CN103396491A - 针对人抗苗勒激素ii型受体的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及直接针对人抗苗勒激素II型受体（AMHR-II）的单克隆抗体及其片段以及它们在治疗和诊断癌症（如卵巢癌）中的应用。具体地，本发明提供了一种对人抗苗勒激素受体II型受体AMHR-II具有特异性的单克隆抗体及其片段；本发明还提供了上述单克隆抗体及其片段的重链和/或轻链；本发明还提供了生产上述单克隆抗体及其片段所用的核酸、载体、宿主细胞和方法，本发明还提供了上述单克隆抗体及其片段相关的药物组合物、免疫偶联物、标记片段和应用。本发明可提供高特异性地靶向人卵巢癌的AMHR-II的手段，以诊断和治疗卵巢肿瘤。

Description

针对人抗苗勒激素II型受体的单克隆抗体及其制备方法和应用

本申请是申请号为200780048964.1、申请日为2007年10月31日、名称为“针对人抗苗勒激素Ⅱ型受体（AMHR-Ⅱ）的单克隆抗体”的中国申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及直接针对人抗苗勒

激素II型受体（AMHR-II）的单克隆抗体及其片段以及它们在治疗和诊断癌症（如卵巢癌）中的应用。

背景技术

卵巢癌是妇科恶性肿瘤的重要原因，是妇女癌症相关死亡的第五大主要原因。平均发病率为每100000人中约10人，全欧洲共有1-2％的妇女在某个年龄阶段发生卵巢癌（Black RJ et al.1997）。

颗粒细胞肿瘤(GCT)约占卵巢恶性瘤的5％，占卵巢性索间质瘤（ovariansex cord-stromal tumours）的70％。尽管在疾病最初几年中它们的恶化可能性相对较低，但可能在手术切除原发瘤后直到30年才出现复发(Singh-RangerG et al.2004)。如果早期作出诊断，在肿瘤扩散出腹膜之前，通过手术彻底切除可明显地改善预后复发（Dutertre M.et al.,2001）。

上皮卵巢癌约占所有卵巢肿瘤的80％。若在早期诊断出这类癌，存活率约为90％。不幸的是，在诊断中，大约75％的妇女普遍发生腹内疾病扩散（美国癌症学会的实例和图片。2001www.cancer.org）。在这些病例中，通过适当治疗，存活率约为20-25％（Rapkiewicz AV.et al.2004）。

提出了针对上皮卵巢癌的一些分子标记，尤其是循环形式的癌抗原125（CA125或MUC16），它在约80％的这类肿瘤中过度表达。但是它的进化水平与月经和良性条件（如子宫内膜异位症或肝病）相关。

用于上皮卵巢癌的主要治疗策略是外科手术和化学疗法。例如，通常以顺铂类化学疗法治疗卵巢癌，但由于获得的顺铂抗性而使其经常复发（Yahata,H.et al.,2002）。尽管大部分患者一开始能对铂和紫杉醇化学疗法作出反应，包括完全缓解，但复发率约为85％（Gordon AN et al.2004）。基于激素、抗生成血管因子和单克隆抗体的新靶向疗法已经快速发展起来。单克隆抗体包括奥戈伏单抗（oregovomab）（OvaRex,AltaRex），该奥戈伏单抗是一种直接针对CA125的研究型鼠单克隆抗体，目前被用于免疫治疗的临床试验（BerekJS et al.2004）；和西妥昔单抗（cetuximab），该西妥昔单抗是直接针对表皮生长因子受体(EGFR)的，在30-70％的上皮卵巢癌中有表达(Ozols RF et al.2004)。

因而，对用于治疗卵巢癌的新治疗剂存在大量的需求。此外，明确需要对作为用于诊断活体受试者卵巢癌的灵敏的和特异性的生物标记的新卵巢癌相关蛋白进行识别。

抗苗勒激素II型受体参与了与男性生殖***的发育相关的苗勒胆管的退化。该受体在人上皮卵巢癌细胞中频繁表达。对于已经证实的AMH抑制卵巢癌细胞生长的能力，AMHR-II可构成有价值的靶点以用在基于抗体的免疫疗法中。

通过小鼠种系的遗传操作，研究了动物模型中的AMHR-II表达。Dutertre等(2001)报导了功能型AMHR-II在颗粒细胞卵巢肿瘤中的表达，所述颗粒细胞卵巢肿瘤源于使用AMH启动子SV40癌基因构建体通过定向致癌基因而获得的转基因小鼠。在新近研发的小鼠模型中，Conolly等(2003)使用相同的癌基因构建体，在控制AMHR-II5’上游调控序列的情况下，证实了约50％的雌小鼠发生了上皮卵巢癌。Masiakos等(1999)也证实了在人上皮卵巢癌细胞株中以及从卵巢癌患者和形成固体肿瘤的患者中分离出的腹水细胞（ascitecells）样品中表达有AMHR-II。这些研究者还报导了在源于其它组织（如乳腺（Segev DL et al;2000）或***（Segev DL et al.2002））的癌细胞株中表达有AMHR-II。这些数据表明了在人类癌症，尤其在卵巢肿瘤中AMHR-II具有非常特异性的分布。

2004年，Salhi等开发并表征了直接针对人AMHR-II的单克隆抗体(mAb)，并采用免疫组织化学(IHC)通过人颗粒细胞肿瘤(GCTs)和人睾丸中的塞尔托利（Sertoli）和莱迪希（Leydig）细胞，证实了AMHR-II的强表达。他们还清楚地显示了mAb12G4在高水平表达有天然配体(AMH)的颗粒细胞中的非竞争性结合，从而实现mAb12G4在表达有AMHR-II的肿瘤中的体内应用。

最近，Yuan等(2006)描述了从人非免疫scFv噬菌体展示文库中筛选AMHR-II特异的人scFv（单链可变区片段）分子。他们进一步表明，基于抗体的构建体可提供高特异性地靶向人卵巢癌的AMHR-II的手段，以诊断和治疗这种疾病。

发明内容

本发明提供了由Salhi等(2004)开发的特异性单克隆抗体的公众可获得来源，所述特异性单克隆抗体就是发明人所指的mAb12G4。实际上，按照布达佩斯条约已于2006年9月26日将分泌mAb12G4的杂交瘤保藏在国立微生物保藏中心（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）（CNCM,lnstitut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex15,法国）。保藏的杂交瘤的CNCM保藏号为I-3673。本发明人还克隆并表征了所述mAb12G4的轻链可变区和重链可变区，从而确定了所述抗体的互补决定区(CDR)。

此外，本发明人使用mAb12G4并通过免疫组织化学，研究了在多种肿瘤组织切片中的AMHR-II表达。因此证实了AMHR-II在卵巢癌中的特定表达谱，不仅在属于恶性上皮增生的上皮卵巢癌而且还在属于性索间质肿瘤的特定亚型（如血清和明确腺癌和成人）的颗粒细胞肿瘤中。从而表明了AMHR-II可表示为卵巢AMHR-II阳性癌的新诊断标志，且可作为使用mAb12G4或其衍生物的免疫疗法的靶点。

近来发明人通过免疫荧光实验证实了mAb12G4在AMHR-II稳定转染的GCT细胞株(COV434-plRES-EGFP-AMHR-II)(Zhang H et al.2000)中表现出有效的内化（internalization）。该细胞株表达了约10⁴个受体/细胞。还表明了所述抗体具有在体外抑制表达AMHR-II的COV434细胞生长的能力。也进行了体内实验，实验表明在异种移植了COV434-plRESEGFP-AMHR-II细胞的无胸腺裸鼠模型中，mAb12G4能够延迟肿瘤的生长。

本发明的第一方面涉及一种免疫球蛋白的重链和/或轻链，其中，该重链和/或轻链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-1的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6、CDR-2的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7、以及CDR-3的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中所组成的组中的序列的CDR。

本发明的第二方面涉及一种直接针对抗苗勒激素II型受体(AMHR-II)的单克隆抗体或其片段，该单克隆抗体或其片段包括：

重链，其中重链可变区包括至少一个具有选自由CDR-H1的SEQ IDNO:2、CDR-H2的SEQ ID NO:3、以及CDR-H3的SEQ ID NO:4所组成的组中的序列的CDR；和/或

轻链，其中轻链可变区包括至少一个具有选自由CDR-L1的SEQ IDNO:6、CDR-L2区的SEQ ID NO:7序列、以及CDR-L3的SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。

本发明的第三方面涉及一种核酸，该核酸含有编码本发明单克隆抗体或其片段的序列。

本发明的第四方面涉及一种含有本发明核酸的载体。

本发明的第五方面涉及一种被上述核酸和/或载体转化的宿主细胞。

本发明的第六方面涉及一种制备本发明抗体的方法，其中，该方法包括以下步骤：(i)在适于使所述抗体表达的条件下培养上述转化的宿主细胞；和(ii)回收表达的抗体。

本发明的第七方面涉及一种药物组合物，其中，该药物组合物含有：上述抗体、和/或核酸、和/或载体、和/或宿主细胞；以及药用可接受的载体。

本发明的第八方面涉及一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有与抗癌剂或生长抑制剂偶联的本发明的抗体。

本发明的第九方面涉及一种标记有可检测分子或物质的本发明抗体。

本发明的第十方面涉及上述抗体、药物组合物、或免疫偶联物在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

本发明的第十一方面涉及本发明抗体在诊断和/或监测卵巢癌中的应用。

定义

“编码序列”或“编码”表达产物（如RNA、多肽、蛋白、或酶）的序列，是指表达时能够产生RNA、多肽、蛋白、或酶的核苷酸序列，即，该核苷酸序列编码多肽、蛋白、或酶的氨基酸序列。所述蛋白的编码序列包括起始密码子（通常是ATG）和终止密码子。

本文中，所涉及的特定蛋白（如，抗体或AMHR-II）可包括具有天然氨基酸序列的多肽，以及它们的变体和修饰形式，而不管它们的来源或制备模式。具有天然氨基酸序列的蛋白是指可从自然中获得的具有相同氨基酸序列的蛋白（如，天然存在的AMHR-II）。这种天然序列蛋白可从自然界中分离到或使用标准的重组和/或合成方法而制备得到。所述天然序列蛋白具体包括：天然存在的截短的或可溶的形式，天然存在的变体形式（例如，可选剪接形式），天然存在的等位变体和包括翻译后修饰的形式。所述天然序列蛋白包括：经翻译后修饰（如对某些氨基酸残基的糖基化、磷酸化、或其它修饰）的蛋白。

术语“基因”表示编码或对应于包括一个或多个蛋白或酶的全部或部分氨基酸序列的特定氨基酸序列的DNA序列，该DNA序列可以包括或不包括调控DNA序列，例如决定基因表达条件的启动子序列。某些不是结构基因的基因可从DNA转录成RNA，但不能翻译成蛋白。其它基因可能充当结构基因的调控因子或DNA转录的调控因子。尤其是，术语基因可以是编码蛋白的基因组序列，即含有调控因子、启动子、内含子和外显子序列的序列。

