JP2022163165A - 抗原特異的t細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ら誘導されたiPS細胞を、CD4/CD8ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、
前記CD4/CD8ダブルネガティブ細胞のT細胞受容体に刺激を与える工程と、T細胞
受容体に刺激を与えた前記CD4/CD8ダブルネガティブ細胞をCD8シングルポジテ
ィブ細胞及び/又はCD4シングルポジティブ細胞に分化させる工程とを含む、抗原特異
性を有するヒトCD8シングルポジティブ細胞及び/又はCD4シングルポジティブ細胞
の製造方法に関する。また、本発明は、該方法により製造された、抗原特異性を有するヒ
トCD8シングルポジティブ細胞又はCD4シングルポジティブ細胞に関する。
す細胞である。特に、細胞傷害性T細胞(CTL)は、その細胞表面上に存在するT細胞
受容体(TCR)を介して、抗原提示細胞のクラス1主要組織適合抗原(MHCクラス1
、HLAクラス1)と共に提示された、ウィルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、
異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して、特異的に細胞傷害活性を発揮し、攻
撃するようになる。さらに、CTLの一部は、長期生存型メモリーT細胞となって、異物
に対する細胞傷害性を維持したまま宿主内に記憶され、次に同じ異物に曝露された場合に
対応できるようになっている。ゆえに、微生物、ウィルス感染及び新生物(腫瘍)と闘う
免疫系において、CTLは主要な要素として機能している(非特許文献1及び2)。
8SP細胞は、胸腺内において、TCRを発現しておらず、CD4もCD8も有さない未
成熟な細胞(CD4/CD8ダブルネガティブ(DN)細胞)から、CD8及びCD4が
共に発現している細胞(CD4/CD8ダブルポジティブ(DP)細胞)を経て、分化し
てくることが知られている。
特異的に認識した際に、それらの増殖機能及びエフェクター機能は発揮し始める。このよ
うに、T細胞免疫の最大の利点は、長期生存型メモリーT細胞による長期間の免疫監視の
他、標的細胞に対しての特異的な認識と該細胞の撲滅とにある(非特許文献3~5)。
に対する不十分な認識によってしばし妨げられる。すなわち、持続する潜在的ウィルス感
染又はがん/自己抗原への曝露は、T細胞の長期生存能、増殖能及びエフェクター機能を
損なわせ、T細胞をひどく消耗させる。そして、しまいには抗原応答T細胞プールを失う
ことになる(非特許文献6及び7)。
ーを発現している抗原特異的T細胞を用いる養子免疫療法は有望な治療法であるとして注
目されている。しかしながら、抗原特異的末梢T細胞の体外増幅は、患者由来の検体を体
外処理している間に、前記同様のT細胞機能の損失が生じてしまうため、大量に体外増幅
させたT細胞を利用しても、今までのところ十分な治療の有効性を示すに至っていない(
非特許文献8)。
ローチの開発も進められている(非特許文献9及び10)。しかしながら、このアプロー
チによる治療効果は、誘導・増幅されたT細胞の抗原特異性に大きく依存するはずである
(非特許文献11及び12)。ことに、このような造血幹細胞又は末梢成熟T細胞を抗原
特異的T細胞に誘導するために外来的にTCRを導入した際には、通常、誤対合TCRが
生じることも明らかになっている。
特許文献13)。しかしながら、造血幹/前駆細胞を用いてすら、十分に機能的なヒトT
細胞への分化法が確立されていないため、実用化には多くの困難があることが想定される
。
L(CD8シングルポジティブ)細胞の製造方法の開発が強く求められ、様々な試行錯誤
が行われてきたが、有効な方法は提供されるに至っていなかった。
る人工多能性幹細胞(誘導性多能性幹細胞、iPS細胞)の技術の可能性を探り、TCR
遺伝子の再構成が終了しており抗原特異性を有するヒトT細胞から、iPS細胞(以下、
「T-iPS細胞」とも称する)を樹立することに成功した。そして、該T-iPS細胞
からT細胞に分化誘導することにも成功し、さらには、該方法により元のT細胞と同じ遺
伝子再構成パターンを有するT細胞(すなわち、元のヒトT細胞が認識する抗原に対して
特異性を示すT細胞)が得られることも明らかにした(特許文献1)。
胞を樹立し、さらに該T-iPS細胞からT細胞に分化誘導する方法が開発されている。
また、該方法により、元のT細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するT細胞が得られる
ことも明らかにされている(特許文献1)。
遺伝子再構成パターンを有するT細胞の頻度は、4分の1程度であることが新たに見出さ
れた。
化して得られたT細胞において、元のヒトT細胞と同じTCR遺伝子の再構成パターンを
有するT細胞(すなわち、元のヒトT細胞が認識する抗原に対して特異性を示すT細胞)
の出現頻度を顕著に向上させることを目的とする。
、最も未成熟な段階(CD4/CD8DN段階)にあるT細胞においては、通常TCRは
発現していないことが知られていることから、本発明者らは、まず、T-iPS細胞をT
細胞に再分化させる過程におけるTCRの発現の検証を行った。
胸腺内のT細胞の成熟過程における従来の知見とは異なり、CD4/CD8DN段階でも
TCRが発現していることが判明した(後述の実施例1 参照)。
したTCRシグナルは、RAG遺伝子の発現を停止させ、TCR遺伝子の更なるアセンブ
ルを抑制することが知られている。さらに、抗CD3抗体刺激により発生させたTCRシ
グナル様シグナルが、同様の効果を奏することも明らかになっている。
胞で発現しているTCRに対して刺激を与えることにより、TCR遺伝子の更なるアセン
ブルを抑制し、元のT細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するT細胞の出現頻度を向上
させることが可能か否かの検証を行った。さらに、このような刺激を与えたCD4/CD
8DN細胞に、CD8系譜選択に寄与している分子を作用させることにより、該細胞をC
D8SP細胞に分化させることが可能か否かの検証も行った(後述の実施例1 参照)。
CD3抗体等により刺激を与え、さらに、このような刺激を与えられたCD4/CD8D
N細胞に対してCD8系譜選択に寄与するIL-7等の分子を作用させることにより、元
のヒトT細胞と同じTCR遺伝子の再構成パターンを有するCD8SP細胞の出現頻度を
顕著に向上させることが可能であることを見出した。さらに、このようにして製造された
CD8SP細胞は、元となったT細胞よりもテロメアの長さが長く、高い増殖性(複製能
)を有していることをも見出した。また、T-iPS細胞由来のCD4/CD8DN細胞
で発現するTCRに対して抗CD3抗体等により刺激を与え、さらに、このような刺激を
与えられたCD4/CD8DN細胞に対してIL-7等の分子を作用させることにより、
CD4SP細胞を得ることもできた。
ヒトCD8シングルポジティブ細胞の製造方法であって、ヒトT細胞から誘導されたiP
S細胞を、CD4/CD8ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、前記CD4/CD
8ダブルネガティブ細胞のTCRに刺激を与える工程と、TCRに刺激を与えた前記CD
4/CD8ダブルネガティブ細胞をシングルポジティブT細胞、具体的には、CD4シン
グルポジティブ細胞又はCD8シングルポジティブ細胞に分化させる工程とを含む、方法
を提供するものである。
T細胞、具体的には、CD4シングルポジティブ細胞及びヒトCD8シングルポジティブ
細胞をも提供するものである。
(1)抗原特異性を有するヒトシングルポジティブT細胞の製造方法であって、
ヒトT細胞から誘導されたiPS細胞を、CD4/CD8ダブルネガティブ細胞に分化
させる工程と、
前記CD4/CD8ダブルネガティブ細胞のT細胞受容体に刺激を与える工程と、
T細胞受容体に刺激を与えた前記CD4/CD8ダブルネガティブ細胞をシングルポジ
ティブT細胞に分化させる工程とを含む、方法。
(2)シングルポジティブT細胞が、CD8シングルポジティブ細胞である、上記(1)
に記載の方法。
(3)ヒトT細胞が、抗原特異性を有する、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)上記(1)~(3)のいずれかに記載の方法により製造された、抗原特異性を有す
るヒトシングルポジティブT細胞。
(5)上記(4)に記載のヒトシングルポジティブT細胞を含んでなる医薬組成物。
して得られたT細胞において、元のヒトT細胞と同じTCR遺伝子の再構成パターンを有
するT細胞の出現頻度を極めて高くすることが可能となる。
本発明は、ヒトT細胞から誘導されたiPS細胞(以下、「T-iPS細胞」ともいう
)を、CD4/CD8ダブルネガティブ(DN)細胞に分化させる工程と、前記CD4/
CD8DN細胞のT細胞受容体に刺激を与える工程と、T細胞受容体に刺激を与えた前記
CD4/CD8DN細胞をシングルポジティブT細胞、具体的には、CD8SP細胞及び
/又はCD4SP細胞に分化させる工程とを含む、抗原特異性を有するヒトCD8SP細
胞及び/又はCD4SP細胞の製造方法を提供する。
ても、免疫機能が低下している人や、悪性腫瘍、慢性感染症などの感染症、自己免疫疾患
等を患っている人であってもよい。本発明によって得られるヒトCD8SP細胞又はCD
4SP細胞を免疫細胞治療に用いる場合は、拒絶反応が起こらないという観点から、T細
胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたT細胞が投与されるヒトとHLAの型が
一致していることが好ましく、本発明によって得られたT細胞が投与されるヒトと同一人
であることがより好ましい。
r、TCR)と称される抗原受容体を発現している細胞、及びその前駆細胞(TCR(T
CRαβ)が発現していないプロT細胞、TCRβとプレTCRαとが会合しているプレ
T細胞等)を意味する。また、「CD4/CD8ダブルネガティブ(DN)細胞」とは、
CD4及びCD8が共に発現していないT細胞を意味し、「CD4/CD8ダブルポジテ
ィブ(DP)細胞」とは、CD4及びCD8が共に発現しているT細胞を意味し、「CD
8シングルポジティブ(SP)細胞」とは、CD4及びCD8のうち、CD8のみが発現
しているT細胞を意味する。また、「CD4シングルポジティブ(SP)細胞」とは、C
D4及びCD8のうち、CD4のみが発現しているT細胞を意味する。
ているT細胞であり、例えば、CD8陽性細胞である細胞傷害性T細胞が挙げられる。「
iPS細胞へ誘導されるヒトT細胞」としてはまた、CD3及びCD4が発現しているT
細胞であり、例えば、CD4陽性細胞であるT細胞が挙げられる。このようなヒトT細胞
の具体例としては、CD4陽性細胞であるヘルパー/制御性T細胞、CD8陽性細胞であ
る細胞傷害性T細胞(CTL)、ナイーブT細胞(CD45RA+CD62L+細胞)、
セントラルメモリーT細胞(CD45RA-CD62L+細胞)、エフェクターメモリー
T細胞(CD45RA-CD62L-細胞)、及びターミナルエフェクターT細胞(CD
45RA+CD62L-細胞)が挙げられる。なお、T細胞における抗原特異性は、抗原
特異的な、再構成されたTCR遺伝子によりもたらされる。なお、製造効率の観点からは
、特にこれに限定されないが、抗原特異的CD8SP細胞を得るためには、iPS細胞へ
誘導されるヒトT細胞としては、抗原特異的CD8陽性T細胞を用いることが好ましく、
抗原特異的CD4SP細胞を得るためには、iPS細胞へ誘導されるヒトT細胞としては
、抗原特異的CD4陽性T細胞を用いることが好ましい。また、後述する免疫療法を実施
する場合、iPS細胞から分化させるヒトT細胞は、iPS細胞へ誘導されるヒトT細胞
と抗原特異性が同一または実質的に同一であることが好ましい。
により単離することができる。ヒトの組織としては、前記T細胞を含む組織であれば特に
制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙
げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点か
ら、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトT細胞を単離するための公知の手法としては、例え
ば、後述の実施例に示すようなCD4又はCD8等の細胞表面マーカーに対する抗体と、
セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌
や機能性分子の発現を指標に、所望のT細胞を単離することも出来る。かかる場合、例え
