JP2014508519A - 飼料添加用組成物 - Google Patents

Abstract

直接給与生菌を、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて含む飼料添加用組成物、並びに対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性（例えば、アミノ酸の消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎に対する対象の耐性の向上、又は餌料転換効率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物における体重増加性の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖性の向上に関係する方法を提供し、本方法は、直接給与生菌を、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む。

Description

本発明は、特定の組み合わせの酵素と組み合わせて直接給与生菌を用いることにより、飼料組成物を改良する方法、並びに特定の組み合わせの酵素と組み合わせて直接給与生菌を含有する飼料添加用組成物に関する。本発明は、更に、使用法及びキットに関する。

酵素サプリメントは、栄養機能及び産生効率を向上させるという意味合いで、動物飼料、特に鶏及び豚用飼料に添加剤として使用されている。酵素ブレンドを利用することで、大豆ミール、動物性タンパク質ミール、又は高繊維飼料副産物を含有している飼料の栄養価を改良することができる。

直接給与生菌（ＤＦＭ）という概念は、ストレス期（疾患、飼料の変化、環境ストレス又は出産ストレス）にある乳牛などの動物に、有益な微生物を給与することに関与する。この分類に当てはまる飼料添加物にはプロバイオティクスという別称があり、これまでにプロバイオティクス又はＤＦＭは、管理下試験において、動物の生産性能を向上させることが示されている。ＤＦＭには、直接給与生菌の他、酵母系の産物も包含される。

ＤＦＭと一部の酵素を組み合わせるという手法は想到されているものの、ＤＦＭと酵素との相互作用は完全には解明されていない。本発明は、動物の生産性能を非常に向上させる新規の特定の組み合わせに関する。

本発明は、ＤＦＭと、プロテアーゼ及びフィターゼとを組み合わせることで、動物の性能に対し非常に有益な効果が得られるという、独創性に富んだ発見に基づくものである。

特に、本発明は、ＤＦＭと、プロテアーゼ、及びフィターゼとを組み合わせることで、動物の性能に関し、次の：飼料要求率（ＦＣＲ）、原材料を消化する能力（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素可消化性）、窒素保持、生存時間、枝肉歩留まり、成長速度、体重増加、飼料効率、壊死性腸炎に対する抵抗性、対象とする動物の免疫応答性、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖、のうちの１つ以上の点で、非常に有益な効果が得られるという、独創性に富んだ発見に基づく。

その他に本発明は、対象とする動物から得られる糞尿への栄養素の排出を減少させ得る（例えば、窒素及びリンの排出を減少させる）という点でも、驚くべきものである。

一態様では、本発明は、直接給与生菌と、プロテアーゼ及びフィターゼとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を提供する。

他の態様では、本発明は、対象とする動物の性能の向上、又は飼料に含まれる原材料に対する可消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、に関係する方法を提供し、本方法は、直接給与生菌を、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む。

本発明の更に他の態様は、対象とする動物の性能の向上、又は飼料に含まれる原材料に対する可消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上）、又は壊死性腸炎の悪影響の回避、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、を目的として、直接給与生菌を、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて使用するものである。

本発明の更なる態様では、直接給与生菌、プロテアーゼ、フィターゼ（及び所望により少なくとも１種のビタミン及び／又は所望により少なくとも１種のミネラル）、及び投与についての指示書、を含む、キットが提供される。

他の態様では、本発明は、直接給与生菌を、プロテアーゼ及びフィターゼと混合する工程、並びに（所望により）パッケージングする工程、を含む、飼料添加用組成物の製造法を提供する。

本発明の更に他の態様は、直接給与生菌を、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を含む、飼料又は家畜飼料を提供する。

プレミックスは、直接給与生菌を、プロテアーゼ及びフィターゼ、並びに少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を含む。

他の態様では、本発明は、直接給与生菌と、プロテアーゼ及びフィターゼとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物を、飼料成分と混合する工程を含む、家畜飼料製造方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象とする動物におけるコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を予防及び／又は処置するための飼料添加用組成物に関する。

本発明は、壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症を予防及び／又は処置する方法を更に提供し、本方法では、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与する。

ＤＦＭ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから入手可能なＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標））と、プロテアーゼ（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）プロテアーゼ）、及びフィターゼ（例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから入手可能な５００ＦＴＵ／ｋｇのＰｈｙｚｙｍｅ ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ））とを組み合わせることで、動物の腸において、対照に曝露した場合と比較して、壊死性腸炎病変スコアが優位に改善する（低下させる）ことを示す。 ２０〜４２日齢の壊死性腸炎（ＮＥ）病変に関係する斃死を示す。ＤＦＭ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから入手可能なＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標））を次の組み合わせ：プロテアーゼ（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）プロテアーゼ）、及びフィターゼ（例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから入手可能な５００ＦＴＵ／ｋｇのＰｈｙｚｙｍｅ ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ））と組み合わせることで、ＮＥ斃死率は優位に改善された（低下した）。 壊死性腸炎モデルのブロイラーの０〜２３日齢の体重増加を示す。ＤＦＭ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから入手可能なＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標））を次の組み合わせ：プロテアーゼ（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）プロテアーゼ）、及びフィターゼ（例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから入手可能なＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから入手可能な５００ＦＴＵ／ｋｇのＰｈｙｚｙｍｅ ＸＰ（大腸菌（E. coli）フィターゼ））とを組み合わせることで、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）に曝露したブロイラーにおいて、陰性対照に曝露したブロイラーと比較して体重増加率（ＢＷ獲得）が優位に向上したことを示す。 壊死性腸炎モデルのブロイラーの０〜１２日齢の体重増加を示す。プールされたＳＥＭは４．８６であった。 壊死性腸炎モデルのブロイラーの飼料効率をを示す。プールされたＳＥＭは０．０２６であった。 壊死性腸炎モデルの０〜２３日齢のブロイラーの飼料要求率を示す。プールされたＳＥＭは０．０２２であった。 ２３日齢の時点の空腸に関し、すべての処理に関する対象とする遺伝子の発現プロファイルのヒートマップを示す。

未処理対照群＝未処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＝処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＋プロテアーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋プロテアーゼ
ＣＣ＋ＥＰ＝処理対照群＋フィターゼ＋Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋プロテアーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋プロテアーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ。
２３日齢の時点のすい臓における、すべての処理についてのニワトリαアミラーゼの発現プロファイルのヒートマップを示す。

未処理対照群＝未処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＝処理対象＋フィターゼ
ＣＣ＋プロテアーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋プロテアーゼ
ＣＣ＋ＥＰ＝処理対照群＋フィターゼ＋Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋プロテアーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋プロテアーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ。

好ましくは、本発明で用いる各酵素は、ＤＦＭにとって外来性のものである。換言すれば、好ましくは、酵素はＤＦＭに加えられ、又はＤＦＭと混合される。

別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示の属する技術分野の業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びに、Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くについての一般的辞書を当業者に提供する。

本開示は、本明細書において例示される方法及び材料に限定されるものではなく、本開示の実施形態を実施又は試験するにあたって、本明細書に開示されるものと類似する又は等価である任意の方法及び材料を使用することができる。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。別途記載のない限り、任意の核酸配列は、それぞれ、核酸は左から右に５’→３’の向きで記載され、アミノ酸は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記載される。

本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものであるしたがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。

本明細書において、アミノ酸は、アミノ酸名、３文字略記、又は１文字略記により参照する。

本明細書で使用するとき、用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを包含する。

本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。

用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基に対し一般的な一文字表記及び２文字表記が用いられる場合がある。アミノ酸の三文字表記は、ＩＵＰＡＣＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義される通りのものである。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。

用語についての他の定義は本明細書中で明らかになる場合がある。例示的な実施形態（exemplary embodiments）をより詳細に記載する前に、本開示は記載される具体的な実施形態に制限されるものではなく、言うまでもなく、多岐にわたることは理解される。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、制限を意図するものではなく、したがって、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されるであろう。

値について範囲が提供される場合、文脈上明記されていない限り、範囲の上限値及び下限値の間の各数値も明確に開示されているものとし、下限とする単位の少数第一位までを開示するものとする。規定の任意の値又は規定の範囲に含まれる値、及びその他の任意の規定の値又は規定の範囲に含まれる値、に挟まれる、より小さな各々の範囲も本開示に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲に包含させることができ、あるいは除外させることができ、かつ各範囲が、記載の範囲内の任意の特定の制限を包含するよう、上限及び下限のいずれかを包含し、又はいずれも包含せず、又はいずれをも包含する、より小さな範囲も本開示に包含させる。規定の範囲が上限又は下限のいずれか又は両方を含有する場合、これらの含有される上限又は下限のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明記されない限り複数形も含む。したがって、例えば、「酵素（an enzyme）」には、複数の候補となる剤が包含され、「飼料（the feed）」を参照する場合には、当業者に知られる１種以上の飼料及びその等価物等が包含される。

本明細書で述べる開示は、本開示の出願日よりも先に開示されているという意味合いでのみ提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術に相当するものと承認すると判断される記載は存在しない。

本発明において使用される酵素は、バッチ培養法、フェドバッチ培養法、及び連続培養法などの、固体培養又は深部培養のいずれかにより製造することができる。培養は、水溶性無機塩類培地、有機増殖因子、炭素供給源及びエネルギー供給源、酸素分子、及び言うまでもなく、選択した１種以上の特定の微生物の初回接種材料、を含む、増殖培地で実施する。

直接給与生菌（ＤＦＭ）
本明細書において、用語「微生物（microbial）」は、「微生物（microorganism）」と互換的に使用される。

好ましくはＤＦＭは生菌を含む。好ましくは、ＤＦＭは生細菌、又は生酵母、又は生真菌を含む。

好ましくは、ＤＦＭは、生菌を含む。

用語「生菌」は、代謝的に活性であるか、又は分化することのできる微生物を意味する。

一実施形態では、ＤＦＭは、芽胞形成細菌であってよく、すなわち用語「ＤＦＭ」は、芽胞、例えば細菌芽胞からなり、又は芽胞を含有する。したがって、一実施形態では、本明細書で使用される用語「生菌」には、芽胞又は分生子などの細菌芽胞が包含される場合がある。

他の実施形態では、本発明に従う飼料添加用組成物に含まれるＤＦＭは、細菌芽胞、例えば、芽胞又は分生子からは構成されず、又は細菌芽胞を含有しない。

微生物は天然に生じる微生物であっても、あるいは形質転換を起こした微生物であってもよい。微生物は、好適な微生物の組み合わせであってもよい。

一部の態様では、本発明に従うＤＦＭは、微生物、酵母、又は真菌のうちのいずれか１種以上であり得る。

好ましくは、本発明に従うＤＦＭはプロバイオティック細菌である。

本発明では、用語「直接給与生菌（ＤＦＭ）」は、直接給与細菌、直接給与酵母、直接給与真菌、及びこれらの組み合わせを包含する。

好ましいＤＦＭは、直接給与細菌である。

好ましくいＤＦＭは、２種以上の細菌、例えば、３種以上、又は４種以上の細菌を含む混合物であり、あるいはＤＦＭは、２種以上の細菌株、例えば、３種以上、又は４種以上の細菌株を含む混合物である。

好ましくは、これらの単数種又は複数種の細菌は、単離されたものである。

好適なＤＦＭは、次の属：ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、バチルス属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、カルノバクテリウム（Carnobacterium）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム（Clostridium）属及びメガスフェラ（Megasphaera）属、並びにこれらの組み合わせ、のうちの１種以上に由来する細菌を含み得る。

一実施形態では、ＤＦＭは、次のバチルス菌種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・リケニフォルミス、及びバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）から選択され得る。

一実施形態では、ＤＦＭは２種以上のバチルス（Bacillus）株を含む混合物であり得る。

一実施形態では、ＤＦＭは、２種以上の枯草菌（Bacillus subtilis）株、３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）、２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０５）、ＢＳ １８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３３）、及びＢＳ ２７８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３４）の混合物であり得る。

株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、及び２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）より公的（publically）に入手可能である。

株２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０５）は、米国の農業研究サービス機関の系統保存株（Agricultural Research Service Culture Collection）（ＮＲＲＬ）より公的に入手可能である。枯草菌（Bacillus subtilis）株ＬＳＳＡ０１はしばしば枯れ草菌８と呼ばれる。

これらの株については米国特許第７，７５４，４６９（Ｂ２）号に教示される。

枯草菌（Bacillus subtilis）ＢＳ １８及び枯草菌（Bacillus subtilis）ＢＳ ２７８は、ブダペスト条約の下、Ａｎｄｙ Ｍａｄｉｓｅｎ（Ｗ２２７ Ｎ７５２ Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ ５３１８６、ＵＳＡ）又はＤａｎｉｓｃｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｗ２２７ Ｎ７５２ Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ ５３１８６、ＵＳＡ）により、農業研究サービス機関の微生物株保存施設（ＮＲＲＬ）（１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に、それぞれ寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３３及びＮＲＲＬ Ｂ−５０６３４で２０１２年１月９日に寄託されている。

Ａｎｄｙ Ｍａｄｉｓｅｎ（Ｗ２２７ Ｎ７５２ Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ ５３１８６、ＵＳＡ）及びＤａｎｉｓｃｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｗ２２７ Ｎ７５２ Ｗｅｓｔｍｏｕｎｄ Ｄｒ．Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ ５３１８６）、ＵＳＡ ａｕｔｈｏｒｉｓｅ Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ（Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ １、ＰＯ Ｂｏｘ １７、ＤＫ−１００１、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）は、本開示において、これらの寄託された生物材料を指すものであり、制限は受けておらず、かつ取り消しを受けぬよう、寄託された材料は公共に利用され得るものであると承認されてる。

一部の実施形態では、ＤＦＭは、次の表に詳しく記載する枯草菌（Bacillus subtilis）株を含む混合物であり得る。

一実施形態では、ＤＦＭは次のラクトコッカス菌種：タクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、及びラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、及びこれらの混合物から選択され得る。

一実施形態では、ＤＦＭは次のラクトバチルス菌種：ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ビフィダス（Lactobacillus bifidus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス・へルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、発酵ラクトバチルス（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ファルシミニス、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、デルブリュッキ菌、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ガセリ菌（Lactobacillus gasseri）、ジョンソニイ菌（Lactobacillus johnsonii）、及びラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、並びにこれらのうちの任意の組み合わせから選択され得る。

一実施形態では、ＤＦＭは次のビフィドバクテリウム菌種（Bifidobacterium spp）：ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidium）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、及びビフィドバクテリウム・アンギュラツム（Bifidobacterium angulatum）、並びにこれらのうちの任意の組み合わせから選択され得る。