本文中，术语“寡核苷酸”通常是指至少10个，优选至少12个，更优选至少15个，还优选至少20个核苷酸，优选不大于100个核苷酸，还优选不大于70个核苷酸的核酸。

“功能保守变体”是指那些改变了蛋白或酶的规定氨基酸残基但不改变多肽的整体构象和功能的变体，包括但不限于：具有相似属性氨基酸之间的置换（例如，极性、氢键合力、酸性、碱性、疏水性、芳香性等等）。蛋白中除了表现保守的氨基酸以外的其它氨基酸可以不同，使得任意两个功能相似的蛋白之间的蛋白百分比或氨基酸序列的相似性可能变化，例如，通过聚类法按照序列比对图确定的70-99％，其中，相似性是基于MEGALIGN算法确定的。“功能保守变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定的至少具有60％的氨基酸同一性的多肽，优选至少75％，更优选至少85％，还优选至少90％，还更优选至少95％，并且“功能保守变体”具有与天然蛋白或亲代蛋白相同的或基本相似的属性。

当在较短序列的全长中大于80％，优选大于85％，优选大于90％的氨基酸是相同的；或大于90％，优选大于95％是相似的（功能相同），则两个氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。优选地，使用例如GCG（基因计算机组，GCG程序包的程序手册，第7版，Madison,Wisconsin）堆积程序或例如BLAST、FASTA等的任选的序列比对算法进行比对，可鉴别相似的或同源的序列。

本发明中，“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同意思，在本发明中将被等同使用。抗体是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包括能够与抗原进行免疫特异结合的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅包括整个抗体分子，还包括抗体片段以及抗体和抗体片段的变体（包括衍生物）。在天然抗体中，两条重链通过双硫键相互联接而每条重链通过双硫键与轻链相连。有两类轻链，λ(I)和κ(k)。有五种主要的重链类别（或同种型）它们决定了以下抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链包含不同的序列区。所述轻链包括两个区，可变区(VL)和恒定区(CL)。所述重链包括四个区，即一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，全体都是CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区具有重要的生物学特性（如抗体链联合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合、以及与Fc受体(FcR)的结合）。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N末端部分，并且该Fv片段包括一条轻链的可变部分和一条重链的可变部分。抗体特异性源自抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。所述抗体结合位点主要由源自高可变区或互补决定区(CDRs)的残基构成。有时候，来自非高可变区或框架区(FR)的残基会影响整个域结构，从而影响与位点的结合。互补决定区或CDRs是指共同限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链都具有三个CDRs，并分别被命名为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，所述抗原结合位点包括六个CDRs，包括来自每条重链和轻链V区的CDR集。

框架区(FRs)是指***在CDRs之间的氨基酸序列，即在单个种内不同免疫球蛋白之间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分，如Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)所确定的。在本文中，“人框架区”是与天然存在的人抗体框架区基本相同的框架区（约85％，或更大，特别是90%、95%、或100%）。

本文中术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单纯氨基酸组成的抗体分子，是直接针对特定抗原的且是由单克隆的B细胞或杂交瘤产生的。

术语“嵌合抗体”是指包括源自非人动物抗体的VH区和VL区、其它抗体（尤其是人抗体）的CH区和CL区的工程抗体。对于非人动物，可采用任何动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、或兔子等。

术语“人源化抗体”是指框架或“互补决定区”(CDR)被修饰成包括来自与亲代免疫球蛋白相比具有不同特异性的供体免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选实施方式中，小鼠CDR被移植到人抗体的框架区中，以制备“人源化抗体”。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab1、dsFv、scFv、sc(Fv)2、双体（diabodies）、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“Fab”表示分子量约为50000且具有抗原结合活性的抗体片段，其中在经蛋白酶、木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中，约一半的H链N末端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。

术语“F(ab')2”是指分子量约为100000且具有抗原结合活性的抗体片段，其略大于Fab，在经蛋白酶、木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中通过铰链区的二硫键结合。

术语“Fab'”是指分子量约为50000且具有抗原结合活性的抗体片段，其是通过切断F(ab')2铰链区的二硫键而获得的。

单链Fv(“scFv”)多肽是共价结合的VH::VL异源二聚体，其通常由包括通过编码肽的连接体而连接的VH和VL编码基因的融合基因所表达。本发明的人scFv片段包括优选通过使用基因重组技术而保持适当构象的CDRs。

“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异源二聚体。二价和多价抗体片段可通过单价scFvs的联合自然形成，或通过由肽连接体偶联单价scFvs而生成，如二价Sc(Fv)2。

术语“双体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述双体片段包括与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)。通过使用因太短而不能在同一链的两个区之间配对的连接体，促使该区与其它链的互补区配对，并产生了两个抗原结合位点。

术语“杂交瘤”表示一种细胞，该细胞是通过将以抗原免疫非人哺乳动物而制备的B细胞与源自小鼠或类似物的骨髓瘤细胞进行细胞融合而获得的，所述杂交瘤可产生所需的具有抗原特异性的单克隆抗体。

术语“AMHR-II”表示抗苗勒激素II型受体。已从大鼠(Baarends WM etal.1994)、兔子(di Clemente N.et al.1994)、人(hAMHR-II)(Imbeaud S et al.1995)和小鼠(mAMHR-II)(Behringer RR et al.1990)中分离出AMHR-II基因。它包括11个外显子：编码人受体中由127个氨基酸组成的胞外区的外显子1-3，以及编码由26个氨基酸组成的跨膜区的外显子4。预测的AMHR-II序列与其它TGF-β族II型受体具有约30％的相似性。在天然组织靶点、生殖器官和生殖腺中，可特异地表达AMHR-II。在苗勒管中，当通过旁分泌机制使AMH（抗苗勒激素）诱导退化时，则AMHR-II在间充质中表达(Tsuji M etal.1992)。AMHR-II或AMH的突变会造成雄性的性发育异常，如雄性转基因小鼠(Behringer RR et al.1990)的假两性畸形（在人则称作永久性苗勒管综合症(PMDS)(Belville C et al.1999)）。在雌性中，随苗勒管长度而维持AMHR-II的表达，AMHR-II可在正常的和妊娠的子宫中检测到(Teixeira J etal.1996)。缺乏AMHR-II-或AMH-的雌性小鼠是正常的，与年轻鼠一样可繁殖。分别在睾丸塞尔托利（Sertoli）细胞和卵巢颗粒细胞中，以及在衍生细胞如Smat-1(Dutertre M et al.1997)和AT29C(Racine C et al.1998)中，AMH和AMHR-II是共表达的。已在啮齿动物的莱迪希（Leydig）细胞(Racine C,etal.1998;Lee MM et al.1999)和人细胞(Masiakos PT et al.1999)中检测到单独表达的AMHR-II，但在鼠类卵巢表面的上皮组织中未检测到(di Clemente et al.1994;Baarends WM et al.1995)。人AMHR-II的多肽序列以登录号U29700保存在Genebank数据库中。

当涉及多肽（即本发明的抗体片段）或核苷酸序列，“纯化”和“分离”表示指定分子以基本不含有其它同类生物大分子的方式而存在。本文中术语“纯化”优选表示存在至少75重量％的同类生物大分子，更优选至少85重量％，还更优选至少95重量％，最优选至少98重量％。编码特定多肽的“分离”核酸分子是指基本不含有其它不编码目标多肽的核酸分子的核酸分子；但是，该分子可以包括对成分的基本特征无不利影响的另外的碱基或基团。

本文中，术语“受试者”表示哺乳动物，如啮齿类动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。本发明优选受试者是人。

本发明的抗体、免疫球蛋白链和多肽：

本发明提供了直接针对人AMHR-II的分离的单克隆抗体或其片段。尤其是，本发明人按照布达佩斯条约已于2006年9月26日将分泌mAb12G4的杂交瘤保藏在微生物培养保藏中心（Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes）(CNCM,lnstitut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724ParisCedex15,法国)。保藏的杂交瘤的CNCM保藏号为I-3673。本发明人还克隆并表征了所述mAb12G4的轻链可变区和重链可变区，从而确定了如表1、图2和3所示的所述抗体的互补决定区(CDRs)。

表1：mAb12G4的VH,VL和CDR区

因此，本发明涉及一种具有人AMHR-II特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体包括重链，其中，重链可变区包括至少一个具有选自由CDR-H1的SEQ ID NO:2、CDR-H2的SEQ ID NO:3和CDR-H3的SEQ ID NO:4所组成的组中的序列的CDR。

本发明还涉及一种具有人AMHR-II特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体包括轻链，其中，该轻链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-L1的SEQ ID NO:6、CDR-L2的SEQ ID NO:7和CDR-L3的SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。

本发明还涉及一种具有人AMHR-II特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体包括重链和/或轻链，其中，所述重链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-H1的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6、CDR-H2的SEQ ID NO:3或SEQID NO:7、以及CDR-H3的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR；所述轻链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-H1的SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:6、CDR-H2的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7和CDR-H3SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。

本发明的单克隆抗体可以包括重链和/或轻链，其中，所述重链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-H1的SEQ ID NO:2、CDR-H2的SEQ IDNO:3和CDR-H3的SEQ ID NO:4所组成的组中的序列的CDR，所述轻链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-L1的SEQ ID NO:6、CDR-L2的SEQID NO:7和CDR-L3的SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。

本发明的单克隆抗体可以包括轻链和/或重链，其中，所述轻链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-H1的SEQ ID NO:2、CDR-H2的SEQ IDNO:3和CDR-H3的SEQ ID NO:4所组成的组中的序列的CDR，所述重链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-L1的SEQ ID NO:6、CDR-L2的SEQID NO:7和CDR-L3的SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。尤其是，本发明提供了直接针对抗苗勒激素II型受体(AMHR-II)的单克隆抗体，该单克隆抗体包括：

重链，其中该重链的可变区包括

a）CDR-H1区的SEQ ID NO:2，CDR-H2区的SEQ ID NO:3和CDR-H3区的SEQ ID NO:4；或

b）CDR-H1区的SEQ ID NO:6，CDR-H2区的SEQ ID NO:7和CDR-H3区的SEQ ID NO:8；

和/或

轻链，其中该轻链的可变区包括

c）CDR-L1区的SEQ ID NO:6、CDR-L2区的SEQ ID NO:7和CDR-L3区的SEQ ID NO:8；或

d）CDR-L1区的SEQ ID NO:2、CDR-L2区的SEQ ID NO:3和

CDR-L3区的SEQ ID NO:4。

在一个具体实施方式中，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

可通过本领域公知的任何技术制备所述抗体。尤其可通过下文所述的技术制备所述抗体。

在一个实施方式中，本发明单克隆抗体是鼠抗体。尤其是，所述鼠抗体可以从CNCM保藏号为I-3673的杂交瘤获得。

在另一实施方式中，本发明单克隆抗体是嵌合抗体，优选小鼠/人嵌合抗体。尤其是，所述小鼠/人嵌合抗体可包含从保藏为CNCM-I-3673的杂交瘤获得的抗体的可变区。

在另一个实施方式中，本发明单克隆是一种人源化抗体。尤其是，在所述人源化抗体中，可变区包含人受体框架区域，和任选存在的人恒定区，和非人供体CDRs（例如上述定义的小鼠CDRs）。

