WO2024043238A1 - 超開花性ムギとその生産方法および評価方法 - Google Patents

超開花性ムギとその生産方法および評価方法 Download PDF

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WO2024043238A1
WO2024043238A1 PCT/JP2023/030178 JP2023030178W WO2024043238A1 WO 2024043238 A1 WO2024043238 A1 WO 2024043238A1 JP 2023030178 W JP2023030178 W JP 2023030178W WO 2024043238 A1 WO2024043238 A1 WO 2024043238A1
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wheat
gene
sof1
flowering
mutant
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PCT/JP2023/030178
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隆夫 小松田
大野　陽子
和広 佐藤
裕 久野
俊 佐久間
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国立大学法人 岡山大学
国立大学法人鳥取大学
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to wheat that targets the Sof1 gene and has improved flowering properties, and a method for producing and evaluating the same.
  • the world's grain supply is at risk of tightening due to various factors such as increased demand for food due to population growth, especially in developing countries, as well as decreased production due to frequent abnormal weather events and water resource constraints. As one means to solve this problem, there is a need to develop new varieties of grains that can increase agricultural productivity.
  • Hybrid vigor is a phenomenon in which the production capacity of hybrid first generation (F1) individuals exceeds the production capacity of their parents, and it has been utilized in the development of new varieties of various crops.
  • F1 hybrid first generation
  • Non-Patent Document 1 cleistogamy 1 located on the long arm of chromosome 2H
  • the flowering-type Cly1 gene (Cly1.a) of barley has the function of expanding the width and thickness of the lodicule, pushing the outer and inner shells outward from the floret, and mechanically causing flowering (Non-patent Document 2) ).
  • the difference in Cly1.a is caused by a single nucleotide substitution within the specific binding site of microRNA172 (miR172) encoding the sequence of Cly1. miR172-mediated cleavage of the cly1 transcript is reduced in the wild type with a.
  • translated CLY1 protein accumulates to a high degree, and the suppressed lodicules develop normally (Non-patent Documents 2 and 3).
  • Flowering type Cly1 By using A, it is possible to impart flowering traits to cleistoflowering cultivars. However, the flowering ability brought about by the gene alone is not sufficient to increase the production efficiency of hybrid seeds through cross-pollination, and there is still a need for a dramatic improvement in flowering ability.
  • the present invention has been made in view of the problems posed by the above-mentioned prior art, and its purpose is to provide a wheat with dramatically improved flowering ability, and a method for producing and evaluating the same.
  • the present inventors first screened for mutants with improved flowering properties by irradiating a flowering type wild barley line (OUH602) with gamma rays. As a result, they succeeded in selecting a mutant that exhibits the super-flowering trait with dramatically improved flowering performance.
  • the selected mutants were crossed with a flowering cultivar (Morex), and map-based cloning was performed using the F2 population.
  • Mcex flowering cultivar
  • map-based cloning was performed using the F2 population.
  • the gene responsible for super-flowering exists between markers HM7H234200 and HM7H246100 on chromosome 7H, and that this trait is controlled by a single recessive gene (the gene that controls this super-flowering trait). was named “sof1”). It was found that 43 annotated genes and 5 unannotated pseudogenes existed within this approximately 3.1 Mb candidate region.
  • this mutant was transformed into a flowering type Cly1.b gene. It was crossed with barley varieties Sv73528 and Adorra, which have the a gene. As a result, the lodicule of the obtained individuals was significantly longer than that of Sv73528 and Adorra, and showed the trait of super-flowering. From the above, it was revealed that the sof1 gene is the causative gene for the super-flowering trait. Furthermore, as a result of searching for homologous genes in other plants, the present inventors found that a gene corresponding to the barley gene also exists in wheat, and it was also possible to obtain a mutant that exhibits the super-flowering trait. Successful.
  • the present inventors have found that it is possible to improve the flowering ability of wheat by suppressing the function of the Sof1 gene (a wild-type gene corresponding to the mutant sof1 gene), and that the function of the Sof1 gene can be improved.
  • the present inventors have discovered that it is possible to evaluate the flowering ability of wheat based on the inhibition of the above, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • [1] A method for producing wheat with improved flowering performance, which includes artificially suppressing the function of the endogenous gene (a) or (b) below in wheat.
  • (a) An endogenous gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 5, 8, or 11.
  • (a) An endogenous gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 5, 8, or 11.
  • An endogenous gene encoding a protein consisting of a homologous amino acid sequence [3] A method for evaluating flowering ability of wheat, comprising the following endogenous gene (a) or (b) or its expression control region in wheat: A method comprising analyzing the base sequence of. (a) An endogenous gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 5, 8, or 11. An endogenous gene encoding a protein consisting of a homologous amino acid sequence [4] A method for evaluating the flowering ability of wheat, comprising analyzing the expression of the following endogenous genes (a) or (b) in wheat. Methods that include.
  • the present invention it is possible to produce wheat with dramatically improved flowering properties.
  • the wheat exhibits a large flowering angle due to the large expansion of its lodicule.
  • this trait is introduced into the pollen parent, it will facilitate the scattering of pollen, but if it is introduced into the male-sterile seed parent, it will facilitate pollination. This makes it possible to dramatically increase the efficiency of producing hybrid seeds through cross-pollination.
  • FIG. 2 is a graph (continued from FIG. 1) of wild type OUH602 (WT) and mutant 44205 (MT).
  • FIG. 2 is a diagram showing map-based cloning of sof1.
  • A High-resolution genetic map of sof1. The numbers between the markers above the linkage map line indicate the number of recombinants covered.
  • C Annotated genes with mutations identified by whole genome sequencing in a 3.1 Mb physical area. Arrows indicate the direction of transcription of annotated genes.
  • FIG. 3 is a diagram (continuation of FIG.
  • FIG. 3 shows map-based cloning of sof1.
  • A Structure of Sof1 gene. The boxes at both ends represent the 5' and 3' untranslated regions (UTRs), the boxes in between represent coding exons, and the thin lines represent introns. ATG and TAG represent the start codon and stop codon, respectively. The dashed line indicates the 22 bp deletion in the mutant.
  • B Structure of SOF1 protein. Each box (positions 1043-1334, 1359-1473, 1587-1661) indicates the domain of SOF1.
  • FIG. 3 shows characterization of Sof1 function by CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the gene structure of the Sof1 candidate gene (Horvu_MOREX_7H01G238100) and the mutants generated by CRISPR/Cas9. Exons and introns are indicated by boxes and lines, respectively. The inverted triangle indicates the target site of the guide RNA (gRNA) within the gene. The line on the Golden Promise (GP) sequence indicates the gRNA target site and the protospacer adjacent motif (PAM). Dashed lines indicate deleted bases.
  • B Scheme of phenotypic identification in F3 plants derived from crosses between the edited T1 line and two non-closing barley cultivars. The target genotype of each generation is shown in parentheses.
  • FIG. 3 shows a phylogenetic analysis of SOF1 homologues in monocots and dicots. The tree was constructed by the neighbor-joining (NJ) method based on alignment of polypeptide sequences of SOF1 homologs.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of Sof1 transcripts in the developing panicle with vegetative and reproductive organs between wild type OUH602 (WT) and mutant 44205 (MT).
  • DR double ridge stage
  • TM triple mound stage
  • GP glume primordium stage
  • LP lemma primordium stage
  • primordium stage primordium stage
  • SP stamen primordium stage
  • AP awn primal stage
  • WA white anther stage
  • GA green anther stage
  • YA yellow anther stage
  • flowering ability means a trait in which the angle of flowering increases due to expansion of the lodicule.
  • the inflorescence of monocotyledonous plants such as wheat, rice, and maize consists of a structure called a spikelet and contains one or more florets.
  • Each floret consists of reproductive organs (stamens and pistils) and is covered by a pair of bract-like organs (external and internal bracts).
  • the ⁇ lepidum'' exists between these reproductive organs and the glume.
  • the lodicules are generally considered to correspond to flower petals, and they are present at the base of the left and right reproductive organs (stamens and pistils).
  • the lodicule When the lodicule expands rapidly just before flowering, it mechanically separates the outer and inner halves, facilitating the release of pollen from the torn anthers, and then allowing the stigma to cross-pollinate (non-closing pollination). sex). In contrast, when the lodicules are unable to expand, pollen is hidden within the closed floret, thereby causing self-pollination (clistopolination).
  • flowering performance is improved means that the flowering angle is increased compared to the case where the function of the Sof1 gene is not artificially suppressed.
  • the increase in flowering angle is preferably 2° or more, more preferably 5° or more, even more preferably 8° or more, particularly preferably 10° or more.
  • the flowering angle is measured as the angle at which the line along the edge of the outer glume (the glume on the far side from the cob) and the line along the edge of the inner glume (the glume nearer to the cob) intersect in the floret of the panicle. can do.
  • the flowering angle may vary depending on the species and variety of wheat, but for example, the flowering angle of wild type barley OUH602 is usually 10.2 ⁇ 2.2° (FIG. 11 (left)).
  • "wheat” whose flowering properties are to be improved refers to all plants of the wheat family belonging to the Poaceae subfamily, Poaceae, and includes, for example, barley, wheat, rye, triticale, and oat. Moreover, it may be a wild species or a cultivated species. If wheat possesses the cly1 gene of the flowering type, the effect of suppressing the function of the Sof1 gene is less likely to occur. Preferably. If the function of the Sof1 gene is suppressed in wheat that carries the flowering type cly1 gene, then the flowering of the cly1 gene will be suppressed by crossing with wheat that carries the flowering type cly1 gene or by genome editing. It is possible to eliminate the negative influence of the cly1 gene by changing from the cly1 type to the flowering type (for example, single nucleotide substitution within the specific binding site of miR172).
  • the method of the present invention includes artificially suppressing the function of the Sof1 gene (an endogenous gene encoding the SOF1 protein).
  • the "Sof1 gene” in the present invention belongs to the SWI/SNF subfamily and is presumed to encode a chromatin remodeling ATPase protein.
  • the scales expand and flowering properties are improved, so it is thought that the wild type protein (SOF1 protein) has the activity of suppressing the expansion of the wheat scales.
  • the typical cDNA nucleotide sequence of the barley Sof1 gene is shown in SEQ ID NO: 1, the genomic DNA nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by these DNAs is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequences of typical cDNAs in wheat are SEQ ID NOs: 4, 7, and 10
  • the base sequences of genomic DNA are SEQ ID NOS: 6, 9, and 12
  • the amino acid sequences of proteins encoded by these DNAs are SEQ ID NOs: 4, 7, and 10. : Shown in 5, 8, and 11.
  • the Sof1 gene in the present invention includes these homologous genes as long as flowering performance is improved by suppressing its function.
  • the amino acid sequence of a protein encoded by a homologous gene usually has high homology with the amino acid sequence of the protein encoded by the specific gene.
  • "high homology” means at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). % or more).
  • Sequence homology can be determined using the BLAST program (Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990) 215:403-410).
  • the program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Karlin, S. & Altschul, SF., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-226 8, Karlin, S. & Altschul, S.F., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877).
  • homologous genes can be obtained using, for example, hybridization techniques (Southern, E. M., (1975) J. Mol. Biol., 98:503) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki, R. K. et al. , (1985) Science, 230:1350-1354; Saiki, R. K. et al., (1988) Science, 239:487-491).
  • hybridization techniques Southern, E. M., (1975) J. Mol. Biol., 98:503
  • PCR polymerase chain reaction
  • suppression of the function of the Sof1 gene includes both complete suppression (inhibition) and partial suppression of its function. It also includes both suppression of SOF1 protein activity (for example, activity to suppress scale expansion) and suppression of Sof1 gene expression (transcription suppression and translation suppression).
  • the function of the Sof1 gene can be suppressed, for example, by introducing mutations into the Sof1 gene or its expression control region (eg, promoter region). Mutations introduced into the Sof1 gene are not particularly limited as long as they suppress its function, and include, for example, nucleotide substitutions, deletions, additions, and/or insertions, but include frameshift mutations, nonsense mutations, and null mutations. is preferred.
  • the number of mutations introduced into the Sof1 gene is not particularly limited as long as its function is suppressed, and may be one or more (e.g., 2, 3 or less, 5 or less, 10 or less, 20 or less, 30 or less). or less, 40 or less, or 50 or less).
  • nucleotide deletions 22 base deletion [sof1 mutant], 5 base deletion [sof1-2 mutant]
  • the mutant protein is produced, resulting in improved flowering performance in barley.
  • the SOF1 protein encoded by the Sof1 gene has two functional domains (ATPase domain and SnAC domain) on its N-terminal side, but mutations in the C-terminal side, where these functional domains are absent, also cause the SOF1 protein to lose its function. Is possible. Therefore, the mutation introduced into the Sof1 gene does not need to cause the entire amino acid sequence of the protein encoded by the gene to be lost, but may be introduced into the gene so that a part of it is lost or changed.
  • the deletion is preferably 5% or more of the total, more preferably 10% or more, and more preferably 20% or more of the total protein. % or more, more preferably 30% or more, more preferably 50% or more (for example, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more).
  • Genome editing is a method of modifying target genes using site-specific nucleases.
  • Site-specific nucleases include, for example, Cas nuclease (CRISPR/Cas system), transcriptional activation-like effector nuclease (TALEN), zinc finger nuclease (ZFN), which is given site specificity by forming a complex with guide RNA. ), etc.
