が1.02E+06(1/Ms)、解離定数が2.00E-04(1/s)、平衡解離定数KDが1.97E-10(M)である。
実施例3 マウス抗ヒトTIGIT抗体によるTIGITとそのリガンドPVRとの結合への遮断能力
多くの研究から、抗TIGIT抗体によるTIGITとそのリガンドPVRとの結合への遮断は、エフェクターT細胞及びNK細胞の機能を回復することができるので、選別されたマウス抗ヒトTIGITによりTIGITとそのリガンドPVRとの結合が遮断できるか否かを体外実験で研究する必要があることが明らかになる。
多くの研究から、抗TIGIT抗体によるTIGITとそのリガンドPVRとの結合への遮断は、エフェクターT細胞及びNK細胞の機能を回復することができるので、選別されたマウス抗ヒトTIGITによりTIGITとそのリガンドPVRとの結合が遮断できるか否かを体外実験で研究する必要があることが明らかになる。
-80℃の冷蔵庫から適量のPVR-Fcタンパク質を取り、Thermo scientific社のビオチン標識試薬キット(EZ-Link(登録商標) HSulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit、製品番号:21435)を使用し、取扱書における操作工程に従ってPVR-Fcに対してビオチン化標識を行い、標識されたタンパク質をPVR-Fc-bioと名付けた。実験の操作プロセスは下記の通りである。1)TIGIT-Fc(2μg/ml)を被覆し、被覆液を1×PBS(リン酸塩緩衝液)とし、4℃で一晩被覆した。2)3%のBSAで37℃の恒温箱にて2h密封した。3)PBSでPVR-Fc-bioを希釈し、PVR-Fc-bioの最終濃度が2μg/mlになり、この溶液を抗体希釈液とした。4)m10D8及び陽性対照抗体10A7抗体(ハムスター抗マウスTIGITで、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)、陰性無関係対照抗体を希釈液で希釈し、開始濃度を8μg/mlとし、半々に希釈し、1ウェルごとに100μl入れ、37℃の恒温箱にて2hインキュベートした後、PBST(0.05%のトゥイーン20を含むPBS)で8回洗った。5)酵素標識二次抗体(Jackson Immuno Research Inc.、製品番号:016-030-084、1:10000で希釈した)を加え、1ウェルごとに100μl入れ、37℃の恒温箱にて1hインキュベートしてから、PBSTで8回洗った。6)TMB(3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン)顕色液で顕色し、1ウェルごとに100μl入れた。7)2MのH2SO4を加えて顕色を止め、マイクロプレートリーダーにより450nmの波長で数値を読んだ。その結果は図6に示されており、m10D8は、同じ条件で競合阻害曲線が陽性抗体10A7の曲線の下方にあるので、陽性抗体に対して、m10D8の方は、TIGITとそのリガンドPVRとの結合への遮断能力が強いことが明らかになる。
実施例4 マウス抗ヒトTIGIT抗体の生物学的機能の検出
初期T細胞完全活性化をシミュレーションするには、第1シグナルと第2シグナルが共に関与しなければならないが、この原理に基づき、抗TIGIT抗体の生物学的活性検出方法が開発された。この検出システムには、マウス抗ヒトCD3単鎖抗体を過剰発現するとともに、PVRを過剰発現する、人工的に構築された抗原提示細胞(sAPC)に類似した細胞と、IL-2プロモーターにより転写翻訳が起動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子検出要素をトランスフェクションした、TIGIT及びCD226を過剰発現する工学的なJurkat細胞(CTI-Jurkat)との2つの細胞がある。sAPC細胞膜における抗ヒトCD3単鎖抗体とJurkat細胞膜におけるT細胞受容体(T cell receptor;TCR)との結合によるT細胞の活性化は第1シグナルに属し、sAPC細胞膜におけるPVRとJurkat細胞における活性化受容体CD226又は阻害受容体TIGITとの相互作用によるシグナル伝達は第2シグナルに属する。抗TIGIT抗体が関与しない場合に、PVRとTIGITの親和力がPVRとCD226の親和力よりも遥かに高いため、PVRとTIGITの優先的な結合は、TIGIT細胞内構造ドメインシグナル伝達によるT細胞の増殖とサイトカインの放出への阻害を引き起こすとともに、PVRは、CD226の正常な生理的機能に影響しないように同じ細胞表面のCD226が機能的な二量体を形成することを遮断し、また、CD226とPVRの親和力は弱いため、同じ条件下でTIGITとPVRに勝てない結果、T細胞を効果的に活性化することができないことで、T細胞は全体として阻害状態にあり、IL-2プロモーターは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写翻訳を効果的に起動することができない。逆に、検出システムに抗TIGIT抗体がある場合に、高い親和力の抗TIGIT抗体はTIGITに結合することで、TIGITとPVRのシグナル伝達を阻止することができるとともに、TIGITはCD226の二量体化を遮断することもできないので、CD226はPVRと効果的に結合することで、CD226の細胞内構造ドメインシグナルを伝達させてT細胞を活性化することができ、IL-2プロモーターは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写翻訳を効果的に起動し、ルシフェラーゼ基質の関与で機器に捕捉されるように蛍光シグナルを自発的に発光することができる。
初期T細胞完全活性化をシミュレーションするには、第1シグナルと第2シグナルが共に関与しなければならないが、この原理に基づき、抗TIGIT抗体の生物学的活性検出方法が開発された。この検出システムには、マウス抗ヒトCD3単鎖抗体を過剰発現するとともに、PVRを過剰発現する、人工的に構築された抗原提示細胞(sAPC)に類似した細胞と、IL-2プロモーターにより転写翻訳が起動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子検出要素をトランスフェクションした、TIGIT及びCD226を過剰発現する工学的なJurkat細胞(CTI-Jurkat)との2つの細胞がある。sAPC細胞膜における抗ヒトCD3単鎖抗体とJurkat細胞膜におけるT細胞受容体(T cell receptor;TCR)との結合によるT細胞の活性化は第1シグナルに属し、sAPC細胞膜におけるPVRとJurkat細胞における活性化受容体CD226又は阻害受容体TIGITとの相互作用によるシグナル伝達は第2シグナルに属する。抗TIGIT抗体が関与しない場合に、PVRとTIGITの親和力がPVRとCD226の親和力よりも遥かに高いため、PVRとTIGITの優先的な結合は、TIGIT細胞内構造ドメインシグナル伝達によるT細胞の増殖とサイトカインの放出への阻害を引き起こすとともに、PVRは、CD226の正常な生理的機能に影響しないように同じ細胞表面のCD226が機能的な二量体を形成することを遮断し、また、CD226とPVRの親和力は弱いため、同じ条件下でTIGITとPVRに勝てない結果、T細胞を効果的に活性化することができないことで、T細胞は全体として阻害状態にあり、IL-2プロモーターは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写翻訳を効果的に起動することができない。逆に、検出システムに抗TIGIT抗体がある場合に、高い親和力の抗TIGIT抗体はTIGITに結合することで、TIGITとPVRのシグナル伝達を阻止することができるとともに、TIGITはCD226の二量体化を遮断することもできないので、CD226はPVRと効果的に結合することで、CD226の細胞内構造ドメインシグナルを伝達させてT細胞を活性化することができ、IL-2プロモーターは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写翻訳を効果的に起動し、ルシフェラーゼ基質の関与で機器に捕捉されるように蛍光シグナルを自発的に発光することができる。
sAPC細胞を用意した。CD CHO AGTTM培地(25μMのMSX及び400μg/mlのハイグロマイシンを含む)でsAPCを対数成長期まで培養してから、800rpmで5分間遠心分離し、Ham’s F-12培地(10%のFBSを含む)でsAPCを40万/mlまで再懸濁し、その後にマルチチャンネルピペットで96ウェルプレートの対応するウェルを敷き、1ウェルごとに100μl入れ、即ち、1ウェルごとに4万個の細胞入れ、そして8%のCO2の37℃のインキュベータに置いて一晩培養し、翌日に培地を捨てた後、細胞培養プレートを吸取紙に俯せて残った培地を完全に吸い取った。
CTI-Jurkat細胞を用意した。10%のFBSを含む1640培地でCTI-Jurkatを対数期まで培養してから、1640(1%のFBS)培地でCTI-Jurkat細胞を500万/mlまで再懸濁し、そしてマルチチャンネルピペットでCTI-Jurkat細胞をsAPCのウェルに加え、1ウェルごとに40μl、即ち、1ウェルごとに20万個の細胞を入れた。
