JP2023111899A - 短葯形質を有するイネ、及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】短葯形質を有するイネの製造方法等を提供すること。【解決手段】イネの、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、短葯形質を有するイネの製造方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、短葯形質を有するイネ、及びその製造方法に関する。

イネは、基本的に高頻度で自家受粉する植物であるものの、開花後に花粉を外部にも飛散させるため、低頻度ながら他家受粉もすることが知られている。

そのため、生産者や消費者の中には、遺伝子組換え作物が周辺の一般栽培作物に交雑・混入することについて強い懸念があり、遺伝子組換え作物を実用化する上で大きな障害となっている。花粉の飛散による周辺の野生植物や同種作物との交雑を防止するためには、栽培距離の確保、開花時期が重ならないような栽培時期の調整、摘花、除雄、花への袋がけ、防風ネットの設置等が行われるが、いずれの場合も多大な労力を要する。

また、水稲の種子生産現場においても異品種混入が大きな問題となっており、自然交雑により発生した異株の発見・抜き取り作業に多くの労力を要している。これは、高齢化が進み人手不足である水稲種子生産農家にとって大きな負担となる。

以上のことから、労力をかけずに交雑を抑制する方法等が求められており、このような方法として、例えば、開花せずに受粉する形質を有するイネ（閉花受粉性イネ）の利用が考えられている。閉花受粉性を有する水稲品種等のイネが実用化出来れば、品種の純度維持がより低コストで可能となり、種子生産の持続的かつ安定的維持に寄与できることが期待される。

かかる背景の下、開花に関与する器官である鱗被の形成不全によって、閉花受粉性を有する突然変異体ｓｐｗ１－ｃｌｓ１の実用化が試みられている（特許文献１）。しかしながら、当該突然変異体は、低温下では穎花形成時期に開花することが明らかにされており、新たな交雑抑制技術の開発が望まれている。

この点に関し、ｓａｎ－１（ｓｈｏｒｔ ａｎｔｈｅｒ）は、Ｔ６５を原品種として、化学変異源物質によって誘発された突然変異体であり、葯長が、野生型に比べて約３０％減少する短葯性を示す（非特許文献１）。そして、かかる葯の短さ故、葯が頴から抽出し難く、また花粉も飛散し難いため、新たな交雑抑制技術としての利用が期待される。

しかながら、この突然変異体の表現型に関与する原因遺伝子は未だ同定されていない。そのため、Ｔ６５以外の品種において、かかる短葯形質を有する系統を作出すること、ひいては当該系統を利用して交雑を抑制することは困難であった。

特開２００７－３００８７６号公報

科学研究費助成事業 ２０１６年度 研究成果報告書、研究代表者 吉田 均、研究課題名：イネの花器官サイズの制御機構の解明、公開日：２０１８年３月２２日

本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、ｓａｎ－１における短葯形質に関与する原因遺伝子を同定し、当該遺伝子を標的とする短葯形質を有するイネの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、短葯形質を有するイネの突然変異体 ｓａｎ－１とイネ品種カサラスを交配し、Ｆ２集団を用いたマップベースクローニングを行った。その結果、原因遺伝子は第５染色体上のマーカーＲＭ１８６３９とＲＭ６８４１の間に存在すると予想された。さらに候補領域を絞り込んだ結果、候補領域はマーカーＩＲＩＣ１１とＲＭ１８７１９の間に存在すると予想された。この候補領域内にはＲＡＰ－ＤＢデータベース上に２０遺伝子も存在していた。次に、遺伝子配列を比較したところ、ｓａｎ－１において、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて２３６番目のグアニンがアデニンに置換することにより、未成熟終始コドンが生じていることを見出した。

そこで、当該候補遺伝子（配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）内の第１エキソンにおいて、異なる２箇所にガイドＲＮＡを設計し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法でのゲノム編集を用いてフレームシフト変異を引き起こした。さらに、第２エキソンにおいても、ゲノム編集を用いてフレームシフト変異を引き起こした。その結果、いずれのガイドＲＮＡを用いた場合においてもｓａｎ－１と同様の短葯性を示したため、当該遺伝子がｓａｎ－１における短葯形質に関与する原因遺伝子であることが遂に明らかとなり、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は以下を提供するものである。
＜１＞ 短葯形質を有するイネの製造方法であって、
イネの、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
＜２＞ 下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するイネ
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。

本発明によれば、短葯形質を有するイネを製造することが可能となる。当該イネは、その短葯故、葯が頴から抽出し難く、また花粉も飛散し難い。そのため、他のイネ等との交雑を抑制することも可能となる。

