CN110892074A - 用于增加香蕉的保质期的组成物及方法 - Google Patents

用于增加香蕉的保质期的组成物及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110892074A
CN110892074A CN201880046146.6A CN201880046146A CN110892074A CN 110892074 A CN110892074 A CN 110892074A CN 201880046146 A CN201880046146 A CN 201880046146A CN 110892074 A CN110892074 A CN 110892074A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
nucleic acid
banana
dna
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880046146.6A
Other languages
English (en)
Inventor
艾尔·毛利
亚伦·盖伦提
克里斯蒂娜·皮诺奇
安吉拉·查帕罗·加西亚
奥菲尔·梅尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tropic Biosciences UK Ltd
Original Assignee
Tropic Biosciences UK Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tropic Biosciences UK Ltd filed Critical Tropic Biosciences UK Ltd
Publication of CN110892074A publication Critical patent/CN110892074A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)

Abstract

本发明提供一种包括一基因组的香蕉植物，所述基因组在一核酸序列中包括一功能丧失突变，所述核酸序列编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分。本发明同时提供一种增加香蕉的保质期的方法。

Description

用于增加香蕉的保质期的组成物及方法
技术领域及背景技术
在本发明的一些实施例中，本发明涉及用于增加香蕉的保质期的组成物及方法。
栽培的香蕉及大蕉(plantains)是芭蕉属(Musa)中的巨型草本植物。它们既无菌又单性结实(parthenocarpic)，因此发育成不具有种子的果实。所述栽培的杂交种及品种大多为三倍体(2n＝3x＝33；少数为二倍体或四倍体)，并且大多数是从野生环境中发现的突变体繁殖而来。
香蕉是世界十大粮食作物之一。根据栽培品种(cultivar)的不同，香蕉既可以生吃，也可以被烹饪。大约60％的香蕉是作为甜品水果而用于生吃的，另外40％的香蕉是在蒸、煮、烤及油炸过程中烹煮的。每年生产的香蕉果实超过1.2亿吨，印度、乌干达及中国这三个最大的生产国几乎消费了其国内生产的所有香蕉果实。
香蕉属于更年性水果(climacteric fruit)，收获后必须通过成熟过程来进行更年性变化，包括内部乙烯的产生、淀粉及原果胶的水解及其相似的变化，直到果肉***、甜度增加并产生香气为止，然后，可以增加其食用价值。
常规上，香蕉是提前收获的，随着成熟的进展，香蕉的运输及存储时间会延长。然而，由于在运输过程中会产生乙烯，香蕉果实可能经常会成熟。此外，所述果实可能会过度成熟并变质，从而大幅降低所述市场价值。因此，控制乙烯的生物合成可用于提供一种控制香蕉成熟的方法。
乙烯是以气态形式存在的一植物激素，乙烯可能会影响植物中的许多生理及生化反应。乙烯在植物的生长、发育及压力响应中起着重要作用，例如，当植物遭受洪水、机械伤害、细菌感染、叶及花的衰老、果实成熟及其相似情况时，植物将生产乙烯。乙烯的生物合成途径包括借助AdoMet合成酶将甲硫氨酸(methionine)转化为S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)，借助ACC合成酶(ACS)从AdoMet合成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，然后借助1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)将ACC氧化为乙烯(参见图1，改编自Rudus等人，2013年，第35卷，第2期，第295至307页)。已知ACO是乙烯的生物合成途径中使用的最后一种酶，因此，抑制ACO基因或其蛋白质表达可以抑制/降低乙烯的生物合成，并且进一步实现延迟一果实的后熟的目的。
不同于大多数的其他主要粮食作物，香蕉很难进行基因改良。面临的挑战是几乎所有的香蕉栽培品种及本地品种都是三倍体，具有很高的雄性与雌性的***程度。已经有许多国际常规的育种计划，其中许多计划正在开发新的栽培品种。但是，实际上不可能使香蕉回交(backcross)，因此排除了将新性状渗入一当前的栽培品种的可能性。
因此，为了应对日益增长的全球粮食生产需求的挑战，提高农业生产率的所述典型方法(例如：提高产量或改变的抗病虫能力)依赖于突变育种或通过转化将新基因引入作物基因组中。这些过程本质上是非特定的且效率相对较低。例如，植物转化方法提供了在随机位置整合到基因组中的外源DNA。因此，为了鉴定及分离具有所需属性的转基因植物品系，必须为每个构建体(construct)产生数百个独特的随机整合事件，然后筛选所需的个体。结果，常规的植物性状工程(plant trait engineering)是一费力、费时且不可预测的工作。此外，这些整合的随机性使得难以预测是否由于非预期的基因组破坏而产生了多效性效应(pleiotropic effects)。
所述当前的转化过程的所述随机性需要生成数百个事件以鉴定及选择转基因事件候选者(相对于从功能基因组研究中鉴定的基因候选者而言，转化及事件筛选是具有速率限制(rate limiting)的)。另外，取决于所述基因组内的整合位置，由于所述基因组位置效应，一基因表达盒可以以不同程度表达。结果，具有工程基因或性状的植物品系的产生、分离及表征一直是非常费力及成本密集且成功的可能性很小的过程。除了与选择的转基因事件相关的障碍之外，还出现了一些与基因限制以及将转基因植物释放到环境中以进行商业应用所需的严格程度有关的主要问题。
基因组编辑技术的最新进展使得能够改变活细胞中的DNA序列。基因组编辑比常规作物育种方法或标准基因工程(转基因或基因修改(GM))的方法更加精确。通过仅编辑植物细胞中的数十亿个核苷酸(基因的组成部分)，这些新技术可能是使得作物在恶劣的气候下能够更好地生长、抵抗病虫害或提升营养的最有效方法。由于所述技术越精确，所述遗传物质的改变就越少，因此对植物行为的其他影响的不确定性也就越低。
使用CRISPR Cas9基因组编辑技术的最成熟的植物基因工程方法需要将新的DNA***宿主的基因组。这种***、带有多个转录单元的转移DNA(T-DNA)，从而成功完成CRISPRCas9基因组编辑。这些通常由选择转基因植物的一抗生素抗性基因、所述Cas9机制以及几个sgRNA单元组成。由于将外源DNA整合到所述基因组中，以这种方式产生的植物被归类为转基因或基因改造(GM)的植物。一旦在宿主中建立一基因组编辑，就可以通过有性繁殖及育种来去除所述T-DNA的骨架，因为不再需要所述CRISPR Cas9机制来维持所述表型。然而，如上所述，香蕉物种是单性结实的(不产生能独立生存的种子)，使得无法通过有性繁殖来去除T-DNA骨架。
其他背景技术包括：
美国专利申请，公开第20130097732号；
美国专利申请，公开第20140075593号；
Zhang，Y.等人，通过CRISPR/Cas9的DNA或RNA的瞬时表达在小麦中进行高效且无转基因的基因组编辑。Nat Commun，2016年7月：第12617页；
Woo，J.W.等人，在具有预组装的CRISPR-Cas9核糖核蛋白的植物中进行无DNA的基因组编辑。Nat Biotechnol，2015年.33(11)：第1162页至1164页；
Svitashev，S.等人，由CRISPR-Cas9的核糖核蛋白复合物引导的玉米基因组编辑。Nat Commun，2016年.7：第13274页；
Luo，S.等人，使用纯化的序列特异性核酸酶的非转基因植物基因组编辑。MolPlant，2015年.8(9)：第1425页至1427页；
Hoffmann 2017年，PlosOne 12(2)：e0172630；
Chiang等人，2016年。SP1,2,3.Sci Rep.2016年4月15日；6：24356。
发明内容
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种香蕉植物，所述香蕉植物包括一基因组，所述基因组在一核酸序列中包括一功能丧失突变，所述核酸序列编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种增加香蕉的保质期的方法，所述方法包括：
(a)使一香蕉植物细胞经受针对一核酸序列的一DNA编辑媒介的作用，所述核酸序列编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分，从而导致编码所述乙烯生物合成途径的所述核酸序列中的一功能丧失突变，以及
(b)从所述植物细胞再生一植物。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包括：从所述植物中收获果实。
根据本发明的一些实施例，所述植物缺乏编码所述DNA编辑媒介的一转基因。
根据本发明的一些实施例，所述突变是一纯合子形式。
根据本发明的一些实施例，所述植物或其中的原种已经通过一DNA编辑媒介处理，所述DNA编辑媒介针对编码所述乙烯生物合成途径中的所述组分的所述基因序列。
根据本发明的一些实施例，所述突变选自于由缺失、***、***/缺失(***缺失)及取代所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)及1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括：编码一DNA编辑媒介的一核酸序列，所述DNA编辑媒介针对编码一香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分的一核酸序列，编码所述DNA编辑媒介的所述核酸序列可操作地连接至一植物启动子。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介是一DNA编辑***，所述DNA编辑***选自于由大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)及CRISPR-Cas所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介是包括CRISPR-Cas的一DNA编辑***。
根据本发明的一些实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)及Ma07_g19730(SEQ ID NO：27)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)、Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)、Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)及Ma07_g19730(SEQ ID NO：27)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)及Ma07_g19730(SEQ ID NO：27)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)及Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介针对多个核酸坐标，所述多个核酸坐标特异性地靶向在所述乙烯生物合成途径中编码所述组分的一个以上的核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括与选自于由SEQ ID NO：47至54所组成的群组的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括与SEQ ID NO：47所示的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47所示的一核酸。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47至54所示的多个核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47、49或50所示的多个核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：51及53所示的多个核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述香蕉植物是非转基因的。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种植物部分，所述植物部分为上文所述植物的所述植物部分。
根据本发明的一些实施例，所述植物部分为一果实。
根据本发明的一些实施例，所述果实是干燥的。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种生产香蕉的方法，所述方法包括：
(a)种植如上文所述的所述植物；以及
(b)从所述植物中收获果实。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种加工香蕉产品，包括基因组香蕉DNA，所述基因组香蕉DNA在编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分的一核酸序列中包括一功能丧失突变。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种香蕉植物或其部分，其包括引入一基因组核酸序列的一功能丧失突变，所述基因组合酸序列编码一蛋白质，所述蛋白质为所述香蕉的一乙烯生物合成途径的一组份，其中相较于所述丧失功能突变的一香蕉植物，所述突变导致所述蛋白质的程度降低或活性降低。
根据本发明的一些实施例，所述植物包含一个或多个非天然丧失功能的突变，所述多个突变被引入编码一个或多个蛋白质的一种个或多个基因组核酸序列中，所述蛋白质是所述香蕉的一乙烯生物合成途径的组分，其中相较于缺少所述功能丧失突变的一香蕉植物，一个或多个突变各自导致蛋白质程度降低或活性降低。
根据本发明的一些实施例，所述一种或多种蛋白质选自于由1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)及1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述ACS蛋白基因组的核酸序列包括与选自于由Ma01_g07800.1(SEQ ID NO：1)、Ma01_g12130.1(SEQ ID NO：2)、Ma02_g10500.1(SEQ ID NO：3)、Ma03_g12030.1(SEQ ID NO：4)、Ma03_g27050.1(SEQ ID NO：5)、Ma04_g01260.1(SEQ IDNO：6)、Ma04_g24230.1(SEQ ID NO：7)、Ma04_g31490.1(SEQ ID NO：8)、Ma04_g35640.1(SEQID NO：9)、Ma04_g37400.1(SEQ ID NO：10)、Ma05_g08580.1(SEQ ID NO：11)、Ma05_g13700.1(SEQ ID NO：12)、Ma09_g19150.1(SEQ ID NO：13)及Ma10_g27510.1(SEQ ID NO：14)所组成的群组的一核酸序列具有至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或为所述群组的一核酸序列；并且其中所述ACO蛋白基因组的核酸序列包括与选自于由Ma09_g04370.1、Ma09_g04370.1(SEQ ID NO：15)、Ma06_g17160.1(SEQ ID NO：16)、Ma11_g05490.1(SEQ ID NO：17)、Ma00_g04490.1(SEQ ID NO：18)、Ma07_g15430.1(SEQ ID NO：19)、Ma01_g11540.1(SEQ ID NO：20)、Ma10_g16100.1(SEQ ID NO：21)、Ma05_g08170.1(SEQID NO：22)、Ma06_g14430.1(SEQ ID NO：23)、Ma05_g09360.1(SEQ ID NO：24)、Ma11_g22170.1(SEQ ID NO：25)、Ma05_g31690.1(SEQ ID NO：26)、Ma07_g19730.1(SEQ ID NO：27)、Ma06_g02600.1(SEQ ID NO：28)、Ma10_g05270.1(SEQ ID NO：29)、Ma06_g14370.1(SEQID NO：30)、Ma11_g05480.1(SEQ ID NO：31)、Ma06_g14410.1(SEQ ID NO：32)、Ma06_g14420.1(SEQ ID NO：33)、Ma06_g34590.1(SEQ ID NO：34)、Ma02_g21040.1(SEQ ID NO：35)、Ma11_g04210.1(SEQ ID NO：36)、Ma05_g12600.1(SEQ ID NO：37)、Ma04_g23390.2(SEQID NO：38)、Ma03_g06970.1(SEQ ID NO：39)、Ma05_g09980.1(SEQ ID NO：40)、Ma04_g36640.1(SEQ ID NO：41)、Ma11_g04180.1(SEQ ID NO：42)、Ma11_g02650.1(SEQ ID NO：43)以及Ma00_g04770.1(SEQ ID NO：44)所组成的群组的一核酸序列具有至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或为选自所述群组的一核酸序列。
根据本发明的一些实施例，编码所述乙烯生物合成途径中的所述蛋白质组分的所述基因组核酸序列包括与选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g35640(SEQ IDNO：9)、Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)、Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)以及Ma07_g19730(SEQID NO：27)所组成的群组的一核酸序列具有至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或为选自所述群组的一核酸序列。
根据本发明的一些实施例，编码所述乙烯生物合成途径中的所述蛋白质组分的所述基因组核酸序列包括与选自于由Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)及Ma07_g19730(SEQ IDNO：27)所组成的群组的一核酸序列具有至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或选自所述群组的一核酸序列。
根据本发明的一些实施例，编码所述乙烯生物合成途径中的所述蛋白质组分的所述基因组核酸序列包括与选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g31490(SEQ IDNO：8)及Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)所组成的群组的一核酸序列具有至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同或为选自所述群组的一核酸序列：。
根据本发明的一些实施例，使用一DNA编辑媒介来引入所述非天然的功能丧失突变。
根据本发明的一些实施例，所述植物不包括:编码所述DNA编辑媒介的一转基因、编码一选择标记或一报告子(reporter)的一转基因或不包括编码任何DNA编辑媒介、选择标记或所述报告子的一转基因。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括一DNA编辑***，所述DNA编辑***选自于由大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)及CRISPR-Cas所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介是CRISPR-Cas。
根据本发明的一些实施例，所述突变是纯合子形式。
根据本发明的一些实施例，所述突变选自于由缺失、***、***/缺失(***缺失)及取代所组成的群组。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种核酸构建体，其包括编码一DNA编辑媒介及一DNA靶向媒介的一核酸序列，其中所述靶向媒介将所述编辑媒介靶向至一基因组核酸序列，所述基因组核酸序列编码一香蕉的一乙烯生物合成途径中的一蛋白质组分，在基因组核酸序列中引入一功能丧失突变，其中所述编辑媒介及靶向媒介可操作地连接至一植物启动子，并且相较于缺乏所述功能丧失突变的一香蕉植物，其中所述突变导致所述蛋白质的程度降低或活性降低。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介及所述DNA靶向媒介产生一种突变，所述突变为所述权利要求1至13任一项所述的所述植物基因组中的多种突变中的一种。
根据本发明的一些实施例，所述DNA靶向媒介被设计用于靶向核酸，所述核酸对于编码所述乙烯生物合成途径中的一组分的一个以上基因组核酸序列而言是共有的。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括与选自于由SEQ ID NO：47至54所组成的群组的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括与SEQ ID NO：47所示的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47所示的一核酸序列
根据本发明的一些实施例，所述核酸构建体包括两个或更多个DNA编辑媒介，所述DNA编辑媒介包括选自SEQ ID NO：47至54所示的核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述核酸构建体包括两个或更多个DNA编辑媒介，所述DNA编辑媒介包括选自SEQ ID NO：47、49或50所示的核酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述核酸构建体包括至少两个DNA编辑媒介，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：51及53所示的核酸序列。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种增加香蕉的保质期的方法，所述方法包括：
(a)利用权利要求14至22任一项所述的核酸构建体来转化一香蕉植物的一个或多个细胞；
(b)在编码所述乙烯生物合成途径的所述蛋白质组分的所述基因组核酸序列中产生所述功能丧失突变，其中所述突变导致所述蛋白质程度降低或活性降低；以及
(b)从所述植物细胞再生一植物。
根据本发明的一些实施例，所述DNA编辑媒介是CRISPR-Cas以及所述DNA靶向媒介是sgRNA。
根据本发明的一些实施例，编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一蛋白质组分的所述基因组核酸序列选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g35640(SEQ IDNO：9)、Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)、Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)及Ma07_g19730(SEQ IDNO：27)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述sgRNA的DNA靶向媒介选自于由sg-183(SEQ IDNO：47)、sg-184(SEQ ID NO：48)、sg-188(SEQ ID NO：49)、sg-189(SEQ ID：50)、sg-190(SEQID NO：51)、sg-191(SEQ ID NO：52)、sg-194(SEQ ID NO：53)及sg-195(SEQ ID NO：54)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述功能丧失突变如本文所述。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种包括突变香蕉的突变香蕉植物，其中所述突变植物在编码1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)蛋白的一基因中包括一突变，其中相较于缺乏所述突变的一香蕉的所述蛋白质的活性，所述突变香蕉植物的所述ACS蛋白质的活性降低，并且其中所述突变的香蕉果实的成熟速度慢于缺乏突变的一香蕉植物的香蕉。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种包括突变香蕉的突变香蕉植物，其中所述突变植物包括基因Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)中的一突变，其中基因Ma09_g19150编码蛋白1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)，其中相较于缺乏突变的一香蕉植物的蛋白质的活性，所述突变香蕉植物的ACS蛋白质的活性降低，并且其中所述突变的香蕉果实的成熟速度慢于缺乏突变的一香蕉植物的香蕉。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种包括突变香蕉的突变香蕉植物，其中所述突变植物包括基因Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)中的一突变，其中基因Ma04_g356400编码蛋白质1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)，其中相较于缺乏突变的一香蕉植物的蛋白质的活性，所述突变香蕉植物的ACS蛋白质的活性降低，并且其中所述突变的香蕉果实的成熟速度慢于缺乏突变的一香蕉植物的香蕉。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种包括突变香蕉的突变香蕉植物，其中所述突变植物包括基因Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)中的一突变，其中基因Ma04_g31490编码蛋白质1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)，其中相较于缺乏突变的一香蕉植物的蛋白质的活性，所述突变香蕉植物的ACS蛋白质的活性降低，并且其中所述突变的香蕉果实的成熟速度慢于缺乏突变的一香蕉植物的香蕉。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种包括突变香蕉的突变香蕉植物，其中所述突变植物在编码一ACC氧化酶(ACO)蛋白的一基因中包括一突变，其中相较于缺乏突变的一香蕉植物的蛋白质的活性，所述突变香蕉植物中的所述ACO蛋白的活性降低，并且其中突变的香蕉果实的成熟速度慢于缺乏突变的一香蕉植物的香蕉。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种包括突变香蕉的突变香蕉植物，其中所述突变植物包括基因Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)中的一突变，其中相较于缺乏突变的一香蕉植物的蛋白质的活性，所述突变香蕉植物中的所述ACO蛋白的活性降低，并且其中突变的香蕉果实的成熟速度慢于缺乏突变的一香蕉植物的香蕉。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供一种包括突变香蕉的突变香蕉植物，其中所述突变植物包括基因Ma07_g19730(SEQ ID NO：27)中的一突变，其中基因Ma07_g19730编码蛋白ACC氧化酶(ACO)，其中相较于缺乏突变的一香蕉植物的蛋白质的活性，所述突变香蕉植物中的所述ACO蛋白的活性降低，其中突变的香蕉果实的成熟速度慢于缺乏突变的一香蕉植物的香蕉。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种生产香蕉的方法，所述方法包括：
(a)种植如本文所述的植物；以及
(b)从所述植物中收获果实。
根据本发明的一些实施例，所述植物或其部分是一植物部分。
根据本发明的一些实施例，所述植物部分是一果实。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种包括所述植物部分的加工香蕉产品。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含意相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法及材料可以用于本发明的实施例的实践或测试中，但是在下文中描述了示例性的方法及/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书及其定义为准。另外，材料、方法及实施例仅是说明性的，并不旨在必然地限制本发明。
图示说明
在本文中仅通过示例的方式，参考所述多个附图来描述本发明的一些实施例。现在具体地参考所述多个附图，应当理解，所示出的细节是作为示例并且出于对本发明的实施例的说明性讨论的目的。因此，显而易见的，结合附图中的描述使本领域技术人员清楚地知道如何实施本发明的实施例。
在所述多个附图中：
图1是取自Bleecker及Kende的2000年.Annu.Rev.Cell.Dev 16:1-18的乙烯生物合成途径的一示意图。
图2是选择包括一基因组编辑事件的细胞的方法的一实施例的一流程图。
图3显示使用mCherry的质粒对香蕉原生质体的阳性转染。使用带有mCherry(荧光标记)的质粒pAC2010的PEG来转染1x106个香蕉原生质体。转染后3天，在一荧光显微镜下分析所述转染效率。所述图显示多个香蕉原生质体，上图为明视野，下图为荧光。
图4A显示阳性mCherry香蕉的FACS富集。使用带有所述荧光标记mCherry的质粒pAC2010的PEG来转染1x106个香蕉原生质体。转染后三天，通过FACS来分析多个原生质体，通过分选并收集所有mCherry阳性细胞。
图4B显示阳性mCherry香蕉原生质体的FACS富集。通过荧光显微镜证实mCherry香蕉原生质体的富集。在转染后3天，利用一荧光显微镜对未分选的(上图)及分选的(下图)转染的原生质体进行成像。
图5A至图5C显示mCherry阳性香蕉原生质体随时间的减少，其指示多个瞬时转化事件。在转染后的第3天(图5A)及第10天(图5B)对转染带有所述mCherry荧光标记的一质粒的多个香蕉原生质体进行成像。图5C为通过FACS测量，观察到转染后直至25天，mCherry阳性原生质体的数量逐渐减少。100％代表转染后3天樱桃表达细胞的所述比例。
图6A显示mCherry阳性香蕉原生质体随时间的减少，其表示在未分选的原生质体上的瞬时转化事件以及在FACS之前成像。利用带有所述mCherry荧光标记(pAC2010)的一质粒或不含DNA来转染小果野蕉(Musa acuminata)原生质体。如图所示，在转染后的第3、6及10天对未分选的原生质体成像。显微图像显示，随着时间的推移，mCherry阳性原生质体的数量及强度逐渐降低。BF(明视野)。
图6B显示mCherry阳性原生质体随时间的减少，其表示在分选的原生质体上的瞬时转化事件以及在FACS之后成像。如本文所示，利用带有所述mCherry荧光标记的质粒(2010)所转染的小果野蕉的原生质体被分选并在转染后的第3、6及10天成像。显微图像显示，随着时间的推移，mCherry阳性原生质体的数量及强度逐渐降低。BF(明场)。
图7A至图7B是在番茄(S.lycopersicum)及香蕉(M.acuminata)中的***1至***2的过渡期间，所述乙烯生物合成及调节的一示意图。从S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-Ado-Met)到1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)到乙烯的所述乙烯两步骤生化途径的简化方案，以及在番茄(图7A)及香蕉果实成熟(图7B)期间从***1过渡到***2的基因。从***1到***2的所述过渡取决于所述ACC合成酶(ACS)及ACC氧化酶(ACO)基因家族的几个成员的基因表达调控。多个紫色框表示已选择进行进一步分析的所述番茄基因。番茄试验方案改编自Alexander及Grierson，2002年，Journal of Experimental Botany,第53卷,第377卷,第2039至2055页；Cara及Giovannoni，2008年，Plant Science第175卷,第106至113页；以及Pech等人，2012年，Annual Plant Reviews,第44卷,第275至304页。香蕉试验方案是基于所述番茄的发现及Liu等人，1999年，PlantPhysiology，第121卷，第1257至1265页，以及Rudus等人，2013年，ActaPhysiol Plant，第35卷，第295至307页。
图8是ACC合成酶(ACS)基因的所述演化关系的一示意图。所述演化历史是使用所述近邻相接法(Neighbor-Joining method)所推导的。在bootstrap测试中，相关分类群聚在一起的复制树(1000个复制)的百分比显示为多个彩色分支(红色＜20％；蓝色50％；绿色＞90％)。虚线的紫色框表示所述番茄基因已被证明与番茄果实的成熟有关，并且被用作查询序列以检索香蕉基因组中紧密相关的基因。多个橙色的基因识别码(Gene IDs)表示香蕉的候选基因，所述候选基因最有可能与涉及果实成熟的所述特征化的番茄基因同源。
图9是ACC氧化酶(ACO)基因的所述演化关系的一示意图。所述演化历史是使用所述近邻相接法所推导的。在bootstrap测试中，相关分类群聚在一起的复制树(1000个复制)的百分比显示为多个彩色分支(红色＜20％；蓝色50％；绿色＞90％)。多个紫色或红色的基因识别码分别表示来自拟南芥(Arabidopsis)或番茄的基因，这些基因已在果实成熟期间进行表征，并被用作查询序列以检索香蕉基因组中紧密相关的基因。多个橙色的基因识别码表示香蕉的候选基因，所述候选基因最有可能与涉及果实成熟的所述特征化的番茄基因(与番茄及拟南芥)同源。
图10显示选择多个sgRNA的一例子。在使用公开可用的演算法查找及设计感兴趣的序列中的多个sgRNA之后，手动管理步骤可确保选择与根据经验显示或预测对蛋白质功能重要的区域重叠的sgRNA(多个红色框)。多个蓝色框突出显示设计的多个sgRNA的位置。根据本发明的多个实施例，选择与蓝色及红色框重叠的多个sgRNA。
图11是显示在香蕉果实中选择的ACS候选基因的基因表达的一图表。实验条件在D'Hont等人，2012年8月9日，Nature；488(7410):213-7中进行描述。在开花之后(40、60及90天)收获果实，并在20℃下放置5天，未经处理(-)或用乙炔处理(+)，从而检查成熟的香蕉果实中的转录组的变化。RNA测序(RNAseq)数据表示乙炔处理诱导了所述香蕉ACS候选基因Ma04_g35640的基因表达的改变。
图12是显示在香蕉果实中选择的ACO候选基因的基因表达的一图表。实验条件在D'Hont等人，2012年8月9日，Nature；488(7410):213-7中进行描述。在开花之后(40、60及90天)收获果实，并在20℃下放置5天，未经处理(-)或用乙炔处理(+)，从而检查成熟的香蕉果实中的转录组的变化。RNA测序(RNAseq)数据表示乙炔处理诱导了香蕉ACO候选基因Ma07_g19730的基因表达的改变。
图13A至图13D显示测序分析及T7测定，其揭示所述候选基因Ma09_19150中的突变的存在。(图13A)代表Ma09_19150基因座的卡通图，所述卡通图表示基于与其他ACS基因的保守区域所设计及选择的所述多个sgRNA的相对位置。(图13B)利用所述多个sgRNA区域外的多个特异性引子来扩增的Ma09_19150基因座，并将其克隆到pBLUNT(Invitrogen)中进行序列分析及T7E1测定。(图13C)通过所述T7E1测定法来测定的突变检测。“Ctr”表示不含多个sgRNA的对照质粒，WT表示未转染的样品(无DNA)。07及08是使用的所述sgRNA的组合。(图13D)将经由多个特定sgRNA引导的所述基因组编辑机制的表达所诱导的突变DNA序列与野生型(WT)序列对齐。所述PAM以灰色突出显示，而所述多个sgRNA以红色字母显示。在分析的几个克隆中发现多个小缺失(Small deletions)。
图14A至图14C显示T7测定结果，其揭示所述候选基因Ma04_35640中的突变的存在。(图14A)代表Ma04_35640基因座的卡通图，所述卡通图表示基于与其他ACS基因的保守区域所设计及选择的所述多个sgRNA的相对位置。(图14B)利用所述多个sgRNA区域外的特异性引子来扩增的Ma04_35640基因座，从而用于T7E1测定。(图14C)通过所述T7E1测定法来测定的突变检测。“Ctr”表示不含多个sgRNA的对照质粒，WT表示未转染的样品(无DNA)。07及08是使用的所述sgRNA的组合。
图15A至图15D显示测序分析及T7测定，其揭示所述候选基因Ma04_31490中的突变的存在。(图15A)代表Ma04_31940基因座的卡通图，所述卡通图表示基于与其他ACS基因的保守区域所设计及选择的所述多个sgRNA的相对位置。(图15B)利用所述多个sgRNA区域外的多个特异性引子来扩增的Ma04_31490基因座，并将其克隆到pBLUNT(Invitrogen)中进行序列分析及T7E1测定。(图15C)通过所述T7E1测定法来测定的突变检测。“Ctr”表示不含多个sgRNA的对照质粒，WT表示未转染的样品(无DNA)。07及08是使用的所述sgRNA的组合。(图15D)将经由多个特定sgRNA引导的所述基因组编辑机制的表达所诱导的突变DNA序列与野生型(WT)序列对齐。所述PAM以灰色突出显示以及所述多个sgRNA以红色字母显示。在分析的几个克隆中发现WT及多个小缺失(Small deletions)。
图16A至图16C显示T7测定结果，其揭示所述候选基因Ma07_19730中的突变的存在。(图16A)代表Ma07_19730基因座的卡通图，所述卡通图表示基于与其他ACO基因的保守区域所设计及选择的所述多个sgRNA的相对位置。(图16B)利用所述多个sgRNA区域外的特异性引子来扩增的Ma07_19730基因座，从而用于T7E1测定。(图16C)通过所述T7E1测定法来测定的突变检测。“Ctr”表示不含多个sgRNA的对照质粒，WT表示未转染的样品(无DNA)。11及12是使用的所述sgRNA的组合。
图17A至图17C显示T7测定结果，其揭示所述候选基因Ma01_11540中的突变的存在。(图17A)代表Ma01_11540基因座的卡通图，所述卡通图表示基于与其他ACO基因的保守区域所设计及选择的所述多个sgRNA的相对位置。(图17B)利用所述多个sgRNA区域外的特异性引子来扩增的Ma01_11540基因座，从而用于T7E1测定。(图17C)通过所述T7E1测定法来测定的突变检测。“Ctr”表示不含多个sgRNA的对照质粒，WT表示未转染的样品(无DNA)。11及12是使用的所述sgRNA的组合以及231是野生型gDNA。
图18显示所述基因Ma01_11540中的突变的测序分析。将经由多个特定sgRNA引导的所述基因组编辑机制的表达所诱导的突变DNA序列与野生型(WT)序列对齐。所述PAM以灰色突出显示以及所述多个sgRNA以红色字母显示。在分析的几个克隆中发现WT及多个小缺失。
图19显示所述基因Ma01_11540中的突变的测序分析。将经由多个特定sgRNA引导的所述基因组编辑机制的表达所诱导的突变DNA序列与野生型(WT)序列对齐。所述PAM以灰色突出显示、所述多个sgRNA以红色字母显示以及多个***以绿色字母显示。在分析的几个克隆中发现WT及多个小缺失。
图20A至图20B显示具有各种sgRNA的所述候选基因Ma01_11540中的突变的测序分析。将经由多个特定sgRNA引导的所述基因组编辑机制的表达所诱导的突变DNA序列与野生型(WT)序列对齐。所述PAM以灰色突出显示及所述多个sgRNA以红色字母显示。在分析的几个克隆中发现WT序列及多个大缺失(large deletions)。
图21显示在靶向ACS基因中的多个基因组编辑事件的证据的一概要。通过以下方式来评估基因组编辑事件：(i)PCR、克隆及测序；以及(ii)T7EI测定。Y＝检测到***缺失；N＝未检测到***缺失；X＝不确定的数据。
图22显示在靶向ACO基因中的多个基因组编辑事件的证据的一概要。通过以下方式来评估基因组编辑事件：(i)PCR、克隆及测序；以及(ii)T7EI测定。Y＝检测到***缺失；N＝未检测到***缺失；X＝不确定的数据。
图23A至图23E显示转染的香蕉原生质体的再生。图23A：新鲜分离的原生质体，利用质粒pAC007、pAC2008、pAC2010、pAC2011或pAC2012来处理所述原生质体。图23B：发生在原生质体分离及转染后48小时的第一次细胞***。图23C：在1至2个月之后会发育成胚细胞的微愈伤组织(Microcalli)。图23D：来自胚胎发生细胞的前胚发育；图23E：球状胚胎；图23F：再生香蕉苗。
图24A显示转染的香蕉原生质体的再生。图24A：在含有MS盐及维生素的发芽培养基(GM)中从转染的香蕉原生质体衍生的成熟胚胎；
图24B至图24C显示在转移之后的1至2周，胚胎开始发芽；
图24D：在转移到GM(发芽培养基)之后的3至4周发芽的胚芽，准备转移到增殖培养基中进行芽伸长。
图25A至图25E显示轰击的香蕉(bombarded banana)胚发生细胞悬浮液(ECS)的再生以延长保质期。图25A：在增殖培养基上轰击后的3天龄ECS；图25B：在轰击一星期后，轰击的ECS扩散；图25C：在受到胚发育培养基(EDM)轰击一个月后，受轰击的ECS产生了胚。图25D：胚在成熟培养基上；图25E：球状胚。
图26显示根据本发明的一些实施例所使用的ACO及ACS序列以及多个sgRNA、多个sgRNA结合位点及引子。红色突出显示表示所述多个sgRNA沿着所述目标序列的所述多个位置；在所述附图中提供了颜色代码。
具体实施方式
在本发明的一些实施例中，本发明涉及用于增加香蕉的保质期的多种组合物及方法。
在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明的应用并不一定限于以下描述中所阐述的或由所述多个示例所举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例，或者能够以各种方式被实践或执行。
乙烯是最简单的不饱和烃(带有双键的两个碳原子)的一种气态植物激素，所述气态植物激素可调节所述植物生命周期中的所有生理过程。乙烯负责以下方面的信号变化：种子的休眠及发芽、根的生长及结瘤、枝及叶形成、花及果实发育、不同器官的衰老及脱落、植物防御机制以及与其他植物激素的多种相互作用。尽管乙烯对于植物的正常生长、发育及存活无疑是必不可少的，但在某些情况下它也可能对植物有害。根据报道，暴露于各种压力下的植物中的乙烯含量升高，包括冷害、高温、营养缺乏、厌氧菌、创伤及病原体感染、结果对植物生长及健康的损害增加。因此，在成熟、感官或压力条件下，在基因上改变乙烯的量，从而产生具有更健壮及/或理想性状的植物性状，这在商业上具有很大的商业利益。
使用CRISPR Cas9基因组编辑技术的最成熟的植物基因工程方法需要将新的DNA***宿主的基因组。这种***、带有多个转录单元的转移DNA(T-DNA)，从而成功完成CRISPRCas9基因组编辑。这些通常由选择转基因植物的一抗生素抗性基因、所述Cas9机制以及几个sgRNA单元组成。由于将外源DNA整合到所述基因组中，以这种方式产生的植物被归类为转基因或基因改造(GM)的植物。一旦在宿主中建立一基因组编辑，就可以通过有性繁殖及育种来去除所述T-DNA，因为不再需要所述CRISPR Cas9机制来维持所述表型。然而，对于不能产生种子的单性结实作物，例如：香蕉，则不能通过有性繁殖去除T-DNA。
本发明的多个实施例涉及在所述香蕉的所述乙烯生物合成途径中用于基因组编辑的靶标的鉴定。
因此，为了降低香蕉植物中的乙烯含量，这可能导致香蕉果实的保质期的延长，并且尝试剔除(knockout)涉及所述乙烯生物合成的基因，包括ACS及ACO(图7A、图7B)。然而，香蕉基因组包括与这些基因同源的多个序列。
为了鉴定所述香蕉基因组中编码功能性ACS及ACO的优良靶基因，从模型或农作物物种的特征途径中鉴定同源序列。所述过程涉及用于DNA及蛋白质序列的比较分析的一连串的连续步骤，其旨在通过***发育分析(phylogenetic analysis)来重建基因的演化历史，通过验证候选基因在普通组织及靶组织中的表达来过滤候选基因，并且对候选基因进行测序以确保合适的sgRNA的设计(避免不匹配)。这个过程允许选择基因、鉴定用于剔除的最佳靶区域(保守及潜在的催化结构域)以及设计多个适当的sgRNA。
利用针对所述乙烯生物合成途径中的多个基因的多个sgRNA来转染香蕉原生质体后，本发明人能够在关键基因(例如：Ma07_g19730及Ma04_g35640)以及所述家族的其他基因中鉴定出稳健的基因组编辑，从而通过冗余(redundancy)来避免补偿(compensation)。这些原生质体也经受再生试验方案的作用，从而获得具有一长保质期的香蕉植物(参见图8至图25A至图25E)。
因此，根据一个方面，本发明提供一种增加香蕉的保质期的方法，所述方法包括：
(a)使一香蕉植物细胞经受针对一核酸序列的一DNA编辑媒介的作用，所述核酸序列编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分，从而导致编码所述乙烯生物合成途径的所述核酸序列中的一功能丧失突变，以及
(b)从所述植物细胞再生一植物。
如本文所用，术语“香蕉”是指芭蕉属的植物，包括：大蕉(Plantains)。
根据一个具体的实施例，所述香蕉是三倍体。
同时考虑其他倍性(ploidies)，包括二倍体及四倍体。
如本文所用，“植物”是指完整的植物、嫁接的植物、植物的亲代及子代以及植物部分，包括：种子、果实、芽(shoots)、茎、根(包括：块茎)、砧木(rootstock)、接穗(scion)及植物细胞、组织及器官。
根据一个具体的实施例，所述植物部分是果实。
根据一个具体的实施例，所述植物部分是种子。
“种子”是指一开花植物的繁殖单位，其能够发育成另一种这样的植物。
根据一个具体的实施例，所述细胞是一生殖细胞。
根据一个具体的实施例，所述细胞是一体细胞。
所述植物可以是任何形式，包括：悬浮培养物、原生质体、胚、分生组织区(meristematic regions)、愈伤组织、叶片、配子体、孢子体、花粉及小孢子。
根据一个具体的实施例，所述植物部分包含DNA。
以下是可根据本发明所使用的品种的一非限制性列表。
AA群组：
二倍体的香蕉(Musa acuminate)，野生香蕉植物及栽培品种
青安香蕉(Chingan banana)
拉卡坦香蕉(Lacatan banana)
小米蕉(Lady Finger banana)(糖香蕉)
Pisang jari buaya(鳄鱼手指香蕉)
Figure BDA0002357667420000231
香蕉(Monkoy、Arnibal香蕉、Cuarenta dias、
Figure BDA0002357667420000232
Pisang EmpatPuluh Hari、Pisang Lampung)[12]
Sinwobogi香蕉
AAA群组：
三倍体的小果野蕉(Musa acuminata)，野生香蕉植物及栽培品种
香芽蕉亚组(Cavendish Subgroup)
‘矮人香芽蕉’(Dwarf Cavendish)
‘巨人香芽蕉’(‘威廉斯’)
‘Grand Nain'(‘Chiquita')
‘马萨克希乔’(Masak Hijau)
‘Robusta’
‘Red Dacca’
矮红香蕉(‘Dwarf Red banana’)
格罗斯米歇尔香蕉(‘Gros Michel banana’)
东非高地香蕉(AAA-EA子组)
AAAA群组：
四倍体的小果野蕉，野生香蕉及栽培品种
Bodles Altafort香蕉
金美香蕉(Golden Beauty banana)
AAAB群组：
芭蕉杂交大蕉的四倍体栽培种
Atan香蕉
金手指香蕉(Goldfinger banana)
AAB群组：
香蕉(Musa×paradisiaca)的三倍体栽培品种。所述群组包含由“真”大蕉或非洲大蕉组成的所述大蕉亚群组，其多样性以中部非洲及西部非洲为中心，可能在2000至3000年前从亚洲引进祖先大蕉后，大量的品种被培育。
Iholena及Maoli-Popo'ulu亚群组被称为太平洋大蕉。
Iholena亚组：在太平洋地区培育的烹饪香蕉亚组
Maoli-Popo'ulu亚组：在太平洋地区培育的烹饪香蕉亚组
Figure BDA0002357667420000241
香蕉
Popoulu香蕉
Mysore亚组：烹饪及甜点香蕉[15]
Mysore香蕉
Pisang Raja亚组
Pisang Raja香蕉
大蕉亚组
法国大蕉
法国青香蕉(Green French banana)
牛角大蕉(Horn plantain)及犀牛角香蕉(Rhino Horn banana)
Nendran香蕉
法国粉香蕉
老虎香蕉(Tiger banana)
梨子组
石榴香蕉
Figure BDA0002357667420000251
香蕉(矮人巴西香蕉，矮人Prata)
丝绸亚组(Silk subgroup)
拉通丹香蕉(丝绸香蕉，苹果香蕉)
其他
Pisang Seribu香蕉
plu香蕉
AABB群组：
香蕉(Musa×paradisiaca)的四倍体栽培品种
卡拉马戈香蕉
Pisang Awak(杜卡斯香蕉)
AB群组：
香蕉(Musa×paradisiaca)的二倍体栽培品种
Ney Poovan香蕉
ABB集团
香蕉(Musa×paradisiaca)的三倍体栽培品种
蓝爪哇香蕉(冰淇淋香蕉，Ney mannan，灰大蕉(Ash plantain)，Pata hina，Dukuru，Vata)
Bluggoe亚组
Bluggoe香蕉(也称为orinoco及“burro”)
银色Bluggoe香蕉
Pelipita香蕉(Pelipia、Pilipia)
Saba亚组
萨巴香蕉(Cardaba、Dippig)
Cardaba香蕉
Benedetta香蕉
ABBB群组：
香蕉(Musa×paradisiaca)的四倍体栽培种
Tiparot香蕉
BB群组：
二倍体芭蕉科、野生香蕉
BBB群组：
三倍体野蕉(Musa balbisiana)，野生香蕉及栽培品种
Kluai Lep Chang Kut
根据一个具体的实施例，所述植物是一植物细胞，例如：在胚细胞悬浮液中的植物细胞。
根据一个具体的实施例，所述植物细胞是一原生质体。
所述原生质体衍生自任何植物组织，例如：根、叶、胚细胞悬浮液、愈伤组织或幼苗组织。
如本文所用，“乙烯生物合成途径中的组分”是指对于香蕉中的乙烯生物合成所必须的多肽，例如：酶。具体地，乙烯的生物合成从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)开始，并且包括两个关键步骤(图1)，如Pech等人所述(2010年，乙烯生物合成，摘自：植物激素：生物合成、转导、作用，第3版，Springer,Dordrecht,第115至136页)。
所述乙烯的生物合成途径包括借助AdoMet合成酶将甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet，SAM)。1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)[EC4.4.1.14]将SAM的环化催化为1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，这通常被认为是所述途径中的限速反应。ACS还生产5'-甲硫基腺苷(MTA)，所述MTA被再循环以再生甲硫氨酸。最后的步骤是通过ACC氧化酶(ACO)的催化来将ACC以氧依赖性转化成乙烯[EC 1.14.17.4]。ACC通过修饰ACC的碳C-2及C-3而转化为乙烯，而C-1转化为氰化物，以及所述羧基转化为二氧化碳。
根据一个具体的实施例，所述AdoMet合成酶是香蕉AdoMet。
所有登录号对应于名为Pahang(2n＝22)整合版本2的所述种质收集登录号的可公开获得的基因组M.acuminata的双单倍体。
所有登录号对应于名为Pahang(2n＝22)整合版本2的所述种质收集登录号的可公开获得的基因组M.acuminata的双单倍体。
根据一个具体实施例，所述ACS为：
＞Ma01_g07800.1(SEQ ID NO：1)；
＞Ma01_g12130.1(SEQ ID NO：2)；
＞Ma02_g10500.1(SEQ ID NO：3)；
＞Ma03_g12030.1(SEQ ID NO：4)；
＞Ma03_g27050.1(SEQ ID NO：5)；
＞Ma04_g01260.1(SEQ ID NO：6)；
＞Ma04_g24230.1(SEQ ID NO：7)；
＞Ma04_g31490.1(SEQ ID NO：8)；
＞Ma04_g35640.1(SEQ ID NO：9)；
＞Ma04_g37400.1(SEQ ID NO：10)；
＞Ma05_g08580.1(SEQ ID NO：11)；
＞Ma05_g13700.1(SEQ ID NO：12)；
＞Ma09_g19150.1(SEQ ID NO：13)；或
＞Ma10_g27510.1(SEQ ID NO：14)；
根据一个具体实施例，所述ACO为：
＞Ma09_g04370.1(SEQ ID NO：15)；
＞Ma06_g17160.1(SEQ ID NO：16)；
＞Ma11_g05490.1(SEQ ID NO：17)；
＞Ma00_g04490.1(SEQ ID NO：18)；
＞Ma07_g15430.1(SEQ ID NO：19)；
＞Ma01_g11540.1(SEQ ID NO：20)；
＞Ma10_g16100.1(SEQ ID NO：21)；
＞Ma05_g08170.1(SEQ ID NO：22)；
＞Ma06_g14430.1(SEQ ID NO：23)；
＞Ma05_g09360.1(SEQ ID NO：24)；
＞Ma11_g22170.1(SEQ ID NO：25)；
＞Ma05_g31690.1(SEQ ID NO：26)；
＞Ma07_g19730.1(SEQ ID NO：27)；
＞Ma06_g02600.1(SEQ ID NO：28)；
＞Ma10_g05270.1(SEQ ID NO：29)；
＞Ma06_g14370.1(SEQ ID NO：30)；
＞Ma11_g05480.1(SEQ ID NO：31)；
＞Ma06_g14410.1(SEQ ID NO：32)；
＞Ma06_g14420.1(SEQ ID NO：33)；
＞Ma06_g34590.1(SEQ ID NO：34)；
＞Ma02_g21040.1(SEQ ID NO：35)；
＞Ma11_g04210.1(SEQ ID NO：36)；
＞Ma05_g12600.1(SEQ ID NO：37)；
＞Ma04_g23390.2(SEQ ID NO：38)；
＞Ma03_g06970.1(SEQ ID NO：39)；
＞Ma05_g09980.1(SEQ ID NO：40)；
＞Ma04_g36640.1(SEQ ID NO：41)；
＞Ma11_g04180.1(SEQ ID NO：42)；
＞Ma11_g02650.1(SEQ ID NO：43)；或
＞Ma00_g04770.1(SEQ ID NO：44)；
根据一个具体的实施例，所述ACO是Ma01_g11540.1(SEQ ID NO：20)及/或Ma07_g19730.1(SEQ ID NO：27)：
根据一个具体的实施例，所述ACS是Ma09_g19150.1(SEQ ID NO：13)、Ma04_g35640.1(SEQ ID NO：9)及/或Ma04_g31490.1(SEQ ID NO：8)：
同时考虑上述每个基因的天然存在的功能同源物，例如，如上文所定义，功能同源物表现出与上述基因具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有一ACS或ACO活性。
如本文所用，在两个核酸或多肽序列的环境(context)中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”或语法上的等同物包括当对齐时，在两个序列中的相同的残基。当使用序列相同的百分比来表示蛋白质时，将理解不相同的残基位置通常会因保守的氨基酸取代而有所不同，其中氨基酸残基被具有类似化学性质(例如：电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不会改变分子的功能特性。如果序列在保守取代中不同，则可以向上调整序列的同一性百分比以校正所述取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行所述调整的手段对于本领域技术人员而言是众所周知的。通常，这涉及将一保守取代评分为一部分错配而不是一全部错配，从而增加序列同一性的百分比。因此，例如，在一相同氨基酸的一得分为1以及一非保守取代的一得分为零的情况下，一保守取代的一得分为0至1。计算保守取代的所述得分，例如，根据Henikoff S及Henikoff JG的所述算法[来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992,89(22):10915-9]。
可以使用任何同源性比较软件来确定同一性，例如包括：国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastN软件，例如：使用默认参数。
根据本发明的一些实施例，所述同一性是一整体同一性(global identity)，即在本发明的整个核酸序列上而不是在其部分上的同一性。
如本文所用，“植物”是指完整的植物、嫁接的植物、植物的亲代及子代以及植物部分，包括：种子、果实、芽(shoots)、茎、根(包括：块茎)、砧木(rootstock)、接穗(scion)及植物细胞、组织及器官。
所述植物可以是任何形式，包括：悬浮培养物、原生质体、胚、分生组织区、愈伤组织、叶片、配子体、孢子体、花粉及小孢子。
根据一个具体的实施例，所述植物部分包含DNA。
根据一个具体的实施例，香蕉植物是一香蕉育种品系，更优选地是一优良育种品系(elite line)。
根据一个具体的实施例，所述香蕉植物是一优良育种品系。
根据一个具体的实施例，所述香蕉植物是一纯育种品系。
根据一个具体的实施例，所述香蕉植物是一香蕉品种或育种种质。
如本文所用，所述术语“育种品系”是指与野生品种或地方品种相反，具有商业价值或农学上期望的特征的一栽培香蕉的一品系。所述术语包括提及一优良育种品系或优良品系，其代表一个基本上是纯合子的、通常为自交的、用于生产商业F1杂种的植物品系。通过育种及选择优越的农艺性能来获得一个优良的育种品系，所述优越的农艺性能包括：许多农艺上的理想性状。一优良植物是一优良品系中的任何植物。优越的农艺性能是指本文所定义的多种农艺理想性状的一理想组合，其中理想的是与一非优良育种品系相比，大多数、优选地为所有农艺理想性状都被改善。优良育种系基本上是纯合子的，并且优选为自交品系(inbred lines)。
如本文所用，所述术语“优良品系”是指由于优越的农艺性能而育种及选择而产生的任何品系。优选地，优良品系具有多个，优选为至少3个、4个、5个、6个或更多个(基因)本文所定义的理想农艺性状的品系。
所述术语“栽培品种”及“品种”在本文中可互换使用，表示已通过育种(例如：杂交及选择)而刻意开发出的一种植物，其目的是为了商品化(例如：供农民及种植者使用)以生产自用或商业化的农产品。所述术语“育种种质”表示具有除一“野生”状态以外的一生物学状态的一植物，所述“野生”状态表示一植物或登录品(accession)的所述原始非栽培状态或自然状态。
所述术语“育种种质”包括但不限于：半天然、半野生、杂草丛生的、传统栽培品种、地方品种、育种材料、研究材料、种系、合成种群、杂种、创始原种(founder stock)/基础种群(base population)、自交种品系(杂交栽培品种的亲代)、隔离种群、突变的/遗传原种、市场类别及先进/改良栽培品种。如本文所用，所述术语“纯种的”、“纯自交的”或“自交的”是可互换的，并且是指通过重复的自交及/或回交而获得的一基本上纯合子的植物或植物品系。
如本文所用，“修饰基因组”是指在编码香蕉的乙烯生物合成途径中的一组分的至少一个等位基因中引入至少一个突变。根据一些实施例，修饰是指在所述乙烯生物合成途径的一组分的每个等位基因中引入一突变。根据至少一些实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分的所述两个等位基因上的所述突变为一纯合子形式。
根据一些实施例，编码所述乙烯生物合成途径中的所述组分的所述两个等位基因上的多个突变是非互补的。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介修饰所述乙烯生物合成途径中的所述组分的所述靶序列，并且不具有“脱靶(off target)”作用，即，不修饰所述香蕉基因组中的其他序列。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介在所述香蕉基因组中的一非必需基因上包括一“脱靶作用”。
非必需是指当利用所述DNA编辑媒介修饰后不会以一农业上有价值的方式(例如：营养价值、风味、生物量、产量、生物/非生物压力耐受性及其相似性质)来影响所述靶基因组的表型的一基因。
脱靶效应可以使用本领域已知的以及在本文中描述的方法来进行分析。
如本文所用，“功能丧失”突变是指一基因组畸变，其导致能力的降低(即功能受损)或所述乙烯生物合成途径的所述组分不能促进乙烯或其前体的合成。
如本文所用，“降低的能力”是指相较于不具有所述功能丧失突变的所述野生型酶，所述组分在所述乙烯生物合成途径作用(即乙烯的合成)中的活性降低。根据一个具体的实施例，相较于在相同测定条件下的野生型酶，所述降低的活性为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至更多。乙烯的生物合成可以通过气相色谱(GC)或基于激光的测定法在小植株(small plantlets)中进行测量(Cristescu SM、MandonJ、Arslanov D、De Pessemier J、Hermans C、Harren FJM，在植物中检测乙烯的现代方法。Ann Bot-伦敦，2013年；111(3):347–60)。
根据一个具体的实施例，所述功能丧失突变导致所述乙烯生物合成途径的mRNA或蛋白质的组分不表达(取决于编码所述乙烯生物合成途径的所述组分的所述基因中的所述偏差(aberration)的位置)。
根据一个具体的实施例，所述功能丧失突变导致所述乙烯生物合成途径的所述组分的表达，但是无法合成乙烯或其前体或者合成的效率较低。
根据一个具体的实施例，所述功能丧失突变选自于由缺失、***、***-缺失(Indel)、倒位、取代以及它们的组合(例如：缺失及取代，例如：缺失及多个单核苷酸多态性(SNPs))所组成的群组。
根据一个具体的实施例，所述功能丧失突变小于1Kb或0.1Kb。
根据一个具体的实施例，所述“功能丧失”突变在编码所述乙烯生物合成途径的所述组分的基因的所述5'中，从而抑制任何α表达产物(例如：外显子1)的产生。
根据一个具体的实施例，所述“功能丧失”突变是在所述基因中允许所述表达产物产生的任何位置，同时不能促进(有助于)乙烯或其前体的合成，即非活性的蛋白质。本文还提供所述基因的多个调节元件中的一突变，例如：启动子。
如本文所述，所述香蕉植物在编码所述乙烯生物合成途径的所述组分的一基因的至少一个等位基因中包括所述功能丧失突变。
根据一个具体的实施例，所述突变是纯合子的。
根据一个方面，本发明提供一种增加香蕉的保质期的方法，所述方法包括：
(a)使一香蕉植物细胞经受针对一核酸序列的一DNA编辑媒介的作用，所述核酸序列编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分，从而导致编码所述乙烯生物合成途径的所述核酸序列中的一功能丧失突变，以及
(b)从所述植物细胞再生一植物。
根据一个具体的实施例，所述方法还包括从所述植物中收获果实。
根据一个具体的实施例，在成熟前7至14天收获的果实仍然是绿色且坚硬的。每个香蕉成熟植物产生一束由许多香蕉果实或“手指(fingers)”组成，并且聚集在几只手中”(***粮食及农业组织，2014年)。利用一锋利的弯刀或一砍刀来“手工”(通常需要2至3人)切割香蕉束。
如本文所用，“增加的保质期”是指相较于具有相同遗传背景但不包括所述功能丧失突变且以保质期表示的香蕉植物，在所述基因组(如本文所述)中具有功能丧失突变的收获的香蕉果实的保质期至少增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或甚至95％，其通过本领域众所周知的方法而测定(参见下文中的多个示例部分)。通过追踪所述果实的颜色及坚硬度来估计所述保质期。
以下是根据本发明的多个具体实施例中，将核酸改变引入一感兴趣的基因的多种方法及DNA编辑媒介的各种非限制性示例的描述以及用于实现其的媒介。
使用人工核酸内切酶(engineered endonucleases)进行的基因组编辑，这种方法是指一种反向遗传学方法，通常使用人工核酸内切核酸酶在所述基因组中的一期望位置切割并产生特定的双链断裂，然后通过细胞内源性过程(例如：同源重组(homologousrecombination,HR)或非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)来进行修复。NHEJ通过一双链断裂直接连接所述DNA末端，同时HR利用一同源供体序列作为一模板(即S期形成的所述姐妹染色单体)在所述断裂位点再生所述缺失的DNA序列。为了将特定的核苷酸修饰引入所述基因组DNA，在HR期间必须存在含有所述期望的序列的一供体DNA修复模板(外源提供的单链或双链DNA)。
基因组编辑不能使用传统的限制性核酸内切酶来进行，因为大多数限制性内切酶都将所述DNA上的几个碱基对识别为它们的靶标，并且通常会在所述基因组的多个位置上发现这些序列，从而导致多次切割，而这些切割并不局限于一理想位置。为了克服这个挑战并产生特定于位点的单链或双链断裂，迄今为止已经发现了几种不同类别的核酸酶并对其进行生物工程改造。这些核酸酶包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)及CRISPR/Cas***。
大范围核酸酶(Meganucleases)：大范围核酸酶通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cys盒家族及HNH家族。这些家族的特征是结构基序(structuralmotifs)，所述结构基序影响催化活性及识别序列。例如，LAGLIDADG家族的成员的特征在于具有保守的LAGLIDADG基序的一个或两个拷贝。因此，对于保守的结构元件、DNA识别序列的特异性及催化活性而言，大分子核酸酶的四个家族彼此广泛分离。大范围核酸酶通常在微生物物种中发现，并且具有独特的特性，即具有非常长的识别序列(＞14个碱基对)，因此使得所述大范围核酸酶自然地具有非常高的特异性，可在一理想位置进行切割。
可以利用所述大范围核酸酶在基因组编辑中产生位点特异性双链断裂。本领域技术人员可以使用这些天然存在的大范围核酸酶，但是这种天然存在的大范围核酸酶的数量是有限的。为了克服此挑战，诱变及高通量筛选方法已用于创建识别独特序列的大范围核酸酶变体。例如，已经融合各种大范围核酸酶以产生识别新序列的杂合酶(hybridenzymes)。
替代地，可以改变大范围核酸酶的DNA相互作用氨基酸以设计序列特异性大范围核酸酶(参见例如：美国专利8,021,867)。可以使用多种方法来设计大范围核酸酶，例如在Certo，MT等人，Nature Methods(2012年)9：073-975；美国专利号8,304,222；8,021,867；8,119,381；8,124,369；8,129,134；8,133,697；8,143,015；8,143,016；8,148,098；或8,163,514，每个文献的内容通过引用整体并入本文。替代地，可以使用市售技术例如：PrecisionBiosciences的Directed Nuclease EditorTM基因组编辑技术来获得具有位点特异性切割特征的大范围核酸酶。