  • CRISPR/Cas systems include class 2 type II systems (including Cas9), class 2 V type systems (cas such as Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), and Cas12d).
  • CasY Cas12e (CasX), Cas14, etc.
  • Class 2 VI type system Cas includes Cas13a (C2c2), Cas13b, Cas13c, etc.
  • Class 1 I type system Cas, including Cas13a (C2c2), Cas13b, Cas13c, etc.
  • Cas3 Cas3
  • Other methods for introducing mutations into genes include, but are not limited to, physical mutagenesis methods, methods using chemical mutagens, and methods using transposons.
  • Physical mutagenesis methods include, for example, gamma ray irradiation, heavy ion beam (HIB) irradiation, fast neutron beam irradiation, and ultraviolet irradiation (Hayashi Y. et al., (2007) Cyclotrons and Their Applications, 18th International Conference , 237-239, Kazama, Y. et al., (2008) Plant Biotechnology, 25: 113-117).
  • HAJ heavy ion beam
  • Examples of methods using chemical mutagens include a method of treating seeds with chemical mutagens (Zwar and Chandler, Planta, 1995, Vol. 197, pp. 39-48).
  • chemical mutagens There are no particular limitations on chemical mutagens, but examples include N-methyl-N-nitrosourea (MNU), ethyl methanesulfate (EMS), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), sodium azide, and sulfite.
  • MNU N-methyl-N-nitrosourea
  • EMS ethyl methanesulfate
  • ENU N-ethyl-N-nitrosourea
  • sodium azide sodium azide
  • sulfite sodium azide
  • Examples of methods for introducing transposons and the like into genomic DNA include methods of inserting transposons such as TOS 17, T-DNA, etc. into the genomic DNA of plants (Kumar, A. & Hirochika, H., (2001) ) Trends in Plant Science, 6(3): 127-134, Tamara, M. et al., (1999) Trends in Plant Science, 4(3): 90-96).
  • individuals having a mutation in the Sof1 gene are usually selected from a population of individuals that have undergone mutation introduction treatment.
  • Wheat in which a mutation has been introduced into the Sof1 gene may be a heterozygote for the mutant gene.
  • heterozygotes can be crossed to create F1 plants, and homozygotes for the mutant gene can be selected from the F1 plants.
  • the sof1 gene (mutant gene), which is responsible for the super-flowering trait, has been found to be a recessive gene. Therefore, in order to improve the flowering ability of wheat by introducing a mutation into the Sof1 gene, it is preferable that the mutated Sof1 gene is maintained in a homozygous state in the wheat. Note that the unintended mutations can be removed from wheat into which unintended mutations have been introduced, for example, by backcrossing using wild-type wheat.
  • dsRNA double-stranded RNA, e.g. siRNA
  • a method using DNA encoding Sof1 gene a method using DNA encoding antisense RNA complementary to the Sof1 gene transcript (antisense DNA), and an RNA encoding RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the Sof1 gene transcript. It is also possible to use a method that targets the transcription product of the Sof1 gene, such as a method using DNA (ribozyme method).
  • the expression of the Sof1 gene can also be suppressed by modification of nucleotides in epigenetic control, which does not involve mutations in nucleotides.
  • epigenetic regulation include DNA methylation and histone chemical modifications (acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination, etc.).
  • the treatment for artificially suppressing the function of the Sof1 gene can be performed on wheat plants, organs, tissues, or cells, depending on the type of technique used.
  • organs, tissues, or cells include seeds, microspores, pollen, immature embryos, leaf sections, suspension culture cells, protoplasts, callus, growing points, panicles, and the like.
  • DNA e.g., DNA encoding the above-mentioned site-specific nuclease, DNA encoding a transposon, or DNA encoding double-stranded RNA
  • DNA encoding antisense RNA, DNA encoding RNA having ribozyme activity, etc.
  • the vector usually contains a promoter for constitutively or inducibly expressing the DNA.
  • promoters for constant expression include the U3 promoter of barley, the ubiquitin promoter of rice, the 35S promoter of cauliflower mosaic virus, the actin promoter of rice, and the ubiquitin promoter of maize.
  • promoters for inducible expression are known to be expressed by external factors such as treatment with specific compounds, low temperature, high temperature, dryness, ultraviolet irradiation, and infection or invasion by filamentous fungi, bacteria, and viruses. Examples include promoters that are
  • Agrobacterium method Agrobacterium method
  • particle bombardment method Agrobacterium method
  • polyethylene glycol method Agrobacterium method
  • electroporation method Methods known to those skilled in the art can be used, such as electroporation.
  • wheat with improved flowering properties can be obtained by regenerating wheat plants from the cells.
  • Methods for producing transformed wheat plants include Tingay et al. (Tingay, S. et al., (1997) Plant J., 11:1369-1376), Murray et al. 2004) Plant Cell Report, 22:397-402) and Travalla et al. (Travalla, S. et al., (2005) Plant Cell Report 23:78 0-789).
  • transformation and regeneration into plants are performed using the method described in Tabei et al. (edited by Yutaka Tabei, "Transformation Protocol [Plant Edition]", published by Kagaku Dojin Co., Ltd., September 20, 2012). be able to.
  • One embodiment of the method of the present invention includes analyzing the base sequence of the Sof1 gene or its expression control region in wheat.
  • an amplification product obtained by amplifying the Sof1 gene or its expression control region by PCR can be used.
  • the primers used are not limited as long as they can specifically amplify the Sof1 gene or its expression control region, and may be appropriately designed based on the sequence information of the Sof1 gene or its expression control region. I can do it.
  • control nucleotide sequence typically refers to a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (barley) or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 8, or 11 (wheat) or its expression control. This is the base sequence of the region.
  • the test wheat By comparing the determined base sequence of the Sof1 gene or its expression control region in the test wheat with the base sequence of the control, it can be evaluated whether flowering ability is improved in the test wheat. For example, if there is a difference in the base sequence compared to the reference base sequence (especially if there is a large change in the molecular weight or amino acid sequence of the encoded protein due to the appearance of a new stop codon or a frame shift), The tested wheat is evaluated as having a high probability of being a wheat that improves flowering performance.
  • Preparation of DNA for base sequence analysis can be performed by a conventional method, for example, the CTAB method.
  • wheat for preparing DNA not only grown plants but also seeds and young plants can be used.
  • the base sequence can be determined by conventional methods such as the dideoxy method and the Maxam-Gilbert method. In determining the base sequence, commercially available sequencing kits and sequencers can be used.
  • base sequence of the Sof1 gene or its expression control region in the test wheat is different from the base sequence of the control can be determined by, for example, PCR-SSCP (single- Indirect analysis can also be performed by known methods such as strand conformation polymorphism (single-strand conformation polymorphism) method.
  • Another embodiment of the method of the present invention includes analyzing the expression of the Sof1 gene.
  • analysis of gene expression includes analysis of the presence or absence and degree of expression (transcription, translation), and analysis of the molecular weight of the expression product.
  • Detection of the Sof1 gene at the transcription level can be carried out by conventional methods, such as RT-PCR, Northern blotting, and RNA-seq.
  • the primers used when carrying out the PCR are not limited as long as they can specifically amplify the DNA to be detected according to the present invention, and can be appropriately designed based on the already determined sequence information of the Sof1 gene.
  • detection at the translation level can be performed by a conventional method, for example, Western blotting.
  • Antibodies used in Western blotting may be polyclonal or monoclonal antibodies, and methods for preparing these antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the expression level of the Sof1 gene in the test wheat is significantly lower than the expression level of a variety that retains the wild-type Sof1 gene (e.g., OUH602 in barley, Chinese Spring in wheat) (e.g. , if the Sof1 gene is not substantially expressed), it is evaluated that there is a high probability that the wheat has improved flowering performance. Further, if the molecular weight of the amplification product or expression product of the Sof1 gene is significantly different from the molecular weight of the expression product of the wild-type Sof1 gene, it is evaluated that there is a high probability that the wheat has improved flowering properties.
  • the expression level of the Sof1 gene in the test wheat is significantly lower than the expression level of a variety that retains the wild-type Sof1 gene (e.g., OUH602 in barley, Chinese Spring in wheat) (e.g. , if the Sof1 gene is not substantially expressed)
  • the present invention provides a method for producing wheat with improved flowering properties.
  • the method of the present invention includes crossing the above-mentioned wheat with improved flowering ability with any other wheat.
  • Examples of "any other wheat” to be crossed with wheat with improved flowering ability include, but are not limited to, wheat varieties in which the function of the Sof1 gene is not suppressed and do not exhibit the super-flowering trait. . Wheat in which the function of the Sof1 gene is suppressed can be selected from among the individuals obtained by crossing by the above method.
  • OUH602 Plant Materials A non-closing wild barley line (Hordeum vulgare subsp. spontaneum) OUH602 was obtained from the Institute of Plant Science and Resources, Okayama University. OUH602 was treated with slow irradiation of cobalt-60 ( 60 Co) gamma rays (0.24 to 0.77 Gy per day, irradiation for 5 days per week) during the growth process from young seedlings. The OUH602 mutant (line number: 44205) was selected from M3 lines derived from 1600 M2 individuals based on the hyperflowering phenotype. For genetic analysis, the OUH602 mutant was crossed with the cultivar "Morex" to create a mapping population. Plant growth was carried out in a screened room (with natural light and no temperature control) or in an air-conditioned greenhouse (maintained at 24° C.) with 1 plant/4 L pot.
  • genotypes of recombinants identified with these two markers were determined by other CAPS markers developed within the genomic region of HM7H228700-HM7H254000.
  • the key F2 recombinants were further genotyped using the InDel marker (HM7H238100-Indel), and their progeny F3 recombinants (20 individuals) were also genotyped using the InDel marker. Genotypes were determined and lodicule size phenotypes were confirmed.
  • Genome sequencing of sof1 gene locus Genomic DNA was extracted from the leaves of seedlings grown for 2 weeks. The quality and quantity of gDNA was assessed using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc.). For Sanger sequencing, the primers used for PCR amplification and sequencing were prepared using NCBI/Primer-BLAST software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). designed and synthesized. The 20 kb genomic region of the sof1 locus was divided into approximately 5 kb overlapping amplicons for a total of 5 amplicons, and at least 20 sequencing reactions were performed per amplicon.
  • Each amplicon was amplified using the high-fidelity enzyme PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TaKaRa) according to the manufacturer's instructions.
  • the amplification reaction with a total volume of 50 ⁇ l was composed of 100 ng of genomic DNA template, 1 ⁇ PrimeSTAR GXL buffer, 200 ⁇ M dNTPs, 0.3 ⁇ M of each primer, and 2.5 units of PrimeSTAR GXL DNA polymerase.
  • the PCR program was performed with 30 cycles of "98°C/10 seconds, 55 or 60°C (primer dependent)/15 seconds, 68°C/4-5 minutes”.
  • PCR products were purified with the QIAquick PCR purification kit (QIAGEN) and cycle sequenced using Big Dye Terminator v3.1 technology (Applied Biosystem).
  • Each sequencing reaction consisted of an initial denaturation of 96°C/1 minute, followed by 25 cycles of "96°C/10 seconds, 50°C/5 seconds, 60°C/4 minutes.”
  • Reaction products were purified on an Agencourt CleanSEQ system (Beckman) and analyzed on an ABI Prism 3130 or 3730xL genetic analyzer (Applied Biosystems). Genomic sequences were aligned using Seqman version 7.1.0 (DNASTAR).
  • Each 50 ⁇ l PCR reaction volume contained 20 ng of template, 1 ⁇ PrimeSTAR GXL buffer, 200 ⁇ M dNTPs, 0.3 ⁇ M of each primer, and 2.5 units of PrimeSTAR GXL DNA polymerase.
  • the PCR program consisted of 30 cycles of "98°C/10 seconds, 55 or 60°C (primer dependent)/5 seconds, 68°C/1-4 minutes". Purification, sequencing and alignment of reaction products are as described above.
  • Genome editing by CRISPR/Cas9-mediated method The CRISPR/Cas9 system was used for targeted mutagenesis of the barley Sof1 gene.
  • Three guide RNAs gRNA, gRNA1: 5'-TGCATCCGGGAAGAAAACAG-3'/SEQ ID NO: 13, gRNA2: 5'-TGCTGCTATGAAGGAACCAG-3'/SEQ ID NO: 14 and gRNA4: 5'-ACCAGAAGAGAGAAGAAGGTAG-3'/ Sequence number: 15
  • WU-CRISPR website http://crisprdb.org/wu-crispr/; Wong, N. et al., (2015) Genome Biology, 16:218).
  • a pair of complementary oligo DNAs for each gRNA sequence is pHvU3, which was constructed by replacing the rice OsU6 promoter of pU6gRNA-oligo (Abe, F. et al., (2019) Cell Reports, 28:1362-1369) with barley HvU3. -15 and pHvU3-21 (LC672614 and LC672613, respectively) into the BbsI cleavage site. Next, the gRNA expression cassette and the pHvU3-15/21 scaffold sequence were excised with PacI and AscI.
  • the binary vector of interest pZH_gYSA_PubiMMCas9 containing the expression cassettes of Cas9 and hygromycin phosphotransferase genes was digested with the same restriction enzymes to introduce the gRNA expression cassette (Mikami, M. et al., (2015) Plant Molecular Biology, 88:561-572).
  • the conditions for DNA extraction, PCR, and sequencing were in accordance with the method described in the literature (Hisano, H. et al., (2022) Plant Biotechnology Journal, 20:37-46).