ば、T細胞は、Th1タイプかTh2タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、
そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のThタイプを有するT細胞を単離する
ことができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細
胞傷害性T細胞(CTL)を単離することが出来る。さらに、「所望の抗原特異性を有す
るT細胞」を含むヒトの組織より単離する場合には、所望の抗原を固定化したアフィニテ
ィカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させ
たMHC(主要組織適合遺伝子複合体)を多量体化させたもの(例えば、「MHCテトラ
マー」、「プロ5(登録商標)MHC クラスIペンタマー」)を用いて、ヒトの組織よ
り「所望の抗原特異性を有するT細胞」を精製することもできる。
potent stem cell)又は誘導性多能性幹細胞とも称される細胞であり、
前記T細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。「細胞初期化
因子」は、前記T細胞に導入されることにより、単独で、又は他の分化多能性因子と協働
して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であれば特に制限されることはないが、Oc
t3/4、c-Myc、Sox2、Klf4、Klf5、LIN28、Nanog、EC
AT1、ESG1、Fbx15、ERas、ECAT7、ECAT8、Gdf3、Sox
15、ECAT15-1、ECAT15-2、Fthl17、Sal14、Rex1、U
tf1、Tcl1、Stella、β-catenin、Stat3及びGrb2からな
る群から選択される少なくとも一種のタンパク質であるであることが好ましい。さらにこ
れらのタンパク質の中では、少ない因子で効率良くiPS細胞を樹立できるという観点か
ら、Oct3/4、c-Myc、Sox2及びKlf4(4因子)を前記T細胞に導入す
ることがより好ましい。国際公開第2011/096482号において示されている通り
、ヒトCD8陽性T細胞又はCD4陽性T細胞からiPS細胞への誘導効率をより高める
という観点から、OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC及びNANOGをヒトCD
8陽性T細胞又はCD4陽性T細胞に導入することがより好ましく、OCT4、SOX2
、KLF4、C-MYC、NANOG及びLIN28をヒトCD8陽性T細胞又はCD4
陽性T細胞に導入することが特に好ましい。また、得られる多能性幹細胞の癌化のリスク
を低くするという観点から、c-Mycを除く、Oct3/4、Sox2及びKlf4(
3因子)を前記T細胞に導入することがより好ましい。
細胞に細胞初期化因子を導入する方法)としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択
して用いることができる。例えば、前記細胞初期化因子をタンパク質の形態にて前記T細
胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイ
ン(PTD)融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジ
ェクション法が挙げられる。また、前記細胞初期化因子をコードする核酸の形態にて前記
T細胞に導入する場合においては、前記細胞初期化因子をコードする核酸(例えば、cD
NA)を、T細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベ
クターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸
カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクト
ロポレーション法にて細胞に導入することができる。
ウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、センダイウィルス等のウィルスベク
ター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、挿入変異が生じにくく、また遺伝子導入
効率が高く、導入される遺伝子のコピー数も多いという観点から、センダイウィルスを用
いて、前記細胞初期化因子をコードする核酸を前記T細胞に導入することが好ましい。
ター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、RSVプロモ
ーター、HSV-TKプロモーター等が挙げられる。また、かかるプロモーターは薬剤(
例えば、テトラサイクリン)の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝
子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、さらに、プロモーターの他
に、エンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子(例えば、ネオマイシン耐
性遺伝子)、SV40複製起点等を含有していてもよい。
示す通り、前記T細胞は、前記細胞初期化因子の導入前に、インターロイキン-2(IL
-2)の存在下にて抗CD3抗体及び抗CD28抗体によって刺激して活性化することが
好ましく、フィトヘマグルチニン(PHA)、インターロイキン-2(IL-2)、同種
抗原発現細胞、抗CD3抗体、及び抗CD28抗体からなる群から選択される少なくとも
1の物質によって刺激して活性化してもよい。かかる刺激は、例えば、後述の実施例にお
いて示すように、培地中に、PHA、IL-2、抗CD3抗体及び/又は抗CD28抗体
等を添加して前記T細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗C
D3抗体及び抗CD28抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さら
にこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を表面に
結合させた培養ディッシュ上で前記T細胞を一定期間培養することによって刺激を与えて
もよい。さらにまた、前記T細胞(例えば、ヒトT細胞)が認識する抗原ペプチドをフィ
ーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
制限はないが、1~100μg/mlであることが好ましい。また、培地中に添加するI
L-2の濃度としては特に制限はないが、1~200ng/mlであることが好ましい。
さらに、培地中に添加する抗CD3抗体及び抗CD28抗体の濃度としては特に制限はな
いが、前記T細胞の培養量の1~10倍量であることが好ましい。また、かかる刺激を前
記T細胞に与えるために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗CD3抗体及び抗CD
28抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗CD3抗体では
0.1~100μg/ml、好ましくは1~100μg/ml、抗CD28抗体では0.
1~10μg/mlであることが好ましい。
に十分な期間であって、前記細胞初期化因子の導入に必要な細胞数までT細胞を増殖しう
る期間であれば特に制限はないが、通常1~14日間であるが、1~6日間としてもよく
、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは2~7日間、より好ましくは2~4日間である
。さらに、遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培
養ディッシュ上にて培養することが好ましい。
添加する培地としては、例えば、前記T細胞の培養に適した公知の培地(より具体的には
、他のサイトカイン類、ヒト血清を含む、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)16
40培地、最小必須培地(α-MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、F
12培地等)を用いることができる。培地には、PHA、IL-2、抗CD3抗体及び/
又は抗CD28抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸(例えば、L-グルタミン)、抗生
物質(例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン)が添加してあっても良い。また、アポ
トーシスを抑制するという観点から、培地にIL-7及びIL-15を添加することが好
ましい。IL-7及びIL-15の添加濃度としては特に制限はないが、それぞれ1~1
00ng/mlであることが好ましい。
はないが、前記細胞初期化因子を導入した前記T細胞は、フィーダー細胞層上で培養する
のが好ましい。かかるフィーダー細胞としては特に制限はないが、例えば、放射線の照射
や抗生物質処理により細胞***を停止させたマウス胎児繊維芽細胞(MEF)、STO細
胞、SNL細胞が挙げられる。
いう観点から、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を前記T細胞に前記細胞初期化因
子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。
)阻害剤(バルプロ酸(VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC1293、
M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA等)、G9aヒストンメチルト
ランスフェラーゼ阻害剤(BIX-01294等の低分子阻害剤、G9aに対するsiR
NA等)、p53阻害剤(Pifithrin-α(PFT-α)等の低分子阻害剤、p
53に対するsiRNA等)を、前記T細胞に前記細胞初期化因子を導入する際、又はそ
の後において、培地に添加しておくことが好ましい。
、該ベクターが前記T細胞に結合し易くなるという観点から、硫酸プロタミンを培地に添
加しておくことが好ましい。
T細胞の培養に適した公知の培地から、iPS細胞の培養に適した培地に徐々に置換して
いきながら培養することが好ましい。かかるiPS細胞の培養に適した培地としては、公
知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ノックアウト血清代替物、L-グル
タミン、非必須アミノ酸、2-メルカプトエタノール、及びb-FGF等を含有する、ダ
ルベッコ変法イーグル培地/F12培地(ヒトiPS細胞培地)が挙げられる。
胞又はCD4陽性T細胞をiPS細胞に誘導する場合においては、iPS細胞への誘導効
率をより高めるという観点から、前記フィーダー細胞上に移し換えた後に、1~1000
μM ROCK inhibitorを更に添加した培地中、低酸素濃度条件(酸素濃度
:例えば、5%)下にて培養することが好ましく、また1~1000μM MEK in
hibitor(例えば、PD0325901)及び1~1000μM GSK3 in
hibitor(例えば、CHIR99021)を後述のコロニー形成まで培地に添加し
ておくことが好ましい。
の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例え
ば、後述の実施例において示すようなES細胞/iPS細胞様コロニーの形態を顕微鏡下
にて観察して選択する方法や、iPS細胞において特異的に発現することの知られている
遺伝子(例えば、前記細胞初期化因子)の遺伝子座に薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子
(GFP遺伝子等)をターゲッティングした組換え型のT細胞を用い、薬剤耐性やレポー
ター活性を指標として選択する方法が挙げられる。
うことの確認は、例えば、後述の実施例において示すような、選択された細胞における未
分化細胞特異的マーカー(ALP、SSEA-4、Tra-1-60、及びTra-1-
81等)の発現を免疫染色やRT-PCR等によって検出する方法や、選択された細胞を
マウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。また、
このようにして選択された細胞が前記T細胞由来であることの確認は、例えば、後述の実