多个ZFN及TALEN：两种截然不同的工程化核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)及转录激活因子样效应子核酸酶(TALENs)，都可有效产生靶向的双链断裂(Christian等人，2010年；Kim等人，1996年；Li等人，2011年；Mahfouz等人，2011年；Miller等人，2010年)。
基本上，多个ZFN及TALEN限制性核酸内切酶技术利用一种非特异性的DNA切割酶，所述酶与一种特定的DNA结合结构域相连(分别是一连串的锌指结构域或TALE重复序列)。通常，选择其DNA识别位点及切割位点彼此分开的一限制性酶。所述切割部分被分离，然后连接至一DNA结合结构域，从而产生对一所需序列具有非常高特异性的一核酸内切酶。具有这种性质的一示例性限制酶是FokI。此外，FokI的优势是需要二聚化才能具有核酸酶活性，这意味着随着每个核酸酶伴侣(nuclease partner)识别一个独特的DNA序列，所述特异性都会大幅提高。为了增强这种效果，已经设计只能用作异二聚体并具有增加的催化活性的FokI核酸酶。具有异二聚体功能的核酸酶避免非期望的同二聚体活性的可能性，因此增加所述双链断裂的特异性。
因此，例如为了靶向一特定位点，多个ZFN及TALEN被构建为核酸酶对，所述核酸酶对中的每个成员被设计为在所述靶位点处结合相邻的序列。在细胞中瞬时表达后，所述核酸酶与它们的靶位点结合，以及所述FokI结构域异二聚体(FokI domainsheterodimerize)形成一双链断裂。通过所述非同源末端连接(NHEJ)途径来修复这些双链断裂通常会导致小缺失或小序列***。由于通过NHEJ进行的每次修复都是独特的，因此使用单个核酸酶对可以在所述靶位点处产生具有一连串不同缺失的等位基因系列(allelicseries)。
通常，在基因编辑依赖的错误NHEJ中，NHEJ是相对准确的(人类细胞中约85％的多个DSB在检测后约30分钟内被NHEJ修复)，因为当所述修复是准确时，所述核酸酶将继续切割，直到所述修复产物突变，以及所述识别/切割位点/PAM基序消失/突变，或者暂时引入的核酸酶不再存在。
所述缺失的长度通常介于几对碱基对到几百个碱基对之间，但是通过同时使用两对核酸酶在细胞培养中成功产生多个较大的缺失(Carlson等人，2012年；Lee等人，2010年)。此外，当将与目标区域具有同源性的一DNA片段与所述核酸酶对一起引入时，所述双链断裂可通过同源重组(HR)进行修复，从而产生特异性修饰(Li等人，2011年；Miller等人，2010年；Urnov等人，2005年)。
尽管多个ZFN及TALEN的核酸酶的部分具有相似的特性，但这些人工核酸酶之间的差异在于其DNA识别肽。多个ZFN依赖于Cys2-His2锌指，以及多个TALEN依赖于多个TALE。这两个DNA识别肽结构域都具有在其蛋白质中天然存在的特征。Cys2-His2锌指通常存在于间隔为3个碱基对的重复序列中，并以多种核酸相互作用蛋白的不同组合形式存在。另一方面，在所述氨基酸与所述识别的核苷酸对之间，在具有一对一识别比率的重复序列中发现多个TALE。由于多个锌指及多个TALE均以重复模式发生，因此可以尝试使用不同的组合来创建各种各样的序列特异性。制备位点特异性锌指核酸内切酶的多种方法包括：例如，模块组装(将与三联体序列相关的锌指连接成一排，从而覆盖所需序列)、OPEN(肽结构域的低严格性选择与三联体核苷酸，然后进行肽组合的高严格性选择与细菌***中的最终目标)，以及锌指库的细菌单杂交筛选等等。多个ZFN也可以从例如Sangamo BiosciencesTM(Richmond，CA)设计及商业获得。
设计及获得多个TALEN的方法在以下文献中描述，例如：Reyon等人，NatureBiotechnology 2012年5月；30(5)：460-5；Miller等人，Nat Biotechnol，(2011年)29：143-148；Cermak等人，Nucleic Acids Research(2011年)39(12)：e82及Zhang等人，NatureBiotechnology(2011年)29(2)：149–53。Mayo Clinic引入一最近开发的基于网络的程序，其称为Mojo Hand，所述程序用于设计用于基因组编辑应用程序的TAL及TALEN构建体(可以通过www(dot)talendesign(dot)org来访问)。TALEN也可以从例如：Sangamo BiosciencesTM(Richmond,CA)设计及商业获得。
T-GEE***(TargetGene的基因组编辑引擎)：提供一种可编程的核蛋白分子复合物，所述复合物包含一多肽部分及一赋予特异性的核酸(SCNA)，所述特异性的核酸在一靶细胞中进行体内组装，并且能够与预定的靶核酸相互作用。所述可编程的核蛋白分子复合物能够特异性地修饰及/或编辑所述靶核酸序列内的一靶位点及/或修饰所述靶核酸序列的功能。核蛋白组合物包括：(a)多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码一嵌合多肽的多核苷酸分子并且包括(i)能够修饰所述靶位点的一功能结构域及(ii)能够与一赋予特异性的核酸相互作用的一连接结构域，以及(b)赋予特异性的核酸(SCNA)，其包括(i)与位于所述靶位点侧面的所述靶核酸的一区域互补的一核苷酸序列，以及(ii)能够特异性地附着于所述多肽的所述连接结构域的一识别区域。所述组合物能够通过赋予特异性的核酸与一靶核酸的碱基配对，以高特异性及分子复合物与所述靶核酸的结合能力来精确、可靠及成本有效地修饰一预定的靶核酸序列。所述组合物的遗传毒性(genotoxic)较小，组装时采用模块化设计，无需定制即可使用单个平台，可在专用核心设施之外独立使用，并且开发周期短且成本较低。
CRISPR-Cas***(在本文中也称为“CRISPR”)：许多细菌及古细菌包含可降解入侵噬菌体及质粒核酸的内源性基于RNA的适应性免疫***。这些***由成簇规则间隔的短回文重复(CRISPR)的核苷酸序列组成，所述序列产生RNA组分及与CRISPR相关(Cas)的基因，所述基因编码多种蛋白组分。所述多个CRISPR RNA(crRNAs)包含与特定病毒及质粒的DNA同源的多个短片段，并且作为引导Cas核酸酶降解所述相应病原体的所述互补核酸的指南。化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR/Cas***研究表明，三个组分形成一RNA/蛋白质复合物，并且所述三个组分在一起足以产生序列特异性核酸酶的活性：所述Cas9核酸酶、一crRNA含有20个与所述靶序列同源的碱基对，以及一反式激活的crRNA(tracrRNA)(Jinek等人，Science(2012年)337：816-821)。
进一步证明，由crRNA及tracrRNA融合而成的一合成嵌合引导RNA(gRNA)可以引导Cas9在体外切割与所述crRNA互补的多个DNA靶标。同时还证明Cas9与合成的多个gRNA的瞬时表达可用于在多种不同物种中产生靶向的双链断裂(Cho等人，2013年；Cong等人，2013年；DiCarlo等人，2013年；Hwang等人，2013a，b；Jinek等人，2013年；Mali等人，2013年)。
所述CRIPSR/Cas***用于基因组编辑，其包含两个不同的组分：一gRNA及一核酸内切酶，例如：Cas9。
所述gRNA通常是20个核苷酸的序列，所述序列编码所述目标同源序列(crRNA)及所述内源细菌RNA的一组合，所述序列在单个嵌合转录物中将所述多个crRNA与所述Cas9核酸酶(tracrRNA)连接。通过所述gRNA序列与所述互补基因组DNA之间的碱基配对，将所述gRNA/Cas9复合物引进到所述靶序列。为了成功结合Cas9，所述基因组靶序列还必须包含紧随所述靶序列之后的正确的原间隔序列邻近基序(PAM)的序列。所述gRNA/Cas9复合物的结合将所述Cas9定位在基因组靶序列上，以便使所述Cas9可以切割所述DNA的两条链，从而导致一双链断裂。如同多个ZFN及TALEN，由CRISPR/Cas产生的所述多个双链断裂可以通过HR(同源重组)或NHEJ(非同源末端连接)修复，并且在DNA修复过程中容易受到特定序列修饰的影响。
所述Cas9核酸酶具有两个功能结构域：RuvC及HNH，各自切割不同的DNA链。当这两个结构域均具有活性时，所述Cas9会导致所述基因组DNA中出现双链断裂。
CRISPR/Cas的一显着优势是这个***的高效率以及容易创建多个合成gRNA的能力。这产生可以容易地被修饰以靶向不同基因组位点的修饰及/或靶向相同位点的不同修饰的一***。此外，已经建立能够同时靶向多个基因的试验方案。带有所述突变的大多数细胞在所述目标基因中出现双等位基因突变(biallelic mutations)。
然而，所述gRNA序列与所述基因组DNA靶序列之间的所述碱基配对的相互作用的明显灵活性允许通过Cas9来切割所述靶序列的不完美配对。
所述Cas9酶的改良版本包含被称为“切口酶(nickases)”的单个无活性的催化结构域(RuvC-或HNH-)。仅具有一个活性核酸酶结构域，所述Cas9切口酶仅切割所述靶DNA的一条链，从而形成一单链断裂或“切口”。单链断裂或切口大多是通过单链断裂修复机制来修复的，所述机制涉及蛋白质，例如但不限于：PARP(传感器)及XRCC1/LIG III复合物(连接)。如果单链断裂(SSB)是由拓扑异构酶I毒物或通过在天然存在的多个SSB上捕获PARP1的多种药物所产生，则单链断裂可能会持续存在，并且当所述细胞进入S期以及所述复制叉(replication fork)遇到这种多个SSB时，它们将成为多个单端DSB，所述多个单端DSB只能由HR修复。然而，由一Cas9切口酶引入的两个近端、相反的链切口被视为一双链断裂，所述双链断裂在通常被称为一“双切口”的CRISPR***中。如同其他多个DSB，可以通过HR或NHEJ来修复基本上为不平行的DSB的一双切口，所述修复取决于对所述基因靶标的预期作用及一供体序列的存在以及所述细胞周期阶段(HR具有较低的丰度并且只能在所述细胞周期的S及G2阶段发生)。因此，任何一个单独的gRNA将导致不太可能改变所述基因组DNA的多个切口，即使这些事件不是不可能的，因此，如果特异性及降低脱靶效应是重要的，则使用所述Cas9切口酶并通过设计两个gRNA来创建一双切口以降低脱靶效应，所述两个gRNA具有非常接近并且在所述基因组DNA的相反链上的靶序列。
所述Cas9酶的多种修饰形式包含两个无活性的催化结构域(死亡的Cas9或dCas9)，所述两个催化结构域不具有核酸酶活性，但仍能够基于gRNA特异性与DNA结合。所述dCas9可以用作一DNA转录调节因子的平台，通过将所述无活性酶融合到已知的多个调控结构域来激活或抑制基因表达。例如，dCas9单独与基因组DNA中的一靶序列的结合会干扰基因转录。
已经有许多公开可用的工具可帮助选择及/或设计靶序列以及生物信息列表，所述生物信息列表用于决定在不同物种中的不同基因的多个独特gRNA，例如：Feng Zhang实验室的Target Finder、Michael Boutros实验室的Target Finder(E-CRISP)，RGEN工具：Cas-OFFinder，CasFinder：用于识别基因组中特定Cas9靶标的灵活算法以及CRISPR的最佳靶标查找器。
可以在本发明中使用的一gRNA的多个非限制性示例包括在以下多个示例部分中所描述的内容。
为了使用所述CRISPR***，gRNA及Cas9均应位于一靶细胞中或作为一核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex)来递送。所述***载体可以在一单个质粒上包含两个盒或包含来自两个单独质粒的表达盒。多种CRISPR质粒是市售的，例如：来自Addgene的px330质粒。使用与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的(Cas)引导RNA技术及利用一Cas核酸内切酶来修饰植物基因组也至少在以下文献中公开：Svitashev等人，2015年，Plant Physiology，169(2)：931-945；Kumar及Jain，2015年，J Exp Bot 66：47-57；在美国专利申请第20150082478号中，所述专利通过引用整体并入本文。
“基因打靶的策略(Hit and run)”或“由内而外”涉及两步骤的重组程序。在第一步骤中，使用包含一双重正/负选择标记盒的一***型载体来引入所需的序列改变。所述***载体包含与所述靶基因座同源的一单个连续区域，并且被修饰以携带感兴趣的突变。在同源性区域内的一个位点，利用一限制性酶来线性化这个靶向构建体、引入所述细胞中，并且进行阳性选择以分离多个同源重组事件。带有所述同源序列的所述DNA可以以一质粒、单链或双链寡核苷酸的形式提供。这些同源重组体包含一局部重复(local duplication)，所述局部重复被干预的载体序列隔开，所述载体序列包括所述选择盒。在第二步骤中，对多个目标克隆进行阴性选择，从而鉴定出通过所述多个重复序列之间的染色体内重组而失去所述选择盒的细胞。所述局部重组事件消除所述重复，并且取决于所述重组位点，所述等位基因保留所述引入的突变或恢复为野生型。所述最终结果是引入了所需的修饰，而没有保留任何外源序列。
所述“双重替换”或“标记及交换”策略：涉及两步骤的选择程序，类似于所述基因打靶的策略，但需要使用两种不同的目标构建。在所述第一步骤中，将具有3'及5'的同源臂的一标准靶向载体用于在将要引入所述突变的所述位置附近处***一双重正/负选择盒。将所述多个***组分引入所述细胞并应用阳性选择后，可以确定多个HR事件。然后，将含有与所需突变具有同源性区域的一第二靶向载体引入多个靶向克隆，并进行阴性选择以去除所述选择盒并引入所述突变。所述最终的等位基因包含所需的突变，同时消除不需要的外源序列。
位点特异性重组酶：来自所述P1噬菌体的所述Cre重组酶及来自所述酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Flp重组酶是位点特异性DNA重组酶，每个重组酶都识别一独特的34个碱基对的DNA序列(分别称为“Lox”及“FRT”)以及分别在Cre或Flp重组酶表达后，可通过位点特异性重组来容易地去除两侧带有Lox位点或FRT位点的序列。例如，所述Lox序列由两侧具有13个碱基对的反向重复的一不对称的八个碱基对的间隔区域组成。通过与所述13个碱基对的反向重复结合并催化所述间隔区域中的链切割及重新连接，Cre重组所述34个碱基对的Lox DNA序列。通过Cre在所述间隔区域中形成的所述多个交错DNA切口被6个碱基对隔开，从而提供一个重叠区域，所述重叠区域用作一同源传感器(homologysensor)以确保只有具有相同重叠区域的重组位点才能进行重组。
基本上，所述位点特异性重组酶***(site specific recombinase system)提供在同源重组事件之后去除选择盒的多种方式。这个***还允许产生条件改变的等位基因，其可以以一时间或组织特异性的方式来失活或激活。应当注意，所述Cre及Flp重组酶留下34个碱基对的一Lox或FRT的“疤痕”。剩下的Lox或FRT位点通常留在所述修饰基因座的一内含子或3'UTR中，并且目前的证据表明这些位点通常不会显着干扰基因功能。
因此，Cre/Lox及Flp/FRT的重组涉及引入具有3'及5'同源臂的一靶向载体，所述3'及5'同源臂包含感兴趣的突变、两个Lox或FRT序列以及通常位于两个Lox或FRT序列之间的一选择盒。应用阳性选择，并鉴定出包含靶向突变的多个同源重组事件。Cre或Flp的瞬时表达与阴性选择一起导致所述选择盒的切除，并且选择丢失所述盒的细胞。所述最终的靶向等位基因包含外源序列的Lox或FRT疤痕。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介是CRISPR-Cas9。
本文提供多个示例性gRNA序列。
＞Ma04_g31490
GACTCTAAGATCAGGGTTAAAGG(SEQ ID NO：45)；
＞Ma09_g19150/Ma04_g35640/Ma04_g31490
GCAGCTAACATCAGGGTTAAAGG(SEQ ID NO：46)。
根据一个具体的实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)、Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)、Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)及Ma07_g19730(SEQ ID NO：27)所组成的群组。
根据一个具体的实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)及Ma07_g19730(SEQ ID NO：27)所组成的群组。
根据一个具体的实施例，所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)及Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)所组成的群组。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介针对核酸坐标，所述核酸坐标特异性地靶向所述乙烯生物合成途径中编码所述组分的一个以上的核酸序列。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介包括与选自于由SEQ ID NO：47至54(多个sgRNA：183、184、188、189、190、191、194及195)所组成的群组的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介包括与SEQ ID NO：47(sgRNA：183)所示的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47(sgRNA：183)所示的一核酸。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47至54所示的多个核酸序列(多个sgRNA：183、184、188、189、190、191、194及195)。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47、49及/或50所示的多个核酸序列(多个sgRNA：183、188、189)。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：51及/或53所示的多个核酸序列(多个sgRNA：190及194)。
通常使用表达载体将所述DNA编辑媒介引入所述植物细胞。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种核酸构建体，包括编码一DNA编辑媒介的一核酸序列，所述DNA编辑媒介能够与编码一香蕉的所述乙烯生物合成的一组分的基因杂交并促进所述基因的编辑，所述核酸序列可操作地连接至一顺式作用调节元件(cis-acting regulatory element)以用于在一香蕉的一细胞中表达所述DNA编辑媒介。
如上文所述，本发明的多个实施例涉及任何DNA编辑媒介。
根据一个具体的实施例，所述基因组编辑媒介包括一核酸内切酶，其可能包括或具有一DNA靶向模块(例如：sgRNA，或在本文中也称为“gRNA”)的一辅助单元。
根据一个具体的实施例，所述DNA编辑媒介是CRISPR/Cas9 sgRNA。
根据一个具体的实施例，所述核酸构建体进一步包括编码一DNA编辑媒介的一核酸内切酶(例如：Cas9或上述的核酸内切酶)的一核酸序列。
根据另一个具体的实施例，所述核酸内切酶及所述sgRNA是由不同的构建体所编码的，因此它们分别可操作地连接至在植物细胞中具有活性的一顺式作用调节元件(例如：启动子)。
在本发明一些实施例的一个具体实施例中，所述调节序列是一植物可表达的启动子。
可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术来构建在根据一些实施例的方法中的有用的构建体。这样的构建体可以是市售的、适合用于转化成植物并且适合在所述转化细胞中表达所述感兴趣的基因。
如本文所用，所述短语“植物可表达的”是指一启动子序列，包括添加至其中或包含于其中的任何其他调节元件，其至少能够诱导、赋予、激活或增强的在一植物细胞、组织或器官中表达，优选为一单子叶或双子叶植物的细胞、组织或器官。对于本发明的一些实施例的方法而言有用的启动子的多个示例包括但不限于：肌动蛋白、CANV 35S、CaMV19S、GOS2。本发明也可以使用在各种组织或发育阶段的具有活性的启动子。
可以针对植物表达来优化本发明的一些实施例的多肽的核酸序列。此类序列修饰的多个示例包括但不限于：一改变的G/C含量以更接近通常在感兴趣的植物物种中发现的方法，以及去除在所述植物物种中发现的非典型密码子，通常称为密码子优化。
可以利用本发明的一些实施例的所述核酸构建体来稳定转化或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，本发明的一些实施例的所述核酸分子被整合到所述植物基因组中，因此它代表一稳定及遗传的性状。在瞬时转化中，所述核酸分子由所述转化的细胞表达，但未整合到所述基因组中，因此它代表一瞬时性状。
根据一个具体的实施例，利用一DNA编辑媒介来瞬时转染所述植物。
根据一个具体的实施例，所述核酸构建体中的启动子包括一Pol3启动子。Pol3启动子的多个示例包括但不限于：AtU6-29、AtU626、AtU3B、AtU3d、TaU6。
根据一个具体的实施例，所述核酸构建体中的启动子包括一Pol2启动子。Pol2启动子的多个示例包括但不限于：CaMV 35S、CaMV 19S、泛素(ubiquitin)、CVMV。
根据一个具体的实施例，核酸构建体中的启动子包括一35S启动子。
根据一个具体的实施例，核酸构建体中的启动子包括一U6启动子。
根据一个具体的实施例，核酸构建体中的启动子包括一Pol 3启动子(例如：U6)及/或一Pol 2(例如：CamV35S)启动子，所述Pol 3启动子可操作地连接至编码至少一个gRNA的所述核酸媒介，所述Pol 2启动子可操作地连接至编码所述基因组编辑媒介的所述核酸序列或编码所述萤光报道分子的所述核酸序列(如以下具体实施例中所述)。
根据一个具体的实施例，通过农杆菌介导的转化，所述构建体可用于进行瞬时表达(Helens等人，2005年，Plant Methods 1：13)。本文将进一步描述瞬时转化的方法。
根据一个具体的实施例，所述构建体的所述核酸序列中除了sgRNA序列中的任何引导序列外，不具有与所述植物细胞基因组同源的序列，从而避免与所述植物基因组整合。
在多个特定实施例中，所述核酸构建体是一非整合构建体，优选地，其中编码所述荧光报道子的所述核酸序列也是非整合的。如本文所用，“非整合的”是指未经肯定的设计以促使将所述构建体或序列整合到所述感兴趣的植物基因组的一构建体或序列。例如，用于农杆菌介导的遗传转化的一功能性T-DNA载体***不是一非整合载体***，因为所述***被肯定地设计成整合到所述植物基因组中。类似地，一荧光报道基因序列或具有与感兴趣的植物的基因组同源的侧翼序列的选择性标记序列，促使将所述荧光报道基因序列或选择性标记序列同源重组到所述感兴趣的植物基因组中，因此不是一非整合的荧光报道基因序列或选择性标记序列。
根据本发明的一些实施例的教示，可以使用各种克隆试剂盒。
根据一个具体的实施例，所述核酸构建体是二元载体。二元载体的多个示例为：pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen或pPZP(Hajukiewicz,P等人，Plant Mol.Biol.25，989(1994年)以及Hellens等人，植物科学趋势5，446(2000年))。
在其他的DNA递送方法(例如：转染、电穿孔、轰击(bombardment)、病毒接种)中使用的其他载体的多个示例为：pGE-sgRNA(Zhang等人，Nat.Comms.2016年7月：12697)、pJIT163-Ubi-Cas9(Wang等人，Nat.Biotechnol，2004年，32，947-951)、pICH47742::2x35S-5'UTR-hCas9(STOP)-NOST(Belhan等人，Plant Methods，2013年11月；9(1)：39)。
本文描述的多个实施例还涉及选择包括一基因组编辑事件的细胞的方法，所述方法包括：
(a)利用包括所述基因组编辑媒介(如上所述)及一荧光报道分子的一核酸构建体来转化一香蕉植物的细胞；
(b)利用流式细胞术或成像来选择显示所述荧光报告子发射的荧光的转化细胞；
(c)利用DNA编辑媒介将包括所述基因组编辑事件的所述转化细胞培养一足够长的时间以丢失所述DNA编辑媒介的表达，从而获得多个细胞，所述多个细胞包括由所述DNA编辑媒介生成但缺少编码所述DNA编辑媒介的DNA基因组编辑事件；以及
根据一些实施例，所述方法进一步包括在步骤(c)之后在转化的细胞中验证所述荧光报道分子的表达损失。
根据一些实施例，所述方法进一步包括在步骤(c)之后，在所述转化的细胞中验证所述DNA编辑媒介的表达损失。
在图1的所述流程图中描述所述方法的一非限制性实施例。
根据一个具体的实施例，所述植物是一植物细胞，例如：在一胚胎细胞悬浮液中的植物细胞。
根据一个具体的实施例，所述植物细胞是一原生质体。
所述原生质体衍生自任何植物组织，例如：根、叶、胚细胞悬浮液、愈伤组织或幼苗组织。
已经存在多种将DNA引入植物细胞的方法，例如：使用原生质体以及本领域的技术人员将知道的选择。
在本发明的多个实施例中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将核酸的递送引入一植物细胞，例如，包括但不限于：通过原生质体的转化(参见例如：美国专利第5,508,184号)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(参见例如：Potrykus等人(1985年)Mol.Gen.Genet.199：183-8)；通过电穿孔(参见例如：美国专利第5,384,253号)；通过利用碳化硅纤维来进行搅拌(参见例如：美国专利第5,302,523号及第5,464,765号)；通过农杆菌介导的转化(参见例如：美国专利第5,563,055号、第5,591,616号、第5,693,512号、第5,824,877号、第5,981,840号及第6,384,301号)；通过加速DNA包裹的颗粒(参见例如：美国专利第5,015,580号、第5,550,318号、第5,538,880号、第6,160,208号、第6,399,861号及第6,403,865号)，以及通过纳米颗粒、纳米载体及细胞穿透肽(WO201126644A2；WO2009046384A1；WO2008148223A1)将DNA、RNA、肽及/或蛋白质或核酸及肽的组合递送到植物细胞中。
其他转染方法包括使用转染试剂(例如：Lipofectin、ThermoFisher)、树状聚合物(Kukowska-Latallo、JF等人，1996年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,4897–902)、细胞穿透肽(
Figure BDA0002357667420000491
等人，2005年，细胞穿透肽内化到烟草原生质体中，Biochimica et BiophysicaActa 1669年(2)：101-7)或多胺(Zhang及Vinogradov，2010年，用于基因递送及转染脑毛细血管的内皮细胞的短的可生物降解的多胺)，J Control Release，143(3)：359-366)。
根据一个具体的实施例，通过电穿孔将DNA引入植物细胞(例如：原生质体)中。
根据一个具体的实施例，通过轰击/生物弹道技术将DNA引入植物细胞(例如：原生质体)中。
根据一个具体的实施例，为了将DNA引入原生质体，所述方法包括摄取聚乙二醇(PEG)介导的DNA。更多相关的详细信息，请参见Karesch等人(1991年)Plant Cell Rep.9：575-578；Mathur等人(1995年)Plant Cell Rep，14：221-226；Negrutiu等人(1987年)PlantCell Mol.Biol.8：363-373。然后，在允许原生质体生长细胞壁、开始***形成一愈伤组织、形成芽及根以及再生整株植物的条件下培养原生质体。
瞬时转化也可以通过使用修饰的植物病毒来进行病毒感染。
已经显示对植物宿主转化有用的多种病毒包括：CaMV、TMV、TRV及BV。使用植物病毒的植物转化被描述于美国专利第4,855,237号(BGV)、EP-A 67,553(TMV)，日本专利公开申请第63-14693号(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；以及Gluzman,Y等人，分子生物学通讯：病毒载体，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约，第172至189页(1988)。用于在包括植物的许多宿主中表达外源DNA的伪病毒颗粒被描述于WO87/06261。
一种用于在植物中引入及表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建在上述参考文献以及Dawson,W.O等人，Virology(1989年)172：285-292；Takamatsu等人，EMBO J.(1987年)，6:307-311；French等人，Science(1986年)231:1294-1297；以及Takamatsu等人，FEBS Letters(1990年)269:73-76中被证实。
当所述病毒是一DNA病毒时，可以对病毒本身进行适当的修饰。替代地，可以先将所述病毒DNA克隆到一细菌质粒中，从而易于利用所述外源DNA构建所需的病毒载体。然后，可以从所述质粒中切除病毒DNA。如果所述病毒是一DNA病毒，则一细菌的复制起点可以附着在所述病毒DNA上，然后经由所述细菌复制。这个DNA的转录及翻译将产生所述外壳蛋白，所述外壳蛋白将包裹所述病毒DNA。如果所述病毒是RNA病毒，则通常将所述病毒克隆为一cDNA并***一质粒中。然后，将所述质粒用于构建所有构建体。然后，通过转录所述质粒的所述病毒序列并且翻译所述病毒基因以产生包裹所述病毒RNA的所述一种或多种外壳蛋白，从而产生所述RNA病毒。
上文的参考文献以及美国专利第5,316,931号证明了用于引入及在非病毒外源核酸序列的植物中表达的植物RNA病毒的构建，例如：在本发明的某些实施例的所述构建体中所包括的那些。
在一个实施例中，提供一种植物病毒核酸，其中已经从一病毒核酸中删除所述天然外壳蛋白编码序列，一非天然植物病毒外壳蛋白编码序列及一非天然启动子，优选地，已经***所述非天然外壳蛋白编码序列的所述亚基因组启动子，其能够在植物宿主中表达、所述重组植物病毒核酸的包装并确保通过所述重组植物病毒核酸对所述宿主的一***性感染。替代地，可以通过在所述外壳蛋白基因中***所述非天然核酸序列来使所述外壳蛋白失活，从而产生一蛋白质。所述重组植物病毒核酸可包含一种或多种其他的非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子都能够在所述植物宿主中转录或表达相邻的基因或核酸序列，并且不能彼此重组，也不能与天然亚基因组启动子重组。如果包括一个以上的核酸序列，则可以在所述天然植物病毒亚基因组启动子或所述天然及一非天然植物病毒亚基因组启动子附近***非天然(外源)核酸序列。所述非天然核酸序列在所述亚基因组启动子的控制下在所述宿主植物中转录或表达以产生所需产物。
在一第二实施例中，如同第一实施例，提供一种重组植物病毒核酸，但第二实施例将所述天然外壳蛋白编码序列放置于所述多个非天然外壳蛋白亚基因组启动子中的一个附近而不是放置于一非天然外壳蛋白编码序列上。
在一第三实施例中，提供一种重组植物病毒核酸，其中所述天然外壳蛋白基因与其亚基因组启动子相邻，并且一个或多个非天然亚基因组启动子已***所述病毒核酸中。所述***的非天然亚基因组启动子能够在一植物宿主中转录或表达相邻基因，并且不能彼此重组，也不能与天然亚基因组启动子重组。可以将非天然核酸序列插到所述非天然亚基因组植物病毒启动子的附近，使得在所述亚基因组启动子的控制下，所述序列在所述宿主植物中转录或表达以产生所需产物。
在一第四实施例中，如同第三实施例，提供一种重组植物病毒核酸，不同之处在于所述天然外壳蛋白编码序列被一非天然外壳蛋白编码序列代替。
所述病毒载体被所述重组植物病毒核酸编码的所述外壳蛋白包裹，以产生一重组植物病毒。所述重组植物病毒核酸或重组植物病毒用于感染合适的宿主植物。所述重组植物病毒核酸能够在所述宿主中复制、在所述宿主中***性传播并且能够在所述宿主中转录或表达一个或多个外源基因(分离的核酸)以产生所需蛋白质。
不论采用的转化/感染方法为何，本发明还涉及包括本文所述的一个或多个核酸构建体的任何细胞，例如：一植物细胞(例如：原生质体)或一细菌细胞。
转化后，将细胞进行流式细胞术以选择表现出由所述荧光报道分子(即，荧光蛋白)发射的荧光的转化细胞。
如本文所用，“荧光蛋白”是指发射荧光并且通常可通过流式细胞术或成像检测的一多肽，因此可用作选择表达这种蛋白的细胞的一基础。
可以用作报道分子的荧光蛋白的多个示例是绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)及红色荧光蛋白dsRed。荧光或其他报道分子的一非限制性列表包括：可通过发光(例如：荧光素酶)或比色测定法(例如：GUS)而检测到的蛋白质。根据一个具体的实施例，所述荧光报道分子是DsRed或GFP。
这种分析通常在转化后24至72小时内进行，例如：48至72小时、24至28小时内。为了确保瞬时表达，不使用抗生素选择，例如：将抗生素用于一选择标记。所述培养物仍可能包括抗生素，但不包括一选择标记。
植物细胞的流式细胞术通常经由荧光激活细胞分选术(FACS)来进行。荧光激活细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光性质来分离包括细胞的颗粒的公知方法(参见例如：Kamarch，1987年，Methods Enzymol，151：150-165)。
例如，GFP阳性细胞的FACS利用由一488纳米激光所激发的原生质体的绿色及红色发射光谱的可视化。GFP阳性原生质体可以通过增加绿色与红色发射的比例来区分。
以下是从Bastiaan等人的J Vis Exp，2010年；(36)：1673文献所改编的一非结合方案，其内容通过引用并入本文中。FACS装置是市售的，例如：FACSMelody(BD)、FACSAria(BD)。
使用一100微米的喷嘴及一20磅每平方英寸的护套压力来设置一流动。所述细胞密度及样品注入速度可基于是否需要一最佳可能的产率或最快的可达到的速度来调整为特定的实验，例如：至多10,000,000个细胞/毫升。在所述FACS上搅拌所述样品以防止所述原生质体的沉淀。如果所述FACS阻塞是一个问题，则可以执行三个问题排除步骤：1.执行一样品管线的反冲。2.稀释原生质体悬浮液以降低密度。3.在离心及重新悬浮后，重复所述过滤步骤来清洁所述原生质体溶液。所述设备准备用于在一488纳米激光激发后，测量GFP在530/30纳米处的正向散射(FSC)、侧向散射(SSC)以及测量在610/20纳米处的红色光谱自发荧光(RSA)。这些本质上是用于分离GFP阳性原生质体的唯一参数。可以使用多种电压设置：FSC-60V、SSC 250V、GFP350V及RSA 335V。应当注意，每个FACS的最佳电压设置都是不同的，甚至在细胞分选仪的整个生命周期中都需要进行调整。
所述过程开始于对正向散射与侧向散射建立一点图(dotplot)。施加所述电压设置，使得所述测量的事件在所述图的中心。接下来，创建绿色及红色荧光信号的一点图。施加所述电压设置，以便当观察一野生型(非GFP)原生质体悬浮液时，所述多个测量的事件在所述图中产生一中心的对角种群(centered diagonal population)。衍生自一GFP标记线的一原生质体悬浮液将产生一清晰的绿色荧光事件，这在野生型样品中从未见过。设置补偿约束以调整GFP及RSA之间的光谱重叠。设置适当的补偿约束(compensationconstraints)将使所述GFP阳性原生质体与所述非GFP原生质体及碎片(debris)更好地分离。这里使用的约束如下：RSA，减去17.91％的GFP。设置一闸门(gate)以识别GFP阳性事件，应当使用非GFP原生质体的一阴性对照来辅助限定所述闸门的边界。实施一前向散射截止(forward scatter cutoff)是为了将小碎片排除在所述分析之外。所述GFP阳性事件在所述FSC与SSC的图中是可视化的，从而帮助确定所述截止的位置。例如，将截止设置为5,000。应当注意，所述FACS会将碎片计为分类事件，以及碎片含量高的一样品可能具有与预期不同的GFP阳性事件百分比。这不一定是个问题。然而，当所述样品中的碎片越多，所述分类所需的时间就越长。根据所述实验及待分析的细胞类型的丰度，将所述FACS精确模式设置为所述分选细胞的最佳产量或最佳纯度。
在FACS分选之后，收集显示所述荧光标记的转化植物细胞(例如：原生质体)的阳性选择库，并且使用一等分试样(aliquot)来测试所述DNA编辑事件(可选步骤，参见图1)。替代地(或在可选的验证之后)，在没有选择的情况下(例如：用于选择一标记的抗生素)培养所述克隆，直到它们发展成菌落，即克隆(至少28天)及微愈伤组织。培养至少60至100天后(例如：至少70天、至少80天)，对所述愈伤组织的细胞的一部份进行以下分析(验证)：所述DNA编辑事件及所述DNA编辑媒介的存在，即编码所述DNA编辑媒介的DNA序列的丢失，表示所述方法具有瞬时性。
因此，取决于寻求的编辑的类型，例如：***、缺失、***/缺失(Indel)、倒位、取代及其中的组合，从而验证克隆中是否存在一DNA编辑事件，在本文中也称为“突变”或“编辑”。
根据一个具体的实施例，所述基因组编辑事件包括一缺失、一单碱基对取代或***来自一第二种植物的一遗传材料，否则可以通过传统育种将其引入感兴趣的植物。
根据一个具体的实施例，所述基因组编辑事件不包括将外源DNA引入到感兴趣的植物的一基因组中，而所述基因组不能通过传统育种引入。
多种用于检测序列改变的方法在本领域中是众所周知的，包括但不限于：DNA测序(例如：下一代测序)、电泳、基于酶的错配的检测分析以及一杂交分析，例如：PCR、RT-PCR、RNase保护、原位杂交、引物延伸、南方墨点法、北方墨点法及斑点杂交。本发明也可以使用用于检测多种单核苷酸多态性(SNPs)的各种方法，例如：基于T7核酸内切酶的PCR、异源双链(Heteroduplex)及Sanger测序。
其他验证一DNA编辑事件的方法(例如：Indels)包括一错配切割分析，其利用一结构选择酶(例如：内切核酸酶)来识别及切割错配的DNA。
所述错配切割测定是检测***缺失的一种简单且具有成本效益的方法，因此是检测通过基因组编辑所诱导的突变的典型方法。所述测定使用的酶可以在错配及多个核苷酸形成的螺旋外环上切割异源双链DNA，从而产生两个或更多个较小的片段。当预期的核酸酶切割位点偏离中心时，一PCR产物产生约300至1000个碱基对，因此产生的片段的尺寸不同，并且可以通过常规凝胶电泳或高效液相色谱(HPLC)来容易地分离。末端标记的消化产物也可以通过自动凝胶或毛细管电泳来进行分析。可以通过测量所述PCR扩增子及切割的DNA条带的所述整合强度来估计所述基因座上***缺失的频率。所述消化步骤需要15至60分钟，并且当DNA制备及PCR步骤被加入时，所述整体分析可以在3小时内完成。
在这个分析中通常使用两种替代酶。T7核酸内切酶1(T7E1)是一种可分辨酶，其可识别并切割所述错配的上游的第一、第二或第三磷酸二酯键上的不完全匹配的DNA。基于T7E1的分析的灵敏度为0.5至5％。相反地，SurveyorTM核酸酶(Transgenomic Inc，奥马哈，内布拉斯加州，美国)是源自芹菜的错配特异性核酸酶的CEL家族的一成员。SurveyorTM核酸酶识别并切割由于存在多种单核苷酸多态性(SNPs)或小***缺失而导致的错配，并且切割所述错配下游的两条DNA链。SurveyorTM核酸酶可以检测到高达12个核苷酸的***缺失，并且对以低至3％的频率(即32拷贝中的1个)出现的突变具有敏感性。
验证一编辑是否存在的另一种方法甚至包括所述高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melting analysis)。
高分辨率熔解曲线分析(HRMA)涉及通过掺入一荧光染料的实时PCR来扩增跨越所述基因组靶标(90至200个碱基对)的一DNA序列，然后对所述扩增子进行熔解曲线分析。HRMA基于热变性过程中从双链DNA释放的嵌入染料时的荧光的损失。它记录扩增子的所述温度依赖性变性图，并检测所述熔解过程是否涉及一种或多种分子种类。
另一方法是所述异源双链迁移率的测定。本发明也可以通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来直接分析重新杂交的PCR片段以检测突变。这个方法利用聚丙烯酰胺凝胶中异源双链及同源双链DNA的差异迁移。一***缺失引起的匹配及不匹配的DNA链之间的所述夹角表示所述异源双链DNA在天然条件下的迁移速度比同源双链DNA慢，并且可以根据其迁移率来容易地区分异源双链DNA及同源双链DNA。具有140个至170个碱基对的多个片段可以在一15％的聚丙烯酰胺凝胶中分离。在最佳条件下，此类测定的灵敏度可达到0.5％，这与T7E1相似(重退火(reannealing)所述PCR产物后，测定所述电泳成分需要约2小时)。
其他验证编辑事件是否存在的方法在Zischewski 2017Biotechnol Advances 1(1):95-104中详细描述。
应当理解，对于所述DNA编辑事件，阳性克隆可以是纯合子的或杂合的。技术人员将根据预期的用途来选择用于进一步的培养/再生的所述克隆。
表现出一所需的DNA编辑事件的克隆被进一步分析所述DNA编辑媒介的存在。即，编码所述DNA编辑媒介的DNA序列的丢失，表明所述方法的瞬时性质。
这可以通过分析所述DNA编辑媒介的表达(例如：在所述mRNA、蛋白质处)来完成，例如：通过GFP或q-PCR的荧光检测。
替代地或另外地，分析所述细胞中是否存在本文所述的核酸构建体或其部分，例如：编码所述报道多肽或所述DNA编辑媒介的核酸序列。
克隆显示没有编码所述荧光报道基因或DNA编辑媒介的DNA(例如：通过荧光显微镜、q-PCR及/或任何其他方法(例如：南方墨点法、PCR、测序)来确认)，但仍包含所述一个或多个所需的DNA编辑事件[一或多个突变]被分离以用于进一步处理。
因此，这些克隆可以被存储(例如：冷冻保存)。
替代地，可以通过生长发育成一愈伤组织一组植物细胞，然后通过使用植物组织培养方法从所述愈伤组织再生多个芽(离体培养枝芽发生)来将细胞(例如：原生质体)再生成完整植物。将原生质体生长到愈伤组织中以及再生所述芽需要所述组织培养基中的植物生长调节剂的适当平衡，所述培养基必须针对每种植物物种进行定制。
使用称为原生质体融合的技术，原生质体也可以用于植物育种。通过使用一电场或一聚乙二醇溶液，可以诱导来自不同物种的原生质体的融合。这个技术可用于在组织培养中产生体细胞的杂合。
原生质体再生的方法是本领域众所周知的。影响原生质体分离、培养及再生的几个因素，即所述基因型、所述供体组织及其预处理、用于原生质体分离的酶处理、原生质体培养的方法、所述培养物、所述培养基及所述物理环境。有关一全面的评论，请参见Maheshwari等人，1986年，原生质体及转化植物细胞的分化：3-36。施普林格出版社，柏林。
所述再生的植物可以进行进一步的育种及选择，因为本领域的技术人员认为合适。
所述植物或其细胞不具有编码一DNA编辑媒介的一转基因。
可以分析所述最终品系、植物或中间育种产品的表型，例如：通过确定编码所述乙烯生物合成途径的所述组分的基因的序列、所述序列在mRNA或蛋白质程度中的表达、所述蛋白质的活性及/或分析所述水果的性质(保质期)。
乙烯生产：可以通过气相色谱(GC)或基于激光的测定法(Cristescu SM，MandonJ，Arslanov D，De Pessemier J，Hermans C，Harren FJM，用于检测植物中的乙烯的多种现代方法。Ann Bot-London。2013年；111(3)：347-60)来测量在小苗中乙烯的生物合成。
如本文及随后的所述多个示例部分所示。本发明人能够利用一种或多种基因组编辑媒介来转化香蕉，同时避免稳定的转基因。
因此，本方法允许基因组编辑而无需整合一可选择的或可筛选的报道基因。
因此，本发明的多个实施例进一步涉及包括根据本教导所产生的所述一个或多个基因编辑事件的植物、植物细胞及植物的加工产物。
因此，本教导还涉及本文所述的植物的部分或其加工产物。
使用本文所述的植物来考虑香蕉果实及基于香蕉果实的产品及其生产方法。
本发明还考虑香蕉副产品及其生产方法，例如：在各种食品及非食品应用中的果皮、树叶、假茎、茎及花序，它们用作增稠剂(thickening agent)、色素及风味剂、大量及微量营养素的替代来源、营养保健品、牲畜饲料、天然纤维以及天然生物活性化合物及生物肥料的来源。
根据一个具体的实施例，加工产物包含DNA。
可预期地，在本申请到期的专利有效期内，将开发出许多相关的DNA编辑媒介，而DNA编辑媒介一词的范围也应包含所有这些新技术。
如本文所用，所述术语“约”是指±10％。
所述术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含”、“含有”，“具有”及其共轭词意指“包括但不限于”。
所述术语“由...组成”是指“包括并限于”。
所述术语“基本上由…组成”是指所述组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部分，但前提是所述额外的成分、步骤及/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基础及新颖特征。
如本文所使用的，所述单数形式“一(a)”，“一(an)”及“所述”包括复数引用，除非上下文中另有明确规定。例如，所述术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个申请中，本发明的各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便及简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该认为一范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开多个子范围，例如：从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的单个数字，例如：1、2、3、4、5及6。这与所述范围的广度无关。
每当在本文中指示一数值范围时，其意图包括在指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。所述短语“在第一指示数字及第二指示数字之间的范围/区间”以及“从第一指示数字到第二指示数字的范围/区间”在本文中可互换使用，并且旨在包括所述第一指示数字及第二指示数字，以及它们之间的所有小数及整数。
如本文所用，所述术语“方法”是指用于完成一给定任务的方式、手段、技术及过程，包括但不限于已知的方式、手段、技术及过程或由化学、药理、生物学、生化及医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术及过程容易地开发的那些方式、手段、技术及过程。
当参考特定的序列表时，应当理解为所述参考还包括基本上对应于其互补序列的序列，包括例如：由于测序错误、克隆错误或导致碱基取代的其他改变而引起的微小序列变化、碱基缺失或碱基添加，前提是此类变异的频率小于50个核苷酸中的1个、或者小于100个核苷酸中的1个、或者小于200个核苷酸中的1个、或者小于500个核苷酸中的1个、或者小于1000个核苷酸中的1个、或者少于5,000个核苷酸中的1个、或者少于10,000个核苷酸中的1个。
应当理解，本申请中公开的任何序列识别号(SEQ ID NO)可以是一DNA序列或一RNA序列，这取决于提及所述SEQ ID NO的上下文，即使SEQ ID NO仅以DNA序列格式或RNA序列格式表达。例如，一给定的SEQ ID NO：以一DNA序列格式表达(例如：胸腺嘧啶为T)，但是它可以是对应于一给定核酸序列的一DNA序列，或者是一RNA分子核酸序列的所述RNA序列。同样地，尽管某些序列以一RNA序列格式表示(例如，用U表示尿嘧啶)，但根据所描述分子的实际类型，它可以指包含一dsRNA的一RNA分子的序列，也可以指与所示RNA序列相对应的一DNA分子的序列。在任何情况下，设想DNA及RNA分子都具有与任何替代物一起公开的序列。
应当理解，为清楚起见在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中以组合的方式提供。相反地，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所述的实施例中合适地提供。在各种实施例的上下文中所描述的某些特征不应被认为是那些实施例的必要特征，除非所述实施例没有那些元件就不能作用。
在上文中描述以及在以下权利要求书中要求保护的本发明的各种实施例及多个方面在以下多个示例中得到实验支持。
如本文所用，所述术语“约”是指±10％。
所述术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含”、“含有”，“具有”及其共轭词意指“包括但不限于”。
所述术语“由...组成”是指“包括并限于”。
所述术语“基本上由…组成”是指所述组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部分，但前提是所述额外的成分、步骤及/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基础及新颖特征。
如本文所使用的，所述单数形式“一(a)”，“一(an)”及“所述”包括复数引用，除非上下文中另有明确规定。例如，所述术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个申请中，本发明的各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便及简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该认为一范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开多个子范围，例如：从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的单个数字，例如：1、2、3、4、5及6。这与所述范围的广度无关。
每当在本文中指示一数值范围时，其意图包括在指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。所述短语“在第一指示数字及第二指示数字之间的范围/区间”以及“从第一指示数字到第二指示数字的范围/区间”在本文中可互换使用，并且旨在包括所述第一指示数字及第二指示数字，以及它们之间的所有小数及整数。
如本文所用，所述术语“方法”是指用于完成一给定任务的方式、手段、技术及过程，包括但不限于已知的方式、手段、技术及过程或由化学、药理、生物学、生化及医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术及过程容易地开发的那些方式、手段、技术及过程。
如本文所用，所述术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转病情的进展、基本上改善病情的临床或美学症状或基本上防止病情的临床或美学症状的出现。
当参考特定的序列表时，应当理解为所述参考还包括基本上对应于其互补序列的序列，包括例如：由于测序错误、克隆错误或导致碱基取代的其他改变而引起的微小序列变化、碱基缺失或碱基添加，前提是此类变异的频率小于50个核苷酸中的1个、或者小于100个核苷酸中的1个、或者小于200个核苷酸中的1个、或者小于500个核苷酸中的1个、或者小于1000个核苷酸中的1个、或者少于5,000个核苷酸中的1个、或者少于10,000个核苷酸中的1个。
应当理解，本申请中公开的任何序列识别号(SEQ ID NO)可以指一DNA序列或一RNA序列，这取决于提及所述SEQ ID NO的上下文，即使SEQ ID NO仅以DNA序列格式或RNA序列格式表达。例如，一给定的SEQ ID NO：以一DNA序列格式表达(例如：胸腺嘧啶为T)，但是它可以是对应于一给定核酸序列的一DNA序列，或者是一RNA分子核酸序列的所述RNA序列。同样地，尽管某些序列以一RNA序列格式表示(例如，用U表示尿嘧啶)，但根据所描述分子的实际类型，它可以指包含一dsRNA的一RNA分子的序列，也可以指与所示RNA序列相对应的一DNA分子的序列。在任何情况下，设想DNA及RNA分子都具有与任何替代物一起公开的序列。
应当理解，为清楚起见在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中以组合的方式提供。相反地，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所述的实施例中合适地提供。在各种实施例的上下文中所描述的某些特征不应被认为是那些实施例的必要特征，除非所述实施例没有那些元件就不能作用。
在上文中描述以及在以下权利要求书中要求保护的本发明的各种实施例及多个方面在以下多个示例中得到实验支持。
多个示例：
现在参考以下多个示例，所述多个示例与以上描述一起以非限制性的方式示出本发明的一些实施例。
通常，本文所用的命名法及本发明中所用的实验室方法包括分子、生化、微生物学及重组DNA技术。这些技术在以下文献中均有详尽的解释，例如参见：“分子克隆：实验室手册”Sambrook等人(1989年)；“分子生物学的当前方案”Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994年)；Ausubel等人，“分子生物学的当前方案”，John Wiley及Sons,Baltimore,Maryland(1989年)；Perbal，“分子克隆实用指南”，John Wiley及Sons，纽约(1988年)；Watson等人，“重组DNA”，Scientific American Books，纽约；Birren等人(eds)“基因组分析：实验室手册系列”，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约(1998年)；美国专利第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号及第5,272,057号；“细胞生物学：实验室手册”，Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994年)；“动物细胞的培养-基本技术手册”Freshney、Wiley-Liss，纽约(1994年)，第三版；“免疫学的当前方案”，第I-III卷，Coligan J.E.编辑(1994年)；Stites等人(eds)，“基本及临床免疫学”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994年)；Mishell及Shiigi(eds)，“细胞免疫学的选择方法”，W.H.Freeman及Co.，纽约(1980年)；专利及科学文献中广泛描述了多种可用的免疫测定，例如参见：美国专利第3,791,932号；第3,839,153；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号及第5,281,521号；“寡核苷酸合成”，Gait,M.J编辑(1984年)；“核酸杂交”，Hames,B.D及Higgins S.J.编辑(1985年)；“转录及翻译”，Hames,B.D.及Higgins S.J.编辑(1984年)；“动物细胞培养”，Freshney,R.I.编辑(1986年)；“固定化的细胞及酶”，IRL出版社(1986年)；“分子克隆实用指南”，Perbal,B.(1984年)及“酶学方法”，第1至317卷，学术出版社；“PCR方案：方法及应用指南”，学术出版社，San Diego,CA(1990年)；Marshak等人，“蛋白质纯化及表征的策略-实验室课程手册”CSHL出版社(1996年)；通过引用将其全部内容并入本文，如同在此完全阐述一样。本文件中也提供其他一般的参考文献。其中的步骤被认为是本领域中众所周知的并且是为了使读者方便而提供的。其中包含的所有信息均通过引用并入本文中。
材料及方法：
胚性愈伤组织及细胞悬浮液的产生及维持：
从一初始的外植体(例如：未成熟的雄性花或枝梢)发育出的一胚性愈伤组织如Ma于1988年所述(Ma SS 1991香蕉的细胞悬浮培养的体细胞胚发生及植物再生。1988年3月8日至9日，台湾台北，园艺作物的组织培养研讨会文献，第181至188页)以及Schoofs于1997年所述(Schoofs H.1997年，Musa胚胎发生细胞的起源。博士学位论文，比利时库鲁芬)。胚性细胞悬浮液是由新发育的高胚性愈伤组织在液体培养基中引发(initiated)而成。80％的培养基每12至14天更新一次，直到完全建立所述初始的细胞悬浮液(6至9个月)。
sgRNA克隆：
所述使用的转染质粒由4个模块组成，其中包括(1)由所述多个CaMV35启动子驱动且由一G7终止序列终止的eGFP；(2)由所述多个CaMV35启动子驱动且由Mas终止序列终止的Cas9(优化的人类密码子)；(3)AtU6启动子驱动引导(1)的sgRNA；(4)AtU6启动子驱动引导(2)的sgRNA。可以使用二元载体，例如：pCAMBIA或pRI-201-AN DNA。
通过靶向外源报道基因GFP来进行基因编辑***的验证：
通过靶向外源基因(GFP)的DNA来验证并优化此处提出的所述非转基因GE***。为了分析不同的RNA聚合酶III(pol-III)的启动子的强度，设计了sgRNA以靶向CRISPR Cas9复合物中的eGFP，然后测试不同启动子在转化细胞中剔除eGFP表达的作用。
具体地，质粒(例如：pBluescript、pUC19)包含四个转录单元，其中包含由不同的pol-II及pol-III启动子(例如：CAMV 35S、U6)驱动的Cas9、eGFP、dsRED及sgRNA-GFP。将这些质粒转染到原生质体培养物中，并在24至72小时的培育期间后通过FACS来进行分析。dsRED(或mCherry、RFP)表达的高频率表示转染效率高，而eGFP表达的低频率则表示成功通过CRISPR-Cas9来进行基因编辑。因此，显示最低的eGFP：dsRED的表达比率的品系是所述选择的pol-III启动子，因为它通过CRISPR Cas9复合物所导致eGFP失活的比例最高。
最终质粒设计：
为了瞬时表达，使用了含有四个转录单元的质粒。所述第一个转录单元包含所述CaMV-35S启动子驱动表达的Cas9及所述烟草花叶病毒(TMV)终止子。下一个转录单元由另一个驱动eGFP及所述nos终止子表达的CaMV-35S启动子组成。第三及第四个转录单元各自包含所述拟南芥U6启动子，所述拟南芥U6启动子表达针对靶基因的sgRNA(如上文所述，每个载体包含两个sgRNA)。
原生质体分离：
在室温下，通过将植物材料(例如：叶片、愈伤组织、细胞悬浮液)在一消化液中培养4至24小时(1％纤维素酶、0.5％铜绿酶、0.5％脱水酶、0.4M甘露醇、154毫摩尔的氯化钠、20毫摩尔的氯化钾、20毫摩尔的pH值为5.6的MES、10毫摩尔的氯化钙)并且轻轻摇动。消化后，将剩余的植物材料用W5溶液(154毫摩尔的氯化钠，125毫摩尔的氯化钙、5毫摩尔的氯化钾，2毫摩尔的pH值为5.6的MES)洗涤，并利用一40微米的过滤器来过滤原生质体悬浮液。在室温下以80g离心3分钟后，将原生质体重悬于2毫升的W5缓冲液中，并通过重力在冰中沉淀。将所述最终的原生质体沉淀重悬于2毫升的MMg(0.4摩尔的甘露醇、15摩尔的氯化镁、4毫摩尔的pH值为5.6的MES)中，并使用一血细胞计数器(hemocytometer)来测定原生质体的浓度。使用台盼蓝染色(Trypan Blue staining)来估计原生质体的存活率。
聚乙二醇(PEG)介导的质粒转染。香蕉原生质体的PEG转染是使用Wang等人报告的策略的改良版来进行的(2015)[Wang，H.等人，一种有效的PEG介导的葡萄原生质体瞬时基因表达***及其在类黄酮生物合成酶的亚细胞定位研究中的应用，园艺科学，2015年，191：第82至89页]。将原生质体重悬于一密度为2至5×106个原生质体/毫升的MMg溶液中。将100至200微升的原生质体悬浮液添加到含有所述质粒的一试管中。所述质粒：原生质体的比例大幅地影响转化效率，因此测定原生质体悬浮液中的一系列质粒的浓度(5至300微克/微升)。将PEG溶液(100至200微升)加入混合物中，并在23℃下以10至60分钟的各种时间长度来进行培育。优化PEG4000的浓度，测定200至400毫摩尔的甘露醇中的20％至80％的PEG4000、100至500毫摩尔的氯化钙溶液。然后将所述原生质体在W5中洗涤，以80g离心3分钟，然后重悬于1毫升的W5中，并在黑暗中以23℃进行培育。培育24至72小时后，通过显微镜来检测荧光。
电穿孔法：
使用电穿孔法(BIORAD-GenePulserII；Miao及Jian，2007年Nature Protocols 2(10)：2348-2353)将包含Pol2驱动的GFP/RFP、Pol2驱动的NLS-Cas9及Pol3驱动的sgRNA靶向相关基因(参见上述表2的列表)的一质粒引入所述细胞。将500微升的原生质体转移到电穿孔比色皿(electroporation cuvettes)中，并与100微升的质粒(10至40微克的DNA)混合。在130伏特及1,000法拉下对原生质体进行电穿孔，然后在室温下培育30分钟后。将1毫升的原生质体培养基加入每个比色皿中，并将原生质体悬浮液倒入一个小培养皿中。培育24至48小时后用显微镜来检测荧光。
荧光蛋白表达细胞的FACS分选：
在递送质粒/RNA后的48小时，收集细胞并使用一流式细胞仪来分选荧光蛋白表达，从而富集GFP/编辑媒介表达细胞[Chiang等人，T.W.，基于CRISPR-Cas9(D10A)切口酶的基因型及表型筛选可增强的基因组编辑，Sci Rep，2016年6月：p.24356]。这个富集步骤允许绕过抗生素选择，仅收集瞬时表达的所述荧光蛋白、Cas9及所述sgRNA的细胞。这些细胞可以通过非同源末端连接(NHEJ)来进一步测试所述靶基因的编辑以及相应基因表达的缺失。
菌落形成：
所述荧光蛋白阳性细胞的一部分被采样并用于DNA提取及基因组编辑(GE)测试，并且以高稀释度而部分地铺在液体培养基中以允许菌落形成28至35天。挑选菌落，使其生长并分成两等份。一个等分试样用于DNA提取及基因组编辑(GE)测试以及不含DNA的CRISPR测试(参见下文)，而其他等分试样则保持培养直至其状态得到验证。只有那些明显显示是GE及不含DNA的CRISPR被选中。
在黑暗中20天后(从***(splitting)起到进行GE分析，即60天，因此总共80天)，将所述菌落转移到相同但降低葡萄糖含量(0.46摩尔)及0.4％的琼脂糖的培养基中，并且在一低光强度下培育。六周后，将琼脂糖切成薄片，并置于含有0.31摩尔的葡萄糖及0.2％凝胶的原生质体培养基上。一个月后，将原始菌落(或愈伤组织)传代培养至再生培养基(半强度MS+B5维生素，20克/升的蔗糖)中。将再生的小植株在28℃下以一低光强度置于固化的培养基(0.8％琼脂)上。2个月后，将小植株转移到土壤中，并置于80至100％湿度的一温室中。
筛选基因修饰及CRISPR***DNA的缺失：
从每个菌落中，从GFP分选的原生质体的一等分试样中提取DNA(可选步骤)，并从原生质体衍生的菌落中提取DNA，并且利用位于所述靶基因侧翼的引物来进行一PCR反应。采取多种方式来采样所述菌落，因为阳性菌落将用于再生所述植物。原生质体经相同方法但不含Cas9-sgRNA的一控制反应被纳入并被认为是野生型(WT)。然后将所述PCR产物在一琼脂糖凝胶上分离以检测与所述WT相比产物尺寸的任何变化。将不同于所述WT产物的所述PCR反应产物克隆到pBLUNT或PCR-TOPO(Invitrogen)中。或者，可以使用测序来验证所述编辑事件。挑选得到的菌落，分离质粒并测序以确定所述突变的性质。选择具有预测会导致结构域改变或相应蛋白质的完全丢失的带有突变的克隆(克隆或愈伤组织)来进行全基因组测序，以验证它们是否脱离所述CRISPR***的DNA/RNA并检测在所述基因组DNA水平的所述突变。
首先，将表现出所需GE的阳性克隆通过显微镜分析(与WT相比)来检测GFP的表达。接下来，使用所述Cas9序列或所述表达盒的任何其他序列的特异的引物(或下一代测序，NGS)，通过PCR来测试GFP阴性植物中所述Cas9盒的存在。还可以测试所述构建体的其他区域，以确保所述原始构建体中不含任何基因组。
植物再生：
乙烯生产：可以通过气相色谱法(GC)或基于激光的测定法在小植株中测量乙烯的生物合成(Cristescu等人，2013年，同上)。
示例2：
香蕉的ACS及ACO基因的基因组编辑及植物再生：
表1、引物的列表
Figure BDA0002357667420000681
Figure BDA0002357667420000691
在图26中描述sgRNA及靶序列。
根据上文的示例1，遵循了用于从小果野蕉(Musa acuminata)的细胞悬浮液中有效分离原生质体的一有效方案，随后利用带有所述CRISPR/Cas9机制的质粒转染所述原生质体，从而靶向所述感兴趣的基因(内源ACS及ACO基因)并且富集利用FACS分选的表达一报道基因的细胞。为了实现这个目的，本发明人(i)生产并维持胚发生材料；(ii)从所述材料中分离出原生质体；(iii)利用靶向ACS及/或ACO基因的特异性质粒来进行转染；(iv)富集表达一荧光标记的细胞，所述萤光标记作为带有所述CRISPR/Cas9复合物及靶向所述感兴趣基因的多个sgRNA的细胞(例如：mCherry)的一指标；以及(v)通过一原生质体再生管道促使分选的原生质体再生成小植株。
为了测试是否可以从小果野蕉植物材料中回收存活的原生质体，在室温下，将香蕉植物材料(细胞悬浮液)在一消化液中以轻轻摇动的方式培育4至24小时。消化后，洗涤所述植物材料，过滤并重悬于2毫升的MMG缓冲液(0.4摩尔的甘露醇、15毫摩尔的氯化钙、4摩尔的pH值为5.6的MES)中。测定原生质体的浓度并将其调节至1×106个。接下来，在聚乙二醇(PEG)的存在下，将DNA质粒pAC2010(带有作为荧光标记的mCherry)与衍生自香蕉的原生质体一起培育。转染后3天，通过荧光显微镜检测mCherry在所述原生质体中的表达(图3)。
恢复基因编辑植物的下一步是将CRISPR/Cas9复合物及多个sgRNA递送至香蕉原生质体中感兴趣的基因，并通过荧光激活细胞分选(FACS)对携带所述复合物的细胞进行富集，从而分离出瞬时表达所述荧光蛋白、Cas9及所述sgRNA的成功转染的细胞。使用FACS，富集并收集阳性mCherry表达的原生质体(图4A)。通过荧光显微镜证实已分选的原生质体仍然完整，并且确实表达了所述荧光标记物(图4B)。
接下来，检查针对小果野蕉原生质体中感兴趣的靶基因的CRISPR/Cas9复合物及sgRNA的转染的瞬时性质。由于我们的所有质粒均包含一荧光标记(例如：dsRed、mCherry)、Cas9及多个sgRNA(在一U6启动子下并且靶向一感兴趣的内源基因)，因此随着时间的流逝，可以追踪所述荧光标记在转染的香蕉原生质体中的表达，以及使用许多作为指标的mCherry阳性原生质体的数量，从而获得所述CRISPR/Cas9复合物及多个sgRNA可以表达多长时间的一指示(图5A至图5C)。FACS用于量化随时间变化的mCherry阳性香蕉原生质体的百分比，并将转染后3天(dpt)的mCherry阳性香蕉原生质体的总数设置为100％。已经发现，在10dpt时，mCherry阳性香蕉原生质体的数量比mCherry阳性香蕉原生质体的初始数量减少30％，而在25dpt时，几乎80％的转染香蕉原生质体未显示任何荧光(图5C)。通过显微镜在3dpt(图5A；图6A)、6dpt(图6A)及10dpt(图5B；图6A)时监测未分选的香蕉原生质体中的mCherry表达，这证实mCherry的表达确实会随着时间而减少。此外，如通过FACS(图4A)所看到的那样，分选的香蕉原生质体的荧光显微镜显示出mCherry阳性原生质体的数量及强度逐渐降低(图6B)。综上所述，这些结果表示带有CRISPR/Cas9复合物及多个sgRNA的载体的表达是瞬时的，并且预期所述植物基因组中没有进一步的Cas9激活或整合。
为了降低香蕉植物中的乙烯水平，这可能导致香蕉果实的保质期延长，因此尝试剔除涉及乙烯生物合成的基因，包括突出显示的ACS及ACO(图7A、图7B)。然而，所述香蕉基因组包含与这些基因同源的多个序列。
为了鉴定所述香蕉基因组中编码功能性ACS及ACO的基因，从模型或农作物物种的特征途径中鉴定出同源序列。所述过程涉及用于DNA及蛋白质序列比较分析的一系列连续步骤，其旨在通过***发育分析来重建基因的演化历史，通过验证候选基因在普通组织及靶组织中的表达来过滤候选基因，并对候选基因进行测序以确保合适的sgRNA设计(避免不匹配)。这个过程允许选择基因、鉴定用于剔除的最佳靶区域(保守的及潜在的催化结构域)以及设计适当的多个sgRNA。