  • Genomic DNA cleavage, quantification, reverse transcription, and cDNA synthesis were performed as described above (see the sofl cDNA sequence part).
  • First strand cDNA derived from 10 ng of total RNA was used as a template for quantitative real-time PCR (qPCR).
  • qPCR quantitative real-time PCR
  • qPCR was performed according to the protocol using a CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad) and THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Kit (Toyobo).
  • the qRT-PCR data for each target gene showed the average expression level obtained by performing three replicate PCR reactions (three times per replicate) using each biological sample.
  • the expression level of the barley actin gene (accession number DN182500) was normalized in each sample according to the method described in the literature (Sakuma, S. et al., (2017) Plant Physiol, 175(4):1720-1731). was used as an endogenous control for Relative gene expression was analyzed using the 2- ⁇ Ct method.
  • RNA-seq profiling Plants used for RNA sequencing were grown in an air-conditioned greenhouse.
  • the panicle tissues were collected from wild-type OUH602 and mutant 44205 in four panicles at the vegetative growth stage (VEG stage), double ridge stage (DR stage), awn primordium stage (AP stage), and green anther stage (GA stage). were collected at each developmental stage.
  • Six biological replicate samples were collected at each of the four stages, with each replicate containing 12 shoots from 6 plants in the VEG stage, 10 shoots from 5 plants in the DR stage, and 5 in the AP stage. Contains bulk samples of 5 panicles from 1 plant, 3 panicles from 3 plants in GA stage.
  • RNA samples were immediately frozen in liquid nitrogen and transferred to -80°C for storage until RNA extraction.
  • RNA from samples of the Anohara stage harvested under screen room conditions and air-conditioned greenhouses was also used for RNA-seq.
  • Total RNA was extracted using the RNeasy Mini kit (QIAGEN), followed by removal of genomic DNA contamination using the RNA-Free DNase Set (QIAGEN).
  • the quality of RNA samples was assessed using an Agilent 2100 Bioanalyzer instrument (Agilent Technologies).
  • RNA-seq For RNA-seq, a strand-specific RNA library was constructed from 1 ⁇ g of total RNA of each sample using the TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (Illumina), and a strand-specific RNA library was constructed from 1 ⁇ g of total RNA of each sample using the TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (Illumina) and the Illumina HiSeq 150bp).
  • Heatmaps of gene expression data were visualized using the R package pheatmap v1.0.12, with gene expression levels at each stage measured as the mean TPM from six biological replicates and log2(mean TPM+1 ) converted to a value. Hierarchical clustering was performed using heat map analysis based on their expression patterns.
  • sof1 gene was mapped to sof1 gene.
  • the gene was initially located on chromosome 7H between C7_77055_96891401 and C7_67011_165769003.
  • Rough mapping using 93 F2 individuals then confirmed that the sof1 locus is located at a 3.3 cM interval between fluidigm markers FB0278 and FB0088 on chromosome 7H.
  • Further genotyping with additional CAPS markers and phenotypic analysis of the 93 individuals described above placed the sof1 locus within a physical region of 1.1 cM genetic distance between markers HM7H234200 and HM7H246100 (Fig. 3A).
  • this physical region is approximately 9.2 Mb, containing 110 annotated genes and 8 annotated genes. There were 118 genes consisting of none pseudogenes.
  • Horvu_OUH_7H01G211300 corresponds to Horvu_MOREX_7H01G238100 as a high-confidence gene in the Morex genome and was annotated as a chromatin remodeling protein (Jayakodi, M. et al., (2020) Nature, 588:284-28 9).
  • 13 significant F2 recombinants were genotyped using an In-del marker developed for a 22 bp deletion (HM7H238100-Indel), followed by 3 The genotypes and phenotypes of the F3 progeny of the two recombinants were analyzed. The results showed that the In-del marker did not recombine with sof1.
  • sof1-2 T0 line was crossed with non-cleistomorphic barley Sv73528 and Adorra to create an F3 population with genotype sof1-2sof1-2Cly1_ and its The lodicule phenotype was determined (Fig. 5B).
  • the lodicule length of the sof1-2 mutant (T2) was significantly longer than that of Sv73528 and Adorra (Fig. 6).
  • Sof1 is a wild type allele of sof1.
  • the Sof1 gene has a length of 20,720 bp from the start codon to the stop codon (SEQ ID NO: 3), a full-length CDS of 10,326 bp (SEQ ID NO: 1) ( Figure 4A), and is a predicted 3,441 amino acid protein with two Snf2 family domains. (SOF1) ( Figure 4B).
  • One is the ATPase domain, which is composed of SNF2_N (N-terminal domain of the SNF2 family) and Helicase_C (helicase conserved C-terminal domain), and the other is the SnAC (Snf2 ATP coupling) domain ( Figure 4B).
  • the ATPase and SnAC domains are located at the N-terminus of SOF1, but no conserved domain is found in the C-terminal region.
  • the sof1 mutant contains a 22 bp deletion (Fig. 4A), causing a frameshift mutation (D2659Efs) and introducing a stop codon at the base corresponding to amino acid 2677 in the C-terminal region.
  • Fig. 4A a 22 bp deletion
  • D2659Efs causing a frameshift mutation (D2659Efs) and introducing a stop codon at the base corresponding to amino acid 2677 in the C-terminal region.
  • a 2676 amino acid truncated protein lacking the last 765 amino acids results (approximately 22% of the complete SOF1 protein) results (Figure 4B). It was thought that the truncated protein would cause the mutant to lose its biological function.
  • SNF2 is an ATP-dependent chromatin remodeling factor that controls many aspects of DNA events such as transcription, replication, homologous recombination, and DNA repair.
  • SOF1 homologues Based on BLASTp searches on plant species, SOF1 homologs were found in monocots and dicots, and we further selected top homologs with high identity to SOF1 from each taxon for use in phylogenetic analysis. . Three other Arabidopsis SWI/SNF subfamily members were included to infer the class to which homologous proteins belong.
  • the phylogenetic tree shows that all SOF1 homologs are clustered within the SWI/SNF subfamily, indicating that SOF1 belongs to this SWI/SNF subfamily (SWI/SNF ATPase) and that these sequences are orthologous.
  • SWI/SNF ATPase has the function of bringing chromatin into an active state and turning on its genes.
  • SOF1 and Arabidopsis SPLAYED (SYD) proteins were closely related to each other (Figure 8).
  • Arabidopsis SYD acts on several downstream bHLH genes via multiple MADS box genes and suppresses petal enlargement. Therefore, the SYD mutation causes larger petals.
  • the Poaceae homologous organ of petals is the lodicule. Therefore, the gene control system originating from SYD can be used as one of the models for lodicule enlargement (hyperflowering) in barley sof1 mutants.
  • the homologue HORVU_MOREX_6H01G041600.1 was annotated as an ATP-dependent helicase family protein of the Morex genome. This shows a close relationship with Arabidopsis BRAHMA (BRM), and is determined by the NCBI conserved domain database (Marchler-Baur, A. et al., (2017) Nucleic Acids Res., 4;45(D1):D200-D203).
  • HORVU_MOREX_6H01G041600.1 is a barley SOF1 paralog.
  • OsSYD (XP_015642458.1) is one of the SYD orthologs based on phylogenetic analysis, and has been reported to be the SYD ortholog of Oryza sativa ssp japonica (Su, Y. et al., (2006) The Plant Journal, 46(4):685-699, Hu, Y. et al., (2013) Plant physiology and biochemistry, 70:33-42).
  • Sof1 encodes a chromatin remodeling ATPase protein, and its function may be similar to Arabidopsis SYD and OsSYD.
  • Sof1 transcript abundance profiling The transcript abundance of Sof1 was examined in the whole panicle or in individual reproductive organs across panicle development stages, and in various vegetative organs (FIG. 9). qRT-PCR profiling revealed that this gene is widely transcribed throughout panicle developmental stages in both wild type and mutants. In the wild type, transcription of this gene could be detected in six floral organs, leaf sheaths, leaf blades, nodes, and internodal vegetative organs at the green anther stage, but was also low in panicles at the same awn primordium stage. The amount of transcript in the mutant was significantly lower than that in the wild type in the panicle and reproductive organs (FIG. 9).
  • the transcription level of this gene was significantly decreased in the mutant from the awn primordial stage to flowering, and was also clearly decreased in the lodicule (P ⁇ 0.01, Fig. 9). Transcript abundance analysis suggested that this gene may play a function during vegetative growth and reproductive development.
  • RNA-seq analysis was performed on wild type OUH602 and mutant 44205. Analysis of immature ears (awn primordium stage) of plants grown in air-conditioned greenhouses (22°C with natural light) and screened rooms revealed a total of 2412 and 1371 differential expressions between genotypes under the two growth conditions, respectively. genes (DEGs) (FDR ⁇ 0.05 and
  • genes whose expression was significantly suppressed six flower homeosis genes were detected. They are B class genes (AP3-like, Horvu_MOREX_7H01G536500 and PI-like, Horvu_MOREX_1H01G402000), C class genes (AG-like, Horvu_MOREX_3H01G171300), E class genes (AGL6-like, H orvu_MOREX_6H01G395900 and SEP-like, Horvu_MOREX_7H01G328200), SVP-like gene (Horvu_MOREX_4H01G454700), and these genes were homologues with rice OsMADS16, OsMADS4, OsMADS3, OsMADS6, and OsMADS6, respectively.
  • B class genes AP3-like, Horvu_MOREX_7H01G536500 and PI-like, Horvu_MOREX_1H01G402000
  • C class genes AGL6-like
  • OsMADS16 (Nagasawa, N. et al., (2003) Development, 130(4):705-18, Yoshida, H. et al., (2007) Plant B iotechnology Journal, 5(6):835-846)
  • OsMADS3 (Yamaguchi, Y. et al., (2006) The Plant Cell, 18(1):15-28, Dreni, L. et al., (2011) The Plant Cell, 23(8):2850-2863 )
  • OsMADS6 (Li, H. et al., (2010) Cell research, 20(3):299-313)
  • OsMADS7 genes (Cui, B. et al., (2010) Plan t J., 61 (5 ): 767-781) reported on lodicule development through rice mutants.
  • Wheat homologous gene sequences were obtained from the genome information of the wheat variety Chinese Spring.
  • the cDNA base sequences of the identified wheat Sof1 genes are shown in SEQ ID NOs: 4, 7, and 10, the genomic DNA nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 6, 9, and 12, and the amino acid sequences of the proteins encoded by these DNAs are shown in SEQ ID NOs: : Shown in 5, 8, and 11. Similar to barley Sof1, it was also found to be strongly expressed in various organs such as roots, leaves, and panicles in wheat (Fig. 10). Furthermore, by the TILLING method, we succeeded in selecting multiple lines of wheat Sof1 gene mutants in the wheat varieties Kronos and Cadenza.
  • the present invention it is possible to produce wheat with improved flowering properties.
  • INDUSTRIAL APPLICATION Since the present invention can greatly improve the efficiency of developing new wheat varieties, it contributes to improving grain productivity in the agricultural field.