好適なＤＦＭは次の属：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス菌種、ビフィドバクテリウム菌種、アシドフィルス菌、ペディオコッカス（Pediococcus）・アシディラクティシ、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、枯草菌（Bacillus subtilis）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミニス、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）菌種、サリバリウス、プロピオニ細菌属及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含み得る。

本発明に使用される直接給与細菌は、同様の種類（属、種及び株）であってよく、又は複数の属、種、及び／又は株の混合物を含んでよい。

本発明に従う好適なＤＭＦは、次の表に記載される通りの１種以上の製品、又はこれらの製品に含有される微生物を含んでよい。

一実施形態では、好適なＤＦＭはＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）である場合がある。Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）はＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから市販されている製品であり、バチルス（Bacillus）株２０８４ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲＲｌ Ｂ−５００１３、バチルス（Bacillus）株ＬＳＳＡＯ１ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０４及びバチルス（Bacillus）株１５Ａ−Ｐ４ ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０７の混合物である（米国特許第７，７５４，４６９（Ｂ）号に教示の通りのものである−参照により本案件に組み込まれる）。

好適には、ＤＦＭはサッカロミセス菌種由来の酵母を含ませることができる。

好ましくは、本発明に従って使用されるＤＦＭは、一般に安全であると認識されている微生物であり、好ましくはＧＲＡＳにより認可されている微生物である。

当業者であれば、食品産業及び農産業において使用され、一般的に動物による消費に好適であると考えられ、本明細書に記載の属の範囲に含まれる微生物の、具体的な種及び又は株は容易に見当がつくであろう。

好ましくは、本発明に従って使用されるＤＦＭは、動物による消費に好適なものである。

有利に、製品は飼料又は飼料添加用組成物であり、生活性を有するＤＦＭは、製品の一般的な「販売期限」又は「消費期限」の間、すなわち飼料又は飼料添加用組成物が販売業者によって販売される期間中は効果を保持すべききである。所望の時間及び一般的な貯蔵寿命（shelf life）は、家畜飼料によって異なる場合があり、当業者であれば、貯蔵寿命は、家畜飼料の種類、家畜飼料の容量、保管温度、加工条件、梱包材料及び梱包装置に応じ変化することを認識するであろう。

一部の実施例では、ＤＦＭが熱に耐性を有すること、すなわち熱耐性であることが重要である。これは特に、飼料がペレット形態である場合に当てはまる。したがって、一実施形態では、ＤＦＭは熱耐性微生物であり、例えば、バチルス菌種などの熱耐性細菌であってよい。

一部の実施例では、ＤＦＭが芽胞形成細菌、例えば、バチルス菌種などのバチルス（Bacillus）であることが好ましい場合がある。バチルス（Bacillus）は、増殖に望ましくない条件下で安定な芽胞を形成することができる微生物であり、熱、ｐＨ、湿度、及び殺菌剤に対し非常に抵抗性である。

一実施形態では、好適なＤＦＭは、腸内での病原微生物（クロストリジウム（Clostridium）・パーフリンゲンス及び／又は大腸菌（E. coli）及び／又はサルモネラ菌及び／又はカンピロバクター菌など）の増殖を低減又は予防することができる。

本発明のＤＦＭは、任意の好適なＤＦＭであってよい。一実施形態では、次のアッセイ「ＤＦＭアッセイ」により、ＤＦＭに好適な微生物を判定することができる。誤解を避けるため、一実施形態では、本明細書で教示する「ＤＦＭアッセイ」に従って抑制株（又は抗病原ＤＦＭ）として選別されたＤＦＭは、本発明に従って使用するのに、すなわち、本発明に従う飼料添加用組成物に使用するのに好適なＤＦＭである。

ＤＦＭアッセイ：
各試験管に、代表的なクラスターの代表的な病原体を接種した。

可能性の高いＤＦＭの好気的又は嫌気的増殖物の上清を試験管に接種し、インキュベートした。

インキュベート後、各病原体について、対照処理及び上清処理を行った試験管の吸光度（ＯＤ）を測定した。

対照と比較してＯＤの値が低かった株（潜在的ＤＦＭ）のコロニーを阻害株（又は抗病原体ＤＦＭ）として分類した。

本明細書で使用するＤＦＭアッセイは、米国特許第２００９／０２８００９０号（参照により本案件に組み込まれる）により詳細に説明される。

好ましくは、アッセイに使用される代表的な（１種以上の）病原体は、次の：ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、及び／又は大腸菌（E. coli）、及び／又はサルモネラ菌種（Salmonella spp）、及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）などのクロストリジウム（Clostridium）属である。好ましい実施形態では、アッセイは、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、及び／又は大腸菌（E. coli）のうちの１種以上を用い実施され、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、より好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）を用い実施される。

一実施形態では、本発明のＤＦＭは好ましくは抗病原性である。

本明細書で使用するとき、用語「抗病原性」は、ＤＦＭが、病原体のもつ作用（例えば、負の効果）に対抗することを意味する。

一実施形態では、ＤＦＭが本発明に従う抗病原性のものであるかどうかを判定するのに、上記のＤＦＭアッセイを使用できる。上述の「ＤＦＭアッセイ」において、特に、病原体がウェルシュ菌（Clostridium perfringens）である際に阻害株であると分類された場合、ＤＦＭは抗病原性又は抗病原性ＤＦＭであると見なされる。

一実施形態では、抗病原体ＤＦＭは、次の微生物：
枯草菌（Bacillus subtilis）株２０８４ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３、
枯草菌（Bacillus subtilis）株ＬＳＳＡＯ１ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０４、
枯草菌（Bacillus subtilis）株１５Ａ−Ｐ４ ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０７、
枯草菌（Bacillus subtilis）株３Ａ−Ｐ４ ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＰＴＡ−６５０６、及び
枯草菌（Bacillus subtilis）株ＢＳ２７ ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０５、のうちの１種以上であり得る誤解を避けるため、これらの株は入手可能なものであり、かつ米国特許第７，７５４，４５９（Ｂ）に引用されるものである。

一実施形態では、本発明に従って使用されるＤＦＭは、国際公開第２００８／０１６２１４号に教示されるようなガセリ菌（Lactobacillus gasseri）ＢＮＲ １７株Ａｃｃ Ｎｏ．ＫＣＴＣ １０９０２ＢＰではない。

好ましくは、ＤＦＭは、不活性化した微生物ではない。

一実施形態では、本明細書で使用されるＤＦＭは、本明細書に記載の通りのＤＦＭ微生物を１種以上含む組成物である。組成物には、本発明の酵素を更に含ませることができる。組成物は、直接給与生菌（ＤＦＭ）として動物に供与することができる。１つ以上の担体又はその他の材料をＤＦＭに添加することもできる。ＤＦＭは、例えば、トップドレス、若しくは液体ドレンチ剤に使用される水溶性濃縮物として、又は代用乳、ゼラチンカプセル、若しくはゲルに加えるなどして、様々な物理形態で存在させることができる。トップドレス形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、石灰岩（炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び／又はアルミノ珪酸ナトリウムなどの担体に添加する。水溶性濃縮物の一実施形態ではドレンチ液用又は代用乳添加剤用の凍結乾燥させた発酵産物を、水溶性担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、乾燥デンプン、アルミノ珪酸ナトリウムに添加し、液体を加えてドレンチを生成するか、又は乳又は代用乳に添加剤を加えるかする。ゼラチンカプセル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、糖、石灰岩（炭酸カルシウム）、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び／又はアルミノ珪酸ナトリウムに加える。一実施形態では、細菌及び担体は分解性ゼラチンカプセルに封入される。ゲル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、担体、例えば植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、及び／又はゲル形成用の合成着色料に加える。

ＤＦＭは、所望により添加剤の乾燥製剤と混合してよく、このような乾燥製剤としては増殖基質、酵素、糖、炭水化物、抽出物、及び増殖促進用微量成分が挙げられるが、これらに限定されない。糖としては、次の：ラクトース、麦芽糖、ブドウ糖、マルトデキストリン、ブドウ糖、フルクトース、マンノース、タガトース、ソルボース、ラフィノース、及びガラクトースが挙げられる。糖はそれぞれ又は合計して５０〜９５％の範囲である。抽出物には、可溶性の酵母又は乾燥酵母発酵産物が５〜５０％含有され得る。増殖基質には、トリプチケースが５〜２５％、乳酸ナトリウムが５〜３０％、及びＴｗｅｅｎ ８０が１〜５％含有され得る。炭水化物としては、マニトール、ソルビトール、アドニトール、及びアラビトールが含まれ得る。炭水化物はそれぞれ又は合計して５〜５０％の範囲である。微量成分としては、炭酸カルシウムが０．５〜５．０％、塩化カルシウムが０．５〜５．０％、リン酸二カリウムが０．５〜５．０％、リン酸カルシウムが０．５〜５．０％、マンガンプロテアーゼが０．２５〜１．００％、及びマンガンが０．２５〜１．０％の範囲で含有され得る。

本明細書で記載のＤＦＭを調製する際、培養物及び担体（使用する場合）をリボンミキサ又はパドルミキサに加え、約１５分混合することができる。ただし、この混合時間は増減させてよい。培養物と単体が均一に混合されるように成分を混合する。最終生成物は好ましくは流動性の乾燥粉末である。次に、ＤＦＭ又はこれを含む組成物を家畜飼料又は飼料プレミックスに添加することができ、又は動物用飲用水に添加することができ、又は当該技術分野で既知の他の手法により投与することができる（好ましくは、本発明の酵素とともに同時に）。家畜飼料には、本明細書に記載の１種以上のＤＭＦを添加でき、あるいは本明細書に記載の組成物を添加できる。

「少なくとも２種の株からなる混合物」は、２、３、４、５、又は６種以上の株の混合物を意味する。一部の実施例の株混合物では、割合は１％〜９９％で変化し得る。株混合物の他の実施例は２５％〜７５％である。株混合物の追加例では、各株約５０％である。混合物が２種以上の株を含む場合、この株は混合物中に実質的に同じ比率で、又は異なる比率で存在し得る。

ＤＦＭは適切に投与できる。

飼料へのＤＦＭの好適な添加量は、約１×１０^３ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０^９ＣＦＵ／飼料（ｇ）、好適には約１×１０^４ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０^８ＣＦＵ／飼料（ｇ）、好適には約７．５×１０^４ＣＦＵ／飼料（ｇ）〜約１×１０^７ＣＦＵ／飼料（ｇ）であり得る。

一実施形態では、ＤＦＭは約１×１０^３ＣＦＵ／飼料（ｇ）超、好適には約１×１０^４ＣＦＵ／飼料（ｇ）超、好適には約７．５×１０^４ＣＦＵ／飼料（ｇ）超で飼料に添加される。

飼料添加用組成物へのＤＦＭの好適な添加量は、約１×１０^５ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０^１３ＣＦＵ／組成物（ｇ）、好適には約１×１０^６ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０^１２ＣＦＵ／組成物（ｇ）、好適には約３．７５×１０^７ＣＦＵ／組成物（ｇ）〜約１×１０^１１ＣＦＵ／組成物（ｇ）であり得る。

一実施形態では、ＤＦＭは、飼料添加用組成物に、約１×１０^５ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１×１０^６ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３．７５×１０^７ＣＦＵ／組成物（ｇ）超で添加される。

一実施形態では、ＤＦＭは、飼料添加用組成物に、約２×１０^５ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２×１０^６ＣＦＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３．７５×１０^７ＣＦＵ／組成物（ｇ）超で添加される。

本明細書で使用するとき、用語「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位を意味し、単一の前駆細胞から***した細胞の凝集塊を示すコロニーに含まれる生菌に関する尺度である。

プロテアーゼ
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ」は、ペプチダーゼ又はプロテイナーゼと同義である。

本発明での使用を目的としたプロテアーゼは、サブチリジン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）又はバシロリジン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）又はアルカリセリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）又はケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ）であり得る。

好ましくは、本発明に従うプロテアーゼはサブチリジンである。

適当なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。化学的に修飾された、又はタンパク質工学により導入された変異体も好適である。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼであってよく、例えば、好アルカリ菌プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリプロテアーゼの例としては、サブチリジン、特に、例えば、バチルス属のサブチリジンＮｏｖｏ、サブチリジンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリジン３０９（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号を参照されたい）、サブチリジン１４７、及びサブチリジン１６８（例えば、国際公開第８９／０６２７９号を参照されたい）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及びフザリウムプロテアーゼ（例えば、国際公開第８９／０６２７０号及び国際公開第９４／２５５８３号を参照されたい）が挙げられる。有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号及び同第９８／２０１１５号に記載の変異体も挙げられるがこれらに限定されない。

好ましい実施形態では、本発明での使用を目的としたプロテアーゼは、次の市販品のうちの１種以上に含まれる１種以上のプロテアーゼであり得る。

一実施形態では、プロテアーゼは枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼであってよい。

一実施形態では、プロテアーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから入手可能なノカルディオプシスプロテアーゼであり得る。

好ましくは、プロテアーゼは飼料中に約１０００Ｕ／飼料（ｋｇ）〜約２０，０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約１５００ＰＵ／飼料（ｋｇ）〜約１００００ＰＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約２０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）〜約６０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）の範囲で含有される。

一実施形態では、プロテアーゼは、飼料中に約１０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約１５００ＰＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約２０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）超で含有される。

一実施形態では、プロテアーゼは、飼料中に約２０，０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）、好適には約１００００ＰＵ／飼料（ｋｇ）、好適には約７０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）、好適には約６０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）未満で含有される。

好ましくは、プロテアーゼは、飼料添加用組成物中に約２００ＰＵ／ｇ〜約４００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、より好ましくは約３００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約２００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約５０００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約１００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約７００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約７０，０００ＰＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約１０００ＰＵ／組成物（ｇ）〜約６０，０００ＰＵ／組成物（ｇ）の範囲で含有される。

一実施形態では、プロテアーゼは、飼料添加用組成物中に約２００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約３００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約４００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約５００ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約７５０ＰＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１０００ＰＵ／組成物（ｇ）超で含有される。

一実施形態では、プロテアーゼは、飼料添加用組成物中に、約４００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約２００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１００，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約８０，０００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約７００００ＰＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約６００００ＰＵ／組成物（ｇ）未満で含有される。

プロテアーゼ単位（ＰＵ）は、ｐＨ ７．５（４０ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４／乳酸緩衝液）、４０℃にて、１分あたりに、１μｇのフェノール化合物（トリプシン等量として表わす）を基質（０．６％カゼイン溶液）から放出させる酵素量であることは理解されるであろう。この条件は、本明細書において、１ＰＵ単位を定量するアッセイとして参照され得る。

