JP7464528B2 - 多能性幹細胞からｔ細胞を入手するための新規な方法およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、免疫学の技術分野に関するものである。より具体的には、本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞、特に調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／またはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を入手するための方法に関する。

Ｔリンパ球またはＴ細胞は、二次免疫応答において中心的な役割を担う細胞である。その名称は、胸腺で起こる分化に由来する。これらの細胞が胸腺に入ると、Ｎｏｔｃｈ１を発現する前駆細胞と、胸腺に強力かつ独占的に発現するＮｏｔｃｈデルタ－１およびデルタ－４リガンドとの相互作用のため、それらはＢリンパ球に分化する能力を急速に失う（Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ ２００７）。Ｔ細胞では様々な亜集団、特に調節性Ｔ細胞「Ｔｒｅｇ」、エフェクターＴ細胞「Ｔｅｆｆ」、およびナチュラルキラーＴリンパ球「ＮＫＴ」が同定されている。

Ｔリンパ球は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、および／またはＴ細胞受容体「ＴＣＲ」の発現によって同定され得る。

Ｔｒｅｇ細胞と呼ばれる調節性Ｔ細胞は通常、造血の過程でそれらの分化に不可欠な転写因子である、Ｆｏｘｐ３（フォークヘッドボックスＰ３）の発現を特徴とする。Ｔｒｅｇ細胞は、マウス、ラット、およびヒトでＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の５～１０％を占め、このＴｒｅｇ細胞の約１～２％が末梢循環中を循環している（Ｈａｑｕｅ ２０１６）。Ｔｒｅｇ細胞は免疫応答を制御する能力が高いことから、特に移植、移植片、または自己免疫および炎症性疾患の治療で、望ましくない免疫応答を制御するツールであると考えられてきた。このため、既に臨床試験が実施されており、例えば、１型糖尿病、慢性炎症性疾患の患者における、および腎移植または肝移植を受けた患者における同種造血幹細胞の移植、臓器移植を実施した後のＧｖＨＤ（移植片対宿主病）の治療において、Ｔｒｅｇを用いる細胞療法について有望な結果が示されている（Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ ２０１７）。

エフェクターＴリンパ球は、様々なサイトカインを産生し、細胞毒性活性を示し、生物体に対して異物と見なされる細胞を認識し、破壊することが可能である。それらは、移植物の拒絶および腫瘍細胞またはウイルス感染細胞の細胞死に重要な役割を果たす。

ＮＫＴ細胞は末梢血Ｔリンパ球の約０．２％を占める。ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲ発現または抗原に対する型特異的応答などのＴ細胞に特有の特徴、およびＮＫ１．１またはＣＤ５６発現などの自然免疫のナチュラルキラー「ＮＫ」細胞に関連する特徴をともに示す点で特殊である（Ｋａｔｏ ２０１８）。

Ｔ細胞の治療的使用が急速に発展しつつある。このため、効果的なＴ細胞を、それらの治療応用を可能にする十分な量で入手できる培養方法が必要とされている。

多能性細胞からＴ細胞を作製できるプロトコルがいくつか実現されており、具体的には、国際公開第２０１７／１００４０３号、同第２０１４／１６５７０７号、同第２０１０／０５１６３４号、ならびにＣｈａｎｇら（２０１４）、Ｌｅｉら（２００９）、およびＨｏｌｍｅｓら（２００９）による科学刊行物に記載されている。

多能性幹細胞の、例えばヒドロゲルマトリックスなどの生体材料中での、三次元での培養は、正常な胚発生の過程で起こる相互作用および物理的制約を厳密に再現できることがわかっている。これらの「改善された」条件により、生きた生物体中の発生および分化の過程で観察される表現型のより代表的な表現型を有する細胞集団が得られる。

さらに、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する細胞（細胞系ＯＰ９－ＤＬＬ１およびＯＰ９－ＤＬＬ４）とともに培養したマウス人工多能性幹細胞に、レンチウイルスを介して、ＴＣＲの発現を可能にする遺伝子に関連するＦＯＸＰ３遺伝子を導入することは、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋またはＣＤ８＋ＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋であり、ＴＣＲ（ＴＣＲ＋）を有するＴｒｅｇの作製を可能にした（Ｈａｑｕｅ ２０１２；Ｈａｑｕｅ ２０１７）。マウスで得られたこれらの結果は、胸腺断片の使用を示唆し、それはヒトでの治療応用に不可能であると思われる。

このため、多能性幹細胞からＴ細胞、特にＴｒｅｇ細胞を作製でき、ヒトの治療に直接使用でき、かつ胸腺断片を示唆しないプロトコルが必要とされている。

さらに、現時点で本発明者らが知る限り、Ｔｅｆｆ細胞およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団においてＴＣＲの顕著な発現を得ることが可能な方法は公開されていない。

さらに、Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を同時に含むＴ細胞集団を得ることが可能なプロトコルが必要とされている。

このため、特に治療応用のために、大量に、Ｔ細胞、特にＴｒｅｇ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を入手できる簡便な方法が必要とされている。特に、例えば移植片拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、炎症性疾患、または癌を治療する細胞療法に使用できる、キメラ抗原受容体または「ＣＡＲ」を発現するＴ細胞を多数入手できる簡便な方法が必要とされている。特に、例えば移植片拒絶反応または移植片対宿主病を治療する細胞療法に使用できる、キメラ抗原受容体または「ＣＡＲ」、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞を多数入手できる簡便な方法が必要とされている。

本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法、このようにして入手される集団、薬剤としての使用のためのこのようにして入手される集団、および免疫調節異常、例えば感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、アレルギー、移植片拒絶反応、移植片対宿主病などに関連する病態の治療での使用のためのこのようにして入手され集団に関する。

本発明の第一の目的は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法であって、以下の段階：
ａ）少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
ｂ）上記胚様体を分離する段階と；
ｃ）上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドとともに培養する段階と；
ｄ）段階ｃ）中に、好ましくは細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含む、方法である。

一実施形態では、段階ａ）で得られる胚様体は、少なくとも１５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む。

一実施形態では、段階ａ）を少なくとも９日間、好ましくは９～１２日間実施する。

一実施形態では、段階ａ）を、ＢＭＰ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、および／またはＩＬ－３を含む無血清培地中で実施する。

一実施形態では、段階ｂ）の終了時に得られた、分離された胚様体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、および／またはＩＬ－７を含む培地中で少なくとも１５日間培養する。

一実施形態では、Ｆｏｘｐ３をコードする核酸配列を含むベクターを導入する段階ｄ）を、段階ｃ）の第Ｄｄ８日～第Ｄｄ１２日に実施する。

一実施形態では、段階ｄ）のベクターは、レトロウイルス、好ましくはレンチウイルスである。

一実施形態では、段階ｄ）のベクターの核酸配列は、目的とするさらなる核酸配列を含む。

一実施形態では、目的とするさらなる核酸配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｍｃｌ－１、Ｂｃｌ－ｘＬ、およびＨｅｌｉｏｓをコードする核酸から選択される。

一実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞またはヒト胚性幹細胞である。

一実施形態では、本発明による方法は、Ｔ細胞を単離する段階をさらに含む。

一実施形態では、本発明による方法は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、エフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）、およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔリンパ球から選択される細胞集団を単離する段階をさらに含む。

本発明の１つの目的は、上記の請求項のいずれか１項の方法に従って入手可能なＴ細胞集団に関する。

一実施形態では、本発明によるＴ細胞集団は、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ならびに／あるいはＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびに／あるいはＣＤ８－ＣＤ４－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む。

本発明の１つの目的はまた、薬物として使用するための本発明によるＴ細胞集団に関する。

したがって、本発明はまた、薬剤として使用するためのＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ならびに／あるいはＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の集団に関する。

本発明のまた別の目的は、免疫調節異常、例えば感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、アレルギー、移植片拒絶反応、移植片対宿主病などに関連する病態の治療に使用するための、本発明によるＴ細胞集団に関する。

したがって、本発明はさらに、免疫調節異常、例えば感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、アレルギー、移植片拒絶反応、移植片対宿主病などに関連する病態の治療に使用するための、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ならびに／あるいはＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびに／あるいはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団に関する。

定義
本発明では、「約」という用語は、ある数値が、測定装置の使用に関連する許容誤差、その数値を求めるのに用いる方法、または試験する集団内の細胞間および集団間に存在し得る変動に特有の変動を含むことを表すのに使用される。したがって、一実施形態では、ある数値の前にある「約」という用語は、この数値の±１０％に対応する。

本発明では、細胞に言及する場合の「胚様体」という用語は、分化を経た多能性幹細胞の集団を含む三次元構造または集合体を指す。胚様体を発生させる当該技術分野で公知の方法は、例えば、国際公開第２００６０２１９５０号およびＰｅｔｔｉｎａｔｏ（Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２４（１４）：１５９５－６０９）に記載されている。

本発明では、「ベクター」という用語は、宿主細胞内に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。一実施形態では、ベクターは、標的宿主細胞に特異的な抗体を運搬する、アデノウイルスベクター、プラスミド、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ハイブリッドアデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクチンベクター、または装飾ペグ化リポソームを含む群から選択される。一実施形態では、ベクターはウイルス、具体的にはレトロウイルス、より具体的にはレンチウイルスである。「プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡから分離された染色体外ＤＮＡ分子であり、染色体ＤＮＡとは独立に複製できる、一般的なタイプのベクターを指す。いくつかの場合には、それは環状かつ二本鎖である。