这条管道是基于具有一共同祖先的同源蛋白质可能具有一类似功能的假设，通过进行一***发育重建，在所述演化背景下建立并评估基因家族的功能多样性。这对于经历大规模基因组重复的植物物种及扩大的基因家族而言是特别重要的。然而，一基因家族中的旁系同源物(paralogs)不一定具有相同的功能，并且所述过程的一部分是针对一家族中不论是单独地或作为一群组的基因选择，从而解决冗余的问题。
简要地，乙烯的合成涉及三步骤的反应：所述酶S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-AdoMet)催化甲硫氨酸的腺苷化。然后，S-AdoMet被所述ACC合成酶(ACS)代谢为第一个用于乙烯生物合成的化合物-1氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)。最后，ACC通过所述ACC氧化酶(ACO)转化为乙烯(图7A)(Cara及Giovannoni，2008年，Plant Science，Vol.175.Pp.106-113)。在成熟期间，在诸如香蕉这样的更年性水果中，ACC合成酶(ACS)及ACC氧化酶(ACO)均被诱导，并有助于调节乙烯的生物合成(图7B)(Liu等人，1999，植物生理学，Vol 121,pp.1257-1265)。已经建议将乙烯调节为一两个***的过程，其中***1在正常的营养生长过程中发挥作用以及乙烯具有一自动抑制作用，并且负责产生在所有组织(包括那些非更年性果实)中检测到的基础乙烯水平，而***2在更年性果实的成熟及衰老期间起作用(图7A至图7B)。在所述过渡阶段，已经确定多种成熟的调节剂，例如：RIN、CNR等，以及诱导特定的ACS基因(LeACS4)导致乙烯自动催化，从而导致***1产生负反馈。另外，还诱导其他ACS及ACO基因(LeACS2，4及LeACO1，4)，并且负责通过***2(图7A)来产生大量的乙烯(Cara及Giovannoni，2008年，Plant Science.Vol.175.Pp.106-113)。
小果野蕉的全基因组序列分析揭示所述Musa谱系中特定的祖先全基因组重复(WGD)及其对基因分离(gene fractionation)的影响(D'Hont等人，2012.Nature.Vol 488；Martin等人，2016年，BMC Genomics.17：243)。此外，根据报道，一些参与乙烯生物合成及信号传导的香蕉基因家族通过WGD演化并且被优先保留(Jourda等人，2014年，NewPhytologist.Vol.202.Pp 986-1000)。有趣地，所述乙烯途径中的主要基因被扩展以及基因表达谱显示其中一些衍生自WGD的基因具有功能冗余性(Jourda等人，2014年，NewPhytologist，Vol.202.Pp 986-1000)。因此，候选基因的选择需要仔细评估。
在番茄中已经充分研究乙烯的生物合成途径，并且已经表征沿着***1及2的步骤所涉及的ACS及ACO基因。这些特征基因被用作查询序列，分别在ACS及ACO的图9及图10中突出显示。相似性搜索证实所述ACS及ACO家族均在香蕉中(分别为图8、图9)，并且选择一些ACS及ACO的基因候选物来用于后续研究。如图10所示，在不同的香蕉品种中对这些候选基因进行测序可以实现多个sgRNA的特异性设计及选择。此外，为了深入了解这些基因的可能作用，检索所有ACS及ACO候选基因的香蕉成熟果实的公开表达数据(ACS：Ma09_g19150；Ma04_g35640；Ma04_g31490。ACO：Ma01_g11540；Ma07_g19730)(分别为图11及图12)。所述香蕉转录组数据库中的每个基因的所述RPKM数据表示ACS Ma04_g35640及ACO Ma07_g19730是靶向减少乙烯生物合成的候选基因(分别为图11及图12)。本发明的多个实施例还考虑靶向其他ACO及/或ACS基因以获得一稳健的表型。
利用两对sgRNA靶向ACS基因(Ma09_g19150；Ma04_g35640；Ma04_g31490)，如图13A、图14A及图15A所示。所述多个sgRNA位于所述候选基因的外显子1及外显子3之间，并且选择这些区域，因为这些区域在所有3个候选基因中是高度保守的。类似地，如图6A及图17A所示，利用两对sgRNA靶向ACO基因(Ma01_g11540；Ma07_g19730)。所述多个sgRNA位于两个候选基因的第1外显子及第4外显子之间，并且是针对每个基因而专门设计的，但结合在所述转染质粒中。将多个sgRNA克隆到含有mCherry、Cas 9的转染质粒中，并且两个sgRNA由一U6 pol 3启动子驱动。
接下来，将靶向ACS及ACO候选基因的所述CRISPR/Cas9复合物及多个sgRNA转染到香蕉原生质体中，并且通过荧光激活细胞分选(FACS)来富集带有这种复合物的细胞。使用所述mCherry标记，在转染后3天(dpt)，将瞬时表达的所述荧光蛋白、Cas9及所述sgRNA的转染香蕉细胞分离、分选并收集mCherry阳性香蕉原生质体。在在转染后6天(dpt)的5000个分选原生质体(Qiagen Plant Dneasy提取试剂盒)中提取DNA。使用图13A、图14A、图15A、图16A、图17A中所示的引物来进行巢式PCR(Nested PCR)以提高灵敏度。对于所有候选的ACS及ACO基因的扩增区域的琼脂糖凝胶显示在图13B、图14B、图15B、图16B、图17B中。仅在ACO基因Ma01_g11540中，观察到约350个碱基对的一清晰缺失(图17B)。
为了评估所述多个sgRNA及所述CRISPR/Cas9复合物是否激活并且是否在所有其他ACS及ACO基因中诱导基因组编辑事件，因此进行一T7E1分析。已经发现所有sgRNA组合物在所有ACS及ACO基因中诱导基因组编辑事件(ACS：Ma09_g19150；Ma04_g35640；Ma04_g31490。ACO：Ma01_g11540；Ma07_g19730)，如图13C、图14C、图15C、图16C、图17C所示。此外，克隆及测序证实某些基因的所述T7E1结果，并且发现使用的某些sgRNA确实诱导***缺失，如图13D、图15D、图18、图19、图20A，图20B所示。总之，这些结果表明，所述CRISPR/Cas9***可成功用于在所述内源ACS及ACO基因中引入精确的突变，并且多个sgRNA的设计及选择会影响基因组编辑的效率。
并行地，在所述原生质体的再生中推进(advanced)其他分选的mCherry阳性原生质体。简要地，将分选的原生质体以高稀释度铺在液体培养基中，从而允许菌落形成28至35天。挑选菌落，使其生长并分成两等份。一等分试样用于DNA提取及基因组编辑(GE)测试以及不含CRISPR DNA的测试，而其他等分试样则保持培养直至其状态得到验证。向前筛选的只有那些明确显示不含GE及CRISPR DNA的抗体。
在黑暗中20天后(从分离到进行GE分析，即60天，因此总共80天)，将所述菌落转移到相同但降低葡萄糖含量(0.46摩尔)及0.4％的琼脂糖的培养基中，并且在一低光强度下培育。六周后，将琼脂糖切成薄片，并置于含有0.31摩尔的葡萄糖及0.2％凝胶的原生质体培养基上。一个月后，将原始菌落(或愈伤组织)传代培养至再生培养基(半强度MS+B5维生素，20克/升地蔗糖)中。(图23A至图23E)。接下来，将成熟的胚传递到含有MS盐及维生素的发芽培养基(GM)中，在转移后的1至2周，胚开始发芽。3至4周后，准备好将发芽的胚转移到增殖培养基中以进行芽伸长(图24A至图24D)。
此外，利用用于转染的相同质粒(pAC2007、pAC2008、pAC2010、pAC2011及pAC2012)来轰击香蕉胚发生细胞悬浮液(ECS)，从而延长保质期。轰击后3天，将细胞移到增殖培养基中，当胚胎从轰击的ECS中发育时，将胚胎转移到胚胎发育培养基(EDM)及成熟培养基中(图25A至图25E)。
尽管已经结合本发明的特定实施例来描述本发明，但是显然地，对于本领域技术人员而言，许多替代、修改及变化将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求书的精神及广泛范围内的所有这样的替代、修改及变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请都通过引用整体并入本文，其程度与好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地及单独地指示通过引用并入本文的程度相同。此外，在本申请中对任何参考文献的引用或标识均不应解释为承认所述参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的程度上，不应将其解释为必然的限制。
序列表
<110> 热带生物科学英国有限公司
毛利,艾尔
盖伦提,亚伦
皮诺奇,克里斯蒂娜
查帕罗,加西亚,安吉拉
梅尔,奥菲尔
<120> 用于增加香蕉的保质期的组成物及方法
<130> 73989
<150> 1708662.0
<151> 2017-05-31
<160> 74
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1759
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 1
tgcaatctct ctgttgtgtt ctgtaggtat aacttctctt gatctcttct tggcatacca 60
cgatggagca gaagctgctg tcgagaaagg ctgcatgcaa cagccacggg caggattcgt 120
cctacttctt ggggtggcag gagttcgaga agaaccccta cgatccaatc gccaacacag 180
gagggatcat tcagatgggt cttgcagaaa accaggttgg ttatcccctc tcatagcttc 240
tcctcattcg tcattcctga aaccctagtg tttgattgat cccttaccgt cttgttcatc 300
gtgcatgcct gcagctctca ttcgatctca tcgagtcatg gcttgaagac caccctgacc 360
tcaccggatt caagaaagat ggtggtttgg tgttccggga gcttgctctg ttccaggact 420
atcatggctt gccagctttc aagaatgtaa gcccatatta tagcctcagc taatcgatcc 480
aggggaagat tcgcatccat tcttgatgtc tctactgacc tctgcaacac atacatttgc 540
aggcattggc tagatatatg ggagaagtca gaggaaacaa agtaagtttc gagcccagca 600
agctcgtcct cacggctggt gccacttctg ccaacgagac tctcatgttc tgtcttgccg 660
accctggaga agcgttcctt ctcccaactc cgtactatcc agggtactgc actgacctcg 720
tcgatacctg agctatgttg ttgggtcgcc gtggtgacac tcctttggat gcgcgtgaca 780
ggttcgacag ggacctcaaa tggcgaaccg gcgtggagat cgttcccatc cactgctcga 840
gctcgaatgg cttccgaatc acccgagcgg cactggaggc ggcactccga cgtgcgcaga 900
agcgtagact gagagtgaaa ggagtgctgg tgaccaaccc gtccaaccca ctggggacga 960
cgctgacccg acaagaactg gacaccctcg tcgacttcgc cgttgccaat gacatccacc 1020
tcatcagcga cgagatctac tccggcacca ccttcggctc gccgggtttc gtcagcatcg 1080
ccgaggccac caagggcagg gacgacgtct cccatcgcat tcacatcgtg tgcagtctct 1140
ccaaggatct cggcctccct ggcttccgcg tcggcgcaat ctattcggac aacgaggccg 1200
tcgtgtccgc cgccaccaag atgtcgagct tcgggctgat ctcttcgcag acgcagtacc 1260
tcctggcggc gctgctatca gacaaggaat tcaccgagac gtacgtccgc gagagccaga 1320
agcggctcaa agaacgccac gacatgctcg tggaagggct ccggcgaatc gggatcggtt 1380
gcttggaggg caacgcaggg ttgttctgct gggtggacat gaggcacctg ctgaggtcga 1440
acaccttcga aggggagatg gaactgtgga agaagatcgt gtatcgagta ggactcaaca 1500
tctcgccggg ttcttcctgc cactgcgacg aaccagggtg gtttcgcgtc tgcttcgcca 1560
acatgtccga ggacaccctg gagctcgcca tgaggcggct cgagagcttc gtggattcct 1620
gccatcggcg ccgcccaaga cggcaattct tggccaaatg ggtgctcggc tcagcctcat 1680
cgtctgccga tcgcaagtcc gagcgataac gcctgctaag ctgccagtga ctgcatgcat 1740
gatcactcct actacgatt 1759
<210> 2
<211> 4242
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 2
taggcggcac gcattcggca actccaaccc ctacccctac ctcaggataa acagcgcgcc 60
tctgcttgcc tgggcccgta agcgaagacg cggccgccgc cgccgcccgc cgacgacacg 120
ggtgggatcc gtgtgctaga ggaggaagga ccagacggag gaggacggtc tcacgccagc 180
gatcgataaa ggcagccatg cgcgtcatag tccccctcca ggccgtggtg caggggaggg 240
gcggcctcgt cctcggttcc ctcatcccct gcgccctctt ctacttcctc cagttctacc 300
tccgccgcaa ccgcccctcc tcctcttccc cgccgccccc ttcctctgcc tccggctcca 360
acctgcccga gctcgcctcc atccctcggt cgctctcgag gggcctcctc tctccccggg 420
gctcctttgg cccagcacgc ctctcctcgc gcggcaccgc cgtcgtcagg gacgacgaca 480
acccctacta cgtcgggctg aagaggtgcg ccgatgaccc ctacaatcgc tcgatcaatc 540
cccagggctt ccttctgctt gggctggcag agaatagggt gtgtgatcct cccttccttt 600
gcttcctgct atgtcaatgg gcgatatgaa agatttggtg cttgtttttg gcacagttgt 660
cattggatat aattcaagat tggttggtca agaattggaa ggagtcattg ctgttggatg 720
acgaggagga agagttgagt atccagggac tggcaacgta tcagccttat gatggatcga 780
tggatttgaa gacggtgagt gaaacttttc tcccttttgt tttctacatc tttcgatctc 840
atttcttggt gcacgctctt agagtctgta ttgccactgg ttcagaataa tatttgaata 900
agatttatga tgcaaatacc aacaggagaa gcaatttaga acacctcagt atatgacctg 960
tttatgattc tttttcatgt ccatcaattc agtccttgtc aagacttcct tgttttgtta 1020
ttatgtgtag aaaaaaaaac tagatacaaa tttatgccct aatgtattgt gacatggcat 1080
ctacggatgg ttgtgacgat attgtccttc ttctccagct tagtcttggt tttgtctgtt 1140
caattttgtg ggccttttgc actgatgaag tctgcctgcc tatttgttgt acaagaagct 1200
gattttgggt gtgtgcatgt ttattcattt tgatctatgt tttttttctg atatttccat 1260
agatcaaaat gaagacaaca tacttttgaa aatccctaag cgaagcatac tttttattat 1320
tataccaaga gattgtacgc ttaattattt gcttatatag atacttgatt ttatgactaa 1380
aaaggcagaa cagcatcatg gcaaaaggca agagaagaca acattattaa agatccatct 1440
tggagacact ttcactgata gatacattat gttgattctt gttttgtatt atattttacc 1500
ttttattaac ctgatgatgc ttaatgtgtg gaattggatt taacaactca ttcgtagtta 1560
taaggcaatg tctataactg catgttagat gcttcaaatc tatttccaaa ttgacgtttc 1620
ttattttgtc gcaatggatc tttcatacct tccatttcat tagtttcata acagagaaaa 1680
tactatgatc atatccactt ctgatttttt taacacgata agaaaggttg aagttttttt 1740
gacgttagct tggaaataat ggttcttgta ttttacactt acaaattcaa gcgagaattg 1800
caaatttata tgtaactatg acatacaaat tttaattaat ttaccttgta ttttaatttc 1860
aaatgtactt ctggcatttg gtggagcata attatggatt tggtagtttg ctgtgattaa 1920
ctggtgaata tatttgctac aagaatgaaa aaaccattgt cttcaggtta ctcactcaag 1980
atcttgtatg tccaaagttg ctcatctttt tatgtggaac atcaagtttg attacaaagc 2040
tatgttgttc tcacaaggtt acatctagaa ttttcctctc tggaaatctt gactataagt 2100
ttggtggata ctaagaacta tagctgaaag aaaatcagcc agcatgatct tcattgttca 2160
tctatcattt catcttcaag aagtgtgata ttatctcgta ttatcaactg aaatattctt 2220
gtatttaggc ttacatattg agatttaatt gataattttg acttttttga gagacatttc 2280
ctcccatgga gaacatttgt gggataactt aataaaaatg cattccgtgc ataacacatc 2340
cttgtccatt atggtgattc ataggttttt ctgcttctgc ctaagtaatg ggccatgctg 2400
gttccttgca tgtggaattt gcttgagtta ttcactcacg tcttagataa gtggcatccg 2460
ttactaattc cttcagtcta ctgagatttt ttcccaattc tattccagtt tgcaagagca 2520
ccactttgtc tgatttcatt tctgacttga aatcattttt tgtttttaat taggtgatga 2580
attgctaatc tgatttgttt tatttactgt catataaatt caaaagcacc tgaatgttct 2640
tcattgcttt ttcaacaggc tgttgctgaa ttcatgggtc aagtcatgca ggggtcagtt 2700
tcattcaatc cgtcacacgt tgtattaact gcaggtgcca ctcctgctgt tgagacacta 2760
ggcttctgtc tggctgaccc tggagatgct tttcttgttc catcacctta ttaccctggg 2820
tgactattag tttttactct aactgagtga tcaatttttt atgagtcaag atagtataca 2880
aaattaacaa gcacccaatg caggtgggac agggatatca agtggcgaac tggtgtagag 2940
cttattcctg ttccatgccg aagcactgat aactttagca taagtattgc tgcccttgaa 3000
ctagcataca accaagtaaa gaagcgaggc atgaaggttc gtgctgttct tgtttctaac 3060
ccctccaatc cagttggtag tcttatagat cgggagacac tatgtggcct tctggacttt 3120
gttatggaaa aaaacataca tctgatttct gatgaaatat ttgctggatc gacatatggg 3180
agcgataagt ttgtaagtgt ggccgaggtt ctagatgcag aaagctttga caagagcagg 3240
gtccatataa tatatggact gtcaaaagac cttgctgttc caggctttag ggttggagtc 3300
atctactctt acaatgaaaa tgtcctggct gctgcatcaa agctggcaag gttttcatcc 3360
atttcagctc ctacccaacg gttgcttatc tcaatgctct cggatagaaa attcatctca 3420
gaatatcttg cagtgaacag agcgagacta catgacatgc atgccttatt tgttgatgga 3480
ctgaaacagt tgggtatcaa gtgtgccagt agcagtggtg gattctattg ttgggcagac 3540
atgagcatgt ttattcgacc atatagtgag aaaggggagc ttaagctctg ggataatctg 3600
ctgaatgtgg ccaaggtcaa tgtgacacct gggtcatcat gccactgtat cgaacctgga 3660
tggttcagat gttgcttcac gacattgaca gagaaagatg ttcctacagt tatggaaaga 3720
atacagaaaa ttaccaaaag caattaagtt actgatgttt caaaactcac ctcttcaggc 3780
atcactttta ataaattgaa gtgacttcaa atgtttatgt agtgtgagga cgctgtagtt 3840
cggcagtcag catgtcatct ctggacttca acatgcaacc aaagttagga caccgtcgca 3900
agaatcaaac ttggagaggt ggagataaag ggtggtgttg aaatactaag gacattattg 3960
aaatatacag tttgatgcga cttttaacct ccacagctgg ctggtgcgac aatcttcttg 4020
ctatgggtat tagatgatag tttagaatct tctgtacctg ttcacttctt gtttaagttg 4080
aattggcttt tctagtagat tgtgcatatt ctcctcatta agctgcagat gtagattcaa 4140
gattttggtt tctactggta ggatggggga tgttcattga catataatca tttttggtct 4200
tgttatgaca taatttagtt tatgagtcat attgtttagt tt 4242
<210> 3
<211> 1876
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 3
gtctctcaat ctcttctcag cctaccagaa tgaatcagat gctgctctcc agaaaagctg 60
catgcaacat ccatgggcag gactcctcct atttcctggg gtggcaggag tacgagaaga 120
acccctatga tccaatcact aacccgacag ggatcattca gatgggtctc gcagagaacc 180
aggttggttc tctcactcag acaagttctc ctcactcaag tcactcgtga cagtaactaa 240
tattaaggcc tctcgttcat gcttgcagct ctgctttgat ctcatcgaat cgtggcttga 300
gaaccatccc gacccagctg cattcaagaa agatggagca ctactattcc gggagctcgc 360
tttgttccag gactaccatg gcttgccagc cttcaagcgt gtaagtccat aaacttaaac 420
taatttaccg gggatatatc agaaggatca catccattct cgcatatatc aacagaatct 480
gctgggttac taattgcagt ccgcgatgca tacatctgca ggcattggct aaatacatgg 540
gagaagtaag aggaaacaaa gtagctttcg atcccaacag gctcgtcctc acggctggtg 600
ctacttctgc caatgagact ctcatgtttt gtcttgccga acctggagaa gcattccttc 660
tgcctactcc atactaccca gggtacgtac acatccacaa cagagccttg tcgaccaatt 720
actctaccca tgcacgcgat cggttccatg tacttgaatt gccatggtga cacactcacc 780
tttcccatgt gtgtctgaca gattcgacag agacctcaaa tggcgaaccg gagcggagat 840
cgttcccatc cattgttcga gctctaacga cttcaggatc accaaaccgg ccctggaagc 900
tgcataccaa gatgcgcaga agcgtagcct cagagtgaaa ggtgtgctgg tgaccaaccc 960
gtccaaccca ttggggacga cgctgacccg acacgaactc gacattcttg tcgactttgt 1020
cgtctccaag gacatccatc tcatcagtga cgagatctac tcagggacca acttcgactc 1080
gccggggttc atcagcattg cagaggccac aaaggacagg aacaacgtct cccatcggat 1140
tcacatcgtg tgcagcctct ctaaagatct cggcctccca ggttttcgtg tcggtgcaat 1200
ctattcggag aatgaagcag tcgtgtctgc tgctactaag atgtcaagct ttgggatggt 1260
ctcttctcaa acccagtacc tcctcgcggc gttgctatcc gacaaagaat tcaccgataa 1320
gtaccttctc gagaatcaga agagactcaa agagcggcac gacatgcttg tcgaaggact 1380
gcgcaggatc gggatcgggt gcttgaaagg aagtgcggcc ttgttctgct gggtggacat 1440
gagacacctg ctgaagtcca acaccttcaa aggagagatg gagctgtgga agaagatagt 1500
gtatcaggtg ggactaaaca tctcgccggg ttcttcgtgc cactgcgacg aaccggggtg 1560
gttccgcgtc tgcttcgcta acatgtccga ggacacccta accctcgcta tgcagcggct 1620
taaaagcttc gttgactccg gcgattgcgg cagtaaccat gactccggcc atcagcgccc 1680
cagaaagcca ttcttgacca agtgggtcct ccgcttgtcg tccaccgatc gcaagtccga 1740
gcgctgataa caccggattg ctgcagcgaa tgcacgatcg atcattcttt acatttttac 1800
gccaaacagc atgtttcttt tctcctcgtg tctttttgcc ttggatcacg cgatctgtct 1860
ggttttttga gtgccc 1876
<210> 4
<211> 3417
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 4
ccgcaggcac ccgtcggcta gaggaagaaa caccaggagg aggagtaggg ttcgcctgcc 60
gctatgcgcg tcatagtccc gctccaggct gtggtgcagg ggagaggtgg cctcgtcctc 120
ggctccctca tcccctgcgc cctcttctac ttcctccagc tctacatccg ccgcgaccgc 180
cgctcctcct ccgcctccaa cctgcccgag ctcgctccca tgcctcgttc gctctctagg 240
agcctcctct cgccccgcgg ctcgtccggg cccgcgcgtc tctcatcgcg cggtgcttcc 300
gtcgcccggg atgatgacaa cccctactac gtcggcctta agaggtgcgc cgaggatcct 360
taccatcact cgtccaatcc ccgtggcttc atgcagctcg ggttggccga gaattgggtg 420
ggtgttcttc cttccctcag ttttttacta tttggatggc cgatataaaa ggatttggcc 480
taccgtttgg tgctcgtctt cggtacagtt gtcgttggat atgatccgag attggttggt 540
cggtaatgta aaggagccat tgctgttaga tgaggaagga gagttgagta tccacggatt 600
ggcgacgtat cagccttatg atggattgat ggatttgaag atggtgagta aaagttctct 660
gctttcgttt tctaggtcga ttaatttcat taatcttgtt aatactggtg cacattcttc 720
aagtctgtgt ttctaataga tttggcgaaa ttttcaatac ggtttatgat gtaaaagcta 780
atgggaaact gagcatggaa acataataga cgaccaccga tctccctttt gctgcccatc 840
aatttggttc tcatcaaata ttcctctttt tgttctttag taaaactaga tgcaaagtta 900
agaaaatttg tatgcatttc tttctttgta gtagtacaat gaatacacat attctgataa 960
aaagttgatg gcataacaaa tgttgtgaat taatttcaga aatctgattc gtacgacaac 1020
atgttgcctt atgaagcaaa acgtatctca tcagccatac ccttccacga attgaaagct 1080
tcttaaatcc aattgtagga ccaaaccgaa tgattaggca atatctgtgc atgtctttct 1140
ttgtagtagt ataatgaata cacttcttct ggtgaaaaga tgatggcatg gcacaacaaa 1200
tgttgtgaat taatttcaga aatctgattc gtacgagaac atgttgtctt ataaagcaaa 1260
acatatctca tcagccatat ccttccacga attgaaagct tcttaaatcc aattgtagga 1320
gcaaaccaaa tgattaggca atgtcggtgc atgtctttct ttgcagtagt ataatgaata 1380
cacatctggt aaaaagatga tggcataaca aatgttgtga attaatttca gaaatctgat 1440
tcgtatgaga acatgttgtc ttataaagca aaacatatct catcagccat atccttccat 1500
gaattgaaag cttcttaaag ccaatcgtag gagcaaaccg aattattaag caatatccat 1560
gtagatgatt ttttttatgt taacagacag atgttgcaga ggtaacttta acacacttca 1620
cacagttgtg tcaaccttag aaagctgcat ctagaatttt atatttatag atgttaacaa 1680
atataggtgt attagacacc tgcatgatct gcatttgcaa tctgttattt tattttcgag 1740
aattgtgaat gtttttgagt tagtcttgtt gtgaatgcta taactttaag atttggatgg 1800
cagattttac ttgctgaaat aactttctac ccatgaagaa tatctacaac ataggccaaa 1860
aaaaatattc aagccatgcg tacatttcgt tgcccattat gtgatttttt atatttttgt 1920
atgactgcct ttatacatat cacagctgat ttcttgcttg tgaaatttgc ttgagttatt 1980
atcttaggta agcgatcata catgtctaat tcgtaaatca ctacccaaga gttttctata 2040
tctattccag tttgcaagtg gatcagtgtc ttttgtcaaa ttttatatct ggctatgata 2100
ttttattatt attattattt ttcatgttaa gagttgttaa tctgattttt ctttttaaaa 2160
tctggcatat aaatctaaca tcatcttgag attgttcatt gtttttcaac aggctgttgc 2220
tgaatttatg ggtcaagtca tgcagggatc agtttcattc catccatcac aaattgtgtt 2280
aactgcaggt gctactcctg cagttgagac acttagtttc tgtctggctg accctggaaa 2340
tgcatttctt gttccatcac cttattaccc tgggtaatta ttattttatc ctctaagaaa 2400
attttcatta ttacaagtaa acacgaaact aagaagcatc caatgcaggt gggataggga 2460
tatcaagtgg cgaactggga tagaacttat tcctgttcct tgcagaagca ctgataactt 2520
cagcataagc attgctgctc ttgaactagc atacaaccaa gcaaagaagc gaggtgtgaa 2580
agtttgtgct gttcttgtct ctaacccctc caacccagtt ggtaatctaa tagatcggga 2640
aacactatat gatcttctgg actttgttat ggagaaaaac atacatctga tttcagacga 2700
agtctttgct ggatcaacat atgggaatga tagatttgta agtgtggctg aagttctaga 2760
ttcagaaaac ttcgatagga gaagagttca tataatatat ggactgtcaa aagatctttg 2820
tgttccaggc tttaggatcg gggtcatcta ctcttacaat gaaaatgtcc tggctgctgc 2880
gtcaaagctg gccaggttct catccatttc gactcctacc caatgtttgc ttatttcaat 2940
tctctcgaat acaaaattca ttacagaata tctcaaggta aacaaggagc agttatgcga 3000
catgcatgcc ttatttgttg atggactgaa acggttgggt atcaagtgtg ctagcagcag 3060
tggtgggttc tattgttggg cagacatgag tatgtttatt caatcatata atgagaaagg 3120
ggagcttaag ctgtgggata agctgttgaa tgaagctaag attaatgtga cacctgggtc 3180
atcatgtcac tgtattgaac ctggatggtt tagatgttgc ttcacaacat tgacaaagca 3240
ggatattcct atagttatgg aaaggatcca cagaattact gagagcaact aagttgttga 3300
attttcagaa ttttcatctt cagcttgcat tttttgataa cttatgcaag tggctctctg 3360
tttgaagaag tgcattccaa aagtcggatg gcaagaacta attcccattg gcattca 3417
<210> 5
<211> 1963
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 5
ctctctctct ttctctctct ctctctctct ctgtttgtgt gtgcgttcgt aatccctgtt 60
gggcagaatc tctgtcttgt tctgtacgta catcatctct tcattgtata ccacaatgaa 120
tcagaagctg ctctctagaa aggcagcatg caacgttcat gggcaggact cctcgtactt 180
cctagggtgg caagagtacg agaagaaccc ctatgatcca atcacgaacc ccggagggat 240
gattcagatg ggtcttgccg agaaccaggt tggttctctc tcgaacaagt tctgcgctca 300
tacacaaact aatcccatgc ttaacgatct cgtcatgcat gcttgcagct ctgctttgat 360
cttatcgagt cgtggctgca cacccaccct gacgccgccg gattcaagaa agacggcgca 420
ttaatattcc gggagcttgc tctgttccag gactaccatg gcttacctgc tttcaagagc 480
gtaagtctat aaacccaagc agatgaatca tggatatcat atcagaagaa atggtttgat 540
ttcttatcga tccctgcatt gcgtacttcc gcaggcattg gcaaaattca tgggagaagt 600
acgaggaaac agagtaactt tcgagccctg caagctcgtc ctgactgctg gtgccacttc 660
tgccaacgag acactcatgt tctgccttgc cgagcccgga gaagctttcc ttctgcccac 720
tccatactat ccagggtatg catcgacagc aaaacctcga cgacgactac tactactact 780
cttggcatgc acgcattgct caaacttgtg tgtgacagat tcgacaggga cctcaaatgg 840
cgaaccggag ctgagatcgt tcccatccac tgctccagct ccaatggctt ccgagtcacc 900
aaagtggccc tcgaagcagc gcaccgacac gcgcagaagc gtggcctcag ggtgaaggga 960
gtcctcgtga ccaacccttc caacccattg ggcacaacca tgacccggca agaactggac 1020
accctcatcg acttcgtcgt tgccaaagac atccatctca tcagcgacga gatctactcg 1080
ggcaccagct tcgactcgcc ggaattcgtc agcatcgccg aggccatcaa ggacagggac 1140
gacgtcgccc accgcgtcca catcgtgtgt agcctctcca agggtctcgg tctcccggga 1200
ttccgcgtcg gtgcaatcta ctcaggcaac gacgcggtgg tgtctgccgc tacgaagatg 1260
tccagcttcg gtctgatatc ttctcagact cagtacctcc tcgcagcgtt gctctccgac 1320
gatgagttca ccaagaagta cattctcgag aaccggagga ggattaaaga acggcacgcc 1380
ctgctcgtgc aagggcttcg taggatcggg atcagatgct tagagagcaa cgcgggtctg 1440
ttctgctggg tggacatgag acacctgctc aagtccgaca ccttcaaagg agagatggag 1500
ctgtggagga agatagtgta tcaagtggga ctaaacatct cgccgggctc ttcgtgccac 1560
tgcgacgaac cggggtggtt ccgcgtctgc ttcgccaaca tgtcggagga cacactcaac 1620
ctctccatgc aacggctcaa gaacttcgtg gactccggcg agcatcgcag gacccacgat 1680
tctggccatc ggagtccgag aaggcaattc ttgactgcat gactattcct acaattctta 1740
tagtttgtat atcccaagaa gaagtagata acgaagaagt agaagaagaa gaagacatta 1800
tttaatttgt gagggtgttt tttccctgga tcaccacaat ctgcttggat ttttggtggc 1860
catggtctca tcatctataa gatggtttgt atgtttagct cctcacttcc tcaagtctgt 1920
attcggagga cagaatggac taaagcaaca tcatttgtgc aag 1963
<210> 6
<211> 1653
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 6
atgccgcagc agctgctctc caggaaggcc gcgtgcaaca cccatggaca ggactcctcc 60
tacttcctgg gatggcagga gtacgagaag aacccttacg atcccaagac gaaccccacc 120
ggcatcattc agatgggtct cgcagagaac caggtctgat aatggtcatg aatcccattt 180
ccgcattctc ggcatgctcg ctgatagcca ccgagtcttg atcttcatgt cacgtttcat 240
gcagctctcc ttcgacctga tcgagtcgtg gctcgaaagc caccccgacg ctacggggct 300
caggcgagac ggcgtcctcg tgttccgcga gctgggcctt ttccaggatt atcatggcct 360
gcctgagttc aagaaggtaa gcattggata ccgtctctat tctcaaatgt gagggaatga 420
gcgatcttcc ctgtgttgat cgatccgctt ctacgtaaac gttcgcaggc actggcggat 480
ttcatgggag agtcgagacg aaacacagtg aaattcgatc cccacaagct cgtcctcacg 540
gcaggcgcca cttctgcaaa cgagactctc atattttgcc tcgccgaacc cggcgaagca 600
ttccttctcc ctactccata ctacccgggg tatggaacta gggacctgcc accctttcca 660
ttctcatacc tacactgtac attagtctca cacaactacg tgcataacag cttcgacagg 720
gatctcaaat ggcgaactgg tgcagaaatc gttcctgtac gttgttcaag ctccaatggc 780
ttccggatca ctaaggcggc gctcgagaaa gcccatcgac gggcacgaaa gcttcacttg 840
agagtaaaag gagttctgat gaccaaccct tccaatccat tgggcacgac gatgacacag 900
gtcgagctcg acaccctgat cgacttcgtc gtcgccaaag acatccatct catcagcgac 960
gaggtctact cgggcaccaa cttcgactct ccgggggtca tcagcgtcat ggaggccatc 1020
cagggccgga aaaatgtggc acatcgcgtt cacctcgtct acagtctctc caaggatctc 1080
ggcctccctg ggttccgagt cggtgcaatc tactctaata atgagacggt ggtggctgcg 1140
gccactaaga tgtctagctt tgggctcgtc tcttcccaga ctcagtacct cctctccgca 1200
ctgctctcag acaaggagtt cagaagaagc tacatcgtgg agaaccagag gaggatcaaa 1260
gagcggcatg acctgctcgt tcgtggactc gagaaaaccg gcatcaattg cctgaatagc 1320
aatgcgggtt tgttctgctg ggtggacatg agacacctgc tgaagtccaa cacctttgaa 1380
ggagagatgg agctgtggaa gacgatggtg taccaggtgg ggctaaacat ctccccgggc 1440
tcctcctgcc actgcgacga gccggggtgg ttccgcgtct gcttcgccaa catgtcggcg 1500
gagacgctcg agctggcgat ccaacggctc gacgatttcg tagtttcctg tcatggccac 1560
aaggtgatct gcaactcagg atgcaggatg caatcatgca tgcccaaatg gatccttact 1620
ctgccatcct cggatcgcat gttggagaga tga 1653
<210> 7
<211> 1662
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 7
atggcccaga tgctactctc catgaaggct gcgtgcaaca ctcatgggca ggactcctcg 60
tacttcctgg ggttgcagga gtatgagaac gacccgtatg atccgaagac caaccccacc 120
gggatcattc agatgggcct ggcggagaac caggttcgca ttccgtggat cgccatcatc 180
ttttgccggc tctctctctc tctctctcgc ttactcttac cctgtcgatc gtgcagctct 240
ctttcgatct catcgagtcg tggctgcagc gacaccccga cgcggcgggg ctaagaagag 300
acggccgcgt cgtgttccga gagctggctc tcttccagga ttaccatggc ttacctgagt 360
tcaagagagt aagtgctggg ttcgaacaga tagagaggga tgtcgcgctt ctcttttgcc 420
gcatggtaat gcgatgcgtg cgcttctttg agatcccgtc ttcacgttct gcacaacgta 480
cgtctgcagg cactggcgga tctcatgggc gatttaagag gcaacaagat cgagatcgat 540
ccgcgaaagc ttgtcctgac cgccggagcc acctctgcta acgagattct catgttctgt 600
ctcgccgaac ccggcgaggc ctttcttatt cctactccat actatccagg gtaaacacat 660
catctctccc actgttcata aacctcagta actccgcgac taacatccgc taaacacagg 720
tttgacaggg atctgaaatg gcgtaccggc gcggagatcg ttcctgtaca ctgttccagc 780
tccaatgggt tccgaatcac cagagccgcc ctcgaaaaag cctatcaagg agcgcgaaag 840
cgtaatctga tagtaaaagg agttctgatc accaatcctt ccaatccatt gggcacgacg 900
atgagtcgga acgagatcga cgccctcgtc gacttcgtcg tcgccaagga cgtccatctc 960
atcagcgacg agatctactc cggaacgacc ttcgactcgc ccgggttcgt cagcgtcacg 1020
gaggctatcg agggcagagc acacgtaacg gatcgcgttc acgttgtata cagcctctcc 1080
aaggatctcg gcctccctgg cttccgggtg ggtgcaatct actccaacaa cgaggccgtg 1140
gtggccgcag ctaccaagat gtcgagcttc ggcctcgtct cttcccaaac ccagtacctc 1200
ctctcggctc tgctctccga cgaggagttc agaggcaatt acaccgggga gaaccagaag 1260
aggatcaagc agcggcacga ccggctcgtc caaggccttg ggcggagtgg catcagctgc 1320
ttaaagagca atgcgggtct gttctgctgg gtggacatga ggcacttgct gcgttccaac 1380
acattggagg gggagatgga gctgtggagg aagatagtgt acgaagtggg gctcaacatc 1440
tcgccgggct cctcctgcca ctgcgacgag cccgggtggt tccgcgtctg ctttgccaac 1500
atgtcggtcg agacactcga cgtcgccatg cggcggctgc aggacttcgt ggcctccggc 1560
cgagcccacg acgacggcag ccaccaaagg aagaagccaa tcttgggcaa gtggatgctc 1620
accttgtcat cctcggacca caggtcggag aggggatggt aa 1662
<210> 8
<211> 1884
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 8
atggggattc ccggtgacga gatcctctcc agggtcgcta cgggcgatgg ccacggtgag 60
aacacctcgt acttcgatgg ctggaaggcc tacgataatg atcctttcca cccgattcat 120
aatcccaatg gtgtcatcca aatgggactc gcagaaaacc aggtaatgct tgtttctggc 180
tctgtccatt actttctcct cctcctgctg ctgctgctgc taatgggttt cggtctgcct 240
ttcctcagct ctgcttggac ttgatgcgag attggatcag gaagaatcca caggcttcta 300
tatgcaccaa ggagggcgtt tcagagttcg aagccatcgc taacttccag gactaccatg 360
gcctgccgga cttccgtaag gtaatcaccg tctgcagcca taatgcagct cctcgatccc 420
ttactcatgc gtgccatgaa cgatgagggc acagttggat cgatatgcgt tgctatagcc 480
gaaaggtaat gacgcgatca tctatggaaa tgcacaggcc attgccaagt tcatggagaa 540
agcgagagga ggacgagcca ggttcgaccc ggagcgcata gtgatgagcg gtggagccac 600
cggagctcaa gaaacgatcg cattttgtct ggccaatccc ggggacgcct tcctcattcc 660
gacgccatac tacccagcgt acgtatgcct gttgagtcaa cattctgatc tctcaagtaa 720
ttgcgtcgtc aacttccccg ttcgaacaaa tgttccagcc gaccaatcag tcgtgcaatg 780
acccaaacga cagtcaaact tttatctgcc tgagcattga ccaaaaccac accattcaac 840
gtaattgtgg tcatgcaatc cgacactaaa gaacgacatt tggttcttct caggttcgat 900
cgagacttca ggtggagaac tggagttcag ctcctcccta ttcgctgcca cagtcacgac 960
aacttcaaga tcaccgaagc cgagcttgct gctgcctacc ggaaggcgcg cgactctaag 1020
atcagggtta aaggaatact aataaccaac ccgtcgaatc ctctgggcac aaccatggac 1080
agggagacgc taagaaccct agtaagattc gcgaacgagg aaaggatcca cctagtctgc 1140
gacgagatct tctccggcac agtcttcgac gggccggaat atgtcagtgt ggcggagata 1200
ttgcaagagg atccgtcgac ctgcgacgga gacctaatcc acatcgtcta cagcctgtcg 1260
aaggacctcg gcgtccccgg attccgtgtc ggcatcatat actcgttcaa cgacgcggtg 1320
gtcagctgcg ctcggaggat gtccagcttc ggactggtct cgacgcagac tcaacgcctg 1380
cttgcttcca tgctgggaga cgacgacttc accaccgacc tcttggcgga gagcaggagg 1440
agattaatgc acaggcacag gacgtttact gccggcctcg aaggcgtcgg cattcgttgc 1500
ttacagagca acgccggact attctgctgg atgagcttga agcctctgct gaaagacgcc 1560
acggcggagg gcgaggtcga gctgtggcgg gtgatagtga acgaggtgaa gctcaacatc 1620
tctccggggt cctcgttcca ctgcaccgag ccggggtggt tcagggcgtg ctttgccaac 1680
atggacgagg agaccatgga gacggccctg cggcggatca ggacgttcgt gcgccgggcg 1740
aacgacgcag ctactgccgc caagaccaag aagaggtggg acacatcgct tcgcctgagc 1800
ttgccacgaa ggttcgagga gatgaccgtc ctgacaccgc gtctgatgtc tcctcgctct 1860
ccgctcgttc aggccgccac ctga 1884
<210> 9
<211> 2504
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 9
gcagcagctg cttctccttc ttctctgctc gcttcagcct tttccggtac gtacctgaga 60
taacgggtca catgaggatc tacggcgagg agcacccaaa tcagcagatc ctctctcgga 120
tcgcgaccaa cgacggccat ggcgagaact cctcctactt cgatgggtgg aaggcctacg 180
agaaggatcc tttccacctc accgacaacc ccacgggggt catccaaatg ggactcgcag 240
aaaaccaggt tagagttcct tcatggtgat gattaatcgc acatgccttc cgtcaattgc 300
cactccctgc ggttgctaat ctaatctgta tgtgggtttt gggtctttct ttcctcagct 360
ttccctcgac ttgatccgag actggatgaa gaagaacccg caggcttcga tctgcaccga 420
agaaggggtc tcagagttca aagcaattgc caactttcag gactatcatg gcctcccagc 480
cttccgaaag gtaatgattt caacccaaaa cgcagcgctg cagctgcttg tcctcactgt 540
ccaagtagct acatacgtcc aatatgataa agctgggact gacagccact tacggcccga 600
gccctgcctg ctcaccctgg ataagggata agctaatgat ggtgtgattt gctgacacgc 660
gcaggccatc gcccagttca tggagaaggt gagaggggga cgagccagat ttgacccaga 720
ccgcatcgtg atgagcggtg gagccaccgg tgctcaggaa accatcgcct tttgcctggc 780
tgatcctggc gaggccttct tgattccaac gccatattat ccggggtaag tgttcaggtg 840
tactaatcta ccgagttctt tatccggcag aggatctaat ggcatctgca tggtttccag 900
attcgatcga gacttcaggt ggaggacagg agttcagctc ctccccattc actgccacag 960
ttccaacaag ttcaagatca cccaagccgc actggagact gcttacagga aggctcgaaa 1020
ctcacacatt agagtcaaag gaatactggt gaccaaccca tcgaaccctc tgggcacaac 1080
catggacaga gagacgctga gaaccctagt cagcttcgtc aacgagaaaa ggatgcactt 1140
ggtgtgcgac gagatcttct ccggaaccgt cttcgacaag ccgagttacg tgagcgtctc 1200
cgaggtgatc gaagacgatc cctactgcga cagggatctg attcacatcg cctacagcct 1260
ctccaaggac ctgggcgtcc ctggcttccg cgtcggcgtc atatactcct acaacgacgc 1320
cgtggtcagc tgcgcgagga agatgtcgag ctttggactg gtctcgtcgc agacgcagca 1380
cctgctcgct tccatgttgg gagacgagga gttcaccacg agtttcttag cgacgagccg 1440
gacgaggttg tgcgggcggc gcagggtctt tacggacggc ctcaagcgag tcgggattca 1500
ttgcttggac ggcaacgcgg ggctgttctg ctggatggac ttgaggccgt tgctgaagga 1560
agcgacggtg gaggcggagc tccggctgtg gcgggtgatc atcaacgacg tgaagctcaa 1620
catctcgccg gggtcgtcct tccactgctc ggagccgggg tggttcaggg tatgcttcgc 1680
caacatggac gacacggcca tgaagatagc gctgaggagg atcgagagtt tcgtgtaccg 1740
ggagaacgac gccgctgtgc aggcgaagaa caagaggagg tgggacgaag cgctgcggct 1800
gagcttgcct cgtcggaggt tcgaggatcc gaccatcatg acaccacatc tgatgtctcc 1860
ccactcgcct ctcgttcaag ccgccacctg aaacatcgac agcggcgtgt ctgatgtcaa 1920
cgaaggttaa ttaccgtctg atatgttgca catttctttg ttctttggat tatttatttt 1980
tttttttttg ggaaaaatgg gttgaatgtt cccactaagt tatattagat tgttgttcgg 2040
tctcattcat gttataggaa acgaggatag aattgcttgc ctctctcttt cttttatata 2100
tggaaatatg ttacaattgg cctaagctta tttgatgaca ttaatttcac aagacaaagc 2160
cttctaatta atgtttcgga ccaaatgcag gagctcacta catacatttg ttacacttca 2220
tatgttcaaa attagtccag tttaccggtg actcagtttt aaaggttata aatggttctg 2280
attcaagtac ttatctttgg ttctgttaat tggttcaaac cgaatcgatt ttaatttaaa 2340
caatattaat ttaattaaat tttttaattg gtttaaatcg attaatcaaa tcagttgatc 2400
agggaaaata ttattgatgt cttactcaac tcgatatggt ctatactcac gtgcgtagga 2460
atgtccgaga tgtctctgag ataaaaacat cgtgctttcg tgat 2504
<210> 10
<211> 1584
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 10
atggttaagg gtgctgagtc ctgtgtgcca ctctcagaag tggcaacttc caacacccac 60
ggggaggact ccccttactt tgctggctgg aaagcttatg atgaagaccc ttatgatgct 120
gcaagcaacc ctgcaggggt cattcagatg ggtttggcag agaaccaagt aagctattac 180
tgatgcatac tcattttagc ataagaagaa gttgtcttca tttctcttgc ctgactgtgc 240
ccttgtggcc tttctcaggt ttcatttgat ctactggaga agtatttaga ccagcacccg 300
ggagcatccg gctggggatg tggtatctcc ggcttcagag aaaacgcttt gtttcaagat 360
taccatggtc tacaaacttt tagacaggca ataagcataa cctgggaacg atcgtgttgc 420
ttatccgttc gtaattgttt cagagaatca cgctcgacta caactgtgtc tgcaggaaat 480
ggcaactttt atggaacaga taagagaagg cagggcaaag tttgatcccg aacgcatcgt 540
cctcaccgca ggtgcaaccg ccgcaaacga gctactcacc ttcatcttag cagatcccgg 600
agattgtttg ctgatcccaa caccttatta tcctgggtaa gagctacggc cacctcacag 660
tgctgccgct tgttaatctt ggcttaatta ggttaacagg aaaaccactt ctaatccagg 720
tttgacagag atctaagatg gagaactggt gttcgtatca ttccggtcca ctgtagcagc 780
tcaaatggat tccaagtaac tctccaggcc ttagaagatg cgtacgtgaa agcagaaggc 840
atgaagatta gagtcagagg acttctcctc acaaacccat cgaacccgtt gggcaccgcg 900
atcgcaaggc atgtactcga ggaggtatta gactttgtga cgcagaagga catccacttg 960
atctcagacg agatctactc aggctccgtg ttctcctccg atgagttcgt cagcgtcgcg 1020