施例に示すように、TCR遺伝子再構成の状態をゲノムPCRによって検出することによ
り行うことができる。
することができ、概ね、前記細胞初期化因子を前記T細胞に導入してから10~40日、
好ましくは14日~28日である。培養環境としては、上記にて特に断りのない限り、好
ましくは、5%CO2、35~38℃、より好ましくは37℃の条件である。
ヒトT細胞から誘導されたiPS細胞(すなわち、T-iPS細胞)をCD4/CD8
DN細胞に分化させるためには、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、先
ずはT-iPS細胞をフィーダー細胞(好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒト
ストローマ細胞)上にて、必ずしもサイトカインを含有しなくてもよいが、サイトカイン
、血清(例えば、ウシ胎児血清(FBS))、インスリン、トランスフェリン、亜セレン
酸ナトリウム、L-グルタミン、α-モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有す
る培地中にて培養することが好ましい。用いるストローマ細胞としては、造血系への分化
を誘導し易くするという観点から、放射線照射等の処理を施したOP9細胞、10T1/
2細胞(C3H10T1/2細胞)であることが好ましい。T-iPS細胞を効率良くC
D34造血前駆細胞に誘導させる観点では、培地に添加されるサイトカインは、VEGF
、SCF、TPO、SCF及びFLT3L群から選択される少なくとも1のサイトカイン
であることが好ましく、VEGF、SCF及びTPO、又は、VEGF、SCF及びFL
T3Lであることがより好ましい。また、培地としては、例えば、X-VIVO培地、イ
スコフ改変ダルベッコ培地(IMDM培地)、α-MEM、DMEMが挙げられるが、造
血前駆細胞等を含有する袋状の構造物(「T-iPSサック」又は「ESサック」とも称
する)の形成効率が高いという観点から、IMDM培地が好ましい。このT-iPS細胞
の培養期間としては、T-iPSサックを形成するまでの期間であることが好ましく、T
-iPS細胞の培養を開始してから好ましくは8~14日間、より好ましくは10~14
日間である。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、5%CO2、35~3
8℃、より好ましくは37℃の条件である。また、T-iPSサックの形成効率が高く、
T-iPSサックに含まれる血球細胞の数が多いという観点から、低酸素濃度条件(酸素
濃度:例えば、5~20%)下にて培養することがより好ましい。
たT-iPSサックに含有されている細胞(造血前駆細胞、CD34陽性細胞、血球細胞
等)は、サイトカインや血清(例えば、FBS)等を含有する培地中にて、フィーダー細
胞(好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞)上で培養すること
が好ましい。T-iPSサックの内部に存在する細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済
みの篩状器具(例えば、セルストレイナーなど)に通すことにより、分離することができ
る。この培養に用いるストローマ細胞としては、notchシグナルを介して、Tリンパ
球への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したOP9-DL1細胞
、OP9-DL4細胞、10T1/2/DL4細胞、10T1/2/DL1細胞であるこ
とが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、IL-7、FLT3L、
VEGF、SCF、TPO、IL-2、及びIL-15が挙げられる。特に限定されない
が、CD4SP細胞への分化では、SCF、TPO、FLT-3L及びIL-7のいずれ
か1つ以上、またはすべてを組み合わせて添加することができる。これらの中では、初期
T細胞の分化を助けるという観点から、IL-7及びFLT3Lが好ましい。T-iPS
細胞のNKT細胞への分化を抑制するという観点から、SCFは培地に含まれていないこ
とが好ましい。IL-7の培地への添加濃度としては、CD3陽性CD56陰性のT系譜
細胞が得られやすく、またCD8SP細胞又はCD4SP細胞への分化が誘導され易いと
いう観点から、好ましくは0.1~9.5ng/mlであり、より好ましくは1~4ng
/mlである。FLT3Lの培地への添加濃度としては、血球の増殖性を高めるという観
点から、0.1~100ng/mlであることが好ましい。培地としては、例えば、α-
MEM培地、DMEM培地、IMDM培地が挙げられるが、ストローマ細胞を維持し易い
という観点から、α-MEM培地が好ましい。また、培地には、IL-7及びFLT3L
以外にも、培養に必要なアミノ酸(例えば、L-グルタミン)、抗生物質(例えば、スト
レプトマイシン、ペニシリン)が添加してあっても良い。
して得られたCD4/CD8DN細胞の細胞表面上にT細胞受容体(TCR)が発現する
までの期間であることが好ましく、T-iPSサックに含有されている細胞の培養を開始
してから14~28日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、
好ましくは、5%CO2、35~38℃、より好ましくは37℃の条件である。
か否かは、後述の比較例1において示す通り、抗TCRαβ抗体、抗CD3抗体、抗CD
4抗体及び抗CD8抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価することができる(図
20 参照)。
後述の比較例1において示す通り、T-iPS細胞から再分化したT細胞において、R
AG1及びRAG2の発現は、CD4/CD8DN段階よりもCD4/CD8DP段階の
方がより強いことが、本発明者らによって初めて明らかとなった。さらに、T-iPS細
胞を再分化させたT細胞のTCRA mRNAにおいて、DN段階よりもDP段階の方が
、元のヒトT細胞とは異なるTCR遺伝子の再構成パターンを有する頻度が高いことが、
本発明者らによって初めて明らかとなり、T-iPS細胞をT細胞に再分化させる過程、
特にCD4/CD8DN段階からCD4/CD8DP段階に至る過程において、RAG1
及びRAG2により、TCRA遺伝子の更なるアセンブル(受容体修正)が生じているこ
とが強く示唆された。
胞においては、DN段階でもTCRが発現していることも本発明者らによって初めて明ら
かになった。通常の生体内では、T細胞はDN段階ではTCRを発現しない。従って、T
-iPS細胞を分化させて得られたDN細胞でTCRが発現していたことは、驚くべきこ
とであった。
Rシグナルは、RAG遺伝子の発現を停止させ、TCR遺伝子の更なるアセンブルを抑制
することが知られている。また、抗CD3抗体によるTCRシグナル様シグナルは、同様
の効果(すなわち、TCR遺伝子の更なるアセンブルを抑制する効果)を奏することも明
らかになっている。本発明者らは、T-iPS細胞から誘導したDN細胞に発現するTC
Rを刺激することにより、TCR遺伝子の更なる再構成を抑制することに成功し、これに
より、元のヒトT細胞と同じTCR遺伝子の再構成パターンを有するT細胞の出現頻度を
向上させることに成功した。
製造方法においては、T-iPS細胞由来のCD4/CD8DN細胞を、該細胞表面上に
発現しているTCRを介して刺激することにより、TCRA遺伝子の更なる再構成を抑制
することができ、ひいては、再分化して得られたCD8SP細胞及び/又はCD4SP細
胞において、元のヒトT細胞と同じTCR遺伝子の再構成パターンを有するT細胞の出現
頻度を極めて高くすることを可能としている。
ては、PHA、抗CD3抗体、抗CD28抗体、T-iPS細胞の元となったヒトT細胞
が特異的に結合する抗原ペプチド、前記T細胞受容体に対し拘束性を示すHLAとの複合
体を発現する細胞、該抗原ペプチドを結合させたMHC多量体、PMA及びイオノマイシ
ン(Ionomycin)からなる群から選択される少なくとも1の物質とT-iPS細
胞由来のCD4/CD8DN細胞とを接触させる方法が好ましく、生理的な刺激を与える
観点からは、特異ペプチド/HLA複合体発現細胞を接触させる方法がより好ましい。ま
た、刺激の均一性を重視する観点からは、抗体や試薬を接触させる方法がより好ましい。
添加して前記T細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗CD3
抗体及び抗CD28抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこ
れらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を表面に結合
させた培養ディッシュ上で前記T細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよ
い。さらにまた、前記抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによ
って刺激を与えても良い。
しては特に制限はないが、1~100μg/mlであることが好ましい。また、培地中に
添加する抗CD3抗体及び抗CD28抗体の濃度としては特に制限はないが、前記T細胞
の培養量の1~10倍量であることが好ましい。また、CD4/CD8DN細胞のTCR
を刺激するために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗CD3抗体及び抗CD28抗
体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗CD3抗体では0.1
~100μg/ml、抗CD28抗体では0.1~10μg/mlであることが好ましい
。
して得られたCD4/CD8DN細胞の細胞表面上にT細胞受容体(TCR)が発現する
あたりの期間を含むことが好ましく、T-iPSサックに含有されている細胞の培養を開
始してから7~29日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、
好ましくは、5%CO2、35~38℃、より好ましくは37℃の条件である。
ェクターメモリーT細胞及びエフェクターT細胞に分化できる多能性を有するCD8+メ
モリー幹細胞(幹細胞様メモリーT細胞(TSCM))の生成を増強するという観点から
、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β(GSK3β)に対する阻害剤を前記培地中に添
加してもよい。かかるGSK3βに対する阻害剤としては、GSK3βによるβ-カテニ
ンによるリン酸化が抑制することにより、Wntシグナル伝達経路を活性化できるもので
あればよく、例えば、4,6-二置換ピロロピリミジン化合物(TWS119)が挙げら
れる。なお、TSCMについては「Luca Gattinoniら、Nature M
edicine、2011年、17巻、1290~1298ページ」参照のこと。また、
GSK3βの阻害とTSCMの生成の増強との関連については「Luca Gattin
oniら、Nature Medicine、2009年、15巻、808~813ペー
ジ」参照のこと。
後述の実施例において示す通り、前記工程にて、T-iPS細胞由来のCD4/CD8
DN細胞を、該細胞表面上に発現しているTCRを介して刺激することにより、T-iP
S細胞が、DN段階からDP段階、さらにはSP段階(例えば、CD8SP段階又はCD
4SP段階)へと分化するにつれ生じ得るTCRA遺伝子の更なる再構成(受容体修正)
を抑制できることが明らかになった。
法においては、T-iPS細胞由来のCD4/CD8DN細胞を、該細胞表面上に発現し
ているTCRを介して刺激した後に、該細胞をシングルポジティブT細胞、具体的には、
CD8SP細胞又はCD4SP細胞に分化させることにより、再分化して得られたCD8
SP細胞又はCD4SP細胞において、元のヒトT細胞と同じTCR遺伝子の再構成パタ
ーンを有するT細胞の出現頻度を極めて高くすることを可能としている。
T-iPS細胞由来のT系譜細胞の中に、CD4/CD8DN細胞のみならず、CD4/
CD8DP細胞まで分化するものも存在する。従って、本「T細胞受容体に刺激を与えた
CD4/CD8DN細胞をシングルポジティブT細胞に分化させる工程」においては、T
細胞受容体に刺激を与えたCD4/CD8DN細胞をCD8SP細胞又はCD4SP細胞
に分化させる工程のみならず、DN段階においてTCRが刺激されているCD4/CD8
DP細胞をCD8SP細胞又はCD4SP細胞に分化させることが含まれる。