本发明进一步提供了所述单克隆抗体的片段，该单克隆抗体的片段包括但不限于Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

在另一方面，本发明涉及一种免疫球蛋白的重链和/或轻链，其中，该重链和/或轻链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-1的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6、CDR-2的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7和CDR-3的SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。

尤其是，本发明提供一种免疫球蛋白重链和/或轻链，其中，该重链和/或轻链的可变区包括：

至少一个具有选自由CDR-1的SEQ ID NO:2、CDR-2的SEQ ID NO:3和CDR-3的SEQ ID NO:4所组成的组中的序列的CDR；或

至少一个具有选自由CDR-1的SEQ ID NO:6、CDR-2的SEQ ID NO:7和CDR-3的SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。

在一个优选实施方式中，本发明涉及一种免疫球蛋白的重链和/或轻链，其中，该重链和/或轻链的可变区包括：

CDR-1的SEQ ID NO:2，CDR-2的SEQ ID NO:3和CDR-3的SEQ IDNO:4；或

-CDR-1的SEQ ID NO:6，CDR-2的SEQ ID NO:7和CDR-3的SEQ IDNO:8。

在一个实施方式中，本发明的免疫球蛋白重链和/或轻链包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的可变区。

在一个实施方式中，本发明免疫球蛋白链是重链或轻链。

本发明还涉及包括本发明免疫球蛋白的重链或轻链的免疫球蛋白。尤其是，免疫球蛋白可包括如上定义的重链或轻链。

在另一方面，本发明涉及一种具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的多肽。

本发明的抗体和多肽能以分离（例如纯化）的形式或包含在载体（如膜或脂囊泡（例如脂质体））中的形式被使用。

核酸，载体和重组宿主细胞

本发明的另一目的涉及一种编码本发明单克隆抗体或其片段的核酸序列。

在一具体实施方式中，本发明涉及一种编码mAb12G4的VH区或mAb12G4的VL区的核酸序列。

通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可被包含在任何适宜的载体中，如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。

术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指能够将DNA或RNA（如外源基因）导入宿主细胞的介质，以转化宿主并促进导入序列的表达（如：转录和翻译）。

因此，本发明的另一目的涉及一种包括本发明核酸的载体。

这种载体可包括调控元件，如启动子、增强子、终止子等等，以促使或调控受试者中所述多肽的直接表达。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的实例包括：SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T.et al.1987)，莫洛尼（Moloney）小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y et al.1987)，免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO et al.1985)和增强子(Gillies SD et al.1983)等等。

可采用任何动物细胞用表达载体，只要能够***和表达编码人抗体C区的基因即可。适宜载体的实例包括：pAGE107(Miyaji H et al.1990)，pAGE103(Mizukami T et al.1987)，pHSG274(Brady G et al.1984)，pKCR(O'Hare K et al.1981)，pSG1βd2-4-(Miyaji H et al.1990)等等。

质粒的其它实例包括：具有复制起点的复制质粒、或整合质粒，如pUC、pcDNA、pBR等等。

病毒载体的其它实例包括：腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。可通过本领域已知技术制备这种重组病毒，如转染包装的细胞或以辅助质粒或病毒的瞬时转染。包装病毒的细胞的典型实例包括：PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv^＋细胞、293细胞等。可在WO95/14785、WO96/22378、US5,882,877、US6,013,516、US4,861,719、US5,278,056和WO94/19478中找到制备这种复制缺陷的重组病毒的具体方案。

本发明的另一目的涉及一种已被本发明核酸和/或载体所转染的、感染的或转化的细胞。

术语“转化”是指将“外源”（即外部的或胞外的）基因、DNA、或RNA序列导入宿主细胞，以使宿主细胞表达被导入的基因或序列，并产生所需物质，通常是由被导入基因或序列所编码的蛋白或酶。接受并表达导入DNA或RNA的宿主细胞被“转化”。

本发明的核酸可用于在适宜的表达体系中产生本发明的重组多肽。术语“表达体系”是指在适宜条件下的宿主细胞和相容性载体，如用于表达被导入宿主细胞的由载体所携带的外源DNA所编码的蛋白的体系。

常用的表达体系包括：大肠杆菌（E.coli）宿主细胞和质粒载体，昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其它实例包括但不限于：原核细胞（如细菌）和真核细胞（如酵母细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞等）。具体实例包括：大肠杆菌、克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces）或酵母菌属（Saccharomyces）酵母。哺乳动物细胞株（例如：Vero细胞，CHO细胞，3T3细胞，COS细胞等）以及原始或构建好的哺乳动物细胞培养物（例如：由淋巴细胞，成纤维细胞，胚细胞，上皮细胞，神经细胞，脂肪细胞等制备的）。实例还包括：小鼠SP2/0-Ag14细胞（ATCC CRL1581），小鼠P3X63-Ag8.653细胞（ATCC CRL1580），二氢叶酸还原酶基因（下文表示为"DHFR基因"）缺陷的CHO细胞（Urlaub G etal;1980），大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞（ATCC CRL1662,下文表示为"YB2/0细胞"）等等。优选YB2/0细胞，因为在该细胞中表达时嵌合抗体或人源化抗体的ADCC活性被强化。

本发明还涉及一种制备用于表达本发明抗体或多肽的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在体外或离体将上述重组核酸或载体导入感受态宿主细胞中；(ii)在体外或离体培养获得的重组宿主细胞；以及(iii)任选地，筛选表达和/或分泌所述抗体或多肽的细胞。所述重组宿主细胞可以被用于制备本发明抗体和多肽。

制备本发明抗体的方法

可通过本领域任何已知技术来制备本发明抗体和多肽，如但不限于任何化学的、生物的、遗传的或酶技术，可单独或组合使用。

在已知所需序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员通过制备多肽的标准方法可容易地制备出所述抗体或多肽。例如，可采用公知的固相法进行合成，优选采用可商业得到的肽合成装置（例如Applied Biosystems,FosterCity,California制造的）并按照生产商的说明进行合成。可选地，可通过本领域公知的重组DNA技术来合成本发明的抗体和多肽。例如，在编码所需（多）肽的DNA序列被***到表达载体中并将该载体导入至适宜的可表达所需多肽的原核或真核宿主之后，这些片段可作为DNA表达产物而得到，随后采用公知的技术将它们从中分离出来。

尤其是，本发明还涉及一种制备本发明抗体或多肽的方法，该方法包括以下步骤：(i)在适于使所述抗体或多肽表达的条件下，培养本发明的转化宿主细胞；和(ii)回收表达的抗体或多肽。

本发明抗体和多肽适于通过常规的免疫球蛋白纯化程序（如蛋白A琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析）而从培养基中分离出。

在一具体实施方式中，通过获取编码前述VL区和VH区的核酸序列，将该核酸序列***到用于具有编码人抗体CH和人抗体CL基因的动物细胞的表达载体以构建人嵌合抗体表达载体，并将表达载体导入动物细胞中以表达编码序列来制备本发明的人嵌合抗体。

对于人嵌合抗体的CH区，它可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，但IgG类的那些是适宜的，也可采用属于IgG类的任一子类，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。此外，对于人嵌合抗体的CL，它可以是属于Ig的任何区域，可采用κ类或λ类的那些。

制备人嵌合抗体的方法包括本领域公知的常规重组DNA和基因转染技术（参见Morrison SL.et al.(1984)和专利文献US5,202,238；和US5.204,244）。

通过获取编码前述CDR区的核酸序列，将该核酸序列***到用于具有编码(i)与人抗体的重链恒定区相同的重链恒定区和(ii)与人抗体的轻链恒定区相同的轻链恒定区的基因的动物细胞的表达载体中，以构建人源化抗体表达载体，并将表达载体导入动物细胞中以表达基因来制备本发明的人源化抗体。

人源化抗体表达载体可以是编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因分别存在于独立的载体中的类型，或两个基因存在于同一载体中的类型（串联型）。鉴于构建人源化抗体表达载体的便利，导入动物细胞的便利，和动物细胞中抗体H和L链的表达水平之间的平衡，优选串联型的人源化抗体表达载体(Shitara K et al.1994)。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18等等。

基于常规重组DNA技术和基因转染技术制备人源化抗体的方法是本领域公知的（参见：例如Riechmann L.et al.1988;Neuberger MS.et al.1985）。抗体的人源化可采用多种本领域已知技术包括，例如CDR移植（EP239,400;PCT WO91/09967;美国专利Nos.5,225,539;5,530,101;和5,585,089）、贴合（veneering）或表面重修（resurfacing）（EP592,106;EP519,596;Padlan EA(1991);Studnicka GM et al.(1994);Roguska MA.et al.(1994))）、以及链改组（chain shuffling）（美国专利No.5,565,332）。制备该抗体的惯用重组DNA技术也是已知的（参见欧洲专利申请EP125023和国际专利申请WO96/02576）。

以蛋白酶、木瓜蛋白酶处理能与人AMHR-II发生特异性反应的抗体可获得本发明的Fab。此外，通过将编码抗体Fab的DNA***到用于原核表达体系或真核表达体系的载体中，并将该载体导入到原核生物或真核生物（适宜的）以表达Fab可制备Fab。

以蛋白酶、木瓜蛋白酶处理能与AMHR-II发生特异性反应的抗体可获得本发明的F(ab')2。此外，通过硫醚键或二硫键与下述Fab'结合可制备F(ab')2。

以还原剂、二硫苏糖醇处理能够与hAMHR-II发生特异性反应的抗体可获得本发明的Fab'。此外，通过将编码抗体Fab'片段的DNA***到原核表达载体或真核表达载体中，并将该载体导入到原核生物或真核生物（适宜的）以表达可制备Fab'。

通过获取编码前述VH区和VL区的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA***到用于原核表达载体或真核表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物（适宜的）以表达scFv可制备本发明的scFv。为生成人源化scFv片段，可采用公知的所谓CDR移植技术，该技术包括筛选来自供体scFv片段的互补决定区(CDRs)，并将它们移植到具有已知三维结构的人scFv片段框架中（参见：例如W098/45322、WO87/02671、US5,859,205、US5,585,089、US4.816,567、EP0173494）。