一実施形態では、酵素は好適には上記のＥ．Ｃ．分類法により分類され、かつ１ＰＵの定量に関し本明細書において教示されるアッセイにおいて試験した場合に活性を有する酵素は、このＥ．Ｃ．分類法により命名される。

フィターゼ
本発明での使用を目的としたフィターゼは、６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６として分類）又は３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８として分類）に分類される。

一実施形態では、フィターゼは６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）であってよい。

好ましい実施形態では、本発明での使用を目的としたフィターゼは、次の市販品のうちの１種以上に含まれる１種以上のフィターゼであり得る。

本明細書で使用するとき、用語「コンセンサスな遺伝子（consensus遺伝子）」は、微生物を形質転換させるのに使用されるＤＮＡベクターが、コンセンサス配列に基づく合成フィターゼ遺伝子、非病原性酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＵＲＡ遺伝子、及び大腸菌（E. coli）プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点を含有することを意味する。

一実施形態では、フィターゼは、例えば、国際公開第２００６／０３８０６２号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２００６／０３８１２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来のシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ、好ましくはＣ．フレウンディＮＣＩＭＢ ４１２４７、及びこれらの誘導体、国際公開第２００４／０８５６３８号に開示されるものなどのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＹＨ−１５、国際公開第２００６／０３７３２８号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・ブラアキイ（Citrobacter braakii）ＡＴＣＣ ５１１１３、並びに例えば国際公開第２００７／１１２７３９号（参照により本案件に組み込まれる）及び国際公開第２０１１／１１７３９６号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどの、これらの変異体、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）、好ましくは、国際公開第２００６０３７３２７号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ ２５４０５又はシトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）ＡＴＣＣ ２５４０７、シトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）、好ましくは、国際公開第２００６０３７３２７号（参照により本案件に組み込まれる）に開示されるものなどのシトロバクター・ギレニイ（Citrobacter gillenii）ＤＳＭ １３６９４、又はシトロバクター（Citrobacter）・インターメディウス、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター（Citrobacter）・マーリニアエ、シトロバクター（Citrobacter）・ローデンティウム、シトロバクター（Citrobacter）・セドルアキィ、シトロバクター（Citrobacter）・ワークマニイ、シトロバクター（Citrobacter）・ヨウンガエ、シトロバクター（Citrobacter）種ポリペプチド、又はこれらの変異体である。

一実施形態では、フィターゼは、シトロバクター（Citrobacter）属、例えば、シトロバクター・フレウンディイ（Citrobacter freundii）由来のフィターゼであってよく、国際公開第２００６／０３８１２８号（この開示は参照により本案件に組み込まれる）において教示される通りのフィターゼ酵素であってよい。

好ましい実施形態では、好ましくはフィターゼは、商品名Ｐｈｙｚｙｍｅ ＸＰ（商標）でＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓより市販の大腸菌（E. coli）フィターゼである。

あるいはフィターゼはブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ、例えば、ブティアウクセラ（Buttiauxella）アグレスティスフィターゼであってよく、このフィターゼは国際公開第２００６／０４３１７８号、同第２００８／０９７６１９号、同第２００９／１２９４８９号、同第２００８／０９２９０１号、ＰＣＴ／米国特許第２００９／４１０１１号、ＰＣＴ／ＩＢ第２０１０／０５１８０４号に教示される。これらの開示の各々は参照により本案件に組み込まれる。

一実施形態では、フィターゼは、ハフニア（Hafnia）由来の、例えば、米国特許第２００８２６３６８８号（この開示は参照により本案件に組み込まれる）に教示のハフニア（Hafnia）・アルベイ由来のフィターゼであってよい。

一実施形態では、フィターゼは、アスペルギルス（Aspergillus）属由来の、例えばコウジカビ（Aspergillus oryzae）由来のフィターゼであってよい。

一実施形態では、フィターゼはアオカビ属（Penicillium）由来の、例えば、ペニシリウム（Penicillium）・フニクロサム由来のフィターゼであってよい。

好ましくは、フィターゼは、家畜飼料中に、約２００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約３００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約７５０ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）、より好ましくは約４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜約５００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）の範囲で含有される。

一実施形態では、フィターゼは、家畜飼料中に、約２００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約３００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超、好適には約４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）超で含有される。

一実施形態では、フィターゼは、家畜用飼料中に、約１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）未満、好適には約７５０ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）未満で含有される。

好ましくは、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約４０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、より好ましくは約８０ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約２０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約１００ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）、及び更により好ましくは約２００ＦＴＵ／組成物（ｇ）〜約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）の範囲で含有される。

一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約６０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１００ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約１５０ＦＴＵ／組成物（ｇ）超、好適には約２００ＦＴＵ／組成物（ｇ）超で含有される。

一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約４０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約２０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１５，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満、好適には約１０，０００ＦＴＵ／組成物（ｇ）未満で含有される。

１ＦＴＵ（フィターゼ単位）は、ＩＳＯ ２００９フィターゼアッセイ−すなわち、国際標準ＩＳＯ／ＤＩＳ ３００２４：１〜１７，２００９に見られる、フィターゼ活性及び１ＦＴＵを定量するための標準アッセイ−に定義される反応条件下で、基質から１分あたり１μｍｏｌの無機オルトリン酸を放出させるのに必要とされる酵素量であることは理解されるであろう。

一実施形態では、酵素は好適には上記のＥ．Ｃ．分類法により分類され、かつ１ＦＴＵを定量するために本明細書において教示されるアッセイにおいて試験した場合に活性を有する酵素は、このＥ．Ｃ．分類法により命名される。

利点
ＤＦＭと酵素の相互作用は複雑であり、理論に束縛されることは望ましくないが、驚くべきことに、対象とする動物の壊死性腸炎に対する抵抗性の改善が認められ、例えば、病変スコアの減少が認められる。本発明以前には、ＤＦＭと酵素（例えば本明細書に教示のもの）との組み合わせは、この特定の目的に関しては教示されていない。

本発明の利点の一つは、本発明に従う飼料添加用組成物は、壊死性腸炎の悪影響を回避することができ、すなわち壊死性腸炎に対する対象の抵抗性を改善するために使用できるというものである。

理論に束縛されるものではないが、フィターゼは、穀類及びマメ科植物に含まれるリンの主な貯蔵形態であるフィチン酸の連続的な加水分解を触媒し、これに伴い無機リン酸を放出させて、ミオイノシトール誘導体のリン酸化の程度を低下させる。フィチン酸の加水分解により、腸内腔に対するアミノ酸の内因性の損失が減少することになる。腸において内因性のアミノ酸の損失が減少すると、微生物の増殖に利用され得る窒素が減少するため、ＤＦＭが持つ、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及びその他の病原菌に対する阻害活性が補助される。

理論に束縛されることを望むものではないが、プロテアーゼは、腸管において食物タンパク質を非特異的に加水分解し、様々なポリペプチドを生成する。動物類はタンパク質の加水分解を完了させ、アミノ酸などを吸収する。しかしながら、腸内の病原菌に曝露させた場合、病原菌は、空腸及び回腸内腔においてペプチド効率の高さを巧みに利用する。ＤＦＭは、例えば、Ｎ供給源について競合することで、並びに直接阻害することで、腸管病原性の増殖を阻害する。

驚くべきことに、これらの酵素とＤＦＭとを組み合わせることで、それ以外のＤＦＭと酵素との組み合わせ及び／又はＤＦＭ単独及び／又は酵素単独の場合と比較して、病原菌の減少性及び／又は壊死性腸炎に対する抵抗性が非常に向上する。

ＤＦＭと酵素の処方
ＤＦＭと酵素は、活性ＤＦＭと活性酵素とを処方に確実に含有させるのに好適な方法で処方できる。

一実施形態では、ＤＦＭと酵素は液体、乾燥粉末、又は顆粒として処方され得る。

乾燥粉末又は顆粒は、トップスプレー式流動床コーター、ボトムスプレー式Ｗｕｒｓｔｅｒコーター又はドラム式造粒（例えば、高せん断造粒）、押出、パンコーティング又はマイクロミキサなど、当業者に既知の手法により製造できる。

一部の実施形態ではＤＦＭ及び／又は酵素は被覆してよく、例えば、カプセル封入してよい。好適には、ＤＦＭと酵素は同一の被覆内に配合してよく又は同一のカプセル内にカプセル封入してよい。あるいは、いずれか又は両方の酵素を同一の被覆内に配合してもよく、あるいは同一のカプセル内にカプセル封入してもよく、かつＤＦＭは、いずれかの又は両方の酵素とは別にして被覆中に配合することもできる。ＤＦＭが芽胞を産生し得る一部の実施形態では、ＤＦＭには何ら被覆を行わなくてもよい場合もある。このような状況では、ＤＦＭの芽胞は、いずれか又は両方の酵素と単純に混合してもよい。後者の場合、酵素を被覆してもよく、例えば、カプセル封入してもよく、例としては、いずれか又は両方の酵素を被覆してもよく、例えばカプセル封入してもよい。酵素は酵素の混合物（すなわち、いずれか又は両方の酵素の混合物）としてカプセル封入することができ、あるいは酵素は別個に、例えば、単一の酵素としてカプセル封入することもできる。一部の好ましい実施形態では、両方の酵素を一緒に被覆してよく、例えば、一緒にカプセル封入してよい。

一実施形態では、被覆は熱から酵素を保護し、熱保護材としてみなすことができる。

一実施形態では、飼料添加用組成物は、国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）又は同第１９９７／０１６０７６号又は同第１９９２／０１２６４５号（これらの各々が参照により本案件に組み込まれる）に記載の通り、乾燥粉末又は顆粒剤中に配合される。

一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、活性剤、及び少なくとも１つの被覆を含む飼料組成物用の顆粒として配合されてよく、顆粒に含まれる活性剤は、ａ）飼料のペレット加工、ｂ）蒸気加熱による飼料の前処理加工）、ｃ）貯蔵、ｄ）ペレット加工していない混合物としての材料の貯蔵、及びｅ）微量元素、有機酸、還元糖、ビタミン、塩化コリン、及び化合物から選択される少なくとも１種の化合物を含む飼料ベースミックス又は飼料プレミックスとしての成分の貯蔵、のうちの１つ以上から選択される条件で処理した後に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％の活性を保持する。

顆粒に関しては、少なくとも１つのコーティングは加水分解材料を含み得る。この材料は顆粒の少なくとも５５重量％を構成し、及び／又は少なくとも１つのコーティングは２つのコーティングを含み得る。２つのコーティングは、湿分水和コーティングと防湿コーティングであってもよい。一部の実施形態では、水和コーティングは顆粒の２５重量％〜６０重量％であってよく、防湿コーティングは顆粒の２重量％〜１５重量％であってよい。湿分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプン、及びマルトデキストリンから選択されてよく、かつ防湿コーティングは、ポリマー、ガム、乳清、及びデンプンから選択されてよい。

顆粒は、飼料のペレット加工により製造してよく、飼料の前処理加工は、７０℃〜９５℃で、例えば８５℃〜９５℃で最大で数分間実施してよい。

一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、貯蔵後及び顆粒が材料となる蒸気加熱ペレット加工後に活性を少なくとも８０％保持している活性剤、防湿コーティング、及び顆粒の少なくとも２５重量％の加水分解コーティング、蒸気加熱ペレット加工前の水分活性が０．５未満である顆粒、を含む、動物飼料用の顆粒に配合することができる。

顆粒はポリマー及びガムから選択される防湿コーティングを有してよく、加水分解材料は無機塩であってよい。加水分解コーティングは顆粒の２５重量％〜４５重量％であってよく、防湿コーティングは顆粒の２重量％〜１０重量％であってよい。

顆粒は、蒸気加熱ペレット加工により製造することができ、このペレット加工は８５℃〜９５℃で最大で数分間実施することができる。

一部の実施例では、粉末澱粉、又は石灰石などの希釈剤を用いて、ＤＦＭ（例えば、ＤＦＭの芽胞）を希釈してもよい。

一実施形態では、組成物は消費に好適な液体配合物であり、好ましくは、緩衝材、塩、ソルビトール、及び／又はグリセロールのうちの１つ以上を含有する液体組成物などである。

他の実施形態では、飼料添加用組成物は、塗布により、例えば、酵素の担体基材、例えば粉末小麦などへの噴霧により配合することができる。

一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、プレミックスとして配合され得る。例えば、プレミックスは１種以上の飼料成分、例えば、１種以上のミネラル及び／又は１種以上のビタミンを含み得る。

一実施形態では、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、マルトデキストリン、石灰岩（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、小麦又は小麦成分、スクロース、デンプン、Ｎａ_２ＳＯ_４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩（sorbiate）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１種の生理学的に許容できる担体とともに配合される。

パッケージング
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は家畜飼料はパッケージ化される。

一実施形態では、飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は家畜飼料は、袋、例えば紙袋によりパッケージ化される。

代替的な実施形態では、飼料添加用組成物及び／又はプレミックス及び／又は飼料又は家畜飼料は、容器内に、密閉され得る。任意の好適な容器を使用できる。

飼料
本発明の飼料添加用組成物は、飼料として、又は飼料の調製に使用できる。

本明細書において、用語「飼料」は、「家畜飼料」と同義に使用される。

飼料は、使用及び／又は適用態様及び／又は投与態様に応じ、液体又は固体形態であり得る。

飼料として使用する際、又はサンプルの調製に使用する際、本発明の組成物は、次の：栄養学的に許容できる担体、栄養学的に許容できる希釈剤、栄養学的に許容できる賦形剤、栄養学的に許容できる補助剤、栄養学的有効成分のうちの１つ以上と組み合わせて使用できる。

好ましい実施形態では、本発明の飼料添加用組成物を飼料成分と混合して家畜飼料を製造する。

本明細書で使用するとき、用語「飼料成分」は、家畜飼料の全て又は一部を意味する。「家畜飼料の一部」は、家畜飼料に含まれる成分のうちの１つ、あるいは家畜飼料に含まれる成分のうちの１つ以上、例えば、２、又は３、又は４を意味し得る。一実施形態では、用語「飼料成分」は、プレミックス又はプレミックス成分を包含する。

好ましくは、飼料は、飼い葉又はそれらの混合物、配合飼料又はそれらのプレミックスであり得る。一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、配合飼料又は配合飼料成分と混合してよく、あるいは配合飼料のプレミックス、又は飼い葉、飼い葉成分、若しくは飼い葉プレミックスと混合してよい。

本明細書で使用するとき、用語「飼い葉」は、動物に提供される（動物がそれを求めて探しまわるというものではない）任意の食物を意味する。飼い葉は、裁断済みの植物を包含する。