胞又はCD4SP細胞に分化させるために、CD4/CD8DN細胞は、サイトカインや
血清(例えば、ヒト血清)等を含有する培地中にて培養することが好ましい。培地に添加
するサイトカインとしては、CD4/CD8DN細胞をCD8SP細胞又はCD4SP細
胞に分化させることができるものであればよく、例えば、IL-7、IL-15、IL-
2が挙げられる。これらの中では、CD8SP細胞への分化において、CD8系譜を選択
させ、かつメモリー型CD8+T細胞生成が生じ易くさせるという観点では、IL-7及
びIL-15を組み合わせて添加することが好ましい。IL-7及びIL-15の添加濃
度としては特に制限はないが、1~20ng/mlであることが好ましい。培地としては
、例えば、RPMI-1640培地、X-VIVO培地、DMEM培地、α-MEM培地
が挙げられるが、血球細胞の生育により適しているという観点から、RPMI-1640
培地又はX-VIVO培地が好ましい。また、培地には、IL-7、IL-15等以外に
も、培養に必要なアミノ酸(例えば、L-グルタミン)、抗生物質(例えば、ストレプト
マイシン、ペニシリン)、IL-7、IL-15等以外のサイトカインが添加してあって
もよい。
。フィーダー細胞としては特に制限はないが、細胞接触等を介して、CD8SP細胞又は
CD4SP細胞への分化、増殖をより促進させるという観点から、末梢血単核球細胞(P
BMC)であることが好ましい。かかるPBMCとして、TCRへの効果的な刺激の観点
から、CD4/CD8DN細胞とはアロ(同種異系)の関係にあることが好ましい。また
、過剰なTCR刺激を防ぎつつ生存を援ける観点からは、CD4/CD8DN細胞とはオ
ート(同一人由来)の関係にあることが好ましい。また、TCRを刺激し続け、TCRの
更なる再構成を抑制し続けるという観点から、CD4/CD8DN細胞の元となったヒト
T細胞が特異的に結合する抗原ペプチドを提示する末梢血単核球細胞を用いることがより
好ましい。
培養期間としては、2~4週間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はな
いが、好ましくは、5%CO2、35~38℃、より好ましくは37℃の条件である。
107, 18939-18943.2010年、107巻、18939~18943ペ
ージ」において、マウス胸腺における異常に早期のTCRシグナル伝達は、リンパ腫発生
を引き起こす可能性が指摘されている。そのため、本発明のヒトCD8SP細胞又はCD
4SP細胞を製造する方法においては、早期(CD4/CD8DN段階)のTCRシグナ
ル活性化による腫瘍の発生を回避するという観点から、自殺遺伝子を利用した系を組み込
んでもよい。かかる「自殺遺伝子を利用した系」としては、例えば、「Antonio
Di Stasiら、N Engl J Med、2011年、365巻、1673~1
683ページ」に記載の、ヒトカスパーゼ9と改変FK結合タンパク質とからなる誘導性
のカスパーゼ9(iCasp9)をコードする遺伝子を利用する系や、「Kaneko,
S.ら、BLOOD、2009年、113巻、1006~1015ページ」、「Fabi
o Ciceriら、THE LANCET、2009年、10巻、489~500ペー
ジ」及び「Attilio Bondanzaら、blood、2011年、24巻、6
469~6478ページ」等に記載のチミジンキナーゼ(TK)遺伝子を利用する系が挙
げられる。
であり、また該T-iPS細胞の元となったT細胞由来であることの確認は、例えば、後
述の実施例に示すように、TCR遺伝子再構成の状態をゲノムPCRによって検出するこ
とにより行うことができる。
宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、後述の実施例に
示すようなCD8又はCD4等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用
いたフローサイトメトリーが挙げられる。「所望の抗原特異性を有するT細胞」をヒトよ
り単離する場合においては、所望の抗原(例えば、CD8SP細胞の場合は、CD8SP
細胞の元となったT細胞が認識する抗原、CD4SP細胞の場合は、CD4SP細胞の元
となったT細胞が認識する抗原)を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方
法、当該抗原を結合させたMHC多量体(例えば、MHCテトラマー)を用いて「所望の
抗原特異性を有するT細胞」を精製する方法を採用することもできる。
セントラルメモリーT細胞の表現型を代表するCD27及びCD28と共にCCR7が発
現しており、またテロメアも元となったT細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を
有している。従って、本発明によれば、元のT細胞と同一のTCR遺伝子の再構成パター
ンを有するT細胞(例えば、CD8SP細胞)であって、PD-1を発現せず、CD27
、CD28及びCCR7を発現する細胞を製造することができる。そして、ヒトから採取
したT細胞は、PD-1を発現し、CD27、CD28及びCCR7を発現しない点で、
得られたT細胞とは異なる。CD4SP細胞も同様であると考えられる。
1~2週間毎に、当該細胞に刺激を与えてもよい。かかる刺激としては、CD8SP細胞
に対しては、抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-7、IL-15、該CD
8SP細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたMHC多量体、該CD8SP細胞とア
ロの関係にあるフィーダー細胞及び該CD8SP細胞とオートの関係にあるフィーダー細
胞からなる群から選択される少なくとも1の物質との接触が挙げられる。同様にCD4S
P細胞に対しては、かかる刺激としては、抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、I
L-7、IL-15、該CD4SP細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたMHC多
量体、該CD4SP細胞とアロの関係にあるフィーダー細胞及び該CD4SP細胞とオー
トの関係にあるフィーダー細胞からなる群から選択される少なくとも1の物質との接触が
挙げられる。
本発明の方法によって製造されるヒトCD8SP細胞又はCD4SP細胞は、後述の実
施例において示す通り、抗原特異的な免疫機能を有する。さらに、特にCD8SP細胞は
、疲弊したT細胞(すなわち、長期生存能、自己複製能及び/又はエフェクター機能が著
しく弱まったT細胞)のマーカーの一つであるPD-1は発現していないのに対し、セン
トラルメモリーT細胞の表現型を代表するCD27及びCD28と共にCCR7が発現し
ており、またテロメアも元となったT細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有し
ている。このことは、CD4SP細胞においても同様であると考えられる。従って、本発
明の方法によって製造したヒトT細胞は、例えば、腫瘍、感染症(例えば、慢性感染症)
、自己免疫不全等の疾患の治療又は予防において有用である。
薬組成物、並びに該ヒトT細胞を用いた免疫細胞治療の方法(免疫細胞療法又は免疫療法
)を提供する。本発明は特に、本発明の方法によって製造したヒトCD8SP細胞及び/
またはヒトCD4SP細胞、該ヒトCD8SP細胞及び/又はヒトCD4SP細胞を含む
医薬組成物、並びに該ヒトCD8SP細胞及び/又はヒトCD4SP細胞を用いた免疫細
胞治療の方法を提供する。
胞をヒト、好ましくはHLA型が一致するヒト、より好ましくは治療対象者から採取する
。次に、T細胞からT-iPS細胞を作成し、次いで、T-iPS細胞を元のT細胞と同
じTCR遺伝子再構成パターンを有するT細胞、好ましくはCD4SP細胞又はCD8S
P細胞に分化させる。得られたT細胞は、セントラルメモリーT細胞の表現型を代表する
CD27及びCD28と共にCCR7が発現しており、PD-1は発現しておらず、また
テロメアも元となったT細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。従っ
て、所望により、得られた細胞は、CD27、CD28、CCR7及び/又はPD-1の
発現を確認しても良い。このようにして得られたT細胞は、治療対象者に投与することが
できる。
が、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与することが
でき、より好ましくは、静脈内投与することができる。あるいは、患部に局所投与するこ
ともできる。
SP細胞を、公知の製剤学的方法により製剤化することにより調製することができる。例
えば、カプセル剤、液剤、フィルムコーティング剤、懸濁剤、乳剤、注射剤(静脈注射剤
、点滴注射剤等)、などとして、主に非経口的に使用することができる。
理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐
剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、
滑沢剤、着色剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる
。また、前記疾患の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用し
てもよい。
態、組成物の種類(医薬品、飲食品等)等に応じて、適宜選択される。
るために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を
付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を
開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する
。
工程と、該所望の抗原特異性を有するT細胞からiPS細胞を誘導する工程と、該iPS
細胞をCD4/CD8ダブルネガティブ細胞に分化させる工程と、該CD4/CD8ダブ
ルネガティブ細胞のT細胞受容体に刺激を与える工程と、T細胞受容体に刺激を与えた該
CD4/CD8ダブルネガティブ細胞をCD8シングルポジティブ細胞及び/又はCD4
シングルポジティブ細胞に分化させる工程と、得られたCD8シングルポジティブ細胞及
び/又はCD4シングルポジティブ細胞をヒトの体内に投与する工程とを含む方法である
。
T細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたCD8SP細胞及び/又はCD4S
P細胞が投与されるヒトとHLAの型が一致していることが好ましく、本発明によって得
られたCD8SP細胞及び/又はCD4SP細胞が投与されるヒトと同一人であることが
より好ましい。投与されるヒトCD8SP細胞及び/又はCD4SP細胞は、本発明の方
法により製造されたヒトT細胞をそのまま投与してもよく、また、上記の通り、製剤化さ
れた医薬組成物の形態で投与してもよい。
実施例に限定されるものではない。また、下記実施例及び比較例においては、特に断りの
ない限り、以下の実験方法を用いて行った。
HLAはA24型であるHIV-1感染患者のPBMCsからNef138-8(wt
)特異的CTL株を、「Kawana-Tachikawa,A.ら、J Virol、
2002年、76巻、11982~11988ページ」の記載に沿って樹立した。
「Takayama,N.ら、J Exp Med、2010年、207巻、2817
~2830ページ」に記載の通り、最適化されたT細胞の培養条件によって、末梢血T細
胞又はCTLクローンからヒトiPS細胞を樹立した。
i Biotec社製)によって、末梢血T細胞を刺激し、活性化させた。一方、CTL
クローンは、PHA(Sigma-Aldrich社製)によって、刺激し、活性化させ
た。また、CTLクローンに関しては、放射線照射した前記HIV-1感染患者とは他人
由来のPBMCs(同種抗原発現細胞)による刺激によっても、活性化させた。なお、P
HAによる刺激を与えた場合と、同種抗原発現細胞による刺激を与えた場合とにおいて、
得られるT-iPS細胞の性状に大差はないことは確認している。
又はセンダイウィルスベクター(SeVベクター)を介して、再プログラミング因子を導
入し、RH10培地にて、10ng/ml(200U) IL-2、5~10ng/ml
IL-7及び5~10ng/ml IL-15(Peprotech社製)と共に培養
した。そして、徐々にbFGF等を含有するヒトiPS培地(Wako社製)に置換して
いった。
ra社製)上にて遠心することにより行った。また、RH10培地の組成は下記の通りで