本发明抗体的修饰

考虑了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，期望改善抗体的结合亲和性和/或其它生物特性。已知当通过仅将源于非人动物抗体的VH和VL中的CDRs简单地移植到人抗体的VH和VL的FRs中来制备人源化抗体时，则相对于源于非人动物的原始抗体它的抗原结合活性降低。认为不仅在CDRs还有FRs中，非人抗体的VH和VL的多个氨基酸残基都直接或间接地与抗原结合活性相关。由此，以源于人抗体VH和VL的FRs中的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基会降低结合活性。为了解决这个问题，在移植了人CDR的抗体中，必须尝试从人抗体VH和VL的FR的氨基酸序列中识别出与抗体结合直接相关的、与CDR的氨基酸残基相互反应的、或维持抗体三维结构的和与抗原结合直接相关的氨基酸残基。通过以源于非人动物原始抗体的氨基酸残基替换相同氨基酸，可增强被降低的抗原结合活性。

可对本发明抗体的结构和其编码DNA序列进行修饰和改变，并仍能够获得编码具有所需特性的抗体和多肽的功能分子。

按照表2改变DNA序列密码子可实现氨基酸的改变。

表2

对多肽的氨基序列进行改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸的亲水指数对蛋白的活性生物功能的重要性是本领域普遍公认的。认为氨基酸的相关亲水值促进了相应蛋白的二级结构，所述亲水值依次决定了蛋白与其它分子（例如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等等）的相互作用。根据每个氨基酸的疏水性和电荷特性确定的亲水指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷胺酰胺(-3.5)；天冬氨酸(<RTI3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本发明的另一目的还包括本发明抗体的功能保守变体。

例如，在未观察到活性损失的情况下，以其它基酸取代蛋白结构中的特定氨基酸。因为蛋白的活性能力和本质决定了蛋白的生物功能活性，可在蛋白序列和其DNA编码序列中进行特定氨基酸的取代，同时仍然获得具有相似特性的蛋白。从而考虑了本发明的抗体序列或相应的编码所述多肽的DNA序列中进行多种改变，且对它们的生物活性不造成可观察到的损失。

本领域已知以具有相似亲水指数或得分的其它氨基酸取代特定氨基酸，仍可使蛋白具有相似生物活性，即仍可以获得等效生物功能的蛋白。

综上所述，氨基酸的取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相关相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑多种前述特性的可参照取代是本领域技术人员所公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷胺酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

还希望基于效应子的功能来修饰本发明抗体，例如，增强由抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)。通过在抗体Fc区中导入一个或多个氨基酸取代可实现。可选地或额外地，在Fc区中可引入半胱氨酸残基，由此在该区域形成链间二硫键。由此生成的同源二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Caron PC.et al.1992;和Shopes B.1992)。

另一类的本发明抗体的氨基酸修饰可用于改变所述抗体的原始糖基化模式。

“改变”是指删除一个或多个抗体中存在的碳水化合物基团，和/或增加一个或多个抗体中没有的糖基化位点。

抗体的糖基化通常是N-连接。“N-连接”是指碳水化合物基团结合在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸（其中X是除脯氨酸之外的任意的氨基酸）是碳水化合物基团与天冬酰胺侧链的酶促结合的识别序列。从而，多肽中任意的这类三肽的存在形成了潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列（用于N连接糖基化位点），可方便地实现给抗体加入糖基化位点。

另一类的共价键修饰涉及以化学方法或酶方法将糖苷与抗体偶联。这类操作的优势在于不要求在具有用于N-连接或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生所述抗体。根据所用的偶联模式，糖可以结合于：(a)精氨酸和组氨酸；(b)自由羧基；(c)自由巯基，如半胱氨酸的巯基；(d)自由羟基，如丝氨酸的羟基、苏氨酸的羟基、或羟基脯氨酸的羟基；(e)芳香族残基，如苯丙氨酸的芳香族残基、酪氨酸的芳香族残基、或色氨酸的芳香族残基；或(f)谷胺酰胺的酰胺基。例如，此类方法如WO87/05330所述。

可通过化学方法或酶方法移除抗体中存在的任意的碳水化合物基团。化学去糖基化需要将抗体暴露于三氟甲磺酸化合物中，或等效的化合物中。这种处理可切除除了连接糖（N乙酰葡糖胺或N乙酰半乳糖胺）之外的大部分的或全部的糖，同时保持抗体不受损。Sojahr H等(1987)和Edge,AS等(1981)描述了化学去糖基化。使用Thotakura,NR等(1987)描述的多种内切糖苷酶和外切糖苷酶，可实现抗体中碳水化合物基团的酶切除。

另一类的抗体共价键修饰包括：以美国专利Nos.4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337所示的方式，将抗体与多种非蛋白聚合物（如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯）中的一种连接。

免疫偶联物

本发明涉及含有与抗癌剂（如细胞毒素剂或生长抑制剂）偶联的本发明抗体的免疫偶联物。

本文中“生长抑制剂”是指能够在体外或体内抑制细胞（尤其是卵巢癌细胞）生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括：阻断细胞周期的试剂，如诱导G1阻滞和M期阻滞的试剂。经典的M期阻断剂包括：长春胺（vincas）（长春新碱和长春碱）；紫杉烷；和拓扑异构酶II抑制剂，如多柔比星（doxorubicin），表柔比星（epirubicin），柔红霉素（daunorubicin），依托泊苷（etoposide），以及博来霉素（bleomycin）。这些阻滞G1的试剂还溢出至S期的阻滞，例如，DNA烷化剂，如他莫昔芬（tamoxifen）、***（prednisone）、达卡巴嗪（dacarbazine）、氮芥（mechlorethamine）、顺铂（cisplatin）、甲氨蝶呤（methotrexate）、以及5-氟尿嘧啶。紫杉烷（紫杉醇和多西他赛）都是源于紫杉的抗癌药物。源于欧洲紫杉的多西他赛(

Rhone-Poulenc Rorer)是半合成的紫杉醇(

Bristol-Myers Squibb)的同型物。紫杉醇和多西他赛能够促进微管蛋白二聚体合成微管，并通过阻止可抑制细胞中有丝***的降解来稳定微管。

本文中术语“细胞毒素剂”是指能够抑制或阻碍细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语可包括：放射性同位素（例如：At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、以及Lu的放射性同位素）；化疗剂，如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱（长春新碱、长春碱、依托泊苷）、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；和毒素如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物源的酶活性毒素包括其片段和/或变体，如白树毒素、蓖麻毒素、皂草素；以及多种以下公开的抗肿瘤剂或抗癌剂。其它细胞毒素剂如下文所述。杀肿瘤剂可引起肿瘤细胞的破坏。

可采用多种双功能蛋白偶联剂来制备本发明抗体与细胞毒素剂或生长抑制剂的偶联物，所述多种双功能蛋白偶联剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基（2-二硫吡啶）丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧化物、硫醇亚胺(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物（如二甲基亚氨酸酯HCL）、活性酯（如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯）、醛（如戊二醛）、二叠氮化合物（如二（对叠氮基苯甲酰基）己二胺）、二重氮衍生物（如二（对重氮基苯甲酰基）乙二胺）、二异氰酸酯（如甲苯-2,6二异氰酸酯）、以及双活性含氟化合物（如l,5-二氟-2,4-二硝基苯）。例如可按Vitetta等(1987)所述来制备蓖麻毒素免疫毒素。碳标记的1-异硫氰酸苯甲基甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于偶联放射性核素与抗体的可参照的螯合剂(WO94/11026)。

所述连接体可以是能够促进细胞中细胞毒素剂或生长抑制剂释放的“可剪切连接体”。例如，可采用酸敏性感连接体、肽酶敏感性连接体、光敏感性连接体、二甲基连接体或含双硫的连接体（参见例如美国专利No.5,208,020）。

可选地，可通过重组技术或多肽合成来制备含有抗体和细胞毒素剂或生长抑制剂的融合蛋白。DNA的全长可包括编码偶联物的两个部分的相应区域，所述偶联物的两个部分相互毗邻或被编码不破坏偶联物所需特性的连接体肽的区域所隔开。

通过将抗体与能够将药物前体（例如肽基化疗剂，参见WO81/01145）转化成活性抗癌药物（参见例如WO88/07378和美国专利No.4,975,278）的药物前体活化酶偶联，可将本发明的抗体用于依赖酶介导的药物前体疗法。用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括：以能够将药物前体转化成更有活性的细胞毒素形式的方式活化药物前体的任何的酶。本发明方法可用的酶包括但不限于：用于将含磷酸盐的药物前体转化成自由药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸盐的药物前体转化成自由药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶，如沙雷菌属蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶和组织蛋白酶（如组织蛋白酶B和L），它们可用于将含肽的药物前体转化成自由药物；用于转化含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；切除碳水化合物的酶，如用于将糖基化药物前体转化成自由药物的O-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶；用于将经P-内酰胺衍生的药物转化成自由药物的P-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，如用于将位于其氨基氮上的分别由苯氧乙酰基和苯乙酰基衍生的药物转化成自由药物的青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶。通过本领域公知技术可将酶共价键合到抗体上，例如采用上述的杂合双功能交联剂。

诊断方法和应用

本发明的另一目的涉及本发明抗体在诊断和/和监测与AMHR-II表达相关的癌症上的应用。与AMHR-II表达相关的癌症通常包括卵巢癌。在一个优选实施方式中，本发明抗体可用于诊断包括颗粒细胞肿瘤和上皮卵巢癌在内的卵巢癌。

在一个优选实施方式中，可以使用可检测分子和物质来标记本发明抗体，例如荧光分子，放射性分子和任何其它本领域已知的标记。本领域已知的标记通常提供（或直接或间接的）信号。

本文中关于抗体的术语“标记”可包括：通过将可检测物质如放射性试剂或荧光团（如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚花青素(Cy5)）偶联（即物理偶联）到抗体上而直接标记抗体，以及通过与可检测物质的反应而间接标记抗体。

可通过本领域已知的任何方法用放射性分子标记本发明抗体。例如放射性分子包括但不限于：用于闪烁法研究的放射性原子如I¹²³、1¹²⁴、In¹¹¹、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸。还可以使用用于核磁共振(NMR)成像（也称为磁共振成像，mri）的自旋标记对本发明的抗体进行标记，如碘-123、碘-131、铟-III、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

“生物样品”包括从受试者处获取的并可用于诊断或检测试验的多种样品类型。生物样品包括但不限于：血液和其它生物源液体样品、固体组织样品（如活检标本或组织培养物或由此所得的细胞，及它们的子代）。例如，生物样品包括从疑似患有与AMHR-II表达相关癌症的个体上收集的组织样品中获取的细胞，在一个优选实施方式中是从卵巢中获取的细胞。因此，生物样品包括临床样品、培养的细胞、细胞上清夜、细胞裂解液、血清、血浆、生物流体、以及组织样品。

