JP2014509846A - 飼料添加用組成物 - Google Patents

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Abstract

直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter spp)菌種に由来するフィターゼと組み合わせて含む、試料添加用組成物、並びに対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性(例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性)の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率(FCR)の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料要求率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節(例えば、改善させる)、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、に関係する方法であって、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter spp)菌種に由来するフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む、方法。

Description

本発明は、直接給与微生物を、シトロバクター(Citrobacter)菌種に由来する(好ましくは、シトロバクター(Citrobacter)菌種に由来する)フィターゼ、特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する(好ましくは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する)フィターゼと組み合わせて用い、飼料組成物を改良するための方法、並びに直接給与微生物を、シトロバクター(Citrobacter)菌種に由来するフィターゼ、特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する(好ましくは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する)フィターゼと組み合わせて含む飼料添加用組成物、に関する。本発明は、更に、使用法及びキットに関する。
酵素添加物は、栄養効率及び生産効率を向上させるという方法として、動物用飼料、特に家禽及び豚用飼料に添加剤として使用されている。酵素ブレンドを利用することで、大豆ミール、動物性タンパク質ミール、又は高繊維飼料副産物を含有している試料の栄養価を改良することができる。直接給与微生物(DFM)という概念は、ストレス期(疾患、飼料の移行、環境ストレス又は生産期)にあるブロイラーなどの動物に、有益な微生物を給与することに関与する。この分類に当てはまる飼料添加物にはプロバイオティクスという別称があり、これまでにプロバイオティクス又はDFMは、管理下試験において、動物の生産性能を向上させることが示されている。DFMは、直接給与微生物及び/又は酵母系の産物を含有する。
DFMと一部の酵素とを組み合わせることはこれまでも企図されてきたが、DFMと外来性酵素とを動物用飼料に組み込むことについては完全には解明されていない。本発明は、動物の生産性能を非常に向上させる新規の特定の組み合わせに関する。
本発明は、DFMを、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは由来する)フィターゼと組み合わせることで、動物性能に対し非常に有益な効果が得られるという発見に基づくものである。
詳細には、本発明は、DFMを、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは由来する)フィターゼと組み合わせることで、動物性能に対し、次の:飼料要求率(FCR)、原材料の消化性能(例えば、栄養素消化性能、アミノ酸の消化性能など)、窒素保持、生存時間、枝肉歩留まり、成長速度、体重増加、飼料要求率、壊死性腸炎に対する動物の抵抗性、対象とする動物の免疫応答性、対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖、のうちの1つ以上の点で、非常に有益な効果が得られるという発見に基づくものである。
その他に本発明は、対象とする動物から得られる糞尿の成分に含まれる排出栄養素量を減少させ得る(例えば、窒素及びリンの排出を減少させる)という点でも、驚くべきものである。
一態様では、本発明は、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼと組み合わせて含む(又は組み合わせることで本質的に構成される、又は組み合わせることで構成される)、飼料添加用組成物を提供する。
他の態様では、本発明は、対象とする動物の性能の向上、又は飼料に含まれる原材料に対する消化性(例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性)の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率(FCR)の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料要求率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節(例えば、改善させる)、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、に関係する方法を提供し、本方法は、直接給与微生物を、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む。
本発明の更に他の態様では、対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性(例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性)の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率(FCR)の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料要求率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節(例えば、改善させる)、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、を目的として、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼと組み合わせて使用する。
本発明の更なる態様は、直接給与微生物(DFM)、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼ、任意に少なくとも1種のビタミン、任意に少なくとも1種のミネラル、及び投与についての指示書、を含む、キットを提供する。
他の態様では、本発明は、飼料添加用組成物の製造法を提供し、方法は、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼと混合する工程と、(任意に)パッケージングする工程と、を含む。
本発明の更に他の態様では、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼと組み合わせてを含む(又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる)、飼料又は動物用飼料を提供する。
直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼ、及び少なくとも1種のミネラル及び/又は少なくとも1種のビタミンと組み合わせて含む(又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる)飼料添加用組成物を含む、プレミックス。
他の態様では、本発明は、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii))に由来する(好ましくは、由来する)フィターゼと組み合わせて含む(又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる)飼料添加用組成物と、飼料成分とを混合する工程を含む、動物用飼料の製造法を提供する。
更なる態様では、本発明は、対象とする動物におけるコクシジウム症及び/又は壊死性腸炎を予防及び/又は処置するための、本発明の飼料添加用組成物に関する。
本発明は、壊死性腸炎及び/又はコクシジウム症を予防及び/又は処置する方法を更に提供し、本方法は、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与するものである。
シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113由来のフィターゼ(6−フィターゼ)活性を有するポリペプチドの配列(配列番号1)を示す。配列鎖の最初のXaaはGlyであり、配列鎖の2番目のXaaはProである。最初の22個のアミノ酸(下線)は、成熟タンパク質では切断されているシグナルペプチドである。したがって、成熟タンパク質は、アミノ酸配列の第23番目のアミノ酸から開始する。したがって、成熟タンパク質は第23番目〜第433番目のアミノ酸からなる。この酵素は、DSM/NovozymesからRonozyme HiPhos(商標)として市販される。 シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)由来のフィターゼ活性を有するポリペプチドの配列(配列番号2)を示す。配列鎖の最初のXaaはGlyであり、配列鎖の2番目のXaaはProである。最初の22個のアミノ酸(下線)は、成熟タンパク質では切断されているシグナルペプチドである。したがって、成熟タンパク質は、アミノ酸配列の第23番目のアミノ酸から開始する。したがって、成熟タンパク質は第23番目〜第433番目のアミノ酸からなる。 フィターゼ(6−フィターゼ)活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列(配列番号3)を示す。配列番号3のヌクレオチド67〜1299は、フィターゼ活性を有するポリペプチド(すなわち、配列番号1に示すポリペプチド)をコードする(rはg又はaを意味し、yはt/u又はcを意味し、かつsはg又はcを意味する)。 フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列(配列番号4)を示す。配列番号4のヌクレオチド67〜1299は、フィターゼ活性を有するポリペプチド(すなわち、配列番号2に示すポリペプチド)をコードする(rはg又はaを意味し、yはt/u又はcを意味し、かつsはg又はcを意味する)。 シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼ(6−フィターゼ)活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号5)を示す。 フィターゼ活性を有するポリペプチド(すなわち、配列番号5に示すポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列(配列番号6)を示す。 シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)YH−15由来のフィターゼ(6−フィターゼ)活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号7)を示す。 コウジカビ(Aspergillus oryzae)で発現させた、ペニフォラ・リシイ(Peniphora lycii)由来のフィターゼ(6−フィターゼ)を含むアミノ酸配列(配列番号8)を示す。DSM & NovozymesからRonozyme P(商標)として市販。 シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)由来の、フィターゼ活性を有するポリペプチドの配列(配列番号9)を示す(UniProtKB/TrEMBL受諾番号Q676V7)。 シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)由来の、フィターゼ活性を有するポリペプチドの配列(配列番号10)を示す(EBI受託番号EM−PRO:AY390262)。 フィターゼ活性を有するポリペプチド(すなわち、配列番号10に示すポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列(配列番号11)を示す。
好ましくは、本発明で使用する酵素は、DFMにとって外来性のものである。換言すれば、好ましくは、酵素はDFMに加えられ、又はDFMと混合される。
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示の属する技術分野の業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,20 ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)、並びに、Hale & Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)は、本開示で使用される用語の多くについての一般的辞書を当業者に提供する。
本開示は、本明細書において開示される代表的な方法及び材料に限定されるものではなく、本開示の実施形態を実施又は試験するにあたって、本明細書に開示されるものと類似する又は同等である任意の方法及び材料を使用することができる。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。別途記載のない限り、任意の核酸配列は、それぞれ、左から右に5’→3’の向きで記載され、アミノ酸配列は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記載される。
本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。
本明細書において、アミノ酸は、アミノ酸名、3文字略記、又は1文字略記により参照される。
本明細書で使用するとき、用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを包含する。
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び/又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基に対し一般的な1文字表記及び2文字表記が用いられる場合がある。アミノ酸の3文字表記は、IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN)に準拠して定義される通りのものである。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは1種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。
用語についての他の定義は本明細書中で明らかになる場合がある。実施例をより詳細に説明する前に、本開示は記載される具体的な実施形態に制限されるものではなく、言うまでもなく、多岐にわたることは理解される。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、制限を意図するものではなく、したがって、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されるであろう。
値について範囲が提供される場合、文脈上明記されていない限り、下限とする単位の少数第一位までが開示されているものとし、それ以外には、範囲の上限値及び下限値の間の各数値も明確に開示されているものとする。規定の任意の値又は規定の範囲に含まれる値、及びその他の任意の規定の値又は規定の範囲に含まれる値、に挟まれる、より小さな各々の範囲も本開示に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲に包含させることができ、あるいは除外させることができ、かつ各範囲が、記載の範囲内の任意の特定の制限を包含するよう、上限及び下限のいずれかを包含し、又はいずれも包含せず、又はいずれをも包含する、より小さな範囲も本開示に包含させる。規定の範囲が上限又は下限のいずれか又は両方を含有する場合、これらの含有される上限又は下限のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数冠詞「a」、「an」、及び「the」には、文脈上明記されない限り複数形も含む。したがって、例えば、「酵素(an enzyme)」には、複数の候補となる剤が包含され、「飼料(the feed)」を参照する場合には、当業者に知られる1種以上の飼料及びその同等物等が包含される。
本明細書で述べる開示は、本開示の出願日よりも先に開示されているという意味合いでのみ提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術に相当するものと解釈すると判断される記載は存在しない。
本発明において使用される酵素は、バッチ培養法、フェドバッチ培養法、及び連続培養法などの、固体培養又は液内培養のいずれかにより製造することができる。培養は、水溶性無機塩類培地、有機増殖因子、炭素供給源及びエネルギー供給源、酸素分子、及び言うまでもなく、採用した1種以上の特定の微生物の初回接種材料、を含む、増殖培地で実施する。
直接給与微生物(DFM)
本明細書において、用語「微生物(microbial)」は、「微生物(microorganism)」と互換的に使用される。
本明細書で使用するとき、用語、「DFM」は、直接給与微生物を意味する。
好ましくはDFMは生細菌を含む。好ましくは、DFMは生細菌、又は生酵母、又は生真菌を含む。
好ましくはDFMは生細菌を含む。
用語「生細菌」は、代謝的に活性であるか、又は分化することのできる微生物を意味する。
一実施形態では、DFMは、芽胞形成細菌であってよく、すなわち用語「DFM」は、芽胞、例えば細菌芽胞からなり、又は芽胞を含有する。したがって、一実施形態では、本明細書で使用される用語「生細菌」には、芽胞又は分生子などの細菌芽胞が包含される場合がある。
他の実施形態では、本発明に従う飼料添加用組成物に含まれるDFMは、細菌芽胞、例えば、芽胞又は分生子からは構成されず、又は細菌芽胞を含有しない。
微生物は天然に生じる微生物であっても、あるいは形質転換を起こした微生物であってもよい。微生物は、好適な微生物の組み合わせであってもよい。
一部の態様では、本発明に従うDFMは、微生物、酵母、又は真菌のうちのいずれか1種以上であり得る。
好ましくは、本発明に従うDFMはプロバイオティク微生物である。
本発明では、用語「直接給与微生物(DFM)」は、直接給与細菌、直接給与酵母、直接給与真菌、及びこれらの組み合わせを包含する。
好ましいDFMは、直接給与微生物である。
好ましくは、DFMは2種以上、例えば、3種以上又は4種以上の細菌を含む混合物である。
好ましくは、これらの単独種又は複数種の微生物は、単離されたものである。
好適なDFMは、次の属:ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、バチルス(Bacillus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、カルノバクテリウム(Carnobacterium)属、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)属、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、クロストリジウム(Clostridium)属及びメガスフェラ(Megasphaera)属、並びにこれらの組み合わせ、のうちの1種以上に由来する細菌を含み得る。
一実施形態では、DFMは、次のバチルス菌種:枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、及びバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)から選択され得る。
一実施形態では、DFMは2種以上のバチルス(Bacillus)株を含む混合物であり得る。
一実施形態では、DFMは2種以上のバチルス(Bacillus)株を含む混合物であり得る。
一実施形態では、DFMは、2種以上の枯草菌(Bacillus subtilis)株、3A−P4(PTA−6506)、15A−P4(PTA−6507)、22C−P1(PTA−6508)、2084(NRRL B−500130)、LSSA01(NRRL−B−50104)、BS27(NRRL B−50105)、BS 18(NRRL B−50633)、及びBS 278(NRRL B−50634)の混合物であり得る。