ある。
10% ヒトAB血清、2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリン及び10
0ng/ml ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640。
ヒトiPS培地の組成は下記の通りである。
20% KSR、2mM L-グルタミン、1%非必須アミノ酸、10μM 2-メルカ
プトエタノール及び5ng/ml b-FGFを添加したDMEM/F12FAM。
(Invitrogen社製)により、樹立したiPSクローンにsiRNA L527
(「Nishimura,K.ら、J Biol Chem、2011年、286巻、4
760~4771ページ」 参照)を導入した。
<アルカリフォスファターゼ染色及び免疫細胞化学>
アルカリフォスファターゼ活性は、アルカリフォスファターゼ基質キットII(Vec
tor Laboratories社製)を用いて、その使用説明書に従って評価した。
、207巻、2817~2830ページ」の記載に沿って、下記抗体を用いて行った。括
弧内の数値は各抗体の希釈率を示す。
SSEA-4(1:50,FAB1435P,R&D Systems社製)
Tra-1-60(1:100,MAB4360,Millipore社製)
Tra-1-81(1:100,MAB4381,Millipore社製)
HLA-A24(1:100,BIH0964,Veritas社製)
顕微鏡写真は、AxioオブザーバーZ1蛍光顕微鏡(Carl Zeiss社製)を用
いて行った。
NOD-Scidマウスを用いた系におけるテラトーマ形成を通して、「Masaki
,H.ら、Stem Cell Res、2007年、1巻、105~115ページ」の
記載に沿って、ヒトiPS細胞の多能性を評価した。
ゲノムDNAを、メチルイージーエクシード急速DNAバイサルファイト変換キット(
MethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulphite Mo
dification Kit、Human Genetic Signatures社
製)を用い、その使用説明書に従って処理した。
Takara社製)を用いたPCRにより増幅した。得られたPCR産物は、pGEM-
T-Easyベクター(Promega社製)に挿入し、クローニングして、シークエン
シングに供した。PCRに用いたプライマーの配列(配列番号:5~8)を表1に示す。
ES細胞、iPS細胞及びT細胞から、RNイージーマイクロキット(RNeasy
micro kit、Qiagen社製)を用いて、トータルRNAを抽出した。次いで
、トータルRNAを鋳型として、大容量cDNA逆転写キット(High Capaci
ty cDNA Reverse Transcription Kit、Applie
d Biosystems社製)とランダム6塩基プライマーとを用いて、逆転写反応を
行った。RT-PCRは「Takayama,N.ら、J Exp Med、2010年
、207巻、2817~2830ページ」に記載の通りに行った。分析に用いた、標的遺
伝子及びPCRプライマーの配列(配列番号:9~43)を表2に示す。
Man Array Human Stem Cell Pluripotency C
ard and Customized Card、Applied Biosyste
ms社製)を用いて行った。
ゲノムDNAは、QIAamp DNAキット(Qiagen社製)を用いて、その使
用説明書に従って、約5x106細胞から抽出した。
OMED-2プロトコール(「van Dongen,J.J.ら、Leukemia、
2003年、17巻、2257~2317ページ」参照)に沿って行った。TCRB遺伝
子の再構成を分析するためのPCRに用いたプライマー(配列番号:44~81)を表3
に示す。
82~127)及びLATaq HS(Takara社製)を用いて、PCRを行った。
なお、PCRは、95℃にて30秒、68℃にて45秒及び72℃にて6分からなる増幅
工程を3サイクルと、95℃にて30秒、62℃にて45秒及び72℃にて6分からなる
増幅工程を15サイクルと、95℃にて15秒、62℃にて30秒及び72℃にて6分か
らなる増幅工程とを12サイクル行うようプログラムし、行った。予想される分子量の範
囲内の主なバンドをQIAクイックゲル抽出キット(Qiagen社製)を用いて精製し
、シークエンシングに供した。V、D及びJについてのセグメント使用は、オンラインツ
ール(IMGT/V-Quest)を使用し、ImMunoGeneTics (IMG
T)データベース(http://www.cines.fr/)と比較することにより
同定した(「Lefranc,M.P.、Leukemia、2003年、17巻、20
03年、260~266ページ」 参照)。遺伝子断片(セグメント)の命名は、IMG
T命名法に従った。
逆転写産物5’末端における乗り換え機構(switch mechanism at
the 5’-end of the reverse transcript)に基
づく方法(SMART法、「Du,G.ら、J Immunol Methods、20
06年、308巻、19~35ページ(2006)」 参照)にて、スーパースマートc
DNA合成キット(Super SMART(TM)cDNA synthesis k
it、Clontech Laboratories社製)を用いて、その使用説明書に
従って、二重鎖cDNAを合成した。合成した二重鎖cDNAはアドバンテージ2PCR
キット(BD Clontech社製)を用いて増幅し、増幅したcDNAから表5に示
すプライマー(配列番号:128~130)を用いてTCRA特異的増幅又はTCRB特
異的増幅を行った。得られたPCR産物は、pGEM-T-Easyベクター(Prom
ega社製)に挿入し、クローニングして、シークエンシングに供した。
細胞内のグランザイムBに染色するため、T細胞をα-CD3/28ビーズ及び10μ
g/ml ブレフェルジンA(BFA、Invitrogen社製)と共にインキュベー
トした。
ilization solution、BD Pharmingen社製)にて固定し
、FITC結合抗グランザイムB抗体(BD Bioscience社製)を用いて、そ
の使用説明書の通り、細胞内染色を行った。
8ビーズにてインキュベートし、FITC結合抗CD107a抗体(BioLegend
社製)と共に培養した。
cience社製)にて分取し、Flowjoソフトウェア(Treestar社製)を
用いて分析した。
ヒトES細胞、T-iPS細胞、再分化T細胞、末梢血T細胞及び末梢血NK細胞から
、全RNA(Total RNA)をRNeasyマイクロキット(Qiagen社製)
を用いて抽出した。
、Agilent Technologies社製)又はSurePrint G3ヒト
遺伝子発現8×60K(G4851A、Agilent Technologies社製
)とを、一色法(one-color protocol)にてハイブリダイズさせた。
そして、得られたシグナルデータは、GeneSpring GX ソフトウェア(Ag
ilent Technologies社製)を用いて分析した。
「Neuber,K.ら、Immunology、2003年、109巻、24~31
ページ」に記載の通り、DAKOテロメアPNAキット/FITC(DAKO社製)を用
いて、テロメアの長さを測定した。
抗原発現細胞として、HLA-A24発現自己B-LCLsを用いて、「Kawana
-Tachikawa,A.ら、J Virol、2002年、76巻、11982~1
1988ページ」及び「Tsunetsugu-Yokota,Y.ら、J Virol
、2003年、77巻、10250~10259ページ」の記載に沿って、IFN-γを
対象とするELISPOTアッセイ及び標準的な51Cr放出アッセイを行うことにより
、T細胞の抗原特異的応答性を測定した。
本実施例における全てのデータは、平均値±標準偏差(mean±S.D.)にて表わ
される。本実施例における全ての統計解析においては、エクセル(Microsoft社
製)及びPrism(Graphpad Software社製)を用い、不対2テール
(two-tailed)スチューデントのt検定を行い、P<0.05の値を有意とし
た。
<抗原特異的細胞傷害性T細胞クローンから多能性細胞への再プログラミング>
T細胞由来iPS細胞を樹立するため、本発明者らは健常被験者から提供された末梢血
単核球細胞(PBMCs)からCD3+T細胞を磁気的に単離した。次いで、単離したC
D3+T細胞を、10ng/ml IL-2存在下、前記CD3+T細胞量の3倍量の抗
ヒトCD3抗体及び抗ヒトCD28抗体でコートしたマイクロビーズ(α-CD3/CD
28ビーズ)にて刺激した。そして、このように活性化したCD3+T細胞に、OCT4
、SOX2、KLF4及びc-MYCを各々コードするレトロウィルスを導入した(図2
参照)。
V-1 Nefタンパク質由来の抗原ペプチド(Nef-138-8(wt);RYPL
TFGW、配列番号:1、「 Miyazaki,E.ら、AIDS、2009年、23
巻、651~660ページ」参照)に対して特異的なCD8+CTLクローンを樹立した
。当該クローンのうちのH25-4と名付けた1クローンを5μg/mlPHAにて刺激
した。そして、このように活性化したH25-4に2種のセンダイウィルス(SeV)ベ
クター:シストロニックに発現される4因子(OCT4、SOX2、KLF4及びc-M
YC)並びにmiR-302標的配列をコードするSeVベクター(SeVp[KOSM
302L]、「Nishimura,K.ら、J Biol Chem、2011年、2
86巻、4760~4771ページ」参照)と、SV40ラージT抗原をコードするSe
Vベクター(SeV18+SV40/TS15ΔF、「Fusaki,N.ら、Proc
Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci、2009年、85巻、
348~362ページ」参照)とを導入した。そして、これら2種のSeVベクターを、
PHAにて活性化したH25-4に導入することにより、その後40日間の培養において
、十分な数のヒトES細胞様コロニーの出現を確認することができた(図3及び4 参照)
。
様コロニー(各々「TkT3V1-7」及び「H254SeVT-3」とも称する)は、
アルカリフォスファターゼ(AP)活性を有しており、多能性細胞マーカー(SSEA-
4、Tra-1-60及びTra-1-81)の発現が認められた(図4及び5 参照)
。また、組み込まれたプロウィルス(TkT3V1-7)又は細胞質SeVRNAs(H
254SeVT-3)からの外因性再プログラミング因子の発現が終了しても、ヒトES
細胞関連遺伝子が発現していることも確認された(図6及び7 参照)。
ターンと、ヒトES細胞におけるそれとは類似していたが、末梢血T細胞におけるそれと
はかなり異なっていた(図6、8及び9 参照)。
ー領域においてメチル化が僅かに生じていることが確認された。従って、「Freber
g,C.T.ら、Mol Biol Cell、2007年、18巻、1543~155
3ページ」の記載に照らし合わせて、これらES様細胞において、再プログラミングが出
来ていることが明らかになった(図10及び11 参照)。
、913~916ページ」の記載に照らし合わせて、これらES様細胞をNOD-Sci
dマウスに注入した際には、三胚葉各々に由来する特徴的な組織を含有するテラトーマの
形成が認められ、これら細胞が多能性を有していることが明らかになった(図12及び1
3 参照)。
TCRαβ遺伝子の再構成は、胸腺における正常なαβT細胞の発達過程に関与してい
ることが知られている。そこで次に、前記にて樹立したT-iPS細胞はαβT細胞に由
来しているかどうかを、かかる再構成に基づき遡及的に確認した。すなわち、TCRB遺
伝子アセンブルを解析するための多重PCRプライマーを、BIOMED-2コンソーシ
アム(「van Dongen,J.J.ら、Leukemia、2003年、17巻、
2257~2317ページ」 参照)により設計した。また、TCRA遺伝子アセンブル
を検出するためのプライマーは独自に設計した(図1 参照)。そして、かかるプライマ
ーを用いて、PCRを行うことにより、前記T-iPS細胞におけるTCRαβ遺伝子の
再構成を検出した。得られた結果を図14~17に示す。
3V1-7及びH254SeVT-3各々のアレルにおいて、単一のバンドとして同定さ
れた。
びCDR3)によって構成されている。さらに、これら3領域において、様々なランダム
ヌクレオチド(N-ヌクレオチド又はP-ヌクレオチド)が挿入されているV(D)J結
合領域に及んでいるため、CDR3が最も多様な配列を有している(「Alt,F.W.