イネ突然変異体ｓａｎ－１は短葯形質を有することを示す図である。図中、（Ａ）は、野生型（Ｔ６５）及びｓａｎ－１に関し、外穎を取り除いた穎花を各々観察した結果を示す写真である。（Ｂ）は、野生型と比較してｓａｎ－１は、葯長が３０％程短縮していることを示すグラフである。（Ｃ）は、内穎長においては、野生型とｓａｎ－１とで有意な差はみられないことを示すグラフである。 ｓａｎ－１における原因遺伝子のマッピング経緯を示す、概要図である。原因遺伝子の候補領域であるマーカーＩＲＩＣ１１とＲＭ１８７１９の間において、ＲＡＰ－ＤＢデータベースで推測される遺伝子の領域を矢印で示す。これらの２０遺伝子のうち、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００がｓａｎ－１の原因遺伝子として同定された。 ｓａｎ－１の原因遺伝子にみられた塩基置換の概要を示す図である。遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて２３６番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換することにより、本来トリプトファン（Ｗ）をコードするコドンが未成熟終始コドン（ｓｔｏｐ）に変化していた。 イネＳＡＮ遺伝子の構造を示す、概略図である。イネＳＡＮ遺伝子は、Ｎ末端側にＡＲＭ（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ）ドメイン、Ｃ末端側にＴＰＲ（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ）ドメインを持つ６０１アミノ酸をコードする。 イネゲノム編集ベクターの概略を示す図である。 イネｓａｎ－ＣＲ１ゲノム編集体における塩基挿入部位を示す、概略図である。イネＳＡＮ遺伝子の翻訳開始点から数えて３９２番目と３９３番目の塩基の間にチミンが挿入することにより、フレームシフトが生じていた。 イネｓａｎ－ＣＲ２ゲノム編集体における塩基挿入部位を示す、概略図である。イネＳＡＮ遺伝子の翻訳開始点から数えて１５３番目と１５４番目の塩基の間にチミンが挿入することにより、フレームシフトが生じていた。 イネＳＡＮゲノム編集体における短葯化を観察した結果を示す、写真である。ｓａｎ－ＣＲ１、ｓａｎ－ＣＲ２いずれのゲノム編集体においても、ｓａｎ－１と同様の短葯性がみられた。 イネｓａｎ－ＣＲ３ゲノム編集体における塩基挿入部位を示す、概略図である。イネＳＡＮ遺伝子の翻訳開始点から数えて１６６７番目と１６６８番目の塩基の間にチミンが挿入することにより、フレームシフトが生じていた。 イネＳＡＮ－ＣＲ３ゲノム編集体における短葯化を観察した結果を示す、写真及びグラフである。ｓａｎ－ＣＲ３＃３ゲノム編集体（＃５）では、ｓａｎ－ＣＲ２編集体（＃１４－１）よりも弱い短葯性がみられた。

（短葯形質を有するイネの製造方法）
後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、マップベースクローニング等によって、短葯形質を有するイネの系統であるｓａｎ－１（ｓｈｏｒｔ ａｎｔｈｅｒ）の表現型に関与する候補遺伝子（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子）を選抜した。さらに、当該遺伝子の機能をゲノム編集法により抑制することによって、野生型のイネに短葯形質を付与することに成功した。したがって、本発明の短葯形質を有するイネの製造方法は、前記遺伝子（短葯遺伝子）の機能を人為的に抑制する工程を含むことを特徴とし、より具体的には以下を提供する。

短葯形質を有するイネの製造方法であって、
イネの、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。

本発明において、「短葯形質」とは、雄蕊の葯の長さ（葯長）が短縮する形質を意味する。ここで「葯長」とは、略楕円形である葯の縦（長軸）の長さを意味する。また「短縮」とは、例えば、本発明にかかる短葯遺伝子の機能を人為的に抑制する前（例えば、野生型のイネ）と比較して１０％以上（好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上）短くなることが挙げられる。

本発明において、短葯形質の付与対象となる「イネ」としては、イネ科イネ属に属する植物であれば、特に制限はなく、例えば、ジャポニカ種であってもよく、インディカ種であってもよい。また野生種であってもよく、栽培種であってもよい。さらに、これらイネの遺伝子組み換え体やゲノム編集体（例えば、病害耐性作物、除草剤耐性作物、害虫耐性作物、食味向上作物、保存性向上作物、収量向上作物）であってもよい。このように、本発明において、短葯形質の付与対象となるイネとしては、特に制限はないが、より交雑を抑制するという観点から、閉花受粉性を有するイネが好ましい。かかるイネとしては、より具体的に、ｓｐｗ１－ｃｌｓ１、ｓｐｗ１－ｃｌｓ２（Ｌｏｍｂａｒｄｏ Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、２０１７年、１５巻、９７～１０６ページ）が挙げられる。