用語「飼い葉」には、干し草、わら、貯蔵牧草、圧縮及びペレット化飼料、油及び混合飼料、並びに同様に発芽穀類及びマメ科植物が包含される。

飼い葉は次の植物：アルファルファ（ルーサン）、大麦、シャジクソウ（birdsfoot trefoil）、アブラナ属、シャウ・モエラー（Chau moellier）、ケール、菜種（キャノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、カブ、ツメクサ、タチオランダゲンゲ、ムラサキツメクサ、サブタレニアンクローバー、シロツメクサ、イネ科草本、偽エンバク（false oat grass）、ウシノケグサ、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、ヒース・グラス（heath grass）、牧草（牧草地および草原の草が自然と混ぜ合わされたもの）、カモガヤ、ホソムギ、オオアワガエリ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、アワ、エンバク、サトウモロコシ、大豆、樹木（まぐさ用に刈り込まれた枝葉）、小麦、及びマメ科植物のうちの１種以上から得られる。

用語「配合飼料」は、粉末、ペレット、ナッツ、ケーキ、又はクランブルの形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、各種原材料及び添加剤を配合したものであってよい。これらの配合物は、対象とする動物に対する具体的な必要量に従って配合される。

配合飼料は、１日に必要とされる栄養分をすべて提供する完全飼料、配給食の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃厚飼料、又はミネラル及びビタミンなどのその他の微量栄養素のみを提供する栄養補助食品であってよい。

配合飼料には、トウモロコシ、大豆、サトウモロコシ、エンバク、及び大麦などの飼料用穀類が主成分として使用される。

本明細書で記載される通りに好適なプレミックスは、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵産物、及びその他の必須成分などの微量成分からなる組成物であり得る。一般的に、プレミックスは、市販のに配合するのに好適な組成物である。

本発明の任意の家畜飼料は、ａ）シリアル類、例えば、小粒の穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、及びこれらの組み合わせ）、及び／又は大粒の穀物（例えば、トウモロコシ又はサトウモロコシなど）など、ｂ）シリアル類を原料とする製品、例えば、コーングルテンミール、トウモロコシ等の穀物からアルコールを作成した後の蒸留粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート（wheat shorts）、米ぬか、もみ殻、エンバクのもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプ、ｃ）タンパク質類、例えば、大豆、ヒマワリ、落花生、ルピナス、エンドウ豆、ソラマメ、綿、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質など、ｄ）油類及び脂肪類、例えば、植物資源及び動物資源から得られる油類及び脂肪類、ｅ）ミネラル類及びビタミン類、からなる群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。

本発明の家畜飼料は、トウモロコシ及び大豆ミール、又はトウモロコシ及び高脂肪分大豆又は小麦ミール又はヒマワリミールを、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも６０重量％含有し得る。

これに加え、又はこれに代替して、本発明の家畜飼料には、少なくとも１種の高繊維飼料材料及び／又は少なくとも１種の高繊維飼料材料の少なくとも１種の副産物を含有させて、動物用高繊維飼料を提供することもできる。高繊維飼料材料の例としては、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、穀類由来の副産物、例えば、コーングルテンミール、トウモロコシ等の穀物からアルコールを作成した後の蒸留粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート、コメヌカ、もみ殻、エンバクのもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプが挙げられる。一部のタンパク質資源：ヒマワリ、ルピナス、ソラマメ、及び綿などの資源から得られたタンパク質も、高繊維であるとみなすことができる。

本発明では、飼料は、次：ペレット、ナッツ又は（ウシ用）ケーキなどの配合飼料及びプレミックス、農作物又は農作物廃棄物：トウモロコシ、大豆、サトウモロコシ、エンバク、大麦、トウモロコシ茎葉、コプラ、麦わら、まぐさ、サトウダイコン廃棄物；魚粉；刈りたての牧草類及びその他の飼料用植物；肉骨粉飼料；糖蜜；油かす及び圧搾ケーキ；オリゴ糖；保存加工した飼料植物：まぐさ及び貯蔵牧草；海草；全粒の又は圧砕、製粉などを施した種子及び穀類；発芽粒及び豆類；酵母エキスのうちの１つ以上であり得る。

本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、ペットフードも包含する。ペットフードは、ドッグフード又はキャットフードなど、ペットによる消費が意図された植物性又は動物性物質である。ドッグフード及びキャットフードなどのペットフードは、犬用キブルなどの乾燥形態、又はウェットタイプの缶詰のいずれかであってもよい。キャットフードには、アミノ酸のタウリンを含有させてもよい。

本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、魚用飼料も、包含する。一般的に、魚用飼料は、飼育している魚の健康を良好に保つのに必要とされる多量栄養素、微量栄養素、及びビタミンを含有している。魚用飼料は、フレーク、顆粒、又は錠剤形態で有り得る。顆粒形態の飼料のうち、一部の迅速に沈降する飼料は、多くの場合、大型の魚又は水槽底部で生活する魚に使用される。一部の魚用飼料は、観賞魚の発色を人工的に改良する目的で、βカロテン又は性ホルモンなどの添加剤も含有する。

本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、鳥用飼料も包含する。鳥用飼料には、バードフィーダーに用いられるもの及びペットの鳥に給餌するためのものの両方のサンプルが包含される。典型的な鳥用サンプルは多様な種子から構成されるが、獣脂（牛脂又は羊脂）を含有させてもよい。

本明細書で使用するとき、用語「接触」は、本発明の組成物が間接的に又は直接的に製品（例えば、飼料）に適用されていることを意味する。使用することのできる本開示の適用例としては、限定するものではないが、飼料添加用組成物を材料として含む製品を処理する工程、飼料添加用組成物を製品と混合して直接適用する工程、飼料添加用組成物を製品表面に噴霧する工程、又は製品を飼料添加用組成物の調合液に浸漬する工程、が挙げられる。

一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、好ましくは製品（例えば、家畜飼料）と混合させる。別の方法としては、飼料添加用組成物は、家畜飼料の乳濁液又は原材料に含有させてもよい。

一部の用途に関しては、組成物を作用させる／組成物で処理する製品表面上に又は表面に対して利用可能であるように、組成物を製造することが重要である。これにより、組成物に次の望ましい特性：性能利益のうちの１つ以上を付与する。

本発明の飼料添加用組成物は、ＤＦＭ及び酵素の量を調整して、製品（例えば、家畜飼料、又は家畜飼料の原材料）に点在、被覆、及び／又は含浸させることができる。

ＤＦＭ及び酵素は、同時に（例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも）、又は連続的に（例えば、これらを別の経路により送達した場合）使用できる。一実施形態では、好ましくはＤＦＭと酵素は同時に適用する。好ましくは、ＤＦＭと酵素は、家畜飼料への送達前に、又は家畜飼料の原材料への送達前に混合させる。

本発明の飼料添加用組成物に含まれるＤＦＭは、好適な濃度で添加でき、例えば、最終的な飼料製品中で、日用量あたり約２×１０^５ＣＦＵ〜約２×１０^１１ＣＦＵ、好適には約２×１０^６〜約１×１０^１０、好適には約３．７５×１０^７ＣＦＵ〜約１×１０^１０ＣＦＵの濃度になるよう添加できる。

好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、約７０℃、約８５℃、又は約９５℃までの熱処理に対して熱安定性である。熱処理は、最大で約１分、約５分、約１０分、約３０分、約６０分まで実施することができる。用語「熱安定性」は、特定温度への加熱前に添加剤中に存在した／添加剤中で活性であった酵素成分及び／又はＤＦＭのうちの少なくとも約７５％が、室温への冷却後も存在する／活性であることを意味する。好ましくは、特定温度への加熱前に添加剤中に存在しかつ活性であった酵素成分及び／又はＤＦＭのうちの少なくとも約８０％が、室温への冷却後も存在しかつ活性である。

特に好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を均質化させて、粉末を製造する。

代替的な好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）に記載のとおりに顆粒に配合する。

他の好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を顆粒に配合する場合、顆粒は、タンパク質コアを被覆する加水分解水塩コーティングを含む。このような塩コーティングには、熱耐性の向上、貯蔵安定性の向上、及びそのままでは酵素及び／又はＤＦＭに対し悪影響を及ぼすその他の飼料添加物からの保護、という利点がある。

好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、２０℃下で、６０％超の一定湿度と、０．２５超の水分活性とを有する。

好ましくは、塩コーティングは、Ｎａ_２ＳＯ_４を含む。

飼料添加用組成物の製造法は、更に、粉末をペレット化する工程も含み得る。粉末は、当該技術分野において知られているその他の成分と混合させることもできる。粉末、又は粉末を含む混合物にダイを通過させ、得られたストランドを、望ましい長さで好適なペレットに切断する。

任意に、ペレット化工程は、ペレットの製造前に蒸気処理、又は調整工程を包含し得る。粉末を含む混合物は、調整槽に、例えば、蒸気噴射装置を備えるミキサに入れることができる。混合物を調整槽内で規定の温度まで、例えば６０〜１００℃に加熱する。典型的な加熱温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃である滞留時間は、例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び１時間などのように、秒単位から分単位、及び更には時間単位で変化させることができる。

本発明の飼料添加用組成物は、任意の適切な飼料材料に添加するのに好適であることは理解されるであろう。

本明細書で使用するとき、用語「飼料材料」は、動物により消費されている基本的な飼料材料を意味する。飼料材料には、例えば、少なくとも１種以上の未加工の穀類、及び／又は加工植物、及び／又は大豆ミール又は骨粉などの動物性材料が含まれ得ることは更に理解されるであろう。

本明細書で使用するとき、用語「家畜飼料」は、１種以上の飼料添加組成物が添加されている飼料材料を意味する。

異なる動物種は異なる家畜飼料を必要とすること、並びに同種の動物であってさえも、動物の飼育目的に応じ、異なる家畜飼料を必要とする場合があることは、当業者により理解されるであろう。

好ましくは、家畜飼料は、トウモロコシ（ｍａｉｚｅすなわちｃｏｒｎ）、小麦、大麦、ライ小麦、米、タピオカ、サトウモロコシ、及び／又は任意の副産物、並びに大豆ミール、ナタネ粕、セイヨウアブラナ粕、綿実粕、ヒマワリ種子粕、動物性残渣、及びこれらの混合物などの高タンパク質成分を含むサンプル材料を含み得る。より好ましくは、動物用サンプルは、動物性脂肪及び／又は植物油を含み得る。

場合により、動物用サンプルには、カルシウムなどの追加のミネラル、及び／又は追加のビタミン類を含有させることもできる。

好ましくは、家畜飼料は、トウモロコシ／大豆ミール混合物である。

一実施形態では、好ましくは、飼料はペットフードではない。

他の態様では、家畜飼料の製造方法を提供する。家畜飼料は、典型的には、最初に原材料を安定な粒経に挽き、次に適切な添加剤と混合する。次に、家畜飼料を水で溶くか、又はペレット化することができる。後者の場合、典型的には、目的とする高さまで温度を上昇させ、次に飼料をダイに通過させて、特定の大きさのペレットを製造する手法を包含する。ペレットを冷却させる。続いて、脂肪、及び酵素などの液性添加物を添加してもよい。家畜飼料の製造には、特に、少なくとも蒸気の使用を包含し得る適切な技術により、ペレット化の前に押し出し又は膨張させることを含む、追加工程を包含させてもよい。

家畜飼料は、家禽（例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラ種鶏、七面鳥、鴨、ガチョウ、水鳥）、ブタ（全年齢種）、ペット（例えば、イヌ類、ネコ類）、又は魚などの単胃動物用の家畜飼料であってよく、好ましくは、家畜飼料は鶏肉用である。

一実施形態では、家畜飼料は産卵鶏用のものではない。

ほんの一例として、鶏、例えば、ブロイラー用の鶏用動物飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される齢％で含み得る。

ほんの一例として、ブロイラーなどの鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。

ほんの一例として、産卵鶏用飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される齢％で含み得る。

ほんの一例として、産卵鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。

ほんの一例として、七面鳥用飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される齢％で含み得る。

ほんの一例として、七面鳥用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。

ほんの一例として、子豚用の飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される齢％で含み得る。

ほんの一例として、子豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。

ほんの一例として、成豚／出荷豚用の飼料は、下表に掲載される１種以上の成分を、下表に掲載される齢％で含み得る。

ほんの一例として、成豚／出荷豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。

形態
本発明の飼料添加用組成物、及び他の成分及び／又は他の成分を含む家畜飼料は、任意の好適な形態で使用できる。

本発明の飼料添加用組成物は、固体又は液体調製物の形態で、又はこれらの代替形態で使用できる。固体調製物例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、カプセル、ペレット、タブレット、細粉、及び可溶性のもの、噴霧乾燥させたもの、又は凍結乾燥させものであり得る顆粒が挙げられる。液体調製物例としては、限定するものではないが、水溶液、有機溶液、又は有機溶媒水溶液、懸濁液、及び乳濁液が挙げられる。

一部の用途では、本発明のＤＦＭ又は飼料添加用組成物は、飼料と混合してもよく、又は飲用水に投与してもよい。一実施形態では、水に含有させる際の投与範囲は、約１×１０^３ＣＦＵ／動物／日〜約１×１０^１０ＣＦＵ／動物／日、及びより好ましくは約１×１０^７ＣＦＵ／動物／日である。

好適な形態例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、ペレット、タブレット、丸剤、カプセル、腔坐剤、溶液又は懸濁液のうちの１つ以上が挙げられ、これらには、即効性、徐放性、修飾性（modified-）、持続性、周期性、拍動性、又は放出制御性投与用の着香剤又は着色剤を含有させることもできる。

例えば、本発明の組成物を固体形態、例えば、ペレット形態で使用する場合、組成物には、賦形剤（例えば、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム及びグリジンなど）、崩壊剤（例えば、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ポテト、又はタピオカ澱粉）、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の珪酸塩複合体など）、造粒結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルク）のうちの一種以上を含有させることもできる。

成形の際に使用するにあたって栄養学的に許容できる担体例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペトロエトラル脂肪酸エステル（petroethral fatty acid esters）、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

成形に好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。

水懸濁液及び／又はエリキシル剤の場合には、本発明の組成物は、各種甘味料又は着香料、着色剤又は染料、乳化剤及び／又は懸濁剤、並びに希釈剤（例えば、水、プロピレングリコール及びグリセリン、及びこれらの組み合わせ）と組み合わせることができる。