本発明では、特定のタンパク質をコードする、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「核酸配列」という用語は、転写され任意選択で遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳もされる、核酸分子のことである。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡの形態で存在し得る。ＤＮＡの形態で存在する場合、核酸分子は一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。

本発明では、「形質導入」という用語は、「形質導入する」細胞集団の少なくとも１つの細胞中に目的とする核酸配列を含むベクターを導入する１つの様式を指すのに使用される。より具体的には、「形質導入」という用語は、細胞集団の少なくとも１つの細胞中への目的とする核酸配列を含むウイルスベクター、好ましくはレトルトウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターの導入を指す。

本発明では、「Ｆｏｘｐ３」という用語は、フォークヘッドボックスＰ３遺伝子（ヒトでは公式記号ＦＯＸＰ３、ＩＤ：５０９４３）、ならびにこの遺伝子によってコードされるｍＲＮＡおよびタンパク質を指す。この遺伝子から発現されるタンパク質は、ＦＯＸタンパク質ファミリーに属する転写因子である。それはｓｃｕｒｆｉｎとも呼ばれる。

本発明では、「表現型」という用語は、特に細胞表面、または集団内の一連の細胞での特定のマーカーの有無を指す。例えば、「ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋」表現型は、ＣＤ３４およびＣＤ４３を発現する、細胞または集団内の一連の細胞を指す。「ＣＤ４３－」は、ＣＤ４３を発現しない、細胞または集団内の一連の細胞を指す。Ｌｙ－４８、ロイコシアリン、シアロフォリン、白血球シアロ糖タンパク質、およびＷ３／１３としても知られるＣＤ４３は、Ｏ－グリコシル化部位およびシアリル化部位を多数含むＩ型膜貫通糖タンパク質である。その表現型は、当該技術分野で公知の手段によって同定できる。例えば、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートされたＣＤ４３特異的抗体を用いて、フローサイトメトリーにより細胞集団内のＣＤ４３発現を測定し、かつ「ＣＤ４３－」または「ＣＤ４３＋」表現型を同定し得る。別の例では、ＣＤ３４マーカーを有する細胞に結合し、かつフローサイトメトリーによって定量化できる、フィコエリトリン－シアニン７（ＰＥ－Ｃｙ７）複合体にコンジュゲートされたＣＤ３４特異的抗体を用いることにより、「ＣＤ３４＋」表現型を同定し得る。「ｇｐ１０５－１２０」とも呼ばれるＣＤ３４は、シアロムチンファミリーに属する、約１０５～１２０ｋＤの膜貫通リン糖タンパク質である。

本発明では、ある数値の前にある文字「Ｄ」は、本発明の方法の細胞培養の第一段階（造血幹細胞を含む胚様体を入手する段階）中の特定の日を指す。したがって、Ｄ０は第一段階の開始時に対応し、Ｄ１は第一段階のＤ０の後の日を指すなどとなる。ある数値の前にある文字「Ｄｄ」は、本発明の方法の細胞培養の第二段階（Ｔ細胞への分化の段階）中の特定の日を指す。したがって、Ｄｄ０は第二段階の開始時、Ｄｄ１は第二段階のＤｄ０の後の日などである。

本発明では、「治療」という用語は、ある病態によって引き起こされる、またはそれを原因とする症状の治療、予防、遅延、または軽減を指す。具体的には、「治療」という用語は、病態およびそれに関連する症状の進行を制御することを含む。免疫調節異常に関連する病態の治療の効果は、望ましくない免疫応答の減少または免疫応答低下の増大に対応する。より一般的には、免疫調節異常に関連する病態の治療は、免疫ホメオスタシスを回復させる（すなわち、免疫応答が強すぎる場合にはその強度を低下させる、または免疫応答が弱すぎる、もしくは全くみられない場合にはその大きさを増大させる）ことができる。「抗拒絶反応治療」という用語は、移植片拒絶反応を予防する治療（移植片拒絶反応の治療）を指す。「抗癌治療」という用語は、癌の治療を指す。

特定の実施形態による細胞分化の実験プロトコルの略図である。培地の組成は実験の部に明記される。Ｐｒｅ－Ｔ：胸腺前駆細胞；ＳＰＩ Ｐｒｅ－Ｔ：シングルポジティブ未成熟胸腺前駆細胞；ＤＰ：ダブルポジティブ胸腺細胞；Ｔｒｅｇ：調節性Ｔ細胞。四角で囲った文字ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅはそれぞれ、培地の更新および／または細胞の再播種のプロトコルに対応し、その詳細は実験の部に記載される。 Ｄ７、Ｄ８、およびＤ９の胚様体の細胞表現型；造血幹細胞マーカーであるＣＤ３４およびＣＤ４３の存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：Ｄ７での測定。Ｂ：Ｄ８での測定。Ｃ：Ｄ９での測定。 分化段階の第２０日（Ｄｄ２０）での細胞表現型；Ｄ９に共培養を実施した細胞集団中のＤｄ２０でのＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、およびＣＤ５６の存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：リンパ系細胞のマーカーである、ＣＤ５およびＣＤ７の発現。Ｂ：Ａで同定されたＣＤ５＋ＣＤ７＋亜集団内でのＣＤ４およびＣＤ８ａの発現。Ｃ：Ａで同定されたＣＤ５＋ＣＤ７＋亜集団内でのＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂの発現。Ｄ：Ａで同定されたＣＤ５＋ＣＤ７＋亜集団内でのＣＤ５６およびＣＤ８ａの発現。 分化段階の第２６日（Ｄｄ２６）での細胞表現型：Ｄ９に共培養を実施した細胞集団中のＤｄ２６でのＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ５６、およびＴＣＲａｂの存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：リンパ系細胞のマーカーである、ＣＤ５およびＣＤ７の発現。Ｂ：Ａで同定されたＣＤ５＋ＣＤ７＋亜集団内でのＴ細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ８ａの発現。Ｃ：Ａで同定されたＣＤ５＋ＣＤ７＋亜集団内でのＴ細胞マーカーＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂの発現。Ｄ：Ａで同定されたＣＤ５＋ＣＤ７＋亜集団内でのＮＫおよびＴ細胞マーカーであるＣＤ５６およびＣＤ８ａの発現。Ｅ：Ａで同定されたＣＤ５＋ＣＤ７＋亜集団内でのＴ細胞マーカーＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。 分化段階の第２６日（Ｄｄ２６）での細胞表現型：Ｄ９に共培養を実施し、かつ共培養開始からの様々な時点でＦｏｘｐ３の形質導入を実施した細胞集団中のＤｄ２６でのＦｏｘｐ３およびＣＤ７の存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：Ｄｄ０での形質導入の結果。Ｂ：Ｄｄ５での形質導入の結果。Ｃ：Ｄｄ１０での形質導入の結果。Ｄ：Ｄｄ１５での形質導入の結果。 分化段階の第２６日（Ｄｄ２６）での細胞表現型：図５で同定された細胞亜集団Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ７＋中のＤｄ２６でのＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、およびＴＣＲａｂの存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：Ｄｄ０に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｂ：Ｄｄ５に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｃ：Ｄｄ１０に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｄ：Ｄｄ１５に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｅ：Ｃで同定されたＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋亜集団中のＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂの発現（Ｄｄ１０に形質導入）。Ｆ：Ｅで同定されたＣＤ８ａ＋ＣＤ８ｂ＋亜集団中のＣＤ８ａおよびＣＤ４の発現（Ｄｄ１０に形質導入）。 分化の第２６日（Ｄｄ２６）での細胞表現型：図５で同定されたＦｏｘｐ３－ＣＤ７＋細胞亜集団中のＤｄ２６でのＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８ａ，ＣＤ８ｂ、およびＴＣＲａｂの存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：Ｄｄ０に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｂ：Ｄｄ５に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｃ：Ｄｄ１０に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｄ：Ｄｄ１５に形質導入を実施したときのＣＤ３およびＴＣＲａｂの発現。Ｅ：Ｃで同定されたＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋亜集団のＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂの発現（Ｄｄ１０に形質導入）。Ｆ：Ｅで同定されたＣＤ８ａ＋ＣＤ８ｂ＋亜集団中のＣＤ８ａおよびＣＤ４の発現（Ｄｄ１０に形質導入）。 分化の第２６日（Ｄｄ２６）での細胞表現型：形質導入を実施せず、Ｄ９に共培養を実施した細胞集団中のＣＤ７，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４３の存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：Ｄｄ８でのＣＤ７およびＣＤ３４の発現。Ｂ：Ｄｄ１０でのＣＤ７およびＣＤ３４の発現。Ｃ：Ｄｄ１２でのＣＤ７およびＣＤ３４の発現。Ｄ：Ｄｄ８でのＣＤ７およびＣＤ３４の発現。Ｅ：Ｄｄ１０でのＣＤ７およびＣＤ３４の発現。Ｆ：Ｄｄ１２でのＣＤ７およびＣＤ３４の発現。Ｇ：Ｄｄ８でのＣＤ７およびＣＤ３８の発現。Ｈ：Ｄｄ１０でのＣＤ７およびＣＤ３８の発現。Ｉ：Ｄｄ１２でのＣＤ７およびＣＤ３８の発現。 異なるｈＥＳ細胞系およびｈｉＰＳ細胞系から入手した、Ｄ９での胚様体の細胞表現型：造血幹細胞マーカーである、ＣＤ３４およびＣＤ４３の存在に関するバイパラメトリックヒストグラムである。Ａ：ｈＥＳ ＷＡ０９。Ｂ：ｈｉＰＳ Ｔ０４。Ｃ：ｈｉＰＳ ＬＯＮ８０。Ｄ：ｈＥＳ ＷＡ０１。