本発明において機能抑制の対象となる「短葯遺伝子」として、典型的なアミノ酸配列をコードする遺伝子の例は、下記表１に示すとおりである。

なお、自然界においてもヌクレオチド配列が変異することは起こり得ることである。そして、それに伴いコードするアミノ酸も変化し得る。したがって、本発明の短葯遺伝子には、その機能が抑制されることによって短葯形質を付与し得る限り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。

ここで「複数」とは、通常１２０アミノ酸以内、好ましくは９０アミノ酸以内、より好ましくは６０アミノ酸以内、さらに好ましくは５５アミノ酸以内、より好ましくは５０アミノ酸以内、さらに好ましくは４５アミノ酸以内、より好ましくは４０アミノ酸以内、さらに好ましくは３５アミノ酸以内、より好ましくは３０アミノ酸以内（例えば、２５アミノ酸以内、２０アミノ酸以内、１５アミノ酸以内）、特に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、９アミノ酸以内、８アミノ酸以内、７アミノ酸以内、６アミノ酸以内、５アミノ酸以内、４アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸）である。

さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の遺伝子が得られた場合、その遺伝子のヌクレオチド配列情報を利用して、同種の植物から、その相同遺伝子を同定することが可能である。相同遺伝子を同定するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を同定するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ 尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の単離を期待することができる。本発明の短葯遺伝子には、その機能が抑制されることによって短葯形質を付与し得る限り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子が含まれる。

同定された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、前記特定の遺伝子がコードするそれと高い相同性（高い類似性）、好ましくは高い同一性を有する。ここで「高い」とは、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）のことである。本発明の短葯遺伝子には、その機能が抑制されることによって短葯形質を付与し得る限り、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性（類似性）又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。

配列の相同性は、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。例えば、ＢＬＡＳＴによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

本発明の「短葯遺伝子の機能の人為的抑制」には、該機能の完全な抑制（阻害）及び部分的な抑制の双方が含まれる。また、短葯遺伝子の発現の人為的抑制の他、短葯遺伝子がコードするタンパク質の活性の人為的抑制が含まれる。そして、かかる人為的抑制は、例えば、短葯遺伝子のコード領域、非コード領域、転写制御領域（プロモーター領域等）に変異を導入することによって行なうことができる。

本発明において、短葯遺伝子に導入される変異としては、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、及び／又は挿入が挙げられるが、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ヌル変異、インフレーム変異、逆位、転座が好ましい。また、本発明において、短葯遺伝子に導入される変異は、かかるヌクレオチドにおける変異を伴わない、エピジェネティック制御における変異であってもよい。エピジェネティック制御としては、例えば、ＤＮＡのメチル化、ヒストンの化学的修飾（アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化等）が挙げられる。また、短葯遺伝子に導入される変異の個数としても、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、１個でもよく、また複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下）でもよい。

このような変異としては、例えば、後述の実施例に示すように、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の５５７位以降のアミノ酸（全体の約７％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１３１位以降のアミノ酸（全体の約７８％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７９位以降のアミノ酸（全体の約８７％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の５２位以降のアミノ酸（全体の約９１％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異が挙げられる。そして、このような欠失等により、本発明の短葯遺伝子の機能は抑制され、短葯形質を有するイネを得ることができる。

したがって、短葯遺伝子に導入される変異としては、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列全部を失わせる必要はなく、その一部が失われるか変化するように当該遺伝子内に導入されてもよい。

なお、遺伝子の変異により発現するタンパク質の一部が欠失する場合、通常、全体の５％以上（例えば、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上）のアミノ酸が変更又は欠失すればよく、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）が変更又は欠失していればよい。

このようにアミノ酸配列が変更又は欠失する領域としては、特に制限はないが、例えば、後述の実施例に示すように、Ｃ末側の領域が挙げられる。また、本発明の短葯遺伝子がコードするアミノ酸配列において、その機能（タンパク質間相互作用等）を発揮する上で重要であると示唆される領域（ＡＲＭ（アルマジロリピート）ドメイン及び／又はＴＰＲ（テトラトリコペプチドリピート））も、アミノ酸配列が変更又は欠失する領域の例として挙げられる。

また、本発明においては、短葯遺伝子における、変異の導入箇所、導入する変異の種類、又はそれらに伴いアミノ酸配列が変更又は欠失する領域を調整することによって、葯長の短縮の程度を制御することも可能となる。例えば、後述の実施例に示すように、短葯遺伝子の上流（コードするアミノ酸配列において１～４００位に相当する領域）に変異を導入することによって強い短葯化がもたらされる一方で、下流（コードするアミノ酸配列において４０１位～６０１位に相当する領域）に変異を導入することによって弱い短葯化がもたらされる。また、インフレーム変異等でコードするタンパク質の活性を弱めることにより、弱い短葯化をもたらすことも可能となる。