本发明抗体可用于对与AMHR-II表达相关癌症进行的分期（例如在放射成像中）。例如，本发明抗体可用于对卵巢癌进行分期。它们可单独使用或与其它卵巢癌标志（包括但不限于CAI25、HE4和间皮素）组合使用。

本文中术语“检测”包括有对照或无对照的定性和/或定量检测（测量水平）。

另一方面，本发明是一种通过使用本发明抗体来检测受试者细胞中的AMHR-II以诊断受试者的与AMHR-II表达相关癌症的方法。尤其是，所述诊断方法可包括以下步骤：

（a）在足以使抗体与表达AMHR-II的生物样品的细胞形成复合物的条件下，将可能患有与AMHR-II表达相关癌症的受试者的生物样品与本发明抗体接触；

（b）检测和/或量化所述复合物，由所述复合物的检测来指示与AMHR-II表达相关的癌症。

为检测癌症，可按不同时间周期重复本发明诊断方法，以测定与样品结合的抗体是增加还是减少，由此确定癌症是发展还是消退。

治疗方法和应用

本发明的抗体、片段或免疫偶联物可用于治疗任何与人AMHR-II表达相关的癌症。本发明抗体可单独使用或与任何适宜的试剂组合使用。

已知治疗单克隆抗体可导致产生能够被抗体特异性识别的抗原的细胞的耗尽。可通过至少三种机制来介导这种耗尽：抗体介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性溶胞、以及通过抗体靶向抗原所给出的信号而直接抗肿瘤的抑制肿瘤生长。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指存在补体的靶细胞的溶胞。通过补体***的第一补体和与它们的同源抗原结合的抗体的结合，起始经典补体途径的激活。为评估补体激活，可进行如Gazzano-Santoro等(1997)所述的CDC试验。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指可分泌能够结合到特定的细胞毒性细胞（例如：天然杀伤(NK)细胞，中性白细胞，和巨噬细胞）中存在Fc受体(FcRs)上的抗体的一种细胞毒性，可使这些细胞毒性效应细胞与产生抗原的靶细胞特异地结合，然后杀死靶细胞。为评估兴趣分子的ADCC活性，可进行如美国专利No.5,500,362或5,821,337描述的体外ADCC试验。

在另一实施方式中，本发明抗体可与前述的生长抑制剂、细胞毒性剂、或药物前体活化酶相偶联。本发明抗体确实可用于靶向所述生长抑制剂、细胞毒性剂、或表达AMHR-II肿瘤细胞的药物前体。

从而，本发明的目的涉及一种治疗与AMHR-II表达相关癌症的方法，该方法包括将有效治疗剂量的本发明抗体、片段或免疫偶联物给药至患病受试者。

与人AMHR-II表达相关的癌症通常包括卵巢癌。在一个优选实施方式中，本发明抗体可用于治疗卵巢癌，包括颗粒细胞肿瘤和上皮卵巢癌。

在本发明中，术语“进行治疗”或“治疗”是指预防该术语所涉及的紊乱或病状或该紊乱或病状的一种或多种症状，或反转、减轻、抑制它们的发展。关于本文中术语“治疗卵巢癌”是指抑制卵巢癌细胞的生长。优选地这种治疗还导致肿瘤生长的消退，即可测量肿瘤的尺寸减小。最优选地，这种治疗导致肿瘤的完全消退。

本发明中，术语“患者”或“患病者”是指患有或可能患有与AMHR-II表达相关癌症的人或非人哺乳动物。

对于本发明多肽的“有效治疗剂量”是指在适用任何医药治疗的合理利益/风险比下能够治疗所述癌症的抗体的足够剂量。然而，可以理解的是可由主治医生在正确的医药判断范围内来确定本发明抗体和组合物的日常总量。对于任意特定患者的具体有效治疗剂量的水平将取决于多种因素，包括：被治疗的紊乱和紊乱的严重性；所用特定抗体的活性；患者所用的特定组合物，年龄，体重，一般健康，性别和饮食；所用特定抗体的给药时间，给药途径，以及***率；治疗的持续时间；与所用特定多肽组合使用或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。例如，本领域技术人员公知所述化合物的起始剂量的水平低于实现所需治疗效果所要求的剂量，并逐渐增加剂量直至实现所需效果。

本发明的另一目的涉及本发明的至少一种抗体、片段或免疫偶联物在制备治疗与AMHR-II表达相关癌症的药物中的应用。

本发明的抗体可与任何其它用于治疗卵巢癌的治疗方案（如外部的放射疗法、化学疗法或细胞因子）组合使用。

药物组合物

本发明的多肽、核酸或偶联物可与药用可接受的赋形剂和任选的持续释放基质（如生物可降解聚合物）组合，以形成治疗组合物。

“药用的”或“药用可接受的”是指当被适当地给药至哺乳动物（尤其是人）时，不产生相反的、过敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。药用可接受的载体或赋形剂是指任意类型的无毒固体的、半固体的或液体的填充剂、稀释剂、装胶囊用材料或制剂辅料。

药物组合物的形式、给药途径、剂量和治疗方案基本上取决于患者所治疗的病状、疾病的严重性，年龄，体重，以及性别等。本发明药物组合物可制成局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内给药的制剂等等。

优选地，药物组合物含有用于使制剂能被注射的药用可接受的介质。尤其可以是等渗的、无菌的盐溶液（磷酸一钠或二钠、氯化钠、钾、钙或镁等等或这些盐的混合物），或干燥（特别是冻干）的组合物，可根据情况通过添加无菌水或生理盐水，使它们形成可注射的溶液。

用于给药的剂量可适用于多个参数的函数，尤其是适用于相关病症所用给药模式的函数，或可选的所需治疗持续时间的函数。

为制备所述药物组合物，可将有效剂量的抗体溶解或分散在药用可接受的载体或水性介质中。

用于注射的药物剂型包括：无菌水溶液或分散液；包含芝麻油、花生油、或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。总而言之，所述剂型必须是无菌的且必须是可流动至容易注射的程度。所述剂型在制备和储存条件下必须是稳定的且必须在保存中能够抗微生物（如细菌和真菌）的污染作用。

可在与表面活性剂（如羟丙纤维素）适度混合的水中制备活性化合物，如游离的碱或药用可接受的盐的溶液。也可在甘油、液态聚乙二醇、以及它们的混合物中和在油中制备分散液。在常规的储存和使用条件下，这些药剂含有防腐剂，以防止微生物的生长。

本发明抗体可制成中性的或盐形式的组合物。药用可接受盐包括：酸加成盐（以蛋白的自由氨基形成的）；和以无机酸（如盐酸或磷酸）或有机酸（如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等等）形成的盐。以自由羧基形成的盐还可源于无机碱（如氢氧化钠，钾，铵，钙，或铁）；和有机碱（如异丙胺，三甲胺，组氨酸，普鲁卡因（procaine）等等）。

所述载体也可以是溶剂或分散介质，例如，包括水，乙醇，多元醇（例如，甘油、丙二醇、以及液态聚乙二醇等等），它们的适宜混合物，以及植物油。例如，可通过使用包被物如卵磷脂、当为分散液时则可通过保持所需颗粒大小、以及可通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。通过多种抗菌剂和抗真菌剂（例如对羟苯甲酸，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞（thimerosal）等等）可实现对微生物活性的抑制。在多数情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂（例如单硬脂酸铝和明胶），能够实现可注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的活性化合物和上列的多种其它成分按要求并入至适宜的溶剂中之后过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。通常通过将多种无菌活性成分并入至含有基本分散介质和来自以上所列的必需其它成分的无菌介质中，来制备分散液。如果制备用于无菌可注射溶液的无菌粉末，则优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术能够生产出由前述灭菌过滤溶液生产的活性成分加任选另外的所需成分的粉末。

同时还考虑了用于直接注射的更浓的或高度浓缩的溶液的制备，欲使用DMSO作为溶剂，以实现极快穿透，并将高浓度的活性剂投送至小肿瘤区。

经制剂化后，溶液会以与剂型相符的方式和有效治疗剂量进行给药。所述制剂能以多种剂型如上述的可注射溶液形式容易地给药，但也可采用药物释放胶囊等进行给药。

对于在水溶液中的肠胃外给药，例如如果需要应对该溶液进行适当缓冲，并且首先以足够的盐水或葡萄糖将稀释液体进行等渗。这种特定的水溶液尤其适宜于肠胃外、肌肉内、皮下和腹膜内给药。在这方面，可使用的无菌的水性介质可以是本领域技术人员由现存文献所得知的。例如，一个剂量可溶解在1ml的等渗NaCl溶液中或添加到1000ml的皮下灌注流体中或在预定灌注位点进行注射（参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"15th版,1035-1038和1570-1580页）。必须依据被治疗的受试者的状况来调整剂量。无论如何由负责给药的人来决定单个受试者的适宜剂量。

本发明抗体可按约每剂量含有约0.0001-1.0毫克，或约0.001-0.1毫克，或约0.1-1.0或甚至约10毫克的量而被制剂到治疗混合物中。也可多剂量给药。

除了制成用于肠胃外给药（例如静脉内或肌肉内注射）的化合物之外，其它药用可接受形式包括：例如片剂或用于口服的其它固体剂；定时释放的胶囊；和目前采用的任何其它形式。

在某一实施方式中，考虑使用脂质体和/或纳米粒将所述抗体导入至宿主细胞。所述脂质体和/或纳米粒的制剂和应用是本领域技术人员已知的。

毫超微囊剂（nanocapsule）通常能以稳定和可复制的方式包埋化合物。为避免胞内聚合过载引起的副作用，这类超微颗粒（大小约0.1μm）通常是使用在体内能降解的聚合物来设计的。本发明中使用符合这些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷酯纳米粒，且这种颗粒易于制备。

由分散在水性介质中并自发形成多层包围式双层囊泡（也称作多层脂囊(MLVs)）的磷脂可形成脂质体。MLVs的直径通常是25nm-4μm。超声处理MLVs可形成直径为的核心处含有水性溶液的小型单层囊泡(SUVs)。所述脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和存在的二价阳离子。

试剂盒

最后，本发明还提供了含有至少一种本发明抗体的试剂盒。含有本发明抗体的试剂盒用于检测AMHR-II表达、或者治疗分析或诊断分析。本发明的试剂盒可含有与固体支持物（例如组织培养板或微球（例如琼脂糖微球））偶联的抗体。含有抗体的试剂盒可用于AMHR-II的体外检测和定量，例如ELISA或蛋白质印迹。用于检测的抗体可以具有标记（如荧光或放射性标记）。