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Abstract

Ｓｏｆ１遺伝子の機能を抑制することにより、ムギの開花性を向上させることが可能であり、また、Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制を指標にムギの開花性を評価することが可能であることを見出した。

Description

超開花性ムギとその生産方法および評価方法
　本発明は、Ｓｏｆ１遺伝子を標的とした、開花性が向上したムギとその生産方法および評価方法に関する。
　世界の穀物の供給は、開発途上国を中心とした人口増加による食料の需要の増加に加え、異常気象の頻発や水資源の制約による生産量の減少などの諸要因によって逼迫するおそれがある。この問題の解決のための手段の一つとして、農業生産性を増大できる穀物の新品種の開発が求められている。
　雑種強勢は雑種第一代（Ｆ１）の個体の生産能力が両親の生産能力を上回る現象であり、様々な作物の新品種の開発に利用されてきた。しかしながら、遺伝的多様性の極めて高いオオムギでは雑種強勢効果が優れているにもかかわらず、元来自殖性で他家受粉による雑種種子の生産効率が低いという理由から雑種強勢技術が成熟してこなかった。
　そこで、他家受粉の効率を高めるために、穀物の開花性を制御する遺伝子の同定が試みられている。例えば、閉花性オオムギ品種の小さい鱗被は、染色体２Ｈの長腕にある単一の劣性遺伝子ｃｌｅｉｓｔｏｇａｍｙ　１（ｃｌｙ１）によって制御されており（非特許文献１）、この遺伝子はシロイヌナズナＡＰ２転写因子のオルソログであることが報告されている（非特許文献２）。オオムギの開花型Ｃｌｙ１遺伝子（Ｃｌｙ１．ａ）は、鱗被の幅と厚みを拡大させ、小花の中から外頴と内頴を外へ押し出し、機械的に開花させる働きをもつ（非特許文献２）。閉花型ｃｌｙ１．ｂと開花型Ｃｌｙ１．ａの違いは、ｃｌｙ１の配列をコードするｍｉｃｒｏＲＮＡ１７２（ｍｉＲ１７２）の特異的結合部位内の一塩基置換により生じ、Ｃｌｙ１．ａをもつ野生種ではｍｉＲ１７２を介したｃｌｙ１転写産物の切断が減少する。その結果、翻訳されたＣＬＹ１タンパク質が高蓄積し、抑制されていた鱗被が正常に発達するようになる（非特許文献２、３）。
　開花型Ｃｌｙ１．ａを利用することにより、閉花性品種に開花性の形質を付与することが可能である。しかしながら、当該遺伝子によりもたらされる開花性のみでは他家受粉による雑種種子の生産効率を高めるには不十分であり、飛躍的な開花性の向上がいまなお求められている。
Ｔｕｒｕｓｐｅｋｏｖ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００４）　Ｔｈｅｏｒ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．，　１０９：４８０－４８７ Ｎａｉｒ，　Ｓ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　１０７（１）：４９０－４９５ Ａｎｗａｒ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１８）　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，　１２２（２）：２５１－２６５
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、開花性が飛躍的に高められたムギとその生産方法および評価方法を提供することにある。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく、まず、開花型の野生オオムギ系統（ＯＵＨ６０２）にガンマ線照射することにより開花性が向上した変異体のスクリーニングを行った。その結果、開花性が飛躍的に向上した超開花の形質を示す変異体を選抜することに成功した。次いで、選抜した突然変異体を開花型の栽培品種（Ｍｏｒｅｘ）と交配し、Ｆ２集団を用いたマップベースクローニングを行った。その結果、超開花の原因遺伝子は染色体７Ｈ上のマーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２４６１００の間に存在し、この形質が単一の劣性遺伝子により支配されていることを見出した（この超開花の形質を支配する遺伝子を「ｓｏｆ１」と命名した）。この約３．１Ｍｂの候補領域内には、４３個のアノテーション付き遺伝子と５個のアノテーションなし偽遺伝子が存在することが判明した。
　次に、これら遺伝子の多型を調査するために、変異体の全ゲノムショットガン配列解析を行い、野生型オオムギ系統（ＯＵＨ６０２）のゲノム配列と比較した。その結果、この標的領域内では、３つのホモ接合多型が検出され、そのうち２つは遺伝子間領域に存在する１ｂｐ挿入であり、残りの一つはＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００遺伝子内に存在する２２ｂｐ欠失であった。
　この遺伝子が超開花の形質の原因となるｓｏｆ１であることを裏付けるために、閉花型の栽培品種（Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅ）のＳｏｆ１遺伝子（上記２２ｂｐ欠失の近傍領域）を標的として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法による変異の導入を行った。その結果、Ｓｏｆ１遺伝子内に５ｂｐの欠失を持つ変異（ｓｏｆ１－２）が得られ、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅが持つ鱗被より有意に長い鱗被を形成したことから、変異の効果が確認された。しかしながら、この変異体は、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅが持つ閉花型ｃｌｙ１．ｂ遺伝子の影響を受けて、超開花の形質を示す程度に十分な大きさの鱗被は形成しなかった。そこで、ｃｌｙ１．ｂ遺伝子の影響を排除することを目的に、この変異体を開花型Ｃｌｙ１．ａ遺伝子を持つオオムギ品種Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと交配した。その結果、得られた個体の鱗被は、Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａよりも有意に長く、超開花の形質を示した。以上から、ｓｏｆ１遺伝子が超開花の形質の原因遺伝子であることが判明した。さらに、本発明者らは、他の植物における相同遺伝子の探索を行った結果、コムギにおいても、当該オオムギ遺伝子に対応する遺伝子の存在が判明し、超開花の形質を示す変異体の取得にも成功した。
　以上から、本発明者らは、Ｓｏｆ１遺伝子（変異体ｓｏｆ１遺伝子に対応する野生型遺伝子）の機能を抑制することにより、ムギの開花性を向上させることが可能であり、また、Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制を指標にムギの開花性を評価することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下の態様を含む。
　［１］開花性が向上したムギの生産方法であって、ムギにおいて、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能を人為的に抑制することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
　［２］下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能が人為的に抑制された、開花性が向上したムギ。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
　［３］ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
　［４］ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の発現を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
　［５］開花性が向上したムギを生産する方法であって、請求項２に記載のムギと他の任意のムギとを交配させることを含む方法。
　本発明によれば、開花性が飛躍的に向上したムギを生産することが可能となる。当該ムギは、その鱗被が大きく膨張することにより、大きな開花角度を示す。この形質は、ムギの育種において花粉親に導入すれば花粉の飛散が容易となる一方、雄性不稔の種子親に導入すれば受粉が容易となる。これにより他家受粉による雑種種子の生産の効率を飛躍的に高めることが可能となる。
野生型ＯＵＨ６０２（ＷＴ）と突然変異体４４２０５（ＭＴ）の写真である。（Ａ）野生型ＯＵＨ６０２および（Ｂ）突然変異体４４２０５の小穂。（Ｃ）野生型ＯＵＨ６０２および（Ｄ）突然変異体４４２０５の開花直前の黄葯期の鱗被。（Ｅ）野生型ＯＵＨ６０２および（Ｆ）突然変異体４４２０５の小穂正面側から見た鱗被。（Ｇ）野生型ＯＵＨ６０２と（Ｈ）突然変異体４４２０５の小穂側面側から見た鱗被。 野生型ＯＵＨ６０２（ＷＴ）と突然変異体４４２０５（ＭＴ）のグラフ（図１の続き）である。（Ａ）開花角度、（Ｂ）鱗被の長さ、（Ｃ）鱗被の厚み、（Ｄ）鱗被の幅、（Ｅ）鱗被の細胞数、（Ｆ）鱗被の細胞の長さ。 ｓｏｆ１のマップベースクローニングを示す図である。（Ａ）ｓｏｆ１の高解像度遺伝地図。連鎖地図の線の上のマーカーの間の数字は、カバーされた組換え体の数を示す。（Ｂ）大規模なＦ２母集団を使用したｓｏｆ１のファインマッピング（ｎ＝１７５９）。（Ｃ）３．１Ｍｂの物理的領域で全ゲノムシーケンシングによって同定された変異を持つアノテーション付き遺伝子。矢印は、アノテーション付き遺伝子の転写の方向を示す。 ｓｏｆ１のマップベースクローニングを示す図（図３の続き）である。（Ａ）Ｓｏｆ１遺伝子の構造。両端のボックスは５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を表し、その間のボックスはコーディングエクソンを表し、細い線はイントロンを表す。ＡＴＧとＴＡＧは、それぞれ開始コドンと停止コドンを示す。破線は、変異体における２２ｂｐの欠失を示す。（Ｂ）ＳＯＦ１タンパク質の構造。各ボックス（１０４３－１３３４位、１３５９－１４７３位、１５８７－１６６１位）はＳＯＦ１のドメインを示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した変異誘発によるＳｏｆ１機能の特性評価を示す図である。（Ａ）Ｓｏｆ１候補遺伝子（Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により生成された変異体の遺伝子構造の概略図。エクソンとイントロンは、それぞれボックスと線で示す。逆三角形は、遺伝子内のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的部位を示す。Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅ（ＧＰ）配列上の線は、ｇＲＮＡの標的部位とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を示す。破線は、削除された塩基を示す。（Ｂ）編集されたＴ１系統と２つの非閉花型オオムギ栽培品種との間の交配に由来するＦ３植物における表現型同定のスキーム。括弧内は各世代の対象遺伝子型を示す。 野生型Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅ（ＧＰ）およびホモ接合Ｔ２変異系統の写真（上）および鱗被サイズのグラフ（下）である。グラフにおける各測定値は、統計分析用の９～１３個の鱗被の平均を表す。Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ。＊＊はＰ＜０．０１を、ｎｓは大きな違いはないことを示す。 ２つの非閉花型栽培品種とそれらの対応するＦ３植物における、小花の開花角度の比較を示す写真（上）および鱗被サイズの比較を示す写真（下）である。 単子葉植物と双子葉植物のＳＯＦ１ホモログの系統発生分析を示す図である。ツリーは、ＳＯＦ１ホモログのポリペプチド配列のアラインメントに基づく近隣結合（ＮＪ）法によって構築した。枝に表示される数字は、ブートストラップの確率を示す。 野生型ＯＵＨ６０２（ＷＴ）と突然変異体４４２０５（ＭＴ）の間の栄養器官および生殖器官を伴う穂の発達におけるＳｏｆ１の転写産物量を示すグラフである。ＤＲ（二重***期／ｄｏｕｂｌｅ　ｒｉｄｇｅ　ｓｔａｇｅ）；ＴＭ（三重マウンド期／ｔｒｉｐｌｅ　ｍｏｕｎｄ　ｓｔａｇｅ）；ＧＰ（苞頴原基期／ｇｌｕｍｅ　ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ　ｓｔａｇｅ）；ＬＰ（護頴原基期／ｌｅｍｍａ　ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ　ｓｔａｇｅ）；ＳＰ（雄しべ原基期／ｓｔａｍｅｎ　ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ　ｓｔａｇｅ）；ＡＰ（芒原基期／ａｗｎ　ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ　ｓｔａｇｅ）；ＷＡ（白葯期／ｗｈｉｔｅ　ａｎｔｈｅｒ　ｓｔａｇｅ）；ＧＡ（緑葯期／Ｇｒｅｅｎ　ａｎｔｈｅｒ　ｓｔａｇｅ）；ＹＡ（黄葯期／ｙｅｌｌｏｗ　ａｎｔｈｅｒ　ｓｔａｇｅ）。ＤＡＧ（発芽後日数／ｄａｙ　ａｆｔｅｒ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）。値は平均値±ＳＥ（ｎ＝３つの独立した生物学的複製）。統計的な有意の値は、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ検定によって計算した。＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を、ｎｓは大きな違いがないことを示す。 野生型コムギ品種（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ）におけるＳｏｆ１の転写産物量を示すグラフである。 野生型ＯＵＨ６０２（左）と超開花性のＯＵＨ６０２突然変異体（以下、特に断りがない限り、「突然変異体４４２０５」と言う）（右）の開花角度を示す写真である。計測された開花角度を写真中に記載した。
　＜開花性が向上したムギの生産方法＞
　本発明において「開花性」とは、鱗被が膨張することにより開花角度が増加する形質を意味する。ムギ、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物の花序は、小穂と呼ばれる構造からなり、１つまたは複数の小花を含んでいる。それぞれの小花は生殖器（雄しべと雌しべ）で構成され、苞葉のような器官（外頴と内頴）のペアで覆われている。「鱗被」は、これら生殖器と穎の間に存在する。鱗被は一般に花びらに相当すると見なされており、鱗被は生殖器（雄しべと雌しべ）左右の基部に存在する。開花の直前に鱗被が急速に膨張すると、機械的に外頴と内頴を引き離し、裂けた葯から花粉が放出されやすくなり、その後柱頭が他家受粉をできるようになる（非閉花受粉性）。対照的に、鱗被が膨張することができないと、花粉が閉じた小花の中に隠され、それによって自家受粉を引き起こす（閉花受粉性）。
　本発明において「開花性が向上する」とは、Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制しない場合と比較して、開花角度が増加することを意味する。開花角度の増加は、好ましくは２°以上、さらに好ましくは５°以上、さらに好ましくは８°以上、特に好ましくは１０°以上である。開花角度は、穂の小花における外穎（穂軸から見て遠い側の穎）の縁に沿う線と内穎（穂軸から見て近い側の穎）の縁に沿う線が交わる角度として測定することができる。なお、開花角度は、ムギの種や品種により変動し得るが、例えば、野生型オオムギＯＵＨ６０２の開花角度は、通常、１０．２±２．２°である（図１１（左））。
　本発明において開花性を向上させる対象となる「ムギ」とは、イネ科イチゴツナギ亜科に属するムギ類の植物全般を意味し、例えば、オオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバクが挙げられる。また野生種であってもよく、栽培種であってもよい。ムギが閉花型ｃｌｙ１遺伝子を保有している場合、Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制の効果が生じ難くなることから、開花性を向上させる対象となる「ムギ」は、開花型ｃｌｙ１遺伝子を保有していることが好ましい。閉花型ｃｌｙ１遺伝子を保有しているムギを対象にＳｏｆ１遺伝子の機能を抑制した場合には、その後、開花型ｃｌｙ１遺伝子を保有しているムギとの交配やゲノム編集などによるｃｌｙ１遺伝子の閉花型から開花型への改変（例えば、ｍｉＲ１７２の特異的結合部位内の一塩基置換）などにより、閉花型ｃｌｙ１遺伝子による負の影響を排除することが可能である。
　本発明の方法は、Ｓｏｆ１遺伝子（ＳＯＦ１タンパク質をコードする内因性遺伝子）の機能を人為的に抑制することを含む。
　本発明における「Ｓｏｆ１遺伝子」は、ＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリーに属し、クロマチンリモデリングＡＴＰａｓｅタンパク質をコードしていると推定される。変異タンパク質を発現するムギでは、鱗皮が膨張して開花性が向上することから、野生型タンパク質（ＳＯＦ１タンパク質）は、ムギの鱗皮の膨張を抑制する活性を有していると考えられる。
　オオムギのＳｏｆ１遺伝子の典型的なｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、コムギにおける典型的なｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：４、７、１０に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：６、９、１２に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５、８、１１に示す。
　自然界においてはヌクレオチド配列に個体差が生じることがあり、また、現在の技術水準では、当業者は特定の遺伝子が得られた場合、その遺伝子のヌクレオチド配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、対応する遺伝子を同定することが可能である。従って、本発明におけるＳｏｆ１遺伝子には、その機能の抑制により開花性が向上する限り、これら相同遺伝子が含まれる。