短葯遺伝子への変異の導入は、当業者であれば公知の変異導入方法により達成することができる。かかる公知の方法としては、ゲノム編集法、物理的変異導入法、化学的変異剤を用いる方法、トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイム活性を有するＲＮＡ等を用いた、転写産物を標的とする方法が挙げられるが、これらに限定はされない。

これらの中で、短葯遺伝子を標的として人為的に変異を導入できるという観点から、ゲノム編集法、転写産物を標的とする方法、後述のＴＩＬＬＩＮＧ法が好ましい。

ゲノム編集法は、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法である。例えば、ＺＦＮｓ（米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）、ＴＡＬＥＮｓ（米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５３：１１７１－１１７９（２０１２））等の融合タンパク質や、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７１，（２０１５））やＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））等のガイドＲＮＡとタンパク質の複合体、あるいはタンパク質の複合体を用いる方法が挙げられる。

「Ｃａｓ酵素」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、III型ＣＲＩＳＰＲ系酵素等が挙げられるが、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９が好ましい。「Ｃａｓ９」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＣａｓ９、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９等が挙げられるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）が好ましい。また、これらの生物に由来するＣａｓ９の変異体であってもよく、ニッカーゼ（一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素）として機能することが知られているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であってもよく、Ｃａｓ９ホモログ、又はオルソログであってもよい。

物理的変異導入法としては、例えば、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、速中性子線照射、ガンマ線照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００７年、第１８回国際会議、２３７～２３９ページ、及び、Ｋａｚａｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２５巻、１１３～１１７ページ 参照）。

化学的変異剤を用いる方法としては、例えば、化学変異剤によって種子等を処理する方法（Ｚｗａｒ及びＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９～４８ページ等 参照）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトログアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。

トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法としては、例えば、Ｔ_ＯＳ１７等のトランスポゾン、Ｔ－ＤＮＡ等を植物のゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、２００１年、６巻、３号、１２７～１３４ページ、及び、Ｔａｍａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、４巻、３号、９０～９６ページ 参照）。

以上の方法により変異が導入されたイネについては、公知の方法により、短葯遺伝子に変異が導入されていることを確認することができる。かかる公知の方法としては、例えば、ＤＮＡシークエンス法（次世代シークエンシング法等）、ＰＣＲ法、マイクロアレイを用いた解析法、サザンブロット法、ノーザンブロット法が挙げられる。かかる方法によれば、短葯遺伝子に変異が導入されているか否かを、変異導入前後の当該遺伝子の配列又は長さを比較することによって判断することができる。また、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、マイクロアレイによる解析法等を利用することにより、転写制御領域等に変異が導入されたイネにおいて、短葯遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量の低下が認められれば、該イネは短葯遺伝子に変異が導入されたイネであると確認することもできる。

また、短葯遺伝子に変異が導入されていることを確認する他の方法として、ＴＩＬＬＩＮＧ（標的誘導型ゲノム特定位傷害、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）が挙げられる（Ｓｌａｄｅら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．、２００５年、１４巻、１０９～１１５ページ、及び、Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２００４年、３７巻、７７８～７８６ページ 参照）。特に、前述の重イオンビーム照射や化学的変異剤等を用いてイネゲノム中に非選択的変異を導入した場合には、短葯遺伝子又はその一部をＰＣＲで増幅した後に、該増幅産物に変異を有する個体を、前記ＴＩＬＬＩＮＧ等により選抜することができる。

また、上述の方法により変異が導入されたイネと野生型のイネとを交配させ、戻し交配を行うことにより、目的とする遺伝子以外の遺伝子に導入された変異を除去することもできる。

短葯遺伝子に変異を導入することにより当該遺伝子の機能が抑制されたイネが、短葯遺伝子のヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）である場合がある。そのような場合、例えば、かかるヘテロ接合体同士を交配してＦ１植物体を得ることにより、当該Ｆ１植物体から当該変異が導入された短葯遺伝子を有するホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）を選抜する。この場合、「当該変異が導入された短葯遺伝子を有するホモ接合体であるイネ」には、互いに同一である変異を有する短葯遺伝子の対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）を２つ有するイネだけでなく、第１の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第１の短葯遺伝子と、第２の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第２の短葯遺伝子とを有するイネが含まれる。

本発明において、短葯遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法として、上述の変異導入の他、短葯遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを用いる方法、短葯遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を用いる方法、短葯遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを用いる方法（リボザイム法）といった、短葯遺伝子の転写産物を標的とする方法も挙げられる。

本発明において、短葯遺伝子の機能の人為的な抑制は、上述の方法等に応じ、イネの植物体、種子又は植物細胞に対して行うことができる。植物細胞には、イネ由来の培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態のイネ由来の細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。

また、本発明において、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質又はガイドＲＮＡとタンパク質の複合体をコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ等を、ベクターに挿入した形態にてイネの細胞に導入してもよい。