将通过以下附图和实施例进一步阐述本发明。

附图说明

图1显示了使用与给定的VH或Vκ基因家族对应的适宜的恒定引物和信号引物组合得到的mAb12G4的(A)VH和(B)Vκ链区的PCR扩增产物。有效的引物对能够扩增出VH扩增的450bp的产物以及Vκ扩增的390bp的产物。

图2显示了mAb12G4的VL区的核酸序列和氨基酸序列。

图3显示了mAb12G4的VH区的核酸序列和氨基酸序列。

图4显示了在稳定转染的COV434-pIRES-EGFP-AMHR-II1F3细胞株中HER2表达（灰色线）和AMHR-II表达（黑色线）的流式细胞计数分析。

图5显示了由MTS试验测量的mAb12G4、非特异性mAb35A7和抗HER2曲妥珠单抗（trastuzumab）和FRP5mAbs对COV434-pIRES-EGFP-AMHR-II1F3细胞株的体外抗增殖效应。

图6显示了在无胸腺模式的小鼠中mAb12G4对COV434-AMHRII-1F3异种移植物生长的体内效应的初步研究。肿瘤达到1200mm³的确定体积所需时间的卡普兰-迈耶曲线（Kaplan-Meier curves）。

图7显示了在COV434-AMHRII-1F3异种移植物中AMHR-II表达的蛋白质印迹分析。

具体实施方式

实施例1

A-材料与方法

小鼠杂交瘤的VH和Vκ基因的cDNA合成和PCR扩增：使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)按生产商说明从5×10⁶个12G4杂交瘤细胞中提取总RNA。提取后，取出小部分总RNA制备物，以测定样品质量和总RNA的产量。通过UV光谱进行对照以检验RNA浓度和纯度。使用Agilent RNA6000Nano LabChipa试剂盒和Agilent2100生物分析仪(Agilent Technologies,PaloAlto,CA)分析总RNA谱，以测定它的量和完整性。使用用于RT-PCR的Superscript第一条链合成***(Invitrogen life Technologies)按生产商的说明，用280ng(1μl)总RNA合成cDNA。采用Oligo(dT)起始第一链cDNA的合成反应，以与3'Poly(A)尾杂交。将cDNA保持在-20℃备用。

在含1μl的cDNA合成反应物、10μM的dNTPs、2μl的10×PCR缓冲液(New England Biolabs,Beverly,MA,USA)的20μl终体积中，进行PCR扩增。分别使用每组族特异性的5'引物和适宜的与3'-寡核苷酸探针匹配的轻链或重链恒定区RevC/cSall和RevC/Sall引物，进行14VH和18Vκ的PCR反应。所用的引物如Chardes等(1999)（参见参考文献的表1和2）所述。

还制备了含有所有VH或Vκ的5'引物的两种混合物。用VH13(3609N)基因家族的特异性引物不发生PCR反应，因为属于该家族的唯一公开成员是PC3609的无功能等位基因。每种引物的起始用量为10pM。反应混合物在94℃加热5分钟，然后添加2U的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)并于94℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟下扩增30个循环。72℃延长10分钟后，通过1.5％的琼脂糖凝胶和SYBR Green染色分离PCR产物。从该家族特异性PCR的筛查中选择由5'引物和3'引物对形成的390bp的Vκ的PCR扩增产物和450bp的VH的PCR扩增产物。将使用相同选择引物的五次复制物进行如上所述的新PCR。在1.5％的低熔点琼脂糖凝胶(Gibco)中凝胶纯化PCR扩增DNA产物。

扩增的V基因的直接核苷酸测序：使用MWG Biotech(

Germany)的标准测序反应读值服务器，对500ng的每种PCR产物进行直接测序。

B-结果

对来自任意免疫球蛋白基因家族（Strohal et al.1987）的小鼠可变区使用扩增和直接测序的高效方法，测定mAb12G4的VH区和VL区的序列。简而言之，根据氨基酸和/或核苷酸序列的相似性，将鼠V基因分类成15VH和18Vκ基因家族。在可能扩增所有V基因家族的免疫球蛋白(Ig)基因的尝试中，Strohal等已确定可与每个重链和轻链基因家族的相对保守信号序列杂交的两组原始前导引物。这些引物已被常用于他们的实验室，以用于九个鼠单克隆抗体(mAbs)可变区全长的扩增和直接测序，包括属于7个不同Vκ和5个不同VH基因家族的域。他们的策略实现了任意Ig基因家族可变区的快速和准确的测序，并可促进临床感兴趣的嵌合抗体的设计。

总RNA的分析：使用Agilent RNA6000Nano LabChipa试剂盒和Agilent2100生物分析仪，分析了总RNA谱以测定它的量和完整性。

使用基因家族特异的信号引物对小鼠杂交瘤12G4的V基因进行的PCR扩增：图1显示了使用与给定VH或Vκ基因家族对应的适宜恒定引物和信号引物组合得到的mAb12G4的(A)VH和(B)Vκ链区的PCR扩增产物。有效的引物对可扩增450bp的VH扩增产物和390bp的Vκ扩增产物。从分泌抗AMHR-II mAb12G4(lgG1/κ)的杂交瘤细胞cDNA中，获得了预期大小的主要条带（图1）：

-以VH1-J558/RevCγSall引物对用于重链的扩增。引物VH9(VGam3-8)、VH10、VH11、VH12、VH14和VH15未获得扩增。

-以Vκ4/5/RevCκSall或Vκ21/RevCκSall引物对用于Vκ的扩增。

按照扩增产物直接测序的mAb12G4可变区的基因表征：通过扩增产物的直接测序对组合基因的进一步分析表明了VH基因属于主要的VH基因家族(VH1)。Vκ4/5基因家族被确定是编码Vκ12G4的基因家族。以Vκ21引物扩增的VκPCR产物与在骨髓瘤细胞株（如源于原始MOPC21肿瘤的NS1(Chardes et al.1999)）中转录的无功能重排κ轻链相对应。在每个基因家族中，使用IMGT数据库由经测序的可变区鉴别出最接近的种系基因。

实施例2

A-材料

单克隆抗体：

抗AMHR-II的mAb12G4：以在细菌中表达并以His标签融合蛋白形式纯化(Gouedard L.et al.,2000)的人AMHR-II(ECD-hAMHR-II)重组胞外域作为抗原。3周内进行四次腹腔注射，以溶于完全弗氏佐剂(Sigma)的20μg蛋白进行首次注射，以溶于不完全弗氏佐剂(Sigma)的蛋白进行后续的注射，以使免疫BALB/c小鼠产生小鼠杂交瘤。第四次免疫后的3周，以ECD-hAMHR-II进行静脉内加强注射。三天之后，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株P3-X63-Ag.8.653融合。使用ECD-hAMHR-II通过ELISA筛选新产生克隆的上清液。通过荧光活化细胞分选法(FACs)，证实在AMHR-II阳性细胞中上清液的hAMHR-II的特异性。

抗HER2的MAbs：使用鼠mAb FRP5(Harweth I.et al.,1992)和人源化的曲妥珠单抗

曲妥珠单抗

从Genentech,Inc.(SanFrancisco,CA,USA)购买。

使用MAbs作为对照：在对照实验中，以抗CEA的单克隆抗体35A7（CEA Gold2表位特异性的,(Haskell C.et al.1983;Hammarstrom S.et al.,1989）和PX（从小鼠骨髓瘤P3-X63纯化的正常小鼠IgG1(

G.1975)）作为不相关抗体。通过硫酸铵沉淀（4℃的45％饱和度）然后在DE52纤维素中的离子交换层析(Whatman,Balston,United Kingdom)，从小鼠杂交瘤腹水中纯化出所有的鼠IgG1MAbs。

细胞株和培养条件：人颗粒肿瘤细胞株COV434是由Van DenBerg-Bakker(van den Berg-Bakker C.et al.,1993)课题组购买得到的。为获得AMHR-II阳性转染的COV434-AMHR-II1F3细胞株，使用pIRES-EGFP载体（FuGENE6转染试剂盒，Roche Diagnostics）以人AMHR-II编码cDNA稳定转染GCT肿瘤细胞株COV434，然后亚克隆COV434-AMHR-II1F3细胞株。

所有细胞株在含10%的热灭活胎牛血清、链霉素(0.1mg/mL)、青霉素(0.1IU/mL)和两性霉素B(0.25μg/mL)的DMEM F12培养液中生长。细胞在5%CO₂气氛中37℃下生长和每周更换两次培养液。使用胰岛素(0.5mg/mL)EDTA(0.2mg/mL)采集细胞。所有的培养液添加物都是从Life Technologies,Inc.(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)购买。对于转染细胞，在培养液中添加了庆大霉素(0.67%)。

B-方法与结果

体外和体内研究COV434-AMHR-II1F3细胞株的流式细胞计数分析：分别使用鼠抗AMHR-II(12G4)和抗HER2(FRP5)的抗体通过流式细胞计数(FACs)分析COV434-AMHR-II1F3。洗涤之后，添加偶联FITC的抗小鼠单克隆抗体(Sigma Aldrich)，以检测一抗（primary antibodies）。直接温育具有二抗（secondary antibodies）的细胞作为背景测量。在FACScan II(BectonDickinson,Mountain View,CA,USA)中通过观察20000最小值来分析样品。以野生型(wt)COV434细胞株作为阴性对照（图4）。通过这些技术，使用QIFIKIT(Dako,Danemark)，可估算出约10⁴个AMHR-II受体/细胞和10³个HER2受体/细胞的表达率。

COV434-AMHR-II-1F3转染细胞株中mAb12G4内化的免疫荧光研究：使用免疫荧光法可显现在COV434-AMHRII-1F3细胞中内化抗体的能力。在每个实验中，在置于35-mm有盖培养皿中的22-mm方形玻璃盖玻片上，以使用RPMI培养5.10⁴个细胞。两天后，在对数生长期间，于4°C（非内化条件下）或转移至37℃温育箱(内化条件)中，以在PBS-BSA(1mg/mL)中的10μg/mL抗体（或不相关mAb(PX)、抗AMHR-II(12G4)、抗HER2(FRP5)或无抗体）温育细胞。180分钟时，去除上清液，以PBS-BSA洗涤细胞两次，PBS洗涤一次。在***（3.7%在PBS的p甲醛）中温育20分钟后，在-20℃丙酮中将细胞渗透30秒。通过增加的PBS体积持续稀释溶液。以PBS-BSA洗涤细胞两次，并在避光处以在PBS-BSA中的FITC标记羊抗鼠Ig F(ab')2(Silenus,Eurobio,France)片段温育1小时。然后将其用PBS-BSA洗涤三次，以PBS洗涤一次，再与50μl的4,6二脒（diaminido）-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI,Sigma,Chemical Co.)温育15分钟，并制备以用于荧光显微观察。