（詳細な説明）
本発明者らは、多能性幹細胞からＴリンパ球集団を入手する新たな方法を発見した。より具体的には、本発明の方法に従って入手されるＴ細胞集団は、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、（Ｆｏｘｐ３－）ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含み得る。

本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法であって、以下の段階：
ａ）少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
ｂ）上記胚様体を分離する段階と；
ｃ）上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドとともに培養する段階と；
ｄ）任意選択で、好ましくは細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、段階ｃ）中に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階；
を含み、上記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞ではない、方法に関する。

本発明の別の目的は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法であって、以下の段階：
ａ）少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
ｂ）上記胚様体を分離する段階と；
ｃ）上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドとともに培養する段階と；
ｄ）好ましくは細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、段階ｃ）中に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含む、方法に関する。

一実施形態では、本発明の方法によって入手されるＴ細胞集団は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む。

一実施形態では、本発明による方法は、中間段階によって区切られる、細胞培養の２つの主要な段階を含む。第一の主要な段階は、多能性幹細胞から造血幹細胞を入手することを可能にし、好ましくは、上記造血幹細胞は胚様体に含まれる。中間段階は、胚様体を分離することで構成される。第二の主要な段階は、段階１で入手した造血幹細胞からＴ細胞を入手することを可能にし、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、例えば少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞とともに、上記細胞を培養することを含む。任意選択で、かつより好ましくは同時に、Ｔリンパ球への分化のこの第二の段階はまた、目的とする核酸配列を含むベクターを少なくとも１つの細胞中に導入することを含む。

本発明による第一の段階は、多能性幹細胞から造血幹細胞を入手することを可能にする。

好ましくは、これらの多能性幹細胞は哺乳動物由来の多能性幹細胞である。好ましくは、これらの多能性幹細胞はヒト細胞、好ましくはヒト人工多能性幹細胞またはヒト胚性幹細胞である。

一実施形態では、多能性幹細胞はヒト人工多能性幹細胞である。

本発明によるヒト人工多能性幹細胞は、分化細胞を当該技術分野で公知の方法により、特に、ウイルスベクター、プラスミド、センダイウイルスによるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４遺伝子の導入により、または細胞内へのｍＲＮＡの注入により、再プログラムすることによって入手できる。分化細胞は、例えば、皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、造血細胞であり得る。

ヒト人工多能性幹細胞の例は、特に限定されないが、ｈｉＰＳ Ｔ０４細胞、ｈｉＰＳ ＬＯＮ８０細胞、ｈｉＰＳ ＬＯＮ７１、ｈｉＰＳ ＢＪ１、およびｈｉＰＳ ＭｉＰＳを含む。

一実施形態では、人工多能性幹細胞に再プログラムすることが意図される分化細胞は、対象から採取した生体試料に由来する。生体試料は、例えば、生検試料、血液、血漿、血清、唾液試料、または尿試料から選択され得る。

したがって、本発明の一実施形態では、本発明の方法は、対象から採取した分化細胞から人工多能性幹細胞を入手する第一の段階を含む。

一実施形態では、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞である。

ヒト胚性幹細胞の例は、特に限定されないが、ｈＥＳ ＷＡ０９細胞、ｈＥＳ ＷＡ０１細胞、ｈＥＳ ＷＡ０７、ｈＥＳ ＢＧ０１、ｈＥＳ、およびＨＵＥＳ７細胞を含む。

特定の実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト胚の破壊によって入手されない胚性幹細胞である。このような幹細胞を入手するための方法は、具体的にはＣｈｕｎｇら（２００８）によって記載されている。

本発明の別の実施形態では、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。

本発明の方法によって多能性幹細胞を造血幹細胞に分化させる前に、多能性幹細胞を、最後の継代から数日～数週間、特に約１～１０日間、一般には約５日間維持するのに適した培地中で維持できる。多能性幹細胞の維持に適した培地は当該技術分野で公知である。一実施形態では、多能性幹細胞の培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地と栄養素、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を含む。

好ましくは、多能性幹細胞の培地は、約５～約４０％、好ましくは約２０％のＫＳＲ血清（「ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ」、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を含む。

一実施形態では、多能性幹細胞の培地は、約０．１％～約５％のＬ－グルタミン、好ましくは約１％のＬ－グルタミンを含む。

一実施形態では、多能性幹細胞の培地は、約０．１％～約５％の非必須アミノ酸、好ましくは約１％の非必須アミノ酸を含む。

一実施形態では、多能性幹細胞の培地は、約０．０１％～約０．５％の２－メルカプトエタノール、好ましくは約０．１％の２－メルカプトエタノールを含む。

一実施形態では、多能性幹細胞の培地は、約１～約３０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む。

一実施形態では、好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む、多能性幹細胞の培地は、上記のＫＳＲ血清、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、および／またはＦＧＦ２を含む。

一実施形態では、好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む、多能性幹細胞の培地は、上記のＫＳＲ血清、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、およびＦＧＦ２を含む。

一実施形態では、造血幹細胞を入手するために多能性幹細胞を培養する。造血幹細胞の出現を可能にするために実現される複数の培養条件が、当該技術分野で公知である。

したがって、本発明による方法の第一の段階（本発明による方法の段階ａ）に対応する）は、少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で多能性幹細胞を少なくとも９日間培養することで構成される。

好ましい実施形態では、胚様体の形成を誘導することを可能にする条件下で多能性幹細胞を培養する。この目的のために、細胞培養を、例示目的で言えば、三次元の細胞集合体（胚様体）が出現しやすくかつ動物体での胚発生中に存在する細胞間相互作用をより効率的に再現する低接着プレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｆｉｓｈｅｒ社）中で実施できる。

一実施形態では、段階ａ）での多能性幹細胞の培養を、少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で、少なくとも９日間、胚様体の形成を誘導するのに適した培地中にて実施する。

造血細胞の増殖に適した培地は、最新技術からわかる（例えば、Ｃｈａｎｇら（２０１４）を参照されたい）。

一実施形態では、胚様体の形成を誘導する培地は、造血細胞の増殖に適した無血清培地、例えばＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を含む。

一実施形態では、胚様体の形成を誘導する培地は、約０．１～約５％のＬ－グルタミン、好ましくは約１％のＬ－グルタミンを含む。

一実施形態では、胚様体の形成を誘導する培地は、約０．１～約５％の非必須アミノ酸、好ましくは約１％の非必須アミノ酸を含む。

一実施形態では、胚様体の形成を誘導する培地は、約０．０１～約０．５％の２－メルカプトエタノール、好ましくは約０．１％の２－メルカプトエタノールを含む。

一実施形態では、胚様体の形成を誘導する培地は、約１０～約１０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、好ましくは約１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含む。

一実施形態では、胚様体の形成を誘導する培地は、約１０～約１０００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む。

一実施形態では、胚様体の形成を誘導する培地は、約５～約１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含む。

一実施形態では、造血細胞の増殖に適した無血清培地、例えばＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地は、上記のＬ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、および／またはアスコルビン酸を含む。

一実施形態では、段階ａ）での多能性幹細胞の培養を、少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で、少なくとも９日間、ＢＭＰ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、および／またはＩＬ－３を含み、造血細胞の増殖に適した無血清培地、例えばＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中にて実施する。

一実施形態では、段階ａ）での多能性幹細胞の培養を、少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で、少なくとも９日間、ＢＭＰ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、およびＩＬ－３を含み、造血細胞の増殖に適した無血清培地、例えばＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中にて実施する。

好ましい実施形態では、多能性幹細胞を最初に、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）の存在下でインキュベートして、胚様体の形成の誘導を促進する。好ましい実施形態では、多能性幹細胞を、ＢＭＰの存在下で１０～４８時間、好ましくは１日間インキュベートする。別の実施形態では、細胞を、３～３００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ、より好ましくは２０～５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ、具体的には約３０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰの存在下でインキュベートする。好ましくは、ＢＭＰは、ＢＭＰ－４、より好ましくはヒトＢＭＰ－４（ｈＢＭＰ－４）である。より好ましくは、細胞を、好ましくはＤ０（第二の段階の開始時）に、約３０ｎｇ／ｍＬのｈＢＭＰ－４ａの存在下で１日間インキュベートする。

一実施形態では、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ－４の存在下でのインキュベート後に、ＢＭＰ（好ましくはＢＭＰ－４）とＦＧＦ－２とを含む混合物を培地に加えて中胚葉を誘導させる。

好ましくは約３ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ－４、および約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を培地に添加し、好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ－４、および約５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を培地に添加する。一実施形態では、この添加を、好ましくは胚様体形成の誘導段階の第１日（第Ｄ１日）に、一度に実施する。

一実施形態では、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液を、胚様体形成の誘導段階終了時まで、好ましくは胚様体形成の誘導段階の第３日（第Ｄ３日）から、２日毎に添加する。

胚様体形成の誘導段階の終了は、胚様体が分離される時点に対応する。この時点は、例えば、胚様体形成の誘導段階の第５日、第６日、第７日、第８日、第９日、第１０日、第１１日、第１２、またはそれよりも後（Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、またはそれよりも後）に起こり得る。

特定の実施形態では、多能性幹細胞の培養の段階ａ）を、少なくとも９日間実施する。

「少なくとも９日間」という用語は、９日間、１０日間、１１日間、またはそれより多い日数を含む。したがって、一実施形態では、多能性幹細胞の培養の段階ａ）を、９日間実施する。