短葯遺伝子の機能を人為的に抑制するための前記ＤＮＡが挿入されるベクターとしては、イネの細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、前記ＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、イネのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。さらに、本発明にかかるＤＮＡとしてガイドＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の短いＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｕ６プロモーター等ｐｏｌIII系のプロモーターが好適に用いられる。

イネの細胞へ前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクター等を導入する方法としては、例えば、パーティクルボンバードメント法、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。

なお、ＤＮＡの形態をとらずとも、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質、トランスポゾンは、タンパク質として、上述の、ガイドＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡは、ＲＮＡとして、イネの細胞に導入しても、変異を導入することはできる。

このように、本発明においては、前記ＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されたベクター、前記タンパク質、前記ＲＮＡといった短葯遺伝子を標的とする物質を用いることにより、イネに短葯形質を付与することができる。したがって、本発明は、前記ＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されたベクター、前記タンパク質及び前記ＲＮＡからなる群から選択される、短葯遺伝子を標的とする少なくとも１の物質を有効成分として含む、イネに短葯形質を付与するための薬剤も提供し得る。

かかる薬剤においては、２種の有効成分を１つの組成物中に含む態様であってもよく、２種の有効成分を別々の組成物中に含む態様（所謂、キット）であってもよい。また、本発明の薬剤においては、上記物質の他、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。

また、上述の方法等により遺伝子の機能が人為的に抑制された細胞からイネの植物体を再生することにより、短葯形質を有するイネを得ることができる。

例えば、イネにおいて、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｅｄｓ．）ｐｐ６６－７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３－１５０７，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７－９６２，１９９１）及びアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１－２８２，１９９４）等、いくつかの技術が既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられている。また、Ｔａｂｅｉら（田部井豊 編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載に方法等を用い、形質転換及び植物体への再生を行なうことができる。

（短葯形質を有するイネ）
上述の方法等により、本発明の短葯遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するイネを得ることができる。したがって、本発明は、
下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するイネ
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
を提供する。

なお、短葯遺伝子、その機能の人為的抑制、該抑制によって短葯形質が付与されるイネ等については、上述のとおりであるが、本発明の短葯形質を有するイネとしては、ｓａｎ－１を除いたイネであることが好ましく、本発明の短葯遺伝子の機能が人為的に抑制されたイネ品種Ｔ６５（Ｔａｉｃｈｕｎｇ ６５）を、除いたイネであることがより好ましい。

また、一旦、短葯遺伝子の機能が人為的に抑制されている植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって本発明には、短葯形質を有するイネの子孫及びクローン、並びに、それらの繁殖材料が含まれる。なお、繁殖材料としては、例えば、種子、株、カルス、プロトプラストが挙げられる。

＜短葯形質を有するか否かを判定する方法＞
本発明の、短葯形質を有するか否かを判定する方法は、被検イネにおける、短葯遺伝子、又はその発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする。より具体的には以下のとおりである。

イネにおいて短葯形質を有するか否かを判定する方法であって、被検イネにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする方法。なお、本発明の判定方法において検出対象となる短葯遺伝子は、上述のとおりである。

後述の実施例において示すように、短葯遺伝子において、ヌクレオチドの挿入や欠失が導入されることで、葯長が短縮することとなる。したがって、短葯遺伝子領域のヌクレオチド配列を解析することによって、短葯形質を有するか否かを判定することができる。

また、短葯遺伝子の発現量、並びにその発現量を制御する転写制御領域（エンハンサー、プロモータ－、サイレンサー、インスレーター等）のヌクレオチド配列を解析することによって、短葯形質を有するか否かを判定することもできる。

短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列の解析に際しては、本発明の短葯遺伝子又はその発現制御領域をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。前記ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、短葯遺伝子又はその発現制御領域を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、短葯遺伝子又はその発現制御領域の配列情報に基づいて適宜設計することができる。

なお、短葯形質を有するか否かを判定する方法においては、例えば、「対照のヌクレオチド配列」と比較する工程を含むことができる。被検イネにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列と比較する「対照のヌクレオチド配列」は、イネであれば、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列である。

決定した被検イネにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列と、前記対照のヌクレオチド配列とを比較することにより、被検イネにおいて短葯形質を有するか否かを判定することができる。例えば、前記対照のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１）と比較して、ヌクレオチド配列において大きな相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被検イネは短葯形質を有するイネである蓋然性が高いと判定される。

なお、本発明の判定方法における、被検イネからのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。ＤＮＡを調製するための植物としては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。また、ヌクレオチド配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム－ギルバート法などにより行なうことができる。ヌクレオチド配列の決定においては、市販のシークエンスキット及びシークエンサーを利用することができる。

被検イネにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列が、対照のヌクレオチド配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用したＲＦＬＰ法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法が挙げられる。

本発明の、短葯形質を有するか否かを判定する別の方法は、被検イネにおける短葯遺伝子の発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする。より具体的には以下のとおりである。