已经证实在37℃时抗AMHR-II12G4和抗HER2FRP5的抗体可内化到细胞中而PX则不能。实际上，在细胞的细胞质中可清晰地观察到荧光囊泡。因此，也将MAbs在4℃温育。已知在这个低温下可抑制所有主动运输途径，甚至在4℃可观察到两种特异性抗体的更强的膜标记。在细胞内未发现这些特异性抗体，尽管观察到了强的膜结合。

mAb12G4的体外抗增殖效应(MTS试验)：使用四唑盐(MTS)和电子偶联试剂(PMS)可评估曲妥珠单抗、12G4、FRP5或35A7对细胞活力的影响。简而言之，按100μl的培养液中5000个细胞/孔，将COV434-AMHR-II-1F3细胞置于96孔微孔板中。24小时后，以浓度范围为0.1-1μg/μl的抗体处理细胞。温育96小时之后，将细胞与MTS（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑）试剂接触，并在37℃温育2小时。测量490nm处的吸收，以增殖细胞与未处理培养液的百分比来计算活力抑制百分比。所有实验都重复三次。

结果表明使用1μg/μl的mAb12G4或曲妥珠单抗可观察到约20％的活力抑制百分比，而使用相同浓度的抗CEA35A7mAb则观察不到抑制（图5）。以曲妥珠单抗作为阳性对照，因为它的抗增殖效应已被广泛证实。

体内初步肿瘤生长抑制的研究：所有体内实验都按照实验动物研究的法文指南（协议号No.B34-172-27）进行操作。从Harlan(Gannat，法国)购买的裸鼠，6-8周雌性无胸腺裸鼠。将COV434-AMHRII-1F3(10.106)细胞悬浮在50％培养液和50％Matrigel（BD biosciences，Le Pont De Claix，法国）中，并皮下注射(s.c.)到无胸腺裸鼠的右侧肋腹。当肿瘤达到大约相同体积时，将生长肿瘤的小鼠随机分成不同组。通过腹腔内注射(i.p.)0.9%的NaCl或mAb12G4处理小鼠。每种mAb的注射量是每次注射200μg，一周两次，连续五周。

以测径器每周测量肿瘤尺寸，并通过D1×D2×D3/2式计算体积。

以肿瘤达到1200mm³确定体积所需的时间修正的卡普兰-迈耶存活曲线来表示结果（图6）。中间延迟被定义为有50％小鼠肿瘤达到确定体积的时间且与对照NaCl组相比显示了处理组的中间延迟是更长的14天。

异种移植物中AMHR-II表达的免疫印迹分析：以RIPA缓冲液（50mMTris-HCI,pH7.4,150mM NaCI,1%脱氧胆酸盐,1%NP40,2mM EDTA,0.1%SDS和1mM苯甲磺酰基氟化物）复苏，并溶解了来自异种移植物肿瘤的细胞。在还原条件下10%的SDS-PAGE中电泳之后，蛋白被转移至以含5％脱脂奶粉的PBS饱和的聚偏氟乙烯膜(Millipore Co.,Bedford,MA)上，然后以抗AMHR-II12G4的抗体温育。

在切除肿瘤的三个不同部位都强烈地表达了AMHR-II且在65kDa处泳动（图7）。

参考文献

Baarends WM,Hoogerbrugge JW,Post M,Visser JA,De Rooij DG,Parvinen M,Themmen AP,Grootegoed JA Anti-mullerian hormone and anti-mullerian hormone type11receptor messenger ribonucleic acid expressionduring postnatal testis development and in the adult testis of the rat.Endocrinology.1995Dec;136(12):5614-22.

Baarends WM,van Helmond MJ,Post M,van der Schoot PJ,HoogerbruggeJW,de Winter JP,Uilenbroek JT,Karels B,Wilming LG,Meijers JH,et al.Anovel member of the transmembrane serine/threonine kinase receptor family isspecifically expressed in the gonads and in mesenchymal cells adjacent to themullerian duct.Development.1994Jan;120(1):189-97.

Behringer RR,Cate RL,Froelick GJ,Palmiter RD,Brinster RL.Abnormalsexual development in transgenic mice chronically expressing mullerianinhibiting substance.Nature.1990May10;345(6271):167-70.

Belville C,Josso N,Picard JY.Persistence of Mullerian derivatives in males.Am J Med Genet.1999Dec29;89(4):218-23.

Berek JS,Taylor PT,Gordon A,Cunningham MJ Finkler N,Orr J Jr,RivkinS,Schultes BC Whiteside TL Nicodemus CF.Randomized,placebo-controlledstudy of oregovomab for consolidation of clinical remission in patients withadvanced ovarian cancer.J Clin Oncol.2004Sep1;22(17):3507-16.

Black RJ,Bray F,Ferlay J,Parkin DM.Cancer incidence and mortality inthe European Union:cancer registry data and estimates of national incidence for1990.Eur J Cancer.1997Jun;33(7):1075-107.

Brady G,Jantzen HM,Bernard HU,Brown R,Schutz G Hashimoto-Gotoh T.New cosmid vectors developed for eukaryotic DNA cloning.Gene.1984Feb;27(2):223-32.

Caron PC Laird W,Co MS Avdalovic NM Queen C,Scheinberg DA.Engineered humanized dimeric forms of IgG are more effective antibodies.J ExpMed.1992Oct1;176(4):1191-5.

Chardes T,Villard S,Ferrieres G,Piechaczyk M,Cerutti M,Devaucheile G,Pau B.Efficient amplification and direct sequencing of mouse variable regionsfrom any immunoglobulin gene family.FEBS Lett.1999Jun11;452(3):386-94.

Connolly DC,Bao R,Nikitin AY,Stephens KC,Poole TW,Hua X,HarrisSS1Vanderhyden BC,Hamilton TC.Female mice chimeric for expression of thesimian virus40TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelialovarian cancer.Cancer Res.2003Mar15;63(6):1389-97.

di Clemente N,Wilson C,Faure E,Boussin L,Carmillo P,Tizard R,PicardJY,Vigier B,Josso N,Cate R.Cloning,expression,and alternative splicing of thereceptor for anti-Mullerian hormone.MoI Endocrinol.1994Aug;8(8):1006-20.

Dutertre M,Gouedard L,Xavier F,Long WQ,di Clemente N,Picard JY,Rey R.Ovarian granulosa cell tumors express a functional membrane receptor foranti-Mullerian hormone in transgenic mice.Endocrinology.2001Sep;142(9):4040-6.

Dutertre M,Rey R,Porteu A,Josso N,Picard JY.A mouse Sertoli cell lineexpressing anti-Mullerian hormone and its type Il receptor.MoI Cell Endocrinol.1997Dec31;136(1):57-65.

Edge AS,Faltynek CR,Hof L,Reichert LE Jr,Weber P.Deglycosylation ofglycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid.Anal Biochem.1981Nov15;118(1):131-7.

Gazzano-Santoro H,Ralph P,Ryskamp TC,Chen AB,Mukku VR.Anonradioactive complement-dependent cytotoxicity assay for anti-CD20monoclonal antibody.J Immunol Methods.1997Mar28;202(2):163-71.

Gillies SD,Morrison SL,Oi VT,Tonegawa S.A tissue-specific transcriptionenhancer element is located in the major intron of a rearranged immunoglobulinheavy chain gene.Cell.1983Jul;33(3):717-28.

Gordon AN,Schultes BC,Gallion H,Edwards R,Whiteside TL Cermak JM,Nicodemus CF.CA125-and tumor-specific T-cell responses correlate withprolonged survival in oregovomab-treated recurrent ovarian cancer patients.Gynecol Oncol.2004Aug;94(2):340-51.

Gouedard,L.,Chen,Y.G.,Thevenet,L.,Racine,C,Borie,S.,Lamarre,I.,Josso,N.,Massague,J.,and di Clemente,N.(2000)J Biol Chem275,27973-27978.

Hammarstrom,S.,Shively,J.E.,Paxton,R.J.,Beatty,B.G.,Larson,A.,Ghosh,R.,Bormer,O.,Buchegger,F.,Mach,J.-P.,Burtin,P.,Seguin,P.,Darbouret,B.,Degorce,F.,Sertour,J.,JoIu,J.-P.,Fuks,A.,Kalthoff,H.,Schmiegel,W.,Arndt,R.,Kloppel,G.,von Kleist,S.,Grunert,F.,Schwarz,K.,Matsuoka,Y.,Kuroki,M.,Wagener,C,Weber,T.,Yachi,A.,Imai,K.,Hishikawa,N.,and Tsujisaki,M.(1989)Cancer Res49,4852-4858.

Harwerth,I.M.,WeIs,W.,Marte,B.M.,and Hynes,N.E.(1992)J.BiolChem.267,15160-15167.

Haskell,C.M.,Buchegger,F.,Schreyer,M.,Carrel,S.,and Mach,J.-P.(1983)Cancer Res43,3857-3864.lmbeaud S,Faure E,Lamarre I,Mattei MG,diClemente N,Tizard R,Carre-Eusebe D,Belville C,Tragethon L,Tonkin C1Nelson J,McAuliffe M,Bidart JM,Lababidi A,Josso N,Cate RL,Picard JY.Insensitivity to anti-mullerian hormone due to a mutation in the humananti-mullerian hormone receptor.Nat Genet.1995Dec;11(4):382-8.

Kohler G.,M.C.(1975)Nature256,495-497.

Kuwana Y,Asakura Y,Utsunomiya N,Nakanishi M,Arata Y,ltoh S,NagaseF,Kurosawa Y.Expression of chimeric receptor composed ofimmunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived C regions.Biochem Biophys Res Commun.1987Dec31;149(3):960-8.

Lee MM,Seah CC,Masiakos PT,Sottas CM,Preffer FI,Donahoe PK,Maclaughlin DT,Hardy MP.Mullerian-inhibiting substance type II receptorexpression and function in purified rat Leydig cells.Endocrinology.1999Jun;140(6):2819-27.

Masiakos PT,MacLaughlin DT,Maheswaran S,Teixeira J Fuller AF Jr,Shah PC,Kehas DJ,Kenneally MK1Dombkowski DM,Ha TU Preffer FIDonahoe PK.Human ovarian cancer,cell lines,and primary ascites cells expressthe human Mullerian inhibiting substance(MIS)type II receptor,bind,and areresponsive to MIS.Clin Cancer Res.1999Nov;5(11):3488-99.

Mason JO,Williams GT,Neuberger MS.Transcription cell type specificityis conferred by an immunoglobulin VH gene promoter that includes a functionalconsensus sequence.Cell.1985Jun;41(2):479-87.

Miyaji H Mizukami T,Hosoi S,Sato S,Fujiyoshi N,Itoh S.Expression ofhuman beta-interferon in Namalwa KJM-1which was adapted to serum-freemedium.Cytotechnology.1990Mar;3(2):133-40.