ら、Proc Natl Acad Sci USA、1982年、79巻、4118~
4122ページ」及び「Lafaille,J.J.ら、Cell、1989年、59巻
、859~870ページ」 参照)。
アセンブルされたTCRA及びTCRB遺伝子のCDR3について、それらの配列(配列
番号:131~133及び145~148)を決定した。得られた結果を表6~9に示す
。
CRA及びTCRB遺伝子のアセンブル、例えばインフレームで結合しており、ストップ
コドンがない構成を1セットずつ同定した。さらに、H254SeVT-3のCDR3配
列と、H25-4のそれとは、TCRA及びTCRB遺伝子領域において、完全に一致し
ていることも明らかになった。これらの結果から、単一のT細胞からiPS細胞が樹立さ
れたこと、並びに再プログラミングの過程においても、ゲノムDNAに刻まれている抗原
特異性は保存されていることが明らかになった。
<T-iPS細胞からT細胞への再分化>
次に、前記T-iPS細胞の造血分化能を調べるため、特異的なインビトロ分化プロト
コールに従って、前記T-iPS細胞を中胚葉に由来する種類の細胞、特に造血幹/前駆
細胞へと再分化させた(国際公開第2011/096482号、「Vodyanik,M
.A.ら、Blood、2005年、105巻、617~626ページ」及び「Taka
yama,N.ら、Blood、2008年、111巻、5298~5306ページ」
参照)。
H10T1/2細胞上に移し、20ng/mL VEGF、50ng/mL SCF及び
50ng/mL FLT-3L存在下(Peprotech社製)、EB培地にて共培養
した。EB培地の組成は下記の通りである。
15%ウシ胎児血清(FBS)と、10μg/mL ヒトインスリン、5.5μg/mL
ヒトトランスフェリン及び5ng/mL亜セレン酸ナトリウムからなるカクテルと、2m
M L-グルタミンと、0.45mM α-モノチオグリセロールと、50μg/mLア
スコルビン酸とを添加したIMDM。
に含まれている造血細胞(CD34+造血幹/前駆細胞)を回収し、それら細胞を放射線
照射済みのOP9-DL1細胞上に移した。OP9-DL1細胞は、文部科学省(日本)
のナショナルバイオリソースプロジェクトを通じて理研バイオリソースセンターより提供
された細胞である(「Watarai,H.ら、Blood、2010年、115巻、2
30~237ページ」 参照)。そして、10ng/mL FLT-3L及び1ng/m
L IL-7存在下、OP9培地内にて、造血細胞をT系譜細胞に分化させた(「Ika
wa,T.ら、Science、2010年、329巻、93~96ページ」参照)。O
P9培地の組成は下記の通りである。
15% FBS、2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリン及び100ng
/ml ストレプトマイシンを添加したαMEM。
D45+,CD38+,CD7+,CD45RA+,CD3+及びTCRαβ+のT系譜
細胞への分化が確認された(図18及び19 参照)。
詳細に特徴付けることができなかった少数のSP T細胞への分化もあったが、CD4/
CD8ダブルポジティブ(DP)段階にある細胞、及びより成熟したCD4シングルポジ
ティブ(SP)段階又はCD8シングルポジティブ(SP)段階にある細胞へと分化した
細胞群の存在も確認された。
8DP段階は、各々β鎖アセンブル段階又はα鎖アセンブル段階に相当する(「Von
Boehmer,H.Advances in Immunology、2004年、8
4巻、201~238ページ」 参照)。また、遺伝子アセンブルのネガティブフィード
バック制御及びTCRB遺伝子座における更なる再構成に対する抑止は、極めて厳格に行
われている(「Khor,B.ら、Current Opinion in Immun
ology、2002年、14巻、230~234ページ」参照)。一方で、比較的緩い
ネガティブフィードバック制御システム及びプレアセンブル遺伝子の更なる遺伝子アセン
ブルも行われており、この現象は、TCRA遺伝子座において生じる傾向にあり、「受容
体修正(receptor revision)」として知られている(「Huang,
C.ら、J Immunol、2001年、166巻、2597~2601ページ」及び
「Krangel,M.S.、Curr Opin Immunol、2009年、21
巻、133~139ページ」参照)。
伝子(例えば、Rag1及びRag2)の再活性化がDP段階において生じ、内在性Tc
ra遺伝子の遺伝子アセンブルも観察されている(「Petrie,H.T.ら、J E
xp Med、1993年、178巻、615~622ページ」及び「Padovan,
E.ら、Science、1993年、262巻、422~424ページ」参照)。
も生じるかどうかを明らかにするため、前記CD45+、CD3+、TCRαβ+及びC
D5+T系譜細胞から、CD1a-DN及びCD1a+DP段階にある細胞を集め、TC
RmRNAの発現及び配列(配列番号:131~149)を分析した。得られた結果を図
21、並びに表10~13に示す。
に分化が進んでいるCD8+SP段階にある細胞を集め、TCRmRNAの発現を分析し
た。得られた結果を表14及び15に示す。
塩基配列と、T-iPS細胞のそれらとは共に一致していた。
段階において、同一の配列と異なる配列とが含まれていた。また、DN段階よりもDP段
階の方が、高頻度にて異なる配列が確認され、特に、H254SeVT-3由来の再分化
DP細胞において、元のT細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているT細胞の頻度は
4分の1程度であった。
TCRA遺伝子においては、DN段階、DP段階、CD8+SP段階と分化が進むにつれ
、元のT細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有しているT細胞の頻度は、100%、89
%、75%と低下していることが明らかになった。
階において共に認められたが、DN段階よりもDP段階の方が、より強い発現が確認され
た。
<本発明の方法による、T-iPS細胞からCD8シングルポジティブ細胞への再分化
>
比較例1において示した通り、T-iPS細胞を再分化させたT細胞のTCRAmRN
Aにおいて、DN段階よりもDP段階の方が、元のヒトT細胞とは異なるTCR遺伝子の
再構成パターンを有する頻度が高いことが明らかになった。また、T-iPS細胞を再分
化させたT細胞において、RAG1及びRAG2の発現は、DN段階よりもDP段階の方
がより強いことが明らかになった。
ているDN段階でも、T-iPS細胞を再分化させたT細胞の細胞表面上においてTCR
(TCRαβ)が発現していることも初めて明らかになった。
78~781ページ」に記載の通り、「正の選択(positive selectio
n)」の過程において、ペプチド-MHC複合体を介したTCRシグナルは、RAG遺伝
子の発現を停止させ、TCR遺伝子の更なるアセンブルを抑制することが知られている。
また、抗CD3抗体によるTCRシグナル様シグナルは、同様の効果を奏することもTu
rkaらは確認している。
β)が発現しているという新規知見、並びにTCRシグナルを活性化させることにより、
RAG遺伝子の発現を停止させ、ひいてはTCR遺伝子の更なるアセンブルを抑制できる
という従前の報告に基づき、比較例1において示された受容体修正を伴うことなく、T-
iPS細胞由来のT系譜細胞から成熟CD8SP細胞を製造するため、DN段階からDP
段階への移行が完全に終了する前に、再分化T系譜細胞のTCRを刺激することを試みた
。
T-3)の小塊(<100細胞数以下)を放射線照射済みのC3H10T1/2細胞上に
移し、20ng/mL VEGF、50ng/mL SCF及び50ng/mL FLT
-3L存在下(Peprotech社製)、EB培地にて共培養した。培養14日目に、
iPSサックに含まれている造血細胞を回収し、それら細胞を放射線照射済みのOP9-
DL1細胞上に移し、10ng/mL FLT-3L及び1ng/mL IL-7存在下
、OP9培地内にて、造血細胞をT系譜細胞に分化させた。
5μg/ml PHAを前記OP9培地に添加することにより刺激し、T系譜に方向づけ
られた細胞を、OP9-DL1上にて培養し続けた(α-CD3/CD28ビーズ又はP
HAによる刺激を、第一の刺激とする)。
ng/mL IL-15の存在下、放射線照射済みのHLA-A24-PMBCsと共に
RH10培地にて培養した。
(「Chong,M.M.ら、Immunity、2003年、18巻、475~487
ページ」、「Singer,A.ら、Nat Rev Immunol、2008年、8
巻、788~801ページ」及び「Park,J.H.ら、Nat Immunol、2
010年、11巻、257~264ページ」 参照)、さらに、IL-7及びIL-15
については、メモリー型CD8+T細胞生成のために必要なことも報告されている(「B
ecker,T.C.ら、J Exp Med、2002年、195巻、1541~15
48ページ」、「Tan,J.T.ら、J Exp Med、2002年、195巻、1
523~1532ページ」、「Prlic,M.ら、J Exp Med、2002年、
195巻、F49~52ページ」及び「Kaneko,S.ら、Blood、2009年
、113巻、1006~1015ページ」 参照)。
HLA-A24の発現により、H254SeV-3の派生物であることが確認された。一
方、インビトロにて培養されたCD8+T細胞上にて発現しているCD56の発現は、そ
れらCD8SP細胞において認められた(CD56については、「Lu,P.H.ら、J
Immunol、1994年、153巻、1687~1696ページ」参照のこと)。
さらに、それらCD8SP細胞において、CD7も発現しており、CD2については一部
の細胞において発現は認められた。さらにまた、それらCD8SP細胞の殆どにおいて、
疲弊したT細胞のマーカーの一つであるPD-1は発現していなかった。一方で、それら
CD8SP細胞の一部において、セントラルメモリーT細胞の表現型を代表するCD27
及びCD28と共にCCR7の発現が認められた。なお、図25、後述の図26~39、
表8及び9は、第一の刺激としてPHAによる刺激を前記T系譜細胞に与えた場合におけ
る結果を示す図である。また、図には示さないが、第一の刺激としてα-CD3/CD2
8ビーズによる刺激を前記T系譜細胞に与えた場合も、PHAによる刺激を与えた場合と
同様の結果が得られることを確認している。
<本発明のCD8SP細胞の抗原特異性>
実施例1において得られた再分化CD8SP細胞は、元となったH25-4のTCR遺
伝子と同じ再構成パターンを有することにより、H25-4が特異性を示す抗原ペプチド
を認識できるかどうかを調べた。すなわち、実施例1において得られた再分化T細胞全部
と、A24/Nef-138-8(wt)テトラマーとを混合し、「Kawana-Ta
chikawa,A.ら、J Virol、2002年、76巻、11982~1198
8ページ」の記載に沿って、フローサイトメトリー分析を行った。なお、「A24/Ne
f-138-8(wt)テトラマー」は、H25-4が認識する抗原(Nef-138-
8(wt))及びHLA(A24)を4量体化させたものである。得られた結果を図26
に示す。
がA24/Nef-138-8(wt)テトラマーによって染色された。また、T-iP
S細胞由来のCD8SP細胞(CD8SPテトラマー陽性細胞及びCD8SPテトラマー
陰性細胞)における、CD8SP陽性細胞(抗原特異的CD8SP細胞)の比率は77%
であった。しかし、図には示さないが、コントロールとして用いた、HIV-1エンベロ
ープ由来のペプチド(RYLRDQQLL、配列番号:2)を提示するHLA-A24テ
トラマーによっては、T-iPS細胞由来のCD8SP細胞は染色されなかった。従って
、DN段階からDP段階への移行が完全に終了する前に、再分化T系譜細胞のTCRを刺
激することによって、比較例1において確認された元のT細胞と同じ遺伝子再構成パター
ンを有しているT細胞の頻度(4分の1)は、大幅に改善されることが明らかになった。
るCD8+細胞を集め、展開し、再度PHAによって刺激した(このPHAによる刺激を
、第二の刺激とする)。そして、このような再分化実験を数回独立して行うことにより、
最終的に、A24/Nef-138-8(wt)テトラマーに反応するCD8SP細胞(
reT-1,reT-2.1,reT-2.2及びreT-3)を得た。
図27並びに表8及び9に示す通り、元となったCD8T細胞クローンH25-4のTC
R遺伝子の再構成パターンと一致していることが明らかになった。また、かかるMHCテ
トラマーを認識する抗体どうしであってもアミノ酸配列(特にCDR3のアミノ酸配列)
は相違していることが多いが、表8及び9に示す通り、A24/Nef-138-8(w
t)テトラマーに反応するCD8SP細胞(reT-1,reT-2.1,reT-2.