抗体を用意した。m10D8、陽性対照抗体Tiragolumab(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30に示される)及び陰性対照抗体BAT5906(中国特許出願CN110003328Aに示される)を1640(1%のFBS)培地で希釈し、それぞれ64、32、16μg/mlという3つの濃度、及び対照としての0μg/mlを設置した。そして、希釈された抗体を、sAPC及びCTI-Jurkat細胞が敷かれたウェルに加え、1ウェルごとに40μl(即ち、抗体の最終濃度が32、16、8、0μg/mlである)入れた。
試料加入済みの細胞培養プレートを8%のCO2の37℃のインキュベータに置いて4時間インキュベートした後、取り出して室温条件下で10分間置き、細胞培養プレートを室温まで回復させた。その後、ルシフェラーゼ基質(2時間前に-20℃の冷蔵庫から取り出し、室温に置いた)を対応する試料ウェルに加え、1ウェルごとに80μl入れた。培養プレートをマイクロプレートリーダーに入れ、5s振とうしてから、10分間した後蛍光値を読み出し、図7に示す通りである。その結果から、Tiragolumab及びm10D8は、何れもT細胞を活性化する機能を有するが、同じ条件下で、m10D8の方は、T細胞機能を活性化する能力が最も強いことが明らかになる。
実施例5 マウス抗ヒトTIGIT抗体のヒト化
マウス抗ヒトTIGIT抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とヒト抗体データベース中の配列とを比較したが、その結果は表5.1に示される。ヒト化プロセスは、創薬可能性及び薬物の潜在的な免疫原形を兼ねるとともに、抗体の高親和力を確保する必要があり、生物情報学的モデリング計算と合わせて、m10D8ヒト化抗体の1回目のヒト化は、それぞれh10D8V1(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30に示される)、h10D8V2(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)、h10D8V3(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)である3つのムトンを設計した。h10D8V1及びh10D8V2の軽鎖可変領域フレームはIGKV4-1*01で、重鎖可変領域フレームはIGHV3-23*01である。h10D8V3重鎖可変領域フレームはIGHV3-64*04で、軽鎖可変領域フレームはIGKV1-NL1*01である。ムトンタンパク質とTIGITに対して結合実験を行うとともに、生物学的活性を検出した。精製されたh10D8V1、h10D8V2、h10D8V3とTIGITに対して結合実験を行ったが、ELISA結果から示されるように(図8に示される)、三者のEC50(最大効果の50%を引き起こせる濃度)は、それぞれ0.07623μg/ml、0.09241μg/ml、0.05259μg/mlであり、EC50から見ると、h10D8V3はTIGITとの結合能力がより強いように見えるが、ELISA結果に反映された静的な抗原と抗体の結合状況は、抗体と抗原の結合及び解離状況を動的に反映することができないので、SPR-Biacore技術により、この3つの抗体とTIGIT-his tag抗原の平衡解離定数KDを測定した(図9及び表5.2に示される)。その結果から、h10D8V3は他の2つの抗体に対して結合速度が遅いが、解離速度が速く、平衡解離定数の値が他の2つの抗体よりも大きく、即ち、親和力が他の2つの抗体よりも小さいことが認められる。h10D8V1とh10D8V2の可変領域は完全に一致しており、定常領域356位(EU番号で、対応するkabat番号:377位)及び358位(EU番号で、対応するkabat番号:381位)で2つのアミノ酸残基の違いがあるのみで違っているので、親和力において大きな違いがない。同時に、さらにh10D8V1、h10D8V2、h10D8V3の生物学的活性化方法を比較したが(方法は実施例4を参照)、その結果から(図10に示される)、h10D8V1、h10D8V2及びh10D8V3によるT細胞への活性化能力は比較的に近いことが明らかになり、三者の生物学的活性が近いことが示される。
マウス抗ヒトTIGIT抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とヒト抗体データベース中の配列とを比較したが、その結果は表5.1に示される。ヒト化プロセスは、創薬可能性及び薬物の潜在的な免疫原形を兼ねるとともに、抗体の高親和力を確保する必要があり、生物情報学的モデリング計算と合わせて、m10D8ヒト化抗体の1回目のヒト化は、それぞれh10D8V1(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30に示される)、h10D8V2(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)、h10D8V3(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)である3つのムトンを設計した。h10D8V1及びh10D8V2の軽鎖可変領域フレームはIGKV4-1*01で、重鎖可変領域フレームはIGHV3-23*01である。h10D8V3重鎖可変領域フレームはIGHV3-64*04で、軽鎖可変領域フレームはIGKV1-NL1*01である。ムトンタンパク質とTIGITに対して結合実験を行うとともに、生物学的活性を検出した。精製されたh10D8V1、h10D8V2、h10D8V3とTIGITに対して結合実験を行ったが、ELISA結果から示されるように(図8に示される)、三者のEC50(最大効果の50%を引き起こせる濃度)は、それぞれ0.07623μg/ml、0.09241μg/ml、0.05259μg/mlであり、EC50から見ると、h10D8V3はTIGITとの結合能力がより強いように見えるが、ELISA結果に反映された静的な抗原と抗体の結合状況は、抗体と抗原の結合及び解離状況を動的に反映することができないので、SPR-Biacore技術により、この3つの抗体とTIGIT-his tag抗原の平衡解離定数KDを測定した(図9及び表5.2に示される)。その結果から、h10D8V3は他の2つの抗体に対して結合速度が遅いが、解離速度が速く、平衡解離定数の値が他の2つの抗体よりも大きく、即ち、親和力が他の2つの抗体よりも小さいことが認められる。h10D8V1とh10D8V2の可変領域は完全に一致しており、定常領域356位(EU番号で、対応するkabat番号:377位)及び358位(EU番号で、対応するkabat番号:381位)で2つのアミノ酸残基の違いがあるのみで違っているので、親和力において大きな違いがない。同時に、さらにh10D8V1、h10D8V2、h10D8V3の生物学的活性化方法を比較したが(方法は実施例4を参照)、その結果から(図10に示される)、h10D8V1、h10D8V2及びh10D8V3によるT細胞への活性化能力は比較的に近いことが明らかになり、三者の生物学的活性が近いことが示される。
h10D8V1、h10D8V2、h10D8V3の結果に基づき、さらにm10D8に対して2回目のヒト化設計を行ったが、それぞれh10D8OF(SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示され、即ち、重鎖の配列はSEQ ID NO:44、軽鎖の配列はSEQ ID NO:45である)、h10D8V4(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)、h10D8V5(SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30に示される)である3つのムトンをさらに得た。h10D8OF重鎖フレームはIGHV3-64*04で、軽鎖に使用されるフレームはIGKV3D-7*01である。h10D8V4重鎖フレームはIGHV3-64*04で、軽鎖フレームはIGKV4-1*01であり、フレームにおける幾つかのアミノ酸残基とマウス抗体m10D8が一致していることを主な特徴とし、h10D8V5重鎖フレーム及び軽鎖フレームはh10D8V4と同様で、抗体と抗原の接触面(interface)ができる限りマウス抗体m10D8とTIGITの接触面に一致することを主な特徴とする。h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5とTIGITとの結合能力を並べて比較したが、図11に示すように、その結果から、h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5という三者の結合曲線は実質的に重なっており、EC50値はそれぞれ0.02329μg/ml、0.02560μg/ml、0.02408μg/mlであることが明らかになる。