　相同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、通常、前記特定の遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有する。ここで「高い相同性」とは、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　配列の相同性は、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　（１９９０）　２１５：４０３－４１０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ，　Ｓ．　＆　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ．，　（１９９０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７：２２６４－２２６８、Ｋａｒｌｉｎ，　Ｓ．　＆　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ．，　（１９９３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０：５８７３－５８７７）に基づいている。例えば、ＢＬＡＳＴによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２５：３３８９－３４０２）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　これら相同遺伝子は、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｅ．　Ｍ．，　（１９７５）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　９８：５０３）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，　Ｒ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８５）　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４、Ｓａｉｋｉ，　Ｒ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３９：４８７－４９１）を利用することにより取得することが可能である。
　本発明における「Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制」には、その機能の完全な抑制（阻害）および部分的な抑制の双方が含まれる。また、ＳＯＦ１タンパク質の活性（例えば、鱗皮の膨張を抑制する活性）の抑制およびＳｏｆ１遺伝子の発現の抑制（転写の抑制および翻訳の抑制）の双方が含まれる。
　Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制は、例えば、Ｓｏｆ１遺伝子やその発現制御領域（例えば、プロモーター領域）への変異の導入により行なうことができる。Ｓｏｆ１遺伝子に導入される変異としては、その機能を抑制する限り特に制限はなく、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、および／または挿入が挙げられるが、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ヌル変異が好ましい。
　Ｓｏｆ１遺伝子に導入される変異の数は、その機能を抑制する限り特に制限はなく、１個でも複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下）でもよい。実際、本願実施例において、オオムギＳｏｆ１遺伝子におけるヌクレオチドの欠失（２２塩基の欠失［ｓｏｆ１変異体］、５塩基の欠失［ｓｏｆ１－２変異体］）がフレームシフトによりＣ末端側が短縮された変異タンパク質を生じさせ、その結果、オオムギの開花性が向上することが判明している。Ｓｏｆ１遺伝子がコードするＳＯＦ１タンパク質は、そのＮ末端側に２つの機能ドメイン（ＡＴＰａｓｅドメインおよびＳｎＡＣドメイン）が存在するが、これら機能ドメインが存在しないＣ末端側の変異によってもＳＯＦ１タンパク質の機能を喪失させることが可能である。したがって、Ｓｏｆ１遺伝子に導入される変異としては、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列全部を失わせる必要はなく、その一部が失われるか変化するように当該遺伝子内に導入されてもよい。
　遺伝子の変異により発現するタンパク質の一部を欠失させる場合、当該欠失は、ＳＯＦ１タンパク質の活性を抑制する観点から、好ましくは全体の５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上）の欠失である。
　Ｓｏｆ１遺伝子への変異の導入は、当業者であれば公知の方法により達成することができる。公知の方法としては、効率的に部位特異的な変異の導入が可能であることから、ゲノム編集法が好適である。
　ゲノム編集法は、部位特異的ヌクレアーゼを利用して、標的遺伝子を改変する方法である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成することにより部位特異性が付与されたＣａｓヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとしては、クラス２のＩＩ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ９を含む）、クラス２のＶ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１４などを含む）、クラス２のＶＩ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃなどを含む）、クラス１のＩ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ３を含む）など、様々なシステムを利用することができる。
　遺伝子への変異の導入を行うための他の方法としては、物理的変異導入法、化学的変異剤を用いる方法、トランスポゾンを利用する方法などが挙げられるが、これらに限定はされない。
　物理的変異導入法としては、例えば、ガンマ線照射、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、速中性子線照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００７）　Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　１８ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，　２３７－２３９、Ｋａｚａｍａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００８）　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２５：１１３－１１７）。
　化学的変異剤を用いる方法としては、例えば、化学変異剤によって種子などを処理する方法（ＺｗａｒおよびＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９～４８ページ）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、例えば、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸およびヌクレオチド類似体が挙げられる。
　トランスポゾンなどをゲノムＤＮＡに導入する方法としては、例えば、ＴＯＳ１７などのトランスポゾン、Ｔ－ＤＮＡなどを植物のゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒ，　Ａ．　＆　Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ，　Ｈ．，　（２００１）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．，　６（３）：１２７－１３４、Ｔａｍａｒａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９９）　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　４（３）：９０－９６）。
　これらの方法を利用する場合は、通常、変異導入処理を行った個体群から、Ｓｏｆ１遺伝子に変異を有する個体を選抜する。
　Ｓｏｆ１遺伝子に変異が導入されたムギは、当該変異遺伝子のヘテロ接合体でありうる。この場合、ヘテロ接合体同士を交配してＦ１植物体を作成し、当該Ｆ１植物体から当該変異遺伝子のホモ接合体を選抜することができる。本発明において、超開花の形質の原因となるｓｏｆ１遺伝子（変異遺伝子）は、劣性遺伝子であることが判明している。従って、Ｓｏｆ１遺伝子への変異の導入によりムギの開花性を向上させるためには、ムギは、変異したＳｏｆ１遺伝子をホモで保持することが好ましい。なお、目的外の変異が導入されたムギは、例えば、野生型のムギを利用した戻し交配を行うことにより、目的外の変異を除去することができる。
　Ｓｏｆ１遺伝子の発現の抑制により当該遺伝子の機能を抑制する場合、Ｓｏｆ１遺伝子の発現制御領域への変異の導入の他、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを用いる方法、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を用いる方法、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを用いる方法（リボザイム法）など、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物を標的とする方法を利用することもできる。
　また、Ｓｏｆ１遺伝子の発現の抑制は、ヌクレオチドにおける変異を伴わない、エピジェネティック制御におけるヌクレオチドの修飾によっても行いうる。エピジェネティック制御としては、例えば、ＤＮＡのメチル化、ヒストンの化学的修飾（アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化など）が挙げられる。
　本発明において、Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための処理は、使用する技術の種類に応じて、ムギの植物体、器官、組織、または細胞に対して行うことができる。器官、組織、または細胞としては、例えば、種子、小胞子、花粉、未熟胚、葉の切片、懸濁培養細胞、プロトプラスト、カルス、生長点、幼穂などが挙げられる。
　Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための分子がＤＮＡにコードされる分子である場合（例えば、上記の部位特異的ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡなどである場合）、ベクターに挿入した形態でムギに導入してもよい。ベクターとしては、ムギの細胞内で挿入されたＤＮＡを発現させることが可能なものであれば特に制限はない。ベクターは、通常、前記ＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有する。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、オオムギのＵ３プロモーター、イネのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、特定の化合物処理、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。
　Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための分子のムギ細胞への導入には、例えば、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、パーティクルボンバードメント法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション）など、当業者に公知の方法を用いることができる。
　上記の方法によりＳｏｆ１遺伝子の機能が人為的に抑制された細胞が得られた場合、当該細胞からムギの植物体を再生することにより、開花性が向上したムギを得ることができる。ムギの形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ，　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，　（１９９７）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，　１１：１３６９－１３７６）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００４）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ，　２２：３９７－４０２）、およびＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００５）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２３：７８０－７８９）に記載された方法を挙げることができる。また、Ｔａｂｅｉら（田部井豊　編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載の方法を用いて、形質転換および植物体への再生を行なうことができる。
　一旦、Ｓｏｆ１遺伝子の機能が人為的に抑制されている植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に植物体を量産することも可能である。本発明は、こうして得られた、開花性が向上したムギの植物体、子孫、クローン、繁殖材料をも提供するものである。
　＜ムギの開花性を評価する方法＞
　本発明の方法の一つの態様は、ムギにおけるＳｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む。
　Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列の解析に際しては、Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の配列情報に基づいて適宜設計することができる。
　開花性の評価においては、「対照の塩基配列」と比較する工程を含むことができる。「対照の塩基配列」は、典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列（オオムギ）または配列番号：５、８、１１に記載のアミノ酸配列（コムギ）をコードする遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列である。
　決定した被検ムギにおけるＳｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列と、前記対照の塩基配列とを比較することにより、被検ムギにおいて開花性が向上する否かを評価することができる。例えば、前記対照の塩基配列と比較して、塩基配列において相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被検ムギは開花性が向上するムギである蓋然性が高いと評価される。
　塩基配列を解析するためのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法により行うことができる。ＤＮＡを調製するためのムギとしては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。また、塩基配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム－ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキットやシークエンサーを利用することができる。
　なお、被検ムギにおけるＳｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列が、対照の塩基配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法などの公知の方法により間接的に解析することもできる。
　本発明の方法の他の一つの態様は、Ｓｏｆ１遺伝子の発現を解析することを含む。
　ここで「遺伝子の発現の解析」には、発現（転写、翻訳）の有無および程度の解析、並びに、発現産物の分子量の解析が含まれる。
　Ｓｏｆ１遺伝子の転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、ＲＮＡ－ｓｅｑ法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、既に決定されたＳｏｆ１遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。また、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
　遺伝子発現の検出の結果、被検ムギにおいて、Ｓｏｆ１遺伝子の発現量が、野生型Ｓｏｆ１遺伝子を保持する品種（例えば、オオムギではＯＵＨ６０２、コムギではＣｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ）の発現量よりも有意に低ければ（例えば、Ｓｏｆ１遺伝子が実質的に発現していなければ）、開花性が向上するムギである蓋然性が高いと評価される。また、Ｓｏｆ１遺伝子の増幅産物または発現産物の分子量が、野生型Ｓｏｆ１遺伝子の発現産物の分子量と有意に異なれば、開花性が向上するムギである蓋然性が高いと評価される。
　＜開花性が向上したムギを生産する方法＞
　本発明は、開花性が向上したムギを生産する方法を提供する。
　本発明の方法は、上記の開花性が向上したムギと他の任意のムギとを交配させることを含む。
　開花性が向上したムギと交配させる「他の任意のムギ」としては、例えば、Ｓｏｆ１遺伝子の機能が抑制されておらず超開花の形質を示さないムギの品種が挙げられるが、これに制限されない。交配により得られた個体の中から、上記の方法により、Ｓｏｆ１遺伝子の機能が抑制されたムギを選抜することができる。
　本発明の方法を利用すれば、開花性が向上したムギの品種を、種子や幼植物などの早期の段階で適宜選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
　Ａ．材料と方法
　（１）植物材料
　非閉花性野生オオムギ系統（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．　ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）のＯＵＨ６０２は、岡山大学植物科学資源研究所から入手した。ＯＵＨ６０２を幼苗から成長過程においてコバルト６０（６０Ｃｏ）ガンマ線の緩照射（１日あたり０．２４～０．７７Ｇｙ、１週間あたり５日間の照射）で処理した。超開花の表現型に基づいて、１６００のＭ２個体に由来するＭ３系統からＯＵＨ６０２突然変異体（系統番号：４４２０５）を選抜した。遺伝子解析のために、ＯＵＨ６０２突然変異体は栽培品種「Ｍｏｒｅｘ」と交配し、マッピング集団を作成した。植物育成は、網室（自然光かつ温度制御されていない）もしくは、空調温室（２４℃に維持された）の中で、１植物／４Ｌポットで実施した。