gagattgtcg aagctcgcgg ctacaaagat tgtgaccgag tccacatcgt gtatagcctc 1080
tccaaggatc ttggcctgcc tggatttaga gtgggagcaa tttactcgta caacgataga 1140
gtggtgacga ctgctaggag gatgtccagc ttcacattag tctcgtctca gactcagagg 1200
atgttggctt cgatgctggc tgatagaggg ttcactgaga actacctgaa gacaaataga 1260
gaaaggctca agaataggcg tgatttcatc accgaaggtc tcaagaatgc cgggatcgag 1320
tgcttgccag ggaatgctgg gctcttctgc tggatgaatc tggcaccatt actcgaagag 1380
cccaccaggg aaggagagct gagactttgg agcttgatag tgcacgaggc gaagcttaac 1440
atatccccag gctcttcctg ccactgttcg gaagcaggct ggtttagggt atgctttgct 1500
aatatgagcc agcaaacact ggaagttgca gtgaggagaa taaaggactt catgaagaac 1560
atgaaggcaa tacaagagaa ataa 1584
<210> 11
<211> 1675
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 11
atgcctcaga tgcttctctc taggaaggct gcgtgcaaca cccatggaca ggactcctct 60
tacttcctgg ggtggcagga gtacgagaag aacccgtatg atccacggac aaaccccacc 120
ggcatcattc agatgggtct tgcagagaac caggttggta caccatggac gacacctcct 180
cctgcttcgt cttcttcttc tctcccactg tacccacctg ctaatgctat tgttctgtgc 240
agctctcttt cgatctcatc gagtcgtggc tggagcgcca ccccgacgcc gcggggctca 300
ggcgagacgg cgctctcgtc ttccgggagc tggctctttt ccaggactat catggcctgc 360
ctgctttcaa gaaagtaagt tgtactcggc ttaagctact cttacatcgc tttctcttgc 420
gcatgtcaat gctgactttg ctacgcgaac atgtgcaggc tctggcagat ttcatgggag 480
agttaagagg agacaaggtc aagttcgaac cgcacaagct cgtcctcacc gcaggctcca 540
cttctgctaa cgagactctg atgttctgct tggcggagcc cggtgaagcg tttcttctcc 600
ccactccata ctatccaggg tatatttccg tcaccatcac acactgttcg tcgaccttgt 660
ctacgtaaat tcagtgcctg ggtgacgtcg ttaacattac tgcacgtaaa tctttgacag 720
gtttgacagg gatcttaaat ggcgaactgg cgcggagatc gttcccatcc actgttcgag 780
ctccaatggc ttccgggtca ccaaggccgc cctcgaaaaa gcctatcaag gagcgcgaaa 840
gcgtaatctg agggtgaaag gagttctggt caccaatcct tccaatccat tgggcacgac 900
gatgactcgg tgcgagctcg acaccctcat cgacttcgtc gtcgccaagg acatccatct 960
tatcagcgac gagatctact ccgggaccag cttcgacgcg cccgggttcg tcagcgtcat 1020
ggaggccatc gagggcagac aacacgtctc gcatcgtatt cacgtcgtgt acagcctctc 1080
caaggatctc ggcctccctg gcttccgggt gggtgcaatc tactccaaca acgaggcagt 1140
agtggccgcc gctaccaaga tgtcgagctt tggactcgtc tcctcccaga ctcagtacct 1200
cctctcggtt ctgctctccg acaaggagtt caccagaaac tacattgagg agaaccagaa 1260
gaggatcaag gagcggcacg accggctcgt ccaagggctc cggagaagcg gcatcagctg 1320
cctgcagagc aacgcaggtc tgttctgctg ggtggacatg aggcacctgc tgaactccaa 1380
cacgttcgaa ggagagatgg agctgtggaa gaagatcgtg taccaagtgg ggctcaacat 1440
ctcgccgggc tcctcctgcc actccgacga gcccgggtgg ttccgcgtct gcttcgccaa 1500
catgtcggcg gccacgctcg acctctcgat gcaacggctg caggatttcg tggcctcccg 1560
cggaggcccc aatgacggcg cctccgggcc ccggcggcaa aggaagaagc caagcttggg 1620
caagtggatc cttactctgt cgtcctcaga tcgcatctca gacagaggat gttag 1675
<210> 12
<211> 4149
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 12
agaattgtta taaaagagtg tggccaacgg cgacgcttcc ttctatgttt ccaaatacaa 60
tgcaaaccaa caaggtataa aataatctcg ctcctcttcc tcccgtcgat gagcccaacc 120
ccctccaaga aatccgccga cgccgccgca gccgcagcca cagcgaccca agcccggtcg 180
tccgcaaccg gcctcggcgg tggagggggc ggcgcgggca tgcggctcat cgtacctctt 240
cagggcgtcg tccagggccg cggcggcctc gtcctcggca ccctcatccc ctgcgccctc 300
ttctacttcc tccagttcta cctcaggcgc aaccgctctc ctcctcctac ttcgccgcaa 360
ccccccgctg ccaacggccc cgatctcccc ggcatcgtcc ggtcctcctc ccgcaacttc 420
ctctccgccc gcggctcctc cggccacgcc gccgtctcct cccgcgcggc ctcgatcgcc 480
agatccggcg attcgcctta cttcgtcggg actaagaagt gctccgagga cccttaccat 540
cccgtcgata accccgacgg cgtcatacag cttgggttgg ccgagaaccg cgtagctttc 600
ttttacccta gaaaaactgt catctttctt cttccttttg gggttttata cccgtgagga 660
gtttcttatc gattgttgtt ggtttgctgc agttgtcttt ggatctaatt ggggactggc 720
ttgcgagaaa tgtgacggat accctactcg acgagcggca gggtgggctg agcatcagcg 780
gattggcgac gtaccagcct tttgatgggt tggtggaatt gaagatggtg agcaatcgac 840
ctcctttcac cgcacaacta gtttagttgt ttcttttcct atgaatagca attagttttc 900
ctgttgtttc tcctcctgct tcacgctcga actttctgta gtaaaaccag aattttcttt 960
tctttattgc ttcacaactt ctgcggtccc atcagtagtc atgttagtct gatttaaatc 1020
actttgctct gctggtcaat atgaaagttc agatcttttc atagattttt agattattac 1080
aggttgatgt tcaagtaatg cttaacttat gttctaagat ttcttttttt ttttttttta 1140
gtcagaatga aaacttttag ttttcctgca agttcacctt ccttttaagc tgcaagttcc 1200
gtggatattt ttttatgcat gaacacataa gacgtctcca aattttaatc aactcagtga 1260
gggggacaaa agagtttgcc attcatcttt gccaattttc aaacttttgc taaagttaag 1320
tggtttcatc caaggaggag tcatcttttt ctattagagg aattcacctg aaagttcctt 1380
cttgccatct tgcaaaacat ttggtggaaa taagttaaat cttacggaga gaggaagaaa 1440
aagacattat tttcttttgt aaaacataag aaaaaagagc ctgtgcccta aagttctttc 1500
cttgtaagga agaatgggtt gggggaataa agagaaatac atggaaagag aagtcacttc 1560
tccaagcaat attaatacca agtggaaatc aactctgttt tcacaaaagg ttttcatatc 1620
ttcggcgtga aggagggtgt ctttggaaac acttctggga aatgagttga tatttatgaa 1680
actacctata ttgtgtaatc aaagtcggaa agtcgaactc agaagtaaag cctttattca 1740
cttttgagac tcaactatgc ataccgaata ccaaaacaac aaattctaca aatttcttta 1800
tggatgtctt tttttccgta agtattaaaa ccatgagcag tcgatagggt gcatgattct 1860
taaagaattt agctttctgg attaccggag ttggtgcttt actaggttat catgtgtcgg 1920
tttctactga agaagttaca taaaggtcat aaatgtagct tggctggtca ataaggtatc 1980
tgcaattatt acgagatttt tttgtaggtt ttgcaaatat ctggcaaagg ttttttcata 2040
atattaccag ctgcagctat catatttggt ttgtcgatga tgcctcaatg ttgtgatgat 2100
tatcccatat tgcttttact atcttctttt gttgtttcag gatgcataac taagtttaag 2160
aaacatttta tttcacccta aaagatgtgg ttatgatatg catcgattaa cagacagtca 2220
ggctgatggt tgtcttctga agcatgtatt caattatatc attgtaatta gcgttccagt 2280
acacactggt ggtggattct ttgctcatcc attccccttc tggacatgct gtgtgttctt 2340
ctctttagcc atgttttata tgattgggct attttaattg ccgggatatc taatgaagca 2400
ataataactg agagaaagaa aaatatcttg gaaatgttac gtgtaagcat tcatttcgaa 2460
aaggcaggtg atcttggcgt actgcttatg tttgttgaat atgattattt agacttctct 2520
ctgttttatc gtcttactag acctaattgt atgttcttta taggattgat cttggaaaga 2580
ttttgtaata tcatactcat gtttactttt gataggctgt ggctgaattt atgggacaag 2640
tcatgcaagg gtcagtctcg tttgatccat cgcaaataat aatgacagct ggtgcaactc 2700
cagcaattga aattctcagt ttctgcctgg cagatgctgg aaatgcattt cttgttcctt 2760
caccgtatta cccagggtga cttgcttgtt ccaccaaaaa cttgtctcca tgtttcatac 2820
tgagacattt ttacaatttt agtattttga cgtacaggta cgacaggaat ataagatggc 2880
gagctggcat agagttgata cctgttccat gtcgaagcac tgacaacttt ggtttaagta 2940
ttcctgcact cgaaagagca tacaatcagg caaaaatgcg aggtgtcaaa gtgcgagctg 3000
ttcttttctc aaacccctcc aaccctgtgg gcaatcttct gcacagggaa acattacgag 3060
accttcttga ctttgttacg gagaagggca ttcatgtcat tgctgatgaa gtgttcgcag 3120
ggtcaaccca tggtactgag gattttgtga gcatggcgga agttttaaac acagatgagt 3180
ttgatagaag cagggttcac atagtatatg gcttgtcaaa agatctctcc gtcccaggct 3240
ttcggatcgg tctcatctac tcttttaacg aacatgtcat tgcggctgcc tcgaagctgg 3300
caaggttttc ctccgtttct gttccaaccc agcacttgct catctcgatg cttaatgaca 3360
ctaagttcat cacacaatat atcaagacga acagagagag actccgagta atgtatgcat 3420
tgttagtgaa tggccttaaa cagttaggtg ttgagagtgt caaaagcagt ggtggttttt 3480
actgttggac ggatatgagc aaatttatga aatcatacag tgagaaaggg gagcttgagc 3540
tatggaagga gatgcttaat gtagctaaga ttcatttgac acctggaacg gcatgccatt 3600
gcattgaacc tggatggttt cgtttatgct tcacaacatt gactgagaag gatgtgcctg 3660
tagttttgga acgcatcaag agagttgttg ataaccattg agtctactaa agcagaaagg 3720
tagaggtctt tggtacaaat atgttcataa ggctggaaag tcgatcacat cgagtctctt 3780
tcagtagtct cgtatcctct ccagggttgt catcaatttt ggtagtgtag gcttcgcttc 3840
atgcttctct tctccttgct gatgtaacta catcaaggtg caccactact cgtgcagaga 3900
cctccgcttg gtgaagagat ttcttttcac ttaccagttg ctaatatatg ctctcatctt 3960
gttaccattt gcaatgaacg gaaagcatgt aagcaccctc ttctttaggt aatcctgtga 4020
tggacaaatt ggtttagaat gtgagtataa tttccatatc tttcattact tgtctattaa 4080
gtcagtaatg tggaagtaaa gaagaggttt ttaatccgat gcttgtaatg gtagacaggt 4140
ttattagcc 4149
<210> 13
<211> 2294
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 13
tagctcgtgt tctcccttct ccccaggctt cccagtactc gcctaagatc gtaacgtcgg 60
caatggggct ccacgttgat gaacactcaa attacaatgt cctctccagc atcgcaacga 120
gcgatggcca cggggagaac tcctcatact tcgatggctg gaaggcctac gataatgatc 180
ctttccaccc catcgacaat cctcaggggg tcatccaaat gggacttgca gaaaaccagg 240
taaatgctgt ttcacaacta gttcggtaat tatggtagtt ttttcatggc ctatggccaa 300
aaatatgcct tccgtattct cctactactt ggaatgctaa cgggtgctgc gttttcctta 360
tctcagctct gcctggactt gatgcagcag tggatcaagc agaacccaca ggcttccatt 420
tgcaccggcg agggcgtttc cgagtttaag gacgtcgcga acttccaaga ctaccacggc 480
ctgccagact tccgaaaggt aataaccatc acagtgcagc tctttagtta gtccttatca 540
tgtcataaac tgtggaccct cgagaataga ttacatcact cagataaaag atgtgcgcat 600
tatgactcac gtacatgagt ccagaacttg tatctacttg taacgacgtc aagaggattc 660
tggaaatggt gcctgctggg ctagggacaa cctcactaga ttgctttgct gtttctgaaa 720
ggctaatgat gtgatttgtg gaaacacgca ggcgattgct aggttcatgg ggaaagcgag 780
aggaggagga gctacgttcg acccggagcg cattgtaatg agcggcggag ccaccggagc 840
tcaggaaacc atcgcatttt gtctagcgaa tcctggggag gccttcctga ttccaacgcc 900
atattatcca gggtacgtag acctatccta catcaagatt ttatgtttta tgtatatttc 960
acagtgacac taatctgttt taaagaaaac tgtttgagga tgagccgatc gaactacgga 1020
ggcaacatta atataatcca gcttactggt ataaccaaaa aattagtagt caatatttgc 1080
catcgcacga ctgtgacgtc gacaagacag tctcagtata ttatatttct taattaataa 1140
cgctacacca aaaccataac cgacctaccg gccgcttgag gtttctgcac tctccggcct 1200
cattatggat ctatcggttg atatatatat atatatatat gacagcgatt tcacatttcc 1260
tgcagcttcg atcgagactt tcggtggaga actggagttc aactcctccc tattcagtgc 1320
cacagcttcg acaacttcaa gatcaccgaa cccgcgctag ttactgccta tcaaagggca 1380
caaacagcta acatcagggt taaaggaatc ctggtaacca acccttcaaa ccctctgggt 1440
acaaccttgg acagagagac actgagaacc ttagtgagct tcgccaacga gaaacggatc 1500
cacttggtgt gcgacgagat attctcgggc accgtcttcg acaagcctac ctacgtcagc 1560
gtctccgaga tcgtggaaga ggaaccatac tacgacaggg acctaattca catcgtctac 1620
agtctgtcca aggatctcgg cgtccctgga ttccgcgtgg gtgtcattta ctcgtacaat 1680
gatgcagtgg tcagctgtgc tcggaagatg tccagctttg gactggtctc gactcaaacg 1740
cagcacctac tggcttccat gctgggagat gatgacttca caaccaaatt tttggcggag 1800
agcaggagga gattgtcgcg caggcacaaa tattttactg ctggcctcca cagagttgat 1860
atcaaatgtt tggagagcaa tgcggggcta ttctgctgga tgaacttgac gcatctgcta 1920
aacgaagcca cggtggaggc ggaactcaag ctgtggcgag tgataattaa ggaggtgaag 1980
ctcaacattt caccggggtc ttcgttccac tgctctgagc cggggtggtt cagggtgtgc 2040
ttcgccaaca tggacgataa caccatggaa accgcattga agaggatcag gaagtttgtg 2100
tcccccggga atcacactgc ggctgcgcaa gccaagaaga agaacaagag gtgggacgcg 2160
gcgctccgcc taagtttgcc tcgtcggttc gaggaactga gcatcatgac acctcgcctc 2220
atgtctcctc actcgcccct tgttcaggcc gccaactgat ggtgatggat gagcgtgggc 2280
gatattaacc gacg 2294
<210> 14
<211> 1746
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 14
cttgtctcct gttgcttgaa acttccatgg ctaagaaagg tgtgccactg tctgagatgg 60
caacttccga cacccatgga gaagactctc cttactttgt tggctggaag gtatacgatg 120
aaaaccctta tgatgccgca agcaacccct caggagtcat tcagatggga ttggcagaga 180
accaagtaag tcctgcatcc taatatcatg acaagtatct tcatttctct ggtctaacaa 240
ttgtctttta gccttcctca ggtttcattt gatctactag aagattattt ggagcagcat 300
ccacaagaat ttggctgggg atgtggagtg tcgagcttca gagagaatgc tttgtttcaa 360
gattaccatg ggctcaaaac ttttacaagg gtaatagctc ctgattagta gcagctacat 420
cctgttcgta tatataactc atctaatctt ctgcctgcag gcagtggcac tttttatgga 480
gcaaataaga ggaggaagga cacaatttga tcctcaacac atcgttctca ctgcgggagc 540
taccgcggct aatgagctgt tgaccttcat cttagcagac cccggagatg gtctactgat 600
tcctacacct tattatccgg ggtaagagct acggcaaatc tgtagattta gagtgtcact 660
tcaccgttct aattggatta acatgacaaa gccgcttctt gtgctgtagg tttgatagag 720
atctaaggtg gagaacaggt gtcaacatca ttccagtcca ctgcaacagc tcaaatggat 780
tccagattac tctccgggcc ttggaagatg cgtgtgccgg agcagaatcc atgaaggtta 840
gagtcaaagg actcctcctc acaaacccat ccaacccgtt ggggactaca atcaccagac 900
ctgttcttga agagatactg gacttcgtgg cgcacaagga catccacctg atatcagacg 960
agatctactc aggctcagtg ttctcctccg acgagttcgt aagcatgacg gagatcgtcg 1020
aatctcgcgg ccatcaggaa cgcgagagag ttcatatcgt gtacagcctc tccaaggatc 1080
ttgggctacc tggatacaga gtgggcacga tctactcgta caacaacgag gtggtgacga 1140
ctgcgaggag gatgtccagc ttcacactcg tgtcatccca gacgcagaag atgttggcgt 1200
cactgctgtc ggacaaggag ttcacggaga actacctcag gacaaatcga gagaggctta 1260
agaagaggta cgagttcgtg gtggaagggc taagcaatgc tgggatcagg tgcttgcaag 1320
ggaacgctgg tctgttctgc tggatgaatc tgggagagtt actcgaagag cccacagtag 1380
aaggagagct gagtctttgg aacttgatgt tgcatgaagc aaagcttaat atatccccag 1440
gctcgtcatg ccactgttta gaagcaggct ggtttagggt gtgcttcgca aatatgagcc 1500
agcagacgct ggaagttgca ctgatgagga tgaaggattt cacggagaag atgaaggcta 1560
agcaaatgat ttcttcgttg taaattccct catgattaga gtcatgcatt tgtgtcggat 1620
gattatatag caaattcata tacacatgtt caccgtgaga ctgcctcctc tgttctctct 1680
cgcctttttc cttgttgctg ttctttctaa aaccacagaa atggagttca gattcacaga 1740
actgca 1746
<210> 15
<211> 5331
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 15
atggaagtgg cacaggaatg gcccgagccc attgtccggg tgcagagctt ggctgatgcc 60
gaagccatcc ccgagaggta catcaagcca ccgtccgagc gtcccaatct gaatcccggc 120
acggccatgg cggcaggtga gacagaatgc cttcccgtcg tagacctcgg cgggcttaga 180
ggtggcgcgg cggagaggca agcgacgatg cgcgctgtgt cggatgcgtg cagggagtgg 240
ggtttcttcc aggcggtgaa ccacggggtg agcccagcgc tgacggcggc ggtcatggag 300
gcgtggaggc agttcttcca tcttcccatg gcggagaagc aggcgtatgc caattccccc 360
acctcgttcg agggctacgg cagccgcctc ggggtcaaga agggcgccat tcttgactgg 420
ggcgactact tcttccttca gctgttaccg cagtccatca agaactacga caaatggcca 480
acacttcctg cttccttgag gtacccacac acacactctt tctctttcct catccccgag 540
aggtcacgga gcgatgccat cggagcaggg agacgactga ggcctacggc gacgaactgg 600
tgaagctgtg cggggtgata aaggaggtgc tgtcgttaac cctaggaatg gacgaagggt 660
tccttcacag aggattcggg gagcctggcg cttgcctgag ggtgaacttc tatcccaagt 720
gcccgcagcc ggagctcacc ctcggcctct ctccccactc cgaccccggt gggatgaccg 780
tgctgctcac cgacgagcac gtcaaggggc tgcaggtgcg caagggcgac gactggatca 840
cggtgcagcc gatccctgat gctctcatcg tcaacatcgg cgaccaaatc caggttcgct 900
tacttcctcc tcctctccct gcatgaggtc acgtaagcga gatagctctg ctctctgcat 960
gggatacgcg actaaattac gtacatatcc ctttacgatt agcttatctt ctgattatta 1020
tgcccccttt aggtatattt tttgcatatt tttttatgaa tataatatat atgaaatttt 1080
agaaaggaca aatatgtcat ttcagataat tttttttgct tcgcgtgcat gcctacgttg 1140
caaatgttac taagccgtag gagaaagata gtgtcaatat cgatcattaa ggatatctta 1200
tgatgaacat aatattgtaa ttttcttatg atctactaat gatttagcat ttagaaatta 1260
tgaaatattt atattttgga ttagctgcca ataacgagta agattaaatg cctctaagta 1320
gatattataa tgattaaagc gtcatatgca accaaaagaa ttaggatgat gagttgataa 1380
tattagattc ttttatttga acgtcgacta tttcttctat aaaaaagaga aaaagaaaat 1440
gtgacctact acttgaagtg gctaatcaat caactttctc taatttgcac aatccatcta 1500
agatcaataa acttcgaatt ctataagagc atcccgaaag caaatgatcc atcaattaat 1560
gtcgtgatac aatgtttaag ttgttgatca ttatcaatct gttcgaaagc ttaggcatgt 1620
agatgataca aaacatttta ttatgtatat aaagaatgaa gtttgaggat gaaatgacga 1680
atggttttac ctttttttct catgtgattt gcataggtaa agttgttctt tcttaaggaa 1740
aaaagtatgt atgcatttcc acggtctcat tgctacaaaa aactaggtca actttaagag 1800
atagatagca tcatctttcc actaattcaa cagttcctcc tttggtctta tggtgactca 1860
aaagtaccaa caaaaagggg aagaaatgtg cctaatgcac cgaaaagttg gtcacgataa 1920
gatcggcgta gattacaatc aatataataa acgaacagtc taatcatatt aaaacatatg 1980
cttcgcgtgg ttgtaagaat aattgagtaa gcttccaaga tcatagtaga tatatattat 2040
cacttcaata tttcggatta tagttcaagt ttaacaaatt aatgagtcat ttatttcatc 2100
ggatcccatg tcaaaataat ctcgaatttc tacgtatgtc catggattga aaagaaggtt 2160
tccacatatc tatctctttt aaatagtata tttacatata ttctttaaaa tataaatatt 2220
attggcatac atcccttcat atattagtgt tgtgggaaat aactttgagc cgtggccaca 2280
gggccgacac ggctcggttc gagttcggac gacggggatc tccctggggc attcctcgag 2340
cccgctgagg cgatcgggtc cggtgtccga tcgggacggt gtaaccgtct cctccaggca 2400
ggaactcctc gcctgcgcgt ccggagggga ccttcggctt cgcacctgca caaaggtctg 2460
gccgaggcgc tcggcccgac tcctccgacg atcaagttag caaatgtgga gggggtttca 2520
gatgaagaag tgtttttgtg tgtctgtccc gccccccccc cccctccttt ctaatgaacg 2580
agagagtatt tataaggaag cataccgctt cttgagctgc ccgcttgcag ggggcaggct 2640
ggtagcgtct gactttgtgt tatcgtggcg tgaagaattg agccttggca agatgttaat 2700
gtgcctcgat cggcgttccg atctacattg gccaggtgct gttgcgtgag gcatcatctg 2760
acgtcagccg agtcttatca taattactat cctcatcata ttcccccccg aaggaagtca 2820
tgccataaaa agggggggtc cgaggcatgg cttcggcttt gagaaactgt cccagcaggg 2880
cgccttgccg gaggtgtggg aatcgtggag tttagcaact aagaagggtc ggatgtgcag 2940
tggtgaccca ggtagcgtgc ggccgacgag cacacttagt agggcaagcc gacgcatggt 3000
gtgacctcgg ggagcatgga gccgaggagg acgacgtagg cgggctggtc gcgcaggtgt 3060
ggtctcaggg agcatggggc cgaggagccg atgagcacga cgcaggcggg ctggccgcgc 3120
aggtgtgtct caggagcatg gggccgagga gctgagaagc acgacgcaag cgggttggtc 3180
gcgtgggtgt gtctcgggaa gcatggggtc gaggagccga ggagcacgac gcaggcgggc 3240
tggccacgca ggtgtggtct cgggagcatg gggccgagga gccaaggagc acgacacaag 3300
cgggttggcc gcgcaggtgt gtctcgggag catggggccg aggggccgag gagctgagaa 3360
gcacgacgca ggcgggttgg ccgcgcgggt gtgtctcggg aagcatgggg ccaaggagcc 3420
aaggagccga ggagcacgac gcaggcgggc tagccacgca ggtgtggtct cgggcaacat 3480
gcaaccgagg agcacgacgc aggcgagcag gccgtcctga ggcagaactc gggctgtcta 3540
cgaccgagga acatggctca agcgggcagt cacccgacat tccgggccct ccttctagcg 3600
ccaatctatt gtgggaaaca actttgggtc gtggcctcag ggtcgacgca gctcggttcg 3660
ggtccggacg acggggatct ccttggggcg ttcatcgagc ccgctgaggc ggtcgggtgc 3720
ggtgtccgat cgagacggtg tagccgtctc ctccgggcag gaactcctcg cctgcgcatc 3780
tggaggggac cttcggcttc gctcctgcac aaaggtcggg ccgagcgccc cgacccctcc 3840
gacaatcaag ttagcagata tggagggggt ttcaaatgaa gaagtgtttt tgtgtgtctg 3900
tccccccccc cgcccccgcc ccccttctta tgaacgagag ggtatttata gggatgcata 3960
ctgcttcctg agctgcccgc ttgcaagggg caggctggta gcgtttgact ttgtgttggc 4020
atagcgtgaa gaattgagct ttggcaggat gttaatatgc ctcggtcggc gttccggtct 4080
gcattggcca ggtgctgttg cgtgaggcgt catctgacgt cagccgagtc ttatcataat 4140
tactatcctc atcaattagt atcataattc gcccgataat aatacttctt gttagcattc 4200
atcataaata aaaataaaaa aaattaagtt tttttataga aaaattatga tgaaaagtca 4260
agttgggtat acaatttgga ttatatagtt gcaaaaaaat caataatagt taatatgagt 4320
tagtttgagt ttaataaatt agatgaaatt ttgagatatc ttaatattct tattatctct 4380
aatactcttg attagcccca tatttttatt atttaaaaaa aattatttta actaatgatt 4440
taggttgaat gaagttgata gattaattag tttatttggg tcataatatt tggtatcatt 4500
accgacctaa tatttggata tggtgaaagg attcgagtaa aaaaagatta tcaataaatg 4560
gagttaggga gattatcgct tgattaatct catatcttaa gtaaataaga ttaggattaa 4620
tttataaaag gtttgattgg tcataatatt atcataacta aattttaaat aatataaata 4680
ccataaggaa tttcaattga tactcaaaga aaactaatag atttaatata tatatatata 4740
tatgtacata atataatatt ttgtaataat atatgctaca cttaaattta gagaaataag 4800
tataaatatg acttgtttat ttatttatta taaataataa ttaagtcatt actatattct 4860
tcaattggag tgaggatgaa tatcaaacca tatgatttag tatattttat tttattcaaa 4920
aatatttata tgaattgtac tttatttagt attttatatc gatttaatat attataaaaa 4980
ttattattag aatgatattt aaaatgtcaa gataatgata cacgggtacc acagcagagc 5040
gtatcacgaa tcacgaatca cgaatctcga agctcgatga tgcaggtgtt gacgaatgcc 5100
acctacaaga gcgtcgagca ccgagtgacg gtgaacgcga caacggagcg gctctccctt 5160
gccttcttct acaaccccga cgacgacctg cccatcgagc ccgccgccga gctggtgacg 5220
cctacctcgc cgccggtgta caagccgatg acgttcaagg agtacaagat gtacatgagg 5280
atgttgggcc cctgtggcaa gtcgcacgta gatctccaca aggctgcatg a 5331
<210> 16
<211> 2024
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 16
cgcacatata tgctcatgaa atagcgatgc agagctctct acaagcaaat agacacgctt 60
gctttgtggt cgagcagtga cccaagaatc aaaggattaa tccagcaagt ataatctcct 120
tccatgcacc ttgatgacac gtttgtgctc gagttggagg agttgatcga atatatttga 180
gccgagaact tcgtccatgg attgcctgcg agactggcca gagccggttg tccgggtgca 240
gtcgttgtcc gacagcggcg ccaccaccat ccctgaccgc tacgtaaagc cgcagtcgga 300
gcgcgcctcg gtcgatcccg gagacatggt cgggataccg gtcgtcgacc tcgccatgct 360
aacggacgac gtcgccaact gcgaggccac cgtgacggcc atagcggacg cctgccgcca 420
gtggggcttc ttccaagcgg tcaaccacgg agtgagcccg ggcctgatga ggggcgccag 480
agaggtctgg aggggtttct ttcatctgcc catggacgag aagcagcgct acgcgaactc 540
gcccaagact tacgagggct acgggagccg cctcgggatc gagaggggcg ccattttgga 600
ctggggcgac tacttcttcc tccacttcct ccccttgtgc ctgatggatc acgacaagtg 660
gcccgctctt ccgcccgcct tgaggtacca catcactgct ctgccatcaa gctccgatct 720
cctacggctg gcttgtcttc gctgccgtcg gctggaatcc aagcttaacg tgcatgcatg 780
tgcgcacagg gagacgagtg acgagtacgg cgcggcgttg acgaagctgt gccggaggct 840
actgagagcg ctgtcaattg gcctgggact ggacgccgcc tgcttgccgg tggcattcga 900
cgacgaaggg gtctgcatga gggtcaactt ctaccccagg tgcccgcagc cggagctcac 960
actcgggctc tcggcgcact ccgaccccgg cggcatgacc gtcctcctcg tcgacgatca 1020
cgtcaccggc cttcaggtcc ggaagaacga ttcctggatc acggtgcagc cagtccccga 1080
tgccttcatt gtgaacgtcg gcgatcagat tcaggtgacc gcttcctagt gctcttcctc 1140
cacttcgtcc gtatgcaata aatactgaac gcatcggaaa ggcgtggaaa taatgttttc 1200
tttcctcctt gttctactgc taattttgtc atcaccggta tcgtcgagct tcctcacatc 1260
ggagctcaac atgttcttat cctcgttcat taaggcctcg tttcttgtct tatgcgtgac 1320
caagcagaca ccacctaata ggatctcatg ttttatagtg catttccatt tcatcagttg 1380
ccgtcatggt tggaaaacca tcgagtgctt cctgctcagg ataagctcgg tgatggatgg 1440
ataggcatct ctgcatgcgg ctcagaatgg tttgagctgc cgcagttact ttcctaagac 1500
taatggtttt tatataagaa ggtgggggtg atcctttcaa aggcacgtgt tctcgtctgc 1560
ccccgctgat cttcttctag tccataaaca ataagatttt ggtgtctgtt cttcttccac 1620
ttccacccct gtgagtgaca tatctatgca tgcagctgac atctatttgt ttgtccagct 1680
taataataat gatacttttg acgggtagaa agatgcatgc gcgctgggtt tcattggtgg 1740
tgatgaatgg gttgggttgc aggtgctgag caacgcggca tacaagagcg tggagcaccg 1800
ggtgatggtg aatgcggcgg cggagcggct ctccatggcc ttcttctaca acccgaagag 1860
cgacgtgccg atagggccga tacgggagct cgtcacctgc gatcgccccg cgttgtaccg 1920
acccatgacc ttcgacgagt accgcctctt catccggaag aagggccccc gtggcaagtc 1980
gcaggtcgat tccctcgtgg cagcatgacg acccctctcc ctct 2024
<210> 17
<211> 1711
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 17
ggacggctgt gggagagccg atgggctcta tatatggcca tgctctgccg aggcagaagc 60
acaacacgag ctaattgcag cagggtagca gttggtatac actcttgtga cctctatggc 120
tccggtgttg tgctctagca cgagttctga gatgaggatc ggagaggtcg aagacatcca 180
ggagctgcgg cgagctcggc cgacggccgt ccccgagagg tacgtgcggg acacgaacga 240
gcggccggct ctgtcgacga tcctcccctc ctctctgagt gtccctgtca tcgacttatc 300
gaagctggtc tgcggcacca aaagacagag ccaggaagag atggcaaagc tcaccgctgc 360
ctgcgaggag tggggcttct tccaggtagc ttaatggctc atccaccaac ttcttcagca 420
cttattataa tggttgggac gctgatcgat gcagcatcaa ccatgcgatg gcaggtgatc 480
aaccatggga tagagaaaga gttgctggag accatggaga gggtggcgaa ggagttcttc 540
atgctacctt tggaggagaa ggagaagtat ccaatggcgc caggcacgat tcaggggtac 600
ggccatgcct tcgtcttctc ggaggatcag aagctggact ggtgcaacat gcttgcactt 660
ggtgtggagc ctgccttcat tagaaagcct catctctggc ctacaaaccc agctaattta 720
aggtacttcc atcttgccgt caccgcaaca gagaagaaca agtcttcccc tcgcatttcc 780
atcagcttct aacatgtata tgcgatcaca gctacacatt ggagaagtac tcgaaaagca 840
tacgaaggct ctgccagatt ttgctcatgt tcatatcgag gagccttgga ttgagcccaa 900
actacttcga cgagatgttc ggcgtggccg tgcaggccgt aaggatgaac tactaccctc 960
catgctcgag gccagacctc gttctggggc tcagccctca ctccgatggc agcgccctga 1020
ccgtgctgca gcaagacacg gcatccgtcg gcctgcaaat tctcaaagac aacgcctggg 1080
tgcccgtcca ccccatcgcc gaagctctcg tcatcaacat cggtgacacg atcgaggtcg 1140
gcgccatcag ccaccctagt tttcttctcc atcttaatct gccaccaatc ctttgctgat 1200
cgacgccaca tgcacgcagg tcctgacgaa tggcaggtac aggagcgtgg agcacagagc 1260
cgtcaccaac aaagagaccg acaggctctc ggtggtcacc ttctatgctc cgagctacga 1320
cgtcgagttg ggccctgttc ctgagctcgt caatgaccag cagccatgca ggtacaggcg 1380
attcaatcat ggcgagtaca gtcgccacta cgtcaccaac aagctgcagg gcaagaagac 1440
cctggaattt gccaagatac agacaagcta ctgagcaaga aagccaaact ctagacttct 1500
ccaagtacat tcccctacta tgtcgacatg tataagcaga atgattagcc aagcatgttg 1560
tgttaaagat atttacacga agtgtgtaat gggatgtgtg atcatattaa ggtgaatata 1620
aagccaccca tcttgacttt tgaacgcact ttcctgtagc ttgtcattcg tggtcttgaa 1680
aagaaagatg ctggcaatta tgggtttgac a 1711
<210> 18
<211> 1501
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 18
ttacaagagc agcgtagggt tactgtctct atggcgacaa ccaccacaag gctcctcctc 60
ggcgacctgg tgtctcacgc taagaacgtc ccgcttagat acgtccggcc accctccgcc 120
cgcccccacc tctccgccgt cgagaagtcg aatgccacga tcccggtcgt agacctgcag 180
gagctctccg ggtccggtcg tgccatggtg gtcaaggcca ttgggtcagc ttgccaaagc 240
gatgggttct tccaggtacc ttcactcgat tcgctgcgtg ctcttcccac cctctccgtt 300
tagtgtaagg ggttgatttg gatggcaggt caagaaccac ggcattcccg acgacgtgat 360
cggtgccatg ttgcgtgtct cgaaggagtt cttccggttg ccggagtcgg agaggctgaa 420
gagctactcc gacgaccctt cgaggacgac gaggctgtcg acgagcttca acgtgaggac 480
cgaggaggtt tgcaactgga gggactttct gaggttccat tgctatcctc tcaaggacta 540
cgtgcatgaa tggccctcca atccttccgt tttccggtag cctccttgcc cagcacgtca 600
agaacaagta ctgcgtgcag cttcttacca tgtgccaaat atatctgcag ggaggtggtg 660
ggtgactact gcaagcacgc caggcaactg gctttgaggt tgctggaggc catctcggag 720
agcttgggac ttgagaagga ctacatggag aaggcactgg cgaagcaggc acaacacatg 780
gccataaact actatccacc atgcccacag ccggagctca cgtacgggct gccgagccac 840
aaagacccca atgccatcac cctactcctc caggacggcg tctccggctt gcaagtcttc 900
aggaacggca agtgggtggc cgtcgacccc atccccaacg ccttggtcat caacatcggc 960
gatcagattc aggtaaacca ttcaacaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagatgc 1020
tatactcata tgttcttcct cattccaatc atatctttct ttccttcgtt caaaacaggt 1080
gctcagcaat gatcgataca aaagcgtgct ccatcgcgca gtcgtcaacg actccagcga 1140
gaggatttct attcccacct tctattgccc atctcccgat gcagtaattg gaccagctca 1200
agcactggtt gacgagcagc atcctgcagt ctaccgaagc ttcacatatg gggagtacta 1260
tgacgcgttc tggaaccgag gcctccaacg cgagagctgc ctcgacatgt tcagagccac 1320
caacgatcca atctaagcca ccctcccaac acaagaaaat tccatcagat tccaaatcgt 1380
gatgacatga tatatacatg tattgtttaa tgcgtgtaat tgcttgcctt tactgtatta 1440
atgttaaacc acaaacacat aagtcttcca ttgtgtttga tggctaagac gagcgccaag 1500
t 1501
<210> 19
<211> 1730
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 19
agcacataca tctcttctga agcaaactgc ccaactggag gtgctcatgg attgcctgca 60
ggagtggccg gagccgatcg tccccgtgca gtccttatcg gaggcgccga cccttcccga 120
ccgctacgta aagccgccgt cccagcggcc ctcggtcggc gacgccgcac gcagcctcga 180
cattccggtc gtcgacctcg ccatgctgcc cggtggcggc gtcgtcgagg cggtgtcgga 240
ggcgtgcagg cactgggggt tcttccaggt ggtgaaccac ggcgtgagca tggagctggt 300
gaggaggttc cgggaggcgt ggaggggatt cttccatctg cccatggagg aaaagaagag 360
atacgcgaac tcgccgagga cctacgaggg ctacggcagc cggctcgggg tcgacgaggg 420
cgccaatctg gactggggag actactactt ccttcacttc ctgccttgct atctcaaaga 480
ccatgacaag tggcctgcag tcccagcatg cttgaggtac cgcaaaaccc tggcttccgc 540
tccttcccat tagttgattc tgactcccgc ccacgtgaga ccagagaagc gacggacgag 600
tacggcgtgg aggtgaggaa gctgtgcagg agagtgatga gggcgctgtc gctcggcctg 660
ggcctggacg ccgaccgctt gcagaaggcc ttgggcggcg acgacgacgg cgtctgcatc 720
agggtcaact tctaccccag gtgcccgcgg ccggacctcg cgctggggct gtccccgcac 780
tccgaccccg gcggcatgac ggtgctgcta gcggacgacc acgtccacgg gctccaggtc 840
tgcaaggacg gtgtgtggat caccgtccac cccctcccca acgccttcat catcaacgtg 900
ggcgatcaga ttcaggtaac ttcgtcatcg agctctctcc tgtcctcatc ttgctgtctg 960
ttgcgccaac catggcacaa acctgttttg ggcttcctgc gctattacta gaggatccat 1020
ctgaagacaa tcatgcacct acaaagtcca aaacataaac cactatcatc tgctgcattg 1080
tgttcctcga gggaaacact tcgtacaaca agggtcgatg catttcggtt catcaggtcc 1140
atgttgagct ggccaatgac acccaatcag accttatgga ccactgcaca cagtgcaagt 1200
ccaatcaccg agatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 1260
atatatatat atatgtatgt atatatgtat atatatatgt atgtatatat gtatatatat 1320
atatgtatat atgtatatat gtatacatat atttatatat gtaccttatt caatcaaaca 1380
atagaaatgc aacattaaca catgtatgtg tgaacgcgtc cttaggtgct gagcaacgca 1440
gagtacaaga gcgtcgagca ccgggcgatc gtccacgcca aggaggagcg cctctccgtg 1500
gccttcttct acaacccaag gagcgacatc cccatcggac cggtgccgga gctcctcacg 1560
gtgaccggcc gcgccgccct gtaccggccc atgaccttcg acgactaccg cctgttcatc 1620
cggcgcaagg gccctcgcgg caagtcccag gtcgagtcac tcgaggccat ggccatccca 1680
gggacttgac cggcccccgc cccccccgtc gtcgtcctgc ttcgcgacac 1730
<210> 20
<211> 1384
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 20
ggctatatat aagtagcaac gtggagtgac gagtgggaat agacaaagga aatggcgtgc 60
tccttcccgg tcctcgactt ggagaagctc cgtggagagg agagagagca gtccatggac 120
ctccttcgtg acgcttgcga gaaatggggc ttctttgagg tgctctcatt cttttacgtg 180
aacaagttga tgcccacgag catttgaagc taattatcat ggctttccat ttgcttgctg 240
atgtagctgc tcaaccatgg gatctcgcat gagctgatgg acgaggtgga gaggcggacc 300
aaagcgcact acgagcaatg caggaagcaa aagttcaaac agttggcgtg caaggctctc 360
aagagcggac ccgggacgga tgtcaccgac atggactggg agagcacctt cttcctgcgc 420
catctccccg tctccaacat gtccgacttc ccagacatgg acgaggagta ccggtaccgc 480
ttcgatttcc ttcgttacag cgcacccccc accaccatcg actgtagtct gccccgacta 540
accttcgcct tcaggaaggc gatgacggaa ttcgcgacgg ggttagagaa gctggcggag 600
cgtcttctcg atctgctctg cgagaacctc ggcctggagg agggttacct caagaacgcc 660
ttctacggat ccaaaggtcc gaactttggc accaaggtga gcaactaccc gccatgccct 720
cgcccggagc tgatccacgg cctgcgagcc cacaccgacg ccggcggcat catcttgctc 780
ttccaagacg accgcgtcag cggcctccag cttctcaagg atggccagtg gatcgacgtg 840
ccgcccatgc accactccat cgtggtcaac ctcggagatc agatagaggt cctctctctc 900
tctctctctc tctctctttc tctctctgcg ggacaaaaga tcaaacaaca tgagggcgtt 960
catgcaggtg atcacgaacg gcaagtacaa gagcgtgctg caccgggtgg tggctcggag 1020
cgacggcaac aggatgtcga tcgcctcctt ctacaacccg agcggcgacg ccgtcatcta 1080
ccccgcgccc tccctggtcc agaaggaagc ggaggcgtac ccgaggtttg tgttcgagga 1140
ctatatgaag ctctacgtca cgcaaaagtt tcaagcgaag cagcccaggt ttgaagcaat 1200
gaaggccacg gtaacagtca atggccaacc tacgcctaca ccttaggaca ccacgacgtc 1260
tcacgtggag atgccaccat ctattagaat gtggcatcca attgtggaaa taataagcga 1320
agcactatga acgtggcttt ttttagtctc gagggttatg tcgtcgatcc aattttccac 1380
ttct 1384
<210> 21
<211> 2070
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 21
gcatccattg cagaggaaag ttactgagtc ttctgtagat cgaggcagga tgattccggt 60
cattgatttc tccaagttgg atggcgagca gagggctgaa gctttggccc agatcgctaa 120
tggctgtgaa gagtggggat tctttcaggt aggctagcgg ttgcagtcta agaaccgtaa 180
ccctgatttc ttttatggat gtgttatcgt caatccttcg tgtctgcagc tggcgaacca 240
tgggattgca gaggagctcc tcgagcgtgt gaagaaggtc tgttccgagt gctacagact 300
gcgagagaaa agcttcaggg agtccaaccc cgtccggtcg ttcaacgagc ttgtggatgg 360
agaaaccgag ggaggggttg gtaagcggct gagtgatgtg gattgggagg atgtgttcgt 420
cctccaagat ggcatgccat ggccgtcgaa cccaccggag ttcaagtaag tagtcgagga 480
atcgaacaga gcaacactgc ttcttctctg cgcactgata tatcttggct aacttgcagg 540
gagacgatga aggagttcag ggacgagctg aagaagctag cggagaaggt aatggaagtg 600
atggacgaga acctgggcct ggagaatggt tgcataagga aagcgttctc tgcaaacggc 660
aagcaccagc ccttcttcgg gacgaaggtg agccactacc ctccatgccc acgccctgac 720
ctcgtcgacg gtctccgggc ccacaccgac gccggcggcg tcatcctcct cttccaggac 780
gacgaagtcg gcggcctcca gatcctcaaa gacggccagt ggatcgacgt ccagcccgtg 840
aagaactcca tcgtgatcaa caccggggac cagatcgagg tgctgagcaa cggccggtac 900
aagagcgtgt ggcaccgcgt gctcgccacc cccgacggca accgccgctc catcgcctcc 960
ttctacaacc cctccctcaa ggctaccatt gctccggcga cgaagctcct ctcagccgag 1020
tccgacaggg ttcctgcgtc ctaccccaag ttcgtcttcg gcgactacat ggacgtgtac 1080
gtgaagcaga agttcctccc caagcagcca aggtttgagg cagtggcggc agccatgtga 1140