一実施形態では、段階ａ）を、９～１７日間、好ましくは９～１５日間、好ましくは９～１４日間実施する。一実施形態では、段階ａ）を、９～１２日間、好ましくは９～１１日間、好ましくは９～１０日間実施する。

一実施形態では、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＳＣＦ（幹細胞増殖因子、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＦＬｔ３－Ｌ（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３－リガンド、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＩＬ－３（組換えインターロイキン３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、および／またはＦＧＦ２を含む。

増殖因子および／またはサイトカインを含む好ましい溶液は、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＳＣＦ（幹細胞増殖因子、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＦＬｔ３－Ｌ（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３－リガンド、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＩＬ－３（組換えインターロイキン３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、およびＦＧＦ２を含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌを含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－３、好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－３を含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、好ましくは約５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含みＦＧＦ２を含まない溶液を、胚様体形成の誘導段階の終了直前に使用する。好ましくは、この溶液を、胚様体形成の誘導段階中の第Ｄ７日から使用する。

本発明の一実施形態では、入手される胚様体は、ＣＤ３４マーカーを発現できる造血幹細胞を含む。本発明者らはこのようにして、本発明の方法の第一の段階が、ＣＤ３４＋表現型を示す造血幹細胞の亜集団を入手すること可能にすることを明らかにした。より具体的には、細胞集団全体の約４０％が、培養７日後（第一段階）にＣＤ３４＋を発現する。本発明者らはさらに、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋亜集団およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－亜集団の取得を示し、この２つの集団が集団中で比較的均等な割合で存在することを明らかにした。本発明者らは驚くべきことに、胚様体中のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋亜集団の増加、および胚様体中のＣＤ３４＋ＣＤ４３－亜集団の存在が、細胞集団全体を、本発明による細胞分化プロトコルで継続するのに適するようにすることを、明らかにした。

本発明者らは、少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体の入手を可能にする条件が、培地の性質、様々な因子の存在、および培養時間から得られ、これらのパラメータは上に明記したものであることを、明らかにした。

本発明では、「少なくとも５％」は、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％を含む。一実施形態では、段階ａ）の培養条件は、約５％～約３０％、４０％、５０％、または６０％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できるものである。

一実施形態では、段階ａ）の培養条件は、少なくとも１０％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手することを可能にする。一実施形態では、段階ａ）の培養条件は、少なくとも１５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手することを可能にする。

一実施形態では、段階ａ）の培養条件は、約５％～約６０％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞、好ましくは約１０％～約６０％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞、好ましくは約１５％～約６０％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手することを可能にする。

一実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞への造血幹細胞の分化を可能にする培養条件への移行前に、胚様体の分離（本発明の方法の段階ｂ）に対応し、上記の中間段階とも呼ばれる）を含む。

胚様体は、当該技術分野で公知の方法により分離できる。例えば、胚様体を酵素的分離（トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼなど）により、または機械的分離により分離できる。

一実施形態では、分離は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）による処理により実施される酵素的分離である。

一実施形態では、細胞集団の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に胚様体を分離する。

一実施形態では、細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に胚様体を分離する。好ましくは、細胞集団の少なくとも２０％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に胚様体を分離する。

一実施形態では、造血幹細胞集団の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に胚様体を分離する。

したがって、一実施形態では、胚様体の分離を、最も早期には多能性幹細胞の胚様体への分化のための培養の第９日（「Ｄ９」）に実施する。一実施形態では、胚様体の分離を、多能性幹細胞の胚様体への分化のための培養の第９日（「Ｄ９」）～第１２日（「Ｄ１２」）、好ましくは第９日（「Ｄ９」）～第１１日（「Ｄ１１」）、好ましくは第９日（「Ｄ９」）～第１０日（「Ｄ１０」）に実施する。一実施形態では、胚様体の分離を、多能性幹細胞の胚様体への分化のための培養の第９日（「Ｄ９」）、第１０日（「Ｄ１０」）、または第１１日（「Ｄ１１」）に実施する。一実施形態では、胚様体の分離を、多能性幹細胞の胚様体への分化のための培養の第９日（「Ｄ９」）に実施する。

細胞マーカーの発現を測定する方法は当該技術分野で公知である。

一実施形態では、フローサイトメトリーを用いて細胞集団中のマーカーの存在を測定する。

ＣＤ３４を定量化するのに使用し得る抗体は、例えば、コンジュゲート抗ＣＤ３４抗体、例えば、ＣＤ３４－ＰＥ－Ｃｙ７抗体（Ｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＣＤ３４－ＡＰＣ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）である。

ＣＤ４３を定量化するのに使用し得る抗体は、例えば、コンジュゲート抗ＣＤ４３抗体、例えば、ＣＤ４３－ＡＰＣ抗体（Ｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＣＤ４３ｅＢｉｏＲ２／６０抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、またはＣＤ４３－ＦＩＴＣ抗体（Ｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。

既知のフローサイトメトリー法は、細胞を流体流の中に懸濁させかつ電子検出装置を通過させることにより、目的とする細胞をカウントできる。フローサイトメトリー法は、１秒当たり数千個の粒子の物理的および／または化学的パラメータ、例えば蛍光パラメータの同時のマルチパラメトリック分析が可能である。最新のフローサイトメトリー機器は通常、複数のレーザーおよび蛍光検出器を有する。

フローサイトメトリーはまた、目的とする集団を単離または精製するように、その特性に従って不均一な混合物中の細胞を物理的に分離できる。この方法は、「蛍光活性化細胞選別」または「ＦＡＣＳ」として知られる。この方法では、初期の複雑な細胞混合物を最初に、蛍光色素にコンジュゲートされた、細胞表面マーカーに特異的な１つまたは複数の抗体で標識する。細胞を、目的とする遺伝子とともに１つまたは複数の組換え蛍光タンパク質を発現するかを分析して、抗体を使用せずに細胞の選択を可能にすることもできる。

細胞を選別する別の方法は、磁気活性化細胞選別または「ＭＡＣＳ」である。この方法は、特定の細胞表面マーカーに特異的な抗体でコートされた磁気ナノ粒子（「ビーズ」）を使用する。そのため、目的とする集団により発現されるマーカー（ポジティブ選択）または望ましくない細胞型により発現されるマーカー（ネガティブ選択）に特異的な抗体のいずれかを選択することが可能である。ナノ粒子と細胞集団のインキュベーション後に、懸濁液を、ビーズが付着する磁石に取り付けた特殊な使い捨て分離カラムに加え、一方で未標識の細胞が流れ出る。

本発明の一実施形態では、胚様体の分離後に入手した細胞を、本発明の方法の細胞培養の第二の段階（本発明の方法の段階ｃ）に対応する）のための第二の培地に移す。本発明の方法の細胞培養の第二の段階は、ＣＤ３４＋造血幹細胞を胚様体からＴ細胞に分化させる。

一実施形態では、胚様体の分離から得られた全細胞を、Ｔ細胞への造血幹細胞の分化を可能にする培養条件に移す。

一実施形態では、段階ｂ）の終了時に入手した、分離された胚様体を分化培地、好ましくは、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、およびＩＬ－７を含む培地中で、好ましくは少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドとともに培養して、上記Ｔ細胞集団を入手する。

一実施形態では、胚様体から誘導された造血幹細胞（すなわち、ＣＤ３４＋表現型を示す細胞）を単離し、次いで、造血幹細胞をＴ細胞に分化させる培養条件下に置く。

好ましくは、Ｔ細胞への分化を、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンド（例えば、デルタ－Ｌ１またはデルタ－Ｌ４リガンド）の存在下で、好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞の存在下で、さらにより好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞（例：ＯＰ９－ＤＬＬ１もしくはＯＰ９－ＤＬＬ４、またはその混合物）の存在下で実施する。これらの細胞は当該技術分野で公知である。具体的には、ＯＰ９－ＤＬＬ１および／またはＯＰ９－ＤＬＬ４細胞系を使用できる。

一実施形態では、Ｔ細胞への分化のための培地は、ＭＥＭ（最小必須培地、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ社）を含む。

一実施形態では、Ｔ細胞への分化のための培地は、約２～約３０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）、好ましくは約２０％のＦＣＳを含む。

一実施形態では、Ｔ細胞への分化のための培地は、約０．１～約５％のＬ－グルタミン、好ましくは約１％のＬ－グルタミンを含む。

一実施形態では、Ｔ細胞への分化のための培地は、約０．１～約５％の非必須アミノ酸、好ましくは約１％の非必須アミノ酸を含む。

一実施形態では、Ｔ細胞への分化のための培地は、約０．０１～約０．５％の２－メルカプトエタノール、好ましくは約０．１％の２－メルカプトエタノールを含む。

一実施形態では、Ｔ細胞への分化のための培地は、約５～約１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１０～１００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、より具体的には約５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含む。

一実施形態では、好ましくはＭＥＭ（最小必須培地、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）社を含む、Ｔ細胞への分化のための培地は、上記のＦＣＳ、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、および／またはアスコルビン酸を含む。一実施形態では、Ｔ細胞の分化の段階（第二段階）の間に、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液を培地に添加する。一実施形態では、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、ＳＣＦ（幹細胞増殖因子）、ＦＬｔ３－Ｌ（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド）、および／またはＩＬ－７（インターロイキン７）を含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む好ましい溶液は、ＳＣＦ（幹細胞増殖因子）、ＦＬｔ３－Ｌ（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド）、およびＩＬ－７（インターロイキン７）を含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、より具体的には約１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、好ましくは約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、より具体的には約１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌを含む。

