JP5211402B2 - 植物の減数***期組換え位置を変更する方法 - Google Patents
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Description
(1)植物体の減数***期組換えの位置を変更させる方法であって、細胞核内のクロマチン修飾状態を変更する工程を含む方法;
(2)細胞核内のクロマチン修飾状態の変更が、植物体の種子を、クロマチン修飾酵素阻害剤を含む水溶液中で吸水させることにより行われる、(1)記載の方法;
(3)クロマチン修飾酵素阻害剤が、トリコスタチンAである、(2)記載の方法;
(4)細胞核内のクロマチン修飾状態を変更が、植物をクロマチン修飾状態の維持に必要な因子の機能欠損系統と交配して得られたF1種子を吸水させることにより行われる、(1) 記載の方法;
(5)クロマチン修飾状態の維持に必要な因子の機能欠損系統がDDM1遺伝子の発現が阻害された植物体である、(4)記載の方法;
(6)DDM1遺伝子の発現が抑制された植物体が、DDM1遺伝子に対するアンチセンス核酸を発現するベクターの導入により作成された植物体である、(5)記載の方法;
(7)減数***期組換えの位置が変更される植物体がイネである、(1)〜(6)いずれかに記載の方法;
(8)(a) 野生型植物体の種子を、クロマチン修飾酵素阻害剤を含む水溶液中で吸水させるか、または、野生型植物体をクロマチン修飾状態の維持に必要な因子の機能欠損系統と交配して得られたF1種子を吸水させ、F1種子を得る工程
(b) F1種子を播種し、F1植物を生育させる工程
(c) F1植物の葉よりDNAを精製し、クロマチン修飾の変更を確認する工程
(d) クロマチン修飾の変更が確認されたF1植物を自家受粉させる工程
(e) 自家受粉により得られた種子を播種し、F2植物を生育させる工程
(f) F2植物において、減数***期組換えの位置の変更を確認する工程
を含む、植物の育種方法;
(9)工程(a) において用いられるクロマチン修飾酵素阻害剤が、トリコスタチンAである、(8)記載の育種方法;
(10)工程(a) において用いられるクロマチン修飾状態の維持に必要な因子の機能欠損系統が、DDM1遺伝子の発現が阻害された植物体である、(8)記載の育種方法;
(11)DDM1遺伝子の発現が阻害された植物体が、DDM1遺伝子に対するアンチセンス核酸を発現するベクターの導入により作成された植物体である、(10)記載の方法;
(12)工程(c)におけるクロマチン修飾の変更を、DNAのメチル化状態の変更を指標として確認する、(8)記載の育種方法;
(13)DNAのメチル化状態の変更をサザンブロットにより行う、(12)記載の育種方法;
(14)工程(f)における、減数***期組換え位置の変更の確認を、遺伝子型を解析することにより確認する、(8)記載の育種方法;
(15)育種される植物体がイネである、(8)〜(14)のいずれかに記載の育種方法
を、提供するものである。
本発明は、細胞核内のクロマチン修飾状態を変更することにより植物体の減数***期組換えの位置を変更させる方法に関する。より詳細には、クロマチン修飾状態は、生育させる前の植物体の種子を、クロマチン修飾酵素阻害剤を含む水溶液中で吸水させることにより変更することができる。イネ及びシロイヌナズナのような、セントロメア領域の反復塩基配列の情報が得られている植物体については、クロマチン状態変更の確認が容易であること、及びゲノム中の位置マーカーも充実しているため、減数***期組換え位置変更の確認が容易である。従って、本発明の方法は、イネ及びシロイヌナズナのような配列情報が得られている植物体に対しては容易に適用できるため、これらの植物体は本発明の方法を適用する対象植物として有利である。しかしながら、本発明の方法はイネ及びシロイヌナズナへの適用に限定される訳ではなく、種子を形成する種々の作物を含む植物体に対して応用することができる。本発明の方法は、そもそも作物の品種改良・有用形質の蓄積に資することを目的としていることから、品種改良の効果が大きな経済効果につながる可能性を持つ主要作物(ダイズ(双子葉)、トウモロコシ(単子葉)等)は、本発明の方法の適用が特に好ましい植物体として挙げることができる。
(1)三重鎖形成による転写開始阻害;
(2)RNAポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制;