多くの場合、非吸湿性乳清は、ＤＦＭ用（特に、微生物系ＤＦＭ）の担体として使用され、ＤＦＭの増殖開始に良好な培地である。

ペーストを含有している微生物系のＤＦＭは、植物油及び不活性なゲル化材料と配合することもできる。

真菌製品を、担体としての穀類副産物と配合することもできる。

一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、国際公開第２００５／１２３０３４号に教示される微小粒子などの微小粒子系の形態ではない。

投与
本発明のＤＦＭ及び／又は飼料添加用組成物は、単回投与用に設計することができ、又は日単位での供給を目的として設計することもできる。

本発明と組み合わせて使用する組成物（及び組成物に含まれる各成分）の最適量は、処理する製品、及び／又は組成物を製品に接触させる方法、及び／又は製品の使用目的に応じて異なる。

組成物に使用するＤＦＭ及び酵素の量は、有効性を得るために、及びかかる組成物を含有している飼料の給餌を受けた動物の性能を向上させるのに十分な有効性を保持させるために、十分な量でなくてはならない。このような有効時間の長さは、少なくとも製品（例えば、飼料添加用組成物、又は飼料添加用組成物を含有している飼料）が利用される時間だけ延長させるべきである。

飼料に含まれるＤＦＭ対各酵素の比は、下記範囲で有り得る：
ＤＦＭ：フィターゼ（ＣＦＵ／ＦＴＵ）；５．０×１０^２ＣＦＵ ＤＦＭ：１ＦＴＵ酵素〜５．０×１０^９ＣＦＵ：１ＦＴＵ酵素、好ましくは７．５×１０^４ＣＦＵ ＤＦＭ：１ＦＴＵ酵素〜２．５×１０^７ＣＦＵ：１ＦＴＵ酵素の範囲。

ＤＦＭ：プロテアーゼ（ＣＦＵ／ＰＵ）；５．０×１０^１ＣＦＵ ＤＦＭ：１ＰＵ酵素〜１．０×１０^９ＣＦＵ：１ＰＵ酵素、好ましくは１．２５×１０^４ＣＦＵ ＤＦＭ：１ＰＵ酵素〜５．０×１０^６ＣＦＵ：１ＰＵ酵素の範囲。

一実施形態では、好ましくは、家畜飼料は次のものを含む：
少なくとも４０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）のプロテアーゼ；
フィターゼを少なくとも５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、並びに
Ｅｎｖｉｖｏ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を少なくとも７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。

一実施形態では、好ましくは、家畜飼料は次のものを含む：
プロテアーゼを４０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖｏ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。

一実施形態では、好ましくは、家畜飼料は次のものを含む：
プロテアーゼを５０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
フィターゼを６２５ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）；及び
Ｅｎｖｉｖｏ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。

他の実施形態では、家畜飼料は、次のものを含む：
プロテアーゼを２０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖｏ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を３７，５００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。

好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、次の通りに、家畜飼料に投与するのに十分な量の酵素及びＤＦＭを含む：
プロテアーゼを４０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖｏ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜１５０，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。

好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、次の通りに、家畜飼料に投与するのに十分な量の酵素及びＤＦＭを含む：
プロテアーゼを２０００ＰＵ／ｋｇ（飼料）；
フィターゼを５００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）、及び
Ｅｎｖｉｖｏ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）を３７，５００ＣＦＵ／ｇ（飼料）〜７５，０００ＣＦＵ／ｇ（飼料）。

他の成分との組み合わせ
本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び酵素は、他の成分と組み合わせて使用できる。したがって、本発明は、組み合わせにも関係する。ＤＦＭをプロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせたものを、本明細書では「本発明の飼料添加用組成物」として参照する。

本発明の組み合わせは、本発明の飼料添加用組成物（又はこれらの構成成分の１種以上）と、動物による消費に好適でありかつ消費者に薬用効果又は生理学的効果を提供し得る他の成分と、を含む。

一実施形態では、好ましくは「他の成分」は、更なる酵素又は更なるＤＦＭではない。

成分はプレバイオティクスであってもよい。典型的には、プレバイオティクスは、難消化性糖質（オリゴ糖類又は多糖類）、又は糖アルコールであり、上部消化管内では分解されず、すなわち吸収されない。市販品として用いられており、本発明に有用である既知のプレバイオティクスとしては、イヌリン（フラクトオリゴ糖、又はＦＯＳ）、及びトランス型ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ又はＴＯＳ）が挙げられる。好適なプレバイオティクスとしては、パラチノースオリゴ糖、大豆オリゴ糖、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、難消化性デンプン、ラクトスクロース（lactosaccharose）、ラクツロース、ラクチトール、マルチトール、マルトデキストリン、ポリデキストロース（すなわち、Ｌｉｔｅｓｓｅ（登録商標））、ラクチトール、ラクトスクロース（lactosucrose）、大豆オリゴ糖、パラチノース、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖及びキシロオリゴ糖、ペクチン断片、食物繊維、マンナンオリゴ糖が挙げられる。

食物繊維としては、非デンプン性多糖類、例えば、アラビノキシラン、セルロース、及びその他の多くの植物成分、例えば、難消化性デキストリン、イヌリン、リグニン、ワックス、キチン、ペクチン、β−グルカン、及びオリゴ糖が挙げられる。

一実施形態では、本発明は、本発明の飼料添加用組成物（又は飼料添加用組成物の１種以上の成分）と、プレバイオティクスとの組み合わせに関する。他の実施形態では、本発明は、ＤＦＭと、フィターゼ、プロテアーゼ、及びプレバイオティクスとを組み合わせて含む（又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる）飼料添加用組成物に関する。

プレバイオティクスは、本発明の飼料添加用組成物（又はこれらの成分）と同時に（例えば、一緒に混合することにより、又は同一の若しくは異なる経路により送達することにより同時に）、又は連続的に（例えば、同一の若しくは異なる経路により送達することにより連続的に）投与することができる。

本発明の組み合わせの他の成分としては、ポリデキストロース、例えば、Ｌｉｔｅｓｓｅ（登録商標）、及び／又はマルトデキストリン、及び／又はラクチトールが挙げられる。場合によりこれらのその他の成分を飼料添加用組成物に添加することで、乾燥加工を補助し、かつＤＦＭの生存を助けることもできる。

他の好適な成分の更なる例としては、次の：増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤、甘味剤（人口甘味剤を包含する）、レオロジー改質剤、安定化剤、抗酸化剤、染料、酵素、担体、賦形剤、添加剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、懸濁剤、崩壊剤、造粒結合剤などが挙げられる。これらのその他の成分は天然素材であってもよい。これらのその他の成分は化学的手法及び／又は酵素的手法を用い調製してもよい。

一実施形態では、ＤＦＭ及び／又は酵素はカプセル封入することができる。一実施形態では、飼料添加用組成物、及び／又はＤＦＭ、及び／又は酵素は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号（ＴＰＴ顆粒剤と呼ばれる）に記載される通りの乾燥粉末又は顆粒として配合される。

一実施形態では、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、１種以上の脂質と組み合わせて使用することもできる。

例えば、本発明での使用を目的としたＤＦＭ及び／又は酵素は、１種以上の脂質ミセルと組み合わせて使用することもできる。脂質ミセルは、単純脂質ミセル又は脂質ミセル複合体であってよい。

脂質ミセルは、脂質及び／又は油などの配向性両親媒性分子の集合体であってよい。

本明細書で使用するとき、用語「増粘剤又はゲル化剤」は、不混和性の液体の液滴、空気、又は不溶性固体のうちのいずれかの粒子の移動を緩慢にさせるか又は予防することにより、分離を防ぐ製品を指す。個々の水和分子の粘性が上昇し、分離が緩慢になった場合に、増粘がもたらされる。水和分子が結合して３次元ネットワークを形成し、粒子を捕捉し不動化させた場合に、ゲル化がもたらされる。

本明細書で使用するとき、用語、「安定化剤」は、経時変化から製品（例えば、食品）を保護する成分又は成分の組み合わせとして定義される。

本明細書で使用するとき、用語「乳化剤」は、エマルションの分離を予防する成分（例えば、食品成分）を指す。エマルションは、２種の不混和性の物質のうちの他方が液滴形態で存在し、他方に含有されている状態を指す。エマルションは、水中油型（油が液滴又は分散相となり、水が連続相となる）、又は油中水型（水が分散相となり、油が連続相となる）で構成される場合がある。液中気体の状態である発泡体、及び液中固体の状態である懸濁液も、乳化剤を使用して安定化させることができる。

本明細書で使用するとき、用語「結合剤」は、物理的又は化学的反応により製品を互いに結合させる成分（例えば、飼料成分）を指す。例えば、「ゲル化」中に水が吸収されることで、結合効果が得られる。しかしながら、結合剤は、油などの他の液体を吸収し、製品中に保持する場合もある。典型的には、本発明の文脈において、結合剤は、例えば、焼成製品、ペストリー、ドーナッツ、及びパンなどの、固体又は低湿分製品に使用されることになる。

「担体」又は「賦形剤」は、ＤＦＭ及び／又は酵素の投与に好適な材料を意味し、このような材料としては、例えば、当該技術分野で知られている任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、又は可溶化剤などの任意の材料が挙げられる。これらの材料は、非毒性であり、かつ組成物に関係する任意の成分と有害な様式で相互作用しない。

本発明は、ＤＦＭ、フィターゼ及びプロテアーゼを、少なくとも１種のマルトデキストリン、石灰岩（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ_２ＳＯ_４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩（sorbiate）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ブドウ糖、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１種の生理学的に許容できる担体と混合する工程を含む、飼料添加用組成物の製造方法を提供する。

賦形剤の例としては：微結晶セルロース及びその他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム、グリジン、デンプン、乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールのうちの１種以上が挙げられる。

崩壊剤の例としては：デンプン（好ましくはトウモロコシ、ポテト、又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の珪酸塩複合体のうちの１種以上が挙げられる。

造粒結合剤の例としては：ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチン、及びアカシアのうちの１種以上が挙げられる。

滑沢剤の例としては：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルクのうちの１種以上が挙げられる。

希釈剤の例としては：水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上が挙げられる。

他の成分は、同時に（例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも）、又は連続的に（例えば、これらを別の経路により送達した場合）使用できる。

好ましくは、本発明の飼料添加用組成物を他の成分と混合した場合にもＤＦＭは生存活性を保持する。

一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物はクロム又は有機クロムを含まない。

一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はグルカナーゼを含有しない。

一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はソルビン酸を含有しない。

濃縮物
本発明での使用を目的としたＤＦＭは、濃縮物の形態であってもよい。典型的には、これらの濃縮物は、実質的に高濃度のＤＦＭを含む。

本発明の飼料添加用組成物には、生菌成分（コロニー形成単位、ＣＦＵ）を含ませることができ、含有量は、少なくとも１０^４ＣＦＵ／ｇ（好適には、少なくとも１０^５ＣＦＵ／ｇ、例えば、少なくとも１０^６ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０^７ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０^８ＣＦＵ／ｇ）〜約１０^１０ＣＦＵ／ｇ（又は更には約１０^１１ＣＦＵ／ｇ若しくは約１０^１２ＣＦＵ／ｇ）の範囲である。

ＤＦＭが濃縮物の形態である場合、本発明の飼料添加用組成物には少なくとも１０^９ＣＦＵ／ｇ〜約１０^１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは少なくとも１０^１０ＣＦＵ／ｇ〜約１０^１２ＣＦＵ／ｇの範囲で生菌を含ませることができる。

濃縮形態の粉末、顆粒及び液体組成物を水で希釈するか、あるいは水又はその他の好適な希釈剤（例えば、ミルク又はミネラル若しくは植物油などの好適な増殖培地）に再懸濁するかして、使用に際して組成物を用意することもできる。

本発明のＤＦＭ又は飼料添加用組成物、あるいは濃縮物形態の本発明の組み合わせは、当該技術分野で知られている手法により製造することができる。

本発明の一態様では、酵素又は飼料は、濃縮形態の組成物と接触している。

本発明の組成物は、当該技術分野で知られている手法により噴霧乾燥又は凍結乾燥させてもよい。

噴霧乾燥工程を用い粒子を製造するための典型的な加工法は、固体材料を適切な溶媒に溶解させること（例えば、発酵培地でのＤＦＭの培養）を伴う。別の方法としては、材料を非溶媒に懸濁又は乳化させて懸濁液又はエマルションを生成することもできる。場合により、この段階で、他の成分（上述のもの）、又は例えば、抗菌剤、安定化剤、染料、及び乾燥工程の助剤などの要素を添加してもよい。

次に溶液を霧化して、液滴の微細な霧を生成する。この液滴を直ちに乾燥チャンバに回収させ、ガスと接触させる。液滴から乾燥ガス中に溶媒を蒸発させ、液体を固化させることで、粒子を生成する。次に粒子を乾燥ガスから分離し、回収する。

対象
本明細書で使用するとき、用語「対象」は、本発明の飼料添加用組成物、又は本発明の飼料添加用組成物を含む家畜飼料を投与される、又は投与されている動物を意味する。

本明細書で使用するとき、用語「対象とする動物（subject）」は、動物（animal）を意味する。好ましくは、対象は、例えば、家畜類、又は家畜（例えば、ペット）などの哺乳類、家禽、魚類、又は甲殻類である。

一実施形態では、「対象」は家畜類である。

本明細書で使用するとき、用語「家畜類」は、任意の飼育動物を指す。好ましくは、家畜類は、雌牛又は雄牛（仔牛を含む）、家禽、豚（子豚を含む）、家禽（ブロイラー、鶏及び七面鳥を含む）、家禽、魚類（サーモン、タラ、トラウト及びコイ科の魚（例えば、鯉）などの淡水魚、並びに海産魚（例えば、シーバス）を含む）、甲殻類（エビ、イガイ、及びホタテ貝など）、馬（競走馬を含む）、羊（子羊を含む）のうちの１種以上である。

一実施形態では、用語家畜類及び／又は家禽及び／又は鶏には産卵鶏（egg layers）は包含されない。

他の実施形態では、「対象」は家畜又はペット又は動物園などの環境で飼育されている動物である。

本明細書で使用するとき、用語「家畜」又は「ペット」、又は「動物園などの環境で飼育されている動物」は、イヌ科の動物（例えば、犬）、ネコ科の動物（例えば、猫）、げっ歯目（例えば、モルモット、ラット、マウス）、家禽、魚類（淡水魚及び海産魚を含む）、並びに馬などの任意の関係性のある動物を指す。

一実施形態では、対象は腸内病原菌に曝露されている場合がある。

例えば、対象の胃腸又は消化管内には１種以上の腸内病原菌が存在している場合がある。例えば、対象の胃腸又は消化管内には１種以上腸内病原菌が次の程度存在している場合がある：
ｉ）動物の性能が低下する程度、及び／又は
ｉｉ）臨床的に意義のある程度、又は
ｉｉｉ）無症状の程度。