aactgcagtg cgaccatata agctcagcat cgtatctgca cgtacttgta gggctgttat 1200
gagcaatcca aggaggatgg aagctgctaa gtagtatggt gtgtagatgt gtgtttgctt 1260
gcaagagatg cttgcttgaa cgcagtggta gatcgcgttc tttgttgtcg agtctgtgag 1320
tcgctctgta catcgagcaa cttcgactct gtttcttctc ctgttgatga tggtgctctt 1380
ttgagtcgtt gatttcgagc ttagaacccg tgaattcaag tcgatctcca gctttaagtt 1440
cttaatctac tgccaaaatc aatgcaggtt ggatttggaa tcctggaaac cttatgcatg 1500
gttcgtcttc gaagccggtc aacccttagt ctcgctggca atatccacct ttttaatgca 1560
attaatgttc ttcttacaag tcaaacagcg ctaatgtgag aaaggttgac cggcaagatt 1620
tggttcgttc ctctttgctt cctctgattg gtacgtgaga gtcaattctc ttcatctaca 1680
agttgagagc agagggcttc aagcgatcca aacctgtgca gatgctgaac aaactggcgg 1740
aggaagaaga agaagaaggc gatgctaagc gcttggatga cgtggactgg gaggatgtct 1800
tcgtcctcca ggatagcaac cattggccgt ctaatcctcc agtgttcgag tgacctacca 1860
attagctgct aattaaagtc gtgtcctctc tgtttctgcc aatggatcga cgacgatttg 1920
ctccctacaa taacttgcag ggagaccatg agggagagaa gggaagagct gcggaagccg 1980
gccgagaagg tgatggaagc aatggccgag aacctgggct tcgacaagag caataaaccc 2040
atcttgttca ttagtggact ttttagggtc 2070
<210> 22
<211> 1485
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 22
atggatgacc tccgacagtg gcctgagccg gtcgtccccg tccagtcctt gtcggacggc 60
ggcctgacct ctatccccga gaagtacgtg aaaccgccat ccgatcggcc ctctctcgag 120
gccaatcttg accgggggct caccatgccg gtcgtcgatc tgcgtggcat ctacgacggg 180
tcggtggata gccgagccgc catggtggcg atctgggacg catgcaagga gtggggcttc 240
ttccaggtga tcaaccacgg cgtgaggccg gatctggtgg aagagatgaa gggtgtgtgg 300
agggagttct tccgccgtcc cttggatgag aagcagaggt atgccaactc cccggcgacc 360
tacgaggggt acggcagccg cgtcggcgtc gagaagggcg ctgttttaga ttggggagat 420
tactatttcc ttcatctcct tcccctgtcc atcaagagcc atgaccgaca ctggccggct 480
cgtccgagca ccctgaggtg tgtagctacc accgcattag cttgagattt agcttcttgt 540
ctgatgattg cgtgggagca ggaaggtcac cgaggagtac ggcggcgagg tgttcaagct 600
ttgcggggtg ctgctgaggg tgctgtcgat gggcttaggt ttggacgagg agtacttccg 660
gagggcgttc ggcggcgacg gcaccgcctc atgcgtgaga gtgaacctat atcccaaatg 720
cccgcagccg gagctcaccc tcggcctctc cccgcactcc gatcccggag gcctgacggt 780
gctcctcgcc gacgaccacg tcgaggggct ccaagttcgc aaggacggcg cgtggctcac 840
cgtccggcct gtccccggcg ccttcatcgt caacgtcgcc gaccagatcg aggtcatctg 900
cttccaatcc cccactacga tttgcatgca tgacgtacgt gagcacgaag caagaaagca 960
cgaaaacttt gggcacgaaa gttggaactg atagctccga tgcttcattg gttccttcga 1020
aatgtggccg acacactgtt tgcaatactc aacgaagttg acttgcatca actcctctct 1080
ttcctaacat tacaccatac ttgaatcata tcatacatcc ccctcgccat gccatctgaa 1140
gacgatgatc gacttcagtc atactccagg atttgagatc atcgtgttcg ttttgctcaa 1200
caggtgataa gcaatgggat ctacaagagt gtggaccatc gggtgatagc taactcaaaa 1260
gacgagcgac tctccattgc tttcttctac aatccagagg gagatgtggc catcggacct 1320
gcgccagagc ttctcacgcc gcagctgcct ccactgtatc catgcatcac cttcaacgag 1380
tacaggatgt atgtgaggaa gagaggcctg agtggcaaat cccaaatgaa gtccctcaag 1440
ctttactgat gtgaagatat cgtaataatg ttatcgaata ttaag 1485
<210> 23
<211> 1374
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 23
tccattgcag aagggtgttt cccagtcttc tgtagctttg aggcatcatg attccagtca 60
ttgatttctc gaaggtggat ggcgaggaga gggctgaaac cctggcccag attgctaatg 120
gatgtgaaga gtggggcttc tttcaggttc gttagcttgc agttggtgag tgtaatggtt 180
tcttctcttg gacgtcttct aaccagtgtt ttgcatctgc agctggcgaa ccatggcatt 240
ccagtggagc ttcttgaacg tgtgaagaag gtctgttctg cgtgctacaa gttgcgacag 300
gagagcttca aggaatcaaa ccccgtgcag ttgctgaaca agttggtcga ggaagaaagt 360
gagggaagga atgtggagcg gctgaacgac gtcgattggg aggatgtgtt cgtcctccaa 420
gatgataagc cctggccatc taatccccct gagttcaagt aagaacacaa ggacgaggaa 480
tcaaaggaga gaagttcaat ggatcgagtc actgatgctt cttggctaac ttttcaggga 540
gacgatgagg gagtacagga aagagctgag gaagttagcc gagagagtaa tggaagccat 600
ggacgagaac ctgggactgg agaggggcta cataagcaga gcattctccg caaacggcga 660
gcacgagccc ttcttcggga ccaaagtgag tcactaccct ccctgcccgc ggctcgacct 720
cgtcgacggc ctccgcgccc acaccgacgc cggcggagtc atcctcctct tccaggacga 780
cgaggtcggc ggcctccaga tcctgaagga cgacaagtgg gtcgacgtgc agccggtgaa 840
gcactccatc gtgatcaaca ccggggatca gatcgaggtg ctcagcaacg ggcggtacaa 900
gagcgtgtgg caccgcgtgc tcgtctcctc ccacggcaac cgccgctcca tcgcctcctt 960
ctacaaccct tccctcaagg ccaccattgc tcccgccacc aagcttgtcg caagccagcc 1020
ccgggaggtt ggtgcttcgt atcccgagtt cgtgttcggg gactacatgg acgtgtatat 1080
gaagcagaag ttcctcccca aggagccaag gtttcaggcg gtggcagcag ctctgtgaaa 1140
atgcaggaag gagatgatac actccagggt agtttaatgt gtgaccatct aagtttatca 1200
gtgtcgtata tttataggtc ggtatcagcg acagatgctt gcttgcttgg acatgtgcag 1260
cacatctgta tgatacaagt actgcgtact gagtctgttg tcgagtctgt gtgctttgct 1320
tcgtacagta cctggagcct atattccaag ttgtgtcagg tattataagc tctt 1374
<210> 24
<211> 1259
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 24
gtagctgcac atcgagtcaa ggagaggagc aaagccatgg aggtccctgt gatcgacctt 60
gcggagttcg agagtgagga gaggagcaaa gccatgtctc gatttcacca agtgtgcggg 120
aattggggct tcttctgggt aatatgatct ctctgcttct tgctcttgat tcgattcggt 180
aagtcattcg atactggctt cttcaacgca ggtcgagaac catggagtag ctgtggcttt 240
gatggaggag atgaagagac atgtgtactc ccactacgac aagtgcctca aggaaaggtt 300
ctacgactcg gagttggcga agggactcgg gcctcaaacc gatgccgcag aagtcgactg 360
ggagaccacc tacttcgtgc agcatcagcc ggaatcaagc acggaagacg acctcggcct 420
cggggtagaa ttccggtcag tctccagcct cagactagtt taacggcagg aacaagcgct 480
tacaggttca ttcgatcgat gtcgcagcga agccatggat gcttatgtca gccaactgac 540
caagctcgcg gagaagctgg cggagttggt cagcgagaac ctgggactgg acgatgatca 600
tctgaagaag acatttgcgc ctccatttgt gggcacgaag gtggccatgt acccacagtg 660
tcctcagccg gagctggtga cgggcctccg cggccacagc gacgccggcg gcatcatcct 720
gctgctacag gacgacacag tcccaggcct ggagttctac aaggacgggg aatgggtgcc 780
ggtgactccg aacaaaggaa accgcatctt cgtcaacttc ggcgatcagg tggaggtggt 840
cagcaatggc ttgtacagga gcatgtggca ccgggtgctg gccgataagc acggcagccg 900
gctctccgtg gcgacgttct acaatccggg cggcgatgcc atcgtcgggc cggctccgaa 960
gctgctgtac cccggcggat accggttcca ggactacctc cattactact tcgggaccaa 1020
gttctcagac aaaggagcaa ggtttcaggc cgtcaaggaa atgctcgagt gaaggcctcg 1080
tggcttaagc aataagagtg ttctcccgca tttaagacta ccctgttctg ttctgttccg 1140
ttccgttccg ttctactgtg tctttgacat caacaaaatt ggtatgattt agatctgaga 1200
aggttatgag ctatgcttga atcaatgcag aatgaatgaa tggtatgcgc tgttcgaac 1259
<210> 25
<211> 1691
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 25
tgcggttgtc gtccccaaga ttgcttcgac gccttggagt tgtagtctca tggattgccc 60
gaaaggatgg cccgaacagg tagttcgtgt ccaggccttg tccgacagcg gtctgatgac 120
gattccagac ctgtacgtca agccgccggc cgagcgcccg tcggttggta acggtggcga 180
cgttacgtcc gacatcccgg tcatcgaact gggggggctg gcggagggcg cggcggagtg 240
ccgcgccacc atccgcgccg tgggggacgc gtgcagcgag tggggattct tccaggtggt 300
gaaccatggg gtaagcccgg acctcgtcgc cagggtccgg gaggtgtggc gggccttctt 360
ccatctccct atggaggaga agcaagctta cgctaatgac cccaagactt acgagggcta 420
cggcagccgc gtcggcgtcg aaaagggtgc catattggac tggggtgact acttcttcct 480
ccacctcctc cccgaatcca tcaagaacca gaacaagtgg cctgccctgc catcgtcttg 540
caggtacagt acactccatt gtcatataac agtactagta acgacggaaa accatagtat 600
tcatggacat gcatgcgcgt gatcgagcag ggagacggtg caagagtatg cagatgagtt 660
agcgaagctg tgtgggacgc tgatgaaggc gctgtccata agcttaggcc tggacgtgga 720
gcagctgcag accgccttcg gaggggacgc cgtcggcgcc tgcctccgcg tgaactacta 780
cccaaggtgc ccgcagccgg agctcaccct cggcctctcc gcccactccg atcccggtgg 840
cctcaccatc ctcctcgccg acgactgcgt caacggtctc caagtccgca gaggcgacga 900
ctgggtcacc gtccaaccca tccccggcgc tttcatcgtc aacgtcggcg accagattca 960
ggtatagccc cgatccacct tgtggcggta cgtgtgtcgt gcatctctta gcgactactt 1020
tgttcggtga tggttatgac gtatcttatt tacgtatggc cattcggatg cacgagtccg 1080
acatccccca tccctctgtg gatgacgcga ggttttgtct tcatataccg tgtgctttgt 1140
cctacctagt tttggacact tgccgccatc gctgttcgcc ctctggcgct ggtgatcgat 1200
ggctatctta atatttggtc aacatccgaa acacatgggc cgggttgacc gcatcacagt 1260
gacttacaaa acaagtctac ctaagccgcc cacgtcggat gcgatgcaca cgatggatgt 1320
ggaaacggca gcagcaggtt taacctgcgt ttcatttggt tgcaggttct gagtaacgca 1380
gtgtacagga gcgtggaaca ccgagtggtg gtgaacgcag cacaggagcg gctctcgctg 1440
gccttcttct acaatccgag gagcgacgta gcgatcgcgc cggtgagcaa gctggtgacg 1500
ccggagcggc cgcagctgta ccggccgatg accttcgacg agtatcgtct gtacattagg 1560
aagaaggggc cgaaggggaa gtcgcaggtg gagtcattga aggcacagag tgttaattga 1620
tcaggtgtac gtcatctgct tgctgtgata tgtccacatg tagcgagcca tggttgcaga 1680
tcttgcttgg g 1691
<210> 26
<211> 1520
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 26
atggactgcc ttcaggaatg gccagaaccg gttgttcatg tccaggcctt gtcggacagc 60
gctctgacga cgattccaga cctgtacatt aagccgccgt ccgagcgccc gtcgtcggac 120
aaaggcgtcg ccacgcccca catcccggtg atcgacctgg gagggctggc ggagggcgcg 180
gctgaatgcc gcgccaccat ctgcgccgtg gcggacgcgt gccgctcctg gggattcttc 240
caggtggtga accacggggt gagcccggac ctggtcagga aggtccggga ggtatggcga 300
ggcttcttcc gcctccccat ggcggagaag caagcgtacg ccaacaaccc caggacttac 360
gaaggctacg gcagccgcgt cggcgtcgaa aaaggtgcca tcttggattg gggtgactac 420
ttctacctcc acctcctccc cgagtccatt aagaaccaag acaaatggcc tgccctgccg 480
tcttcttgca ggtgcatatc aagcgcaata actcatatga caggacagta agaacggaat 540
aagcccaatt atatggacct atatttacaa tggacgtgca tgattgtgat ggaacaggca 600
gacggtgcag gagtacggag acgagatggt gaagctgtgt gggacgctga tgaaggtgct 660
atccataagc ctgggcttgg acgtggatca actgcaggcc gccttcggag gcgacgacgt 720
aggcgcctgc ctccgcgtga actactatcc gaggtgcccg cagccggagc tcaccctcgg 780
cctctccccg cactccgacc cgggcggcct caccgccctc ctggctgacg actgcgtcaa 840
gggcctccaa gttcggagag gcgacgattg ggtgaccgtc cagcccgtcg ccggcgcttt 900
catcgtcaac atcggcgacc agattcaggt gctctcgctc tctctctctc tctcggcgat 960
tcctcgaggt caaagtttta gctgttttgt tcccgcggat cttttcgtcg tccagggaaa 1020
ctggagtcgc atgcaagcat atctcaacca tgtcctgtga gacgacgctt gtctgcaaag 1080
ttgtcttccc tccgaaacct tcctcggtca ctctgacaac cttcctcttg cggtgtttgt 1140
tgtcagcttt actttatgat tccgttgacc catctcacca cccagcttgt gtcttctgcc 1200
acttgttcca atcatacgtg ggtaaatata tatatgtata tatatatctt atatttcttg 1260
tgttaatgct acagattttg agtaacgcaa agtataagag cgtggaacat cgagtgacag 1320
tgaatgcagc gcaggagaga ctgtcgctcg ccttcttcta caatccgcgg agcgactggc 1380
cgatcgcgcc ggtcggccag ctcgtgacgc cgcagaggcc gccgctctac caggcgacga 1440
ccttcgacga gtaccgcatg cacgtcagga agaatgggcc gacggggaag acgcaggtgg 1500
aatcattgaa ggccatatga 1520
<210> 27
<211> 1402
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 27
acactccaga tagaaagcac aagtgcaatc agggaagaaa gagcgtgtca tggattcctt 60
tccggttatc gacatggaga agcttttggg aagggagaga ggagaagcca tggagatcct 120
ccgagatgct tgcgagaaat ggggcttctt tgaggtgctg aagcatacat aactggtttt 180
gcttctttga actatatata tattgctaaa atgtactatt tgcacatgca atctgtgtgt 240
agattttaaa ccatggcatc tcacatgacc tcatggatga agtggagaag gtgaacaaag 300
accagtacaa caaatgcagg gagcaaaagt tcaacgagtt cgccaacaaa gcactggaaa 360
acgccgactc agaaatcgac cacctcgact gggaaagcac ctttttcctg cgtcatctcc 420
ccgtctccaa catttctgag atccccgatc ttgatgacca gtataggttg cacgatctga 480
tcatgatgtc atcttctggc ctggtctttt caccttgctc atcgtttcgt ttcttgggac 540
gatgactgcg tgcaggaagg cgatgaagga atttgcggca gagatggaga agctggcaga 600
gcggctgctc gacttgctgg gtgagaacct ggggctggag aaggggtacc tgaagaaagc 660
cttctctaat ggatccaagg ggccaacctt tgggaccaag gtcagcagct acccgccatg 720
cccgcgcccg gacctggtga agggcctgag ggcgcacacc gacgccggag gcatcatctt 780
gctcttccag gacgaccagg tcagcggcct gcagttcctc aaggacggcg agtggctgga 840
cgtgcccccc atgcgccacg ccatcgtcgt caacctcggc gaccagctcg aggtttgggt 900
cctctttgct ctcgtttccg ctgcccgtcg tctgtgatgt tgaatgcaac gaggtctgca 960
ggtaatcacc aatggcaagt acaagagcgt ggtgcaccgc gtggtggctc agactgatgg 1020
caacaggatg tcgattgcct ccttctacaa ccccgggagc gacgctgtga tcttcccggc 1080
ccccgctctt gtggagaagg aagcggagga gaagaaggag gtctatccga agttcgtgtt 1140
cgaggattac atgaagctct acgtcgggca taagttccag gccaaggagc caagattcga 1200
agccatgaaa gccatggaag cagttgccac ccacccaatc gctacctctt aagtgacagc 1260
ccccaagtta gtgcatgtcg ctgtacttcg cgttaggaag ctgtcgtcta tgtctatgta 1320
acccgatgga tgtgtggtat gtacgtgtgt gagccttttc taatgaagca aatcatataa 1380
tatatatata tatatatata ta 1402
<210> 28
<211> 1225
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 28
gctggtgaat gcatctacta cggatgtgaa gagttgggtc gaggaagcgt gcttaccgag 60
tcggaggaat aacccgagag gcacgaaagc cggcggaaat ggagatcccg gtgatcaacc 120
ttggagagct ggagggagag aagagaagca aaaccatgtc gctcctccat gatgcgtgcc 180
agaagtgggg gttcttctgg gtacgttgtg agcatcttta tctctgcaag cattggtatt 240
cgtgtttggt tactctgatg agtccggcat ggcagctcga gaaccatggg attgaggatg 300
gagtgatgga ggaggtgaag cagctggtga agcagcacta cgaggagagc atgagggaga 360
gcttctacga gtcggagctg gcacagggac tgcgacgtgg aactaaagcc tcggatgtgg 420
actgggagac cagcttcttc taccgccatc gcccggatcc caacatcaat gatctccccg 480
aactggttcg gtgagttctc ttccatggag tataaccacg tagagcaacc ccaagctgac 540
gccgcagcat gctcgtgcag tgacgctatg aagcaatacg tcgaacaggt ggtgaagctg 600
gccgagaagc tcgcggagct tctgagcgag aatctcgggc tggcgaatac ctacctgaag 660
aacgcattcg ccgagccttt cgtggggacg aaggtggcaa tgtaccccaa atgctccaac 720
ccggagctcg tcatggggct ccgcggccac accgacgccg gtgggatcat cctgctgctg 780
caggacgaca cggtccccgg cctggagttc ctcaaggacg gcgagtgggt ggcggtgccg 840
ccggcgcagg gtcaccgcat cttcgtgaac ctcggcgatc aggtcgaggt cgtgagcaat 900
ggcgtctaca agagcatcag gcaccgggtg ctcgctgacg ggaccggaag ccggctgtcg 960
atcgccacgt tctacaaccc gggggccgac gccatcattt ccccggcggc cgagctggtg 1020
tacccgagtc gctaccgctt ccaagactac ctggattact acaccaagac caagttctca 1080
gacaaagcgt cgaggtttca gaacatgaag cagacgctcg tgtgagccac tcatgcctgt 1140
agtagctgac ggaagaggaa tttgtactgg tcaatccacg cttgtgcttc aatccaaata 1200
aacatcgatc gccatctctt cttta 1225
<210> 29
<211> 2108
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 29
atgaacgtag tacaggagtg gcccgagcca gtcgtccgtg tccagacctt ggccgatgcc 60
caggtaatcc ccgagaggta catcaagcta ccatccgaga gaccacaccc ttcttcagcg 120
gcaggcggcg caggaagcct tcccatggtc gacctcggcg gcctcaagcg tggcgcagcg 180
gagaggcagg cgaccttgct cgccgtgtcg gatgcatgca gagactgggg gttcttccag 240
gtggtgaacc acggggtgag cttggagctg atggccagga tgagggaggt gtggaagggg 300
ttcttcgatc tccccatgga ggagaagcaa gcttacgcca attcccccgt caccttcgag 360
ggctacggca gccgactggg cgtcaagaag ggcgccattc tggactgggg agactactac 420
ttccttccgc tgttccctca ctcgatcaag aactacgaca agtggccttc ccttcctgct 480
tccttgaggt atatatccac gtagattcac agagatccat gcatgcatgt tcctctacac 540
ttttctggtc ttcatcatca tctgatgatc agggaaacga ctgaagaata cggtgaggaa 600
ctggtgaagc tgtgcggggt gatacagaat gtgctctcgt taaccctagg attggacgaa 660
gggttccttc acagggaatt cggagaagct ggagcaggac tgagggttaa ctactatccc 720
aagtgtccgc agccggacct caccctcggc ctctcccccc actccgaccc aggaggtttg 780
accattctcc tcaccgatga ccaggtgaaa ggtttgcagg tgcgcaaggg cggctcatgg 840
atcacggtgg agccgattcc cgatgctttc gtcgtcaatg tcggcgacca aatccaggtt 900
tgcttcctcc tatatggttc atgtttttgc cttgatcctt tctcatctgc atgcacgtcg 960
atgtgtgtgt gatatatgag gaagtgttct tagagattcg atcgaaacag tgctctttcg 1020
cgttgcagtg tccatccact gcatgcagaa gctgtgcatg catggacatg atagaattca 1080
tgctctaagc tgtgcttcca aaatatgcca aaactgagac aacaaaaaag gttgtgcaaa 1140
atactcgaaa tttcgatact aaatgcaata atttttctct tctaattaat acactaaatt 1200
taatcataat ataatgccat atattaatac acaaaaaaaa ccacgaagaa ctctgaaata 1260
tctaagatag tcaaatgttt catatgcgcg ggagaagctt aattataata ccagtgtcta 1320
agtgtttggt cacttcatcc aaataatatt aacatgcatg tcaaaaatct tctaaaagaa 1380
tcatcaacta agaacagggg gtagatagat aagatttgga tgataactaa acatcgggaa 1440
agaaacttgt gatttgcatc gataaggcta tcttctacct tttgtaaggt aagtgtccag 1500
agcatgcagc cacgtgctca tctctccttc ttcacgccct tctttccatc tctagcatgt 1560
tcttccttgg tgatttgact gttaacctaa agtcctgtca acgcttgata gatttgtgcc 1620
atcatctctc tctctctctc tctctctccc tctcgttatc tttccaatca cagaaacgaa 1680
accatatgct ttttaatgca cctcaaaagt tgctctcatt gagttcatgt gttctagctg 1740
tgtgtgagat ggagaggaag agagagaggc tttgattact tgggaattgc atgctcttct 1800
tggccacgca ggtgctgacc aatgggaggt acaagagcgt ggagcaccgg gtggcggtga 1860
atgcagcaac ggagaggctc tccatggctt tcttctacaa cccccaagat gacttgctca 1920
tccaccctgc caaagagctt gtggcagatg gcacatcccc catgtacaag ccgaagacct 1980
tcaaggagta caagctgtgc atgaggatgt tgggcccttg tgggaagatg ctggccgacg 2040
ccatggaagc tacttaatta ataagcatca gaattgaggg ataccaaaca attcgttcag 2100
cttcaagg 2108
<210> 30
<211> 1338
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 30
atcgatcacc attcgagaag cagtatagta gcacagttgg taaccggatc accccatctg 60
tcttttggag aaatggccgt tccaatcatc gatttctcga agctggaggg ggaggaacga 120
gccgaaacat tggcacagat tgccactgga tgcgaagaat ggggattctt tcaggtctgt 180
tatcatggct ttgttttctt tttccgcggg tcctcttctt tctccttccg atgttcttat 240
gaagtcgatg cgtttgcagc tggtgaacca tgggattccg gtggagctct tggaacgcgt 300
gaagaaggtg tgctcggagt gctacaggct cagagccgag ggcttcaagg ggtcgaagcc 360
tgtgcagctg ttgaacaagc tggtggaaga agaagaagac gaagctgccg acgctaagcg 420
cttggacgac gtggactggg aggatgtctt cctactccag gatgacaatg agtggccgtc 480
caacccacca gagttcaggt aatcatcagc ttcctatcgg gacttgttag gctgattgat 540
atgtggctgt actccgtctg tcctagtgct gaaagtttgc acgatcatgc agggagacca 600
tgaaggagta cagggaagag ctgaggaagc tggcggagaa agtgatggaa gtgatggacg 660
agaatctggg ctttgagaag ggctccatca agagtgcatt ctccggaaac ggggagcatc 720
atcccttctt cggcaccaag gtgagccact acccgccgtg cccacgcctg gacctggtga 780
acggccttcg cgcccacacc gacgcaggcg gcgtcatcct cctcttccaa gacgaccaag 840
tgggcggcct gcagatcctt aaagacgggc agtggatcga cgtgcagcca gtggccaatg 900
ccatcgtcat caacacggga gaccaggtcg aagtcctcag caacgggcgg tacaagagcg 960
tgtggcaccg ggtgctgacg accagcgacg gcaaccgtcg ctccatcgct tccttctaca 1020
acccctcctt gaaggccacc atcgctccag ggaccaacga ggacgactct gctgcagcac 1080
tgtaccccaa gtatgttttc ggggactaca tggatgtgta cgtgaagcac aagttctcgc 1140
caaaggaacc ccgctttgag gcagtcaaag ctctgtgagg atcgaaaaat gcataattgt 1200
tggaatttac ttctcatata tatatatata tatgaatgat tctttgtggt gttttatgaa 1260
catgtgtaat ttaattaatg gttttgtttt gacttggcat aaataaaata aaaaaaaata 1320
tgttttgatt tatacatt 1338
<210> 31
<211> 1761
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 31
ccaatttgtc ttctcttata gctttatgtt cttatttgta tgtagcgttc cctgcaaacg 60
aggagaagaa cacttactga tcgcaacgca atggcaacga aggagaattc cggcactgca 120
gtgatcgaag gccgcgtcga ggacgttcaa gagctacggc gctctcatcc gacggtgatc 180
cctgcgcgct acgtgcgaga tggcaacgag aggccttctc ctgctctctc gcccggcctc 240
ccttccatgg acgtccccgt gatcgactta tcgaggctgg gcagctgcag cagcaaaaca 300
ccagagcgtg aatcagagat ggcaaagctc gctgctgcct gcgaagggtg gggcttcttc 360
caggtgcgta ctgcgcttct tcatctctct tctggttccc cagaaaccga agcagcactg 420
aggcgatgac acatgcaggt aatcaaccat ggagtggagc atgagctgct agagaagatg 480
gagaagctgg ccaaggagtt cttcatgctg cctttggagg agaaagagaa gtacccgatg 540
cctcccggtg ggattcaggg ttacggccac gccttcgtct tctcggagca gcagaagctg 600
gactggtgca acatgtttgc gctgggcctc gcgcctgcct tcatgagaaa gcctgaacta 660
tggcccacga atccaccttc cttcaggtaa cacatcgccg ccgtgtttct ctcgccatgg 720
ctccgattca tacctgtatt actgctacag cgagacactg gagaagtact ccaacagcat 780
aagactacta tgtgagacac tgctcggctt catcgccgag agcctcggcc tccgccgcag 840
cttcttcaac gagatgtttg gggaggccgt gcaagctgtg aggatgaact actacccgcc 900
atgttcgagg ccggacctcg ttctggggct gaccccgcac tccgacggca gcgccctcac 960
cgtcctgcag caagagacag catccgtcgg cctgcagatc ctcaaagacg gcgcctggct 1020
tcccgtccat cccatcgcca acgccctcgt ggtcaacgtc ggcgacacgc tagaggtaag 1080
agctccgtgg gaagccgtat gcgctcaatc cagcgcgggc gatcactgac gtgacgagac 1140
atgcaggtgc tcacgaacgg caagtacaag agcgtggaac accgagcggt gaccaaccga 1200
gagagcgaca ggctctccat ggtcacattc tacgctccca gctacgagat cgagttgggt 1260
cccgttcctg aactggtgaa tgacaaggca tgcttgtata ggagatacaa tcatggcgag 1320
tacagtcgcc tctacatcac caacaagctg gaagggaaga agaggttgga atttgccaag 1380
attcagacga gtctctgagc aagaaggtca tcatctccaa attaatcgca ttcccctcca 1440
caagtctgta tatgcttatg catgatttgt attagatgag ttcttactcg tcgagcatgg 1500
tgtcacatcg tatacatgca gtgtatatat ggggggtgta gaaattggat taatgtgaca 1560
ccaactgcat cgtaatgtat caaacacacc accatcattt ccctttctgt agcattccat 1620
ggttcacatc ccacttcacc aaattcatat gttaatatgt agaaagtagg gtgactcatc 1680
tgcatgtatc atccacatcc ctgacatagc tgatcatttt acatgctaca agcaaagcaa 1740
gcatatatac tatagagaac c 1761
<210> 32
<211> 1296
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 32
ccattcgaga agcaatacag aagcataatt tgcaaccaga gcaacatctc gtcctcgcta 60
gaaatggcca ttccagtcat cgatttctcg aagttggagg ggaaggaaag agctgaaacc 120
ttggcacgga ttgccaatgg atgccaagaa tggggattct ttcaggtttg catcccattt 180
gtctggttcc ttctttctcc ttactgggat cttttcgagt tgacgctggt actaaagcag 240
aggaatctac ctgacctgtt tgcagctggt gaaccatggg attccggtgg agttcttgga 300
acgcgtgaag aaggtgtgct ccgagtgcta cagactcaga gcggagggct tcaaggcgtc 360
caaacctgtg cagctgttga acaagctggt ggaagaagaa ggcgacgccg ccgatgctaa 420
gcgcttggat aacgtggatt gggaggatgt cttccttctc caggatgaca acgagtggcc 480
ggccaaccct ccagagttca ggtgatcatc aacttccacg cagggctcgt caggctaatt 540
gatatgtagt tataagtgcc taacgtatgc cctcttcatg cgcaatcttg cagggagatc 600
atgaaggagt acagggaaga gctgaggaag ctggctgaga aggtgatgga agtaatggat 660
gagaatctgg ggttcgagaa gggctccatc aggaactcat tctccggaaa cggcgagcat 720
caacccttct tcggcaccaa ggtgagccac tacccaccgt gcccgcgcct ggacatggtg 780
aacggccttc gcgcccacac cgacgcaggc ggcgtcatcc tcctcttcca agacgaccaa 840
gtgggcggcc tgcagatcct taaagacggg cagtggatcg acgtgcagcc agtggccaat 900
gccatcgtca tcaacacggg agaccagatc gaagtcctca gcaacgggcg gtacaagagc 960
gtgtggcacc gggtgctgac gaccagcgac ggcaaccgcc gctccatcgc ttccttctac 1020
aacccctcct tgaaggccac catcgctcca gggaccaaca aggacggctc tgctacagcg 1080
ctgtacccca agtacgtttt cggggactac atggatgtgt acgtgaagca gaagttcttg 1140
gccaaggagc cgcggttcgc ggcggtgaga gccgtgtgag gatagcaaaa gtgcacgtta 1200
ttcattaaga tatattgttc cttcgattga attcttcgca tgagaagaac gtttgtttgc 1260
atcagattaa ttcttcatgt aatgaataaa acgagt 1296
<210> 33
<211> 1227
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 33
agcaatacag aagcataatt tgcaaccaca gcatcatctc ctcctcgcta gaaatggcca 60
ttccagtcat cgatttctcg aagttggagg ggaaggaaag agctgaaacc ttggcacgga 120
ttgccaatgg atgccaagaa tggggattct ttcaggtttg catctcattt gtccggttcc 180
ttctttctcc ttacagggat cttttcgagt tgaggctggt actaaagcag aggaatctac 240
ctggcctgtt ttgcagctgg tgaaccatgg gattccagtg gaactcttgg aacgcgtgaa 300
gaaggtgtgc tccgagtgct acaggctcag agcggagggc ttcaaggcgt ccaaacctgt 360
gcagctgttg aacaagctgg tggaagaaga aggcgacgcc gccgatgccg agcgcttgga 420
taacgtggat tgggaggatg tcttccttct ccaggatgac aacgagtggc cggccaaccc 480
tccagagttc aggtgatcat caacttccac gcagggctcg tcaggctaat tgatatgtag 540
ttataagtgc ctaatgtatg ccctcttcat gcgcaatctt gcagggagac catgaaggag 600
tacagggaag agctgaggaa gctggctgag aaggtgatgg aagtaatgga tgagaatctg 660
gggttcgaga agggctccat caggaactca ttctccggaa acggcgagca tcaacccttc 720
ttcggcacca aggtgagcca ctacccaccg tgcccgcgcc tggaaatggt gaacggcctt 780
cgcgcccaca ccgatgcagg cggcgtcatc ctcctcttcc aagacgacca agtgggcggc 840
ctgcagatcc ttaaagacgg gcagtggatc gacgtgcagc cagtggccaa tgccatcgtc 900
atcaacacgg gagaccagat cgaagtcctc agcaacgggc ggtacaagag cgtgtggcac 960
cgggtgctga cgaccagcga cggcaaccgc cgctccatcg cttccttcta caacccctcc 1020
ttgaaggcca ccatcgctcc agggaccaac aaggacggct ctgctacagc gctgtacccc 1080
aagtacgttt tcggggacta catggatgtg tacgtgaagc agaagttctt ggccaaggag 1140
ccgcggttcg cggcggtgag agccgtgtga ggatagcaaa agtgcacgtt gttcattaag 1200
atatattgtt ccttcgattg aattctt 1227
<210> 34
<211> 1561
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 34
atggaggtgg ctgaggaatg gccggaacca atcgtccggg ttcaaacttt agctgatgcc 60
gaagctgtcc ctgagaggta catcaagcca ccgtccgagc gacccaacct gaatcccggt 120
acggcgttgg cgccgagtga gacgggaagc cttcctgtca tcgacctcgc cggcctgagt 180
ggtggcgccg cggagaggcg ggcgacgatg ctggccgtct cggatgcttg ccgagactgg 240
ggtttcttcc aggtggtgaa ccacggggtg agcccggagc tgatggaggg gatgagggaa 300
gtgtggacgg cgttcttccg gctacccatg gcggagaagc aagcttacgc caactccccc 360
aagacattcg aggggtacgg cagccgcctc ggcgtcaaga agggcgccat tcttgactgg 420
ggcgactact tcttcctcca gctttcacct cactcgatca ggaactacga caagtggcct 480
gttcttcctg cttccctgag gtatacatat acacacatgg atccttgttt ccgctctttc 540
gatcatttgg atgctgcgta ctgatattga ggatgcgagc agggcgatga cggaggccta 600
cggcgaggaa ctggagaagc tgtgtggggt gataaagaag gtgttgtctg caaccctagg 660
actggacgaa gagttcctcc acagagcctt tggagaggct ggcgcttgcc tgagggtcaa 720
ctactacccc aaatgcccgc agcctgatct caccctcggc ctctctcccc actccgaccc 780
cggagggatg acggtcctgc tcaccgacca ccacgtcaaa ggccttcagg tgcgcaaggg 840
tgacgactgg atcacggtgg agccggtccc cggtgctctc atcgtcaaca tcggggacca 900
aatccaggtt cgcttcctcc cggaccattg catctatctc acgcatacga tacgtcctcc 960
gcctcggcct gcatgagtat agccacgatg gacgtgaata ggacgcatgg tcttaaaaac 1020
ctatttgttt tcttatctca attgcgtgat tggcatgaca acaaagtctc atctttttct 1080
gtcctgatgc ggcatgattc ttcctccctg catccaaaaa taggtcaact ttaagatttt 1140
tggtaagatt cttccccgct gcatccaaaa ataggtcaac tttaagatgt ttcgtcaaat 1200
cgttgtcttc ggaaagcacc aaaaacgtgt cttatacgaa cgtagaatgt aaaaggacaa 1260
gagatagttt actagtgcag ttggctgtgg tgataattca acctcgatga cgcaggtgtt 1320
gaccaatgcg acatataaga gcgtagagca ccgggtggtg gtcaacgcgg cgacggagcg 1380
gctgtcgatg gccttcttct tcaaccccaa cgacgacctg ccgatccaac ccgccgccga 1440
gctggtgacg cccgaggcgc cgcccctgta caagcggctg accttcaagg agtacaagct 1500
gttcatgagg atgttgggcc cccgtggcaa gtcccacgtt gacttcgtca agtccacctg 1560
a 1561
<210> 35
<211> 5306
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 35
cgttcgtcca tggaagccgc ggccgaaacc caacgcgtcc aaaccctcgt ggaggccggc 60
gtcgcccacc tccctgcccg atacgtccag ccgccggagc tccgcccgca cctcagccgc 120
cgtcgcgatg ccacggcgga ttgcggcggc attcccgtcg tcgacctcgg cccctccggc 180
ggcgaccccg tcccggcgat cggccgcgcc tgccgggagt ggggcgcttt ccaggtggtg 240
aaccatgacg ttcgcccggg gctcctggag gaggtcaggg ccatggggtc ttccttcttc 300
cgcgccccca tggaggccaa gctccggttc gcgtgcgatc cccggtcgcc ggcctccgag 360
ggttatggga gccgcatgct cgcgaaggac gatggggtgc tcgattggag agattacttc 420
gaccatcacg cgctgccgga gtctcgccgc aaccctagcc agtggccgga tttcccatcc 480
aattacaggt taggatagtt ggattgaaat tatcaacctt gtgcatcttt tttcttttag 540
aattgattca aacaaagctc gtagaaggtt gcaaatgagc aagtaagcat cttttagtta 600
agaagacgtc cgagatgggt tttgatccga ctgggattta gtgatttcga taagggatga 660
aaggtggcag gtctctgggg ttttgagttc acctaccagc gctgcatgtt gattggtcat 720
actgaaattg aatgtttaat tttgtcattt ctatagggaa aaactgttca ataagatatt 780
catggtatgc aaccatttga acttttgcga gaaatggtat ttctaaaact acttaatgat 840
cgagtatact atggtagatt ggatttgcat gtgttaagta tttaactcgt tcggacaaag 900
aaatctttca ttctgtgcaa tctttcgttt accatctact atattatttg gaaggtttag 960
cggaggcgcc gctggctaaa gtttagttgt tatttgttag tttctcaaaa atcagctctt 1020
tgacttgttt gatattttta ttgttgaaat tcgcttagta attgaaggct cggaactaat 1080
cagtgaaaaa ctagaataat ttagttgttt gcacagtgat gatatgtctc tgttttactt 1140
ataatgtaat ttactgatat atttaataag tttcaatggc ctgcatattg ttgctgctga 1200
tattatcctg gtaacatttg aagatcacaa tttaaagcaa acttcatttt tgggtgaaaa 1260
gtctttgaag aataagaacc agctaacatc agaaagcaat agagtaaata gatgcatttt 1320
tagtggagta gtgaaatctt ggtcatgcgt aataccactg agacactcag ggtgtgtgtc 1380
gttcatcttg actgatgagg aagcaattcc tttaaattga gttctgtttt ctttaggctg 1440
cagtcagttc gaagaattta gtcaagttct agttagttat agacctcaga ctttgaactc 1500
agagttaaga tgtcaaccaa ctggatatga cacctaaagg tcacaaggat cttgcttttg 1560
tgatattgtt tttgaacaga aatgagaacc taaaattttg ttggtttgag attcaaattt 1620
gatgatggag ggactcactt tgtgtagtga atctgaatcc aaaaaggaaa ttttctggaa 1680
cggacaaaat aatccattga agctctctat gacttctcaa ttagaggaaa ctttcttaat 1740
cttagcttca ggactctttt caagactggc atggaactac taattaaaat ggtcatctcc 1800
tgtgcatcaa aaatttgagc ctctcattct ggatcattta cattatacaa aattttagac 1860
cttgattggt tttctactgc agttctgaat atcattacta aaaaaaaaat gcaatgtgat 1920
acgtgtgagt catattgcta aatgtttcct tcagctacat aaattcaggc attaatgcca 1980
ccgttctctt tttcatttct gtccagcatg aacttgtgat gccttctaat gcatgcaata 2040
gaactggctg atttgggcag ggatgttgtg atagaatata gcaacaacat gaagaagctt 2100
gctcaaacat tgttatgtat gatctcccaa agtcttgggt taccaccact gtacattgaa 2160
gaagcagttg gagaagttta tcagaacata actattagct actacccccc ttgtcctcag 2220
ccagatcttg ctcttggttt gcaatcccat tctgatatgg gtgccataac acttctaata 2280
caagatgatg tggaaggtct tgaggtactg aaagatgggg aatgggtgca agtacagcct 2340
ttatctgatg cagttgttgt cattttggct gatcaaactg aggtatttgc atttaagttc 2400
aattatgatg ccaaaatgtt atgtatctgt aactgttttt gttgtaagct ctccttcaaa 2460
ttaatactga tttatcttaa atgattgtta gaacatttag tttattgata ttctataatt 2520
tggtcatttg gtagagaatt ttgaatgttt ctagatgaat ttattgattc taaatgtaac 2580
aataacttca catgtaactg cgttttgcaa agattcaaag gcatgaacag gtagttatat 2640
atcttagatt tctaaaggtt acagggactg atcatatatt tctaggtggt agaccagcat 2700
cttaatcgac acttcttacc acattagata tcctcttgct ctttgacaaa tattaagtat 2760
tgctgttctt cattaattat tttctctctt ttttcttgac ataaaaattc attttcataa 2820
aaacaagtgt tataataact aggtaatgct tacttttata atctttgtct tgattaatta 2880
tactaatttt tgctccttgt atgaactaag gatgtacatg ttagttgtga ttgttccgtt 2940
taacacattc taaaatctac atatcacata tgctaacatt tccatatatg aacaactgat 3000
tcatccattg cactatcagt tcatgtaaag ccactgcatg aacttgatct aatgagctgt 3060
tggtttgaag tatattaata gttgtaatct ctgtaataat gcttctgtct ggggctgatt 3120
agatctttta tagataccaa agcatcatgt ataacatgca attatagaca tgtaagaagt 3180
tcaacatcta gttttatgca aaaatgtgaa cttacatctg gaattaacct gtaaaatgat 3240
tagcaaaaaa ttagttcatt ttctggaacg accaccttaa ttattgaatt acatctcctt 3300
aatgaattta gaggtggctt gctgcaaatt taatttttta taagattttc ttgtggaaaa 3360
tctgctaaca tggactcaac accagattta ttatcccaca tgaaattatg ctgacaagag 3420
aaatttattt ttagtttttt ggatttagca ataatatgat ggtcttttat aaatcctgtg 3480
tgcaatgata attagcatga gttccatctt gtgctgacat ctgtgttcca ggggtattat 3540
ttgaatgatg ttgtctttat cttttcttct gatccccgag cacattttct taagctcaag 3600
aatgatttca gtgatgctgc caccataatg ctttacattt atgagggagt tggtgacatt 3660
gtcttcactc acttcctgat tgattctctg gggaagacga ggctcaatcg tgcttgcttg 3720
attccacatt ttttgcatga gtgccttctc aacgagcagt acaggtacca ttgtttcagc 3780
aagcttccag gggcatcttt cgaaccactt cccaagccta ttttcttgac cttggctcag 3840
cccttcatga attagttctt tatgctcaaa tatgattcta gtgatctggt cctcatgctg 3900
ccacaataat cctcaacatg taggagggag atggtaacat tgtttacact cacttcctgc 3960
ttgatacttt ggttccaaaa ttttggataa gtgccttcca aaagggttat agcattgatg 4020
aacttgatat agttcttctc tttaagattt cactgcctat cactaggggc tttaaaaatg 4080
tgtgagtgaa aattgaattc tagttgctgg gtcaattctt gatcatcatt aacactaagc 4140
aatcttgagc tgggagggta ctgttgcaat ttggaacttg cccgatggca aaaattaagt 4200
cacctttcca aaggtaatat attaaaggta actttgataa ctttgctatt ggtttattat 4260
ataagaggaa ggccgcatga tcttacatct agtcttcgag tatacatctt ccataaaatg 4320
ctaattaaat tgataggctc ctaagaccca ctgttaattt agaaacccgg tctgagctta 4380
ttttttagtt gaatacaaac aaatctggag ttgtgtttct cacatcctct ttgtcagaca 4440
gccagtcaaa cacccaataa gttgaccaaa aaactagttg ataattgttg cagctttttt 4500
gtacacaaat gttagatgat gttgggaaca gtttatgacc tttaaatggc atttggaagg 4560
atatttgatc acatcaaagt ggtggctgtt tgaccaagag tttgacgaag tgggtgtcag 4620
aaagcatttc acagagatct taattatttt gaatctgtac ttttcctgta tttatcttct 4680
gcacaccatg ggtcactcat gaatcatgat gttttaccga aaccttttac ttcagcttga 4740
attctcaccc attctgaatt ttctgcaggt gataagtaac ggtgaatata agagtgctgt 4800
gcatcgagct gttgtcaatg cccatcatcc ccggttatct gttgccacat tttatgatcc 4860
atgtaagacc aggaaaatat atcctgctat gcagctaatc accaagcagt ctccactaaa 4920