同時に、h10D8OF及びh10D8V2とTIGITとの結合能力を比較したが、両者の結合曲線の重合度が高く、h10D8OFはEC50値がh10D8V2よりもやや小さくなり、ELISA結果のみから見れば、前者の親和力がやや高い可能性があることが示され(図12に示される)、h10D8OF、h10D8V2及びTiragolumabのEC50値はそれぞれ、0.04273μg/ml、0.05310μg/ml、0.05361μg/mlである。また、SPR-Biacore技術により、h10D8OF、h10D8V2、TiragolumabとTIGIT-his tag抗原の平衡解離定数KDを検出したが(図13及び表5.3に示される)、動的な親和力検出により、h10D8V2と1価のTIGIT-hisとの親和力がh10D8OFよりも高いことを発見することができる。同時に、さらにh10D8OF、h10D8V4、h10D8V5の生物学的活性を検出したが、検出方法は実施例4と類似し、その結果から(図14に示される)、濃度(32μg/ml)が高い場合に、h10D8OFによるT細胞機能の回復能力は強いが、h10D8V4、h10D8V5の結果は非常に近いことが明らかになる。
実施例6 ヒト化抗体によるTIGITとPVRの結合への遮断実験
マウス抗体がヒト化された後、理論的に、TIGITとPVRの結合を遮断するようなマウス抗体の幾つかの機能が依然として保持されている。ヒト化抗体によるTIGITとPVRの結合への遮断実験の方法は実施例3の方法と類似する。ELISAの方法により、h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5、Tiragolumab(陽性対照抗体)、無関係な抗体(Isotype control)BAT5906の同じ条件下でのTIGITとPVRの結合への遮断能力が検出された。実験の結果(図15に示される)から、h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5、Tiragolumabは、何れもTIGITとPVRの結合を効果的に遮断することができ、IC50値(50%の阻害になる濃度)は、それぞれ0.1592μg/ml、0.2166μg/ml、0.2837μg/ml及び0.4289μg/mlであることが明らかになる。IC50値及び4パラメータ曲線の上下プラットフォーム値から見ると、h10D8OF、h10D8V4によるTIGITとPVRの結合への遮断能力は、陽性抗体Tiragolumabよりも強い。
マウス抗体がヒト化された後、理論的に、TIGITとPVRの結合を遮断するようなマウス抗体の幾つかの機能が依然として保持されている。ヒト化抗体によるTIGITとPVRの結合への遮断実験の方法は実施例3の方法と類似する。ELISAの方法により、h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5、Tiragolumab(陽性対照抗体)、無関係な抗体(Isotype control)BAT5906の同じ条件下でのTIGITとPVRの結合への遮断能力が検出された。実験の結果(図15に示される)から、h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5、Tiragolumabは、何れもTIGITとPVRの結合を効果的に遮断することができ、IC50値(50%の阻害になる濃度)は、それぞれ0.1592μg/ml、0.2166μg/ml、0.2837μg/ml及び0.4289μg/mlであることが明らかになる。IC50値及び4パラメータ曲線の上下プラットフォーム値から見ると、h10D8OF、h10D8V4によるTIGITとPVRの結合への遮断能力は、陽性抗体Tiragolumabよりも強い。
また、ヒトTIGITを過剰発現したJurkat細胞(Jurkat-hTIGIT 2E6)により、これらの抗体によるビオチン化PVRとJurkat細胞表面TIGITとの結合への遮断能力が改めて検証された。反応系は、PBSにより、濃度が80nMのビオチン化PVR-Fcタンパク質溶液を抗体希釈液として調製して抗体を希釈したものである。抗体の開始濃度が15nMであり、半々に希釈し、合計10個の濃度勾配(0nMを含む)が設けられ、10個の濃度勾配の抗体を、それぞれ100万のJurkat-hTIGIT細胞を含む10個の遠心分離管にそれぞれ分割包装した後、細胞を再懸濁し、4℃で置いて1時間インキュベートした。そして、各管の細胞を遠心分離して上清を除去し、PBSで2回洗浄した。その後、各管に1:2000で希釈されたStreptavidin PE(Thermo、製品番号:12-4317-87)100μを加え、再懸濁した後、4℃で置いて40分間インキュベートした。その後、各管の細胞を遠心分離して上清を除去し、PBSで2回洗浄した後、200μlのPBSで再懸濁してから、フローアナライザーにより細胞の蛍光値(mean FL2-A)を検出した。最後に、採集された蛍光値を、4パラメータフィッティンググラフにより分析し、IC50値を算出した。h10D8OF、h10D8V4、h10D8V5のIC50値(図16に示される)はそれぞれ11.26nM、15.78nM、10.44nMであり、3つの抗体は何れも、ビオチン化PVR-FCとJurkat-hTIGIT細胞膜表面のTIGITの結合を効果的に遮断することができるが、h10D8OF及びh10D8V5の遮断効果はより良い。同時に、さらに、h10D8OFと陽性抗体TiragolumabによるPVRとTIGITの結合への遮断能力を比較した(図17に示される)が、h10D8OFの遮断効果はより強い。
実施例7 ヒト化抗体ADCCの活性の検出
Jurkat細胞(ATCC、Clone E6-1、製品番号:TIB-152TM)にNFATとルシフェラーゼレポーター遺伝子(luciferase reporter gene)要素、及びFcγRIIIa(CD16)受容体遺伝子がトランスフェクションされるように構築された安定的な細胞株は、FcγRIIIa受容体を安定的に発現するもので、ADCCの生物学的活性を仲介する必要な分子であり、モノクローナル抗体により効果細胞と標的細胞を接続し、NFATの経路を活性化し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を起動する。ヒトTIGIT分子が過剰発現されるように、Jurkat細胞(ATCC、Clone E6-1)にヒトTIGIT遺伝子をトランスフェクションした安定的な細胞株は、標的細胞である。抗体ADCCの活性を検出するプロセスは、下記の通りである。1)細胞密度によって適量の細胞を取り、1200rpmで5min遠心分離して成長培地を除去してから、細胞密度を調整した。2)2種の細胞を均一に細胞培養プレート(Corning、製品番号:3917)に敷いた。効果細胞は8万個/ウェル、標的細胞は2万個/ウェルであり、1ウェルごとに2種の細胞の総体積は50μlであった。3)1%のFBS1640を希釈培地として抗体を希釈した。h10D8OF、Tiragolumab及び無関係な抗体(ADCC活性がない)は、開始濃度が1.8μg/ml(1ウェルごとに50μl、最終濃度が0.9μg/mlである)で、1/3希釈し、それぞれの濃度勾配に3つの重複ウェルが設けられ、最後の濃度勾配は0μg/mlとした。4)抗体を入れた後、試料が均一に混合されるようにプレートを軽く叩いた。その後、37℃の8%のCO2インキュベータに置き、4時間インキュベートした。5)インキュベートが終了した後、室温で10min置き、ルシフェラーゼ基質試薬も予め室温条件まで平衡しておいた。1ウェルごとに100μlの基質反応液を加え、10min後に数値を読んだ。その結果は図18に示されているが、h10D8OF及びTiragolumabは何れもADCC活性を有し、同じ条件でh10D8OFのADCC活性はTiragolumabよりもやや良い。
Jurkat細胞(ATCC、Clone E6-1、製品番号:TIB-152TM)にNFATとルシフェラーゼレポーター遺伝子(luciferase reporter gene)要素、及びFcγRIIIa(CD16)受容体遺伝子がトランスフェクションされるように構築された安定的な細胞株は、FcγRIIIa受容体を安定的に発現するもので、ADCCの生物学的活性を仲介する必要な分子であり、モノクローナル抗体により効果細胞と標的細胞を接続し、NFATの経路を活性化し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を起動する。ヒトTIGIT分子が過剰発現されるように、Jurkat細胞(ATCC、Clone E6-1)にヒトTIGIT遺伝子をトランスフェクションした安定的な細胞株は、標的細胞である。抗体ADCCの活性を検出するプロセスは、下記の通りである。1)細胞密度によって適量の細胞を取り、1200rpmで5min遠心分離して成長培地を除去してから、細胞密度を調整した。2)2種の細胞を均一に細胞培養プレート(Corning、製品番号:3917)に敷いた。効果細胞は8万個/ウェル、標的細胞は2万個/ウェルであり、1ウェルごとに2種の細胞の総体積は50μlであった。3)1%のFBS1640を希釈培地として抗体を希釈した。h10D8OF、Tiragolumab及び無関係な抗体(ADCC活性がない)は、開始濃度が1.8μg/ml(1ウェルごとに50μl、最終濃度が0.9μg/mlである)で、1/3希釈し、それぞれの濃度勾配に3つの重複ウェルが設けられ、最後の濃度勾配は0μg/mlとした。4)抗体を入れた後、試料が均一に混合されるようにプレートを軽く叩いた。その後、37℃の8%のCO2インキュベータに置き、4時間インキュベートした。5)インキュベートが終了した後、室温で10min置き、ルシフェラーゼ基質試薬も予め室温条件まで平衡しておいた。1ウェルごとに100μlの基質反応液を加え、10min後に数値を読んだ。その結果は図18に示されているが、h10D8OF及びTiragolumabは何れもADCC活性を有し、同じ条件でh10D8OFのADCC活性はTiragolumabよりもやや良い。