例えば、腸内病原菌はウェルシュ菌（Clostridium perfringens）であり得る。

性能
本明細書で使用するとき、「動物性能」は、飼料効率及び／又は動物の体重増加により、並びに／あるいは飼料効率により、並びに／あるいは飼料に含まれる栄養分の消化性（例えば、アミノ酸の可消化性）及び／又は飼料に含まれる可消化エネルギー又は代謝エネルギーにより、並びに／あるいは窒素保持により、並びに／あるいは動物が壊死性腸炎の悪影響を回避する能力により、並びに／あるいは対象とする動物の免疫応答性により決定することができる。

好ましくは「動物性能」は、飼料効率及び／又は動物の体重増加により、並びに／あるいは飼料効率により決定される。

「動物性能の向上」により、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用した場合に、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料と比較して、飼料効率の向上、及び／又は体重増加率の向上、及び／又は飼料効率の減少、及び／又は飼料に含まれる栄養分若しくはエネルギーの消化性の向上、及び／又は窒素保持の向上、及び／又は壊死性腸炎による悪影響を回避する能力の向上、及び／又は対象の免疫応答性の向上によるが得られることを意味する。

好ましくは、「動物性能の向上」により、飼料効率の向上及び／又は体重増加の上昇及び／又は飼料効率の減少が意味される。

本明細書で使用するとき、用語「飼料効率」は、一定期間の間、動物に飼料を適宜又は規定量で給餌した場合に生じる、体重増加の程度を指す。

「飼料効率の向上」は、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用することで、飼料取り込み単位あたりの体重増加率が、既存の飼料添加用組成物を使用した場合と比較して向上していることを意味する。

飼料要求率（ＦＣＲ）
本明細書で使用するとき、用語「飼料要求率」は、体重を特定量だけ増加させるために動物に給餌する飼料量を指す。

飼料要求率の向上は、飼料効率が低くなることを意味する。

「飼料要求率の低下」又は「飼料要求率の向上」は、飼料に飼料添加用組成物を使用した場合に、動物の体重を特定量だけ増加させるために動物に給餌する必要のある飼料量が、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料を同量使用した場合と比較して少なくなることを意味する。

栄養素可消化性能
本明細書で使用するとき、栄養素可消化性能は、胃腸管又は胃腸管の特定の分節（例えば、小腸）から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素可消化性能は、対象に投与した量と、対象の糞便に分泌された量、又は胃腸管の特定の分節、例えば回腸において消化物中に残存している量との差として測定することができる。

本明細書で使用するとき、栄養素可消化性能は、期間中の***物の総回収量を用いて、栄養素の摂取量と排出量の差から測定することができ、あるいは動物により吸収されず、かつ胃腸管又は胃腸管分節に入って消失した栄養素の量を研究者に算出させる不活性マーカーを用いることで、測定することができる。このような不活性マーカーとしては、二酸化チタン、酸化クロム、又は酸不溶性灰分が挙げられる。消化性は、飼料に含まれる栄養素の割合（％）として、又は飼料に含まれる栄養素の質量単位あたりの可消化養分の質量単位として、表すことができる。

本明細書で使用するとき、栄養素可消化性は、デンプン可消化性能、脂肪可消化性能、タンパク質可消化性能、及びアミノ酸の可消化性能を包含する。

本明細書で使用するとき、「エネルギー消化率」は、飼料に含まれる総エネルギーから糞便に含まれる総エネルギーを減じるか、あるいは消費された飼料に含まれる総エネルギーから動物の胃腸管の特定の分節、例えば回腸に残存している総エネルギーを減じるかしてだされた値を意味する。本明細書で使用するとき、「代謝エネルギー」は、見かけの代謝エネルギーを指し、消費された飼料に含まれる総エネルギーから、糞便、尿、及び消化に由来するガスに含まれる総エネルギーを減じた値を意味する。エネルギー消化率及び代謝エネルギーは、栄養素消化率の測定法と同様の方法を用い、飼料の代謝エネルギーを算出するために窒素排出について適切な補正を行って、摂取総エネルギーと、糞便に分泌された又は胃腸管の特定の分節に存在する消化物に残存する総エネルギーとの差として測定することができる。

窒素保持
本明細書で使用するとき、「窒素保持」は、対象とする動物が、食物由来の窒素を体重として保持する能力を意味する。窒素の排出が日常摂取量を超過した場合に負の窒素バランスが生じ、多くの場合、筋肉量の減少が見られる。正の窒素バランスは、多くの場合に筋肉の成長と関連付けられ、これは成長期の動物において顕著である。

窒素保持は、期間中の糞尿の総回収量を用いて、窒素摂取量と窒素排出量の差から測定することができる。窒素排出量には、飼料由来の未消化タンパク質、内因性のタンパク質性分泌物、微生物タンパク質、及び尿窒素が包含されることは理解されるであろう。

生存率
本明細書で使用するとき、用語「生存率」は、生存し続ける率を意味する。用語「生存率の向上」は、「致死率の低下」と言い換えることができる。

枝肉歩留まり及び精肉歩留まり
本明細書で使用するとき、用語「枝肉歩留まり」は、食肉処理に関係する商業工程又は試験工程後に得られる枝肉が生体重に占める割合を意味する。用語「枝肉」は、頭部、尾部、肢部、及び羽又は皮を取り除き食用に食肉処理された動物の肉体を意味する。本明細書で使用するとき、用語「精肉歩留まり」は、食肉が生体重に占める割合、あるいは特定の切り出し肉が生体重に占める割合を意味する。

体重増加
本発明は、更に、対象、例えば、家禽又はブタにおいて、体重増加率を増加させる方法を提供し、該方法は、本発明の飼料添加用組成物を含む家畜飼料を前記対象に給餌する工程を含む。

「体重増加率の増加」は、飼料添加用組成物を含む飼料の給餌を受けた動物の体重増加が、この飼料添加用組成物を含まない飼料の給餌を受けた動物の体重増加と比較して向上していることを指す。

壊死性腸炎
壊死性腸炎は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）により引き起こされる急性又は慢性の腸性毒血症であり、世界中の鶏、七面鳥、及びアヒルで観察されている。多くの場合、壊死性腸炎は、一般的に小腸中央部に生じる線維素壊死性腸炎により特徴づけられる。致死率は５〜５０％であり、一般的には１０％付近である。感染は、糞口感染により生じる。原因となる生物の胞子は非常に耐性が高い。素因としては、コクシジウム症（coccidiosis/coccidiasis）、食餌（高タンパク）が挙げられ、アヒルでは、極度のストレス、高粘度の食餌（多くの場合、食餌のライ麦及び小麦・含量が高いことに関係付けられる）、汚染された飼料及び／又は水、その他の衰弱を招く疾患などが因子となる可能性がある。

本発明は、壊死性腸炎に対する対象の耐性を向上させる工程に関する。換言すれば、本発明は、壊死性腸炎の悪影響を回避する又は減少させる工程に関する。

本明細書で使用するとき、用語「に対する耐性」は、用語「〜耐性」を包含し得る。したがって、一実施形態では、対象は、壊死性腸炎耐性でない場合にも壊死性腸炎耐性とされる場合があり、すなわち、対象の性能に悪影響が現れない場合などがそれに当てはまる。

一実施形態では、本発明は、対象において壊死性腸炎を処理又は予防するための、本発明の飼料添加用組成物に関する。通常、対象は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はエイメリア種を保有しているか、又はウェルシュ菌（Clostridium perfringens）及び／又はエイメリア種に対し曝露されている。このような曝露は、環境に起因するか、あるいは例えば、コクシジウム生ワクチンが使用された場合など、飼料若しくは飲用水に生菌が適用されたことに起因するものであり得る。

他の実施形態では、本発明は、対象とする動物においてコクシジウム症を予防及び／又は処置するための飼料添加用組成物に関する。

本発明は、壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症を予防及び／又は処置する方法を更に提供し、本方法では、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与する。

免疫応答
本明細書で使用するとき、免疫応答は、抗体産生の増加、細胞介在性免疫の上方制御、炎症促進性サイトカインの上方制御、及びｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の増強など、ＤＦＭが動物の免疫系を調節する複数の経路のうちの１つを意味する。ＤＦＭによる胃腸管の免疫賦活は疾患から宿主を保護するのに有益な場合があり、及び胃腸管の免疫抑制は、免疫機能の支持に使用される栄養素及びエネルギーがより少なくなることから、宿主に有益な場合があることは、理解されるであろう。

好ましくは、免疫応答は、細胞性免疫応答である。

好ましくは、免疫応答は、免疫マーカーの観察により測定される。

病原菌
本明細書で使用するとき、用語「病原菌」は、例えば、毒素産生性のクロストリジウム（Clostridium）属例えば、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、及び／又は大腸菌（E. coli）、及び／又は、サルモネラ菌種（Salmonella spp）、及び／又はカンピロバクター菌種（Campylobacter spp）を意味する。一実施形態では、病原菌は、トリ病原性大腸菌（E. coli）属をであり得る。

本発明は、対象の胃腸管において、病原菌集団を減少させることができる。

栄養素の排出
一実施形態では、本発明は、糞尿への栄養素の排出の減少に関する。これにより、環境ハザードの減少に生の効果が得られる。例えば、好ましい実施形態では、本発明は、対象の糞尿における窒素、及び／又はリン含量を減少させることに関する。したがって、環境中の窒素及び／又はリンの量が減少することになり、都合がよい。

生菌
一部の態様では、本発明の組成物に含まれるＤＦＭは、生菌培養効果を発揮し得ると考えられている。本発明の組成物に更に生菌及び／又はプレバイオティクスを添加することも同様に本発明の範囲内に含まれる。

本明細書において、生菌は、
「有益な細菌のうち１種又は限定種の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することで宿主に有効に作用する難消化性食品成分」である。

本明細書で使用するとき、用語「生菌培養物」は、例えば、必要数だけ経口摂取又は局所適用された場合に、宿主生物に有利に作用する、すなわち、１種以上の実証可能な健康効果を宿主生物に付与する、生微生物（例えば、細菌又は酵母など）であると定義する。プロバイオティクスは、１箇所以上の粘膜表面において、微生物のバランスを改善し得る。例えば、粘膜表面は腸、尿路、気道又は皮膚であり得る。本明細書で使用するとき、用語「生菌」は、免疫系の有効なバランスを刺激し得ると同時に、例えば、腸などの免疫表面において炎症応答を減少させる生微生物も包含する。

生菌摂取の下限又は上限は存在しないものの、日用量として、少なくとも１０^６〜１０^１２、好ましくは少なくとも１０^６〜１０^１０、好ましくは１０^８〜１０^９ｃｆｕを用いることが、対象において有利な健康効果を得るのに有効であることが示唆されている。

単離
一態様では、本発明で使用される好適な酵素又はＤＦＭは、単離形態であってよい。用語「単離」は、酵素又はＤＦＭが、少なくとも１種のその他の成分を少なくとも実質的に不含であることを意味し、少なくとも１種のその他の成分は、前記酵素又はＤＦＭと、自然界において天然に関係するものであり、天然に見られる通りのものである。本発明の酵素又はＤＦＭは、本来であればこの物質が関連付けられていたであろう１種以上の汚染物質を実質的に不含の形態で提供され得る。したがって、例えば、１種以上の潜在的に混入しているポリペプチド及び／又は核酸分子を実質的に含まない。

精製
一態様では、本発明に従う好ましくは酵素及び／又はＤＦＭは精製形態である。用語「精製」は、酵素及び／又はＤＦＭが高濃度で存在していることを意味する。酵素及び／又はＤＦＭは、組成物中に存在する主成分として望ましいものである。好ましくは、酵素及び／又はＤＦＭは、考慮中の総組成物に対し少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の濃度で存在し、この濃度は、乾燥重量／乾燥重量基準で決定される。

本明細書に記載の任意の特徴を組み合わせて本発明の範囲内に包含させるよう本発明の実施例を組み合わせ得ることも本発明の範囲内であると見なされる。特に、細菌の何らかの治療上の効果が付随して発揮され得ることも本発明の範囲内のものであると見なされる。

（実施例１）
材料及び方法
３６００羽の１日齢のＣｏｂｂ雄雛を民間の孵化場から購入する。試験の開始時に５５羽の雄を一集団として各処理区画に割りつける。試験は、次の処理から構成された（表１）：
表１．実施例１の試験設計

^１ 大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ。

^２ 枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプロテアーゼ。

^３ Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓにより提供されている。

各区画の雛の体重を、試験初日、２３日目、３５日め、及び最終日（４２日）に測定した。各区画を測定単位とした。ブロイラー用飼料をクランブル（前期飼料）又はペレット（育成飼料及び仕上げ飼料）として給餌した。飼料はＮＲＣ飼養標準に一致するか超過した（表２）。飼料間の相互混入を防止するため、ミキサはフラッシングした。すべての処理飼料はＤａｖｉｓ Ｓ−２０ミキサを用い混合し、カリフォルニアペレットミル（低温ペレット温度６５〜７０℃）を用いペレット化した。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料からサンプルを回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏの存在を確認した。
表２．実施例１の試験飼料の組成

鳥類に適宜給餌し、０日〜４２日の間処理した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供される。すべての飼料は、大腸菌（E. coli）フィターゼをそれぞれもともと５００ＦＴＵ含有していた。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防する。試験の２１日目に、前期飼料から育成飼料に代えた。試験の３５日目に、育成飼料を仕上げ飼料に代える。各飼料の交換時に、飼育者は、各区画毎に飼料を回収し、計量し、空にし、適切な処理飼料を再充填する。試験の最終日に飼料を計量する。各区画の斃死を毎日確認する。間引きしたか、又は斃死が発見された場合、日付及び取り除いた鶏の重量（ｋｇ）を記録する。すべての斃死又は間引き鶏に対し、肉眼剖検を実施し、性別及び推定される死因を判定する。壊死性腸炎の兆候を記録する。