好ましくは、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液は、約２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（インターロイキン７、Ｇｉｂｃｏ社）、好ましくは約２ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、具体的には約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。

一実施形態では、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液を、Ｔ細胞への分化の段階（第二段階）の間に、毎日、２日毎に、または３日毎に、好ましくは２日毎に培地に添加する。

一実施形態では、細胞を、Ｔ細胞分化段階の開始から、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎に、好ましくは５日毎に、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、例えば少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞の存在下で、Ｔ細胞への分化のための新たな培地に移す。

一実施形態では、Ｔ細胞への分化の段階は、少なくとも７日、好ましくは少なくとも１０日、好ましくは少なくとも１５日、好ましくは少なくとも２０日、好ましくは少なくとも２５日継続する。一実施形態では、Ｔ細胞への分化の段階は、約２６日継続する。

一実施形態では、本発明による方法は、目的とする核酸配列を含むベクターを導入すること（本発明の方法の段階ｄ）に対応する）をさらに含む。好ましくは、この核酸配列はＦｏｘｐ３をコードする。一実施形態では、ベクターは、目的とするさらなるポリペプチドに翻訳される可能性のある、少なくとも別の遺伝子の核酸配列または少なくとも１つの他の目的とするｍＲＮＡをコードする核酸配列をさらに含む。このような目的とする核酸配列の例としては、特に限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列、Ｍｃｌ－１をコードする核酸配列、Ｂｃｌ－ｘＬをコードする核酸配列、およびＨｅｌｉｏｓをコードする核酸配列が挙げられる。

一実施形態では、目的とする核酸配列、好ましくはＦｏｘｐ３をコードする核酸配列を含むベクターを導入する段階ｄ）を、段階ｃ）の、すなわちＴ細胞への分化の段階の第Ｄｄ８日～第Ｄｄ１２日、好ましくは第Ｄｄ９～第Ｄｄ１１日に実施する。一実施形態では、目的とする核酸配列、好ましくはＦｏｘｐ３をコードする核酸配列を含むベクターを導入する段階ｄ）を、Ｔ細胞分化段階（細胞培養の第二の主要な段階、本発明の方法の段階ｃ）に対応する）の第Ｄｄ９日、第Ｄｄ１０日、または第Ｄｄ１１日に実施する。

「Ｄｄ」という用語は、Ｔ細胞分化段階の、すなわち、細胞培養の第二段階の、日数を表す。

好ましくは、目的とする核酸配列、好ましくはＦｏｘｐ３をコードする核酸配列を含むベクターの導入を細胞培養の第二の段階の、すなわち、本発明の方法の段階ｃ）の間の、第Ｄｄ１０日に実施する。より好ましくは、目的とする核酸配列、好ましくはＦｏｘｐ３をコードする核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドと細胞を一緒にしてから１０日後に実施する。

実際、本発明者らは驚くべきことに、第二の段階の第２６日（「Ｄｄ２６」）に観察される細胞表現型が、細胞培養の第二の段階の第Ｄｄ１０日に形質導入を実施した場合に特に改善されることを明らかにした。実際、第二の段階の第Ｄｄ２６日に観察される細胞は、形質導入を細胞培養の第二の段階の第Ｄｄ１０日に実施した場合に、より大きな割合のＣＤ３およびＴＣＲを発現する細胞を含有する。本発明者らはさらに、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドと一緒にしてから８日後、１０日後、および１２日後の細胞について、複数のマーカーの発現を特徴付けた。このようにして、細胞は、具体的に、第Ｄｄ８日および第Ｄｄ１２日に関して、第二の段階の第Ｄｄ１０日にＣＤ４３の発現の減少を示した。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、細胞集団中のＣＤ４３－表現型を示す細胞の割合の増大は、目的とする核酸配列を含むベクターのより高い導入効率と関係するのではないかと考える。

したがって、一実施形態では、目的とする核酸配列を含むベクターの導入を、細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に実施する。好ましくは、目的とする核酸配列を含むベクターの導入を、細胞集団の少なくとも２０％がＣＤ４３－表現型を示す場合に実施する。より好ましくは、目的とする核酸配列を含むベクターの導入を、細胞集団の少なくとも２５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に実施する。

一実施形態では、目的とする核酸配列を含むベクターの導入を、細胞集団の１５％～４０％がＣＤ４３－表現型を示す場合に実施する。

「１５％～４０％」は、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、および４０％を含むことが理解される。

本発明の一実施形態では、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法は、以下の段階：
ａ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、およびＩＬ－３を含み、造血細胞の増殖に適した無血清培地中で、少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で、少なくとも９日間培養する段階と；
ｂ）上記胚様体を分離する段階と；
ｃ）上記分離した胚様体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、およびＩＬ－７を含む分化培地中で、少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドとともに培養して、上記Ｔ細胞集団を入手する段階と；
ｄ）段階ｃ）中に、好ましくは細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの第８日（Ｄｄ８）～第１２（Ｄｄ１２）日での導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含む。

本発明の一実施形態では、ベクターは、Ｆｏｘｐ３のみをコードする核酸配列を含む。

別の実施形態では、導入されるベクターは、また別の核酸配列をさらに含む。この追加の配列は、例えば、Ｍｃｌ－１をコードする遺伝子に対応してよく、例えば、出願国際公開第２０１４１８０９４３号に記載されている。追加の配列はまた、Ｈａｑｕｅら（２０１２）に記載されているＢｃｌ－ｘＬをコードする遺伝子に対応し得る。追加の配列はまた、Ｂａｉｎｅら（２０１３）に記載されているＨｅｌｉｏｓ（亜鉛フィンガータンパク質）をコードする遺伝子に対応し得る。

特定の実施形態では、さらなる核酸配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列である。一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗ＨＬＡ ＣＡＲ、すなわち、好ましくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲからなる群より選択されるＨＬＡ抗原を標的とする、または認識するＣＡＲである。したがって、一実施形態では、追加の核酸配列は、ＭａｃＤｏｎａｌｄら（２０１６）に記載される、抗ＨＬＡ－Ａ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（すなわち、ＨＬＡ－Ａ２を標的とする、または認識するＣＡＲ）をコードする核酸配列である。

ＣＡＲは、一般には膜貫通ドメインを介して１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインと結合される標的化ドメインから構成される人工受容体である。ＣＡＲは、標的とされる細胞、例えば、抗拒絶反応治療では抑制される免疫細胞、または抗癌治療では腫瘍細胞の表面に存在する抗原を認識するよう設計される。

ＣＡＲの標的化ドメインは一般に、抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。受容体またはリガンドの結合ドメインに由来する標的化ドメインも、使用に成功している。第一世代ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一般にＣＤ３ゼータに由来する刺激ドメインである。第二世代および第三世代ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの共刺激分子に由来する１つ（第二世代ＣＡＲ）または２つ以上（第三世代ＣＡＲ）の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を概念化し作製する戦略は最新技術で周知である。実例として、以下の参考文献を引用できる：ＢｏｎｉｎｉおよびＭｏｎｄｉｎｏ（２０１５）、ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＲｉｄｄｅｌｌ（２０１５）、ＪｅｎｓｅｎおよびＲｉｄｄｅｌｌ（２０１５）、ならびにＧｉｌｌおよびＪｕｎｅ（２０１５）。

当業者であれば、単独で、またはＦｏｘｐ３遺伝子をコードする核酸配列と組み合わせて使用し得る、目的の遺伝子を同定できる。

一実施形態では、ベクターは、標的細胞に特異的な抗体を運搬するアデノウイルスベクター、プラスミド、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ハイブリッドアデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクチンベクター、または装飾ペグ化リポソームを含む群から選択される。一実施形態では、ベクターはレトロウイルス、好ましくはレンチウイルスである。

一実施形態では、目的とする核酸の発現はＣｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ９系を含む。

本発明の一実施形態では、本発明による方法の細胞培養の第二の段階の終了時に、培養中の細胞集団はＴｒｅｇ細胞を含む。本発明の一実施形態では、本発明による方法の細胞培養の第二の段階の終了時に、培養中の細胞集団はＴｒｅｇ細胞および／またはＴｅｆｆ細胞を含む。本発明の一実施形態では、本発明による方法の細胞培養の第二の段階の終了時に、培養中の細胞集団は、Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む。

本発明の一実施形態では、本発明による方法の細胞培養の第二の段階の終了時に、培養中の細胞集団は、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む。

一実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞の単離および／または精製の段階をさらに含み、ここではＴ細胞を既知の技術によって培地から単離し得る。例えば、上記のＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ法によりＴ細胞集団を単離および精製できる。

別の実施形態では、本発明の方法は、Ｔｒｅｇ細胞の単離および／または精製の段階をさらに含む。例えば、上記のＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ法、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ＴＣｅｌｌ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりＴｒｅｇ細胞集団を単離および精製できる。

一実施形態では、本発明の方法は、Ｔｅｆｆ細胞の単離および／または精製の段階をさらに含む。例えば、上記のＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ法によりＴｅｆｆ細胞集団を単離および精製できる。そのために、細胞を、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＴＣＲａｂマーカーの使用、およびＦｏｘｐ３の発現により同定できる。ＣＤ４および／またはＣＤ８および／またはＴＣＲを発現するが、Ｆｏｘｐ３は発現しない細胞集団は、エフェクターＴ細胞と見なすことができる。