別の実験では、h10D8OFを分泌した宿主細胞CHOを改変し(改変方法は、特許CN107881160A及びWO2019029713 A1に示される)、h10D8OF抗体のフコースを除去したが、当該抗体はh10D8OFKFと名付けられた。上記と類似する方法により、h10D8OFKFとh10D8OFのADCC活性の相違を比較した。その結果は図19に示されており、h10D8OFKF及びh10D8OFは何れもADCC活性を有し、EC50はそれぞれ0.0152nM及び0.125nMであり、同じ条件下でh10D8OFKFのADCC活性はh10D8OFの8.8倍で、より強いADCC活性は体内でより良い薬効があり得る。
実施例8 ヒト化抗TIGIT抗体の作用下でのサイトカイン放出実験
TIGITが腫瘍細胞表面又はAPC細胞表面に発現されたPVR(CD155)に結合した後、T細胞のエフェクター機能が低減され、抗腫瘍免疫応答が阻害される。抗TIGIT抗体による、PVR仲介のT細胞サイトカイン放出の阻害への遮断能力を検出した。購入されたヒト初代CD3+細胞(広州市雷徳生物科技有限公司、製品番号:1507)を、PHA(2μg/ml)及びIL-2(4ng/ml)を含む10%のFBS1640培地にて誘導して10日間培養してから、細胞を遠心分離してPHA及びIL-2のない培地に再懸濁した後、5%のCO2の37℃の細胞インキュベータに置いて24時間静止培養した。その後、細胞を5×105個/mlに再懸濁してから、無関係な抗体BAT5906(中国特許出願CN110003328Aに示される)、h10D8OF(25μg/ml及び10μg/ml)、Tiragolumab(25μg/ml及び10μg/ml)を共に室温で30minインキュベートした。インキュベートが完了した後、細胞を抗CD3抗体(10μg/ml)(BD生物科学社、製品番号が555336である)又はPVR-Fc(10μg/ml)又は抗CD3抗体(10μg/ml)及びPVR-Fc(10μg/ml)を予め被覆しておいた細胞培養プレートに接種してから、細胞インキュベータ(37℃、5%のCO2)に置いて48時間培養した。最後に、細胞培養プレートにおける細胞を取り出し、遠心分離して上清を保持した。上清を一定の倍数に希釈した後、細胞上清におけるIFN-γ及びIL-2のサイトカインの放出を検出した。
TIGITが腫瘍細胞表面又はAPC細胞表面に発現されたPVR(CD155)に結合した後、T細胞のエフェクター機能が低減され、抗腫瘍免疫応答が阻害される。抗TIGIT抗体による、PVR仲介のT細胞サイトカイン放出の阻害への遮断能力を検出した。購入されたヒト初代CD3+細胞(広州市雷徳生物科技有限公司、製品番号:1507)を、PHA(2μg/ml)及びIL-2(4ng/ml)を含む10%のFBS1640培地にて誘導して10日間培養してから、細胞を遠心分離してPHA及びIL-2のない培地に再懸濁した後、5%のCO2の37℃の細胞インキュベータに置いて24時間静止培養した。その後、細胞を5×105個/mlに再懸濁してから、無関係な抗体BAT5906(中国特許出願CN110003328Aに示される)、h10D8OF(25μg/ml及び10μg/ml)、Tiragolumab(25μg/ml及び10μg/ml)を共に室温で30minインキュベートした。インキュベートが完了した後、細胞を抗CD3抗体(10μg/ml)(BD生物科学社、製品番号が555336である)又はPVR-Fc(10μg/ml)又は抗CD3抗体(10μg/ml)及びPVR-Fc(10μg/ml)を予め被覆しておいた細胞培養プレートに接種してから、細胞インキュベータ(37℃、5%のCO2)に置いて48時間培養した。最後に、細胞培養プレートにおける細胞を取り出し、遠心分離して上清を保持した。上清を一定の倍数に希釈した後、細胞上清におけるIFN-γ及びIL-2のサイトカインの放出を検出した。
単独で抗CD3抗体でリンパ球を誘導して産生されたサイトカインを基準として、他の処理で誘導して産生されたサイトカインをそれと比較し、前者は1.0とされ、後者は実際の比率で示され、その結果は図20及び21に示されている。その結果から、h10D8OFは濃度の増加につれて、リンパ球がIFN-γ及びIL-2をより多く産生するように誘導されることが明らかになる。
実施例9 B-hPD-1/hTIGIT二重ヒト化マウスにMC38腫瘍を接種したモデルによる、抗TIGIT抗体の腫瘍への阻害能力の検証
ヒト化抗体はマウスTIGITを認識しないため、C57BL/6背景のマウスゲノムにおけるPD-1及びTIGIT分子の細胞外領域をヒト化改変してヒトPD-1及びヒトTIGIT、即ち、B-hPD-1/hTIGIT二重ヒト化マウスに置換し、マウスの品種は、C57BL/6-Pdcd1 tm1(hPDCD1)Tigit tm1(hTIGIT)/Bcgen(百奥賽図基因生物技術有限公司)であった。B-hPD-1/hTIGITホモ接合体マウス脾細胞には、hTIGIT及びhPD-1 mRNAの発現が検出できたが、mTIGIT及びmPD-1 mRNAの発現が検出できなかった(百奥賽図基因生物技術有限公司の公式サイトでのデータ)。B-hPD-1/hTIGITヒト化マウスを使用してMC38結腸がんの動物モデルを作成することにより、抗TIGIT抗体の薬効、及び抗TIGIT抗体と抗PD-1抗体の併用薬効を検証した。
ヒト化抗体はマウスTIGITを認識しないため、C57BL/6背景のマウスゲノムにおけるPD-1及びTIGIT分子の細胞外領域をヒト化改変してヒトPD-1及びヒトTIGIT、即ち、B-hPD-1/hTIGIT二重ヒト化マウスに置換し、マウスの品種は、C57BL/6-Pdcd1 tm1(hPDCD1)Tigit tm1(hTIGIT)/Bcgen(百奥賽図基因生物技術有限公司)であった。B-hPD-1/hTIGITホモ接合体マウス脾細胞には、hTIGIT及びhPD-1 mRNAの発現が検出できたが、mTIGIT及びmPD-1 mRNAの発現が検出できなかった(百奥賽図基因生物技術有限公司の公式サイトでのデータ)。B-hPD-1/hTIGITヒト化マウスを使用してMC38結腸がんの動物モデルを作成することにより、抗TIGIT抗体の薬効、及び抗TIGIT抗体と抗PD-1抗体の併用薬効を検証した。
動物薬効学的実験に先立ち、まず、予備実験で、抗TIGIT抗体がB-hPD-1/hTIGIT二重ヒト化マウスの体内細胞表面のhTIGITと効果的に結合することができることを検証した。抗mCD3e抗体(Biolegend、製品番号:100301)11.5μgを300μlのPBSに溶けてから、B-hPD-1/hTIGIT二重ヒト化マウスを1匹掴み取り、200μlの抗mCD3e抗体溶液を腹腔内注射した。24h後、マウスを頸椎脱臼で致死し、マウスの脾臓を急速に摘み取り、5mlのPBSが加えられた15mlの遠心分離管に入れた。その後、脾臓を6ウェルプレートに移転し、70μmの篩に置き、1mlのPBSを加え、消毒済みの注射器の尾部で研磨し、そして1~2mlのPBSで篩を洗浄した。ろ過された細胞懸濁液を、3000rpmで5min遠心分離し、上清を除去してから、一時的に遠心分離して上清を除去した。その後、それぞれの脾に1mlの赤血球溶解液(碧雲天、製品番号:C3702)を加え、氷上で5min溶解した。最後に、5mlのPBSを加え、細胞を均一に混合し、4℃で3000rpmで3min遠心分離し、上清を除去してから、一時的に遠心分離して上清を除去した。それから、フローアナライザーで検出をしたが、まず、300μlのPBSで細胞を混合懸濁し、6μlの抗mCD16/32抗体(Biolegend、#101310)及びHuman TruStrain FcX(Biolegend、製品番号:422302)を加えて均一に混合し、氷上で15minインキュベートした。1.2mlのPBSを加えて細胞を均一に混合し、細胞濃度を4×107/mlまで調整し、染色すべき管に25μlの細胞懸濁液を加え、各管に、対応する抗体PerCP-抗mTcRβ(Biolegend、製品番号:109228)及びAPC-抗hTIGIT抗体APC-anti-hTIGIT(eBioscience、製品番号:17-9500-42)、Alexa Fluor 647がGoat Anti-Mouse IgG/Alexa Fluor 647であるマウス抗TIGIT抗体二次抗体Anti-mouse IgG(北京博奥森生物技術有限公司、製品番号:bs-0296G-AF647)、FITCがGoat anti-Human IgG Fc Secondary Antibody、FITCであるヒト化抗TIGIT抗体二次抗体anti-human Fc(Invitrogen、製品番号A18818)を加えて処理した後、機器に載せて検出した。実験の設計は表9.1に示されており、フロー分析の結果から(図22に示される)、m10D8、h10D8V1、h10D8OF、Tiragolumabは何れも、B-hPD-1/hTIGIT二重ヒト化マウスT細胞表面のhTIGITと効果的に結合することができるが、そのうち、同じ条件下でh10D8OFは、hTIGITとの結合能力が他の抗体よりも強いことが明らかになる。h10D8OF、Tiragolumabと、ヒトTIGITを過剰発現したJurkat細胞Jurkat-hTIGIT 2E6との結合実験にも、類似する状況が存在しており(図23に示される)、Tiragolumab(EC50値が1.906nMである)と比べて、h10D8OF(EC50値が0.6961nMである)及び生理学的状態でのTIGIT又は生理学的状態に近いTIGITは、より強い親和力を有することが示され得る。