　（２）鱗被サイズの表現型と開花角度の評価
　１系統あたり３つのスパイク（止め葉がまだ花柄に付着している状態）をランダムに選択し、その中で各スパイクの中央部分から小花（開花直前の黄色い葯の段階）を採取した。小花から外頴をとり除いた後に、文献（上記非特許文献２）の記載に従って、顕微鏡Ａｘｉｏ　Ｚｏｏｍ　ｖ１６（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ、東京、日本）で鱗被を撮影した。デジタル画像を基に、Ｍａｋｉｊａｋｕソフトウェアｖ１．１（ｈｔｔｐ：／／ｌｂｍ．ａｂ．ａ．ｕ－ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／～ｉｗａｔａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｍａｋｉｊａｋｕ／）を使用し、鱗被の長さ、厚み、幅を測定した。
　また、野生型と変異体についてランダムに選んだ穂の小花（開花直後：黄葯期）の写真を撮影し、外穎（穂軸から見て遠い側の穎）の縁に沿う線と内穎（穂軸から見て近い側の穎）の縁に沿う線が交わる角度を、Ｍａｋｉｊａｋｕ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖ１．１（ｈｔｔｐ：／／ｌｂｍ．ａｂ．ａ．ｕ－ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／～ｉｗａｔａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｍａｋｉｊａｋｕ／）を使用して測定し、これを開花角度とした。
　（３）鱗被細胞の測定
　３０％アクリルアミドゲルに鱗被を包埋した後、Ｌｉｎｅａｒ　Ｓｌｉｃｅｒ　ＰＲＯ１０（Ｄｏｓａｋａ　ＥＭ）を使用して１５０μｍの厚さに切断し、０．０１％の蛍光増白剤２８（Ｓｉｇｍａ）で染色した。画像は、ＺＥＮ　２００９　Ｌｉｇｈｔ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　ＣＬＳＭソフトウェアを搭載したレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ７００、カールツァイス）を使用して撮影した。鱗被細胞の測定においては、鱗被の厚みに基づく細胞数を数え、鱗被の厚みを細胞数で割って細胞の大きさを算出した。遺伝子型ごとに平均１０個のサンプルを測定した。
　（４）マーカー開発
　ラフマッピングにおけるＳＮＰ遺伝子型決定のために、オオムギ栽培品種スカイゴールデンおよびオオムギ栽培品種とちのいぶきのゲノム配列の一塩基多型（ＳＮＰ）に基づいて、ｆｌｕｉｄｉｇｍマーカーを開発した。高解像度の遺伝子マッピングのために、ＲＡＤマーカーＦＢ０２７８およびＦＢ００８８の周囲で、同定したＳＮＰを識別するＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカーを追加で開発した。これらの特定の多型部位はＰＣＲ分析によって検出し、さらにＰＣＲ産物は、文献（Ｓａｋｕｍａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　＆　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　１０：１２３－１３３）に従って配列決定し、制限酵素ベースのＣＡＰＳ解析によって同定した。ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）から入手したＭｏｒｅｘ品種（アクセッション番号ＥＲＲ２７１７０５）とＯＵＨ６０２（アクセッション番号ＥＲＲ２７１７３７）の２つのエクソーム配列を比較することにより、合計１１のＣＡＰＳマーカーを開発した。加えて、ＩｎＤｅｌｓ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）マーカーは、突然変異体４４２０５の全ゲノムシーケンスで識別した２２ｂｐの欠失に対して開発した。開発した全てのマーカーは、マッピング集団の系統をスクリーニングするために使用した。
　（５）ｓｏｆ１の遺伝地図
　オオムギＦ２集団は、突然変異体４４２０５をＭｏｒｅｘと交配することによって開発した。
２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）で穂を処理する最大化スパイク培養法（Ｈｏｎｄａ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００５）　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，　１２４：５２４－５３１）を適用して鱗被のサイズを調査した。非開花受粉性はその鱗被の大小（非閉花と閉花）と完全に一致することが知られており（Ｎａｉｒ，　Ｓ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　１０７（１）：　４９０－４９５）、閉花受粉型の全ての系統に２，４－Ｄ（３０ｐｐｍ）を添加しても開花が一切認められず、一方、開花受粉型の系統の鱗被は処理する前と比較して、平均して横幅が約１．５倍に、厚み（外頴に対し垂直方向）が約２．３倍に膨らんだ。
　最初のマッピングには、４０個体の植物（２０のＷＴと２０の突然変異体タイプ）を選択した。４０個体のＦ２植物は、ｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ（Ｄｏｕｂｌｅ　Ｄｉｇｅｓｔ　ＲＡＤ－ｓｅｑ）を使用して遺伝子型を決定した。ラフマッピングでは、９３個体のＦ２でｆｌｕｉｄｉｇｍマーカーを使用したジェノタイピングを行った。リンケージマップは、ＡｎｔＭａｐバージョン１．２（Ｉｗａｔａ，　Ｈ．　＆　Ｎｉｎｏｍｉｙａ，　Ｓ．　（２００６）　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　５６　：３７１－３７７）を使用して作成した。次に、９３個体のＦ２の開花表現型を決定し、前述のＣＡＰＳマーカーを使用して遺伝子型を決定した。ファインマッピングでは、変異体とＭｏｒｅｘの間のＦ２分離について、ＨＭ７Ｈ２２８７００とＨＭ７Ｈ２５４０００の２つの隣接マーカーで遺伝子型の決定を行った。これらの２つのマーカーで同定された組換え体の遺伝子型は、ＨＭ７Ｈ２２８７００－ＨＭ７Ｈ２５４０００のゲノム領域内で開発した他のＣＡＰＳマーカーによって決定した。ｓｏｆ１遺伝子座の正確な判定のため、鍵となるＦ２組換え体は、ＩｎＤｅｌマーカー（ＨＭ７Ｈ２３８１００－Ｉｎｄｅｌ）でさらに遺伝子型を決定し、それらの後代のＦ３組換え体（２０個体）もＩｎＤｅｌマーカーで遺伝子型を特定し、鱗被のサイズの表現型を確認した。
　（６）ｓｏｆ１候補を含むゲノム領域の変異部位の同定
　ＤＮｅａｓｙ植物抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、突然変異体４４２０５のＭ３世代植物の新鮮な幼苗の葉からＤＮＡを抽出した。ペアエンドシーケンス（１５０ｂｐ）用のＤＮＡライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ　ＤＮＡ　ＰＣＲフリーのサンプル調製キット（イルミナ）を使用して構築した。ＤＮＡシーケンスは、イルミナＨｉＳｅｑＸＴｅｎプラットフォームで実行した。野生型ＯＵＨ６０２のデータ配列は、ＮＣＢＩ　Ｓｈｏｒｔ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅａｄ　Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）データベース（アクセッションＥＲＸ５４７１６７５；Ｓａｔｏ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２１）　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｃａｌｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｂａｒｌｅｙ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　“ＯＵＨ６０２”．　Ｇ３　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．　２７；１１（１０））からダウンロードした。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃバージョン０．３９（Ｂｏｌｇｅｒ，　ＡＭ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１４）　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　１；３０（１５）：２１１４－２１２０）でトリミングした後、野生型と変異体の配列を、Ｂｏｗｔｉｅ２バージョン２．３．５．１（Ｌａｎｇｍｅａｄ　Ｂ．　＆　Ｓａｌｚｂｅｒｇ　ＳＬ．，　（２０１２）　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　４；９（４）：３５７－３５９）を使用して、野生オオムギＯＵＨ６０２リファレンスゲノム（２００７２０＿ＯＵＨ６０２＿ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＿ｖ１．ｆａｓｔａ；Ｓａｔｏ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２１）　Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），　２７；１１（１０））に対してそれぞれアラインメントした。ゲノム配列のバリアントコールは、ＳＡＭｔｏｏｌｓバージョン１．１０（Ｌｉ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００９）　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　１５；２５（１６）：２０７８－２０７９）を使用した（マッピングスコア３０、塩基スコア２０以上、ｐｈｒｅｄスコア閾値４０）。ガンマ線照射は、ヌクレオチドの欠失と置換の両方を誘発すると予想されるため、カバレッジ深度の分析を使用して、バリアント呼び出しでは検出されなかった欠失を特定した。各位置でのバリアントの読み取り深度は、ＢＣＦｔｏｏｌｓ（Ｌｉ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１１）　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　１；２７：２９８７－２９９３）によって計算した。読み取り深度に１０のしきい値を適用することにより、バリアントをさらにフィルタリングした。ｓｏｆ１候補領域で同定された変異体の位置は、Ｍｏｒｅｘゲノムの遺伝子アノテーション（Ｍｏｒｅｘ．ｇｆｆ．ｇｚ；Ｊａｙａｋｏｄｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２０）　Ｎａｔｕｒｅ，　５８８（７８３７）：２８４－２８９）と交差していた。バリアント効果は、ＳｎｐＥｆｆ（Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１２）　Ｆｌｙ（Ａｕｓｔｉｎ），　６（２）：８０－９２）を使用して予測した。
　（７）ｓｏｆ１遺伝子座のゲノム配列解読
　２週間生育させた幼苗の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。ｇＤＮＡの質と量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を使用して評価した。サンガーシーケンシングの場合、ＰＣＲ増幅およびシーケンシングに使用されるプライマーは、ＮＣＢＩ／Ｐｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／）を使用して設計し、合成した。ｓｏｆ１遺伝子座の２０ｋｂのゲノム領域は、合計５つのアンプリコンに対する約５ｋｂのオーバーラップアンプリコンに分割し、アンプリコン当たり少なくとも２０のシーケンス反応を行った。各アンプリコンは、製造元の指示に従って、忠実度の高い酵素であるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を使用して増幅した。総量５０μｌの増幅反応は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡテンプレート、１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー、２．５ユニットのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡポリメラーゼで構成した。ＰＣＲプログラムは、「９８℃／１０秒、５５または６０℃（プライマー依存）／１５秒、６８℃／４～５分」の３０サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１テクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用してサイクルシーケンスを行った。各シーケンシング反応は、９６℃／１分の初期変性と、それに続く、「９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分」の２５サイクルで構成した。反応産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＣｌｅａｎＳＥＱシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ）で精製し、ＡＢＩプリズム３１３０または３７３０ｘＬ遺伝子分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ゲノム配列は、Ｓｅｑｍａｎバージョン７．１．０（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して整列した。
　（８）ｓｏｆ１のコーディング領域のゲノム配列の決定
　全ＲＮＡは、製造元のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、芒原基期の発達中のスパイクから抽出した。抽出したＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ）で処理し、ゲノムＤＮＡのコンタミネーションを除去した。ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を使用して定量した。ＤＮａｓｅ処理した、各サンプルの全ＲＮＡ　１μｇを用いて逆転写を行い、オリゴｄＴでプライミングしたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ｓｏｆ１のコード配列を増幅し、設計したプライマーを使用して５つのアンプリコンとして配列決定した。５０μｌのＰＣＲ反応の各容量には、２０ｎｇのテンプレート、１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー、２．５ユニットのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡポリメラーゼが含まれた。ＰＣＲプログラムは、「９８℃／１０秒、５５または６０℃（プライマー依存）／５秒、６８℃／１～４分」の３０サイクルで構成した。反応生成物の精製、配列決定および整列は、上記の通りである。
　（９）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した方法によるゲノム編集
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、オオムギのＳｏｆ１遺伝子の標的変異誘発に使用した。３つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ１：５’－ＴＧＣＡＴＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧ－３’／配列番号：１３、ｇＲＮＡ２：５’－ＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧ－３’／配列番号：１４およびｇＲＮＡ４：５’－ＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＧ－３’／配列番号：１５）は、ＷＵ－ＣＲＩＳＰＲ　Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒｄｂ．ｏｒｇ／ｗｕ－ｃｒｉｓｐｒ／；Ｗｏｎｇ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１５）　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１６：２１８）を用いて設計した。各ｇＲＮＡ配列の相補的オリゴＤＮＡのペアは、ｐＵ６ｇＲＮＡ－ｏｌｉｇｏ（Ａｂｅ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１９）　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　２８：１３６２－１３６９）のイネＯｓＵ６プロモーターをオオムギＨｖＵ３に置き換えることによって構築したｐＨｖＵ３－１５およびｐＨｖＵ３－２１（それぞれＬＣ６７２６１４およびＬＣ６７２６１３）のＢｂｓＩ切断部位に挿入した。次に、ｇＲＮＡの発現カセットとｐＨｖＵ３－１５／２１のｓｃａｆｆｏｌｄ配列をＰａｃＩとＡｓｃＩで切り出した。同時に、Ｃａｓ９およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現カセットを含む目的のバイナリーベクターｐＺＨ＿ｇＹＳＡ＿ＰｕｂｉＭＭＣａｓ９を同じ制限酵素で消化して、ｇＲＮＡ発現カセットを導入した（Ｍｉｋａｍｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１５）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｕｙ，　８８：５６１－５７２）。ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ１、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ２、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ４、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－２１：ｇＲＮＡ２と命名した４つの構築されたベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＡＧＬ１株に形質転換した。それらは、文献（Ｈｉｓａｎｏ，　Ｈ．　＆　Ｓａｔｏ，　Ｋ．，　（２０１６）　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　６：３７５０５）に記載の方法に従って、アグロバクテリウムを介してオオムギの形質転換に使用した。再生した植物におけるＳｏｆ１遺伝子の標的配列の変異を確認するために、特定のプライマーペアを使用してＰＣＲアンプリコンのサンガーシーケンシングを行った。５’－ＡＧＣＡＴＴＧＣＡＣＡＣＴＡＡＴＴＣＴＧＧ－３’／配列番号：１６および５’－ＡＧＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＧＧＧＡＡＧＡＧ－３’／配列番号：１７（ｇＲＮＡ１の場合）、ＣＧＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：１８および５’－ＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：１９（ｇＲＮＡ２の場合）、５’－ＡＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣ－３’／配列番号：２０および５’－ＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：２１（ｇＲＮＡ４の場合）。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、配列決定の条件は、文献（Ｈｉｓａｎｏ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２２）　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　２０：３７－４６）に記載の方法に従った。