別の実施形態では、本発明の方法は、ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の単離および／または精製の段階をさらに含む。例えば、上記のＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ法によりＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞集団を単離および精製できる。

一実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞、具体的にはＴｒｅｇ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞に上記のキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入して、ＣＡＲ、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現する、本発明によるＴ細胞を入手する段階をさらに含む。この形質導入は、当該技術分野で公知の方法に従って実施できる。例えば、形質導入を、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むレトロウイルスまたはレンチウイルスを使用するｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入によって実施できる。

本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞手段を入手する方法であって、以下の段階：
（ａ）造血幹細胞を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
ｂ）上記造血幹細胞を、それらをＴ細胞に分化させる条件下に置く段階と；
ｃ）任意選択で、または同時に、段階ｂ）中に、目的とする核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含む、方法に関する。

一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法であって、以下の段階：
ａ）造血幹細胞を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
ｂ）上記造血幹細胞を、それらをＴ細胞に分化させる条件下に置く段階と；
ｃ）段階ｂ）中に、目的とする核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含む、方法に関する。

一実施形態では、細胞集団の少なくとも５％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に、細胞を移し、段階ｂ）を開始する。一実施形態では、細胞集団の少なくとも１０％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に、細胞を移し、段階ｂ）を開始する。一実施形態では、細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に、細胞を移し、段階ｂ）を開始する。

一実施形態では、細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、段階ｃ）で計画されるベクターの導入を実施する。

一実施形態では、造血幹細胞をＴ細胞に分化させる細胞培養の第二の段階の第８日（Ｄｄ８）～第１２日（Ｄｄ１２）に、段階ｃ）で計画されるベクターの導入を実施する。一実施形態では、造血幹細胞をＴ細胞に分化させる細胞培養の第二の段階の第９日（Ｄｄ９）～第１１日（Ｄｄ１１）に、段階ｃ）で計画されるベクターの導入を実施する。一実施形態では、造血幹細胞をＴ細胞に分化させる細胞培養の第二の段階の第９日（Ｄｄ９）、第１０日（Ｄｄ１０）、または第１１日（Ｄｄ１１）、好ましくは第１０日（Ｄｄ１０）に、段階ｃ）で計画されるベクターの導入を実施する。

一実施形態では、本発明の方法は、以下の段階：
ａ）少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
ｂ）上記胚様体を分離する段階と；
ｃ）上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１５日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置く段階と；
ｄ）任意選択で、または同時に、段階ｃ）中に、好ましくは第８日（Ｄｄ８）～第１２日（Ｄｄ１２）に、好ましくは細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含む。

一実施形態では、本発明の方法は、以下の段階：
ａ）少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
ｂ）上記胚様体を分離する段階と；
ｃ）上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１５日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置く段階と；
ｄ）段階ｃ）中に、好ましくは第８日（Ｄｄ８）～第１２日（Ｄｄ１２）、好ましくは第９日（Ｄｄ９）～第１１日（Ｄｄ１１）に、好ましくは細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含む。

好ましい実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法であって、以下の段階：
ａ）造血幹細胞を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階であって、胚様体の発生、次いで上記胚様体を分離することを含む、段階と；
ｂ）造血幹細胞を含む上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１５日間、例えば少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置いて、それらをＴ細胞に分化させる段階と；
ｃ）任意選択で、または同時に、段階ｂ）中に、好ましくは第８日（Ｄｄ８）～第１２日（Ｄｄ１２）に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含み、細胞を、細胞集団の少なくとも５％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に段階ｂ）に従い少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置き、好ましくは段階ｃ）で計画されるベクターの導入を、細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に実施する、方法に関する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法であって、以下の段階：
ａ）造血幹細胞を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階であって、胚様体の発生、次いで上記胚様体を分離することを含む、段階と；
ｂ）造血幹細胞を含む上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１５日間、例えば少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置いて、それらをＴ細胞に分化させる段階と；
ｃ）段階ｂ）中に、好ましくは第８日（Ｄｄ８）～第１２日（Ｄｄ１２）、好ましくは第９日（Ｄｄ９）～第１１日（Ｄｄ１１）に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含み、好ましくは、細胞を、細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に段階ｂ）に従い少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置き、好ましくは、段階ｃ）で計画されるベクターの導入を、細胞集団の少なくとも１５％がＣＤ４３－表現型を示す場合に実施する、方法に関する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からＴ細胞集団を入手する方法であって、以下の段階：
ａ）造血幹細胞を入手できる条件下で多能性幹細胞を培養する段階であって、胚様体の発生、次いで上記胚様体を分離することを含む、段階と；
ｂ）造血幹細胞を含む上記分離した胚様体を、好ましくは少なくとも１５日間、例えば少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞との共培養で、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置いて、それらをＴ細胞に分化させる段階と；
ｃ）段階ｂ）中に、好ましくは第８日（Ｄｄ８）～第１２日（Ｄｄ１２）に、Ｆｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、少なくとも１つの細胞で実施する段階
を含み、細胞を、細胞集団の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％がＣＤ３４＋ＣＤ４３＋表現型を示す場合に段階ｂ）に従い少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドの存在下に置き、段階ｃ）で計画されるベクターの導入を、細胞集団の少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％がＣＤ４３－表現型を示す場合に実施することを特徴とする、方法に関する。

本発明はまた、造血幹細胞からＴ細胞を入手する方法であって、造血幹細胞集団の少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、上記集団の少なくとも１つの細胞に核酸配列を導入することを含む、方法に関する。好ましくは、本発明は、造血幹細胞からＴ細胞を入手する方法であって、造血幹細胞集団の少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％がＣＤ４３－表現型を示す場合に、上記集団の少なくとも１つの細胞にＦｏｘｐ３をコードする核酸配列を導入することを含む、方法に関する。

一実施形態では、本発明による方法は、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｅｆｆおよび／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を入手することを可能にする。

一実施形態では、本発明による方法は、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を入手することを可能にする。

一実施形態では、本発明による方法は、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋およびＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を入手することを可能にする。

したがって、本発明はまた、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｅｆｆおよび／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団に関する。

一実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む。

一実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋およびＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む。

ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどの方法は、特定の具体的な集団、例えばＴｒｅｇ細胞からなる集団、Ｔｅｆｆ細胞からなる集団、もしくはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞からなる集団、またはその組合せなどを単離できる。このような方法はまた、亜集団、例えばＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の亜集団、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞からなる亜集団、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞からなる亜集団、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞からなる亜集団、またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞からなる亜集団などを単離できる。

当業者は、最新技術からわかる、このような集団および細胞亜集団を単離できる他の方法を特定し、応用できる。

また、本発明による１つの目的は、本発明の方法によって入手された、または入手可能なＴ細胞集団に関する。

一実施形態では、集団は、以下の表現型：ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋を示す、Ｔｒｅｇ集団である。別の実施形態では、集団は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔｅｆｆ集団である。別の実施形態では、集団は、ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋集団である。一実施形態では、集団は、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｅｆｆおよび／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞からなる。

一実施形態では、本発明による方法によって入手可能なＴ細胞を次いで、形質転換（または形質導入）して、上記のキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現させる。この形質転換（または形質導入）は、当該技術分野で公知の方法に従って実施され得る。例えば、形質転換（または形質導入）を、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むレトロウイルスまたはレンチウイルスを使用するｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入により実施し得る。

別の実施形態では、本発明による方法によって入手可能なＴ細胞を次いで、増幅する。例えば、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下でＴ細胞のポリクローナルな増殖を誘導することにより増幅し得る。Ｔ細胞を拡大する方法は当該技術分野、例えばＰｅｔｅｒｓｅｎ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１８“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＩ３Ｋδ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ＶＩＰ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．”Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２．３：２１０－２２３）またはＢｏｕｒｓｉｅｒ（Ｂｏｕｒｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１２ “Ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｄｅｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｕｒｓ ｅｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅｓ ｄａｎｓ ｌｅｓ ｍａｌａｄｉｅｓ ａｕｔｏ－ｉｍｍｕｎｅｓ．”Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８：７５７－６３）で公知である。

本発明のさらなる目的は、薬物としての使用のための上記のＴ細胞集団である。

好ましくは、本発明は、細胞療法での使用のためのＴ細胞の集団に関する。具体的には、Ｔ細胞集団は個別化医療で使用でき、例えば、分化細胞を患者から採取し、次いでヒト人工多能性幹細胞に再プログラムし、本発明の方法に従い使用して新たなＴ細胞を与えることができ、それを上記患者に投与できる。

本発明による別の目的は、免疫調節異常に関連する病態の治療での使用のための上記のＴ細胞の集団である。

本発明では、免疫調節異常に関連する病態は、免疫応答が低下し（例えば、免疫応答が起こらず、または抑えられ）病原体と効果的に戦うことができない病態、および免疫応答が強力すぎて、例えば自己細胞の損傷を引き起こす病態を含む。このような病は、とりわけ、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、アレルギー、移植片拒絶反応、または移植片対宿主病に対応する。

本発明の一実施形態では、本発明によるＴ細胞の治療有効量を、治療する対象に投与するべきである。

本発明によるＴ細胞の治療有効量は、例えば、免疫ホメオスタシスを回復させるため、すなわち、免疫応答が強力すぎる場合にその強度を低下させる、または免疫応答が弱すぎるか全くみられない場合にその大きさを増大させるために効果的な量を含む。