株3A−P4(PTA−6506)、15A−P4(PTA−6507)、及び22C−P1(PTA−6508)は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)より公的に入手可能である。
株2084(NRRL B−500130)、LSSA01(NRRL−B−50104)、BS27(NRRL B−50105)は、米国の農業研究サービス機関の系統保存株(NRRL)より公的に入手可能である。枯草菌(Bacillus subtilis)株LSSA01はしばしば枯草菌8と呼ばれる。
これらの株については米国特許第7,754,469(B2)号に教示される。
枯草菌(Bacillus subtilis)BS 18及び枯草菌(Bacillus subtilis)BS 278は、ブダペスト条約の下、Andy Madisen(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha,WI 53186,USA)又はDanisco USA Inc.(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha,WI 53186,USA)により、農業研究サービス機関の微生物株保存施設(NRRL)(1815 North University Street,Peoria,Illinois 61604,United States of America)に、それぞれ寄託番号NRRL B−50633及びNRRL B−50634で2012年1月9日に寄託されている。
Andy Madisen(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha,WI 53186,USA)及びDanisco USA Inc.(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha,WI 53186)、USA authorise Danisco A/S(Langebrogade 1,PO Box 17,DK−1001,Copenhagen K、Denmark)は、本開示において、これらの寄託された生物材料を指すものであり、制限は受けておらず、かつ取り消しを受けぬよう、寄託された材料は公共に利用され得るものであると承認されている。
一部の実施形態では、DFMは、次の表に詳しく記載する枯草菌(Bacillus subtilis)株を含む混合物であり得る。
Figure 2014509846
一実施形態では、DFMは次のラクトコッカス種(Lactococcus spp):ラクトコッカス・クレモリス(Lactococcus cremoris)、及びラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、及びこれらの混合物から選択され得る。
一実施形態では、DFMは次のラクトバチルス菌種:ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ケフィリ(Lactobacillus kefiri)、ラクトバチルス・ビフィダス(Lactobacillus bifidus)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバシラス・へルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・クルバタス(Lactobacillus curvatus)、ラクトバシラス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、発酵ラクトバチルス(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、ラクトバチルス・ラクチス(Lactobacillus lactis)、デルブリュッキ菌(Lactobacillus delbreuckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・パラプランタルム(Lactobacillus paraplantarum)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、ガセリ菌(Lactobacillus gasseri)、ジョンソニイ菌(Lactobacillus johnsonii)、及びラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、並びにこれらのうちの任意の組み合わせから選択され得る。
一実施形態では、DFMは次のビフィズス菌種(Bifidobacterium spp):ビフィドバクテリウム・ラクティス(Bifidobacterium lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidium)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(Bifidobacterium animalis)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム(Bifidobacterium catenulatum)、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、及びビフィドバクテリウム・アンギュラツム(Bifidobacterium angulatum)、並びにこれらのうちの任意の組み合わせ、から選択され得る。
好適なDFMは次の属:枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス菌種(Enterococcus spp)、及びペディオコッカス菌種(Pediococcus spp)、ラクトバチルス菌種(Lactobacillus spp)、ビフィドバクテリウム菌種(Bifidobacterium spp)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococsus acidilactici)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、枯草菌(Bacillus subtilis)、プロピオニバクテリウム・ソエニイ(Propionibacterium thoenii)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、メガスファエラ・エルスデニイ(Megasphaera elsdenii)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス(Bifidobacterium animalis ssp. animalis)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス(Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius)、プロピオニバクテリア(Propionibacteria sp)及びこれらの組み合わせのうちの1種以上に由来する細菌を含み得る。
本発明に使用される直接給与微生物は、同じ種類(属、種及び株)であってよく、又は複数の属、種、及び/又は株の混合物を含んでよい。
本発明に従う好適なDMFは、次の表に記載される通りの1種以上の製品、又はこれらの製品に含有される微生物を含んでよい。
Figure 2014509846
Figure 2014509846
一実施形態では、好適なDFMはEnviva Pro(登録商標)である場合がある。Enviva Pro(登録商標)はDanisco A/Sから市販されている製品であり、バチルス(Bacillus)株2084 Accession No.NRRl B−50013、バチルス(Bacillus)株LSSAO1 Accession No.NRRL B−50104及びバチルス(Bacillus)株15A−P4 ATCC Accession No.PTA−6507の混合物である(米国特許第7,754,469(B)号に教示の通りのものである−参照により本案件に組み込まれる)。
好適には、DFMにはサッカロミセス菌種(Saccharomyces spp)由来の酵母を含ませることができる。
好ましくは、本発明に従って使用されるDFMは、一般に安全であると認識されている微生物であり、好ましくはGRASにより認可されている微生物である。
当業者であれば、食品産業及び/又は農産業において使用され、動物による消費に好適であると一般的に考えられ、本明細書に記載の属の範囲に含まれる微生物の、具体的な種及び又は株は容易に見当がつくであろう。
好ましくは、本発明に従って使用されるDFMは、動物による消費に好適なものである。
有利なことに、製品は飼料又は飼料添加用組成物であり、生活性を有するDFMは、製品の一般的な「販売期限」又は「消費期限」の間、すなわち飼料又は飼料添加用組成物が販売業者によって販売される期間中は効果を保持すべきである。所望の期間及び一般的な貯蔵寿命は、家畜用飼料によって異なる場合があり、当業者であれば、貯蔵寿命は、家畜用飼料の種類、家畜用飼料の容量、保管温度、加工条件、梱包材料及び梱包装置に応じ変化することを認識するであろう。
一部の実施例では、DFMが熱に耐性を有すること、すなわち熱耐性であることが重要である。これは特に、飼料がペレット形態である場合に当てはまる。したがって、一実施形態では、DFMは熱耐性微生物であり、例えば、バチルス菌種(Bacillus spp)などの熱耐性細菌であってよい。
一部の実施例では、DFMが芽胞形成細菌、例えば、バチルス菌種などのバチルス(Bacilli)であることが好ましい場合がある。バチルス(Bacilli)は、増殖に望ましくない条件下で安定な芽胞を形成することができる微生物であり、熱、pH、湿度、及び殺菌剤に対し非常に抵抗性である。
一実施形態では、DFMは、腸内での病原微生物(ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)及び/又は大腸菌(E. coli)及び/又はサルモネラ菌(Salmonella spp)及び/又はカンピロバクター菌種(Campylobacter spp)など)の増殖を低減又は予防できることが好適である。
本発明のDFMは、任意の好適なDFMであってよい。一実施形態では、本発明に従うDFMは、阻害株(又は抗病原体株)であってよい。一実施形態では、次のアッセイ「DFMアッセイ」により、DFMに好適な微生物を判定することができる。誤解を避けるため、一実施形態では、本明細書で教示する「DFMアッセイ」に従って抑制株(又は抗病原DFM)として選別されたDFMは、本発明に従って使用するのに、すなわち、本発明に従う飼料添加用組成物に使用するのに好適なDFMである。
DFMアッセイ:
各試験管に、代表的なクラスターの代表的な病原体を接種した。