マウスは6~8週齢であり、全て雌マウスが選択され、1群当たりマウスn=6匹がいた。マウスの右腋窩皮下でMC38細胞(百奥賽図基因生物技術有限公司)を5×105個/0.1ml/匹で接種し、腫瘍の体積が150±50mm3になると、群分けて投与し始め、腫瘍の体積が大きすぎる又は小さすぎる担腫瘍マウスを排除した。3日ごとに1回投与し、1週間に腫瘍の体積を2回測定した。毎回投与する時に、Pembrolizumabの用量は0.1mg/kgで、Tiragolumab、m10D8の用量は何れも、20mg/kgであった。抗TIGIT抗体単剤の薬効の結果から(図24に示される)、Tiragolumab及びm10D8抗体は何れも、腫瘍の増殖を阻害することができ、かつ、m10D8とTiragolumab単剤の薬効は比較的近いことが明らかになる。ヒト化抗TIGIT抗体単剤の薬効の結果(図25に示される)から、h10D8V2の腫瘍阻害効果は低く、h10D8OFとTiragolumabの腫瘍阻害効果は比較的近いことが明らかになる。抗TIGIT抗体とPembrolizumabの併用投与の薬効の結果から(図26に示される)、h10D8V2とPembrolizumabの併用投与による腫瘍阻害効果は悪く、h10D8OFとPembrolizumabの併用薬効は、TiragolumabとPembrolizumabの併用投与の薬効と比較的近いことが明らかになる。要するに、動物での薬効から見ると、マウス抗体及びヒト化抗体は何れも腫瘍の増殖を阻害する効果を有し、Pembrolizumabとの併用投与による潜在的な効果を有する。
実施例10 ヒト化抗TIGIT抗体のリンパ球亜群への影響
体内薬効学的試験の治療評価項目を行う場合に、抗TIGIT抗体によるマウスMC38の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)におけるCD4+T細胞及びCD8+T細胞への影響を分析した。試験は、Vehicle対照群(注射用生理食塩水)(n=4)及びh10D8OF(20mg/kg)単剤治療群(n=5)マウスの腫瘍を選択し、手術でマウスの新鮮な腫瘍組織を切り出し、PBSで洗浄し、氷上で置いて保存した。その後、眼科用ハサミで繰り返してせん断してから、IKA研磨器に入れて、1200rpmで正逆方向に10s回転し、合わせて2min研磨し、研磨された腫瘍組織溶液を70μmの篩で50mLの遠心分離管にろ過し、組織を1回繰り返して洗浄した後、低温遠心分離機により4℃、2000rpmで5min遠心分離し、上清を除去し、適量のPBSで腫瘍細胞を再懸濁した。
体内薬効学的試験の治療評価項目を行う場合に、抗TIGIT抗体によるマウスMC38の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)におけるCD4+T細胞及びCD8+T細胞への影響を分析した。試験は、Vehicle対照群(注射用生理食塩水)(n=4)及びh10D8OF(20mg/kg)単剤治療群(n=5)マウスの腫瘍を選択し、手術でマウスの新鮮な腫瘍組織を切り出し、PBSで洗浄し、氷上で置いて保存した。その後、眼科用ハサミで繰り返してせん断してから、IKA研磨器に入れて、1200rpmで正逆方向に10s回転し、合わせて2min研磨し、研磨された腫瘍組織溶液を70μmの篩で50mLの遠心分離管にろ過し、組織を1回繰り返して洗浄した後、低温遠心分離機により4℃、2000rpmで5min遠心分離し、上清を除去し、適量のPBSで腫瘍細胞を再懸濁した。
まず、死/生細胞を染色した。2μlのZombie NIRTM染料(Biolegend #423106)を取って500μlのPBSに入れ、2×の死/生細胞染色液を調製した。96ウェルプレートを取り、実験群の各ウェルに25μlの腫瘍細胞懸濁液を入れ、25μlの2×の死/生細胞染色液を取って対応する腫瘍細胞懸濁液を含むウェルに入れた後、暗い室温環境にて軽く振とうして15minインキュベートした。次に、細胞表面を染色し、前工程で染色した細胞25μlを分注器で新しい96ウェルプレートに移転し、1ウェルごとに25μlの細胞表面標識分子染色液を加え、4℃で遮光して30minインキュベートした。細胞表面標識分子の染色液は、抗CD45抗体(FITC、0.5μl、Biolegend #231092)、抗mCD4抗体(PE、0.5μl、Biolegend #248731)、抗mCD8抗体(BV510、0.5μl、Biolegend #248151)、抗hTIGIT抗体(APC、1μl、Biolegend #4272773)を含んだ。インキュベートの終了後に、185μlのPBSを加えて細胞を再懸濁し、均一に混合した後、4℃、2000rpmで5min遠心分離し、上清を除去し、プレートを吸取紙に軽く俯せて、残液をさらに除去した。その後、1ウェルごとに200μlの固定液(1×)を加えて細胞を再懸濁し、均一に混合した後、4℃で一晩置いた。固定終了後に、3000rpmで5min遠心分離し、上清を除去し、プレートを吸取紙に軽く俯せて、残液を除去した。1ウェルごとに200μlの膜貫通液を加え、3000rpmで5min遠心分離し、上清を除去し、プレートを吸取紙に軽く俯せて、残液を除去した。1ウェルごとに25μlの膜貫通液を加えて細胞を再懸濁するとともに、調製された細胞内染液(Anti-Mouse/Rat Foxp3、APC)25μlを加え、4℃で遮光して30minインキュベートした。1ウェルごとに200μlの1×膜貫通液を加え、均一に混合した後、4℃、3000rpmで5min遠心分離し、上清を除去し、プレートを吸取紙に軽く俯せて、残液を除去した。250μlのPBSを加えて細胞を再懸濁し、Attune NXTフローサイトメトリーのSOPに従って、機器に載せて検出した。
まず、調製された単細胞からmCD45+の白血球(図27に示される)を選別し、mCD45+細胞中のCD4+T(図28に示される)及びCD8+T(図29に示される)細胞を分析したが、その結果、2群のマウスTILはmCD45+リンパ球に有意差がないと分かり、さらに分析すると、CD4+TとCD8+T細胞にも有意差がないと発見した。次に、TIGIT+CD4+T細胞及びTIGIT+CD8+Tをさらに分析した(図30及び31に示される)が、対照群に対して、単剤治療群は、TIGIT+CD4+T及びTIGIT+CD8+T細胞の割合が明らかに低下したことが発見した。その結果から、抗TIGIT抗体の作用下で、マウス結腸がんMC38腫瘍TILのCD4+T及びCD8+T細胞には、TIGIT分子の発現が低下した可能性が大きいと示唆しているとともに、CD8+T細胞の機能が回復されたと間接的に示唆している。
実施例11 B-hTIGITヒト化マウスとhPD-L1 MC38腫瘍モデルによる、抗TIGITヒト化抗体の腫瘍への阻害能力の検証
抗TIGITヒト化抗体がマウスTIGITを認識しないため、C57BL/6背景のマウスゲノム中のTIGIT分子の細胞外領域をヒト化改変してヒトTIGIT、即ち、B-hTIGITヒト化マウスに置換し、マウスの品種はC57BL/6-Tigittm1(hTIGIT)/Bcgen(百奥賽図基因生物技術有限公司)であった。B-hTIGITホモ接合体マウス脾細胞には、hTIGIT mRNAの発現が検出できたが、mTIGIT mRNAの発現が検出できなかった(百奥賽図基因生物技術有限公司の公式サイトでのデータ)。本実験は、B-hTIGITヒト化マウス及びhPD-L1を過剰発現したMC38腫瘍モデルにより、抗TIGITヒト化抗体の腫瘍への阻害能力、及び抗TIGIT抗体と抗PD-L1抗体との併用投与の潜在的な相乗効果を検証した。
抗TIGITヒト化抗体がマウスTIGITを認識しないため、C57BL/6背景のマウスゲノム中のTIGIT分子の細胞外領域をヒト化改変してヒトTIGIT、即ち、B-hTIGITヒト化マウスに置換し、マウスの品種はC57BL/6-Tigittm1(hTIGIT)/Bcgen(百奥賽図基因生物技術有限公司)であった。B-hTIGITホモ接合体マウス脾細胞には、hTIGIT mRNAの発現が検出できたが、mTIGIT mRNAの発現が検出できなかった(百奥賽図基因生物技術有限公司の公式サイトでのデータ)。本実験は、B-hTIGITヒト化マウス及びhPD-L1を過剰発現したMC38腫瘍モデルにより、抗TIGITヒト化抗体の腫瘍への阻害能力、及び抗TIGIT抗体と抗PD-L1抗体との併用投与の潜在的な相乗効果を検証した。
h10D8OF及びTiragolumabがマウスの体内でADCC機能を最も効果的に果たすために、h10D8OF及びTiragolumabの重鎖定常領域をマウス抗体IgG2aの重鎖定常領域(SEQ ID NO:31)に置換し、h10D8OF及びTiragolumabの軽鎖定常領域をマウス抗体IgG2aの軽鎖定常領域(SEQ ID NO:32)に置換したが、組換え後の抗体は、mh10D8OF及びmTiragolumabと名付けられた。