イネにおいて短葯形質を有するか否かを判定する方法であって、被検イネにおける短葯遺伝子の発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法。
なお、本発明の判定方法において検出対象となる短葯遺伝子は、上述のとおりである。

後述の実施例において示すように、短葯遺伝子において、ヌクレオチドの挿入や欠失が導入されることにより、発現産物の分子量は低減し、葯長が短縮することとなる。したがって、短葯遺伝子の増幅産物又は発現産物の分子量を検出することによって、短葯形質を有するか否かを判定することができる。また、短葯遺伝子の発現を検出することによって、短葯形質を有するか否かを判定することができる。

ここで「短葯遺伝子の発現の検出」には、転写レベルにおける検出及び翻訳レベルにおける検出の双方を含む意である。また、「発現の検出」には、発現の有無の検出のみならず、発現の程度の検出も含む意である。

短葯遺伝子の転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法やノーザンブロッティング法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、既に決定された短葯遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。

一方、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。

遺伝子発現の検出の結果、被検イネにおいて、短葯遺伝子の発現量が、例えば、イネにおいては、野生型（例えば、日本晴）の発現量よりも有意に低ければ（例えば、短葯遺伝子が実質的に発現していなければ）、また、短葯遺伝子の増幅産物又は発現産物の分子量が野生型における分子量と有意に異なれば、短葯形質を有する植物である蓋然性が高いと判定される。

＜短葯形質を有するイネを育種する方法＞
本発明は、短葯形質を有するイネを育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）短葯形質を有する植物と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体の中から、上述の方法により、短葯形質を有すると判定された植物を、選抜する工程を含む。

「短葯形質を有するイネ」とは、例えば、ｓａｎ－１、上述の短葯遺伝子の機能が抑制されたことにより短葯形質を有するイネが挙げられる。また当該植物と交配させる「任意の品種」としては、例えば、短葯遺伝子の機能が抑制されておらず短葯形質を有さないイネの品種が挙げられるが、これに制限されない。また、より交雑を抑制するという観点から、任意の品種として上述の閉花受粉性を有するイネが好ましい。本発明の育種方法を利用すれば、短葯形質を有するイネの品種を、幼植物等の段階で適宜選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１） イネ短葯変異体の原因遺伝子候補の探索
イネのｓａｎ－１（ｓｈｏｒｔ ａｎｔｈｅｒ）突然変異体は、イネ品種Ｔ６５（Ｔａｉｃｈｕｎｇ ６５）を原品種として、化学変異源物質 Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＭＮＵ）によって誘発された突然変異体集団の中から得られたものである。ｓａｎ－１の葯長は、野生型に比べて約３０％減少する短葯性を示す一方、内穎長には差がみられない特徴を持つ（図１、非特許文献１）。

しかしながら、この短葯形質の原因遺伝子は明らかにされていなかった。そこで先ず、ｓａｎ－１とイネ品種カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）を交配し、Ｆ２集団を用いたマップベースクローニングを行った。その結果、原因遺伝子は第５染色体上のマーカーＲＭ１８６３９とＲＭ６８４１の間に存在すると予想された（図２）。

そこで鋭意検討を重ね、さらに候補領域を絞り込んだ結果、候補領域はマーカーＩＲＩＣ１１とＲＭ１８７１９の間に存在すると予想された。この候補領域内にはＲＡＰ－ＤＢデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）上に２０遺伝子存在していた。遺伝子配列を比較したところ、ｓａｎ－１において、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて２３６番目のグアニンがアデニンに置換することにより、未成熟終始コドンが生じていることを見出した（図３）。同遺伝子は、Ｎ末端側に核局在シグナルとＡＲＭ（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ ｒｅｐｅａｔ）ドメイン、Ｃ末端側にＴＰＲ（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ）ドメインを持つ機能未知のタンパク質をコードする（図４）。

（実施例２） 遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００を標的とするゲノム編集による短葯化１
前記にて同定された候補遺伝子が、イネ短葯変異体の原因遺伝子であるかを明らかにすべく、以下に示す方法にて、当該遺伝子を標的とするゲノム編集を行い、短葯の形質が発現するかどうかを検証した。

＜ガイドＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９等を発現するためのベクターの構築＞
遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００のゲノム配列をＲＡＰ－ＤＢデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から取得した。第１エキソンと予測される配列のうち、ゲノム編集の標的とするガイドＲＮＡ配列（２０ｂｐ長）として２カ所を選定した。それぞれをＳＡＮ－ＣＲ１（位置：３７６－３９５番、配列５’－ＣＣＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴＴＡＣＧ－３’、配列番号：３）及びＳＡＮ－ＣＲ２（位置：１３７－１５６番、配列５’－ＴＴＣＴＣＣＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＣＴＴ－３’、配列番号：４）とした。