可能性の高いDFMの好気的又は嫌気的増殖物の上清を試験管に接種し、インキュベートした。
インキュベート後、各病原体について、対照処理及び上清処理を行った試験管の吸光度(OD)を測定した。
対照と比較してODの値が低かった株(潜在的DFM)のコロニーを阻害株(又は抗病原性DFM)として分類した。
本明細書で使用するDFMアッセイは、米国特許第2009/0280090号(参照により本案件に組み込まれる)により詳細に説明される。
好ましくは、アッセイに使用される代表的な1種(以上の)病原体は、次の:ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)及び/又はクロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、及び/又は大腸菌(E. coli)、及び/又はサルモネラ菌種(Salmonella spp)、及び/又はカンピロバクター菌種(Campylobacter spp)などのクロストリジウム(Clostridium)属である。好ましい実施形態では、アッセイは、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、及び/又はクロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、及び/又は大腸菌(E. coli)のうちの1種以上を用い実施され、好ましくはウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、及び/又はクロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、より好ましくはウェルシュ菌(Clostridium perfringens)を用い実施される。
一実施形態では、本発明のDFMは好ましくは抗病原体である。
本明細書で使用するとき、用語「抗病原性」は、DFMが、病原体のもつ作用(例えば、負の効果)に対抗することを意味する。
一実施形態では、DFMが本発明に従う抗病原性のものであるかどうかを判定するのに、上記のDFMアッセイを使用できる。上述の「DFMアッセイ」において、特に、病原体がウェルシュ菌(Clostridium perfringens)である際に阻害株であると分類された場合、DFMは抗病原性又は抗病原性DFMであると見なされる。
一実施形態では、抗病原体DFMは、次の微生物:枯草菌(Bacillus subtilis)株2084 Accession No.NRRL B−50013、
枯草菌(Bacillus subtilis)株LSSAO1 Accession No.NRRL B−50104、
枯草菌(Bacillus subtilis)株15A−P4 ATCC Accession No.PTA−6507、
枯草菌(Bacillus subtilis)株3A−P4 ATCC Accession No.PTA−6506、及び
枯草菌(Bacillus subtilis)株BS27 ATCC Accession No.NRRL B−50105、のうちの1種以上であり得る。誤解を避けるため、これらの株は入手可能なものであり、かつ米国特許第7,754,459(B)に引用されるものである。
一実施形態では、本発明に従って使用されるDFMは、国際公開第2008/016214号に教示されるようなガセリ菌(Lactobacillus gasseri)BNR 17株Acc番号KCTC 10902BPではない。
好ましくは、DFMは、不活性化した微生物ではない。
一実施形態では、本明細書で使用されるDFMは、本明細書に記載の通りのDFM微生物を1種以上含む組成物である。組成物には、本発明の酵素を更に含ませることができる。組成物は、直接給与微生物(DFM)として動物に給与することができる。1つ以上の担体又はその他の材料をDFMに添加することもできる。DFMは、例えば、トップドレス、若しくは液体ドレンチ剤に使用される水溶性濃縮物として、又は代用乳、ゼラチンカプセル、若しくはゲルに加えるなどして、様々な物理形態で存在させることができる。トップドレス形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、石灰岩(炭酸カルシウム)、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び/又はアルミノ珪酸ナトリウムなどの担体に添加する。水溶性濃縮物の一実施形態では、液体ドレンチ剤用又は代用乳添加剤用の凍結乾燥させた発酵産物を、水溶性担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、スクロース、ブドウ糖、乾燥デンプン、アルミノ珪酸ナトリウムに添加し、液体を加えてドレンチ剤を生成するか、又は乳又は代用乳に添加剤を加えるかする。ゼラチンカプセル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を担体、例えば、乳清、マルトデキストリン、糖、石灰岩(炭酸カルシウム)、もみ殻、酵母培養物、乾燥デンプン、及び/又はアルミノ珪酸ナトリウムに加える。一実施形態では、微生物及び担体は分解性ゼラチンカプセルに封入される。ゲル形態の一実施形態では、凍結乾燥させた発酵産物を、ゲルを形成するための、担体、例えば植物油、スクロース、二酸化ケイ素、ポリソルベート80、プロピレングリコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、クエン酸、エトキシキン、及び/又は合成着色料に加える。
DFMは、所望により添加剤の乾燥製剤と混合してよく、このような乾燥製剤としては、増殖基質、酵素、糖、炭水化物、抽出物、及び増殖促進目的の微量成分が挙げられるが、これらに限定されない。糖としては、次の:ラクトース、麦芽糖、ブドウ糖、マルトデキストリン、ブドウ糖、フルクトース、マンノース、タガトース、ソルボース、ラフィノース、及びガラクトースが挙げられる。糖はそれぞれ又は合計して50〜95%の範囲である。抽出物には、可溶性の酵母又は乾燥酵母発酵産物が5〜50%含有され得る。増殖促進剤には、トリプチケースが5〜25%、乳酸ナトリウムが5〜30%、及びTween 80が1〜5%含有され得る。炭水化物としては、マニトール、ソルビトール、アドニトール、及びアラビトールが含まれ得る。炭水化物はそれぞれ又は合計して5〜50%の範囲である。微量成分としては、炭酸カルシウムが0.5〜5.0%、塩化カルシウムが0.5〜5.0%、リン酸二カリウムが0.5〜5.0%、リン酸カルシウムが0.5〜5.0%、マンガンプロテアーゼが0.25〜1.00%、及びマンガンが0.25〜1.0%の範囲で含有され得る。
本明細書で記載のDFMを調製する際、培養物及び担体(使用する場合)をリボンミキサー又はパドルミキサーに加え、約15分混合することができる。ただし、この混合時間は増減させてよい。培養物と単体が均一に混合されるように成分を混合する。最終生成物は好ましくは流動性の乾燥粉末である。次に、DFM又はこれを含む組成物を動物用飼料又は飼料プレミックスに添加することができ、又は動物用飲用水に添加することができ、又は当該技術分野で既知の他の手法により投与することができる(好ましくは、本発明の酵素とともに同時に)。動物用飼料には、本明細書に記載の1種以上のDMFを添加でき、あるいは本明細書に記載の組成物を添加できる。
「少なくとも2種の株からなる混合物」は、2、3、4、5、又は6種以上の株の混合物を意味する。一部の実施例の株混合物では、割合は1%〜99%で変化し得る。株混合物の他の実施例は25%〜75%である。株混合物の追加例では、各株約50%である。混合物が2種を超える株を含む場合、この株は混合物中に実質的に同じ比率で、又は異なる比率で存在し得る。
DFMは適切に投与できる。
飼料へのDFMの好適な投与量は、約1×10CFU/飼料(g)〜約1×10CFU/飼料(g)、好適には約1×10CFU/飼料(g)〜約1×10CFU/飼料(g)、好適には約7.5×10CFU/飼料(g)〜約1×10CFU/飼料(g)であり得る。
一実施形態では、DFMは約1×10CFU/飼料(g)超、好適には約1×10CFU/飼料(g)超、好適には約7.5×10CFU/飼料(g)超で飼料に添加される。
飼料添加用組成物へのDFMの好適な添加量は、約1×10CFU/組成物(g)〜約1×1013CFU/組成物(g)、好適には約1×10CFU/組成物(g)〜約1×1012CFU/組成物(g)、好適には約3.75×10CFU/組成物(g)〜約1×1011CFU/組成物(g)であり得る。
一実施形態では、DFMは、飼料添加用組成物に、約1×10CFU/組成物(g)超、好適には約1×10CFU/組成物(g)超、好適には約3.75×10CFU/組成物(g)超で添加される。
一実施形態では、DFMは、飼料添加用組成物に、約2×10CFU/組成物(g)超、好適には約2×10CFU/組成物(g)超、好適には約3.75×10CFU/組成物(g)超で添加される。
本明細書で使用するとき、用語「CFU」は、コロニー形成単位を意味し、単一の前駆細胞から***した細胞の凝集塊を示すコロニーに含まれる生細菌数に関する尺度である。
フィターゼ
フィチン酸(royo−イノシトール六リン酸)は、シリアル、豆類、及び油糧種子作物に含まれる重要な成分である。これらの植物において、リンの主要な貯蔵形態はフィターゼ塩の形態である。
フィターゼは、フィチン酸のリン酸モノエステルの加水分解を触媒し、これにより、段階的にミオ−イノシトールペンタキス−、テトラキス−、トリス−、ビス−及びモノホスフェートが生成され、並びに無機リン酸塩が遊離する。
用語「フィターゼ」は、フィチン酸などのリン酸エステルを加水分解して、無機リン酸を放出させることのできるタンパク質又はポリペプチドを意味する。フィターゼは、フィチン酸の他に、中程度にリン酸化されている少なくとも一部のイノシトールリン酸も加水分解することができる。
本発明で使用されるフィターゼは、6−フィターゼ(E.C.3.1.3.26として分類)、又は3−フィターゼ(E.C.3.1.3.8として分類)に分類され得る。
一実施形態では、フィターゼは、好ましくは6−フィターゼ(E.C.3.1.3.26)である。
本発明で使用されるフィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)細菌に由来する(好ましくは由来する)。