2及びreT-3)と、元となったCD8T細胞クローンH25-4とにおいて、TCR
遺伝子の再構成パターンは完全に一致していることから、かかるデータからも、DN段階
からDP段階への移行が完全に終了する前に、再分化T系譜細胞のTCRを刺激すること
によって、比較例1において確認された元のT細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有して
いるT細胞の頻度(4分の1)は、大幅に改善されることが裏付けられた。
2.1における遺伝子発現プロファイルと、末梢血(PB) CD4+T細胞、PB C
D8+T細胞及びH25-4におけるそれらとを、定量的PCRによって比較した。得ら
れた結果を図28~30に示す。
及びCD8の発現パターンは、PB CD8+T細胞、再分化CD8SP細胞及び元にな
ったT細胞クローン H25-4(以後、「H25-4オリジナルT細胞クローン」とも
称する)間において、同じであった。
GZMB)、パーフォリン(PFR1)、IFN-γ(IFNG)及びFASリガンド(
FASLG)は、PB CD8+T細胞において発現しており、また、既に抗原刺激を受
けたT細胞である、CD8SP細胞及びH25-4オリジナルT細胞クローンにおいても
比較的高く発現していることも明らかになった。
分子における、いくつかの因子の発現パターンは、PB CD8+T細胞、再分化CD8
SP細胞及びH25-4オリジナルT細胞クローン間において、同じであった。
化CD8SP細胞である可能性を排除するために、再分化CD8細胞、H25-4オリジ
ナルT細胞クローン及び末梢血NK細胞において、全体的な遺伝子発現プロファイルをc
DNAマイクロアレイにて分析した。得られた結果を図31及び32に示す
図31及び32に示した結果から明らかな通り、再分化CD8SP細胞の遺伝子発現プ
ロファイルは、H25-4オリジナルT細胞クローンのそれとは類似していることが明ら
かになった。しかし、相関係数並びにクラスター解析によって、再分化CD8SP細胞と
NK細胞との相関は見出せなかった。従って、T-iPS細胞は、元になったT細胞と同
じ抗原特異性を示すCD8+T細胞に再分化できることが明らかになった。
<本発明のCD8SP細胞の高い増殖性>
実施例1において、6cmディッシュ上でのT-iPS細胞とOP9-DL1との共培
養から得られたT系譜細胞の数は、105個より少なかった。しかし、図には示さないが
、第一の刺激によって108個以上の細胞数まで増幅させることができた。そこで、本発
明の方法によって得られたCD8SP細胞の増殖性を調べるため、reT-1、reT-
2.2及びreT-3を、5μg/ml PHA、10ng/mL IL-7及び10n
g/mL IL-15にて刺激し、その後2週間における各細胞の増加率(増幅率)を測
定した。得られた結果を図33に示す。
ナルT細胞クローンは約20倍に増幅するのに対し、前記CD8+細胞は100~100
0倍に増幅した。
いては、セントラルメモリーT細胞のマーカーである、例えば、CCR7,CD27及び
CD28の発現が認められた(セントラルメモリーT細胞のマーカーについては、「Ro
mero,P.ら、J Immunol、2007年、178巻、4112~4119ペ
ージ」参照)。
テロメレース活性が極めて高いiPS細胞の状態を経ることによって、H25-4オリジ
ナルT細胞クローンにおいて短くなっていたテロメアを再伸長させることにより、再分化
T細胞に高い複製能が付与できたことが想定される(「Takahashi,K.ら、C
ell、2007年、131巻、861~872ページ」、「Marion,R.M.ら
、Cell Stem Cell、2009年、4巻、141~154ページ」、「Mo
nteiro,J.ら、J Immunol、1996年、156巻、3587~359
0ページ」及び「Weng,N.P.ら、Immunity、1998年、9巻、151
~157ページ」参照)。そこで、本発明の方法によって得られたCD8SP細胞のテロ
メアの長さを測定した。得られた結果を図35に示す。
化T細胞の方が、テロメアの長さは長くなっていた。
)は、T-iPS細胞の状態を経ることにより、優れた増殖能及び生存能を示すセントラ
ルメモリー様T細胞に若返ることができることが明らかになった。
な細胞の増殖も、異常な細胞の生存も観察されなかった。
<本発明のCD8SP細胞の抗原特異的な機能>
CTLsの細胞傷害の主な機構の一つに、TCRシグナルと共に生じる細胞溶解性分子
の分泌がある。そこで、本発明の方法によって得られたCD8SP細胞(reT-2.2
)においても、前記CD8SP細胞量の3倍量のα-CD3/CD28ビーズによってT
CRを刺激することにより、細胞溶解性分子が分泌されるかどうかを細胞内染色により調
べた。得られた結果を図36に示す。
イムBが産生され、再分化CD8T細胞の顆粒内に蓄積されることが明らかになった(図
36左側パネル参照)。
CTLsが刺激された際に、細胞溶解性分子を分泌する脱顆粒と連動して、一過的に発現
する顆粒球膜タンパク質であり、その分泌後は、細胞質に戻ることが知られている(Ru
bio,V.ら、Nat Med、2003年、9巻、1377~1382ページ)。そ
こで、α-CD3/28ビーズによって刺激し、または刺激することなく、本発明の再分
化CD8T細胞を培養し、これら細胞表面上のCD107a分子を蛍光色素を結合させた
抗体によって捕捉した。得られた結果を図36に示す。
にのみ、抗体の取り込まれが検出された(図36右側パネル参照)。
8T細胞が細胞傷害性を発揮できるかどうかを評価するため、抗原提示細胞として、HL
A-A24陽性B-LCL細胞(H25-4 T細胞クローンと患者の由来を同一にする
細胞)を用いた機能アッセイ(ELISPOT(酵素結合免疫スポット、Enzyme-
Linked ImmunoSpot)及び51Cr放出アッセイ)を行った。得られた
結果を図37及び38に示す。
列番号:3)は、HIV-1Gagタンパク質の抗原性ペプチド(アミノ酸残基:28~
36位)であり、Nef-138-8(2F)(RFPLTFGW、配列番号:4)は、
チロシンをフェニルアラニンに置換した、Nef-138-8(wt)の1残基変異体で
あり、共にHLA-A24上に存在している。
した結果、特異抗原であるNef-138-8(wt)による刺激に応じて、本発明の再
分化CD8T細胞は、IFN-γを著しく産生することが明らかになった。
Nef-138-8(wt)の存在下のみにおいて、本発明の再分化CD8T細胞は、5
1Crが取り込まれたB-LCLを溶解することが明らかになった。
抗原を発現している標的細胞を特異的に殺傷するため、機能的な抗原特異的T細胞である
ことが明らかになった。
<本発明の方法による、T-iPS細胞からCD4シングルポジティブ細胞への再分化>
本実施例では、DN段階からDP段階への移行が完全に終了する前に、再分化T系譜細
胞のTCRを刺激する手法を用いて、T-iPS細胞由来のT系譜細胞から成熟CD4S
P細胞を製造することを試みた。
T-3)の小塊(<100細胞数以下)を放射線照射済みのC3H10T1/2細胞上に
移し、20ng/mL VEGFを含むEB培地にて共培養した。培養14日目に、iP
Sサックに含まれている造血細胞を回収し、それら細胞を放射線照射済みのOP9-DL
1細胞上に移し、SCF 20ng/mL、TPO 10ng/mL、FLT-3L 1
0ng/mL及びIL-7 10ng/mLを含むEB培地にて共培養した。それら細胞
を放射線照射済みのOP9-DL1細胞上に移し、5ng/mL FLT-3L及び1n
g/mL IL-7存在下で、OP9培地内にて造血細胞をT系譜細胞に分化させた。そ
の後、培養35日目に、前記造血細胞量の3倍量のα-CD3/CD28ビーズ又は5μ
g/ml PHAを前記OP9培地に添加することにより刺激し、T系譜に方向づけられ
た細胞を、OP9-DL1上にて培養し続けた(α-CD3/CD28ビーズ又はPHA
による刺激を、第一の刺激とする)。次いで、培養45日目に当該T系譜細胞を回収し、
10ng/mL IL-7及び10ng/mL IL-15の存在下、放射線照射済みの
HLA-A24-PMBCsと共にRH10培地にて培養した。
培養60日目にはCD8SP細胞と共にCD4SP細胞が現れていた。また、図には示さ
ないが、第一の刺激としてα-CD3による刺激を前記T系譜細胞に与えた場合も、同様
の結果が得られることを確認している。
胞を経て、再分化して得られたCD8SP細胞において、元のヒトT細胞と同じTCR遺
伝子の再構成パターンを有するT細胞の出現頻度を極めて高くすることができる。また、
このようにして得られるヒトCD8SP細胞は、抗原特異的な免疫機能を有する。このこ
とは、ヒトCD4SP細胞についても当てはまると考えられる。さらに、疲弊したT細胞
のマーカーの一つであるPD-1は発現していないのに対し、セントラルメモリーT細胞
の表現型を代表するCD27及びCD28と共にCCR7が発現しており、またテロメア
も元となったT細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。
CD4SP細胞は、腫瘍、感染症(慢性感染症)、自己免疫不全等の疾患の治療又は予防
において有用である。
<223> Nef-138-8(野生型)
配列番号2
<223> HIV-1エンベロープ由来ペプチド
配列番号3
<223> Gag-28-9(野生型)
配列番号4
<223> 人工的に合成されたポリペプチドの配列(Nef-138-8(2F))
配列番号5~130
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号131
<223> TRAV8-3*01 TRAJ10*01
配列番号132
<223> TRAV13-1*01 TRAJ29*01
配列番号133
<223> TRAV38-2/DV8*01 TRAJ31*01
配列番号134
<223> TRAV12-1*01 TRAJ7*01
配列番号135
<223> TRAV21*02 TRAJ16*01
配列番号136
<223> TRAV1-2*01 TRAJ6*01
配列番号137
<223> TRAV1-2*01 TRAJ7*01
配列番号138
<223> TRAV1-2*01 TRAJ10*01
配列番号139
<223> TRAV1-2*01 TRAJ16*01
配列番号140
<223> TRAV8-1*01 TRAJ6*01
配列番号141
<223> TRAV12-1*01 TRAJ6*01
配列番号142
<223> TRAV12-1*01 TRAJ9*01
配列番号143
<223> TRAV6*01 TRAJ13*01
配列番号144
<223> TRAV12-1*01 TRAJ27*01
配列番号145
<223> TRBV7-9*01 TRBD1*01 TRBJ2-5*01
配列番号146
<223> 生殖系 TRBD1*01 TRBJ2-7*01
配列番号147
<223> TRBV29-1*02 TRBD1*01 TRBJ2-2*01
配列番号148
<223> 生殖系 TRBD2*01/*02 TRBJ2-7*01/*02
配列番号149
<223> TRBV29-1*01 TRBD1*01 TRBJ2-2*01
SEQUENCE LISTING
<110> The University of Tokyo
<120> METHOD FOR PRODUCING ANTIGEN-SPECIFIC T CELLS
<130> PTD-0068D
<150> JP2012-116639
<151> 2012-05-22
<160> 149
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus
<223> Nef-138-8(WT)
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<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus
<223> HIV-1 envelope-derived peptides
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus
<223> Gag-28-9(wt)
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<213> artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 60
tcatgtttac tggtatcggc ag 22
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 61
ttatgtttat tggtatcaac agaatca 27
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 62
caacctatac tggtaccgac a 21
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 63
taccctttac tggtaccggc ag 22
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 64
atacttctat tggtacagac aaatct 26
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 65
cacggtctac tggtaccagc a 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 66
cgtcatgtac tggtaccagc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 67
gccaaacagc cttacaaaga c 21
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 68
tttccaagcc ccacacagtc 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 69
cttacctaca actgtgaatc tggtg 25
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 70
cttacctaca acggttaacc tggtc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 71
cttacctaca acagtgagcc aactt 25
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 72
catacccaag acagagagct gggttc 26
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 73
cttacctagg atggagagtc gagtc 25
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 74
catacctgtc acagtgagcc tg 22
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 75
ccttcttacc tagcacggtg a 21
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
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cttacccagt acggtcagcc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 77
cccgcttacc gagcactgtc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 78
ccagcttacc cagcactgag a 21
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 79
cgcgcacacc gagcac 16
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 80
ctcgcccagc acggtcagcc t 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 81
cttacctgta accgtgagcc tg 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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tctggtatgt gcaatacccc aacc 24