一実施形態では、Ｔ細胞の集団はＴｒｅｇ細胞の集団である。好ましい実施形態では、Ｔ細胞集団は、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、および炎症性疾患の治療での使用のためのＴｒｅｇ細胞集団である。特定の実施形態では、Ｔ細胞集団は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現し、抗拒絶反応の治療または移植片対宿主病の治療での使用のための、Ｔｒｅｇ細胞集団である。

一実施形態では、Ｔ細胞の集団は、Ｔｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団である。好ましい実施形態では、Ｔ細胞の集団は、癌または感染症の治療での使用のためのＴｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団である。特定の実施形態では、Ｔ細胞集団は、癌の治療での使用のための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団である。本発明の１つの目的は、免疫系を調節する方法であって、好ましくは上記の本発明の方法によって入手した、上記のＴ細胞の集団を、治療される対象に投与することを含む、方法に関する。

一実施形態では、本発明は、細胞療法によって免疫系を調節する方法であって、好ましくは上記の本発明の方法によって入手した、上記のＴ細胞の集団を、治療される対象に、投与することを含む、方法に関する。

一実施形態では、上記の免疫系を調節する方法は、好ましくは上記の本発明の方法によって入手した、本発明によるＴ細胞の治療有効量を、治療される対象に投与することを含む。

本発明の１つの目的は、免疫調節異常に関連する病態を治療する方法であって、好ましくは上記の本発明の方法によって入手した、上記のＴ細胞の集団を、治療される対象に投与することを含む、方法に関する。

一実施形態では、この方法は、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、または炎症性疾患を治療する方法であり、好ましくは、上記のＴｒｅｇ細胞の集団を治療される対象に投与することを含む。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現する。したがって、一実施形態では、この方法は、移植片拒絶反応または移植片対宿主病を治療する方法であり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団を、治療される対象に投与することを含む。

一実施形態では、この方法は、癌または感染症を治療する方法であり、好ましくは、上記のＴｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団を、治療される対象に投与することを含む。一実施形態では、Ｔｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。したがって、一実施形態では、この方法は、癌を治療する方法であり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団を、治療される対象に投与することを含む。

一実施形態では、本発明による治療方法は、好ましくは上記の本発明の方法によって入手した、本発明によるＴ細胞の治療有効量を、治療される対象に投与することを含む。

本発明の１つの目的は、免疫調節異常に関連する病態を治療するための薬物の製造のための、好ましくは本発明の方法によって入手した、本発明によるＴ細胞の集団の使用に関する。

一実施形態では、Ｔ細胞集団は、上記のＴｒｅｇ細胞の集団であり、薬物は、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、または炎症性疾患を治療するためのものである。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現する。したがって、一実施形態では、Ｔ細胞の集団は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば抗ＨＬＡ ＣＡＲ、より具体的には抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団であり、薬物は、移植片拒絶反応または移植片対宿主病を治療するためのものである。

一実施形態では、Ｔ細胞集団は、上記のＴｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団であり、薬物は、癌または感染症を治療するためのものである。一実施形態では、Ｔｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。したがって、一実施形態では、Ｔ細胞の集団は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴｅｆｆ細胞および／またはＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞の集団であり、薬物は、癌を治療するためのものである。

本発明の１つの目的は、本発明による方法での使用のためのキットであって、上に明記した造血幹細胞を含む胚様体を形成させる培養プレートと、胚様体の形成を誘導する培地と、造血幹細胞をＴ細胞に分化させる培養プレートと、Ｔ細胞に分化させる培地と、増殖因子および／またはサイトカインを含む溶液とを含む、キットに関する。

（実施例）
実施例１（本発明の方法の実施を説明する参照例）
実験プロトコル
フランスの法的ガイドラインおよび地方施設の倫理委員会に従い研究プロトコルを実施した。

多能性幹細胞
ヒト多能性幹細胞の未分化コロニー（市販のｈＥＳ ＷＡ０９（ＷｉＣｅｌｌ）系）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％のＫＳＲ（「ノックアウト血清リプレースメント」）血清、１％のＬ－グルタミン、１％の非必須アミノ酸、０．１％の２－メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子）（図１、「段階０」）を含む多能性幹細胞用の培地中で、マウス胚線維芽細胞（「ＭＥＦ」）上の培養にて維持した。５～６日毎に継代を実施する。

造血幹細胞の入手方法（段階Ｉ）
ヒト多能性幹細胞を造血細胞に分化させるため、未分化コロニーをディスパーゼ（１Ｕ／ｍＬ）で１０分間処理し、低接着プレートに移して、胚様体を形成させた。

この段階（図１、「段階Ｉ」）に使用した培地は、ＳＴｅｍＰｒｏ－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、１％のＬ－グルタミン、１％の非必須アミノ酸、０．１％の２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、ならびに５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸からなる。

胚様体の形成を、３０ｎｇ／ｍＬのｈＢＭＰ－４（「ヒト骨形成タンパク質４」）の存在下で１日間インキュベートすることにより促進した（図１、文字「ａ」）。

胚様体を次いで、３０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－４および５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２とともに第Ｄ３日まで培養して（図１、文字「ｂ」）、中胚葉の誘導を可能にした。

第Ｄ３日～Ｄ５日、次いで第Ｄ５日～第Ｄ７日に、種分化および増殖を、ｈＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および増殖因子と造血サイトカインのカクテル（１００ｎｇ／ｍＬのｈＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬのｈＦｌｔ３－Ｌ、２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－３、および５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２）（図１、文字「ｃ」）の存在下で継続する。

次いで、分化を、ＦＧＦ２を含まない同じサイトカインでＤ７からＤ９まで継続する（図１、文字「ｄ」）。

Ｄ７、Ｄ８、およびＤ９での胚様体細胞表現型の決定
造血幹細胞を含むＤ７、Ｄ８、およびＤ９での胚様体を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で１０分間処理することにより分離し、存在するマーカーを、フローサイトメトリーにより分析した。

Ｔ細胞の入手方法（段階ＩＩ）
Ｄ９に入手した胚様体を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で１０分間処理することにより分離した。このようにして単離した細胞を、ＯＰ９－ＤＬＬ１細胞の単層上に播種して、リンパ系Ｔに分化させた。この分化を可能にする培地「中間ＯＰ９」（図１、「段階ＩＩ」）は、２０％のＦＢＳ、１％のＬ－グルタミン、１％の非必須アミノ酸、０．１％の２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含み、ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＦｌｔ３Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）が添加されたα－ＭＥＭを含む。２日毎に培地の半分を入れ替え、５日毎に細胞を新たなＯＰ９－ＤＬＬ１単層に移した（図１、文字「ｅ」）。

レンチウイルスの作製および力価測定
構築物ｐＭＳＣＶ－ヒトＦｏｘｐ３－ＥＦ１－ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＦＯＸＰ３ＧＦＰ）を保有するレンチウイルス９μｇと、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２ ８μｇと、プラスミドｐＭＤ２Ｇ ４μｇとを含むＤＮＡプラスミドを作製した。塩化カルシウム法を用いてそれをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４２～６６時間後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清中のレンチウイルス粒子を収集した。力価測定のために、Ｊｕｒｋａｔ細胞１００，０００個を培養し、１０μＬ～０．０７８μＬの範囲にわたるウイルスの半分の段階希釈物を混入させた。３日後、細胞を回収し、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の蛍光をフローサイトメトリーにより分析した。

分化中の細胞の形質導入
Ｄｄ０、Ｄｄ５、Ｄｄ１０、およびＤｄ１５（それぞれＯＰ９－ＤＬＬ１単層上での培養開始後第５日、第１０日、および第１５日）の細胞を回収し、遠心分離し、サイトカインを含むＯＰ９培地５００μＬ中、３７℃で４０分間、１細胞当たりウイルス粒子２０個の感染多重度（ＭＯＩ）にてＦＯＸＰ３ＧＦＰレンチウイルスで形質導入した。形質導入後、細胞を、サイトカインを含むＯＰ９培地２ｍＬ中の新たなＯＰ９－ＤＬＬ１単層に播種した。

フローサイトメトリー
フェノタイピングおよびフローサイトメトリー分析のために、以下のコンジュゲート抗体：ＣＤ３４－ＰｅＣＹ７、ＣＤ４３－ＡＰＣ、ＫＤＲ（ＣＤ３０９）－ＰＥ、ＣＤ７－ＰｅＣｙ５、ＣＤ５－ＢＶ５１０、ＣＤ３－ＡＰＣＣｙ７、ＴＣＲａｂ－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＢＶ６０５、ＣＤ８ａ－ＰＥ、およびＣＤ８ｂ－ＰｅＣｙ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用した。いずれの抗体も２０倍希釈で使用した。死細胞を、ＤＡＰＩで標識することにより全ての実験で分析から除外した。蛍光を、ＬＳＲ ＩＩＩまたはＣａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で測定し、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ社、アシュランド、米国）で分析した。

「ＤＧＥ－ＲＮＡ」ＲＮＡシーケンシング
ＲＮｅａｓｙ－Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを単離し、次いで、これを用いてＲＮＡシーケンシングを実施した。ＲＮＡシーケンシングのための３‘ＤＧＥプロトコルは、Ｐｉｃａｒｄａら（２０１７）に記載されているものである。