本発明で使用されるフィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)のフィターゼであり、好ましくは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)のフィターゼである。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)(例えば、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113)、シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)(例えば、C.フレウンディイ(C. freundii)NCIMB 41247)、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)(例えば、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)ATCC 25405又はシトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)ATCC 25407)、シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)(例えば、シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)DSM 13694)、シトロバクター中間種(Citrobacter intermedius)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シトロバクター・ムルリニアエ(Citrobacter murliniae)、シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)、シトロバクター・セドラキイ(Citrobacter sedlakii)、シトロバクター・ベルクマニイ(Citrobacter werkmanii)、シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)、又はシトロバクター(Citrobacter)種からなる群から選択されるシトロバクター(Citrobacter)細菌に由来し、好ましくは由来するものである。
一実施形態では、フィターゼは、例えば、
・国際公開第2006/037328号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113に由来する、シトロバクター(Citrobacter)・フィターゼ−この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号1として記載され、並びにこれらの変異体は、例えば、国際公開第2007/112739号(参照により本案件に組み込まれる)及び同第2011/117396号(参照により本案件に組み込まれる)に記載の通りのものである、
・国際公開第2004/085638号に記載の通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)YH−15−この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号7として記載される。
・シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、好ましくは、例えば、国際公開第2006/038062号(参照により本案件に組み込まれる)及び国際公開第2006/038128号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのC.フレウンディイ(C. freundii)NCIMB 41247、並びにそれらの変異体、又はUniProtKB/TrEMBL受諾番号Q676V7(本明細書において配列番号9として示す)又はEBI受諾番号EM−PRO:AY390262(本明細書において配列番号10として示す)により教示されるシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)のフィターゼ。
・国際公開第2006037327号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)、好ましくは、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)ATCC 25405又はシトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)ATCC 25407、
・シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)、好ましくは国際公開第2006037327号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)DSM 13694、又は
・シトロバクター中間種(Citrobacter intermedius)、
・シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、
・シトロバクター・ムルリニアエ(Citrobacter murliniae)、
・シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)、
・シトロバクター・セドラキイ(Citrobacter sedlakii)、
・シトロバクター・ベルクマニイ(Citrobacter werkmanii)、
・シトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)、
・シトロバクター・ファルメリ(Citrobacter farmeri)。
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、国際公開第2006/037328号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113に由来し得る、又は由来する、本明細書において配列番号1として示されるアミノ酸配列を有するフィターゼ、並びに例えば、国際公開第2007/112739号(参照により本案件に組み込まれる)及び国際公開第2011/117396号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのこれらの誘導体であり、あるいはシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、好ましくはC.フレウンディイ(C. freundii)NCIMB 41247に由来し得る、又は由来する、本明細書において配列番号5として示されるアミノ酸配列を有するフィターゼ、又はこれらの誘導体、例えば、国際公開第2006/038062号(参照により本案件に組み込まれる)及び国際公開第2006/038128号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのこれらの誘導体であり、あるいはUniProtKB/TrEMBL受諾番号Q676V7(本明細書において配列番号9として示す)に教示されるシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼ、あるいはEBI受諾番号EM−PRO:AY390262に教示されるシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼ(本明細書において配列番号10として示す)、あるいは国際公開第2004/085638号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)YH−15からに由来し得る、又は由来する、かつ本明細書において配列番号7として示されるアミノ酸配列を有するフィターゼ、又はこれらの誘導体、である。
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、国際公開第2006/037328号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113に由来し得る(又は由来する)フィターゼ(例えば、6−フィターゼ)、又はこれらの誘導体、例えば、国際公開第2007/112739号(参照により本案件に組み込まれる)及び国際公開第2011/117396号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りの誘導体である。
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは:(a)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド;(b)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、に1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び/又は保存的置換を含む、変異体;並びに/あるいは(c)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、の断片、からなる群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチドを含む。
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは:(a)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド;(b)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、に1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び/又は保存的置換を含む、変異体;並びに/あるいは(c)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、の断片、からなる群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチドを含む。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、フィターゼ活性を有し、かつ配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも99.1%同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを含む。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは:(a)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、及び(b)配列番号3又は配列番号4のアミノ酸67〜1299と少なくとも98.3%同一であるポリヌクレオチド、からなる群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされていてよい。
