JP5861191B2 - ミエロイド系血液細胞の製造方法 - Google Patents
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本発明は、生体外で増殖する能力を有するヒトミエロイド系血液細胞の製造、およびその培養の方法に関する。より詳細には、本発明は、人体から採取されたミエロイド系血液細胞、あるいは、人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞から所定の分化誘導法を用いて生体外において作製されたミエロイド系血液細胞に、その機能を保持しつつ生体外で増殖する能力を獲得させる方法に関する。さらに、該増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を、より強力なT細胞刺激能力を有する樹状細胞様細胞へと分化させる方法に関する。本発明の方法により製造される生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞は、微生物等を貪食する活性を有している。本発明により作製される増殖能力を有するミエロイド系血液細胞、あるいはそれに由来する樹状細胞様細胞は、アルツハイマー病、がん、感染症、プリオン病、アミロイドーシス、自己免疫疾患等の治療において有用であると期待される。本発明により作製される増殖能力を有するミエロイド系血液細胞およびそれに由来する樹状細胞様細胞は、また、臓器移植における拒絶反応や移植片対宿主病（GVHD）の治療においても有用であると期待される。さらに、ミエロイド系血液細胞は、がん、免疫関連疾患、代謝性疾患、血管病などの病態生理において生体内で重要な役割を有していることから、本発明により製造される増殖能を有するミエロイド系血液細胞は、医薬品等の薬効および毒性を検査するための評価細胞としても有用であると期待される。
ミエロイド系血液細胞は、白血球中に分類される細胞群であり、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球などを含む。マクロファージは、生体内における主要な異物処理細胞であり、生体内に侵入した感染性微生物等を貪食してこれを分解することにより、生体を感染症から防御する役割を有している。また、生体内では、日々、大量の細胞が死滅しており、マクロファージは、生体内組織中に存在するその残骸物を貪食し分解する。それ以外にも、マクロファージは、生体内で生じる様々な代謝産物を貪食・分解処理することにより、生体の恒常性維持において必須の役割を担っている。また、マクロファージは、悪性腫瘍の局所においてしばしば浸潤が認められる。腫瘍の局所に存在するマクロファージは、腫瘍細胞を攻撃している場合と腫瘍細胞の増殖を促進している場合の両方があると考えられている。これまでに、マクロファージの腫瘍細胞に対する攻撃能力を活用して悪性腫瘍を治療しようとする試みもなされている。
樹状細胞は、Tリンパ球を強力に刺激し活性化する細胞であり、生体内において免疫応答の制御を司っている細胞である。感染性微生物の生体内侵入に際して、樹状細胞は、微生物を貪食しそれに由来する抗原物質をTリンパ球に提示し、抗原特異的なTリンパ球を刺激し活性化することにより、免疫応答を誘導する。樹状細胞が有するTリンパ球を強力に刺激する能力を生かし、樹状細胞を、がんや感染症に対する免疫療法において細胞ワクチンとして用いる試みがなされている。
細胞医薬としてマクロファージや樹状細胞を使用し、臨床的な効果を得るためには、大量の細胞を必要とする。マクロファージの場合、1010から1012程度、樹状細胞の場合でも108から109の細胞を必要とする。生体内組織に存在するこれらの細胞の数は、有限であり、また、生体内組織からこれらの細胞を大量に採取することは困難である。そこで、マクロファージや樹状細胞による細胞医療を実現するためには、これらのミエロイド系血液細胞を大量に、かつ、より少ない費用で安定して供給できる方法を確立する必要がある。
マクロファージや樹状細胞は、がん、免疫関連疾患、代謝性疾患、血管病などの病態生理において重要な役割を有する細胞である。これらの疾患を治療するための各種医薬品を開発するにあたっては、マクロファージや樹状細胞に対する薬品の効果を評価することが必要である。医薬品の候補として多種類の化学物質について、同一の条件でその効果を比較するためには、均一な性質を有するマクロファージや樹状細胞を大量に供給する方法が必要である。
胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞）（induced pluripotent stem cell；iPS細胞）などの多能性幹細胞は、様々な細胞へ分化する能力を有する細胞であり、かつ、ほぼ無限に増殖する能力を有する。そして、生体内に存在するマクロファージあるいは樹状細胞と機能的に一定の類似性を有するミエロイド系血液細胞を多能性幹細胞から作製する方法が報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１〜９参照）。そこで、多能性幹細胞を大量に増殖させた後に、これらの分化誘導法を用いて分化させることにより、大量のミエロイド系血液細胞を作製することは、理論的には可能である。例えば、特許文献１には、（Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、及び（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、GM-CSFとインターロイキン−４(IL-4)の存在下に培養するステップ、を含む、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法が開示されている。しかしながら、特許文献１に記載の分化方法を含め、これまでに報告されている分化誘導培養法は、相当な労力と時間（1か月以上）を必要とするため、細胞治療に用いることを目的としてミエロイド系血液細胞を作製する方法としてはコストと時間が過大である。また、これまでに、多能性幹細胞からの分化誘導により作製したミエロイド系血液細胞を長期間（１か月以上にわたり）増殖させ、大量の（例えば、材料として用いた多能性幹細胞の105倍以上の）ミエロイド系血液細胞を作製できる方法は報告されていない。
他方、ヒトの末梢血中の単球（モノサイト、末梢血中のCD14分子を発現する細胞）から、樹状細胞およびマクロファージを作製する方法はよく知られている。健康なヒトの末梢血には、1mlあたり20,000-50,000個前後の単球が存在するので、CD14分子の発現を指標としてヒトの末梢血から単球を分離し、これを用いて樹状細胞およびマクロファージを作製することが可能である。ただし、従来技術ではヒトの末梢血単球を生体外での培養により増殖させることは困難であるため、1010の樹状細胞あるいはマクロファージを作製するためには、1010の単球を必要とし、そのためには20リットル前後の末梢血から単球を分離することを必要とする。そこで、今日、がんに対する細胞ワクチン療法を行うために樹状細胞を作製する場合は、成分採血装置（アフェレーシス）を用いた細胞分離による白血球分離装置を用いた白血球の分離、さらに白血球中の単球の分離が行われている。また、末梢血中の単球の数および生体外での分化能力にはドナーによる違いが大きいため樹状細胞を安定して作製することが困難であるという問題もある。
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本発明の課題は、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞の製造方法、該ミエロイド系血液細胞を増殖させる方法、該方法により得られるミエロイド系血液細胞、及び該ミエロイド系血液細胞を含む細胞医薬を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、細胞治療としての用途に有用なヒトのミエロイド系血液細胞を大量に製造する方法を提供することにある。また、ヒトの体内に存在するミエロイド系血液細胞と同等の機能を保持し、各種医薬品などのミエロイド系血液細胞に与える影響を調べるための検査において評価細胞として有用なミエロイド系血液細胞を安定的に製造する方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するため、多能性幹細胞から大量のミエロイド系血液細胞をできるだけ少ない費用で製造するべく、様々な方法を試みた。また、多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞に様々な遺伝子を強制的に発現させることにより、長期増殖能力を付与することを試みた。その結果、多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞にcMYC遺伝子に加えてBMI1、EZH2、MDM2、MDM4、あるいはHIF1Aの遺伝子を導入し強制的に発現させ、M-CSFを添加した培養液を用いて継続的に培養することにより、長期間に渡ってミエロイド系血液細胞としての性質を保持しながら増殖させることが可能であることを見いだした。さらに、ヒトの体内に存在するミエロイド系血液細胞である末梢血中単球の場合も、これらの遺伝子を導入し強制的に発現させることにより、増殖させることが可能であることを見いだした。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１） ミエロイド系血液細胞において、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
を強制的に発現させることを含む、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を製造する方法。
（２） 前記ミエロイド系血液細胞に前記遺伝子を導入することにより、該ミエロイド系血液細胞において該遺伝子を強制的に発現させる、（１）に記載の方法。
（３） 前記ミエロイド系血液細胞が、多能性幹細胞に由来する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、（３）に記載の方法。
（５） 前記人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、（４）に記載の方法。
（６） 前記ミエロイド系血液細胞が、末梢血単球である、（１）又は（２）に記載の方法。
（７） 前記末梢血単球が、ヒト末梢血単球である、（６）に記載の方法。
（８） 前記ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子が、それぞれ、ヒトｃＭＹＣ遺伝子、ヒトＢＭＩ１遺伝子、ヒトＥＺＨ２遺伝子、ヒトＭＤＭ２遺伝子、ヒトＭＤＭ４遺伝子、及びヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９） マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の存在下で、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法で製造したミエロイド系血液細胞を培養することを含む、ミエロイド系血液細胞を増殖させる方法。
（１０） （１）〜（９）のいずれかに記載の方法により製造される細胞。
（１１） （１０）に記載の細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導することを含む、樹状細胞様細胞を製造する方法。
（１２） 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン-4（IL-4）を含む培養液を用いて、前記ミエロイド系血液細胞を培養することにより、該ミエロイド系血液細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導する、（１１）に記載の方法。
（１３） （１１）又は（１２）に記載の方法により製造される細胞。
（１４） （１０）又は（１３）に記載の細胞を含む、細胞医薬。
（１５） 前記細胞医薬は、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、及び／又は自己免疫疾患の治療又は予防に用いるための細胞医薬である、（１４）に記載の細胞医薬。
（１６） （１０）若しくは（１３）に記載の細胞、又は（１４）に記載の細胞医薬を製造するための、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
の使用。
（１７） （１４）に記載の細胞医薬を用いて、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、及び／又は自己免疫疾患を治療する方法。
（１） ミエロイド系血液細胞において、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
を強制的に発現させることを含む、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を製造する方法。
（２） 前記ミエロイド系血液細胞に前記遺伝子を導入することにより、該ミエロイド系血液細胞において該遺伝子を強制的に発現させる、（１）に記載の方法。
（３） 前記ミエロイド系血液細胞が、多能性幹細胞に由来する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、（３）に記載の方法。
（５） 前記人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、（４）に記載の方法。
（６） 前記ミエロイド系血液細胞が、末梢血単球である、（１）又は（２）に記載の方法。
（７） 前記末梢血単球が、ヒト末梢血単球である、（６）に記載の方法。
（８） 前記ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子が、それぞれ、ヒトｃＭＹＣ遺伝子、ヒトＢＭＩ１遺伝子、ヒトＥＺＨ２遺伝子、ヒトＭＤＭ２遺伝子、ヒトＭＤＭ４遺伝子、及びヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９） マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の存在下で、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法で製造したミエロイド系血液細胞を培養することを含む、ミエロイド系血液細胞を増殖させる方法。
（１０） （１）〜（９）のいずれかに記載の方法により製造される細胞。
（１１） （１０）に記載の細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導することを含む、樹状細胞様細胞を製造する方法。
（１２） 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン-4（IL-4）を含む培養液を用いて、前記ミエロイド系血液細胞を培養することにより、該ミエロイド系血液細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導する、（１１）に記載の方法。
（１３） （１１）又は（１２）に記載の方法により製造される細胞。
（１４） （１０）又は（１３）に記載の細胞を含む、細胞医薬。
（１５） 前記細胞医薬は、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、及び／又は自己免疫疾患の治療又は予防に用いるための細胞医薬である、（１４）に記載の細胞医薬。
（１６） （１０）若しくは（１３）に記載の細胞、又は（１４）に記載の細胞医薬を製造するための、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
の使用。
（１７） （１４）に記載の細胞医薬を用いて、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、及び／又は自己免疫疾患を治療する方法。
本発明によれば、細胞ドナーの身体的負荷を伴うことなく、ミエロイド系血液細胞を大量に、かつ、安定して供給することが可能になる。また、本発明により製造したミエロイド系血液細胞は、生体内に存在するマクロファージと同様に微生物などを貪食する活性を有しており、感染症や悪性腫瘍に対する細胞療法を行うための細胞医薬を提供することを可能とする。また、本発明によれば、アルツハイマー病、アミロイドーシス、あるいは、ある種の代謝性疾患など、体内に特定の物質が大量に蓄積することに起因する疾患に対する細胞医薬を提供することも可能となる。さらに、本発明によれば、悪性腫瘍、感染症などに対する細胞ワクチンとして使用可能な樹状細胞様細胞を製造することが可能である。また、本発明によれば、自己免疫疾患や臓器移植に伴う拒絶反応などを治療する目的で免疫応答を制御するための細胞医薬品としての樹状細胞様細胞あるいはマクロファージを製造することが可能になる。さらに、本発明によれば、各種医薬品のミエロイド系血液細胞へ与える影響を検査するための試験・研究において評価細胞として有用なミエロイド系血液細胞を安定的に製造することが可能になる。
図１に示すように、本発明は、多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞、あるいは、生体から直接採取されたミエロイド系血液細胞に対し、CD１１b分子あるいはCD３３分子を発現する細胞として定義されるミエロイド系血液細胞に、生体外において増殖する能力を獲得させることを特徴とする。本発明は、前記細胞に増殖する能力を獲得させるために、該ミエロイド系血液細胞において、（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を強制的に発現させることを含むことを特徴とする。
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を強制的に発現させることを含むことを特徴とする。
本発明において、出発材料となる「ミエロイド系血液細胞」は、CD１１b分子あるいはCD３３分子を発現する細胞として定義され、その由来は特に限定されるものではないが、例えば、多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞、あるいは生体（例えば、人体）から採取されたミエロイド系血液細胞（例えば、末梢血単球）が例として挙げられる。
本発明において、「多能性幹細胞」とは、試験管内などの人工的に構成された条件下（in vitro）で増殖能を持ち、生体を構成する全ての細胞に分化が可能な細胞を言う。本発明では、多能性幹細胞として、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞 iPS細胞）を用いることが好ましく、人工多能性幹細胞を用いることがより好ましい。以下、本発明において用いられる胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞について説明する。
（胚性幹細胞）
本発明で用いる胚性（ＥＳ）細胞は、哺乳動物由来のＥＳ細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来のＥＳ細胞などを使用することができる。例えば、ヒトの胚性（ES） 細胞は、ヒトの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体内に存在する全ての細胞へ分化できる能力（分化多能性）を維持したまま、長期に渡って生体外で増殖できる細胞である。
本発明で用いる胚性（ＥＳ）細胞は、哺乳動物由来のＥＳ細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来のＥＳ細胞などを使用することができる。例えば、ヒトの胚性（ES） 細胞は、ヒトの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体内に存在する全ての細胞へ分化できる能力（分化多能性）を維持したまま、長期に渡って生体外で増殖できる細胞である。
（人工多能性幹細胞）
本発明で用いるiPS細胞とは、体細胞に人為的な操作を加えることにより、胚性幹細胞に類似した分化多能性を獲得させた細胞である。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、生体を構成する全ての細胞を包含する。
本発明で用いるiPS細胞とは、体細胞に人為的な操作を加えることにより、胚性幹細胞に類似した分化多能性を獲得させた細胞である。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、生体を構成する全ての細胞を包含する。
本発明で言うiPS細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明における人工多能性幹細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
体細胞からiPS細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してiPS細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
（ii）Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
（iii）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
（iv）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
（ｉ）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
（ii）Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
（iii）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
（iv）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子及びMyc遺伝子にはそれぞれ、複数のファミリー遺伝子が含まれている。それぞれのファミリー遺伝子の具体例としては、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報の明細書の第１１頁から第１３頁に記載されているものを用いることができる。具体的には、以下の通りである。
Oct遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Oct3/4（NM_002701）、Oct1A(NM_002697)、及びOct6(NM_002699)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはOct3/4である。Oct3/4はPOUファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして知られており、また多能性維持に関与しているとの報告もある。
Klf遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Klf1(NM_006563)、Klf2(NM_016270)、Klf4(NM_004235)、及びKlf5(NM_001730)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはKlf4である。Klf4（Kruppel like factor-4）は腫瘍抑制因子として報告されている。
Sox遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、例えば、Sox1(NM_005986)、Sox2(NM_003106)、Sox3(NM_005634)、Sox7(NM_031439)、Sox15(NM_006942)、Sox17(NM_0022454)、及びSox18(NM_018419)を挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはSox2である。Sox2は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である。
Myc遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、c-Myc(NM_002467)、N-Myc(NM_005378)、及びL-Myc(NM_005376)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくは、c-Myc である。c-Mycは細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり、多能性維持に関与しているとの報告がある。
上記した遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１から３個）の塩基が置換、挿入及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。
本発明では特に好ましくは、初期化遺伝子として、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子の組み合わせを用いることができる。
初期化遺伝子を体細胞に導入する方法は、導入された初期化遺伝子が発現して体細胞の初期化を達成できる限り特に限定されない。例えば、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を含む発現ベクターを用いて該初期化遺伝子を体細胞に導入することができる。ベクターを用いて２種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する場合には、一つの発現ベクターに２種類以上の初期化遺伝子を組み込んで、該発現ベクターを体細胞に導入してもよいし、１種類の初期化遺伝子を組み込んだ発現ベクターを２種類以上用意して、それらを体細胞に導入してもよい。
発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、誘導多能性幹細胞の作製に使用できるウイルスベクターとしては、レトロウィルスベクター（レンチウィルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどを挙げることができる。
組換えウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入することで組換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法などの公知の遺伝子導入法で行うことができる。
ＥＳ細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地は当業界で公知であり、適当な培地を組み合わせて用いることにより、本発明の人工多能性幹細胞を分離及び培養することができる。即ち、本発明の人工多能性幹細胞を培養するための培地としては、ES培地、ES培地に10ng/ml の濃度のFGF-2を添加後にマウス胚性線維芽細胞を24時間培養した上清であるMEF馴化ES培地（以下MEF馴化ES培地）などをあげることができる。本発明の人工多能性幹細胞を培養するための培地には、各種の成長因子、サイトカイン、ホルモンなど（例えば、FGF-2、TGFb-1、アクチビンA、ノギン（Nanoggin）、BDNF、NGF、NT-1、NT-2、NT-3等のヒトES細胞の増殖・維持に関与する成分）を添加してもよい。また、分離された人工多能性幹細胞の分化能及び増殖能は、ES細胞について知られている確認手段を利用することにより確認することができる。
（多能性幹細胞からのミエロイド系血液細胞への分化）
本発明において、「多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞」とは、多能性幹細胞を生体外で培養しつつ分化誘導することにより作製された細胞であり、細胞表面上にミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるＣＤ１１ｂあるいはCD３３分子を発現する細胞を言う。ヒト多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法は、当業界では公知である。例えば、非特許文献６、７、８、９には、ヒトの多能性幹細胞から、ミエロイド系血液細胞である樹状細胞やマクロファージを作製する方法が記載されている。以下、多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法の例について具体的に説明するが、本発明は、以下の方法による分化誘導により製造された多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞に限定されるものではない。
本発明において、「多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞」とは、多能性幹細胞を生体外で培養しつつ分化誘導することにより作製された細胞であり、細胞表面上にミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるＣＤ１１ｂあるいはCD３３分子を発現する細胞を言う。ヒト多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法は、当業界では公知である。例えば、非特許文献６、７、８、９には、ヒトの多能性幹細胞から、ミエロイド系血液細胞である樹状細胞やマクロファージを作製する方法が記載されている。以下、多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法の例について具体的に説明するが、本発明は、以下の方法による分化誘導により製造された多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞に限定されるものではない。
(多能性幹細胞からのミエロイド系血液細胞分化誘導法)
血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞をフィーダー細胞として、多能性幹細胞と、該フィーダー細胞とを共培養することにより、多能性幹細胞を、中胚葉系細胞を含む細胞群に分化させることができる。
血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞をフィーダー細胞として、多能性幹細胞と、該フィーダー細胞とを共培養することにより、多能性幹細胞を、中胚葉系細胞を含む細胞群に分化させることができる。
「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」としては、例えば、ＯＰ９細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：ＲＣＢ１１２４）を用いることができる。
「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」は、適切な培地の入った培養容器において、当該フィーダー細胞に応じた培養条件下に培養し、該培養容器の底面をほぼ覆う程度まで増殖させ、マイトマイシンＣ溶液による処理又は放射線照射により細胞増殖を失わせた後に、再度、別途用意した細胞培養容器に移植してフィーダー細胞層を形成させて用いられ得る。このようにして作製したフィーダー細胞上に、上記多能性幹細胞を播種し、共培養を行うことができる。
前記フィーダー細胞の作製、及び共培養に用いられる培地としては、付着性の哺乳動物細胞の培養に適した培地が用いられ、フィーダー細胞の種類などに応じて適宜選択される。例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＩＭＤＭ（イスコブ改変ダルベッコ培地）等が挙げられる。
前記フィーダー細胞の培養条件としては、フィーダー細胞として用いる細胞の種類などに応じて適宜設定され得る。例えば、ＯＰ９細胞等の場合、０．１重量％ゼラチン溶液等でコーティングされた培養容器上で培養する条件等が挙げられる。
上記共培養の気相条件は、用いられる多能性幹細胞の種類、培養液の組成等に応じて、適宜設定されうるが、例えば、３７℃前後（特に、３７℃）、５体積％ＣＯ2等の条件が挙げられる。
上記共培養により得られる細胞群は、中胚葉系細胞の性質を示すものであり、球状に近い形態を示す細胞の塊を含有する細胞群として得られうる。
多能性幹細胞と、フィーダー細胞との共培養物から、特に、多能性幹細胞に由来し、中胚葉系細胞に分化した細胞を多く含む細胞集団を分離して、後の工程に用いることが好ましい。分化した中胚葉系細胞を分離する方法としては、共培養後に回収した細胞を培養容器中に静置して付着性の強い細胞を除去することにより、付着性の弱い細胞である中胚葉系細胞を回収する方法を挙げることができる。例えば、上記共培養物をトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素で処理し、全細胞を回収し、ＤＭＥＭ等の適切な培地適当量で希釈した後、該細胞溶液を新たに用意した培養容器に播種する。播種から２〜５時間経過した後、培養容器に付着した細胞を廃棄し、培地中の付着しなかった細胞を中胚葉系細胞を多く含む細胞集団として回収することができる。また、回収した細胞浮遊液に含まれる１００μｍ以上の大きさの細胞塊は、ナイロン製のメッシュ(例えば、ＢＤ．Ｆalcon社、セルストレイナー、１００μｍナイロン)等を用いて除去することが好ましい。
続いて、上記の通り得られた中胚葉系細胞を含む細胞群を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び／又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下で培養することにより、該中胚葉系細胞をミエロイド系血液細胞に分化させることができる。中胚葉系細胞を含む細胞群をミエロイド系血液細胞に分化させる際に用いることができる培地、培養条件等は特に限定させるものではないが、上述のフィーダー細胞の培養及び共培養と同様の培地、培養条件等を採用することができる。
培地中の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の含有量は、中胚葉系細胞のミエロイド系血液細胞への分化を促進させる観点から、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７５〜１５０ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。また、培地中のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の含有量は、中胚葉系細胞のミエロイド系血液細胞への分化を促進させる観点から、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２５〜７５ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。
中胚葉系細胞のミエロイド系血液細胞への分化に要する培養期間としては、培養条件等により限定されるものではないが、例えば、１日〜２０日、好ましくは２日〜１５日程度である。
多能性幹細胞からミエロイド系血液細胞への分化を誘導する培養法としては、非特許文献６あるいは７に記載されているように、フィーダー細胞を用いない方法、あるいは、動物由来の血清を含有しない培養液を用いる方法を使用することも可能である。以下、フィーダー細胞を使用せず、かつ、動物由来の血清を含有しない培養液を使用して、多能性幹細胞をミエロイド系血液細胞へ分化させる方法の一例について、具体的に説明する。なお、フィーダー細胞を用いることなく多能性幹細胞からミエロイド系血液細胞への分化を誘導する培養法としては、非特許文献６あるいは７に記載されているように、ここで説明する方法以外にも知られている。本発明で用いるミエロイド系血液細胞は、いずれかの方法による分化誘導により製造された多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞に限定されるものではない。
（フィーダー細胞を用いない多能性幹細胞からのミエロイド系血液細胞分化誘導法の例）
フィーダー細胞と非ヒト動物の血清のいずれをも用いずに分化誘導を行う場合、細胞の培養容器への付着を助けるために、フィブロネクチンなどによるコーティングを施した培養容器を用いることができる。培養容器のコーティングに用いるフィブロネクチンは、ヒト血漿から精製したもの、あるいは、遺伝子組換えタンパク質として作製されたヒトフィブロネクチン断片等を用いることが可能である。
フィーダー細胞と非ヒト動物の血清のいずれをも用いずに分化誘導を行う場合、細胞の培養容器への付着を助けるために、フィブロネクチンなどによるコーティングを施した培養容器を用いることができる。培養容器のコーティングに用いるフィブロネクチンは、ヒト血漿から精製したもの、あるいは、遺伝子組換えタンパク質として作製されたヒトフィブロネクチン断片等を用いることが可能である。
非ヒト動物の血清を含まない培養液を用いる場合は、D-MEM（ダルベッコ改変イーグル培地）あるいはα-MEM (アルファ-ミニマムエッセンシャル培地)等にKSR(ライフテクノロジー社製)あるいはPeprogrow III (ぺプロテック社製)等の血清代替添加物を加えたもの、あるいは、市販の無血清培養液（AIM-V、OpTmizer: ライフテクノロジー社 Stemline: シグマ社）を用いることができる。
ヒトのフィブロネクチンをコートした培養容器中で、ヒトの多能性幹細胞を動物由来の血清を含有しない培養液を用いて、15-20日間培養する。また、非ヒト動物の血清を含まない培養液には、多能性幹細胞の分化を促進する目的で、ヒトBMP-4 (Bone Morphogenic Protein 4)を添加する。
分化誘導培養を行うと様々な細胞系譜の分化細胞が出現するが、この中から中胚葉系細胞に分化した細胞を分離して、分離した細胞を、中胚葉系細胞を含む細胞群として後の工程に用いることが好ましい。分化した中胚葉系細胞を分離する方法としては、フィーダー細胞を用いた分化誘導法の場合と同様に、共培養後に回収した細胞を培養容器中に静置して付着細胞を除去することにより、浮遊細胞である中胚葉系細胞を多く含む細胞集団を回収する方法を挙げることができる。
続いて、上記の通り得られた中胚葉系細胞を多く含む細胞群を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び／又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下で培養することにより、該中胚葉系細胞をミエロイド系血液細胞に分化させることができる。中胚葉系細胞を含む細胞群をミエロイド系血液細胞に分化させる際に用いることができる培地、培養条件等は特に限定されるものではなく、各種の無血清培養液を使用することができる。
本発明においては、生体内（例えば、ヒトの体内）に存在するミエロイド系血液細胞を用いることも可能である。生体内に存在するミエロイド系血液細胞として、例えば、末梢血中の単球（モノサイト）を用いることも可能であり、ヒトの末梢血単球を用いることが好ましい。以下に、生体内に存在するミエロイド系血液細胞を得る方法の一例としてヒトの末梢血中からの単球の分離方法を説明するが、本発明において用いられるミエロイド系血液細胞を得る方法は、この方法に限定されるものではない。
（ヒト末梢血からの単球の分離）
ヒトの末梢血を採血する。抗凝固剤としては、ヘパリンあるいはクエン酸などを用いる。採血した血液を等量の生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、あるいは、ハンクス緩衝溶液などを用いて希釈する。次に、希釈した血液を、あらかじめ遠心チューブ（BD-Falcon 352070等）中に分注しておいたフィコール液（GE ヘルスケア社）の上に重層する。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力５００gで２０分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む）を回収する。
ヒトの末梢血を採血する。抗凝固剤としては、ヘパリンあるいはクエン酸などを用いる。採血した血液を等量の生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、あるいは、ハンクス緩衝溶液などを用いて希釈する。次に、希釈した血液を、あらかじめ遠心チューブ（BD-Falcon 352070等）中に分注しておいたフィコール液（GE ヘルスケア社）の上に重層する。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力５００gで２０分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む）を回収する。
単球は、単核細胞中からCD14分子の発現を指標として、磁気ビーズ法などにより分離することができる。例えば、CD１４マイクロビーズ（ミルテ二−社 130-050-201）等を用いることにより分離することが可能である。あるいは、単核細胞分画を、細胞培養用の表面処理がなされた細胞培養容器を用いて6-16時間ほど培養し、容器に付着した細胞を回収することにより、単球あるいはそれに由来するマクロファージを得ることも可能である。通常、健康な成人の末梢血１０mlから、２００,０００-５００,０００個の単球を回収することができる。
（ミエロイド系血液細胞への長期増殖能力の付与）
本発明は、多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞、あるいは、生体から採取したミエロイド系血液細胞において、ｃＭＹＣ遺伝子、並びにBMI1、EZH2、MDM2、MDM4、及びHIF1A遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を強制的に発現させることにより、これらの細胞に長期増殖能を付与する。前記遺伝子を強制的に発現させるための方法として、ミエロイド系血液細胞のゲノム上に存在する内在性の遺伝子を強制的に発現させても良いし、あるいは外来の遺伝子を該ミエロイド系血液細胞に導入することにより、これら遺伝子の強制的な発現を行っても良い。遺伝子の効率的かつ高レベルの発現を達成し、ミエロイド系血液細胞に長期増殖能を確実に付与する観点から、遺伝子工学技術を用いて外来遺伝子を該ミエロイド系血液細胞に導入する方法が好ましい。
本発明において、「増殖能力を有するミエロイド系血液細胞」とは、上記の通り、ミエロイド系血液細胞において上記遺伝子を強制的に発現させることにより長期増殖能が付与されたミエロイド系血液細胞を意味する。本発明の「増殖能力を有するミエロイド系血液細胞」は、上記遺伝子が導入されていない、対照となるミエロイド系血液細胞（つまり、出発材料として用いたミエロイド系血液細胞）と比較して、より長期に渡り増殖することが可能となり、例えば、上記遺伝子を強制的に発現させた時点（上記遺伝子を細胞に導入した時点）から２週間以上増殖することが可能である。
本発明は、多能性幹細胞由来のミエロイド系血液細胞、あるいは、生体から採取したミエロイド系血液細胞において、ｃＭＹＣ遺伝子、並びにBMI1、EZH2、MDM2、MDM4、及びHIF1A遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を強制的に発現させることにより、これらの細胞に長期増殖能を付与する。前記遺伝子を強制的に発現させるための方法として、ミエロイド系血液細胞のゲノム上に存在する内在性の遺伝子を強制的に発現させても良いし、あるいは外来の遺伝子を該ミエロイド系血液細胞に導入することにより、これら遺伝子の強制的な発現を行っても良い。遺伝子の効率的かつ高レベルの発現を達成し、ミエロイド系血液細胞に長期増殖能を確実に付与する観点から、遺伝子工学技術を用いて外来遺伝子を該ミエロイド系血液細胞に導入する方法が好ましい。
本発明において、「増殖能力を有するミエロイド系血液細胞」とは、上記の通り、ミエロイド系血液細胞において上記遺伝子を強制的に発現させることにより長期増殖能が付与されたミエロイド系血液細胞を意味する。本発明の「増殖能力を有するミエロイド系血液細胞」は、上記遺伝子が導入されていない、対照となるミエロイド系血液細胞（つまり、出発材料として用いたミエロイド系血液細胞）と比較して、より長期に渡り増殖することが可能となり、例えば、上記遺伝子を強制的に発現させた時点（上記遺伝子を細胞に導入した時点）から２週間以上増殖することが可能である。
ｃＭＹＣ遺伝子の具体例としては、上記人工多能性幹細胞の調製に用いられる、ヒトのｃＭＹＣ遺伝子（ＮＭ＿００２４６７）を挙げることができる（括弧内は、NCBI accession番号を示す。）。ＢＭＩ１遺伝子、EZH2遺伝子、MDM２遺伝子、MDM4遺伝子、 HIF1A遺伝子の具体例としては、それぞれ、ヒトのＢＭＩ１遺伝子（ＮＭ＿００５１８０）、ヒトのEZH2遺伝子（ＮＭ＿００４４５６）、ヒトのMDM２遺伝子（ＮＭ＿００２３９２）、ヒトのMDM４遺伝子（ＮＭ＿００２３９３）、ヒトのHIF1A遺伝子（ＮＭ＿００１５３０）を挙げることができる（括弧内は、NCBI accession番号を示す。）。
ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、EZH2遺伝子、MDM２遺伝子、MDM４遺伝子、及びHIF1A遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１から３個）の塩基が置換、挿入及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。また、野生型の遺伝子と同等あるいはそれ以上の機能を有する限りにおいて、該遺伝子の産物が他のタンパク質あるいはペプチドとの融合タンパク質として発現されるように人為的に修飾を加えた遺伝子でも良い。
cMYC、BMI1、EZH2、MDM2、MDM4、あるいはHIF1A遺伝子を上記ミエロイド系血液細胞に導入する方法は、導入されたこれら遺伝子が発現してミエロイド系血液細胞に長期増殖能を付与できる限り、特に限定されるものではない。例えば、導入遺伝子を含む発現ベクターを用いて該遺伝子をミエロイド系血液細胞に導入することができる。また、一つの発現ベクターに複数の遺伝子を組み込んで、該発現ベクターをミエロイド系血液細胞に導入してもよいし、各遺伝子を別々に組み込んだ発現ベクターを用意して、それらをミエロイド系血液細胞に導入してもよい。
発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターであり、特に好ましくは導入した遺伝子がミエロイド系血液細胞の染色体に組み込まれるようなウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを挙げることができる。
組み換えウイルスベクターを作製するために用いるパッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクタープラスミドの該欠損するタンパク質を補給できる細胞であれば任意の細胞を用いることができる。例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス線維芽細胞NIH3T3に基づくパッケージング細胞を用いることができる。
組換えウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入することで組換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法などの公知の遺伝子導入法で行うことができる。さらに、プラスミドを導入したパッケージング細胞の培養上清から、遠心分離法、あるいはウイルス精製用として市販されているカラムを用いる濃縮する方法などにより遺伝子組換えウイルスを濃縮した溶液を回収することができる。
多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞、あるいは、人体から直接採取したミエロイド系血液細胞に対して、培養容器の中で、前記の様に調整した遺伝子組換えウイルスを含む溶液を添加することにより、ウイルスを感染させ、目的とする遺伝子を導入する。
(増殖能力を有するミエロイド系血液細胞の増殖方法)
上記の通り製造した生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞は、Ｍ−ＣＳＦを含む細胞培養液を用いて培養することができる。培養液中のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の含有量は、２５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。あるいは、レンチウイルスベクター等を用いてＭ−ＣＳＦ遺伝子をミエロイド系血液細胞自身に導入することによりミエロイド系血液細胞自身にＭ−ＣＳＦを産生させることも可能である。この場合は、M-CSFを添加していない細胞培養液を用いて培養し、増殖させることが可能である。
上記の通り製造した生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞は、Ｍ−ＣＳＦを含む細胞培養液を用いて培養することができる。培養液中のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の含有量は、２５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。あるいは、レンチウイルスベクター等を用いてＭ−ＣＳＦ遺伝子をミエロイド系血液細胞自身に導入することによりミエロイド系血液細胞自身にＭ−ＣＳＦを産生させることも可能である。この場合は、M-CSFを添加していない細胞培養液を用いて培養し、増殖させることが可能である。
（ミエロイド系血液細胞からの樹状細胞様細胞への分化）
本発明の生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞から、樹状細胞様細胞を製造することが可能である。例えば、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターロイキン４（ＩＬ−４）の存在下で培養することにより、樹状細胞様細胞を製造することができる。培養液中のＧＭ−ＣＳＦの含有量は、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲、IL-4の含有量は、5〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。本発明において、「樹状細胞様細胞」とは、形態、細胞表面分子、Ｔ細胞刺激能力という点で単球由来樹状細胞等と類似した性質を有する細胞である。
本発明の生体外で増殖する能力を有するミエロイド系血液細胞から、樹状細胞様細胞を製造することが可能である。例えば、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターロイキン４（ＩＬ−４）の存在下で培養することにより、樹状細胞様細胞を製造することができる。培養液中のＧＭ−ＣＳＦの含有量は、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲、IL-4の含有量は、5〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。本発明において、「樹状細胞様細胞」とは、形態、細胞表面分子、Ｔ細胞刺激能力という点で単球由来樹状細胞等と類似した性質を有する細胞である。
（細胞医薬）
本発明のミエロイド系血液細胞は、生体内に存在するマクロファージ等と同様に微生物などを貪食する活性を有しており、感染症や悪性腫瘍に対する免疫細胞療法を行うための細胞医薬を提供することができる。また、本発明のミエロイド系血液細胞は、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、がん、白血病、或いはある種の代謝性疾患など、体内に特定の物質が大量に蓄積することに起因する疾患等の治療に用いるための細胞医薬を提供することもできる。また、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞に由来する樹状細胞様細胞は、悪性腫瘍や感染症の治療に用いるための細胞ワクチンとして使用することができる。さらに、本発明のミエロイド系血液細胞に由来する樹状細胞様細胞は、自己免疫疾患や臓器移植に伴う拒絶反応等を治療する目的で、免疫応答の制御に用いるための細胞医薬を提供することができる。
本発明のミエロイド系血液細胞は、生体内に存在するマクロファージ等と同様に微生物などを貪食する活性を有しており、感染症や悪性腫瘍に対する免疫細胞療法を行うための細胞医薬を提供することができる。また、本発明のミエロイド系血液細胞は、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、がん、白血病、或いはある種の代謝性疾患など、体内に特定の物質が大量に蓄積することに起因する疾患等の治療に用いるための細胞医薬を提供することもできる。また、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞に由来する樹状細胞様細胞は、悪性腫瘍や感染症の治療に用いるための細胞ワクチンとして使用することができる。さらに、本発明のミエロイド系血液細胞に由来する樹状細胞様細胞は、自己免疫疾患や臓器移植に伴う拒絶反応等を治療する目的で、免疫応答の制御に用いるための細胞医薬を提供することができる。
本発明の細胞医薬の製造の際には、本発明の長期増殖能を有するミエロイド系血液細胞、及びそれに由来するミエロイド系血液細胞を安定に保持しうることを目的として、前記したもの以外の助剤、例えば、培地等を適宜用いてもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
実施例1：レンチウイルスベクターの作製
PCR法により初期化因子であるヒトのOCT3/4, SOX2, KLF4,および c-MYCのcDNAを合成し、プラスミドベクター（pENTR-D-TOPO, Gibco-Invitrogen社）へ挿入しクローニングを行った。その後、クローニングを行ったプラスミドDNAの塩基配列をシークエンス解析により確認した。ヒトＢＭＩ１、EZH2、MDM２、MDM４、及びHIF1AのcDNAクローンは、理化学研究所BRC遺伝子材料開発室あるいは製品評価技術基盤機構より入手した。
PCR法により初期化因子であるヒトのOCT3/4, SOX2, KLF4,および c-MYCのcDNAを合成し、プラスミドベクター（pENTR-D-TOPO, Gibco-Invitrogen社）へ挿入しクローニングを行った。その後、クローニングを行ったプラスミドDNAの塩基配列をシークエンス解析により確認した。ヒトＢＭＩ１、EZH2、MDM２、MDM４、及びHIF1AのcDNAクローンは、理化学研究所BRC遺伝子材料開発室あるいは製品評価技術基盤機構より入手した。
LR clonase (Gibco-Invitrogen社)を用いて、前記したcDNA断片をレンチウイルスベクター（CSII-EF-RfAl, 理化学研究所 三好浩之博士より分与）へ挿入した。
リポフェクション法（Lipofectamine 2000, Invitrogen社）を用いて、上記で作製したCSII-EFに導入した遺伝子の各々とパッケージングコンストラクト（pCAG-HIVgp, 三好博士より分与）、およびエンベロープおよびRevのコンストラクト（pCMV-VSV-G-RSV-Rev, 三好博士より分与）をパッケージング細胞（ウイルス産生細胞）である293T細胞へ導入した。
293T細胞への遺伝子導入の３日後に、細胞培養液を回収し、0.45μmのフィルターを通した後、遠心分離法（50,000G、２時間）によりウイルス粒子を沈澱させ回収した。回収した組換えウイルス粒子は、DMEM溶液に懸濁した後、凍結チューブに分注し、使用時まで冷凍庫（-８０℃）にて保存した。
実施例２：ヒト人工多能性幹（iPS）細胞の作製
ヒト腹部の皮膚片を採取し、細胞培養用プレート中で培養液（DMEM / 10 % 牛血清）を用いて培養した。培養開始１週間目以降より、皮膚片からの線維芽細胞の遊走と増殖が認められたので、トリプシン/EDTA含有リン酸干渉生理食塩水（トリプシン-EDTA）を用いて、適宜、線維芽細胞を回収し凍結保存した。
ヒト腹部の皮膚片を採取し、細胞培養用プレート中で培養液（DMEM / 10 % 牛血清）を用いて培養した。培養開始１週間目以降より、皮膚片からの線維芽細胞の遊走と増殖が認められたので、トリプシン/EDTA含有リン酸干渉生理食塩水（トリプシン-EDTA）を用いて、適宜、線維芽細胞を回収し凍結保存した。
凍結保存しておいたヒト線維芽細胞を解凍し、数日間、再度培養した後、培養プレート中において前述のとおり作製し凍結保存しておいたOCT3/4, SOX2, KLF4, およびc-MYCを発現するレンチウイルスベクターを同時に加え、遺伝子導入を行った。
遺伝子導入の4-6日後、トリプシン-EDTAを用いて感染細胞を回収し、事前に準備しておいたマイトマイシンC処理により増殖を停止させたマウス胎児由来線維芽細胞（フィーダー細胞）との共培養を開始した。その翌日より、培養液をヒトES細胞用の培養液に置換し、培養を継続した。
レンチウイルスベクターによる初期化因子の遺伝子の導入から２０-３０日の後、顕微鏡観察の下で、マイクロチップを用いてES細胞様の形態を示すコロニーを人工多能性幹（iPS）細胞クローンとして単離し、別に準備しておいたマウス胎児由来フィーダー細胞との共培養を行った。その後、細胞の増殖に応じて、培養容器を拡大しつつ培養を継続した。
ヒトiPS細胞の維持培養は、ヒト胚性幹細胞用培養液（DMEM-F12(Wako Chemicals)/20% KSR(Gibco-Invitrogen)/bFGF (basic fibroblast growth factor: 10 ng/ml)/2-ME （2-メルカプトエタノール, 50μM））を用いて、マイトマイシンC処理マウス胎児線維芽細胞をフィーダー細胞としてポリスチレン製培養皿にて行った。細胞の増殖に応じて、4-5日に一度、細胞をCTK液（コラゲナーゼ-トリプシン-KSR液、Biochemical and Biophysical Research Communications 345: 926-932, 2006年）を用いて5-10分間処理して回収し、適当な大きさの培養容器へ播種し培養を継続した。
実施例３：ヒト人工多能性幹細胞のミエロイド系血液細胞(iPS-MC)への分化誘導
（１）OP9フィーダー細胞の調整
マウス由来の培養細胞株OP9をマイトマイシンCにて処理（0.01 mg/ml、60分）したものを、ゼラチンをコートしたディッシュに播種し、翌日以降に使用した。
（１）OP9フィーダー細胞の調整
マウス由来の培養細胞株OP9をマイトマイシンCにて処理（0.01 mg/ml、60分）したものを、ゼラチンをコートしたディッシュに播種し、翌日以降に使用した。
（２）分化誘導培養
未分化なiPS細胞を、CTK液を用いて5-10分間処理し、牛胎児(FCS)血清入りのDMEM培養液で回収した。細胞をα-MEM／20%FCSに懸濁し、OP9フィーダー細胞上へ播種し、分化誘導培養を開始した。以降、3日に1度、培養液（α-MEM／20%FCS）を交換しつつ培養を継続した。
未分化なiPS細胞を、CTK液を用いて5-10分間処理し、牛胎児(FCS)血清入りのDMEM培養液で回収した。細胞をα-MEM／20%FCSに懸濁し、OP9フィーダー細胞上へ播種し、分化誘導培養を開始した。以降、3日に1度、培養液（α-MEM／20%FCS）を交換しつつ培養を継続した。
分化誘導開始から18日後、トリプシン-EDTA（エチレンジアミン四酢酸）-コラゲナーゼ液を用いて細胞を処理（37℃ 60分）して解離させて回収し、ピペッティング操作により細胞浮遊液を作製した。そして、直径１０cmのディッシュ1枚に由来する細胞を10 ml のDMEM/10% FCSに懸濁し、フィーダー細胞なし、ゼラチンコートなしの直径１０cmのディッシュ2枚に播種した。2-5時間後、ディッシュに付着しなかった細胞を回収し、100ミクロンのメッシュ（BD Falcon社製 セルストレイナー）を通過させることにより、凝集細胞塊を除いた細胞浮遊液を得た。
メッシュを通過した細胞を、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml、ぺプロテック社製) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、ぺプロテック社製)に浮遊させ、OP9フィーダー細胞を用いずに、培養を行った。その後、3〜9日程度経過すると、浮遊性あるいは弱付着性の細胞が出現し、日を追って細胞数が増加するのが観察された。図２に、このiPS細胞に由来する分化細胞の顕微鏡写真を示す。
前記の浮遊細胞を回収し、白血球マーカー分子であるCD４５、および、ミエロイド系細胞マーカーであるCD１１bとCD33の発現を検討した。まず、抗体の非特異的な結合を阻害する目的で、Fcレセプターブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて10分間処理した。その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識-抗ヒトCD45モノクローナル抗体、フィコエリスロシン（PE）標識-抗ヒト/マウスＣＤ１１b抗体、あるいは、PE標識-抗ヒトCD３３抗体を用いて室温中で40分間染色した。また、陰性対照として、同一の蛍光色素で標識したアイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。
その後、細胞を、ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで2回洗浄し、洗浄後の細胞について、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ソフトウェアを備えたフローサイトメーター解析装置（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。
図３に、フローサイトメーター解析により、この細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。特異的染色のパターンとアイソタイプ適合対照抗体を用いた染色パターンを重ねあわせたヒストグラムを示している。この図に示す結果から、このヒトiPS細胞を分化誘導することによって得られた浮遊細胞が、汎白血球マーカー分子であるCD45を発現していることが分かる。さらに、その多くがミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるCD11bあるいはCD33を発現していることが分かる。この、iPS細胞に由来し、ミエロイド系血液細胞のマーカー分子を発現する細胞をiPS-MC（iPS cell-derived myeloid cells： iPS細胞に由来するエロイド系血液細胞）と命名した。
実施例４：iPS-MCへのcMYCおよびBMI1の導入による長期増殖能力の付与（iPS-MLの作製）
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCあるいはBMI1を発現するレンチウイルス懸濁液を単独で、あるいは同時に加えることにより、感染させた。遺伝子導入の翌日より、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。培養液としては、継続的に、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCあるいはBMI1を発現するレンチウイルス懸濁液を単独で、あるいは同時に加えることにより、感染させた。遺伝子導入の翌日より、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。培養液としては、継続的に、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。
cMYCを発現するレンチウイルスのみを感染させた場合には、iPS-MCは倍加時間約２日の速度で増殖した。しかしながら、レンチウイルスを感染させてから約2週間後、増殖を停止した。結果的に、レンチウイルスによるcMYCの強制的発現により、iPS-MCは30倍から100倍程度に増殖した後に増殖を停止した。
cMYCレンチウイルスのみを感染させた後、2週間以上が経過し増殖を停止しているiPS-MCに、さらにcMYCレンチウイルスを感染させてもその後の細胞増殖は観察されなかった。
BMI1のレンチウイルスのみを感染させた場合には、iPS-MCは、ゆっくりと増殖し、２-3倍程度の細胞数となった後、増殖を停止した。
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた場合には、iPS-MCはcMYCレンチウイルスのみを感染させた場合よりも速い速度で増殖した。また、cMYCレンチウイルスのみを感染させた場合とは異なり、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。このように長期間にわたり増殖する能力を獲得したiPS-MCをiPS-ML(iPS-MC line、iPS cell-derived myeloid cell line、長期増殖能を有するiPS細胞に由来するミエロイド系血液細胞ライン）と名付けた。
増殖するiPS-MLを一定の細胞密度（1 x 105 - 1 x 106 個／ml）を維持しつつ培養を継続した。iPS-MLは、レンチウイルスを感染させた後、４か月間以上にわたって一定の速度(倍加時間2-３日)で増殖を続けた。図４に、iPS-MLの顕微鏡写真を示す。
図５に、iPS-MLにおける、CD４５、CD１１b、およびCD３３の発現を検討したフローサイトメーター解析の結果を示す。この結果から、iPS-MLは、細胞表面上に白血球マーカー分子であるCD45、さらにミエロイド細胞のマーカー分子であるCD11bおよびCD33を発現していることが確認された。
実施例５：iPS-MLの増殖におけるM-CSFおよびGM-CSFの必要性の検討
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを感染させた後、２か月間培養を継続した後のiPS-MLを回収し96穴培養プレート（FALSCON 353072）に播種し（5 x 103細胞 / well）培養を行った。そして、培養液中にGM-CSFとM-CSFが含まれている（５０ng/mlあるいは１００ng/ml）場合と含まれていない場合とで増殖の速度を比較した。
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを感染させた後、２か月間培養を継続した後のiPS-MLを回収し96穴培養プレート（FALSCON 353072）に播種し（5 x 103細胞 / well）培養を行った。そして、培養液中にGM-CSFとM-CSFが含まれている（５０ng/mlあるいは１００ng/ml）場合と含まれていない場合とで増殖の速度を比較した。
96穴培養プレートでの培養開始から48時間後に、3H-メチルチミジンを添加（37 Kbq/well）し、その18時間後にセルハーベスタ（Wallac社）を用いて細胞中の高分子量DNAをガラスフィルターに捕捉した。そして、高分子量DNAへの3H-チミジンの取込みを、シンチレーション計測（Wallac社のマイクロベータシステムを使用）により測定した。高分子量DNAへの3H-チミジンの取込みは、DNA合成の速度すなわち細胞増殖の速度に比例する。
図６にシンチレーション計測の結果を示す。この結果から、iPS-MLの増殖には、培養液中に50 ng/ml程度のM-CSFが含まれていることが必要であることがわかる。一方、GM-CSFは必ずしも必要ではないが、増殖を促進する効果があることがわかる。
実施例６： iPS-MLによる真菌の菌体粒子（ザイモサン）貪食能の解析
一般に、ミエロイド系血液細胞は、細菌や真菌などの微生物を貪食する強い活性を有している。そこで、iPS-MLによる真菌の菌体粒子（ザイモサン）の貪色活性を検討した。維持培養中のiPS-MLをピペッティング操作により培養フラスコから回収し、細胞培養用のコーティングがなされている24穴培養プレート（FALCON 353047）へ播種した（2 x 105/well）。３時間静置しiPS-MLの多くが培養プレートの底面に付着したのを確認した後、FITC標識ザイモサン(Molecular Probe社 Z２８４１)を加えた。さらに３時間が経過した後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
一般に、ミエロイド系血液細胞は、細菌や真菌などの微生物を貪食する強い活性を有している。そこで、iPS-MLによる真菌の菌体粒子（ザイモサン）の貪色活性を検討した。維持培養中のiPS-MLをピペッティング操作により培養フラスコから回収し、細胞培養用のコーティングがなされている24穴培養プレート（FALCON 353047）へ播種した（2 x 105/well）。３時間静置しiPS-MLの多くが培養プレートの底面に付着したのを確認した後、FITC標識ザイモサン(Molecular Probe社 Z２８４１)を加えた。さらに３時間が経過した後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
図７に顕微鏡写真を示す。左側の明視野画像（位相差レンズにより撮影）に、培養プレートに付着しているiPS-MLが認められる。右側の画像は、左側の画像と同じ視野をFITCが発する蛍光を検出する条件で撮影したものである。この蛍光観察画像では、FITC標識ザイモサン粒子の局在を示すシグナルが、iPS-MLに一致して集積しているのが認められる。この結果から、iPS-MLが、FITC標識ザイモサン粒子を貪食していることが示された。
次に、iPS-MLによるザイモサン粒子貪食の時間経過を観察した。24穴培養プレートに付着しているiPS-MLにFITC標識ザイモサンを加え、一定時間（5, 10, 20, 40,あるいは 80分）が経過した後、トリプシン／EDTAを用いてiPS-MLを回収した。フローサイトメーター解析装置を用いて特異的な蛍光を有する細胞、すなわち、FITC標識ザイモサンを貪食した細胞の割合を解析した。
図８に、フローサイトメーターによる解析の結果を示す。この結果から、時間の経過に従って、ザイモサン粒子を貪食したiPS-MLの頻度が増加することが示された。今回の実験では、ザイモサン粒子を添加してから30分の間に約半数のiPS-MLがザイモサン粒子を貪食していた。
実施例７： iPS-MLの樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導
cMYCを発現するレンチウイルスとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた後、40日経過した後のiPS-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養し、樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導を行った。さらにTNF(腫瘍壊死因子)-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した時の細胞の形態（位相差顕微鏡写真）を、図９に示す。突起を有する不規則な形態の細胞がクラスターを形成しているのがわかる。
cMYCを発現するレンチウイルスとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた後、40日経過した後のiPS-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養し、樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導を行った。さらにTNF(腫瘍壊死因子)-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した時の細胞の形態（位相差顕微鏡写真）を、図９に示す。突起を有する不規則な形態の細胞がクラスターを形成しているのがわかる。
上記のように作製したML-DCをピペッティング操作により回収し、抗HLAクラスII抗体、抗ヒト80抗体、あるいは抗ヒト86抗体を用いて染色した。あるいは、アイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。その後、細胞を、ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで2回洗浄した。洗浄後の細胞について、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ソフトウェアを備えたフローサイトメーター解析装置（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。
図１０に抗体染色後のフローサイトメーター解析の結果を示す。この図では、特異的染色のパターン（実線）とアイソタイプ適合対照抗体を用いた染色パターン（破線）を重ねあわせて示している。この解析の結果からML-DCは、生理的に存在する樹状細胞と同様に、Tリンパ球の活性化に関連するCD80、CD86、およびHLAクラスIIを細胞表面上に発現していることが判明した。
実施例８：ML-DCのT細胞刺激能力の検討
iPS-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養してML-DCを作製し、さらにTNF(腫瘍壊死因子)-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した後、細胞を回収した。この細胞に45 GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、96穴丸底培養プレート（FALCON 353077）に播種し（1 x 102細胞-1 x 104細胞/well）、刺激細胞とした。TNF-αの添加を行っていないML-DC、あるいは、GM-CSFとIL-4を加えていないiPS-MLも、同様に45GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、培養プレートに播種し、刺激細胞とした。そして、反応細胞として、アロのドナー由来の末梢血T細胞を加え（5 x 104細胞/well）、培養を行った。末梢血T細胞は、ヒトT細胞分離キット（ミルテ二−バイオテク社 １３０-０９１-１５６）を用いて分離したものを用いた。
iPS-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養してML-DCを作製し、さらにTNF(腫瘍壊死因子)-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した後、細胞を回収した。この細胞に45 GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、96穴丸底培養プレート（FALCON 353077）に播種し（1 x 102細胞-1 x 104細胞/well）、刺激細胞とした。TNF-αの添加を行っていないML-DC、あるいは、GM-CSFとIL-4を加えていないiPS-MLも、同様に45GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、培養プレートに播種し、刺激細胞とした。そして、反応細胞として、アロのドナー由来の末梢血T細胞を加え（5 x 104細胞/well）、培養を行った。末梢血T細胞は、ヒトT細胞分離キット（ミルテ二−バイオテク社 １３０-０９１-１５６）を用いて分離したものを用いた。
培養開始から４日後に3H-メチルチミジンを添加（37 Kbq/well）した。その18時間後にセルハーベスタ（Wallac社）を用いて細胞中の高分子量DNAをガラスフィルターに捕捉した。ガラスフィルターに捕捉された3H-チミジンの放射活性をシンチレーション計測（Wallac社のマイクロベータシステムを使用）により測定することにより、高分子DNA合成の速度、すなわちT細胞の増殖速度を定量化した。
図１１にT細胞増殖応答解析の結果を示す。３種類の刺激細胞（iPS-MLあるいはTNF-α処理を行った、あるいは、行っていないML-DC）のいずれも、アロT細胞を刺激し増殖応答を誘導する活性を有していることが判明した。そして、３種類の刺激細胞のなかでは、TNF-α処理を行ったML-DCが最も強力なT細胞刺激能力を有していることが分かる。以上の結果から、iPS-MLに由来するML-DCが、強力なT細胞刺激能力を有していることが示された。
実施例９：iPS-MCへのcMYCとEZH2の導入によるiPS-MLの作製
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとEZH2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１２に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１３に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとEZH2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１２に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１３に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１０：iPS-MCへのcMYCとMDM2の導入によるiPS-MLの作製
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１４に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１５に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１４に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１５に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１１：iPS-MCへのcMYCとMDM４の導入によるiPS-MLの作製
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとMDM４を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１６に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１７に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとMDM４を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１６に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１７に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１２：iPS-MCへのcMYCとHIF1aの導入によるiPS-MLの作製
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとHIF1aを発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１８に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１９に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
前項で作製したiPS-MCを２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCとHIF1aを発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図１８に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図１９に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１３：フィーダー細胞を用いないヒト人工多能性幹細胞のミエロイド系血液細胞(iPS-MC)への分化誘導およびiPS-MLの作製
未分化なヒトiPS細胞を、CTK液を用いて回収し、ヒトフィブロネクチンをコートした培養容器中で培養した。培養液は、OpTmizerTM T-Cell Expansion SFM (Life Technoilogies社)とStemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium(SIGMA社)を１：１で混合したもの、および、Peprogrow III(Peprotech社)を順次用いた。さらに、培養液には、中胚葉系細胞への分化を促進することを意図して、ヒトBMP-4 (Bone Morphogenic Protein 4)を５ng/mlの濃度で添加した。
未分化なヒトiPS細胞を、CTK液を用いて回収し、ヒトフィブロネクチンをコートした培養容器中で培養した。培養液は、OpTmizerTM T-Cell Expansion SFM (Life Technoilogies社)とStemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium(SIGMA社)を１：１で混合したもの、および、Peprogrow III(Peprotech社)を順次用いた。さらに、培養液には、中胚葉系細胞への分化を促進することを意図して、ヒトBMP-4 (Bone Morphogenic Protein 4)を５ng/mlの濃度で添加した。
培養開始から２５日後、トリプシン-EDTA-コラゲナーゼ液を用いて細胞を処理（37℃ 60分）して解離させて回収し、ピペッティング操作により細胞浮遊液を作製した。そして、直径１０cmのディッシュ1枚に由来する細胞を10 ml のDMEM/10% FCSに懸濁し、フィーダー細胞なし、ゼラチンコートなしの直径１０cmのディッシュ2枚に播種した。2-5時間後、ディッシュに付着しなかった細胞を回収し、100ミクロンのメッシュ（BD Falcon社製 セルストレイナー）を通過させることにより、凝集細胞塊を除いた細胞浮遊液を得た。その後、細胞保存液（セルバンカー 十慈フィールド）を用いて細胞を凍結保存した。
上記で凍結保存しておいた細胞を解凍し、GM-CSF(50ng/ml)およびM-CSF(50ng/ml)を含むα-MEM/20%FCSを用いて培養し１０日間培養した。その結果、浮遊性あるいは付着性の細胞が出現し増殖するのが観察された。図２０に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図２１に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。この結果から、細胞表面上に白血球マーカー分子であるCD45、さらにミエロイド系血液細胞のマーカー分子であるCD11bおよびCD33を発現していることが確認された。そこで、このiPS細胞由来の分化細胞もiPS-MCであると判断された。
次に、このiPS-MCを回収し、２４穴培養プレート中で培養した。そこへcMYCとBMI1を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより感染させ、iPS-MLを作製した。図２２に、この細胞の顕微鏡写真を示す。図２３に、フローサイトメーターによりCD45、CD11b、およびCD33の発現を検討した結果を示す。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
本実施例により得られたiPS-MLは、cMYCのみを導入した細胞よりも速い速度で増殖した。さらに、得られたiPS-ML は、cMYC のみ導入した細胞よりも長期に渡り増殖し、レンチウイルスを感染させてから2週間目以降も増殖を続けた。
実施例１4：ヒト末梢血単球へのcMYCおよびBMI1の導入による長期増殖能力の付与（Mo-MLの作製）
少量（0.5ml程度）のヘパリンを吸引した５０mlの注射シリンジを用いて、健常人ドナーより末梢血を５０ml採血した。血液は、５０mlの遠心チューブ２本に２５mlずつ分注し、等量のリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）で希釈した。次に、この希釈した血液２５mlを、あらかじめ遠心チューブ（BD-Falcon 352070等）中に分注しておいたフィコール液（GE ヘルスケア社 １７-１４４０-０３）15 mlの上にゆっくりと重層した。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力５００gで２０分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む細胞集団）を回収した。
少量（0.5ml程度）のヘパリンを吸引した５０mlの注射シリンジを用いて、健常人ドナーより末梢血を５０ml採血した。血液は、５０mlの遠心チューブ２本に２５mlずつ分注し、等量のリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）で希釈した。次に、この希釈した血液２５mlを、あらかじめ遠心チューブ（BD-Falcon 352070等）中に分注しておいたフィコール液（GE ヘルスケア社 １７-１４４０-０３）15 mlの上にゆっくりと重層した。そして、遠心分離装置を用いて、遠心力５００gで２０分間遠心した後、界面付近に存在する単核細胞分画（リンパ球と単球を含む細胞集団）を回収した。
回収した単核細胞分画をRPMI-1640培養液により洗浄した後、磁気ビーズ分離用緩衝液（2mMのEDTAおよび２％のFCSを含有するPBS）に浮遊させた。そして、抗ヒトCD１４抗体を結合した磁気マイクロビーズ（ミルテ二−バイオテク社製 130-050-201）を加え、６℃で１５分間静置した。その後、磁気ビーズ分離用緩衝液で洗浄した後、細胞分離用カラム（ミルテ二−バイオテク社製 MSカラム 130-042-201）を用いて、細胞表面にCD１４を発現する細胞、すなわち、単球を分離した。また、同様の方法により分離され研究用として市販されていたヒト末梢血単球（Lonza社 2W-400C）も使用した。
前項で分離したヒト末梢血単球（CD14陽性細胞）を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCを発現するレンチウイルス懸濁液およびBMI1を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。培養液としては、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。
レンチウイルスを感染させた後、2週間目までは、明らかな細胞増殖は認めなかった。3週間目以降、増殖が観察されたので、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。レンチウイルスを感染させた後、約４０日後の細胞の顕微鏡写真を図２４に示す。また、同時期の細胞を回収し、フローサイトメーターにより、CD45、CD１１b、CD33、およびCD14の発現を調べた結果を図２５に示す。この結果から、cMYCおよびBMI1の導入により長期増殖能力を獲得した単球由来の細胞が、ミエロイド系血液細胞のマーカーを発現していることが確認された。そこで、この細胞をMo-ML(Monocyte-derived myeloid cell line、単球に由来するミエロイド系血液細胞ライン）と名付けた。
実施例１５： Mo-MLの樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた後、40日経過した後のMo-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養し、樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導を行った。さらにTNF-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した。
cMYCとBMI1を発現するレンチウイルスを同時に感染させた後、40日経過した後のMo-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養し、樹状細胞様細胞(ML-DC)への分化誘導を行った。さらにTNF-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した。
フローサイトメトリーによるML-DCの細胞表面上のマーカー分子の発現の検討を行った。
まず、Fcレセプターブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて10分間処理した。次に、ＦＩＴＣ-抗ヒト80抗体、抗ヒト86抗体、あるいは抗HLAクラスII抗体を用いて室温中で40分間染色した。また、ＦＩＴＣあるいはPEで標識されたアイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ(BD社)を用いて解析した。
まず、Fcレセプターブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて10分間処理した。次に、ＦＩＴＣ-抗ヒト80抗体、抗ヒト86抗体、あるいは抗HLAクラスII抗体を用いて室温中で40分間染色した。また、ＦＩＴＣあるいはPEで標識されたアイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ(BD社)を用いて解析した。
図２６に抗体染色後のフローサイトメーター解析の結果を示す。この図では、特異的染色のパターン（実線）とアイソタイプ適合対照抗体を用いた染色パターン（破線）を重ねあわせて示している。この解析の結果からML-DCは、生理的に存在する樹状細胞と同様に、Tリンパ球の活性化に関連するCD80、CD86、およびHLAクラスIIを細胞表面上に発現していることが判明した。
実施例１６：Mo-ML由来のML-DCのT細胞刺激能力の検討
Mo-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養してML-DCを作製し、さらにTNF-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した後、細胞を回収した。この細胞に45 GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、96穴丸底培養プレート（FALCON 353077）に播種し（1 x 102細胞-1 x 104細胞/well）、刺激細胞とした。TNF-αの添加を行っていないML-DC、あるいは、GM-CSFとIL-4を加えていないMo-MLも、同様に45GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、培養プレートに播種し、刺激細胞とした。そして、反応細胞として、アロのドナー由来の末梢血T細胞を加え（5 x 104細胞/well）、培養を行った。
Mo-MLをGM-CSF(100 ng/ml)とIL-4 (10 ng/ml)の存在下で4日間培養してML-DCを作製し、さらにTNF-α(10 ng/ml)を添加して2日間培養した後、細胞を回収した。この細胞に45 GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、96穴丸底培養プレート（FALCON 353077）に播種し（1 x 102細胞-1 x 104細胞/well）、刺激細胞とした。TNF-αの添加を行っていないML-DC、あるいは、GM-CSFとIL-4を加えていないMo-MLも、同様に45GyのX線を照射して細胞増殖を停止させた後、培養プレートに播種し、刺激細胞とした。そして、反応細胞として、アロのドナー由来の末梢血T細胞を加え（5 x 104細胞/well）、培養を行った。
培養開始から４日後に3H-メチルチミジンを添加（37 Kbq/well）した。その18時間後にセルハーベスタ（Wallac社）を用いて細胞中の高分子量DNAをガラスフィルターに捕捉した。ガラスフィルターに捕捉された3H-チミジンの放射活性をシンチレーション計測により測定することにより、T細胞の増殖速度を定量化した。
図２７にT細胞増殖応答解析の結果を示す。３種類の刺激細胞（iPS-MLあるいはTNF-α処理を行った、あるいは、行っていないML-DC）のいずれも、アロT細胞を刺激し増殖応答を誘導する活性を有していることが判明した。そして、３種類の刺激細胞のなかでは、TNF-α処理を行ったML-DCが最も強力なT細胞刺激能力を有していることが分かる。以上の結果から、Mo-ML由来のML-DCが、強力なT細胞刺激能力を有していることが示された。
実施例１７：末梢血単球へのcMYCおよびMDM2の導入によるMo-MLの作製
ヒト末梢血単球（CD14陽性細胞）を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCおよびMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。培養液としては、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。細胞は、レンチウイルスを感染させた後、3週間目頃よりはっきりとした増殖傾向を示した。図２８に、レンチウイルスを感染させた約１月後の細胞の顕微鏡写真を示す。図２９に、同時期にフローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
ヒト末梢血単球（CD14陽性細胞）を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYCおよびMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。培養液としては、α-MEM / 20%FCS / ヒト GM-CSF (100 ng/ml) / ヒト M-CSF (50 ng/ml、)を用いた。細胞は、レンチウイルスを感染させた後、3週間目頃よりはっきりとした増殖傾向を示した。図２８に、レンチウイルスを感染させた約１月後の細胞の顕微鏡写真を示す。図２９に、同時期にフローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
実施例１8：末梢血単球へのcMYC、EZH2およびMDM2の導入によるMo-MLの作製
ヒト末梢血単球を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYC、EZH2およびMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。細胞は、レンチウイルスを感染させた後、3週間目頃よりはっきりとした増殖傾向を示した。図３０に、レンチウイルスを感染させた約１月後の細胞の顕微鏡写真を示す。図３１に、同時期にフローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
ヒト末梢血単球を２４穴培養プレート中で培養し、そこへcMYC、EZH2およびMDM2を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。細胞は、レンチウイルスを感染させた後、3週間目頃よりはっきりとした増殖傾向を示した。図３０に、レンチウイルスを感染させた約１月後の細胞の顕微鏡写真を示す。図３１に、同時期にフローサイトメーターによりCD45、CD11b、CD33およびCD14の発現を検討した結果を示す。
Claims (16)
- ミエロイド系血液細胞において、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
を強制的に発現させることを含む、増殖能力を有するミエロイド系血液細胞を製造する方法。 - 前記ミエロイド系血液細胞に前記遺伝子を導入することにより、該ミエロイド系血液細胞において該遺伝子を強制的に発現させる、請求項１に記載の方法。
- 前記ミエロイド系血液細胞が、多能性幹細胞に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項３に記載の方法。
- 前記人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項４に記載の方法。
- 前記ミエロイド系血液細胞が、末梢血単球である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記末梢血単球が、ヒト末梢血単球である、請求項６に記載の方法。
- 前記ｃＭＹＣ遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子が、それぞれ、ヒトｃＭＹＣ遺伝子、ヒトＢＭＩ１遺伝子、ヒトＥＺＨ２遺伝子、ヒトＭＤＭ２遺伝子、ヒトＭＤＭ４遺伝子、及びヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の存在下で、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で製造したミエロイド系血液細胞を培養することを含む、ミエロイド系血液細胞を増殖させる方法。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により製造される細胞。
- 請求項１０に記載の細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導することを含む、樹状細胞様細胞を製造する方法。
- 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン-4（IL-4）を含む培養液を用いて、前記ミエロイド系血液細胞を培養することにより、該ミエロイド系血液細胞を樹状細胞様細胞に分化誘導する、請求項１１に記載の方法。
- 請求項１１又は１２に記載の方法により製造される細胞。
- 請求項１０又は１３に記載の細胞を含む、細胞医薬。
- 前記細胞医薬は、感染症、腫瘍、アルツハイマー病、プリオン病、アミロイドーシス、白血病、臓器移植に伴う拒絶反応、及び／又は自己免疫疾患の治療又は予防に用いるための細胞医薬である、請求項１４に記載の細胞医薬。
- 請求項１０若しくは１３に記載の細胞、又は請求項１４に記載の細胞医薬を製造するための、
（Ａ）ｃＭＹＣ遺伝子、並びに
（Ｂ）ＢＭＩ１遺伝子、ＥＺＨ２遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＭＤＭ４遺伝子、及びＨＩＦ１Ａ遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子
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