6~8週齢のB-hTIGITヒト化マウスを選択し、PBSで再懸濁したMC38-hPD-L1細胞(MC38細胞、ヒトPD-L1を発現するとともにマウスPD-L1を取り除いた)(百奥賽図基因生物技術有限公司)を5×105個/0.1mLの濃度、0.1mL/匹の体積でB-hTIGITヒト化マウスの右側皮下に接種した。腫瘍の平均体積が100~150mm3に達すると、腫瘍の体積、体重が適当なマウスを群に入れ、1群当たり10匹で6つの実験群に均等に割り当てた。投与経路は、腹腔内注射であった。対照群はVehicle(注射用生理食塩水)で、mh10D8OFは2群あり、用量がそれぞれ10mg/kg及び30mg/kgで、mTiragolumabの用量は30mg/kgで、抗PD-L1抗体Atezolizumabの用量は1mg/kgで、併用投与群の用量は、mh10D8OFが30mg/kgで、抗PD-L1抗体Atezolizumabが1mg/kgであった。実験の結果は図32に示されている。
mh10D8OF及びmTiragolumabは何れも、腫瘍の増殖を効果的に阻害することができ、阻害程度には統計学的に差異がなく、TGIは何れも50%以上であることが認められる。TGI(The Tumor Growth Inhibition value)は、腫瘍(体積)阻害率である。体内(即ち、動物実験)で試験薬物による腫瘍の増殖への阻害作用を評価することに用いられる。(100-T/C×100)%という式で算出することができ、ただし、Tは治療後の平均相対腫瘍体積で、Cは治療前の平均相対腫瘍体積である。薬物用量の設置のため、本試験には有意な相乗効果が認められなかったが、生物学的に、当該用量の条件下での併用投与による腫瘍への阻害程度がより著しく、腫瘍阻害率TGIが66%であった。
Claims (42)
- 免疫グロブリンと免疫受容体チロシン阻害モチーフを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)タンパク質と特異的に結合し、SEQ ID NO:21に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:22に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:23に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:26又は43に示されるVL CDR2及びSEQ ID NO:27に示されるVL CDR3のうちの1つ又は複数を含む、ことを特徴とする抗体又はその断片。
- SEQ ID NO:21に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:22に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:23に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:43に示されるVL CDR2及びSEQ ID NO:27に示されるVL CDR3を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の抗体又はその断片。
- IgG、IgM、IgA、IgE又はIgDのうちの1つのアイソタイプである、ことを特徴とする請求項1に記載の抗体又はその断片。
- 重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域又はその組み合わせをさらに含む、ことを特徴とする請求項1に記載の抗体又はその断片。
- 前記Fc領域はヒトのFc領域である、ことを特徴とする請求項4に記載の抗体又はその断片。
- 前記ヒトFc領域重鎖は、356位(EU番号)でのアミノ酸がEである、ことを特徴とする請求項5に記載の抗体又はその断片。
- 前記ヒトFc領域重鎖は、386位(EU番号)でのアミノ酸がMである、ことを特徴とする請求項5に記載の抗体又はその断片。
- 前記重鎖は、SEQ ID NO:28又は29に示されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項5に記載の抗体又はその断片。
- 前記軽鎖は、SEQ ID NO:30に示されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項5に記載の抗体又はその断片。
- ヒト化抗体である、ことを特徴とする請求項1~9の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- SEQ ID NO:20、33、35、37、39及び/又は41からなる群から選ばれるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:20、33、35、37、39及び/又は41からなる群のうちのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列相同性を有するペプチドを含む重鎖可変領域を含む、ことを特徴とする抗体又はその断片。
- SEQ ID NO:24、34、36、38、40及び/又は42からなる群から選ばれるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:24、34、36、38、40及び/又は42からなる群のうちのアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するペプチドを含む軽鎖可変領域を含む、ことを特徴とする抗体又はその断片。
- アミノ酸配列がSEQ ID NO:35に示される重鎖可変領域と、アミノ酸配列がSEQ ID NO:36に示される軽鎖可変領域とを含む、ことを特徴とする抗体又はその断片。
- 重鎖部分は、SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖はSEQ ID NO:30に示されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項11~13の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- 重鎖部分は、SEQ ID NO:29に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖はSEQ ID NO:30に示されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項11~13の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- 前記抗体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:44に示される重鎖を含み、及び/又は、前記抗体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:45に示される軽鎖を含む、ことを特徴とする抗体又はその断片。
- TIGITとPVRとの結合を効果的に遮断することができる、ことを特徴とする請求項1~16の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- リンパ球を活性化してサイトカインを放出することができる、ことを特徴とする請求項1~16の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- ヒトTIGITとの親和力値KDは100pM以下である、ことを特徴とする請求項1~16の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- ヒトTIGITとの親和力値KDは5nM以下である、ことを特徴とする請求項1~16の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- ADCC活性を有する、ことを特徴とする請求項1~20の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- フコースに結合していない、ことを特徴とする請求項1~21の何れか1項に記載の抗体又はその断片。
- 請求項1~22の何れか1項に記載の抗体断片と、免疫細胞における分子に対して特異性を有する第2抗体原結合断片とを含む、ことを特徴とする二重特異的抗体。
- 前記分子は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR又はCD47を含む、ことを特徴とする請求項23に記載の二重特異的抗体。
- 請求項1~24の何れか1項に記載の抗体又はその断片と、薬学的に許容可能な担体とを含む、ことを特徴とする組成物。
- 請求項1~24の何れか1項に記載の抗体又はその断片をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とする細胞。
- 必要のある患者においてがん又は感染症を治療する方法であって、前記患者に有効用量の請求項1~24の何れか1項に記載の抗体又はその断片を投与することを含む、ことを特徴とする方法。