本発明で使用されるフィターゼは、(i)配列番号1のヌクレオチド1〜66、又は(ii)配列番号3のヌクレオチド1〜66、からなるシグナルペプチドをコードしている、ヌクレオチド配列によりコードされていてよい。
一部の実施例では、本発明で使用されるフィターゼは、上清を2部に分割し、一方を60℃で30分インキュベートし、他方を5℃で30分インキュベートして、続いていずれについても37℃、pH 5.5にてp−ニトロフェニルホスフェートにより活性を評価することにより、残存活性を測定した場合に、熱安定性が向上していることが示される。ここで、フィターゼの持つ残存活性とは、60℃でインキュベートした場合にサンプルが有する活性を、5℃でインキュベートした場合にサンプルが有する活性により除算したものであり、本明細書において配列番号1として示す参照フィターゼの残存活性は、同様の条件下で測定した場合に少なくとも105%である。
一部の実施例では、本発明で使用するフィターゼは、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含んでよく、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E、241Q、273L、276K、379K、385D、91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q及び362K、R、から選択される。
一部の実施例では、本発明で使用するフィターゼは、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含んでよく、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Qから選択される。
好ましい実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、Ronozyme HiPhos(商標)として市販されているフィターゼである。
酵素Ronozyme HiPhos(商標)は、本明細書において配列番号1として示されるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、本明細書において配列番号7として示されるアミノ酸配列、又はこれらの配列と少なくとも75%、好ましくは80%、好ましくは90%、好ましくは98%同一であるアミノ酸配列、を有する、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)YH−15フィターゼである。
一実施形態では、フィターゼは、国際公開第2006/038128号(参照により本案件に組み込まれる)に教示されるフィターゼ酵素などのシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)由来のフィターゼ、又はUniProtKB/TrEMBL受諾番号Q676V7(本明細書において配列番号9として示される)に教示されるシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼ、又はEBI受諾番号EM−PRO:AY390262(本明細書において配列番号10として示す)に教示されるシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼである。
一実施形態では、フィターゼは、例えば、シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)由来のフィターゼであってよく、国際公開第2006/038128号(この開示は参照により本案件に組み込まれる)において教示されるフィターゼ酵素であってよい。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、配列番号5、配列番号9、又は配列番号10で示される通りのアミノ酸配列、あるいは配列番号5、配列番号9、又は配列番号10と少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一である配列、あるいはこれらの機能性断片を含んでよい。
本明細書で使用するとき、用語「機能性断片」は、フィターゼ活性を有することを意味する。好ましくは「機能性断片」は、断片が、フィターゼ活性の種類及び/又は活性の程度の点から、完全長の配列の持つフィターゼ活性と同様の活性を有することを意味する。
一実施形態では、好ましくは本発明で使用されるフィターゼは:(a)配列番号5、配列番号9、又は配列番号10と少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、並びに(b)配列番号6又は配列番号11と、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリヌクレオチド、からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、次に示すヌクレオチド配列:
(a)配列番号6として記載のヌクレオチド配列、
(b)配列番号6として記載のヌクレオチド配列と少なくとも75%同一であるヌクレオチド配列、
(c)(a)又は(b)として提示したヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
(d)厳密な条件下で、(a)、(b)又は(c)として提示したヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列、
(e)(d)に詳述したヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、によりコードされる。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、配列番号5に示される通りのアミノ酸配列を含んでもよく、この配列は、シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼのものであるか、又はシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼと少なくとも90%同一であり、ポリペプチドは、
配列番号5に対する付番に従って付番した次の:R288M;
K46E/Q82H/E168D/Q274L;Q82K/T154I/Q279E/N308T;Q82R/D112V/Q274H/T362A;
D53N/D57Y/T199I/P229S/R288M;K46E/Q82H/N148D/T154I/T362I;
D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R;D53N/D57Y/T154I/P229S/R288M;
K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D383V;
D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P;D53K/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P;
D53N/D57Y/F88Y/M152V/P229S/Q279E/N308T;D53N/D57Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A393P;D53N/D57Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P;K46E/D53N/D57Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A393P;Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P;Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I384L/P386Q/A393P;H18Q/D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P;Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I384F/A393P/D397N;
D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D/N164D/Q274H/T362I/I384L/A393P;
D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N95P/P102L/V105I/Y136N/N148D/Y177F/Q274H/Q279E/T362I/A393P;
D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/Q274L/G343A/T362I/I384L/A393P;
E23K/K46E/Q82H;
K46E/Q82H/Q385R;
D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P;
からなる群から選択される変異を組み合わせて含み、
単離ポリペプチドは、配列番号5に示す配列を有するポリペプチドと比較して、熱安定性が向上している。
一実施形態では、本発明で使用されるフィターゼは、配列番号7で示される通りのアミノ酸配列、又は配列番号7で示される通りのアミノ酸配列と少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一である配列、又はこれらの機能性断片を含んでよい。
一実施形態では、好ましくは、本発明に従うシトロバクター(Citrobacter)フィターゼの至適pHは3〜4.5の範囲である。一実施形態では、好ましくは、本発明に従うシトロバクター(Citrobacter)フィターゼは、pH約3〜3.5で高い活性を示し得る。
国際公開第2006/037328号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113(この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号1として示される)、並びに国際公開第2004/085638号に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)YH−15(この酵素のアミノ酸配列は本明細書において配列番号7として示される)、のいずれも、至適pHは3〜4.5の範囲である。