すべての区画は約４インチに組み立て、新しい床敷を敷き詰めた。

区画に配置する前に、市販のコクシジウム症ワクチン（Ｃｏｃｃｉｖａｃ−Ｂ）を用い、すべての鳥類に噴霧ワクチンを接種する。１８、１９、及び２０日目に、処理群１を除きすべての鳥類にウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のブロス培地を投与する。ＮＥを引き起こすことが知られており、商用ブロイラーの運用由来する、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の野生分離株を曝露菌として利用する。毎日、新鮮な摂取材料を使用する。滴定レベルは約１．０×１０^８〜９である。各区画に対する接種は同量で行う。接種材料は、チューブフィーダーのベースに一般的に見られる飼料に混合して投与する。２１日目に、各区画から５羽の鳥を選別し、屠殺し、グループを計量し、及び壊死性腸炎領域の病変の程度について評価する。採点は、０〜３点で行った。０が正常であり、３が最も深刻である（０＝所見なし、１＝わずかに症状が見られる、２＝中等度の症状が見られる、３＝顕著な／深刻な症状が見られる；Ｈｏｆａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｕｌｔ．Ｒｅｓ．１２：６０〜６４）。試験の間、薬剤の併用は行わない。

ペアワイズｔ検定により中央値を分別した。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位として区画を使用する。

結果
図１は、壊死性腸炎モデルのブロイラーの壊死性腸炎を、０〜３点で採点した病変スコアを示す。プールされたＳＥＭは０．１５であった。

予期される通り、処理対照群では、未処理群と比較して病変スコアが優位に上昇した。ＤＦＭをプロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて添加することで、他のすべての対照群と比較して病変スコアが減少した。

図２は、２０〜４２日齢の壊死性腸炎（ＮＥ）の病変に関係する斃死を示す。

処理対照群では、ＮＥに関係する斃死率が、未処理対照群と比較して有意に増加していた。ＤＦＭを加えることで、ＮＥ斃死率は、プロテアーゼ＋フィターゼを含有している及び含有していない処理対照群と比較して減少した。

図３は、壊死性腸炎モデルのブロイラーの０〜２３日齢の体重増加を示す。プールされたＳＥＭは＝２８．６であった。

図３は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）処理モデルのブロイラーに、ＤＦＭ（Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標））をプロテアーゼ及びフィターゼとを組み合わせて投与した場合に、処理対照群と比較して、体重増加率（ＢＷ増加）が有意に向上することを示す。このデータは、ＤＦＭをプロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせた場合に、未処理対照＋フィターゼと比較して、総ＢＷ増加が驚くべきほど向上したことを示す。

図４は、壊死性腸炎モデルのブロイラーの０〜１２日齢の体重増加を示す。プールされたＳＥＭは４．８６であった。

図５は、壊死性腸炎モデルの０〜１２日齢のブロイラーの飼料要求率を示す。プールされたＳＥＭは０．０２６であった。

Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）と、プロテアーゼ及びフィターゼとの組み合わせは、０〜１２日目までのブロイラーのＦＣＲ（ＢＷ増加（ｇ）／飼料摂取（ｇ））を、対照、及び酵素単体及びその他の処理と比較して有意に向上させた（減少させた）。

図６は、壊死性腸炎モデルのブロイラー（０〜２３日齢）の飼料要求率を示す。プールされたＳＥＭは０．０２２であった。

Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（ＤＦＭ）と、プロテアーゼ及びフィターゼとの組み合わせは、０〜２３日目までのブロイラーのＦＣＲ（ＢＷ増加（ｇ）／飼料摂取（ｇ））を、対照群、及び酵素のみで処理した群、及びその他の処理と比較して有意に向上させた（減少させた）。

（実施例２）
材料及び方法
ブロイラーで消化試験を実施し、栄養利用能に対するプロテアーゼ及びＤＦＭの効果を評価する。環境的に制御された室内にケージを収容する。鳥類には２０時間蛍光灯照射を行い、かつ飼料及び水は自由に摂取させる。１日目に、すべての雛にブロイラー用コクシジウム生ワクチンを経口投与する。試験は、次の処理から構成される（表３）。

表３．実施例２の実験設計

^１ Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから提供された、大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ。

^２ Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓにより提供されている。

^３ Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから提供された、枯れ草菌由来のプロテアーゼ。

^４ バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のプロテアーゼ。

合計５１２羽の鳥類をそれぞれ計量し、体重をもとに６４のケージに割りつけた（８羽／ケージ）。次に、８つのケージ毎に８種の飼料処理をランダムに割りつけた。０日〜２１日目には鳥類に前期飼料を適宜給与した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供される。すべての飼料は、大腸菌（E. coli）フィターゼをそれぞれもともと５００ＦＴＵ含有していた。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防する。鳥類には、試験の間、マッシュ形態の前期飼料を給餌した（表４）。

表４．実施例２の試験飼料の組成

２１日目に、ケージ毎に８羽ずつ頚椎脱臼により屠殺し、蒸留水により回腸下部の内容物を洗い流す。ケージ内の鳥類から得られた腸内容物をプールし、食事処理群毎に６種のサンプルを得る。回収後、腸内容物サンプルを直ちに凍結し、凍結乾燥させ、加工する。標準法を用い、腸内容物サンプル及び飼料を、Ｔｉ、ＤＭ、ＧＥ、デンプン、脂肪、Ｎ、アミノ酸（トリプトファンを除く）、並びに不溶性及び可溶性の非デンプン多糖類（ＮＳＰｓ）について解析する。Ｒａｖｉｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）により報告されているとおりに、難消化性Ｔｉの濃度をもとに回腸消化吸収率を算出する。

飼料及び糞便中のＴｉ濃度をもとに、窒素に関係する見かけの代謝エネルギー（ＡＭＥｎ）と、窒素保持を評価するため、４日間連続（１７日齢〜２０日齢）でケージごとに代表的な腸内容物サンプルを回収する。***物は、毎日ケージ内でプールして回収し、ブレンダで混合し、サブサンプリングする。各サブサンプルを凍結乾燥させ、０．５ｃｍシーブを通して粉砕し、気密性のプラスチック容器に入れ、解析までの間−４℃で保管した。標準法を用い、加工サンプルをＴｉ、ＤＭ、ＧＥ、Ｎ、可溶性及び不溶性ＮＳＰについて解析する。

ペアワイズｔ検定により中央値を分取する。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位としてケージを使用する。

結果
予備試験により、プロテアーゼ＋フィターゼ＋ＤＦＭを組み合わせた場合、陰性対照＋フィターゼ及びプロテアーゼ＋フィターゼ及び／又はＤＦＭ＋フィターゼと比較して、エネルギー、Ｎ、アミノ酸、デンプン、脂質、及び／又は可溶性及び不溶性ＮＳＰの回腸可消化性が向上していることが示される。フィターゼに加えてプロテアーゼ及びＤＦＭを組み合わせた場合、陰性対照処理＋フィターゼ及びプロテアーゼ＋フィターゼ及び／又はＤＦＭｓ＋フィターゼと比較して、ＡＭＥ、窒素保持、並びに可溶性及び不溶性ＮＳＰの腸管での合計消失量が向上していることが示される。これらのパラメータに対するプロテアーゼの用量反応は、ＤＦＭを含有していない処理群と比較して、ＤＦＭを含有している処理群においてより大きく増加している。

（実施例３）
材料及び方法
ブロイラーで消化試験を実施し、栄養利用に対するフィターゼ＋プロテアーゼ及びＤＦＭの効果を評価する。環境的に制御された室内にケージを収容する。鳥類には２０時間蛍光灯照射を行い、かつ飼料及び水は自由に摂取させる。１日目に、噴霧キャビネットを用い、ブロイラー用のコクシジウム生ワクチンを、すべての雛に投与する。試験は、次の処理から構成される（表５）。

表５．実施例３の試験設計

^１ 大腸菌（E. coli）由来のフィターゼ。

^２ Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから提供された、枯れ草菌由来のプロテアーゼ。

^３ Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）は枯草菌（Bacillus subtilis）株Ｂｓ２０８４、ＬＳＳＡＯ１並びに１５ＡＰ４を組み合わせた製品であり、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓにより提供されている。

^４ 枯れ草菌株Ｃ３１０２を含有しているＤＦＭ製品であるＣａｌｓｐｏｒｉｎ。

^５ バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＤＳＭ１７２３６を含有しているＤＦＭ製品であるＧａｌｌｉｐｒｏ Ｔｅｃｔ。

合計３８４羽の鳥類をそれぞれ計量し、体重をもとに６４のケージに割りつけた（６羽／ケージ）。次に、８つのケージ毎に８種の飼料処理をランダムに割りつけた。０日〜２１日目に鳥類に前期飼料を適宜給与した。すべての試験処理群に関し、酵素及びＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でＤａｎｉｓｃｏから提供される。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防する。鳥には、試験の間、マッシュ形態の前期飼料を給餌した（表６）。

表６．実施例３の試験飼料の組成

２１日目に、ケージあたり６羽ずつＣＯ_２窒息により屠殺し、蒸留水により回腸下部の内容物を洗い流す。ケージ内の鳥類から得られた腸内容物をプールし、食事処理群毎に８種のサンプルを得る。回収後、腸内容物サンプルを直ちに凍結し、凍結乾燥させ、加工する。標準法を用い、腸内容物サンプル及び飼料を、Ｔｉ、ＤＭ、ＧＥ、デンプン、脂肪、Ｎ、並びに不溶性及び可溶性のＮＳＰについて解析する。Ｒａｖｉｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）により報告されているとおりに、難消化性Ｔｉの濃度をもとに回腸消化吸収率を算出する。

窒素量を補正して見かけの代謝エネルギー（ＡＭＥｎ）及び窒素保持量を定量するため、４日連続して（第１７日目〜第２０日目）、ケージ毎に飼料摂取量及び総***量を定量的に測定する。***物は、毎日ケージ内でプールして回収し、ブレンダで混合し、サブサンプリングする。各サブサンプルを凍結乾燥させ、０．５ｍｍシーブを通して粉砕し、気密性のプラスチック容器に入れ、解析までの間−４℃で保管する。標準法を用い、加工サンプルを、ＤＭ、ＧＥ、Ｎ、可溶性及び不溶性ＮＳＰについて解析する。

ペアワイズｔ検定により中央値を分取する。Ｐ＜０．０５を有意な差と見なした。試験単位としてケージを使用する。

結果
予備試験により、プロテアーゼ＋フィターゼと、試験したＤＦＭのいずれかを組み合わせて用いた場合に、エネルギー、Ｎ、デンプン、脂質、及び／又は可溶性及び不溶性ＮＳＰの、回腸での消化率は、陰性対照及びプロテアーゼ＋フィターゼ及び／又はいずれかの各種ＤＦＭの場合と比較して大きくなることが示される。予備試験により、プロテアーゼ＋フィターゼと、試験したＤＦＭのいずれかを組み合わせて用いた場合に、ＡＭＥ、窒素保持、及び可溶性及び不溶性ＮＳＰの回腸での消化率は、陰性対照及びプロテアーゼ＋フィターゼ及び／又はいずれかの各種ＤＦＭの場合と比較して大きくなることが示される。

（実施例４）
材料及び方法
実施例１に記載の試験の２３日齢のブロイラーから、組織サンプルを採取した。処置の仕様を表１に表す。各区画毎に２羽の鳥から空腸、膵臓及び肝臓を切除し、処理群毎に８体のサンプルから得られる粘膜をプールした。試料を緩衝液（ＰＢＳ）ですすぎ、製造元のプロトコルに従い組織保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ）に浸漬し、−８０℃で保存した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａａｃｈｉ（１９８７；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６〜９）に記載のとおりに、一工程フェノールクロロホルム抽出法により各組織サンプルから全ＲＮＡを単離した。２６０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で吸光度を測定してＲＮＡ濃度を決定し、１．２％アガロースゲルでゲル電気泳動を行い、完全性をモニターした。純度が十分であり、かつ２６０ｎｍの吸光度対２８０ｎｍの吸光度が１．８７超であるＲＮＡのみを使用可能な品質であるものと見なした。

Ｄｒｕｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８；Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８７：２４１８〜２９）のプロトコルに従って、７０塩基対のオリゴヌクレオチド（Ｏｐｅｒｅｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を用い、マイクロアレイを製造した。アレイの試験設計は、Ｇａｒｏｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００５；Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．９３：４２５〜３２）に記載される通りに、完全に織り合わせたループデザイン（complete interwoven loop design）であった。各サンプルは、すべての処理を比較できるよう多重対比較的な手法で他のサンプルと直接比較された。Ｄｒｕｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８；Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８７：２４１８〜２９）の記載の方法に従って、サンプルの半量はシアニン系蛍光色素のＣｙ３で、もう半量はＣｙ５で標識した。Ｐｒｏｎｔｏ Ｐｌｕｓ！によりハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション・キットを添加した後に、Ｃｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡプローブを添加し、透明なガラス製カバーグガラス（Ｌｉｆｔｅｒｓｌｉｐ）でカバーし、１６時間ハイブリダイズさせた。次に、レーザーの出力を６５％に設定したＳｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｇｘ ＰＬＵＳマイクロアレイスキャナセットでマイクロアレイをスキャンし、画像を得た。

個々のサンプルから得た全ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成し、これを、Ｄｒｕｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８；Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８７：２４１８〜２９）の記載する通りのｑＰＣＲ増幅でテンプレートとして用いた。各遺伝子についてサーモサイクリングパラメータを最適化し、かつ各遺伝子をそれぞれ２つ組で用い、１つの装置で同時に増幅させた。

マイクロアレイのスキャンイメージからデータファイルを生成したが、各スライド及び色素の組み合わせの強度についての生データの抽出には、ＳｃａｎＡｌｙｚｅソフトウェアを用いた。次にＪＭＰ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ及び初期ｌｏｇ２変換により強度のデータファイルを解析した。データの正規化は、局所重みづけ回帰を用い、最初のアレイとすべてのアレイとの間で補整した。得られた正規化ｌｏｇ２強度を、混合モデルＡＮＯＶＡにより解析した。

ボンフェローニの補正に基づき、閾値の有意性に関しＰ＝０．０５とし、中央強度を比較した（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ １９９８）。すべての複製を含む完全アレイに関し、グリッド強度の中央値を算出した。各遺伝子に対し３つのサイドバイサイドプローブを用い、遺伝子毎の各グリッドに関し計４つの複製中央値を得た。処理に応じて２つ組サンプル（サンプル遺伝子のＣｔ：サンプルＧＡＰＤＨのＣｔ）から得られたＣｔ比に関するデータを一元配置ＡＮＯＶＡにより処理した。

結果
マイクロアレイプラットフォームにより発現データを回収し、「ヒートマップ」を生成して、２３日齢の空腸（図７）及び膵臓（図８）のデータを可視化した。対照とした６つの遺伝子の相対発現量を、目盛りに基づき視覚的に把握できるよう変換し、図７に示す。低発現だった遺伝子はマイナス記号（「−」）で表し、高発現だった遺伝子はプラス記号（「＋」）で表す。また、灰色が濃くなるほど、処理群の平均的な発現レベルと差がある。評価した遺伝子及びそれらに意図した機能を表７に示す。リアルタイムＰＣＲにより、スクラーゼ−イソメルターゼ（ＳＩ）及び脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の遺伝子の発現について検証したヒートマップを示す。これらの発現はアレイデータと高度に相関していた。