(3)合成中RNAとのハイブリッド形成による転写阻害;
(4)イントロン-エキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制;
(5)スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制;
(6)mRNAとのハイブリッド形成による、mRNAの細胞質への移行抑制;
(7)キャッピング部位またはポリA付加部位とのハイブリッド形成によるプロセシング抑制;
(8)翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制;
(9)リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制;
(10)mRNA翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるポリペプチド鎖の伸長抑制;
(11)核酸とタンパク質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制;及び
(12)アンチセンス核酸と標的RNAとのハイブリダイズにより形成された二本鎖核酸の分解により生じるsiRNAのRNAiによる標的RNAの分解誘導。
本発明においては、上記どのような機構により標的とする遺伝子の発現を抑制するものであっても良く、発現阻害の標的となる遺伝子の翻訳領域に対してアンチセンスである配列を含むものだけでなく、その非翻訳領域に対してアンチセンスである配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸に含まれるこのような標的に対してアンチセンスな配列は、標的に対して完全に相補的である必要はなく、標的にハイブリダイズでき、その発現を効果的に阻害するものであればよい。また、標的以外の遺伝子配列とは相補性が低いものであることが望ましい。さらに、必要に応じ、標的に対してアンチセンスな配列に、その細胞内での安定性を増すために必要とされる配列等を付加しても良い。好ましくは、本発明におけるアンチセンス核酸に含まれる標的に対してアンチセンスな配列は、発現抑制の標的となる遺伝子の転写産物の相補鎖に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上同一である(例えば、95%以上)。このようなアンチセンス核酸は、少なくとも15bp以上の長さを有し、好ましくは、18bp、20bp、25bp、30bp、50bp、75bp、100bp、200bp、300bp、または500bp以上の長さを有するものであり、通常、3000bp、または2000bp以内、より好ましくは1000bp以内の長さを有するものである。当業者であれば、標的とする遺伝子の核酸配列情報を元に、上述のような公知技術に基づき使用できるアンチセンス核酸を、適宜設計し、その効果につき試験することができる。
1.方法
イネ日本晴(NB)系統とカサラス(KS)系統との交配によって得られたF1種子の籾を取り除き、70%エタノール中で1分間、続いて2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液中で20分間穏やかに攪拌して、種子表面を滅菌した。続いて、0μMまたは100μMTSAの水溶液中で30度24時間吸水させた。または、イネDDM1遺伝子cDNAの一部(アクセション番号 = AU166638)のアンチセンスRNAの発現により、セントロメア領域反復配列のDNA低メチル化を誘導したNB系統(角谷ら、投稿中)を交配に用いたF1種子を、TSAを含まない水中で同様に吸水させた。その後、種子を滅菌蒸留水で3回以上すすぎ、MS 培地(Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-97)/0.2%ゲランガム上に置き、25度から30度の温室またはグロースチャンバー内で発芽・生育させた。1週間から2週間後に幼苗を培養土に移し、25度から30度の温室内で生育させた。播種後2ヶ月頃のF1植物体の葉からCTAB法によりDNAを抽出した。