gtaccgagag gttctttatg gggactatgt ctcgtcatgg tacagcaaag gtccagaagg 4980
caagcgcaat attgatgctc ttttaattaa ccagtaatgc atcattctta tattgtgatt 5040
ggtctatgaa ctcctaagct cgcccaagtt gagatgtgct ctgtaatgaa aacatgtatg 5100
ccaataagga ttcttggtgg aagatgtcta tcaagattat agccttgaac aaaaaggtac 5160
gtaactttga aagcaacaag aaaaaggatt gtgaataggt atgatttttg tctcatttca 5220
cacatatctg catcttttgg tgttggaaat ttatctgtat aaatcagcaa gcattctatg 5280
gaaggtttag attatgggat ttgact 5306
<210> 36
<211> 1718
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 36
agaagactga gtcaagtacc aaaagataag cttcttggta agcttattgc tagacagtaa 60
tggtggcgaa gcttctctct ctataagtgt tgtcgaagct gctacctgcc caaaccagcc 120
gagctgagag gtgttagtct tcgtacgcgg tgtgtgcgcg cttgcttgct tcgcgagatg 180
gcgaccccga gctttcagcg tctgggaacg tccatcgacg taccgaacgt ccaagctctt 240
gcagcttcca tcgcaaaccc ggctgacgtc cctcctcgat acgtcaggcc ggaagccaag 300
gctgatcccg tcgttagcga cggcgacagc gagcttccgg tcatcgattt ctccaggctc 360
ctccatcgcc gtttctctag ggaagagtct gctaagctcc accatgcctg tgcagactgg 420
ggcttcttcc aggtcagtcg atctacggat cgaaatcgtg tgatcgatag ctgcaacata 480
acaatcgttg atgctaatta acagttgata aatcacggag ttcccgatca agcgatggag 540
aagatgaagg ctgatatagt agaattcttt aagcttccct tggaacagaa gaaggcattt 600
gcgcagttgc cgaacagctt ggaaggttac ggccaaatct tcgtcgtgtc tgacgaccaa 660
gagctggact gggcggacat tatgtacctc ataactcgac cactccagtc gaggaacatc 720
gatctctggc cagctcaacc tctcactttc aggtttatct cgacttcttg tgctgtcatc 780
tactcagcgg ttcagctacg tacttattac gtacatgacg tcctttgctg ccgcttcatg 840
ccgtcagaga ctctctctct tgctactcca tggagctgaa gggcgtggca ggaactttgc 900
tggaggtgat ggcgaagaat ctgggggtcg caccggagga gttctctact atatttcagg 960
accaaccgca gggagtgagg atcaactatt atcccccatg tccaagggct gacgaggtgt 1020
tgggcatctc gccacacacg gacggcagcg gcttgacgtt gctcctacag gtgaacgacg 1080
ttgtaggact ccagatcagg aaggggggga attggttccc ggtgaagcca ctccccggcg 1140
ctctcatcgc taacatcggt gatatcatcg aggtcattaa ctcgactcaa attagtcaga 1200
atcaacatat atcaatcatg tccgatacta attcaattca aaaataaatt atgtttatag 1260
attacgagat tctctcaata tttattaatg taaaattatt attatttttt ttttcaatct 1320
cttctataaa tattttctaa caaaaacaaa agacttttgg aatagatatt gagcaacggc 1380
gtatacaaaa gcgtcgagca tcgggctata ataaatgcca agaaagagcg tcactcgatc 1440
gctaccttcc atgggccaag agaagatttg atggttggtc ctctctcaga gatcgtgaag 1500
gagtgcaagc cgaagtatgt gtcgatgagt tacaaagagt tcatgaaaac ttacttctcc 1560
gcaaaactgg aagggaggag cctcatggaa agcctcaagc tatagaagtc tctaatgtta 1620
gaaagttcat agtgtgttgc ttgaacttga taataagtat gttttgggat aatgttatat 1680
aagcatcgaa tctttgtatg tttaaagtgt attgactt 1718
<210> 37
<211> 3586
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 37
tctgcgcatc gcgtttcccc gttcgacctc gcacaacctt ctctcgctcg ctcgcgcgct 60
ctcccgtttc ccgctccgtc cgatggcaga ccaacttctc tctgcggtct ccgactacgt 120
ctccatcccg gagagttacg tccgcccgga gtcgcagagg cctcgcctca acgaagtgat 180
ccgaggagcc aacatcccca ccatcgatct cggctcagag gatgagctcc aaatcatagc 240
gcaagtcgcc gacgcctgcc ggtctttcgg cttcttccag gtacgtcgtc aggtactcca 300
tgatgctgtg tatcatcgtg gtcatgtata cgtatacgta cacaggtggt gaaccacgga 360
gtgccgctgg agtcgatgca gaagatgatg gcagtggctt cggagttctt ccgcctccct 420
cccgaggaga aggcgaagca ctactcggac gacccagcaa agaagatgag gctgtcgacg 480
agcttcaaca tcaagaagga gacagtccgc aactggagag actatctgcg gctccattgc 540
tatccgctgg aggagttcgt gcctggttgg ccttccaatc ccgcttcatt taggcaagat 600
ttcactccca tctctctctc tctctctctc tctccatcta ttgtcaagaa ctttatagac 660
tattatttgt tgaccggaag ctggagaaga ccttccaccc agtttttgtc agcgtcatgt 720
tgcccgtcta catttcgcag atgagatcag ggtgagaacc ttattcctca aaaaatagga 780
caagaagatg cgtccaagat atataaaccc cacaaaagat actaatcata tataggatgg 840
tccaaatctg agattcgatg cgcatctaat acctgcagac actctgcaca cggagatcac 900
gccatgcaaa ttattggcag caagtgatga ctgatgagct cactttatat tattaccttc 960
aggactgcat gtaggagaga agcacaacaa cagacccctc tttccctggt ttaagccttg 1020
catgttgcga ctgttcatgc attactatga aacatcgact ctgtcaaggg aaggacgaat 1080
caattatgga tacctgcttg aattatgtag cttgaaataa ggaatttctt tgtcaatctt 1140
ggagtaggac caatgacata tatctcgatc aatgacacat ctgctcaaag cactagctga 1200
tccccttcaa tgtttatcca catagaggaa aagtcctctc caacttgttg aagatgtaga 1260
aaatggtccc tctttcttgt aaatggagac ttctcaccta aaacgtatac tcgatgtttt 1320
tcttctcttt gacaagtaca aaaggggcag acatatcaaa gatgaaagat gagagagaag 1380
acaaggaaga acgaacagta acccttttct ttttttctct gagggtggca aatgtaggtc 1440
atttttgcac cttgtatcta ttaactattc atcaacgccc ttctggtcct cgattatcat 1500
gtgataggga aatgaaagat gtagcggaca gataagcata catacattta ctatcagagg 1560
ctcagacaca gcatgtgaag tcacatgaaa ggttcaaagc aaacagttgg atcataagct 1620
actgggtgca tcacagatct ataataggtg gtatatttaa tctttgctca gagattataa 1680
gctctttgct ttgttcatag atcaagtcgt tctccatgtc atgaagaact taatcgttct 1740
gcctttctct ctgtctcagg gatgtggtta gcacttactg cagggaagtc cgtcgactag 1800
ggtttcgact cctgcgagca atatcgctga gccttgagct ggaggaaggc tacatggcga 1860
aggtgcttgg ggagcaggag cagcatatgg ccgtaaacta ctacccaaag tgcccagagc 1920
cggagctcac ctacggctta caggctcaca ccgaccccaa cgccctcacc gtcctgcttc 1980
aggacccaaa cgtcgctggg ttgcaggttc tcaaggacgg caaatggatc gctgtcaatc 2040
cgcaacccga cgcgttggtc atcaacatcg gtgaccaact acaggtaccg atgcttttga 2100
cgaactctgg ccttcgttga gatctgctct gcttgtcctt caaatatact ctacatataa 2160
tactaatttt cctaccgagg atggtcaaat agtcagacga atacggtcga aagcatggaa 2220
aagaagaaac attgttgtta gtgctttcag ccatttggta tacgtctcca tctaaggatc 2280
aaagcttagt tgttgccatt gggtactttc tgcaactggg ggaggaaggg taaaagcatc 2340
acaaacacat gcatgcttat ttcctttggc gaacatggac gaagagtact ttttcctcct 2400
agtcttgtga tctaacgttg ggcttgaaag aataggtggg tttttccaag ctcacaccat 2460
gggcggtact atagtcaatg gtcagcatgg tcatttcctt gcccgccact gcttccaagc 2520
caaaatctct tgttccaatg tgggtcttct ttgaccagca tttgatttta cttgcattct 2580
taaaagccac tgtacgttgg gaggtagcag atccccgagt caagaacatg attagttctt 2640
gaccacactg gaaaacaatg ggtactgcac gccgtggaat cctggtaaac ttgatggatg 2700
cttggtcttt gtgctcatct gtcctttcgt ggtcatcgtg ctcatcttgg aagtggctat 2760
gatcctacaa ttgacctcca tcttttgtga actagtcttc cactgtcacg aaacaatctc 2820
ctgagcatct tcaaaagaga tatagactgc tttggttcca tgtatgagat cagctgtcag 2880
ttgaacaggt gagcggtagc tgatgccaac tgctcttgat catgtttgtc gatgccctct 2940
tcttcttcca attgtcgagc ggcttcttct tttcatggat tgatcgagaa gaaggtgacg 3000
tttgtccatt ggcgcgacta tgttgatgca ggcactgagt aacggaaggt acaggagcgt 3060
gtggcatcga gcggtggtca actcggagag ggagaggata tcggtggcgt cgttcctctg 3120
ccccagcagc agcgtggtga tcagcccgcc ggagaagctc gtcggcgacc gggctcggcc 3180
cgtgtaccgg acctacacct acgacgagta ctacaagaag ttctggagca ggaacctgga 3240
cgacgaccat tgcttgaagc tcttcgagtg ctaatggctt gccgacgagg gaggaggcat 3300
cccacgcgac ccaggatggc ggcctacgtt gctggtatcg tggccacatc agcaagtaca 3360
ccagatgatc tggcatgctg cttcttgaca tgcctccgcg ctgtccacaa taagctatgg 3420
acgtattaaa tttttggtat acggaggcaa atgcatagtg ctcatacgaa gctttcaggc 3480
atggcaataa tgtctcttcc ttgcaaatag aaccgtcatc agtatcttta cgttgcttgt 3540
aagtatgata taaataaatg gtttgctgga gattctgcga aggaaa 3586
<210> 38
<211> 5803
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 38
cctgagaacc gtcccatggc cgaccggctc ctctccactg tccctcacca ccacagcctc 60
ccggaaaact acatccggcc ggaatctcaa aggcctcgcc tcgccgaagt catcagcgac 120
gcccacgtcc ccgccgtcga tctgagctca cccgataagt ctcatgtgat cgctcaaatc 180
gccgacgcct gccgatcgta cggcttcttc caggtgtctt tccgtgagca ggcaacgtaa 240
ggtacttctt ctatgttgga ccccgtgtta ctggcttgtg gtctttatag gtgttgaacc 300
atggagtgcc agttgagctg atggtgaaga tgatggtgat cgctctggaa ttcttccgcc 360
tccctccgga agagaaggcg aagcactact cggatgaccc ggccaggaag atgaggctgt 420
caacaagctt taacatccgg aaggagacgg tccataattg gagagactat cttcgtctcc 480
attgctaccc tctggaggac tacgtgcccg agtggccttc caatccttct tcattcaagt 540
gagaactaag ctcccctcct cctgcatgct cttcctctct tcttccccct cgctttgcat 600
ggtgaaccat gtcagcaaag gatttcttag ctacatggtg ccaaacaaga cctgtttcac 660
ctagtaacct atctagcttg aaggtcttat ttatcctttc ttttctcctt tcgagaaaag 720
caataatagt ctcagatgtt catctgcagc taaaagcagc gagttttgaa ccctcatata 780
tgccattagc aacctatttt gaggaagcgg tatgcggcca ttagctcttg atatataata 840
taatctttgt gtgcaaacct ctccttatgt gtcagtcttg taggagagat tgtgtagaat 900
ccttaactat tctttatctt gaatattatt cccgataaaa agcaagaacg aaccatggtt 960
acaagtcttc tatgaggaac ctttgtatca tctacatcat gattctgatt ctgatagaat 1020
gcacattgtc attgacatga catgctttga taatctaaca aaaggacatc agactatata 1080
gtacttttaa tagtggacat gaccgacgtc gggcttatcg agataaatta aatcgtgttg 1140
gaatatatgt cctaatctga tgtatctgca caaactgtga agatggacta ttgcggcatc 1200
ttgcgaggaa tttgatgtgc ttggctttgt cagggaagtg gccagcgctt actgtaagga 1260
agtccgtcaa ctaggttttc ggctcctggg agcaatatct ctaagcttag ggctggagga 1320
gaagtacatg gaagaggttc tgggggagca agaacaacac atggccgtca actactatcc 1380
caagtgccct cagccgcagc tcacatatgg tctgccaccc cacacggatc ccaatgctct 1440
cacaattctg cttcaggatc ccgacgtctc tggcttgcag gttctcaaac acggccaatg 1500
gatcgcggtg catccccaac cccacgcctt cgtcatcaac atcggcgacc agctgcaggt 1560
gacagcgcct ccctcatcct ctcttgcact tctattttta gtttttgaat tacataaatg 1620
aaagaagaga tcatataaat gcaatttttc ttaaatagta accattttta aaataacagc 1680
atcaagatat tagctcagat caaataggaa aaaaaaataa gatcgaagta tatatatata 1740
tatatatata tatatatata tatatatatt aaagatataa aatactaatt taaatcaaga 1800
aatccttatc tttaaaagtc tatctaatca acttatttaa aggacaaaag ataagaaact 1860
taaaatcatc caaaagataa tactttaaat cttagcattt ctctttaaat tataatttta 1920
aatctggggc gacatcacat gtgcaataga agaacaaaaa ataaaaatat caaaattttt 1980
catagaaaag aaggtttcat cgtcgtatga agattggtgc gtaaaaattc acggaactga 2040
aaaaccacgc gtgttaaggg atgtgtgtta cctaggaaga tcgtatatcc ttgaaaacgt 2100
atagatctat gagagaggat gaaggaggtt aattgtctat ctctctagcg gtgtttcata 2160
tggtatgagc tatgaagacg ctcctcaaat cgctgctcaa atctattcac tatgtgcacc 2220
atacaatcaa gaagggggca acccttctta ttgttcacat gttaataggg gctattgacc 2280
gaaaaggaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaagaatagg aggtgaaagc 2340
caaaaggggt ttagcttata gccctttggt ttcctcctat ttatagaagt catctgtcaa 2400
cttaactcta atggatcata ctatattggg tattggatct ccatccaatt acccaagctt 2460
cttagattaa tgagtcttta tccaatattc tcttattgga tatcatctat aggattgaat 2520
aatttatatg cttattagat atccaataac ataataagat aggggctcta gtgaatatct 2580
catatccgaa cacctactcg tcataacaca taccatatat gtaaccatct aaccttaata 2640
tcaagttggc gaatcatacc tatcagaact ccttctgact cagtaaatta ttatctccat 2700
aataattcac ttgactcatc gactacggat atattatacc actacgtcgt agtctctatc 2760
tgatatagga gaatctaatc tattggatat atctgtcctt agttcccata tatcgatagt 2820
ctctcatcta tctaatatct catagatcat attccgagca tggtgctgtc aaactcatac 2880
gatgtctact caagtcacgc tctaatcgga ttctcccaaa gaactctttc tctttcaatc 2940
cgaatgacct tagctaggga tttgcctgag caagaataca tgagatattt ctctcataac 3000
ataaagagtg gatcctctat caacactcaa tagcctttgt aaggttggct gtcactccct 3060
atgatcgact gtactagaat tggaacttta aagtctataa gtttgatata aaagagtgga 3120
atactcatac aaaacatcct tagtatctca agtttaagga tcatatacac tactaagata 3180
acggaatcac tatatgacaa tatggtatca ttaaccatct agcattttgt gagcagatca 3240
atcagtgaac tcattctcca ataagtacct acgcattatc cctagtgtcc cacacgacga 3300
gaccagttgc ctctaatact tttatttaag ttatgcttta tcttttagac ttatttgtaa 3360
gttttaacgc atgatctcaa gttttatttt tatctagagt ttttatttct tcatcgatga 3420
tatcctccta ctccctaaca ccttttttct tcattaaaat aaataggttt aaaagaaata 3480
atgacttatg ctacattatc tccatctcta taacatgctg gcttggtaat tattttttta 3540
tcttctcaat gttaaaattt tcacttcatg aacatcatta ctccctcgtt tactttgccc 3600
caccattagt gacaaagaaa taatagaagt agatatatac aaagaagaaa ataagtgaaa 3660
attataagag tattaaatga taaaggagac ttaatcatac gttttaaata tatatcattt 3720
ttactattgt gattgatatt taaaaaaaac tatttatgga ggataataag aagaaacttt 3780
atcaaacata atatctcgag ataccacata cttatttgtt tatggatcca tgcatttcaa 3840
tctttctttc tttcatcata gtcaataaag ataatttttt ggtcttaata aagataatgt 3900
gaatatagca caaagaacca aatactttat aatgaataac gtttaatttc ataccaaaca 3960
tgagcctata tgaataattt agattaattg gattgaaagg aacttgatta ataatataag 4020
ttacttaagt catctttcta cttataactc tttctttaca aaatagatcc aagtaaatct 4080
tataaaatca ttaataaaga aaagcatata ataaaaattt gaataagata aagtttgagt 4140
aaggcttgtt agattgatgt gaacaagctt taagagaaat ttacacctcg aaaataatat 4200
atcaaaaggt tagttgtgtg ctttgtgata ttgacaacct tgataaactt tattatggtt 4260
aaaagtagta atatggttaa ctagactttc tacatcataa tttttaattt gaaaaaattt 4320
atatgaccaa gtctagcatg ttagatgttg ataaaatata taaatctttg acccttttat 4380
tattgtgtat aacatctata tttaattatt ttatattata aaaaaactta acttttttat 4440
gatcaataag aatataattt ctaacatcaa ctacatttgc agtagaaaaa taaaatttct 4500
tcacatgata cacattcttt aatgtaatag aattattatc cttatctgag attataatat 4560
taccttcatg atgtctccat cttcccttag gagataaaga ctcccaataa attctctaga 4620
tcttatcgtt ggactgatcg agaagctcga tactaaattc accaacttga ctattataat 4680
ttataatcga aaaaaggtca tcatcttgaa atatagatta tcactattat ggttctgata 4740
ccatgtaaag aaaatgagag atcatataca agtacaatca gttcttaaat aataataata 4800
agaatcaaat aaaagaagaa gaaatcaaga tgtactaaaa acagaaaagc tatattgaac 4860
ttctcaaaaa gaaaaatata aaaatattta caagatattg aactattttt tgacttgagt 4920
tgtatagact tgaacactta aaagacttaa ataaatttac atatataggc atcatctatt 4980
tataggtgta gaataaaaat ttaaatcaag agattctcat ttttacaagt tcatctaatc 5040
aatttattta aaagataaaa aataaaaaat attaaaattt tctaaaatat aatactttaa 5100
atcttaagat tacacctcat ggcttcccaa ttcacttcac tatattttgg tcatcttgca 5160
ctcgattctt tgtttataaa gaatctattg atgcattaca aattagactt ttccttagtc 5220
cgacatatga aaagaaatgc atgcatcttg tagtagcata cactaaccac tataatgttg 5280
tggaatcatc ctgttgattt tatgttaagt gacctttgga ttttctttta gtttccaagt 5340
tcttctctct atctaacaac ataatcgatg ccttgttatg aaagaggcag aaaagctctg 5400
catgaacaaa ggtttcactt tgccactgga gccatatttc cgtaagtttc atattaatgg 5460
ctatatcatt gcaggcattg agtaatggta ggtataagag tgtttggcac cgagctgtgg 5520
tgaactcaga gaaagagagg atgtcaatag catcattcct ctgtccctgt aactgcgcca 5580
tcattagccc tccggagaag ctcatcagcg aggcatctcc ggccatgtac aggagctaca 5640
cctacgagga gtactacaag aagttttgga gcagaaactt ggatgacgag cactgcttgg 5700
aggttttccg aagctaaggt gtatctatca atgaacactg tgttcgttgg acaatgccac 5760
cctagttagt aatgttggga aagaaggcat gaggctaaaa caa 5803
<210> 39
<211> 2099
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 39
cctccgccgc ttctcaagtc cgaccaccac aaccactttc tttgctgctt cctcagcaaa 60
gaccgcagga tggaggtgga gagggtgcag gccatcgcgt ccctgagcgt ggccaccaac 120
gacataccgc cggagttcgt gaggtcggag cacgagcagc cgggtatcac cacgtaccgc 180
ggcccggtcc cggagatccc ggtgatcgac ctcgaagacg gggacgaagg ccgggtgacg 240
cgcgccatcg cggaggccag ccaggagtgg ggcatcttcc agctggtgaa ccacggcatc 300
cccggggagg tgatccgggc gctgcagcgc gtgggcaggg agttcttcga gctgccaccg 360
gaggagaagg agaagtacgc ggcggcgccg gggagcctcc agggctacgg aaccaagctg 420
cagaaggact tggaaggcaa gaaggcgtgg gtggacttcc tcttccacaa catctggccg 480
ccgacgcacg tcgaccaccg cgcatggccg gagaatccag tggattacag gtgcccgctc 540
ctacctctcc ttgcacgaca ctacgcttgg tccaatattg tctaatatac tgttctctcg 600
cttatctcat gcagcactta tatgtgtcac cagcacttgt atggtctctc tcttctgcct 660
atacgacact acctttcctt cctctttcta ggactgttta atttgatgta ttataaatct 720
ataacccaat ttagattgta ttcttaaatc tttttagatc tctaataata ctttcgatat 780
ttttgttaga agtaaaatct ttaattatga ggaagtgtga ggactctaat ttttgcgtgt 840
actttataga tataatattt caagtagact ctctctttaa tataatatta aaaatatttt 900
atctaattca acaaaagtca attatttgtt taaagttgat agaaatagat taatcttagc 960
ataattaatt attacgagaa aaattctttt aaacaccaaa tcaaaatcat tatctctatg 1020
tatatttctt agaatttaga tctaagacac ttccctatct cctgtcttca tgttaaattt 1080
gaatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 1140
atatatatat aaaatcattt ctgtggaata tttgtcttaa acaccattcc tgtggggggg 1200
agtgacatgt cacgaggaac tcaggtttcg tcttctcctc tcacgttaag tattcatcca 1260
cttccatcac attaaattat gtgcaggaga gttcatctaa cctaattatt tcaggaaggc 1320
aaatgaggag tacgccaaac atttggtggg attggtggag aagatgttgg taagcctgtc 1380
caagggactg gggctggagg ccgacgtcct caagcacgca gtgggagggg acgacttgga 1440
gttcctcctc aagatcaact actacccgcc gtgcccgaga cccgacctcg ccctcggcgt 1500
ggtggctcac accgacatgt ccgccatcac catcctgatc cccaacgacg tccccggcct 1560
ccaggtcttc aaggacgacc actggttcga cgccaagtac gtccccgacg ccatcatcgt 1620
ccacatcggg gaccagatcg aggtatgcag acctcaaact atgcttcctc atcaatttca 1680
tgtgctgatg acgagtggtt gcagaaactg agcaacggca ggtacaagag cgtgctgcac 1740
cggacgacgg tgaacaagga gaaggcgagg atgtcgtggc ctgtgttctg ctccccgccg 1800
ggcgagacgg tcattgggcc tctgccgcag ctcgtcagcg acgaacagcc cgctcagtac 1860
aagacgaaga agtacaagga ctatgctttc tgcaagctga acaagcttcc gcagtgaggt 1920
cgcaccgggt tcttcttgca tgacggtatt gctgtacttt gccttatgtg tgggtccctt 1980
ttaagctcat atagtggtct ctgtccactt tgagttggca taactccgtt ggagcagaag 2040
gtggatcccg ctccatcctt cttatctaat aaacgaatat ttggatgtaa gccatcagc 2099
<210> 40
<211> 1483
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 40
gcaacctcga ccttcctcgg ctgtccaagt attctctctc tctctctctc tctagatctg 60
tgcctccctt ccatggccga ccaacttctc tccaccgctc ctgactacca tagcctcccg 120
gagaactaca tccggccgga ggatcaaaga cctgttctca ctgaagtcgt cagcgacgcc 180
cacatccccg ccatcgatat gggggctccc gataggtctc acgttgtctc tcaaatcggc 240
catgcctgcc gatcttacgg cttcttccag gtctcttccc acacacatac atcacaggat 300
tctaccgtgt tcagacttgg gagtgcgctg tatgattact ggcttatgtt cgtgtatagg 360
tggtgaacca tggagtgcca gttgagctga tgctgaggtt gctggtggtc gctcgagaat 420
ttttccacct ccctccgacg gagaaggcca agctctactc ggatgatcca accaagaagg 480
taaggctgtc aacaagctcc aacatccgga aggagacgat ccgtaattgg cgagactatc 540
ttcgtatcca ttgctaccct ctcgaggagt acgtgccgga gtggccttgt gatccttctt 600
ctttcaagtg agaactaaga ttaattgagt gttctcctcc tcctgctctg tcctctcttc 660
ttcctcaaat gtgcatgacg tgctctatgg gcttagtact ttactctcat ctaagaactt 720
tcaccaacaa cagttgaagt attatcaatt taatacaccc taaagttgcg atgactttat 780
attgttcttt ggcagggaag tcgtcagcgc gtactgcaag gaagtccgtc aactgggcct 840
tcgtctcctg gaagcaatat ctctgagctt aggtctggag gaggactgct tggtgaaggc 900
gctgggcgag caaggacagc acatggccat aaactactac cccaggtgcc cgcagccgca 960
gctcacatac ggtctgccag cccacacgga tccgaatgct ctcacaattc tactgccgga 1020
tccggacgtg gctggcttgc aggttcttaa agatggccga tggatcgccg tagatcccct 1080
tgcccacgca tttgtcatca acatcggcga tcagctacag gtgaccaccc ttggcttgct 1140
gatgatccat atattcttgc gttgccatta gctttaatgg ttatgtcgtt gcaggcgttg 1200
accaatggta agtacaagag tgttttgcac cgagctgtgg taaacccaga gaaggaaagg 1260
atatcggtgg catcatttct ctgtccgtgt aactatgcaa tcatcagccc tccagagagg 1320
ctcatcagcg agggatctcc ggccatgtac aggagctaca cttacgagga gtactacaag 1380
aagttttgga gcaggaactt ggatgaggag ccctgcttag agctgttcca aagctaattg 1440
tacaaacgaa gggacagccg aaaccaaata aaagtatatt ttg 1483
<210> 41
<211> 2049
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 41
ctgaatggtt ggttacttcg tccgtccgtc ctcgccctac ctatctctaa gtcccacacg 60
gtcctcatgt ctctcctatg ctctccgtcg tgcttcgtcc atggcagacc agcttctctc 120
cacagtaacc caccacggct ccctgccgga gacctacgtc cgtccggagt cgcaaaggcc 180
tcacctaaat gaagtcctcc gcgacgccga cgtccccacc atcgatctcg gctcaacgga 240
cttgtcgcag accgtagcgc aagtcgccga cgcctgcagc acctacggct tctttcaggt 300
gcatgtccag cttctgcaac ctgggacaaa cctactgctg cgtgcttcaa ctgttccttg 360
ctgtatatgt gtgtgtgcag gtggtgaacc atggagtgcc gatcgagttg atgctgaaga 420
tgatggcggt ggctttggag ttctttcgcc tcccttccga agagaaggcg aagctctact 480
ccgatgaccc tgccaagaag atgaggctgt cgacgagctt caacgtccgg aaggagaagt 540
tccgcaactg gagggactat ctccggctcc attgttatcc tctcgaggag ttcgtgcctg 600
gttggccttc caatccctct tcatttaagt aagtcttctc ccaatttttt ctcttcagga 660
aagtccaaga atatacatat tatacatata tatattcctc ttcctctttc ttcttctcct 720
tgcatctctt aggggttgat tccagctcca tatctgtggc atatgattca tcaatagcaa 780
ggaaaggata agataatcct ggagacctgc ttcttttagc cgatcgtcat attgggatag 840
gaatcttgac atgtaagcca ccaccaaaat ctcctgagat tttgatagag tccaattgtt 900
ttttgatgtg atgagcttag aagcatagaa aaatgtggaa ctggtccact gaatggaatc 960
ttctttcacc taaagaagat tccaatgttt cttttttctt ttccttttga tcggtacaac 1020
atgcagaaat ttcaaagatt aatttcaact ctcttaagga gaaaaagaaa agaaaatgcc 1080
aataatgatc aaccagatta tatgacttca cccgaagcaa cacagttcat tttgtactgt 1140
tatgttgtca gggaagtggt cagcagttac tgcagggaag tccgtcaact ggggtttcga 1200
ctcctcggac taatatcgat cggcctggga ctggaggagg actacatggc gacggtgctc 1260
ggcgagcaag agcagcatat ggccgtaaac tactacccaa agtgcccggc gccggagctc 1320
acgtacggtt tgcaggcgca caccgacccg aacgccctca ctctccttct tcaggaccca 1380
gacgtggccg ggcttcaggt tcgtaaggac ggcaagtgga tcgctgtcaa tccccaaccc 1440
aacgcattcg tcgtcaacat tggtgaccag cttcaggtat cggcatatac ttctgctgct 1500
gattgtttct ggagttgttt gcataggtta tgcaatcatc aagtcttgcc gtcccgaaaa 1560
gctgatgaaa catggtcgac atggattacg tcgatgcatg caggcactga gtaatggaag 1620
ataccggagc gtttggcatc gggctgtggt caacgcggac aaagagagga tatcggtggc 1680
gtcgttcctt tgtccctgca acaatgccat catcagccct ccggagaagc tcgtcgccga 1740
cggatctccg gccatgtaca ggagctacac ctacgacgag tactacaaga agttctggag 1800
cagaaacctg gatgacgagc actgcttgca gctcttcaga agctaatgcc taatgctgct 1860
gcccgtggca tgcaacagga tgagtgctct acgtggcaac cttgctgatg tggacatctc 1920
ggattggtca aaagtgggac gatttcatga catgtctcgg cagcgtttcg gcttttgtgt 1980
agtaagacaa ataatgtttg accgtatttt gacttcaata aactaaaaca ttgcaaggga 2040
ataataaat 2049
<210> 42
<211> 1658
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 42
gaagcaagac aaccaagcga agcttctctc tctataaatg ttgtcgaagc tgctacctga 60
ccaaaccaac cgagctgaga ggtgttagtc ttcgttaagg ggtgtgtgtg tgcgcgcgct 120
tgcttcgcga gatggccaaa tcgagctttc agcgtatggg atcgtccatt cacgtcccga 180
gcgtccaagc tcttgcagct tccatcgcaa acccggctga tgtccctcct cgattcgtca 240
ggccggaagc caaggctgat cccgtcgcta gcgacggtga aagcgagctt ccggtcatcg 300
atttctccag gctcctccat caccgtttct ctcgggaaga gtctgctaag ctccaccacg 360
cctgtgcaga ctggggcttc ttccaggtca gtcgatctac ggatcaaaac cgtgtgatcg 420
atagctgcaa cataacaaat cgttgatgct aacttacagt tgataaatca cggagttccc 480
gatcaagcga tggaaaagat gaaggccgat atagcagaat tctttaagct tcccttggaa 540
gagaagaagg catttgcgca gttgccgaac agcttggaag gttacggcca agccttcgtc 600
gtgtctgacg accaagagct ggactgggcg gacatgctgt acctcataac tcgaccactc 660
cagtcgagga acatcgatct ctggccagca caacctttca ctttcaggtt tatctcgatt 720
tcttgtgctg tcatctactc agcggttcag ctacgtactt attacgtaca tgacgtcctt 780
tgctgccgct tcatgccgtc agagactctc tctcttgcta ctccatggag ctgaagagcg 840
tggcaggaac tttgctggag gtgatggcga agaatctggg ggtcgcaccg gaggagttct 900
ctactatatt tcaggaccaa ccgcagggag tgaggatcaa ctattatccc ccatgtccaa 960
gggctgacga ggtgttgggc ctctcgccac acacggacgg cagcggcttg acgttgctcc 1020
tacaggtgaa cgacgttgaa ggactccata tcaggaaggg ggggaattgg ttcccggtga 1080
agccactccc cggcgctctc atcgctaaca tcggtgatat catcgaggtc attaactcga 1140
ctcaaactag tcaaaattag caatcaagtg cgatactaat tcaattcaaa aaaaagttgt 1200
ttatctcaat atttactaat gtaaaattat tattattatt tttttaatct tttcttacgt 1260
ataaattatt ttctaacaaa aacaaaagac tttcggaata gatattgagc aacggtgtat 1320
acaaaagcat cgagcatcgg gcgataataa acgccaagga agagcgcctc tcgatcgcta 1380
ccttccatgg gccaagagaa gattcggtga ttggtcctct tgagatcgtg aagggataca 1440
agccgaagta tgtttcgatg agctacaaag agttcatgaa agcttacttc tccacaaaac 1500
tggaagggag gagacttatg gaaagcctca agttataaaa gtctctaatg ttagaaagtt 1560
aatggtgtgt tgcttgaact taataataag tgtgtttcgg gataatgcta tctactttat 1620
cgaagcatca aataaacacc tagtgttgtg tatatgaa 1658
<210> 43
<211> 3064
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 43
tccgccttct ccctttattt gtgcagcgtc tcgaagctcc ctttcgatac ctctgtctat 60
ctcatggcgg atcagctcct ctccaccgta acttaccacg agacccttcc ggagaactac 120
gtaaggccag agtctcaaag acctcgtctc acacaggtca tcagcgacgc aaacatcccc 180
atcatcgatc tcggttcacc ggataagtcc cgaatcatct cccagatagg gaaagcctgc 240
caatcctatg gcttcttcca ggtcattgaa ttccgactac ccagcttctt cctttcctcc 300
tcaactgtat gctgagtatt tcccgggtta ttcgtttgta ggttgtgaac catggaatcg 360
atactgaatt gatggtgaag atgatggcta ttagtctgga attcttccgt ctacctcccg 420
aggagaaggc gaagctctac tccgatgacc cggccaagaa aatgaggctc tccacgagct 480
ttaatgtcag aaaggaggcg gtacacaact ggagggacta cctccggctt cactgctatc 540
ctctggagga atacgttccc ggctggcctt ctaatccctc ttcattcaag taagttattc 600
gtgcttctcc tcctcttctt ctctttagtc ggacagtaat agcataagaa tagtcaaata 660
atttgagtat gtactgaaaa aaaaaggtga taataagaat aataataata aataaagcat 720
tgatgtaaag actgctggaa tacccatcga atctctatgt agcgattgga caggtgcata 780
ttaccagtat gcttgattcg ataggctcgc atcttgatgc tggttaagaa tctgatgctg 840
ccagagcatg atgcatgtat aggagaaaca ctccagttcc cttaagtcgt cactagaatt 900
tggttctttg acgagagtag cagtgtgcat gaagccatta gctgctgatg atgatggatt 960
atggttgatc acttggaatt aatacttcat gtctctggat cttatgattg gtcattgtcg 1020
tagaagacaa acatggctgg aaaatataat ctgctgaggt aagaacattc tagtggggga 1080
atcttcatcg tgtgaggcag taccaaacct tccttgtggg atatttttag atttttttat 1140
aggactgaca gtaacatggt tatctatacg gagatttcat aacatggact aataaatcaa 1200
gggaaaacac aaggtttcat gaaagtttgt ggaagacaag atccgggtca gtacgaacct 1260
ctggtcagaa aataggtgca ctcataaaag caccattccc ggagtcatac aagacatccc 1320
acttagagca gtgcatttaa atatggggaa acagatgact caaatcctgc atgtgcaggc 1380
acatgttcac agtcgcagaa cgtatgcatc tgcaaatggg tctgcaataa aagttcttta 1440
actggatggt cccgtttctt gatgattaag tttgaagaga ttgctgcgtt gttctttctg 1500
ttgtgtgtgt tccagggaag tggtgagcac ctactgtaag gaagttcgtc gactgggatt 1560
tcggctcctt ggagcattat cattgagctt aggtttggag gaggagtaca tcgaacgggt 1620
gctgggacag caggagcagc atatggccat caactactac ccaaggtgcc cggaaccgga 1680
gctcacatat ggcctgcccg cacacactga tccaaatgcc ctcaccattc ttctccagca 1740
gcccaacgtg gctggcttgc aggttctcaa ggacggcaaa tggatcgcag tggaacccag 1800
accgaatgcg tttgtgatca acatcggtga ccaactacag gtgattgcta atcacacact 1860
cgttctatct cgttaggaga tcctgatacc taaaaacaaa ggaaaagcac ttctttcttg 1920
cacgaatcaa ggaaaagcac cttatttttt gatggtgtta aggaccatgg tttgtagttt 1980
agagttgccc tttgaacgcc atggtcagac gcactggccc atttcctcgt tttgctgagc 2040
ttgcctgcca tgccctgcac atgacagcgt gcagctgagc tttggcaatt atcccaatcc 2100
tgcccatgtc taagtagcaa taatgttttt ccagcaacca gaccgcttga tcccagtctc 2160
tgtcttcgtt ttctactcac agacatatgc aactcttcca gaggcattca caatgtttgc 2220
cgatagcatt gtgggcttag gcgatcttgc actttatata ttaaatatgt aaatcggttc 2280
ttgtgctcta ctttcagatt tccatttgtt tatgttcaat tactactttt cttttcctcc 2340
aatatcgtcc tcctagtttg tgcatcagag aagcactaaa tctatgatgc tgctcccatc 2400
tcacatatga tatcagccta tcggcttaaa gtaaaagtgt gatgaagctt tggaaaagct 2460
gcagacgatt aaatattttc acgcaggcat taagcaacgc cagattcaag agcgtttggc 2520
accgagctgt agtcaactcg gacaccgaaa ggatgtctgt ggcgtccttc ctctgtccat 2580
gcaacaccgc gatcattagc cctccggaga agctccttgc cgagggatca ccagcggtct 2640
acaggagcta cacatacgac gagtactaca acaagttttg gagcagaaac ctggatgacg 2700
aacattgctt ggagcttttc aaaggggaga agagccaatc aggtggactg agcggcccct 2760
gcaaaagctc gacatgatgt gacatcacac ggacagtgct tcttcgtgat gctggttgat 2820
tccgttcatc atgtggagca caaattattt gcggagactc tcgtgttgtc cacgatcgac 2880
agtgaggaga gttcggtggt ctgccctctt attgatttat ttattcctgc tttgccatgt 2940
tacctttcgc taccaaagca ctcgacttgt ctgcaccatg gagttcggag ctggcccgcc 3000
gtctccattt cttaaaattg gctctgtaat ccagtaactg cttgtatcat tgttttgttc 3060
tctc 3064
<210> 44
<211> 594
<212> DNA
<213> Musa acuminata
<400> 44
cccccgatgc gccactccat cgtcgtcaac ctcggggatc agcttgaggt ttgcgatctc 60
cacccggtct gcgccactac acgcttaaac agcattaaca ctggattctt ccgtgcaggt 120
catcacgaat ggcaagtaca agagcgtgtt gcaccgggtg gtggcgcaga cggacggcaa 180
caggatgtcc atcgcctcgt tctacaaccc gggcagcgac gccgtcgtct tcccggctcc 240
ctccctggtg cagaaggaag ccgagaagga cgacgtggcg gcggtgtatc ccaggtttgt 300
gttcgaggat tacatgaagc tctacgtgat acagaagttt caggccaagg aaccgagatt 360
tgaagccatg aaagccacgg ctcttcccat tcctacatct taagaacatc aacagtcgat 420
cctcatccaa ttcctgcatc tcaataatat gtcatcgtgg aagctaccag tatgcagtaa 480
gaacttagca aaggtcatgt aacgtaagca ccgttatgcc agtgagagtt cctaggcatg 540
tgttatctta aattagactt tttatctttg aggaaataag tggagcactg taaa 594
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 45
gactctaaga tcagggttaa agg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 46
gcagctaaca tcagggttaa agg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 47
ccaccggagc tcaggaaacc atc 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 48
ccggagcgca ttgtaatgag cgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 49
ttcatgggga aagcgagagg agg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 50
cctggacttg atgcagcagt gga 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 51
cgagatgctt gcgagaaatg ggg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 52
ccgacgccgg aggcatcatc ttg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 53
ccccgtctcc aacatttctg aga 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(23)
<223> sgRNA序列
<400> 54
ccgcgcccgg acctggtgaa ggg 23
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 55
atg agg atc tac ggc gag gag cac 24
Met Arg Ile Tyr Gly Glu Glu His
1 5
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 56
atg ggg ctc cac gtt gat gaa cac 24
Met Gly Leu His Val Asp Glu His
1 5
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 57
atg ggg att ccc ggt gac gag 21
Met Gly Ile Pro Gly Asp Glu
1 5
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(19)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 58
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 59
gtg gca ctg aat agg gag gag ttg 24
Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Leu
1 5
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(22)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 60
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 61
gag ttt cga gcc ttc ctg taa gca 24
Glu Phe Arg Ala Phe Leu Ala
1 5
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(23)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 62
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 63
gtg gca gcg aat agg gag gag ctg 24
Val Ala Ala Asn Arg Glu Glu Leu
1 5
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(27)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 64
gaa cgg gga agt tga cga cgc aat tac 27
Glu Arg Gly Ser Arg Arg Asn Tyr
1 5
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(23)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 65
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(25)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 66
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(20)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 67
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(27)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 68
atg gat tcc ttt ccg gtt atc gac atg 27
Met Asp Ser Phe Pro Val Ile Asp Met
1 5
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(18)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 69
ctc gag ctg gtc gcc gag 18
Leu Glu Leu Val Ala Glu
1 5
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(20)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 70
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(20)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 71
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(22)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 72
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 73
ggc tat ata taa gta gca acg 21
Gly Tyr Ile Val Ala Thr
1 5
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(20)
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 74