結果
図２は、７日間にわたる胚様体培養（本発明の方法の段階１）後、細胞の約４０％がＣＤ３４＋を発現することを示す。第７日～第９日に、集団中のＣＤ３４＋細胞の割合は安定なままであり、ＣＤ４３＋の割合は増加している。胚様体発生の第９日に、ＣＤ３４＋細胞は、より高いレベルのＲｕｎｘ３、Ｉｋａｒｏｓ、およびＩＬ－７Ｒなどの転写因子またはリンパ系分化のキー分子を発現する（結果は不掲載）。

ＤＧＥＲＮＡ－Ｓｅｑシーケンシングによる分析は、Ｄ９で細胞がＮｏｔｃｈ２を発現することを示した。Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２ＮＬ、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４の発現は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞でよりもＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞での方が高く（結果は不掲載）、これらのＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞が、Ｎｏｔｃｈ分子の発現と培地中のＮｏｔｃｈ ＤＬＬ１リガンドの存在のおかげでＯＰ９－ＤＬＬ１細胞との共培養において、第二の段階中に、より分化できることを示唆した。

胚様体中のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋亜集団の増加およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－亜集団の存在は、細胞集団全体を、細胞培養の第二の段階中に分化できるようにする。

図３Ａは、Ｄｄ２０（ＯＰ９細胞との共培養の第２０日）での細胞によるリンパ系細胞系のマーカーＣＤ５およびＣＤ７の発現を示す。細胞の約８０％がＣＤ５＋ＣＤ７＋表現型のものあり；そのうち、約２２％がＣＤ４＋ＣＤ８ａ＋であり（図３Ｂ）、２５％がＣＤ８ａ＋ＣＤ８ｂ＋であり（図３Ｃ）、１１％がＣＤ５６＋ＣＤ８ａ＋である（図３Ｄ）。

一方、図４Ａは、Ｄｄ２６（ＯＰ９細胞との共培養の第２６日）での細胞によるＣＤ５およびＣＤ７の発現を示す。細胞の約８０％がＣＤ５＋ＣＤ７＋表現型のものであり；そのうち、約２２％がＣＤ４＋ＣＤ８ａ＋であり（図４Ｂ）、２７％がＣＤ８ａ＋ＣＤ８ｂ＋であり（図４Ｃ）、１１％がＣＤ５６＋ＣＤ８ａ＋である（図４Ｄ）。集団の１％未満がＴＣＲａｂおよびＣＤ３を発現する（図４Ｅ）。さらに、ＤＧＥ－ＲＮＡシーケンシングは、細胞がＴｒｅｇ細胞のキー転写因子であるＦｏｘｐ３を発現しないことを示した。

したがって、Ｆｏｘｐ３をコードする遺伝子の導入を実施して細胞をＴｒｅｇ細胞に分化させた。Ｆｏｘｐ３をコードする遺伝子の挿入を、レンチウイルスの形質導入により実施した。様々な時間を、ＯＰ９細胞との培養開始時から、すなわち、Ｄｄ０（共培養開始時）、Ｄｄ５（共培養開始５日後）、Ｄｄ１０（共培養開始１０日後）、およびＤｄ１５（共培養開始１５日後）を選択して細胞の形質導入を実施し、次いでＤｄ２６に分析した。図５は、形質導入細胞がこれらの形質導入でそれぞれ観察されたことを示す。Ｄｄ１０に実施した形質導入（図５Ｃ）は、Ｆｏｘｐ３を発現する細胞をより多く入手できるように思われ、約１１％のＣＤ７＋Ｆｏｘｐ３＋集団を有した。

ＣＤ７＋Ｆｏｘｐ３＋細胞のこの亜集団のマーカーを、各形質導入時間についてＤｄ２６に観察する。Ｄｄ１０に形質導入した集団は、ＣＤ３およびＴＣＲを発現するＣＤ７＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を約２２％含む（図６Ｃ）のに対して、Ｄｄ０、Ｄｄ５、Ｄｄ１５に形質導入した集団は５％未満を含む（それぞれ図６Ａ、６Ｂ、および６Ｄ）。Ｄｄ１０に形質導入したダブルポジティブ細胞の半数がＣＤ８ａを発現し（図６Ｅ）、それ以外の半数はＣＤ４を発現する（図６Ｆ）。ＣＤ８ａを発現する細胞はほぼ全部がＣＤ８ｂも発現する（図６Ｅ）。このように、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ８＋およびＦｏｘｐ３＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ４＋表現型を有するＴｒｅｇ細胞の入手に成功した。

ＣＤ７＋Ｆｏｘｐ３－細胞亜集団のマーカー（図５）を、各形質導入時間についてＤｄ２６に観察する。Ｄｄ１０に形質導入した集団は、ＣＤ３およびＴＣＲを発現するＣＤ７＋Ｆｏｘｐ３－細胞を約１２％含み（図７Ｃ）、Ｄｄ０、Ｄｄ５、Ｄｄ１５に形質導入した集団は約５～７％含む（それぞれ図７Ａ、７Ｂ、および７Ｄ）。これらのダブルポジティブ細胞の約３５％がＣＤ８ａを発現し（図７Ｅ）、３８％がＣＤ４を発現し（図７Ｆ）、約４分の１がダブルネガティブＣＤ４－ＣＤ８－である。ＣＤ８ａ＋細胞の約７０％がＣＤ８ｂも発現する（図７Ｅ）。これらの細胞はエフェクターＴ細胞であるものと思われる。

細胞がＤｄ１０に形質導入を受けやすい理由をさらに理解するため、それらの表現型をフローサイトメトリーにより分析した。その結果を図８に示す。Ｄｄ８～Ｄｄ１２の間に、細胞は造血幹細胞のマーカーであるＣＤ３４の発現を喪失し、このことは、細胞がリンパ系細胞系に移行したことを反映している。細胞は、初期のリンパ系細胞系を表すＣＤ７マーカーを獲得し、免疫細胞のマーカーであるＣＤ４３およびＣＤ３８も発現する。この段階では、細胞は未だＣＤ４もＣＤ８も発現しない。Ｄｄ１０で、集団の約３０％がＣＤ４３－になり（図８Ｅ）、Ｄｄ８およびＤｄ１２で、この割合はそれぞれわずか約１２％および９％である（図８ＤおよびＦ）ことがわかる。また、集団が最も高い割合のＣＤ７＋およびＣＤ４３＋細胞を含むのは、Ｄｄ１０である（約３５％、図８Ｅ）。

実施例２
市販のｈＥＳ ＷＡ０９幹細胞（ＷｉＣｅｌｌ）から実施例１に記載した造血幹細胞を入手するプロトコル（段階Ｉ）を、ｈＥＳ ＷＡ０１細胞（ＷｉＣｅｌｌ）、ｈｉＰＳ Ｔ０４（ＣＲＴＩ／ＰＦｉＰＳＣ Ｎａｎｔｅｓ）、ｈｉＰＳ ＬＯＮ８０（ＰＦｉＰＳＣ Ｎａｎｔｅｓ）から実施した。

図９Ａは、ｈＥＳ ＷＡ０９細胞をＣＤ３４＋造血幹細胞に分化させることが可能である（Ｄ９で約３６％）ことを確認し、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋の割合が約１６．５％に達することを示す。図９Ｂは、Ｔ０４細胞をＣＤ３４＋造血幹細胞に分化させることが可能であり（Ｄ９で約４０％）、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞の割合が約２１．５％であることを示す。図９Ｃおよび９Ｄは、ｈｉＰＳ ＬＯＮ８０およびｈＥＳ ＷＡ０１細胞をＣＤ３４＋造血幹細胞に分化させることが可能であり、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞の割合がそれぞれ約６．５％および７．０％に達することを示す。

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Claims (15)

1. 多能性幹細胞から調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含むＴ細胞の集団を入手するための方法であって、以下の段階：
   ａ）少なくとも５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む胚様体を入手することを可能にする条件下で多能性幹細胞を培養する段階と；
   ｂ）前記胚様体を分離する段階と；
   ｃ）少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドとともに前記分離された胚様体を培養する段階と；
   ｄ）少なくとも１つの細胞でＦｏｘｐ３をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターの導入を、段階ｃ）中に、段階ｃ）の第８日（Ｄｄ８）および第１２日（Ｄｄ１２）の間で実施する段階
   を含む、方法。
2. 段階ａ）で得られた前記胚様体が、少なくとも１５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む、請求項１に記載の方法。
3. 段階ａ）を少なくとも９日間実施する、請求項１または２に記載の方法。
4. 段階ａ）を、ＢＭＰ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、および／またはＩＬ－３を含む無血清培地中で実施する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 段階ｂ）の終了時に得られた、前記分離された胚様体を、段階ｃ）で、少なくとも１５日間、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌおよび／またはＩＬ－７を含む培地中で培養する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 段階ｄ）の前記ベクターが、レトロウイルスである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 段階ｄ）の前記ベクターの前記核酸配列が、目的のさらなる核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記目的のさらなる核酸配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｍｃｌ－１、Ｂｃｌ－ｘＬ、およびＨｅｌｉｏｓをコードする核酸から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞またはヒト胚性幹細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記方法により得られたＴ細胞の集団が、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞から選択される細胞集団を単離する追加の段階を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記方法により得られたＴ細胞の集団が、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法により入手されたＴ細胞の集団であって、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ならびにＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞を含むことを特徴とする、Ｔ細胞の集団。
14. 薬物としての使用のための、請求項１３に記載のＴ細胞の集団および薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
15. それを必要とする患者における、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、アレルギー、移植片拒絶反応、または移植片対宿主病の治療における使用のための、請求項１３に記載のＴ細胞の集団および薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
    

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