- 前記がんは固形腫瘍である、ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記がんは、膀胱がん、肝がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化管がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、黒色腫、前立腺がん及び甲状腺がんから選ばれる、ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記患者に第2種のがん治療剤を投与することをさらに含む、ことを特徴とする請求項27~29の何れか1項に記載の方法。
- 前記感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症又は寄生虫感染症である、ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 必要のある患者においてがん又は感染症を治療する方法であって、
(a)体外で、請求項1~24の何れか1項に記載の抗体又はその断片により細胞を処理することと、
(b)処理された細胞を患者の体内に投与することと、
を含む、ことを特徴とする方法。 - 工程(a)の前に、個体から前記細胞を単離することをさらに含む、ことを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 前記細胞は、前記患者の体内から単離される、ことを特徴とする請求項33に記載の方法。
- 前記細胞は、前記患者と異なるドナー個体から単離される、ことを特徴とする請求項33に記載の方法。
- 前記細胞はT細胞である、ことを特徴とする請求項32~35の何れか1項に記載の方法。
- 前記T細胞は、腫瘍浸潤性Tリンパ球、CD4+T細胞、CD8+T細胞又はその組み合わせである、ことを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 試料におけるTIGIT発現を検出する方法であって、試料を請求項1~24の何れか1項に記載の抗体又はその断片抗体と接触することにより、前記抗体又はその断片をTIGITに結合させ、試料におけるTIGITの発現量を反映する前記結合を検出する、ことを特徴とする方法。
- 前記試料は、腫瘍細胞、腫瘍組織、感染組織又は血液試料を含む、ことを特徴とする請求項38に記載の方法。
- 請求項1~24の何れか1項に記載の抗体又はその断片をコードすることができる、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項1~24の何れか1項に記載の抗体又はその断片を調製する方法であって、当該抗体又はその断片を発現するために、当該抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を培養する、ことを特徴とする方法。
- 前記細胞は、CHO細胞、HEK293細胞、Cos1細胞、Cos7細胞、CV1細胞又はマウスL細胞である、ことを特徴とする請求項41に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNPCT/CN2019/104258 | 2019-09-03 | ||
CN2019104258 | 2019-09-03 | ||
PCT/CN2020/113200 WO2021043206A1 (zh) | 2019-09-03 | 2020-09-03 | 一种抗tigit免疫抑制剂及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022547850A true JP2022547850A (ja) | 2022-11-16 |
Family
ID=74853066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022514242A Pending JP2022547850A (ja) | 2019-09-03 | 2020-09-03 | 抗tigit免疫阻害剤及び応用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220348650A1 (ja) |
EP (1) | EP4026846A4 (ja) |
JP (1) | JP2022547850A (ja) |
CN (2) | CN117683133A (ja) |
WO (1) | WO2021043206A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022007807A1 (zh) * | 2020-07-07 | 2022-01-13 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 双特异性抗体及其应用 |
TW202216778A (zh) | 2020-07-15 | 2022-05-01 | 美商安進公司 | Tigit及cd112r阻斷 |
BR112023026966A2 (pt) * | 2021-07-02 | 2024-03-12 | Hoffmann La Roche | Métodos para tratar um indivíduo com melanoma, para alcançar uma resposta clínica, para tratar um indivíduo com linfoma não hodgkin, para tratar uma população de indivíduos com linfoma não hodgkin e para tratar um indivíduo com câncer colorretal metastático |
WO2023215719A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Arcus Biosciences, Inc. | Anti-tigit antibodies and uses of the same |
CN117618555A (zh) * | 2022-08-31 | 2024-03-01 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 抗tigit抗体和抗ctla-4抗体联合用于***中的应用 |
Family Cites Families (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4444887A (en) | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
US4716111A (en) | 1982-08-11 | 1987-12-29 | Trustees Of Boston University | Process for producing human antibodies |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
US4980286A (en) | 1985-07-05 | 1990-12-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
US5892019A (en) | 1987-07-15 | 1999-04-06 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of a single-gene-encoded immunoglobulin |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5413923A (en) | 1989-07-25 | 1995-05-09 | Cell Genesys, Inc. | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
DE69120146T2 (de) | 1990-01-12 | 1996-12-12 | Cell Genesys Inc | Erzeugung xenogener antikörper |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
ES2246502T3 (es) | 1990-08-29 | 2006-02-16 | Genpharm International, Inc. | Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
IE922437A1 (en) | 1991-07-25 | 1993-01-27 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
US5756096A (en) | 1991-07-25 | 1998-05-26 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant antibodies for human therapy |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
US6130364A (en) | 1995-03-29 | 2000-10-10 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