国際公開第2006/037328号(参照により本案件に組み込まれる)に開示される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113(この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号1として示される)も、pH約3〜3.5下で最も高く活性を示し得る。
国際公開第2004/085638号に記載される通りのシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)YH−15(この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号7として示される)は、pH約4下で最も高く活性を示し得る。
好ましくは、1種以上のフィターゼを、例えば、2又は3種類のフィターゼを組み合わせて使用することができる。
本発明では、1種以上のシトロバクター(Citrobacter)フィターゼ(例えば、同一又は異なる種又は株由来のフィターゼ)を組み合わせて使用することもできることも企図される。あるいは、本明細書に詳述する通りの少なくとも1種のシトロバクター(Citrobacter)フィターゼを、シトロバクター(Citrobacter)のものではない1種以上のフィターゼと組み合わせて使用することもできる。
一実施形態では、好ましくは、本発明に使用するシトロバクター(Citrobacter)フィターゼは、6−フィターゼである。
一実施形態では、好ましくは、本発明に使用するシトロバクター(Citrobacter)フィターゼは、その他のフィターゼ(例えば、その他のシトロバクター(Citrobacter)フィターゼ、又はシトロバクター(Citrobacter)のものではないフィターゼ)とは組み合わせずに使用される。
好ましくは、フィターゼは、動物用飼料中に、約200FTU/飼料(kg)〜約1000FTU/飼料(kg)、より好ましくは約300FTU/飼料(kg)〜約750FTU/飼料(kg)、より好ましくは約400FTU/飼料(kg)〜約500FTU/飼料(kg)の範囲で存在する。
一実施形態では、フィターゼは、動物用飼料中に、約200FTU/飼料(kg)超、好適には約300FTU/飼料(kg)超、好適には約400FTU/飼料(kg)超で存在する。
一実施形態では、フィターゼは、動物用飼料中に、約1000FTU/飼料(kg)未満、好適には約750FTU/飼料(kg)未満で存在する。
好ましくは、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約40FTU/組成物(g)〜約40,000FTU/組成物(g)、より好ましくは約80FTU/組成物(g)〜約20,000FTU/組成物(g)、及び更により好ましくは約100FTU/組成物(g)〜約10,000FTU/組成物(g)、及び更により好ましくは約200FTU/組成物(g)〜約10,000FTU/組成物(g)の範囲で存在する。
一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約40FTU/組成物(g)超、好適には約60FTU/組成物(g)超、好適には約100FTU/組成物(g)超、好適には約150FTU/組成物(g)超、好適には約200FTU/組成物(g)超で存在する。
一実施形態では、フィターゼは、飼料添加用組成物中に、約40,000FTU/組成物(g)未満、好適には約20,000FTU/組成物(g)未満、好適には約15,000FTU/組成物(g)未満、好適には約10,000FTU/組成物(g)未満で存在する。
1FTU(フィターゼ単位)は、ISO 2009フィターゼアッセイ−すなわち、国際標準ISO/DIS 30024:1〜17,2009に見られる、フィターゼ活性及び1FTUを定量するための標準アッセイ−に定義される反応条件下で、基質から1分あたり1μmolの無機オルトリン酸を放出させるのに必要とされる酵素量であることは理解されるであろう。
一実施形態では、酵素は好適には上記のE.C.分類法により分類され、かつ1FTUの定量に関し本明細書において教示されるアッセイにおいて試験した場合に活性を有する酵素は、このE.C.分類法により命名される。
利点
驚くべきことに、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ(特に、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼ及び/又はシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼ)をDFMと組み合わせることで、壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性が向上すること(例えば、障害スコアの低下が見られる)が判明した。
特に、本明細書に教示する通りのシトロバクター(Citrobacter)フィターゼ(例えば、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)及び/又はシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)由来)を、DFMと組み合わせた場合に、壊死性腸炎に対する対象とする動物の耐性が、その他の既知のフィターゼ(例えば、シトロバクター(Citrobacter)以外の生物由来)と比較して格段に向上することは驚くべきことである。
一実施形態では、この効果は、その他のシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株(例えば、YH−15株由来のC.ブラアキイ(C. braakii)フィターゼ−この配列は、本明細書において配列番号7として示される)由来のフィターゼよりも、本明細書で教示される通りにRonozyme HiPhos(商標)として市販されるシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼに関しより明白であり、このような効果は完全に想定の範囲外のものであった。
更に、理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをDFMと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びDFMをどのように組み合わせればよいのかを提案する。一例としては、C.ブラアキイ(C. braakii)フィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低pH(例えば、3.5〜4.5)での活性が高い。単胃家畜(例えば、ブタ又は鶏)の胃腸(GI)管の胃領域はpHが低いことから、GI管のこの領域ではC.ブラアキイ(C. braakii)フィターゼの活性がより高くなることは明らかであり、したがって、これらのフィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較してより迅速に、フィチン酸基質から、リン、及びその他の栄養素、例えば、タンパク質を放出させ得る。特にpHの上昇に伴い、ミネラル及びタンパク質などのその他の基質と複合体を形成する傾向があるフィチン酸に対し、可能な限り迅速に作用させることが望ましい場合などの、多くの状況下で有利である。フィチン酸が複合体を形成した場合には、酵素が接近してフィチン酸を分解する可能性は低くなる。したがって、pHが低いGI管の胃領域において、フィターゼ基質に作用させることが望ましい。しかしながら、GI管の胃領域においてフィチン酸を分解させると、GI管の空腸及び以降の腸領域におけるリンの可用性が比較的低くなり、ラクトバチルス(これまでに、免疫系の調節、及び腸内pHを低下させる有機酸の産生などの、有益な効果を有すると示されている)などの常在性の「善玉」細菌集団に対し、悪影響が生じる恐れがある。常在性の「善玉」細菌に対し、このように悪影響が及ぼされることにより、日和見的に病原菌が増殖することになり、ひいては腸内細菌の全体的な平衡が崩れることになる。
本発明に関し、驚くべきことに、C.ブラアキイ(C. braakii)フィターゼを使用した場合の副作用は、1種以上のDFMと組み合わせて使用することで克服できることが判明している。DFMは、腸内細菌の平衡を回復させ、ひいては病原菌に起因する腸の損傷を軽減させ、対象とする動物の性能を向上させる。
この場合もやはり理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをDFMと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びDFMをどのように組み合わせればよいのかを提案する。シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低pH(例えば、3.5〜4.5)での活性が高い。胃腸(GI)管の胃領域はpHが低いことから、C.ブラアキイ(C. braakii)フィターゼは、GI管のこの領域においてより活性を示すことは明らかである。フィチン酸はタンパク質と結合して複合体を形成し得ることから、フィターゼがGI管の胃領域で活性であることにより、対象とする動物によるタンパク質の消化性も向上し得る。胃領域でタンパク質吸収が増加すると、動物による塩酸(HCl)の産生が減少する場合がある。塩酸(HCl)の産生が減少すると、GI管の以降の領域のpHが上昇することから、GI管の以降の領域において悪影響を与える可能性がある。病原体を腸内で増殖させる機会を増やすことから、GI管の腸以降の領域でpHが上昇することは、有利ではない。驚くべきことに、本発明により、これらの副作用は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼをDFMと組み合わせることで克服されることが判明している。
驚くべきことに、C.ブラアキイ株ATCC 51113(配列番号1のアミノ酸配列を有する)由来の6−フィターゼは、その他のC.ブラアキイ6−フィターゼ酵素、例えば、C.ブラアキイ株YH−15由来の6−フィターゼ(配列番号7のアミノ酸配列を有する)と比べて、更に良い影響を受ける。
DFMと酵素の処方
DFMと酵素は、活性DFMと活性酵素とを処方に確実に含有させるのに好適な方法で処方できる。
一実施形態では、DFMと酵素は液体、乾燥粉末、又は顆粒として処方され得る。
乾燥粉末又は顆粒は、トップスプレー式流動床コーター、ボトムスプレー式Wursterコーター又はドラム式造粒(例えば、高せん断造粒)、押出、パンコーティング又はマイクロミキサーなど、当業者に既知の手法により製造できる。