続いて、抽出したDNAを制限酵素HpaIIまたはHhaIで消化し、イネのセントロメア反復配列(RCS2: Dong F, Miller JT, Jackson SA, Wang GL, Ronald PC, Jiang J (1998) Rice (Oryza sativa) centromeric regions consist of complex DNA. Proc Natl Acad Sci USA 95: 8135-40)をプローブとしたサザンブロット法(Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Third edition. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)を行いセントロメア領域反復配列のDNA低メチル化を確認した。DNA低メチル化が確認されたF1植物体を自家受粉させ、F2種子を得た。TSA処理系統、未処理系統(0μMTSA処理系統)、DDM1遺伝子機能欠損系統のF2種子(それぞれ190個)を播種、生育させ、播種後3週間目のF2植物体の葉からCTAB法によりDNAを抽出した。これらのDNAを鋳型として、複数の位置マーカーを用いて遺伝子型の解析を行った。遺伝子型解析は、第3染色体の全域と、第11染色体のセントロメア領域を解析対象とした。遺伝子型解析に使用したマーカー名とプライマーの塩基配列を表1及び2に示す。
(2-1)イネ種子のTSA処理及びDDM1遺伝子機能の阻害によるセントロメア領域のDNA脱メチル化の誘導
セントロメアとその近傍はメチル化DNA及びメチル化H3K9に富み、不活性なクロマチン構造を形成していることが知られている。トリコスタチンA(TSA)処理したイネF1(日本晴(NB)×カサラス(KS))、及びイネDDM1遺伝子のアンチセンス発現NB系統とKSとの交配F1系統の葉からDNAを抽出し、DNAメチル化感受性制限酵素を用いてセントロメア領域のサザン解析を行った結果、いずれの場合にも野生型系統と比較して、セントロメア領域のDNAメチル化が低下していることが示された。TSA処理に関しては、30μMではDNA低メチル化は観察されなかったが、100μMで明確なDNA低メチル化が観察された。以上の結果から、イネ種子のTSA処理によるヒストン脱アセチル化酵素の一過的阻害が、セントロメア領域におけるDNAメチル化の低下を誘導すること、さらに発芽後の細胞***を通して低メチル化状態が維持されることが示された。(図2)
第3染色体全域をカバーする位置マーカーを用いて、自殖F2集団におけるNBとKSそれぞれの遺伝子型の分離を解析した。野生型無処理のF2(NB×KS)では、第3染色体の62cM付近と160cM付近に分離ひずみが見られることが報告されている(Harushima et al. (1996) Theor Appl Genet 92: 145-50)。TSA処理系統及びDDM1遺伝子アンチセンス系統のいずれにおいても、62cM付近の分離ひずみに影響は見られなかったが、160cM付近の分離ひずみは消失した。さらにアンチセンスDDM1系統では、セントロメア領域の長腕側に強い分離ひずみが新たに観察された。このひずみ領域では、ヘテロ接合体の出現頻度が著しく上昇しており、雌雄いずれかの配偶体系性異常では説明できない、極めて特徴的な現象がおきていることが示された。(図3)
第3染色体全域をカバーする位置マーカーを用いて、TSA処理系統及びDDM1遺伝子アンチセンス系統の減数***期組換え価を解析した結果を図4に示す。図4中、縦軸は、野生型無処理系統における組換え価を1とした場合のTSA処理系統及びDDM1遺伝子アンチセンス系統における、染色***置マーカー間の相対的な組換え価を示す。幾つかの領域で組換え価の有意な上昇・低下が見られたが、第3染色体全域としての組換え価の上昇・低下は観察されなかった。(図4)
TSA処理及びDDM1遺伝子機能欠損が、第3染色体セントロメア領域の減数***期組換え位置に及ぼす影響を解析した結果を図5Aに示す。TSA処理系統、DDM1遺伝子アンチセンス系統のいずれにおいても。野生型無処理系統では組換えが見られない領域での組換えが観察された。DDM1遺伝子アンチセンス系統で観察されたセントロメア付近の組換え価上昇(上記(2-3)及び図4参照)は、主にセントロメアのギャップ領域に隣接する領域で起こっていた。