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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ctgaggaaac cctctgtgca 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 84
ccgggcagca gacactgctt ctta 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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gatggaaggt ttacagcaca gctc 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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cctcccaggg tccagagtac g 21
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
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ggattgcgct gaaggaagag 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
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gcaacatgct ggcggagcac ccac 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
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tgaaggtcac ctttgatacc accc 24
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 90
aactgcacgt accagacatc 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 91
accctgagtg tccaggaggg 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 92
cactgctgac cttaacaaag gcg 23
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 93
tcctggtgac agtagttacg 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 94
aggctcaaag ccttctcagc aggg 24
<210> 95
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 95
tccaccagtt ccttcaactt cacc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 96
ttcatcaaaa cccttgggga cagc 24
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 97
cccagcaggc agatgattct cgtt 24
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 98
ggataaacat ctgtctctgc g 21
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 99
aagggaatcc tctgactgtg 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 100
gatagccata cgtccagatg 20
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 101
tgccactctt aataccaagg aggg 24
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 102
acactggctg caacagcatc 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 103
ttacaaacga agtggcctcc 20
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 104
accctgctga aggtcctaca ttcc 24
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 105
cttggagaaa ggctcagttc 20
<210> 106
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 106
tgcctcgctg gataaatcat cagg 24
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 107
tcccagctca gcgattcagc ctcc 24
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 108
gtcctgtcct cttgatagcc 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 109
aactgcacgt accagacatc 20
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 110
agcccagcca tgcaggcatc tacc 24
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 111
gaacatcaca gccacccaga ccgg 24
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 112
gcaaagctcc ctgtacctta cgg 23
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 113
cacagcccct aaacctgaag 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 114
agcaaaaact tcggaggcgg 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 115
aaggagagga cttcaccacg 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 116
ggcaagacgg aaccaatgtt 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 117
ggggaggtgg tgacagagtc 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 118
tgacggtgca attttctgct 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 119
agaaacgcca cgtccaagtt 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 120
tcctagccag gacgacgatt 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 121
tcctgggatc agaggaggaa 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 122
tctcctcccc tgactgtggt 20
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 123
tgcaccctga gatggttctt t 21
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 124
ctgccccgag acctgataac 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 125
ttggctgcca cctgtctcta 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 126
gaatgttttg gaggggcaag 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 127
ttcaatgctc ccctccactt 20
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 128
caacgcagag tacgcggg 18
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 129
gctgttgttg aaggcgtttg 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificially synthesized primer sequence
<400> 130
tctccgagag cccgtagaac 20
<210> 131
<211> 43
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV8-3*01 TRAJ10*01
<400> 131
tgtgctgtgg gtttcacggg aggaggaaac aaactcacct ttt 43
<210> 132
<211> 37
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV13-1*01 TRAJ29*01
<400> 132
tgtgcagcaa tcctcaggaa acacacctct tgtcttt 37
<210> 133
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV38-2/DV8*01 TRAJ31*01
<400> 133
tgtgcttatt ggagtaataa caatgccaga ctcatgttt 39
<210> 134
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV12-1*01 TRAJ7*01
<400> 134
tgtgtggtgt actatgggaa caacagactc gctttt 36
<210> 135
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV21*02 TRAJ16*01
<400> 135
tgtgctggtt cagatggcca gaagctgctc ttt 33
<210> 136
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV1-2*01 TRAJ6*01
<400> 136
tgtgctgtga gagcatcagg aggaagctac atacctacat tt 42
<210> 137
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV1-2*01 TRAJ7*01
<400> 137
tgtgctgtga gagattttta tgggaacaac ggactcgctt tt 42
<210> 138
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV1-2*01 TRAJ10*01
<400> 138
tgtgctgtga gagatccggg aggaggaaac agactcacct tt 42
<210> 139
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV1-2*01 TRAJ16*01
<400> 139
tgtactgtgt tttcacatgg ccaaaagctg ctcttt 36
<210> 140
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV8-1*01 TRAJ6*01
<400> 140
tgtgccgtga atgcatcagg aggaagctac atacctacat tt 42
<210> 141
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV12-1*01 TRAJ6*01
<400> 141
tgtgtggtgt caggaggaag ctacatacct acattt 36
<210> 142
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV12-1*01 TRAJ9*01
<400> 142
tgtgtggtga acaatactgg aggattcaaa actatcttt 39
<210> 143
<211> 41
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV6*01 TRAJ13*01
<400> 143
tgtgctctag acattctggg ggttaccaga aagttacctt t 41
<210> 144
<211> 38
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRAV12-1*01 TRAJ27*01
<400> 144
gtgtggtgaa caacaccaat gcaggcaaat caaccttt 38
<210> 145
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRBV7-9*01 TRBD1*01 TRBJ2-5*01
<400> 145
tgtgccagca gcttacggga cagggtgccg gagacccagt acttc 45
<210> 146
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Germline TRBD1*01 TRBJ2-7*01
<400> 146
tacaaagctg taacattgtg gggacaactc tacgagcagt acttcgggcc g 51
<210> 147
<211> 47
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRBV29-1*02 TRBD1*01 TRBJ2-2*01
<400> 147
tatatctctg cagcgttgat ggacagggaa acaccgggga gctgttt 47
<210> 148
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Germline TRBD2*01/*02 TRBJ2-7*01/*02
<400> 148
tatcatggtg taacattgtg gggactagtt taccctacga gcagtacttc g 51
<210> 149
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> TRBV29-1*01 TRBD1*01 TRBJ2-2*01
<400> 149
tgcagcgttg atggacaggg aaacaccggg gagctgtttt tt 42
Claims (5)
- 抗原特異性を有するヒトシングルポジティブT細胞の製造方法であって、
ヒトT細胞から誘導されたiPS細胞を、CD4/CD8ダブルネガティブ細胞に分化
させる工程と、
前記CD4/CD8ダブルネガティブ細胞のT細胞受容体に刺激を与える工程と、
T細胞受容体に刺激を与えた前記CD4/CD8ダブルネガティブ細胞をシングルポジ
ティブT細胞に分化させる工程とを含む、方法。 - シングルポジティブT細胞が、CD8シングルポジティブ細胞である、請求項1に記載
の方法。 - ヒトT細胞が、抗原特異性を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の方法により製造された、抗原特異性を有するヒト
シングルポジティブT細胞。 - 請求項4に記載のヒトシングルポジティブT細胞を含んでなる医薬組成物。
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