Mizukami T,ltoh S.A new SV40-based vector developed for cDNAexpression in animal cells.J Biochem(Tokyo).1987May;101(5):1307-10.

Morrison SL,Johnson MJ,Herzenberg LA,Oi VT.Chimeric humanantibody molecules:mouse antigen-binding domains with human constant regiondomains.Proc Natl Acad Sci U S A.1984Nov;81(21):6851-5.

Neuberger MS,Williams GT,Fox RO.Recombinant antibodies possessingnovel effector functions.Nature.1984Dec13-19;312(5995):604-8.

O'Hare K,Benoist C,Breathnach R.Transformation of mouse fibroblasts tomethotrexate resistance by a recombinant plasmid expressing a prokaryoticdihydrofolate reductase.Proc Natl Acad Sci U S A.1981Mar;78(3):1527-31.

Ozols RF,Bookman MA,Connolly DC,Daly MB,Godwin AK,Schilder RJ,Xu X,Hamilton TC.Focus on epithelial ovarian cancer.Cancer Cell.2004Jan;5(1):19-24.

Padlan EA.A possible procedure for reducing the immunogenicity ofantibody variable domains while preserving their ligand-binding properties.MoIImmunol.1991Apr-May;28(4-5):489-98.

Racine C,Rey R,Forest MG,Louis F,Ferre A,Huhtaniemi I,Josso N,diClemente N.Receptors for anti-mullerian hormone on Leydig cells areresponsible for its effects on steroidogenesis and cell differentiation.Proc NatlAcad Sci U S A.1998Jan20;95(2):594-9.

Rapkiewicz AV,Espina V,Petricoin EF3rd,Liotta LA.Biomarkers ofovarian tumours.Eur J Cancer.2004Nov;40(17):2604-12.

Riechmann L,Clark M,Waldmann H,Winter G Reshaping humanantibodies for therapy.Nature.1988Mar24;332(6162):323-7.

Roguska MA,Pedersen JT,Keddy CA,Henry AH,Searle SJ,Lambert JM,Goldmacher VS,Blattler WA,Rees AR,Guild BC.Humanization of murinemonoclonal antibodies through variable domain resurfacing.Proc Natl Acad SciUSA.1994Feb1;91(3):969-73.

Salhi I,Cambon-Roques S,Lamarre I,Laune D,Molina F,Pugniere M,Pourquier D,Gutowski M,Picard JY,Xavier F,Pelegrin A,Navarro-Teulon I.The anti-Mullerian hormone type II receptor:insights into the binding domainsrecognized by a monoclonal antibody and the natural ligand.Biochem J.2004May1;379(Pt3):785-93.

Segev DL,Ha TU,Tran TT,Kenneally M,Harkin P,Jung M,MacLaughlinDT,Donahoe PK,Maheswaran S.Mullerian inhibiting substance inhibits breastcancer cell growth through an NFkappa B-mediated pathway.J Biol Chem.2000Sep15;275(37):28371-9.

Segev DL,Hoshiya Y,Hoshiya M,Tran TT,Carey JL,Stephen AE,MacLaughlin DT,Donahoe PK,Maheswaran S.Mullerian-inhibiting substanceregulates NF-kappa B signaling in the prostate in vitro and in vivo.Proc NatlAcad Sci U S A.2002Jan8;99(1):239-44.Epub2002Jan2.

Shitara K,Nakamura K,Tokutake-Tanaka Y,Fukushima M,Hanai N.A newvector for the high level expression of chimeric antibodies in myeloma cells.JImmunol Methods.1994Jan3;167(1-2):271-8.

Shopes B.A genetically engineered human IgG mutant with enhancedcytolytic activity.J Immunol.1992May1;148(9):2918-22.

Singh-Ranger G,Sharp A,Crinnion JN.Recurrence of granulosa cell tumourafter thirty years with small bowel obstruction,Int Semin Surg Oncol.2004May11;1(1):4.

Strohal R,Kroemer G,Wick G,Kofler R.Complete variable region sequenceof a nonfunctionally rearranged kappa light chain transcribed in the nonsecretorP3-X63-Ag8.653myeloma cell line.Nucleic Acids Res.1987Mar25;15(6):2771.

Studnicka GM,Soares S,Better M,Williams RE,Nadell R,Horwitz AH.Human-engineered monoclonal antibodies retain full specific binding activity bypreserving non-CDR complementarity-modulating residues.Protein Eng.1994Jun;7(6):805-14.

Teixeira J,Donahoe PK.Molecular biology of MIS and its receptors.JAndrol.1996Jul-Aug;17(4):336-41.

Thotakura NR,Bahl OP.Enzymatic deglycosylation of glycoproteins.Methods Enzymol.1987;138:350-9.

Tsuji M,Shima H,Yonemura CY,Brody J,Donahoe PK,Cunha GR.Effectof human recombinant mullerian inhibiting substance on isolated epithelial andmesenchymal cells during mullerian duct regression in the rat.Endocrinology.1992Sep;131(3):1481-8.

Urlaub G,Chasin LA.Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient indihydrofolate reductase activity.Proc Natl Acad Sci U S A.1980Jul;77(7):4216-20.

van den Berg-Bakker,C.A.,Hagemeijer,A.,Franken-Postma,E.M.,Smit,V.T.,Kuppen,P.J.,van Ravenswaay Claasen,H.H.,Comelisse,C.J.,andSchrier,P.I.(1993)lnt J Cancer53,613-620.

Vitetta ES,Fulton RJ,May RD,Till M,Uhr JW.Redesigning nature'spoisons to create anti-tumor reagents.Science.1987Nov20;238(4830):1098-104.

Yahata H,Kobayashi H,Kamura T,Amada S,Hirakawa T,Kohno K,Kuwano M,Nakano H.Increased nuclear localization of transcription factorYB-1in acquired cisplatin-resistant ovarian cancer.J Cancer Res Clin Oncol.2002Nov;128(11):621-6.Epub2002Oct22.

Yuan QA,Simmons HH,Robinson MK,Russeva M,Marasco WA,AdamsGP.Development of engineered antibodies specific for the Mullerian inhibitingsubstance type II receptor:a promising candidate for targeted therapy of ovariancancer.MoI Cancer Ther.2006Aug;5(8):2096-105.

Zhang H,Vollmer M,De Geyter M,Litzistorf Y,Ladewig A,DurrenbergerM,Guggenheim R,Miny P,Holzgreve W,De Geyter C.Characterization of animmortalized human granulosa cell line(COV434).MoI Hum Reprod.2000Feb;6(2):146-53.

Claims (25)

1.一种免疫球蛋白的重链和/或轻链，其中，该重链和/或轻链的可变区包括至少一个具有选自由CDR-1的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6、CDR-2的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7、以及CDR-3的SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:8所组成的组中的序列的CDR。

2.如权利要求1所述的免疫球蛋白的重链和/或轻链，其中，所述可变区包括：

至少一个具有选自由CDR-1的SEQ ID NO:2、CDR-2的SEQ ID NO:3、以及CDR-3的SEQ ID NO:4所组成的组中的序列的CDR；或

至少一个具有选自CDR-1的SEQ ID NO:6、CDR-2的SEQ ID NO:7、以及CDR-3的SEQ ID NO:8所组成的组中的序列的CDR。

3.如权利要求1或2所述的免疫球蛋白的重链和/或轻链，其中，所述可变区包括：

CDR-1的SEQ ID NO:2、CDR-2的SEQ ID NO:3、以及CDR-3的SEQ IDNO:4；或

CDR-1的SEQ ID NO:6、CDR-2的SEQ ID NO:7、以及CDR-3的SEQ IDNO:8。

4.如权利要求1-3中的任意一项所述的免疫球蛋白的重链和/或轻链，其中，该重链和/或轻链包括具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的可变区。

5.如权利要求1-4中的任意一项所述的免疫球蛋白链，其中，该免疫球蛋白链是重链。

6.如权利要求1-4中的任意一项所述的免疫球蛋白链，其中，该免疫球蛋白链是轻链。

7.一种对人抗苗勒激素受体II型受体AMHR-II具有特异性的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体包括：

（a）权利要求5中所述的重链，和/或

（b）权利要求6中所述的轻链。

8.如权利要求7所述的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体包括：

（a）权利要求5中所述的重链，和

（b）权利要求6中所述的轻链。

9.如权利要求7或8所述的单克隆抗体，其中，所述抗体是鼠抗体。

10.如权利要求9所述的单克隆抗体，其中，所述抗体能够从CNCM保藏号为I-3673的杂交瘤中获得。

11.如权利要求7或8所述的单克隆抗体，其中，所述抗体是小鼠/人的嵌合抗体。

12.如权利要求7或8所述的单克隆抗体，其中，所述抗体是人源化抗体。

13.权利要求7-12中的任意一项所述的单克隆抗体的片段。

14.如权利要求13所述的片段，其中，该片段选自由Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2、以及双体片段所组成的组中。

15.一种核酸，其中，该核酸含有编码权利要求7-12中的任意一项所述的单克隆抗体或权利要求13或14所述的片段的序列。

16.一种载体，其中，该载体包括权利要求15所述的核酸。

17.一种宿主细胞，其中，该宿主细胞被权利要求15所述的核酸和/或权利要求16所述的载体转化。

18.如权利要求17所述的宿主细胞，其中，所述细胞是能够由ATCC获得的保藏号为CRL1662的YB2/0细胞。

19.一种制备如权利要求7-12中的任意一项所述的抗体或权利要求13或14所述的片段的方法，其中，该方法包括以下步骤：(i)在适于使所述抗体表达的条件下培养权利要求17或18中所述的转化的宿主细胞；和(ii)回收表达的抗体。

20.一种药物组合物，其中，该药物组合物含有：权利要求7-12中的任意一项所述的抗体、和/或权利要求13或14所述的片段，或权利要求15所述的核酸、和/或权利要求16所述的载体、和/或权利要求17或18所述的宿主细胞；以及药用可接受的载体。

21.一种免疫偶联物，其中，该免疫偶联物含有与抗癌剂偶联的权利要求7-12中的任意一项所述的抗体或权利要求13或14所述的片段。

22.如权利要求21所述的免疫偶联物，其中，所述抗癌剂是细胞毒性剂或生长抑制剂。

23.标记有可检测分子或物质的权利要求7-12中的任意一项所述的抗体和/或权利要求13或14所述的片段。

24.权利要求7-12中的任意一项所述的抗体、或权利要求13或14所述的片段、或权利要求21或22所述的免疫偶联物在制备用于治疗卵巢癌的药物中的应用。

25.权利要求7-12和23中的任意一项所述的抗体或权利要求13、14或23所述的片段在诊断和/或监测卵巢癌中的应用。

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