同様に、第11染色体に関してもセントロメア付近の組換え位置を調べた(図5B)。その結果、TSA処理系統及びDDM1遺伝子アンチセンス系統の両方において、セントロメアから離れた位置に向かって組換え頻度が上昇する傾向が見られ、ここでも野生型無処理系統では組換えが見られない領域での組換えが観察された。
以上の結果から、TSA処理及びDDM1遺伝子機能欠損によって、イネセントロメア付近の組換え位置を変更し、野生型無処理系統では組換えが見られない領域に組換えを誘導できることが示された。また、第3染色体セントロメア付近においては、過去の解析で組換えが全く観察されていない領域(recombination suppressed region、Harushima et al. (1998) Genetics 148: 479-94)且つセントロメア特異的ヒストンH3結合領域(Yan et al. (2006) Plant Cell 18: 2123-33)の内部でも、野生型無処理系統で組換えが観察されている(図5A、D7722〜D5711間)。本解析では、DDM1遺伝子アンチセンス系統として遺伝子組換え体を利用しているため、野生型無処理系統を含む全ての系統を温室内で生育・自殖させている。従って、上記結果は、環境要因によってセントロメア付近のクロマチン状態が変動する可能性を示すものと考えられる。
特に、遺伝子組換え技術を用いずに減数***期組換え位置を変更することを可能とする、クロマチン修飾酵素阻害剤を用いた手法は、遺伝子組換え技術が適用できない植物を含め、あらゆる作物に利用できると考えられ、幅広い応用が期待される。また、この手法により得られた植物体は、遺伝子組換え体に対する規制も受けないという利点がある。
他方、クロマチン修飾状態の維持に必要な因子の機能欠損系統との交配を含む手法は、後代において機能欠損の原因となる変異等を分離・除去できる点で有利である。また、特定遺伝子のクロマチン修飾変更の固定により、特定の機能が変更・固定された植物体を選抜し、減数***期組換え以外の機能が改変された(エピアリール系統)を得ることにも利用できる。クロマチン修飾の変更・固定は、遠縁間交配の後代で見られる、遺伝子伝達率の偏り(分離ひずみ)にも影響するため、交配育種における有用形質分離に利用することができる。
Claims (11)
- 植物体の減数***組換えの位置を変更させる方法であって、植物体の種子を、クロマチン修飾酵素阻害剤を含む水溶液中で吸水させることにより細胞核内のクロマチン修飾状態を変更する工程、及び、該阻害剤を含む水溶液中で吸水させた種子から該阻害剤を含まない条件下で植物体を生育させる工程を含む方法。
- クロマチン修飾酵素阻害剤が、トリコスタチンAである、請求項1記載の方法。
- 減数***期組換えの位置が変更される植物体がイネである、請求項1または2に記載の方法。
- (1)野生型植物体の種子を、クロマチン修飾酵素阻害剤を含む水溶液中で吸水させるか、または、野生型植物体をDNAメチル化の機能欠損系統と交配して得られたF1種子を吸水させ、F1種子を得る工程
(2)F1種子を播種し、F1植物を生育させる工程
(3)F1植物の葉よりDNAを精製し、クロマチン修飾の変更を確認する工程
(4)クロマチン修飾の変更が確認されたF1植物を自家受粉させる工程
(5)自家受粉により得られた種子を播種し、F2植物を生育させる工程
(6)F2植物において、減数***期組換えの位置の変更を確認する工程
を含む、植物の育種方法。 - 工程(1)において用いられるクロマチン修飾酵素阻害剤が、トリコスタチンAである、請求項4記載の育種方法。
- 工程(1)において用いられるDNAメチル化の機能欠損系統が、DDM1遺伝子の発現が阻害された植物体である、請求項4記載の育種方法。
- DDM1遺伝子の発現が阻害された植物体が、DDM1遺伝子に対するアンチセンス核酸を発現するベクターの導入により作成された植物体である、請求項6記載の方法。
- 工程(3)におけるクロマチン修飾の変更を、DNAのメチル化状態の変更を指標として確認する、請求項4記載の育種方法。
- DNAのメチル化状態の変更をサザンブロットにより行う、請求項8記載の育種方法。
- 工程(6)における、減数***期組換え位置の変更の確認を、遺伝子型を解析することにより確認する、請求項4記載の育種方法。
- 育種される植物体がイネである、請求項4〜10のいずれか一項記載の育種方法。
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