Claims (28)

1.一种香蕉植物，其特征在于：所述香蕉植物包括一基因组，所述基因组在一核酸序列中包括一功能丧失突变，所述核酸序列编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分。
2.一种增加香蕉的保质期的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)使一香蕉植物细胞经受针对一核酸序列的一DNA编辑媒介的作用，所述核酸序列编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分，从而导致编码所述乙烯生物合成途径的所述核酸序列中的一功能丧失突变，以及
(b)从所述植物细胞再生一植物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：从所述植物中收获果实。
4.如权利要求1至2任一项所述的植物或方法，其特征在于：所述植物缺乏编码所述DNA编辑媒介的一转基因。
5.如权利要求1至4任一项所述的植物或方法，其特征在于：所述突变是一纯合子形式。
6.如权利要求1、4或5所述的植物，其特征在于：所述植物或其中的原种已经通过一DNA编辑媒介处理，所述DNA编辑媒介针对编码所述乙烯生物合成途径中的所述组分的所述基因序列。
7.如权利要求1至6任一项所述的植物或方法，其特征在于：所述突变选自于由缺失、***、***/缺失(***缺失)及取代所组成的群组。
8.如权利要求1至6任一项所述的植物或方法，其特征在于：所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)及1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)所组成的群组。
9.一种核酸构建体，其特征在于：所述核酸构建体包括：编码一DNA编辑媒介的一核酸序列，所述DNA编辑媒介针对编码一香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分的一核酸序列，编码所述DNA编辑媒介的所述核酸序列可操作地连接至一植物启动子。
10.如权利要求2至8任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介是一DNA编辑***，所述DNA编辑***选自于由大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)及CRISPR-Cas所组成的群组。
11.如权利要求2至8任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介是包括CRISPR-Cas的一DNA编辑***。
12.如权利要求1至11任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)及Ma07_g19730(SEQ IDNO：27)所组成的群组。
13.如权利要求1至11任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g35640(SEQ IDNO：9)、Ma04_g31490(SEQ ID NO：8)、Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)及Ma07_g19730(SEQ IDNO：27)所组成的群组。
14.如权利要求1至11任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma04_g35640(SEQ ID NO：9)及Ma07_g19730(SEQ IDNO：27)所组成的群组。
15.如权利要求1至11任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述乙烯生物合成途径中的所述组分选自于由Ma09_g19150(SEQ ID NO：13)、Ma04_g31490(SEQ IDNO：8)及Ma01_g11540(SEQ ID NO：20)所组成的群组。
16.如权利要求1至13任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介针对多个核酸坐标，所述多个核酸坐标特异性地靶向在所述乙烯生物合成途径中编码所述组分的一个以上的核酸序列。
17.如权利要求1至13任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介包括与选自于由SEQ ID NO：47至54所组成的群组的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
18.如权利要求1至13任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介包括与SEQ ID NO：47所示的一核酸序列具有至少99％相同的一核酸序列。
19.如权利要求1至13任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47所示的一核酸。
20.如权利要求1至13任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47至54所示的多个核酸序列。
21.如权利要求1至13任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：47、49或50所示的多个核酸序列。
22.如权利要求1至13任一项所述的植物、方法或核酸构建体，其特征在于：所述DNA编辑媒介包括SEQ ID NO：51及53所示的多个核酸序列。
23.一种植物部分，其特征在于：所述植物部分为权利要求1、4至8、10至11任一项的所述植物的所述植物部分。
24.如权利要求23所述的植物部分，其特征在于：所述植物部分为一果实。
25.如权利要求24所述的果实，其特征在于：所述果实是干燥的。
26.一种生产香蕉的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)种植权利要求1、4至8及10至11任一项所述的所述植物；以及
(b)从所述植物中收获果实。
27.一种加工香蕉产品，包括基因组香蕉DNA，其特征在于：所述基因组香蕉DNA在编码所述香蕉的一乙烯生物合成途径中的一组分的一核酸序列中包括一功能丧失突变。
28.如权利要求1至8及10至27任一项所述的植物或方法或加工产品，其特征在于：所述香蕉植物是非转基因的。
CN201880046146.6A 2017-05-31 2018-05-31 用于增加香蕉的保质期的组成物及方法 Pending CN110892074A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1708662.0A GB201708662D0 (en) 2017-05-31 2017-05-31 Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
GB1708662.0 2017-05-31
PCT/IB2018/053903 WO2018220581A1 (en) 2017-05-31 2018-05-31 Compositions and methods for increasing shelf-life of banana