ES2304786T3 (es) | 1995-04-27 | 2008-10-16 | Amgen Fremont Inc. | Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados. |
EP0823941A4 (en) | 1995-04-28 | 2001-09-19 | Abgenix Inc | HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES |
US6420140B1 (en) | 1996-10-11 | 2002-07-16 | Abgenix, Inc. | Production of multimeric protein by cell fusion method |
US5916771A (en) | 1996-10-11 | 1999-06-29 | Abgenix, Inc. | Production of a multimeric protein by cell fusion method |
DK1500329T3 (da) | 1996-12-03 | 2012-07-09 | Amgen Fremont Inc | Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa |
WO1998046645A2 (en) | 1997-04-14 | 1998-10-22 | Micromet Gesellschaft Für Biomedizinische Forschung Mbh | Method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
EP1724282B1 (en) | 1997-05-21 | 2013-05-15 | Merck Patent GmbH | Method for the production of non-immunogenic proteins |
US6051228A (en) * | 1998-02-19 | 2000-04-18 | Bristol-Myers Squibb Co. | Antibodies against human CD40 |
EP0953639A1 (en) * | 1998-04-30 | 1999-11-03 | Boehringer Ingelheim International GmbH | FAPalpha-specific antibody with improved producibility |
AU776910B2 (en) | 1998-12-08 | 2004-09-23 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Modifying protein immunogenicity |
RU2011104348A (ru) * | 2008-07-08 | 2012-08-20 | Эбботт Лэборетриз (Us) | Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение |
EP2448966B1 (en) * | 2009-07-03 | 2018-11-14 | Avipep Pty Ltd | Immuno-conjugates and methods for producing them |
JP2013523153A (ja) * | 2010-04-07 | 2013-06-17 | アッヴィ・インコーポレイテッド | TNF−α結合タンパク質 |
CA2979759C (en) * | 2015-04-16 | 2023-08-08 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Anti-human notch4 antibody |
EP3565839A4 (en) * | 2017-01-05 | 2021-04-21 | Gensun Biopharma Inc. | CHECKPOINT REGULATOR ANTAGONISTS |
CN107881160A (zh) | 2017-08-11 | 2018-04-06 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法 |
CN110283248B (zh) | 2018-01-05 | 2020-07-28 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 一种长效低毒的重组抗vegf人源化单克隆抗体及其生产方法 |
AU2020298324A1 (en) * | 2019-06-21 | 2022-01-27 | Single Cell Technology, Inc. | Anti-TIGIT antibodies |
-
2020
- 2020-09-03 JP JP2022514242A patent/JP2022547850A/ja active Pending
- 2020-09-03 EP EP20860673.1A patent/EP4026846A4/en active Pending
- 2020-09-03 WO PCT/CN2020/113200 patent/WO2021043206A1/zh unknown
- 2020-09-03 CN CN202311684129.4A patent/CN117683133A/zh active Pending
- 2020-09-03 CN CN202080053805.6A patent/CN114206929B/zh active Active
- 2020-09-03 US US17/639,877 patent/US20220348650A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114206929A (zh) | 2022-03-18 |
CN114206929B (zh) | 2023-12-22 |
CN117683133A (zh) | 2024-03-12 |
US20220348650A1 (en) | 2022-11-03 |
EP4026846A1 (en) | 2022-07-13 |
WO2021043206A1 (zh) | 2021-03-11 |
EP4026846A4 (en) | 2023-09-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110352200B (zh) | 抗具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的抗体及其应用 | |
CN108350082B (zh) | Pd-l1抗体及其用途 | |
KR102536145B1 (ko) | 항-pd-1 항체 및 이의 용도 | |
CA3092456C (en) | Anti-tigit antibody and use thereof | |
CN107530428B (zh) | Icos的抗体 | |
JP6847037B2 (ja) | 抗cd73抗体とa2a受容体阻害薬とを含む併用治療薬及びその使用 | |
JP2022130393A (ja) | 抗ctla4-抗pd-1二機能性抗体、その医薬組成物および使用 | |
JP2018537410A (ja) | 改変j鎖を有する結合分子 | |
JP2023538782A (ja) | Ccr8抗体及びその用途 | |
JP2022547850A (ja) | 抗tigit免疫阻害剤及び応用 | |
KR20210013165A (ko) | GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도 | |
KR20140104944A (ko) | 항-axl 항체 및 그의 용도 | |
KR20210109587A (ko) | 인간 il-4ra에 대한 항체 및 이의 용도 | |
WO2022068810A1 (zh) | 抗Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及其用途 | |
JP2023540526A (ja) | ネクチン-4抗体およびそれの使用 | |
JP2022527860A (ja) | 排出ポンプ-癌抗原マルチ特異性抗体ならびにそれに関する組成物、試薬、キットおよび方法 | |
WO2023151693A1 (zh) | 包含抗tigit抗体和抗pd-1-抗vegfa双特异性抗体的药物组合物及用途 | |
CN115812081A (zh) | 抗ctla-4抗体及其用途 | |
CN114106182B (zh) | 抗tigit的抗体及其用途 | |
CN112424231B (zh) | 抗pd-1抗体及其剂量和用途 | |
JP2022514786A (ja) | Muc18に特異的な抗体 | |
CN114478769B (zh) | 抗tigit抗体、其药物组合物及用途 | |
WO2022083723A1 (zh) | 抗cd73的抗体及其用途 | |
TWI806870B (zh) | 抗pd-1抗體及其用途 | |
CN107614524B (zh) | 治疗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230801 |