そして、それぞれのガイドＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９を発現するためのベクター（ゲノム編集系発現ベクター）を、常法に沿って作製した。当該ベクターは、ｐＺＮＨ２ＧＴＲ－Ｕ６ベクター（図５）に基づくものであり、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＯｓＵ６－２プロモーターとＳｃａｆｆｏｌｄ配列の間に挿入されている。さらに、ＳｐＣａｓ９をコードするＤＮＡは、イネＵｂｉ１ｂプロモーターとイネＵｂｉ１ｂターミネーター配列との間に挿入されている。また、このゲノム編集系発現ベクターは、形質転換体の選抜用にハイグロマイシン抵抗性遺伝子の発現用カセットの配列を有する。

＜ゲノム編集イネの作出及び解析＞
（１）イネカルスへの形質転換
前記にて作製したゲノム編集系発現ベクターは、Ｏｉｋａｗａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，６８７－７００（２００４）に記載の方法に従って、アグロバクテリウムを介した形質転換により、イネ品種 日本晴のイネ胚盤由来のカルスに導入した。そして、ハイグロマイシンを含む培地で培養することにより、形質転換カルスを選抜した。

（２）葉からのゲノムＤＮＡの抽出
ハイグロマイシンにより選抜され再分化させた形質転換イネを、培養土（ボンソル１号）へ移植し、約２週間後に伸長してきた葉の先端約５ｍｍ程度を採取し１．５ｍＬプラスチックチューブに入れ、ＤＮＡを抽出しＰＣＲに供試した。

（３）ＰＣＲによる、ＳＡＮ 標的変異導入対象箇所のＤＮＡ断片の増幅
ガイドＲＮＡ ＳＡＮ－ＣＲ１又はＳＡＮ－ＣＲ２を用いてゲノム編集を引き起こした植物体の、標的変異対象部位を増幅するために使用したプライマー配列は以下のとおりである。
ＳＡＮ－ＣＲ１解析用プライマー
ＳＡＮ＿ＣＲ１＿ｓｅｑＦ ５’－ＴＣＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧ－３’（配列番号：５）
ＳＡＮ＿ＣＲ１＿ｓｅｑＲ ５’－ＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴ－３’
（配列番号：６）
ＳＡＮ－ＣＲ２解析用プライマー
ＳＡＮ＿ＣＲ２＿ｓｅｑＦ ５’－ＴＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧＡ－３’ （配列番号：７）
ＳＡＮ＿ＣＲ２＿ｓｅｑＲ ５’－ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＴＡＴＧＧＧＡＴＧ－３’ （配列番号：８）。

ＰＣＲ酵素は、Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用し、全量１０μＬの反応液組成を以下のとおりとし、０．２ｍＬ容量の８連チューブ内で反応させた。
２×Ｇｆｌｅｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
１００μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ プライマー ０．２μＬ
１００μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー ０．２μＬ
Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．２５Ｕ／μＬ） ０．２μＬ
純水 ３．４μＬ
ＤＮＡ抽出液 １μＬ。

ＰＣＲ機は、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを使用し、以下の条件で運転した。
９４℃１分、その後９８℃１０秒、５５℃１５秒及び６８℃３０秒を４０サイクル。

（４）ＰＣＲ増幅断片のシーケンス解析
ＳＡＮ－ＣＲ１を含む領域のＰＣＲ産物（野生型で断片長３０１ｂｐ）及びＳＡＮ－ＣＲ２を含む領域ＰＣＲ産物（野生型で断片長３２１ｂｐ）を、１％アガロースゲル電気泳動にて展開し、増幅を確認した。増幅が確認されたＰＣＲ産物は、ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により精製し、増幅に用いたＦｏｒｗａｒｄプライマーを用いてダイレクトシーケンス解析を行った。

（５）葯長の観察
ＳＡＮゲノム編集体における葯長の観察は、遺伝的に固定したＴ１世代において行った。葯が穎花の中程まで伸長した、開花前の穎花を採取した。ピンセットにより採取した穎花の外穎を取り外し、葯を露出させて実体顕微鏡により葯長を観察した。

＜ゲノム編集イネの解析結果＞
上記のとおり、ゲノム編集系発現ベクターをイネカルスに導入し、ハイグロマイシンにより形質転換体を選抜した。当該カルスから再分化させた植物体を、培土入りのポットに移植し隔離温室で育成した。伸長した葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅及びシーケンス解析により、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の各ガイドＲＮＡ領域にゲノム編集が生じているか否かを解析した。