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110892074A true CN110892074A (zh) 2020-03-17

Family

ID=59270940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880046146.6A Pending CN110892074A (zh) 2017-05-31 2018-05-31 用于增加香蕉的保质期的组成物及方法

Country Status (14)

Country Link
US (2) US20200102570A1 (zh)
EP (1) EP3630983A1 (zh)
JP (2) JP7273033B2 (zh)
CN (1) CN110892074A (zh)
AU (1) AU2018275356A1 (zh)
BR (1) BR112019025498A2 (zh)
CA (1) CA3064502A1 (zh)
CO (1) CO2019014469A2 (zh)
CR (2) CR20190575A (zh)
EC (1) ECSP19090449A (zh)
GB (1) GB201708662D0 (zh)
IL (1) IL271043A (zh)
PH (1) PH12019550255A1 (zh)
WO (1) WO2018220581A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755490A (zh) * 2020-06-01 2021-12-07 广东省农业科学院果树研究所 基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6181065B2 (ja) 2011-11-28 2017-08-16 アルセロルミタル・インベステイガシオン・イ・デサロジヨ・エセ・エレ １７００から２２００ｍｐａの引張強度を有するマルテンサイト鋼
CA3134097A1 (en) * 2019-06-13 2020-12-17 Wim VRIEZEN Tomato plant producing fruit having improved ripening characteristics
US20210332379A9 (en) 2019-06-26 2021-10-28 Eg Crop Science, Inc. Identification of resistance genes from wild relatives of banana and their uses in controlling panama disease
CN111073903A (zh) * 2019-11-15 2020-04-28 青岛农业大学 利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法
WO2023111130A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Tropic Biosciences UK Limited Modified agrobacteria for editing plants
WO2024063076A1 (ja) * 2022-09-21 2024-03-28 学校法人玉川学園 生産方法、ブロッコリ、及び種子

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5886164A (en) * 1996-04-15 1999-03-23 Zeneca Limited DNA encoding enzymes related to ethylene biosynthesis and ripening from banana
US20100293671A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 National Taiwan University Composition and Method for Prolonging the Shelf Life of Banana by Using Interfering RNA
CN105802991A (zh) * 2015-01-19 2016-07-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因瞬时表达对植物定点改造的方法

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
CA1192510A (en) 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
JPS6054684A (ja) 1983-09-05 1985-03-29 Teijin Ltd 新規ｄνａ及びハイブリツドｄνａ
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
GB8608850D0 (en) 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
JPS6314693A (ja) 1986-07-04 1988-01-21 Sumitomo Chem Co Ltd 植物ウイルスｒｎａベクタ−
EP0270496B1 (de) 1986-12-05 1993-03-17 Ciba-Geigy Ag Verbessertes Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
ES2060646T3 (es) 1987-02-09 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Virus rna hibrido.
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
HU220773B1 (hu) 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
HUT70467A (en) 1992-07-27 1995-10-30 Pioneer Hi Bred Int An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
AU2848800A (en) 1999-01-14 2000-08-01 Monsanto Technology Llc Soybean transformation method
EP1945762B1 (en) 2005-10-18 2013-05-01 Precision Biosciences Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and dna-binding affinity
EP2181193B1 (en) 2007-06-07 2017-10-25 Agriculture And Agri-food Canada Plant transformation with cell penetrating peptides
US8722410B2 (en) 2007-10-05 2014-05-13 Dow Agrosciences, Llc. Methods for transferring molecular substances into plant cells
EP2292176B1 (en) 2009-09-07 2019-01-09 Nobel Biocare Services AG Implantation set
AR092482A1 (es) 2012-09-07 2015-04-22 Dow Agrosciences Llc Enriquecimiento de la clasificacion de las celulas activadas por fluorescencia (facs) para generar plantas
US9832943B2 (en) * 2012-11-21 2017-12-05 Nunhems B.V. Solanum lycopersicum plants having non-transgenic alterations in the Acs2 gene
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
AU2014308900A1 (en) 2013-08-22 2016-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company A soybean U6 polymerase III promoter and methods of use
IL293323B2 (en) 2015-06-18 2024-01-01 Massachusetts Inst Technology CRISPR enzyme mutations that reduce unintended effects

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5886164A (en) * 1996-04-15 1999-03-23 Zeneca Limited DNA encoding enzymes related to ethylene biosynthesis and ripening from banana
US20100293671A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 National Taiwan University Composition and Method for Prolonging the Shelf Life of Banana by Using Interfering RNA
CN105802991A (zh) * 2015-01-19 2016-07-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因瞬时表达对植物定点改造的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUIPING CHENG等: "Effect of Nitric Oxide on Ethylene Synthesis and Softening of Banana Fruit Slice during Ripening" *
***等: "香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755490A (zh) * 2020-06-01 2021-12-07 广东省农业科学院果树研究所 基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用
CN113755490B (zh) * 2020-06-01 2023-06-13 广东省农业科学院果树研究所 基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018220581A1 (en) 2018-12-06
CA3064502A1 (en) 2018-12-06
US20230365984A1 (en) 2023-11-16
CR20220425A (es) 2023-01-18
IL271043A (en) 2020-01-30
AU2018275356A1 (en) 2020-01-16
BR112019025498A2 (pt) 2020-06-23
JP2020521512A (ja) 2020-07-27
ECSP19090449A (es) 2019-12-27
EP3630983A1 (en) 2020-04-08
GB201708662D0 (en) 2017-07-12
PH12019550255A1 (en) 2020-07-13
US20200102570A1 (en) 2020-04-02
CO2019014469A2 (es) 2020-01-17
CR20190575A (es) 2020-01-24
JP7273033B2 (ja) 2023-05-12
JP2023071706A (ja) 2023-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106998665B (zh) 单倍体植物的产生
CN106164272B (zh) 修饰的植物
CN110892074A (zh) 用于增加香蕉的保质期的组成物及方法
JP2019523011A (ja) 植物における塩基編集のための方法
KR19980702463A (ko) 저온유도성 프로모터 배열
US10988775B2 (en) Wheat plants resistant to powdery mildew
WO2019038417A1 (en) METHODS FOR INCREASING GRAIN YIELD
EP3936519A1 (en) Method for cultivating plant resistant to gray leaf spot
CN112424364A (zh) 减少咖啡豆中咖啡因含量的组合物及方法
US20220364105A1 (en) Inir12 transgenic maize
CN115485386A (zh) 低生物碱含量的烟草属植物体及其制备方法
WO2022026554A1 (en) Inir12 transgenic maize
KR102516522B1 (ko) 반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도
CN104805100B (zh) 水稻基因OsSμBP‑2在延缓植物叶片衰老中的应用
CN113462661B (zh) 从玉米中分离的siz1蛋白及其编码基因和在品种改良中的应用
CN108517008A (zh) 水稻叶绿体发育调控基因OsFLN1及其用途
CN112194713B (zh) 一种与水稻胚乳淀粉颗粒发育相关的蛋白fse5及其编码基因和应用
JP2012223137A (ja) デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸、プライマー対、抑制剤およびモチ性ソバ属植物
JP2023526035A (ja) 標的突然変異生成によって変異体植物を得るための方法
CN118284331A (zh) 香蕉果实褐变的延缓或预防
KR20240031315A (ko) 바나나 과실의 갈변 지연 또는 예방
CN111164213A (zh) 增加从咖啡豆中提取固体的可提取性的组成物及方法
CN117858952A (zh) 编辑香蕉基因的方法
JP2023111899A (ja) 短葯形質を有するイネ、及びその製造方法
CN112760339A (zh) 一种快速驯化四倍体野生稻落粒性的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination