JP7407415B2

JP7407415B2 - Ｃｄ４陽性制御性ｔ細胞の製造方法

Info

Publication number: JP7407415B2
Application number: JP2019197848A
Authority: JP
Inventors: 美樹安藤; 純安藤; 翠石井; 則夫小松; 啓光中内; 素生渡部
Original assignee: Juntendo University; University of Tokyo NUC
Current assignee: Juntendo University; University of Tokyo NUC
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2024-01-04
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: JP2021069322A

Description

本発明は、多能性幹細胞を介してＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を製造する方法に関する。

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫応答抑制機能を持つため、自己免疫疾患の治療、炎症性疾患、アレルギー疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療や予防などに用いることが期待できる。体外で増幅させてＴｒｅｇを輸注し治療に用いる方法が考えられるが、Ｔｒｅｇはｉｎｖｉｔｒｏでの増殖効率が悪く、凍結保存も困難である。必要時に十分なＴｒｅｇを安定して得ることは難しい。

ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）は、Ｔリンパ球（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞）に感染し、悪性腫瘍である成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）や難治性神経疾患であるＨＴＬＶ－１関連脊髄症（HTLV-1 associated myelopathy：ＨＡＭ）の原因となるレトロウイルスであり、日本に現在約８０万人の感染者が存在すると推定されている。ＨＴＬＶ－１のウイルス遺伝子の中にはＴａｘ及びＨＴＬＶ－１ｂＺＩＰｆａｃｔｏｒ（ＨＢＺ）という２つのがん遺伝子が含まれており、これらの作用により感染細胞ががん化すると考えられている。
また、ＡＴＬ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋であり、腫瘍細胞のオリジンは制御性Ｔ細胞に由来すると考えられている。

一方、近年、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの多能性幹細胞から各種Ｔ細胞を誘導する技術が報告されており、当該技術を利用することにより、抗腫瘍免疫応答を惹起したり、自己に対する異常あるいは過剰な免疫応答を制御する等の様々な細胞免疫療法が可能になる。

これまでに抗原特異的なＴ細胞からｉＰＳ細胞を作り、再び由来となった細胞と同じ抗原特異性を示すＴ細胞に分化誘導する方法が報告されている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、この方法ではＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導はできるもののＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導することは困難であり、人工的にＣＤ４遺伝子を遺伝子導入しないと誘導できないのが実状であった。

国際公開第２０１１／０９６４８２号特許６１６４７４６号公報

本発明は、多能性幹細胞を介してＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞を確率よく製造する方法を提供することに関する。

本発明者らは、上記課題を達成すべく検討したところ、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者由来のＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を作り、再びＴ細胞に分化誘導させた場合に、Ｔｒｅｇと同じ発現型を持つＣＤ４陽性Ｔ細胞が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の１）～２）に係るものである。
１）ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程、及び該ｉＰＳ細胞をＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞に分化させる工程を含む、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の製造方法。
２）１）の方法により製造されたＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞を含有する医薬組成物。

本発明によれば、ｉＰＳ細胞を介して、ＣＤ４遺伝子を導入すること無く、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞を生産することが可能である。これにより、例えば自己に対する異常あるいは過剰な免疫応答を制御するような細胞免疫療法が可能になる。

ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞におけるＴａｘ及びＨＢＺ遺伝子発現の確認。ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳとＣＤ４Ｔ細胞クローン由来ｉＰＳから分化誘導されたＴ細胞の表現型。ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳより誘導したＣＤ４陽性Ｔ細胞の表現型。ＴＣＲＣβ１のサザンブロッティングによる遺伝子再構成の確認。分化誘導されたＣＤ４Ｔ細胞におけるＴａｘ及びＨＢＺ遺伝子発現の確認。

本発明のＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の製造方法は、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程、及び該ｉＰＳ細胞をＣＤ４陽性Ｔ細胞に分化誘導する工程を含む。
（１）ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞の単離
ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、例えばＡＴＬ患者の組織から公知の手法により単離することができる。ＡＬＴ患者の組織としては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む組織、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血が好ましい。
本発明において、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞としては、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞が挙げられ、好ましくはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｔ細胞であり、より好ましくはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である。

ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、細胞分離用磁気ビーズなどを用いる磁気セレクション、抗ＣＤ４抗体とセルソーターとを用いたフローサイトメトリーなどが挙げられる。

（２）ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からｉＰＳ細胞（「ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞」と称す）の樹立
単離されたＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、初期化してｉＰＳ細胞とされる。
ここで、「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）又は誘導性多能性幹細胞とも称される細胞であり、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。
「細胞初期化因子」は、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入されることにより、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であれば特に制限されることはないが、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３、及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質であるであることが好ましい。さらにこれらのタンパク質の中では、少ない因子で効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点から、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することがより好ましい。

本発明において、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞に前記細胞初期化因子を導入する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して、タンパク質の形態又は核酸の形態で導入することができる。例えば、前記前記細胞初期化因子をコードする核酸の形態で前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する場合においては、当該核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集にて細胞に導入することができる。

このような発現ベクターとしては、例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、挿入変異が生じにくく、また遺伝子導入効率が高く、導入される遺伝子のコピー数も多いという観点から、センダイウィルスを用いて、前記細胞初期化因子をコードする核酸を前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することが好ましい。
かかる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、かかるプロモーターは薬剤（例えば、テトラサイクリン）の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、さらに、プロモーターの他に、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含有していてもよい。

また、斯かる核初期化因子の導入に際しては、核初期化因子と共にＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ抗原を導入対象の細胞に発現させるのが同細胞の初期化までに要する増殖と生存率の上昇をする点で好ましい。
したがって、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞に細胞初期化因子を導入する場合の最適な態様として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子をコードする核酸を挿入したセンダイウィルスベクターとＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ抗原をコードする核酸を挿入したセンダイウィルスベクターを前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染することが挙げられるが、他の因子を追加したセンダイウイルスベクターで樹立する、もしくはＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ抗原をコードする核酸を挿入したセンダイウィルスベクターを用いずに樹立することもある。

また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を樹立する際には、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、前記遺伝子の導入前に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下にて抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化してもよく、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、同種抗原発現細胞、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１の物質によって刺激して活性化してもよい。かかる刺激は、例えば、培地中に、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加して前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。

前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞を培養する培地としては、例えば、Ｔ細胞の培養に適した公知の培地（より具体的には、他のサイトカイン類、ヒト血清を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、ＡＩＭＶ^TM ｍｅｄｉｕｍ、ＮＳ－Ａ２を用いることができる。培地には、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。

また、前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞に前記細胞初期化因子等を導入する際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記因子を導入した前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、フィーダーフリー条件下で培養するのが好ましい。例えば、ラミニン５１１Ｅ８断片であるｉＭａｔｒｉｘ-５１１溶液又はビトロネクチンもしくはマトリジェルでコーティングされたウェルが挙げられる。フィーダー細胞条件下での培養でも樹立可能であり、フィーダー細胞としては例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞***を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。

さらに、前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴ－ｉＰＳ細胞に誘導する過程において、翌日からｉＰＳ細胞の培地を添加しておくことが好ましい。その後は１日おきに半量ずつ培地交換を行い、徐々にＣＴＬ培地からｉＰＳ培地に置換するのが好ましい。

また、前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への移行に合わせて、Ｔ細胞の培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ｉＭａｔｒｉｘコーティングした場合にはＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎもしくはビトロネクチンでコーティングした場合にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ８Ｍｅｄｉｕｍ、マトリジェルの場合はｍＴｅＳＲ、ＭＥＦ細胞などのフィーダー細胞上ではノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、及びｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が望ましい。

このようにして前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞から誘導したＴ－ｉＰＳ細胞の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法が挙げられる。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞の各コロニーを選択せず、樹立できたコロニーを全てそのまま継代する方法でもよい。

選択された細胞がＴ－ｉＰＳ細胞であるということの確認は、例えば、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、及びＴｒａ－１－８１等）の発現をｑ－ＰＣＲ等によって検出する方法やＡＬＰ染色で確認する方法、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。また、このようにして選択された細胞が前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞由来であることの確認は、Ｔａｘ、ＨＢＺ遺伝子の定量をｑＰＣＲによって検出することにより行うことができる。

これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら、適宜決定することができ、概ね、前記細胞初期化因子を前記ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入してから１０～４０日、好ましくは１４日～２８日である。培養環境としては、上記にて特に断りのない限り、好ましくは、５％ＣＯ₂、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。低酸素培養環境下（酸素濃度：例えば、５％）においてもコロニーの効率良い生育が観察できる。

（３）Ｔ－ｉＰＳ細胞からＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞への分化誘導
樹立されたＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞へ分化させるためには、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、先ずはＴ－ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上にて、ＶＥＧＦ、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、インスリン、トランスフェリン、Ｌ－グルタミン、α－モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有する培地中にて培養することが好ましい。用いるストローマ細胞としては、造血系への分化を誘導し易くするという観点から、ＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）であることが好ましい。
また、培地としては、例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭが挙げられるが、造血前駆細胞等の誘導細胞を含有する袋状の構造物（「Ｔ－ｉＰＳサック」とも称する）の形成効率が高いという観点から、ＩＭＤＭ培地が好ましい。このＴ－ｉＰＳ細胞の培養期間としては、Ｔ－ｉＰＳサックを形成するまでの期間であることが好ましく、Ｔ－ｉＰＳ細胞の培養を開始してから好ましくは８～１４日間、より好ましくは１０～１４日間である。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ_２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。また、Ｔ－ｉＰＳサックの形成効率が高く、Ｔ－ｉＰＳサックに含まれる血球細胞の数が多いという観点から、７日間は低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５％）下にて培養することがより好ましい。

次いで、得られたサックに含有されている誘導細胞（造血前駆細胞等）を、サイトカインやＦＣＳ等を含有するα－ＭＥＭ培地中におけるストローマ細胞上で培養する。なお、かかるサック状構造物の内部に存在する細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるフィーダー細胞としては、Ｎｏｔｃｈ受容体リガンドを発現するＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＳＣＦ、ＴＰＯが好ましい。

このＴ－ｉＰＳサックに含有されている誘導細胞の培養期間としては、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから約２８日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ_２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
尚、Ｔｒｅｇ様のｐｈｅｎｏｔｙｐｅが発現しているか否かは、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、ＦＯＸＰ－３、抗ＣＣＲ４抗体等を用いた細胞内染色後のフローサイトメトリーにより評価することができる。

次いで、誘導された細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える。Ｔ細胞受容体に刺激を与える方法としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、Ｘ線照射した末梢血単核球にＰＨＡ等を添加して前記誘導細胞を一定期間培養することによって行うことができる。

斯くして分化誘導された細胞は、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することや細胞内染色を用いたフローサイトメトリーにより、該Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったＣＤ４陽性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＣＲ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞）由来であることを確認することができる。

斯くして得られたＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞は、公知の手法を適宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。

本発明の方法によって製造したＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞は、免疫応答抑制機能を有するため、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療又は予防のために用いることができる。従って、本発明は、本発明の方法によって製造したＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造したＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞を、公知の製剤学的方法により製剤化することにより調製することができる。例えば、注射剤（静脈注射剤、点滴注射剤等）、カプセル剤、液剤、フィルムコーティング剤などとして、主に非経口的に使用することができる。

これら製剤化においては、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また、前記疾患の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用してもよい。

本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の製造
（１）ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞の単離
ＡＴＬ患者の末梢血より末梢血単核球を分離後、ＣＤ４ビーズでポジティブセレクションを行いＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離した。得られたＴ細胞の表現型を、各種細胞表面マーカーを用いてフローサイトメトリーにて分析して、ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ２５強陽性であることを確認した。

（２）Ｔ－ｉＰＳ細胞の樹立
（１）で取得したＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞に、核初期化因子（Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ－Ｍｙｃ）を含むセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター（ＳｅＶｐ［ＫＯＳＭ３０２Ｌ］）と、ＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ抗原をコードする核酸を含むＳｅＶベクターを感染させて遺伝子導入した。
ｉＭａｔｒｉｘでコートした６ｗｅｌｌプレートに遺伝子導入後のＴ細胞を移動し、ＩＬ－２を加えたＴ細胞培地（培地の組成：ＲＰＭＩ、１０％ヒトＡＢ血清）にて、ＣＯ_２インキュベーターで培養した。
遺伝子導入の翌日に、ｉＰＳメディウム（ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎ）を等量加え、その後は１日おきに半量ずつＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎに置換した。
２１日後にＴ－ｉＰＳ細胞のコロニーが観察でき、その後コロニーピックアップを行った。

（３）ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞からＣＤ４陽性細胞への分化誘導
（２）で得られたＴ－ｉＰＳ細胞を細かく砕きフィーダー細胞である１０Ｔ１／２上でＶＥＧＦ、ＦＢＳ、インスリン、トランスフェリン、Ｌ－グルタミン、α－モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有する培地中にて最初の１週間を低酸素培養、次の１週間を２０％酸素濃度のインキュベーターで培養した。その後ＮｏｔｃｈＬｉｇａｎｄが発現する１０Ｔ１／２フィーダー細胞上で更に４週間サイトカイン（ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＳＣＦ）と共に、１週間に１回新たなフィーダー細胞に載せかえながら培養し、４週間後に浮遊細胞を全て回収し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激した。ＴＣＲ刺激はＸ線照射した同種末梢血単核球とＰＨＡ、もしくは抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で約２週間ごとに刺激した。