　（１０）系統発生分析
　タンパク質のアミノ酸配列は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）バージョン７．０ソフトウェアパッケージ（Ｋｕｍａｒ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１６）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，　３３：１８７０－１８７４）に実装されているＣｌｕｓｔａｌＷプログラムのデフォルトパラメーターを使用して整列し、１０００回のブートストラップ複製でサポートされる近隣結合（ＮＪ）に基づいて系統樹を構築した。系統樹に示した、アラビドプシスおよび他の種の相同体の遺伝子ＩＤまたはシンボルは、Ｅｎｓｅｍｂｌ　Ｐｌａｎｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔｓ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｍｕｌｔｉ／Ｔｏｏｌｓ／Ｂｌａｓｔ／）から取得し、対応するタンパク質ＩＤは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）ＢＬＡＳＴｐ検索に基づいた。
　（１１）定量的ＰＣＲ解析による発現解析
　幼穂は、文献（Ｋｉｒｂｙ，　Ｅ．　Ｊ．　Ｍ．　＆　Ａｐｐｌｅｙａｒｄ，　Ｍ．，　（１９８１）　Ｃｅｒｅａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｇｕｉｄｅ，　Ｃｅｒｅａｌ　Ｕｎｉｔ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｅｎｔｒｅ．　Ｓｔｏｎｅｌｅｉｇｈ，　Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，　Ｗａｒｗｉｃｋｓｈｉｒｅ，　Ｅｎｇｌａｎｄ．）のガイドラインに従って、実体顕微鏡（Ａｘｉｏ　Ｚｏｏｍ　ｖ１．６、Ｚｅｉｓｓ）を使用して、二重***期（栄養成長期から生殖成長期へ相転換後の花序メリステムから形成される最初の構造で、小穂の***と葉の***から構成される）から開花までの１０の発達段階で収集した。幼穂、緑の葯の段階での花の器官（鱗被，外頴，内頴，葯，雌蕊，包頴，芒を含む）、発芽後７日での幼苗の根と葉、および芒原基期の葉鞘、葉身、節、節間について、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。
　ゲノムＤＮＡ切断、定量化、逆転写、およびｃＤＮＡ合成は、上記の通り実施した（ｓｏｆ１ｃＤＮＡのシーケンスの部分を参照）。１０ｎｇの全ＲＮＡに由来する第一鎖ｃＤＮＡを、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のテンプレートとして使用した。ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ　Ｋｉｔ（東洋紡）を使用して、プロトコールに従って実行した。各ターゲット遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲデータは、それぞれ生物試料による３反復（１反復あたり３回）のＰＣＲ反応を行い、平均発現レベルを示した。オオムギアクチン遺伝子（アクセッション番号ＤＮ１８２５００）は、文献（Ｓａｋｕｍａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１７）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１７５（４）：１７２０－１７３１）に記載された方法に従って、各サンプルの発現レベルを正規化するための内因性コントロールとして使用した。相対的な遺伝子発現は、２－ΔＣｔ法を使用して分析した。
　（１２）ＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリング
　ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に使用される植物は、空調温室で育てた。幼穂組織は、野生型ＯＵＨ６０２と突然変異体４４２０５から、栄養生長期（ＶＥＧ期）、二重***期（ＤＲ期）、芒原基期（ＡＰ期）、緑葯期（ＧＡ期）の４つの穂の発達段階でそれぞれ収集した。４つの段階のそれぞれで、６つのバイオロジカルレプリケートサンプルを収集し、各レプリケートには、ＶＥＧ期の６つの植物からの１２のシュート、ＤＲ期の５つの植物からの１０のシュート、ＡＰ期の５つの植物からの５つの幼穂、ＧＡ期の３つの植物からの３つの幼穂、のバルクサンプルを含む。すべてのサンプルは直ちに液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出まで保存するために－８０℃に移した。網室条件および空調温室下で収穫された芒原基期のサンプルのＲＮＡは、ＲＮＡ－ｓｅｑにも使用した。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、続いてＲＮＡ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してゲノムＤＮＡのコンタミネーションを除去した。ＲＮＡサンプルの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して評価した。ＲＮＡ－ｓｅｑの場合、ＴｒｕＳｅｑ　ＲＮＡサンプル調製キットｖ２（イルミナ）を使用して、各サンプルの１μｇの全ＲＮＡから鎖特異的ＲＮＡライブラリーを構築し、イルミナＨｉＳｅｑ　Ｘシーケンスプラットフォーム（イルミナ）２レーン（ペアエンド１５０ｂｐ）で解析した。
　シーケンシング後、すべてのサンプルからのシークエンス配列の品質をＦａｓｔＱＣ　ｖ０．１１．８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）で評価し、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ　ｖ０．３８（Ｂｏｌｇｅｒ，　ＡＭ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１４）　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　１；３０（１５）：２１１４－２１２０）でアダプターシーケンスと低品質のシークエンスを削除した。残ったリードを、ＨＩＳＡＴ２　ｖ２．１．０（Ｋｉｍ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１５）　Ｎａｔ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　１２：３５７－３６０）を使用して、オオムギリファレンスゲノム（Ｍｏｒｅｘ＿ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＿ｖ２．ｆａｓｔａ；Ｊａｙａｋｏｄｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２０）　Ｎａｔｕｒｅ，　５８８（７８３７）：２８４－２８９）にマッピングした。遺伝子のアノテーション（Ｍｏｒｅｘ．ｇｆｆ；Ｊａｙａｋｏｄｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２０）　Ｎａｔｕｒｅ，　５８８（７８３７）：２８４－２８９）に基づいて、遺伝子にマッピングしたリードは、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ　ｖ１．６．３（Ｌｉａｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１４）　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　３０（７）：９２３－９３０）を使用して発現レベルとしてカウントされ、カウントされたリードはさらに１００万リードあたりの各遺伝子座の転写産物量（ＴＰＭ）に変換した。遺伝子発現差（ＤＥＧ）解析（空調温室と網室からの芒原基期のサンプル）は、Ｒ環境でＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｅｄｇｅＲを使用して実施した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，　Ｍ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　２６（１）：１３９－１４０）。発現レベルは、Ｍ値のトリム平均（ＴＭＭ）法によって正規化し、Ｐ値を負の二項分布に基づく正確なテストによって計算し、遺伝子発現の変動は、ｅｄｇｅＲのｌｏｇ２倍の変化によって推定した。Ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，　Ｙ．　＆　Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，　Ｙ．，　（１９９５）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ：　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｂ　（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）　５７（１）：２８９－３００）を使用した偽発見率（ＦＤＲ）によって調整した。ＦＤＲ＜０．０５およびｌｏｇ２＞０．５の場合、ＤＥＧは有意であるとみなした。すべてのＤＥＧの注釈は、シロイヌナズナ（ＴＡＩＲ１０＿－４０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）およびイネ（ＩＲＧＳＰ－１．０＿ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ－ｐｒｏｔｅｉｎ＿２０２０－０９－０９；ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）のタンパク質データベースに対するＲｅｃｉｐｒｏｃａｌ　Ｂｅｓｔ　Ｈｉｔｓ（ＲＢＨ）メソッドを使用したＢＬＡＳＴｐ検索結果（１０－８のＥ値カットオフ）に基づいた。
　遺伝子発現データのヒートマップは、Ｒパッケージｐｈｅａｔｍａｐ　ｖ１．０．１２を使用して視覚化し、各段階での遺伝子発現レベルは、６つの生物学的複製からの平均ＴＰＭとして測定し、ｌｏｇ２（平均ＴＰＭ＋１）値に変換した。階層的クラスタリングは、それらの表現パターンに基づいてヒートマップ解析を実施した。
　（１３）スプライシングイベントの検出
　二重***期、芒原基期、緑葯期のＲＮＡ－ｓｅｑデータからのマップされたリードが入ったＢＡＭファイルを、ＳＡＭｔｏｏｌｓ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．９．を使用して、野生型ＯＵＨ６０２と突然変異体４４２０５の各遺伝子型に対してマージした。野生型ＯＵＨ６０２と突然変異体４４２０５のマージされたリードを再カウントし、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅバージョン２．１．４（Ｐｅｒｔｅａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１５）　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，　３３（３）：２９０－２９５）によりＯＵＨ６０２と突然変異体４４２０５の新しい遺伝子モデルアノテーションのＧＴＦファイルを作成した。スプライスジャンクションは、１０を超えるマップされた読み取りでサポートされている場合にのみ有効とした。結果は、文献（Ｇａｒｒｉｄｏ－Ｍａｒｔｉｎ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１８）　１９（１）：６７）に記載された方法に従い、Ｒ環境に組み込まれたｇｇｓａｓｈｉｍｉパッケージを使用して視覚化した。
　（１４）統計分析
　すべての実験データは、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表示した。スチューデントのｔ検定を使用して、野生型とｓｏｆ１変異体の表現型の比較、およびサンプル間の遺伝子発現レベルの違いを調べた。サンプル間の有意な効果は、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔの大きさによって評価した（Ｐ値＜０．０５）。
　Ｂ．結果
　（１）突然変異体と野生型の表現型の解析
　突然変異体４４２０５と野生型ＯＵＨ６０２を比較した場合、変異体では外穎と内穎の間がより引き離され、より広い開花角度をもつ「超開花」の表現型を示す（図１ＡおよびＢ）。中央の小穂を観察すると、鱗被がより大きく、変異体ではるかに活発な細胞***を示した（図１Ｃ～Ｆ）。小花の表現型の測定では、変異体は野生型と比較して明らかに大きな開花角度を示した。すなわち、鱗被のサイズが増大し、突然変異体の外穎と内穎が引き離された（図１ＧおよびＨ、図２ＡおよびＢ）（Ｐ＜０．０１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）。変異体と野生型の最も重要な違いは、それらの鱗被のサイズであり（図１Ｈ）、鱗被の長さによってのみ、この表現型を野生型と変異体の間で区別できた（図２Ｂ～Ｄ）。鱗被の伸長は、突然変異体において、より広い開花角度をもたらすと考えられた。さらに、鱗被の細胞の測定により、細胞数は野生型よりも変異体で有意に低く（図２Ｅ）、変異体の細胞長の顕著な増加に対応することが明らかになった（図２Ｆ）。これらの表現型の結果は、伸長した鱗被が変異体の細胞増殖によって引き起こされる可能性を示唆した。
　（２）ｓｏｆ１遺伝子座のマッピング
　超開花の表現型の原因となる遺伝的要因を調査するために、突然変異体４４２０５とＭｏｒｅｘ（非閉花受粉）の交配により、９３個体のＦ２分離集団を構築した。Ｆ１植物は、その親株Ｍｏｒｅｘと同様に、通常の開花角度と鱗被サイズを示した。Ｆ２の分離比は、３：１のメンデルモデル（７２の通常の開花植物と２１の超開花植物；χ２＝０．２９、Ｐ値＞０．０５）に適合し、超開花が単一の劣性遺伝子により制御されていることが判明した。この遺伝子を「ｓｏｆ１（ｓｕｐｅｒ　ｏｐｅｎ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　１）」と命名した。
　ｓｏｆ１遺伝子をマッピングするために、４０個体のＦ２植物でＲＡＤ－ｓｅｑ分析を使用した。遺伝子は、最初、染色体７ＨのＣ７＿７７０５５＿９６８９１４０１とＣ７＿６７０１１＿１６５７６９００３の間に位置していた。次に、９３のＦ２個体を用いた大まかなマッピングにより、ｓｏｆ１遺伝子座が染色体７Ｈ上のｆｌｕｉｄｉｇｍマーカーＦＢ０２７８とＦＢ００８８の間の３．３ｃＭ間隔に位置していることが確認された。追加のＣＡＰＳマーカーによるさらなるジェノタイピングおよび上記の９３個体の表現型分析により、ｓｏｆ１遺伝子座は、マーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２４６１００の間で遺伝距離１．１ｃＭの物理領域内に位置付けられた（図３Ａ）。最新のＭｏｒｅｘリファレンスゲノム（Ｊａｙａｋｏｄｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２０）　Ｎａｔｕｒｅ，　５８８：２８４－２８９）によると、この物理領域は約９．２Ｍｂであり、１１０個のアノテーション付き遺伝子と８個のアノテーションなしの偽遺伝子で構成される１１８個の遺伝子が存在した。
　ｓｏｆ１遺伝子の物理領域を絞り込むために、１７５９個体のｓｏｆ１変異体×Ｍｏｒｅｘを含む大規模なＦ２集団を使用して、組換えイベントをスクリーニングした。マーカーＨＭ７Ｈ２２８７００およびＨＭ７Ｈ２５４０００を使用して９９の組換え植物を同定した（図３Ｂ）。開花前に枯れた３つの植物と、矮性の表現型のために他の植物よりも小さい花器官を生成した１植物体を除いた、９５の組換え植物について鱗被の長さを測定した。鱗被の長さの分布は、３：１のメンデル分離に適合した（χ２＝０．０７、Ｐ値＞０．０５）。結果は、先のデータと一致しており、超開花が単一の劣性ｓｏｆ１遺伝子の下で制御されており、ｓｏｆ１がマーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２４６１００の間にあることが確認された。１３の重要な組換え体の表現型のさらなる遺伝子型分析および評価は、ｓｏｆ１の存在領域をマーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２３９１００の間の０．３７ｃＭ間隔に狭めた（図３Ｃ）。物理的距離は約３．１Ｍｂであり、文献（Ｊａｙａｋｏｄｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２０）　Ｎａｔｕｒｅ，　５８８：２８４－２８９）に記載されたＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３４２００とＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２４６１００の間の４３個のアノテーション付き遺伝子と５個のアノテーションなし偽遺伝子で構成されていた。
　（３）超開花表現型の遺伝的要因