表７．測定した遺伝子に意図される機能

図７は、２３日齢の時点の空腸に関し、すべての処理について、対象とする遺伝子の発現プロファイルのヒートマップを示す。

図８は、２３日齢の時点の肝臓に関し、すべての処理について、対象とする遺伝子の発現プロファイルのヒートマップを示す。

図７及び８の要点は次の通りである：
未処理対照＝未処理対照＋フィターゼ
ＣＣ＝処理対象＋フィターゼ
ＣＣ＋プロテアーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋プロテアーゼ
ＣＣ＋ＥＰ＝処理対照＋フィターゼ＋Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ
ＣＣ＋ＥＰ＋プロテアーゼ＝処理対照＋フィターゼ＋プロテアーゼ＋Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ。

アセチルＣｏＡカルボキシラーゼＡ（ＡＣＡＣＡ）の発現は処理対照において下方制御された一方で、プロテアーゼ＋フィターゼ及びＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏを組み合わせた場合、ＡＣＡＣＡの発現は、未処理対照群と同程度にまで増加した。Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏとフィターゼのみ、あるいはプロテアーゼ＋フィターゼのみでＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏを未添加の場合には、前出の組み合わせほどの顕著な効果は得られなかった。ＡＣＡＣＡはアセチルＣｏＡからの脂肪酸の産生に関与する酵素であり、脂質生合成のマーカーとして使用される。

グルコキナーゼ（ＧＣＫ）の発現は、処理対照群では下方制御されたが、プロテアーゼ＋フィターゼをＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏと組み合わせることで、未処理対照群と同様に上方制御された。上方制御の度合いは、ＤＦＭを用いずにプロテアーゼ＋フィターゼを使用した場合よりも大きかった。同様の状況は、スクラーゼイソマルトース（ＳＩ）でも観察され、Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏをプロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせた場合に、処理対照群及び未処理対照群のいずれと比較した場合にも発現が上昇していた。ＧＣＫはグルコース代謝において重要な酵素であり、ＳＩは、スクロース及びイソマルトースの加水分解に関与するものであることから、動物における炭水化物の消化及び吸収において重要な役割を有する。

Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏと組み合わせた場合、プロテアーゼ＋フィターゼを単独で用いた場合と比較して、オリゴペプチド輸送体１（ＰＥＰＴ１）の発現が上昇した。ＰＥＰＴ１は、ペプチド輸送系の一部であり、かつ多様なジペプチド及びトリペプチドの摂取に関与する。

処理対照群では、密着結合タンパク質１（ＺＯ１）が最も発現が高かった。プロテアーゼ＋フィターゼについても発現の減少が観察されたものの、プロテアーゼ＋フィターゼをＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏと組み合わせた場合には、未処理対照群よりも大幅な発現の減少が観察された。ＺＯ１は、密着結合の細胞質面に存在するタンパク質であり、密着結合組立体に関するシグナル伝達から、密着結合自体の安定性まで様々な役割を担う。

Ｔ細胞抗原ＣＤ３（ＣＤ３Ｄ）は、処理対照群において高発現していた。プロテアーゼ＋フィターゼ処理群では、ＣＤ３Ｄ遺伝子の発現の減少についてある程度の効果を示していたものの、プロテアーゼ＋フィターゼをＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏと組み合わせて使用した場合にはより大きな効果が観察された。同様の結果は空腸及び肝臓でも観察され、ＣＤ３Ｄ発現について同様の結果が得られ得た。ＣＤ３Ｄは、Ｔ細胞に見られる表面分子であり、Ｔ細胞受容体と会合している間のシグナル伝達において重要な役割を果たし、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体の一部を構成する。

脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）は処理対照群では下方制御された一方で、プロテアーゼ＋フィターゼ、及びＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏでは、この遺伝子の発現は上方制御された。Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏをプロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせた場合に、発現は更に上方制御された。ＦＡＳＮは脂肪酸の生合成に重要な酵素であり、長鎖飽和脂肪酸産生を触媒する。

考察
Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ及びプロテアーゼ＋フィターゼを組み合わせることで、処理対照群と比較してアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの発現が上昇したことにより、脂肪生成が増加していることが示唆される。炭水化物可用性及び消化性が増大している場合、脂質の輸送及び貯蔵に転用される余剰エネルギー量が増加していることが意味される。プロテアーゼ＋フィターゼと、Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏとの組み合わせにより、グルコキナーゼ及びスクラーゼイソメラーゼの発現の増加したことから、グルコースの吸収が増加したこと、及び刷子縁におけるスクロース及びイソマルトースの可用性が増加したことが示唆され、これらにより、小腸における炭水化物の吸収性の向上に対し、酵素及びＤＦＭが正の相互作用をもち、ひいては飼料からのエネルギー可用性が向上することが示される。これに加え、処理対照群ではグルコキナーゼの発現が減少したことから、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）への暴露により粘膜の損傷が引き起こされること、並びにＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏ、及びプロテアーゼ＋フィターゼを添加することで損傷が改善されること、が示される。プロテアーゼ＋フィターゼのみを投与した場合に、並びにこれらの酵素をＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏと組み合わせて投与した場合に、ペプチド輸送体のオリゴペプチド輸送体１（ＰＥＰＴ１）の発現が増加したことから、ペプチドの可用性が向上したことが示唆され、ひいては輸送の必要性が増加したことが示唆され、これにより、動物のペプチド可用性を増加させるにあたって酵素及びＤＦＭが相乗効果をもち、この効果により成長が促進されることが示される。

脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の発現が肝臓で増大していること、並びに空腸においてアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＡの発現が増大していることから、炭水化物可用性の増大により、脂肪酸合成が増加していることが示唆される。酵素及びＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏは互いに動物のエネルギー可用性を増大させるように作用し、これにより動物の成長速度は大きくなる。

Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏは、密着結合タンパク質１の発現を減少させるよう作用することから、タンパク質代謝を行う必要性が減少していることが示される。すなわち、これに相関して腸の統合性が高くなっている可能性がある。しかしながら、処理対照群では発現が増加していたことから、コクシジウム及びウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の感染により腸が破損していることに起因して、タンパク質の代謝／要求が高くなっていたことが示される。プロテアーゼ＋フィターゼ（Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ非添加）を組み合わせた場合、又はＥｎｖｉｖａ Ｐｒｏをフィターゼのみと組み合わせた場合に示された効果、すなわちＺＯ１発現の下方制御は、プロテアーゼ＋フィターゼ＋Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏを組み合わせた場合ほど明確なものではなかった。これにより、Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ及びプロテアーゼ＋フィターゼを組み合わせると、腸の統合性が増大するよう作用し、ひいては動物の腸の健康に効果があることが示される。腸の統合性、ひいては吸収能力の向上は、これらが、ＤＦＭを存在させた場合に、外来性酵素の有効性を向上させる機序のうちの１つであることは明らかである。

処理対照群において、Ｔ細胞抗原ＣＤ３ ｄの発現が増大したことから、処理に起因して細胞性免疫反応が増大したことが示される。これらの条件下では、成長に使用され得るエネルギーを免疫応答が必要とするとことから、並びに一部の鳥類は全身性疾患に罹患することから、鳥類は準最適な性能下に置かれることになる。この免疫マーカーの発現の増大は、Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏをフィターゼのみと用いた場合、又はプロテアーゼ＋フィターゼと組み合わせて用いた場合に顕著に逆転する。免疫応答は、腸において下方制御されたことから、ＤＦＭを存在させた場合に、特に腸疾患条件下で、栄養吸収性及び性能を増大させるよう外来性酵素が有効に機能する機序のうちの１つである。

酵素とＤＦＭを組み合わせることによる、免疫応答の下方制御及び腸の統合性強化、並びに栄養素の良好な消化及び吸収に関係する、正味の効果により、ブロイラーの産生性能は向上しているものと疑いなく結論付けられる。

本明細書においてこれまでに言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明に関し記載される手法及び系に対し、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく加えられる各種修正及び変更は当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは明白である。加えて、生化学及びバイオテクノロジー又は関連する分野に属する当業者には本発明を実施する際に記載のモデルに各種修正は明白なものであり、このような修正も以降の特許請求の範囲内で意図されるものとする。

Claims (61)

1. 直接給与微生物を、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて含む、飼料添加用組成物。
2. 前記直接給与微生物が、抗病原体用直接給与微生物である、請求項１に記載の飼料添加用組成物。
3. 前記直接給与微生物が生細菌である、請求項１又は２に記載の飼料添加用組成物。
4. 前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上の細菌を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
5. 前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上の細菌を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
6. 前記直接給与微生物が、次の株：枯草菌株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０５）；ＢＳ １８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ ２７８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
7. 前記直接給与微生物が、芽胞の形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
8. 前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、又はケラチナーゼ、又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
9. 前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
10. 前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項９に記載の飼料添加用組成物。
11. 前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又は大腸菌（E. coli）フィターゼ又はハンゼヌラ（Hansenula）フィターゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
12. 前記フィターゼが、２００ＦＴＵ／飼料添加用組成物（ｇ）、及び１００００ＦＴＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
13. 前記プロテアーゼが、１０００ＰＵ／飼料添加用組成物（ｇ）及び６００００ＰＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
14. 前記直接給与微生物が、３．７５×１０^７ＣＦＵ／飼料添加用組成物（ｇ）及び１×１０^１１ＣＦＵ／飼料添加用組成物（ｇ）の投与量で存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
15. 対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の可消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性の向上、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物における体重増加性の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖性の向上、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少のための方法であって、直接給与微生物を、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む、方法。
16. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を投与する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記直接給与微生物が抗病原体用直接給与微生物である、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記直接給与微生物が生菌である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、及びこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecium）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上に由来する細菌を含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記直接給与微生物が、次の株：枯草菌株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０５）；ＢＳ １８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ ２７８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上の細菌を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、又はケラチナーゼ、又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼである、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又は大腸菌（E. coli）フィターゼ又はハンゼヌラ（Hansenula）フィターゼである、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の可消化性（例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素可消化性）の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性の向上、又は飼料要求率（ＦＣＲ）の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節（例えば、改善させる）、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖性の向上、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌集団の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少のために、プロテアーゼ及びフィターゼと組み合わせる、直接給与微生物の使用法。
28. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を使用する、請求項２７に記載の使用法。
29. 前記直接給与微生物が抗病原体用直接給与微生物である、請求項２７又は２８に記載の使用法。
30. 前記直接給与微生物が生菌である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の使用法。
31. 前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaera）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の使用法。
32. 前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecium）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上に由来する細菌を含む、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の使用法。
33. 前記直接給与微生物が、次の株：枯草菌株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０５）；ＢＳ １８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ ２７８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の使用法。
34. 前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の使用法。
35. 前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、又はケラチナーゼ、又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼである、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の使用法。
36. 前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の使用法。
37. 前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又は大腸菌（E. coli）フィターゼ又はハンゼヌラ（Hansenula）フィターゼである、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の使用法。
39. 直接給与微生物、プロテアーゼ、フィターゼ、及び投与についての指示書を含むキット。
40. 前記キットが、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む、請求項３９に記載のキット。
41. 前記直接給与微生物が抗病原体用直接給与微生物である、請求項３９又は４０に記載のキット。
42. 前記直接給与微生物が生菌である、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
43. 前記直接給与微生物が、次の属：ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、腸球菌（Enterococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、及びメガスフェラ（Megasphaer）、並びにこれらの組み合わせのうちの１種以上に由来する細菌を含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載のキット。
44. 前記直接給与微生物が、次の種：枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecium）、腸球菌種（Enterococcus spp）、及びペディオコッカス菌種（Pediococcus spp）、ラクトバチルス種（Lactobacillus spp）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococsus acidilactici）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Propionibacterium thoenii）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノサス（lactobacillus rhamnosus）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス（Bifidobacterium animalis ssp. animalis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス（Lactobacillus salivarius ssp. salivarius）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プロピオニバクテリア（Propionibacteria sp）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上に由来する細菌を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載のキット。
45. 前記直接給与微生物が、次の株：枯草菌株３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）；１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）；２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）；２０８４（ＮＲＲＬ Ｂ−５００１３０）；ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）；ＢＳ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１０５）；ＢＳ １８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３３）；及びＢＳ ２７８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０６３４）のうちの１種以上である、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載のキット。
47. 前記プロテアーゼが、サブチリジン、バチロリジン、アルカリ性セリンプロテアーゼ、又はケラチナーゼ、又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）プロテアーゼである、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載のキット。
48. 前記フィターゼが６−フィターゼ又は３−フィターゼである、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載のキット。
49. 前記フィターゼが６−フィターゼである、請求項４８に記載のキット。
50. 前記フィターゼが、大腸菌（E. coli）フィターゼ又はブティアウクセラ（Buttiauxella）フィターゼ又はハフニア（Hafnia）フィターゼ又はシトロバクター（Citrobacter）フィターゼ又はアスペルギルス（Aspergillus）フィターゼ又はペニシリウム（Penicillium）フィターゼ又はトリコデルマ（Trichoderma）フィターゼ又は大腸菌フィターゼ又はハンゼヌラフィターゼである、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載のキット。
51. 直接給与微生物を、プロテアーゼ及びフィターゼと混合する工程、並びに（所望により）パッケージングする工程、を含む、飼料添加用組成物の製造法。
52. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。
53. 前記フィターゼが、４００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）〜１０００ＦＴＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項５２に記載の飼料。
54. 前記プロテアーゼが、２０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）〜６０００ＰＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項５２又は５３に記載の飼料。
55. 前記ＤＦＭが、７．５×１０^４ＣＦＵ／飼料（ｋｇ）及び１×１０^７ＣＦＵ／飼料（ｋｇ）の投与量で存在する、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の飼料。
56. 飼料成分を請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物と混合する工程を含む、家畜飼料の製造法。
57. 直接給与微生物を、プロテアーゼ及びフィターゼ、並びに少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む飼料添加用組成物を含むプレミックス。
58. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を、少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせて含む、プレミックス。
59. 対象とする動物においてコクシジウム症及び／又は壊死性腸炎を予防及び／又は処置するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
60. 壊死性腸炎及び／又はコクシジウム症の予防及び／又は処置法であって、対象とする動物に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の有効量の飼料添加用組成物を投与する、方法。
61. 図面及び実施例を参照して本明細書において全体的に定義される通りの飼料添加用組成物又は飼料又はキット又は方法又は使用法又はプレミックス。

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