（４）結果と考察
ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞のＴａｘとＨＢＺ遺伝子の発現をｑＰＣＲで確認した（図１）。もとのＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＡＴＬＰＢＭＣ）と比較し、ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞（ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ）のＴａｘ遺伝子とＨＢＺ遺伝子の発現は１／１０００以下に低下していた。

図２にＣＤ４Ｔ－ｉＰＳから分化誘導により得られたＴ細胞の表現型を、細胞内染色を行いフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。コントロールとして健常人由来ＣＤ４Ｔ細胞クローンから樹立したＣＤ４^＋Ｔｃｅｌｌｃｌｏｎｅ－ｉＰＳから同時にＣＤ４Ｔ細胞の分化誘導を試みている。ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４Ｔ細胞由来ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞から分化誘導を行うと、ＣＤ４Ｔ細胞が多数誘導されている（Ｎｏ．１：２０％、Ｎｏ．２：２０．９％）。さらにＣＤ４陽性細胞にゲートしてＦＯＸＰ３とＣＤ２５の発現を確認したところダブルポジティブの細胞が確認できた。一方でＨＴＬＶ－１感染のないＣＤ４Ｔ細胞から誘導したＴ－ｉＰＳ細胞からはＣＤ４陽性Ｔ細胞はわずか１．５７％しか誘導されず、ＦＯＸＰ３，ＣＤ２５陽性細胞は０％であった。図３に示すようにＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４Ｔ－ｉＰＳより誘導したＣＤ４陽性Ｔ細胞はＦＯＸＰ３陽性、ＣＣＲ４陽性、ＣＤ２５陽性でありＴｒｅｇ様のフェノタイプを示した。図４に示すようにサザンブロット法でＴＣＲＣβ１の再構成を確認すると、もとのＡＴＬ細胞は腫瘍性のクローン性増殖を認めるが、樹立したｉＰＳ細胞と分化誘導したＣＤ４Ｔ細胞には腫瘍性のクローン性増殖を認めなかった。また図５に示すように、分化誘導したＣＤ４Ｔ細胞はＴａｘ，ＨＢＺの発現も消失していた。

これより、通常のｉＰＳ細胞からはＣＤ４Ｔ細胞の誘導は極めて困難でありＴｒｅｇのフェノタイプも確認できなかったが、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４Ｔ細胞から樹立したＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞からＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞が誘導できることを確認した。分化誘導したＣＤ４Ｔ細胞は腫瘍性のクローン性増殖を認めず、またＨＴＬＶ－１感染で陽性となるＴａｘ，ＨＢＺの発現も消失しているため、細胞治療に使用できることが期待できる。

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は免疫応答抑制機能を持つため、自己免疫疾患の治療、炎症性疾患、アレルギー疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療や予防などに用いることが期待できる。体外で増幅させてＴｒｅｇを輸注し治療に用いる方法が考えられるが、Ｔｒｅｇはｉｎｖｉｔｒｏでの増殖効率が悪く、凍結保存も困難である。必要時に十分なＴｒｅｇを安定して得ることは難しい。これまでに抗原特異的なＴ細胞からｉＰＳ細胞を作り、再び由来となった細胞と同じ抗原特異性を示すＴ細胞に分化誘導する方法が報告されている（前記特許文献１、特許文献２）。しかしながら、この方法ではＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導はできるものＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導することは困難であり、人工的にＣＤ４遺伝子を遺伝子導入しないと誘導できないのが実状であった。本発明によれば、ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４Ｔ細胞から樹立したＣＤ４Ｔ－ｉＰＳ細胞からであればＣＤ４遺伝子導入を行わずにＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の誘導が可能である。分化誘導したＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞は腫瘍性のクローン性増殖を認めず、またＨＴＬＶ－１感染で陽性となるＴａｘ，ＨＢＺの発現も消失しているため、免疫応答を抑制する細胞治療に使用できることが期待できる。

Claims

ＨＴＬＶ－１感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する工程、及び該ｉＰＳ細胞をＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞に分化させる工程を含む、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の製造方法。
ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞が医薬組成物を調製するために用いられる、請求項１記載の方法。