　野生型ＯＵＨ６０２と突然変異体４４２０５の間の３．１Ｍｂ間隔にある遺伝子の多型を調査するために、変異体の全ゲノムショットガン配列決定を行い、野生型のゲノム配列と比較した。この標的領域内では、２つの遺伝子型間で３つのホモ接合多型のみが検出され、そのうち２つの１ｂｐ挿入は遺伝子間領域にあり、２２ｂｐ欠失は遺伝子内領域にあった。２２ｂｐの欠失は、野生型Ｓｏｆ１遺伝子のゲノムの１８０８０位から１８１０１位（転写開始点を１とする）に位置し、変異体における遺伝子の翻訳フレームシフト（ｐ．Ａｓｐ２６４６ｆｓ）を生じさせた（図４Ａ、Ｂ）。Ｈｏｒｖｕ＿ＯＵＨ＿７Ｈ０１Ｇ２１１３００は、Ｍｏｒｅｘゲノムの高信頼度遺伝子としてＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００に対応し、クロマチンリモデリングタンパク質様としてアノテーションが付けられた（Ｊａｙａｋｏｄｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０２０）　Ｎａｔｕｒｅ，　５８８：２８４－２８９）。候補遺伝子を検証するために、２２ｂｐの欠失に対して開発されたＩｎ－ｄｅｌマーカー（ＨＭ７Ｈ２３８１００－Ｉｎｄｅｌ）を使用して、１３の重要なＦ２組換え体の遺伝子型を決定し、続いて３つの組換え体のＦ３子孫の遺伝子型と表現型を分析した。その結果、Ｉｎ－ｄｅｌマーカーがｓｏｆ１と再結合しないことが示された。
　（４）Ｓｏｆ１の標的突然変異誘発
　Ｓｏｆ１に対応する遺伝子が、ＯＵＨ６０２ではＨｏｒｖｕ＿ＯＵＨ＿７Ｈ０１Ｇ２１１３００、ＭＯＲＥＸではＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００遺伝子であることを裏付けるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した突然変異誘発を使用して、オオムギ品種のＧｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅに追加の突然変異系統を作成した。ガイドＲＮＡの標的部位は、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅゲノム内のＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００のオルソログであるＨｏｒｖｕ＿ＧＯＬＤＥＮ＿７Ｈ０１Ｇ１９９０００遺伝子（変異体における２２ｂｐ欠失の近傍）を標的とした（図５Ａ）。得られた突然変異は、トランスジェニック植物の遺伝子型と配列決定の後、５ｂｐの欠失を持つ独立した突然変異（ｓｏｆ１－２）が得られた。これは、翻訳の早期終了につながる終止コドンの導入となり機能喪失遺伝子変異対立遺伝子と見なすことができた（図５Ａ）。Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅはｃｌｙ１遺伝子座に閉花性対立遺伝子（ｃｌｙ１．ｂ）を保持し小さな鱗被を形成するが、作成したゲノム編集系統はこの栽培品種に由来して、この閉花性対立遺伝子対立遺伝子を保持するため、潜在的にｓｏｆ１変異の効果が妨げられている。そこで、鱗被の発達に対するｃｌｙ１．ｂによる潜在的な負の影響を排除するために、ｓｏｆ１－２　Ｔ０系統は、非閉花性オオムギＳｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと交配し、遺伝子型がｓｏｆ１－２ｓｏｆ１－２Ｃｌｙ１＿のＦ３集団を作成して、その鱗被表現型を決定した（図５Ｂ）。その結果、Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと比較して、ｓｏｆ１－２変異体（Ｔ２）の鱗被の長さは有意に長かった（図６）。
　Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと比較して、Ｆ３植物は、かなり長い鱗被を持ち開花角度の大きい小花を示したが（図７）、鱗被の深さと幅に大きな違いはなかった。これらの結果は、ｓｏｆ１－２変異体の伸長した鱗被が、Ｈｏｒｖｕ＿ＧＯＬＤＥＮ＿７Ｈ０１Ｇ１９９０００の切断によって引き起こされ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００がＳｏｆ１の機能遺伝子と見なされることが示された。以上から、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００の２２ｂｐの欠失がｓｏｆ１変異体の超開花の原因であると結論づけた。
　（５）Ｓｏｆ１遺伝子の構造的特徴
　Ｓｏｆ１は、ｓｏｆ１の野生型対立遺伝子である。Ｓｏｆ１遺伝子は、開始コドンから停止コドンまでが２０７２０ｂｐ（配列番号：３）、全長ＣＤＳが１０３２６ｂｐ（配列番号：１）であり（図４Ａ）、２つのＳｎｆ２ファミリードメインを持つ予測される３４４１アミノ酸のタンパク質（ＳＯＦ１）をコードしていた（図４Ｂ）。１つは、ＳＮＦ２＿Ｎ（ＳＮＦ２ファミリーのＮ末端ドメイン）とＨｅｌｉｃａｓｅ＿Ｃ（ヘリカーゼ保存Ｃ末端ドメイン）で構成されるＡＴＰａｓｅドメインであり、もう１つは、ＳｎＡＣ（Ｓｎｆ２　ＡＴＰカップリング）ドメインである（図４Ｂ）。ＡＴＰａｓｅドメインとＳｎＡＣドメインは、ＳＯＦ１のＮ末端に位置するが、Ｃ末端領域に保存されたドメインは見つからない。野生型と比較して、ｓｏｆ１変異体は２２ｂｐの欠失を含み（図４Ａ）、フレームシフト変異（Ｄ２６５９Ｅｆｓ）を引き起こし、Ｃ末端領域の２６７７番目のアミノ酸に対応する塩基にストップコドンを導入し、最後の７６５アミノ酸（完全なＳＯＦ１タンパク質の約２２％）を欠く２６７６アミノ酸の切断されたタンパク質が生じる（図４Ｂ）。切断されたタンパク質は変異体の生物学的機能を失うと考えられた。ＳＮＦ２はＡＴＰ依存性のクロマチンリモデリング因子であり、転写、複製、相同組換え、ＤＮＡ修復などのＤＮＡイベントの多くの側面を制御している。ＳＯＦ１の機能を調べるために、ＳＯＦ１ホモログの系統発生分析を行った。植物種でのＢＬＡＳＴｐ検索に基づいて、単子葉植物と双子葉植物でＳＯＦ１ホモログが見つかり、系統発生分析に使用するために、各分類群からＳＯＦ１との同一性が高い上位のホモログをさらに選択した。他の３つのシロイヌナズナＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリーのメンバーは、相同タンパク質が属するクラスを推測するために含めた。系統樹は、すべてのＳＯＦ１ホモログがＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリー内にクラスター化されていることを示し、ＳＯＦ１がこのＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリー（ＳＷＩ／ＳＮＦ　ＡＴＰａｓｅ）に属し、これらの配列がオーソロガスであることを示唆した（図８）。ＳＷＩ／ＳＮＦ　ＡＴＰａｓｅはクロマチンを活性型状態にしてその遺伝子をＯＮする機能をもつ。このＳＷＩ／ＳＮＦのクラスターでは、ＳＯＦ１とＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＳＰＬＡＹＥＤ（ＳＹＤ）タンパク質は互いに密接に関連していた（図８）。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＳＹＤは複数のＭＡＤＳボックス遺伝子を介してさらに下流のｂＨＬＨ遺伝子のいくつかに作用し、花弁の大型化を抑制している。そのためＳＹＤの突然変異では花弁が大型化する。花弁のイネ科相同器官は鱗被である。したがって、ＳＹＤから発する遺伝子制御系は、オオムギｓｏｆ１突然変異における鱗被肥大化（超開花）のモデルの一つとすることができる。一方、ホモログであるＨＯＲＶＵ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ０４１６００．１は、ＭｏｒｅｘゲノムのＡＴＰ依存性ヘリカーゼファミリータンパク質としてアノテーションが付けられた。これは、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＢＲＡＨＭＡ（ＢＲＭ）と密接な関係を示し、ＮＣＢＩの保存ドメインデータベース（Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｒ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　４；４５（Ｄ１）：Ｄ２００－Ｄ２０３）によってＣ末端に潜在的なブロモドメインを含むことが示された。ＨＯＲＶＵ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ０４１６００．１がオオムギのＳＯＦ１パラログであることを示唆された。一方、ＯｓＳＹＤ（ＸＰ＿０１５６４２４５８．１）は、系統発生分析に基づいてＳＹＤオルソログの一つであり、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｓｓｐ　ｊａｐｏｎｉｃａのＳＹＤオルソログと報告されている（Ｓｕ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００６）　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　４６（４）：６８５－６９９、　Ｈｕ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１３）　Ｐｌａｎｔ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　７０：３３－４２）。これらの結果は、ＳＯＦ１がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＹＤのオルソログであることを示唆する。ＳＯＦ１（およびＳＹＤ）は単子葉植物と双子葉植物の両方で保持されており、これらのＳＯＦ１オルソログは共通の祖先に由来し、進化的に保存されていることを示唆する（図８）。したがって、Ｓｏｆ１はクロマチンリモデリングＡＴＰａｓｅタンパク質をコードしており、その機能はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＹＤやＯｓＳＹＤに類似している可能性がある。
　（６）Ｓｏｆ１の転写産物量プロファイリング
　Ｓｏｆ１の転写量を、穂全体または穂の発達段階にわたる個々の生殖器官、およびさまざまな栄養器官で調べた（図９）。ｑＲＴ－ＰＣＲプロファイリングにより、この遺伝子は野生型と変異体の両方で穂の発生段階全体で広く転写されることが明らかになった。野生型において、この遺伝子の転写は、緑の葯の段階で６つの花器官や葉鞘、葉身、節、節間の栄養器官で検出できたが、同じ芒原基期での幼穂も低かった。野生型より変異体の転写産物の量は、幼穂および生殖器官で有意に低かった（図９）。注目すべきことに、この遺伝子の転写レベルは、芒原基期から開花まで変異体で有意に減少し、鱗被でも明らかに減少した（Ｐ＜０．０１、図９）。転写産物量分析は、この遺伝子が栄養成長と生殖発達の間に機能を果たしている可能性があることを示唆した。
　（７）Ｓｏｆ１による推定転写調節
　Ｓｏｆ１の２２ｂｐの欠失の影響をトランスクリプトームで明らかにするために、野生型ＯＵＨ６０２と突然変異体４４２０５でＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。空調温室（自然光で２２℃）と網室で育成した植物の未成熟の穂（ａｗｎ　ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ　ｓｔａｇｅ）を解析した結果、２つの成長条件下において遺伝子型間でそれぞれ合計２４１２および１３７１の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）（ＦＤＲ＜０．０５および｜ｌｏｇ２ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ　｜＞０．５）を明らかとした。さらに、６７４の共通のＤＥＧは、野生型と比較して変異体において３９１（５８％）の発現誘導された遺伝子と２８３（４２％）の発現抑制された遺伝子から構成された。変異体におけるＳｏｆ１発現の低下は、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析でも確認でき、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＳｏｆ１の発現プロファイルの結果と一致していた。
　有意に発現抑制された遺伝子の中で、６つの花のホメオシス遺伝子を検出した。それは、Ｂクラス遺伝子（ＡＰ３－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ５３６５００およびＰＩ－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿１Ｈ０１Ｇ４０２０００）、Ｃクラス遺伝子（ＡＧ－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿３Ｈ０１Ｇ１７１３００）、Ｅクラス（ＡＧＬ６－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ３９５９００およびＳＥＰ－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ３２８２００），ＳＶＰ－ｌｉｋｅ遺伝子（Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿４Ｈ０１Ｇ４５４７００）であり、これらの遺伝子はそれぞれイネのＯｓＭＡＤＳ１６、ＯｓＭＡＤＳ４、ＯｓＭＡＤＳ３、ＯｓＭＡＤＳ６、ＯｓＭＡＤＳ６とホモログであった。特に、ＯｓＭＡＤＳ１６（Ｎａｇａｓａｗａ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００３）　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１３０（４）：７０５－１８、Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００７）　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　５（６）：８３５－８４６）、ＯｓＭＡＤＳ３（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００６）　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　１８（１）：１５－２８、Ｄｒｅｎｉ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１１）　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　２３（８）：２８５０－２８６３）、ＯｓＭＡＤＳ６（Ｌｉ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　Ｃｅｌｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２０（３）：２９９－３１３）およびＯｓＭＡＤＳ７の遺伝子（Ｃｕｉ，　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１０）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，　６１（５）：７６７－７８１）は、イネの変異体を介して鱗被の発達について報告されている。
　（８）開花性の相違による受粉効率の推定
　（１５）受粉効率の推定
　受粉効果を推定するために、開花型２品種（Ａｄｏｒｒａ，　Ｓｖ７３５２８）および閉花型１品種　（カワサイゴク）の細胞質雄性不稔系統を使用し、鉢植した植物体の開花期に物理的に開頴して、芒をテープで固定後、人工授粉して登熟し、着粒数によって受粉効果を推定した。その結果、開花型のＡｄｏｒｒａおよびＳｖ７３５１０８においては５倍以上の顕著な受粉効果（着粒数の増加）が認められ、閉花型の「カワサイゴク」においても、その効果は明らかであった（表１）。
　なお、授粉しない雄性不稔系統の穂には着粒は認められず、授粉処理以外に他の個体の花粉などによって受精しなかったことが確認された。受粉する個体の開花型変異には受粉率の向上による着粒数の大幅な向上が認められた。
　（８）コムギ相同遺伝子の同定と解析
　コムギ品種Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇのゲノム情報からコムギ相同遺伝子配列を取得した。同定した各コムギＳｏｆ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：４、７、１０に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：６，９、１２に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５、８、１１に示す。オオムギＳｏｆ１と同様に、コムギでも根、葉、穂などのさまざまな器官で強く発現することが判明した（図１０）。さらに、ＴＩＬＬＩＮＧ法により、コムギ品種ＫｒｏｎｏｓおよびＣａｄｅｎｚａにおいて、コムギＳｏｆ１遺伝子の突然変異体を複数系統選抜することに成功した。
　以上説明した通り、本発明によれば、開花性が向上したムギを生産することが可能となる。本発明は、ムギ新品種の開発の効率を大きく高めることができることから、農業分野における穀物の生産性の向上に貢献する。

Claims (5)

  1. 　開花性が向上したムギの生産方法であって、ムギにおいて、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能を人為的に抑制することを含む方法。
    （ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
    （ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
  2. 　下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能が人為的に抑制された、開花性が向上したムギ。
    （ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
    （ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
  3. 　ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む方法。
    （ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
    （ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
  4. 　ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の発現を解析することを含む方法。
    （ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
    （ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
  5. 　開花性が向上したムギを生産する方法であって、請求項２に記載のムギと他の任意のムギとを交配させることを含む方法。
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