その結果、表２に示すとおり、解析したＴ０世代の実生当たり８３～８５％の割合でゲノム編集が生じていた。

次いで、ゲノム編集が検出された植物体についてポットに移植し、隔離温室内での栽培を継続し後代種子を取得した。ガイドＲＮＡとしてＳＡＮ－ＣＲ１を使用した系統のうち＃２０－１、ＳＡＮ－ＣＲ２を使用した系統のうち＃１４－１について、Ｔ１世代を育成し各個体のシーケンス解析を行い、ホモ接合体としてゲノム編集が生じている個体を選抜した。その結果、ゲノム編集体 ｓａｎ－ＣＲ１ ＃２０－１では遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて３９２番目と３９３番目の塩基の間にチミンが１塩基挿入（図６）、ｓａｎ－ＣＲ２ ＃１４－１では１５３番目と１５４番目の塩基の間にチミンが１塩基挿入する変異が生じることにより（図７）、フレームシフトが生じていることを見出した。

次に、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００にフレームシフトを引き起こす変異をホモ接合体として持つ、ゲノム編集体ｓａｎ－ＣＲ１ ＃２０－１個体及びｓａｎ－ＣＲ２ ＃１４－１個体に加え、ゲノム編集が生じていない個体を、隔離温室内で育成し、開花前の穎花を採取した。そして、実体顕微鏡下で外穎を除去し葯を露出させて葯長を比較した。

その結果、ゲノム編集が生じていない個体（図８における「ベクターコントロール」）と比較して、ｓａｎ－ＣＲ１ ＃２０－１及びｓａｎ－ＣＲ２ ＃１４－１個体の両方について３０％程度の短葯化が認められた（図８）。

よって、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００が、ｓａｎ－１における短葯化の原因遺伝子（ＳＡＮ遺伝子）であることが明らかとなり、当該遺伝子を標的とし、その機能を抑制することによって、イネに短葯形質を付与することが可能となった。

（実施例３） 遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００を標的とするゲノム編集による短葯化２
上記実施例２においては、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００（ＳＡＮ遺伝子）において、第１エキソンと予測される配列を標的としてゲノム編集を行ったが、今度はそれよりも下流の第２エキソンと予測される配列を標的としてゲノム編集を行い、短葯化の有無、程度を評価した。具体的には、ゲノム編集の標的とするガイドＲＮＡ配列を、ＳＡＮ－ＣＲ３（位置：１６５１－１６７０番、配列５’－ＣＡＴＧＧＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＴＧＣＧＡ－３’、配列番号：９）とし、当該ＳＡＮ－ＣＲ３を用いてゲノム編集を引き起こした植物体の、標的変異対象部位を増幅するために下記プライマーセットを用いた以外は、実施例２に記載の方法にて、同様のゲノム編集イネの作出及び解析を行った。得られた結果を、図９及び１０に示す。
ＳＡＮ－ＣＲ３解析用プライマー
ＳＡＮ＿ＣＲ３＿ｓｅｑＦ ５’－ＧＡＴＡＴＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＡＧ－３’ （配列番号：１０）
ＳＡＮ＿ＣＲ３＿ｓｅｑＲ ５’－ＧＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴ－３’ （配列番号：１１）。

上記のとおり、ＳＡＮ遺伝子がコードするタンパク質のＣ末端側を標的とするガイドＲＮＡ（ＳＡＮ＿ＣＲ３）を設計し、ゲノム編集体を作成した。その結果、得られたゲノム編集体ｓａｎ－ＣＲ３＃５では、翻訳開始点から数えて１６６７番目と１６６８番目の塩基の間にチミンが挿入することにより、フレームシフトが生じていた（図９）。そして、このゲノム編集体における葯長を観察した結果、ｓａｎ－ＣＲ３＃５においても、ゲノム編集が生じていない個体（図１０における「コントロール」）と比較して短葯化が認められた。また、その短葯化の程度は、Ｎ末端側に変異が生じたｓａｎ－ＣＲ２＃１４－１よりも弱いものであった（図１０及び１１）。

よって、短葯化の程度は、ＳＡＮ遺伝子のより上流に変異を導入したｓａｎ－ＣＲ２よりも弱いものの、Ｃ末側の領域のアミノ酸配列をたった７％程度変更及び欠失させた場合でもイネに短葯形質を付与できることが確認された。
さらに、このように、ＳＡＮ遺伝子がコードするアミノ酸配列のＣ末側において、変更又は欠失する領域の大きさに応じて、短葯化の程度を制御できることも明らかとなった。

以上説明したように、本発明によれば、短葯形質を有するイネを製造することが可能となる。そして、この短葯形質によって、葯が頴から抽出し難く、また花粉も飛散し難いため、他品種等との交雑を抑制することができる。よって、本発明は、イネに関する農業分野において有用である。

Claims (2)

1. 短葯形質を有するイネの製造方法であって、
   イネの、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
   （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
   （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
   （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
   （ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
2. 下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するイネ
   （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
   （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
   （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
   （ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。