一部の実施形態ではDFM及び/又は酵素は被覆してよく、例えば、カプセル封入してよい。好適には、DFMと酵素は同一の被覆内に配合してよく又は同一のカプセル内にカプセル封入してよい。あるいは、いずれか又は両方の酵素を同一の被覆内に配合してもよく、あるいは同一のカプセル内にカプセル封入してもよく、かつDFMは、いずれかの又は両方の酵素とは別にして被覆中に配合することもできる。DFMが芽胞を産生し得る一部の実施形態では、DFMには何ら被覆を行わなくてもよい場合もある。このような状況では、DFMの芽胞は、いずれか又は両方の酵素と単純に混合してもよい。後者の場合、酵素を被覆してもよく、例えば、カプセル封入してもよく、例としては、いずれか又は両方の酵素を被覆してもよく、例えばカプセル封入してもよい。酵素は酵素の混合物(すなわち、いずれか又は両方の酵素の混合物)としてカプセル封入することができ、あるいは酵素は別個に、例えば、単一の酵素としてカプセル封入することもできる。一部の好ましい実施形態では、両方の酵素を一緒に被覆してよく、例えば、一緒にカプセル封入してよい。
一実施形態では、被覆は熱から酵素を保護し、熱保護材としてみなすことができる。
一実施形態では、飼料添加用組成物は、国際公開第2007/044968号(TPT顆粒剤と呼ばれる)又は同第1997/016076号又は同第1992/012645号(これらの各々が参照により本案件に組み込まれる)に記載の通り、乾燥粉末又は顆粒剤中に配合される。
一態様では、本発明の飼料は、蒸気処理し造立した飼料組成物を含み、この飼料組成物は、コア及び一層以上のコーティングを含む。コアは、表面上に層が形成されるよう酵素溶液を噴霧された塩顆粒又は同様物であってよい。コアは、少なくとも、本発明のフィターゼ及び/又はDFMなどの活性成分を、1種以上含む。少なくとも一層のコーティングは、防湿コーティングであってよい。一部の実施例では、少なくとも一層のコーティングは、塩を含む。特定の実施形態では、顆粒剤の粒径は、約210〜390μmである。一部の実施形態では、顆粒剤の粒径は、450μm以上、又は500μm以上であってよい。このような実施例は、国際公開第2006/034710号、同第00/01793号、同第99/32595号、同第2007/044968号、同第00/47060号、同第03/059086号、同第03/059087号、同第2006/053564号、及び米国特許第2003/0054511号に見出される。これらの開示の各々は参照により本案件に組み込まれる。
ペレットのコーティング用には、国際公開第2006/034710号に記載される1種以上の塩が好ましい(参照により本案件に組み込まれる)。ペレットをコーティングするのに好ましい塩の例としては:NaSO NaCl、NaCO、NaNO、NaHPO、NaPO、NHCL、(NHHPO、NHPO、(NHSO、KCl、KHPO、KHPO、KNO、KSO、KHSO、MgSO、ZnSO、及びクエン酸ナトリウム、又はこれらの混合物のうちの1つ以上が挙げられる。一部の態様については、ペレットをコーティングするのに好ましい塩の例としては、1種以上のNaSO、(NHSO、KSO、KHSO、MgSO、ZnSO、又はこれらの混合物などの、一種以上の硫酸塩が挙げられる。一部の態様については、ペレットをコーティングするのに好ましい塩の例としては、1種以上のNaSO、(NHSO、及びMgSO、又はこれらの混合物が挙げられる。一部の態様については、ペレットをコーティングするのに好ましい塩は、少なくともNaSOであり、又は少なくともNaSOを含む。
特定の態様では、本発明の飼料は、コアを含む顆粒からなり、コアは、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び/又はDFMを含み、かつ一層以上のコーティングにより被覆されており、少なくとも一層のコーティングは防湿層からなる。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒はコアを含み、コアは、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び/又はDFMを含み、かつ一層以上のコーティングで被覆され、少なくとも一層のコーティングは、防湿剤として機能し得る塩を含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒は、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び/又はDFMを含む、コアを含み、コアは、一層以上のコーティングで被覆され、少なくとも一層のコーティングは、NaSO NaCl、NaCO、NaNO、NaHPO、NaPO、NHCL、(NHHPO、NHPO、(NHSO、KCl、KHPO、KHPO、KNO、KSO、KHSO、MgSO、ZnSO、及びクエン酸ナトリウム、又はこれらの混合物のうちの1つ以上を含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒はコアを含み、コアは、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び/又はDFMを含み、かつ一層以上のコーティングを備え、少なくとも一層のコーティングは、NaSO、(NHSO、KSO、KHSO、MgSO、ZnSO、又はこれらの混合物のうちの1種以上といった硫酸塩を1種以上含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒は、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び/又はDFMを含む、コアを含み、コアは一層以上のコーティングを備え、少なくとも一層のコーティングはNaSO、(NHSO、及びMgSO、又はこれらの混合物のうちの1種以上を含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
特定の態様では、本発明の飼料は顆粒を含み、顆粒は、少なくとも、本発明に従うフィターゼ及び/又はDFMを含む、コアを含み、コアは一層以上のコーティングを備え、少なくとも一層のコーティングはNaSOであり、又は少なくともNaSOを含む。顆粒は、蒸気処理した顆粒であってよい。顆粒は、蒸気処理しペレット化した顆粒であってよい。
一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、活性剤、及び少なくとも1つの被覆を含む飼料組成物用の顆粒として配合されてよく、顆粒に含まれる活性剤は、a)飼料のペレット加工、b)蒸気加熱による飼料の前処理加工)、c)貯蔵、d)ペレット加工していない混合物としての材料の貯蔵、及びe)微量元素、有機酸、還元糖、ビタミン、塩化コリン、及び化合物から選択される少なくとも1種の化合物を含む飼料ベースミックス又は飼料プレミックスとしての成分の貯蔵、のうちの1つ以上から選択される条件で処理した後に少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%の活性を保持する。
顆粒に関しては、少なくとも1つのコーティングは湿分水和材料(moisture hydrating material)を含み得る。この材料は顆粒の少なくとも55重量%を構成し、及び/又は少なくとも1つのコーティングには2つのコーティングが含まれ得る。2つのコーティングは、湿分水和コーティング(moisture hydrating coating)及び防湿コーティングであってもよい。一部の実施形態では、湿分水和コーティングは顆粒の25重量%〜60重量%であってよく、防湿コーティングは顆粒の2重量%〜15重量%であってよい。湿分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプン、及びマルトデキストリンから選択されてよく、かつ防湿コーティングは、ポリマー、ガム、乳清、及びデンプンから選択されてよい。
顆粒は、飼料のペレット加工により製造してよく、飼料の前処理加工は、70℃〜95℃で、例えば85℃〜95℃で最大で数分間実施してよい。
一実施形態では、飼料添加用組成物は、コア、貯蔵後及び顆粒が材料となる蒸気加熱ペレット加工後に活性を少なくとも80%保持している活性剤、防湿コーティング、及び顆粒の少なくとも25重量%の湿分水和コーティング、蒸気加熱ペレット加工前の水分活性が0.5未満である顆粒、を含む、動物飼料用の顆粒に配合することができる。
顆粒はポリマー及びガムから選択される防湿コーティングを有してよく、湿分水和材料は無機塩であってよい。湿分水和コーティングは顆粒の25重量%〜45重量%であってよく、防湿コーティングは顆粒の2重量%〜10重量%であってよい。
顆粒は、蒸気加熱ペレット加工により製造することができ、このペレット加工は85℃〜95℃で最大で数分間実施することができる。
一部の実施例では、粉末澱粉、又は石灰石などの希釈剤を用いて、DFM(例えば、DFMの芽胞)を希釈してもよい。
一実施形態では、組成物は消費に好適な液体配合物であり、好ましくは、緩衝材、塩、ソルビトール、及び/又はグリセロールのうちの1つ以上を含有する液体製剤などである。
他の実施形態では、飼料添加用組成物は、塗布により、例えば、酵素の担体基材、例えば粉末小麦などへの噴霧により配合することができる。
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、プレミックスとして配合され得る。例えば、プレミックスは1種以上の飼料成分、例えば、1種以上のミネラル及び/又は1種以上のビタミンを含み得る。
一実施形態では、本発明での使用を目的としたDFM及び/又は酵素は、マルトデキストリン、石灰岩(炭酸カルシウム)、シクロデキストリン、小麦又は小麦成分、スクロース、デンプン、NaSO、タルク、PVA、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩(sorbiate)、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、1,3−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物から選択される少なくとも1種の生理学的に許容できる担体とともに配合される。
パッケージング
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物及び/又はプレミックス及び/又は飼料又は動物用飼料はパッケージ化される。
好ましい一実施形態では、飼料添加用組成物及び/又はプレミックス及び/又は飼料又は動物用飼料は、袋、例えば紙袋によりパッケージ化される。
代替的な実施形態では、飼料添加用組成物及び/又はプレミックス及び/又は飼料又は動物用飼料は、容器に密閉され得る。任意の好適な容器を使用できる。
飼料
本発明の飼料添加用組成物は、飼料として、又は飼料の調製に使用できる。
本明細書において、用語「飼料」は、「動物用飼料」と同義に使用される。
飼料は、使用及び/又は適用態様及び/又は投与態様に応じ、液体又は固体形態であり得る。
飼料として使用する際、又は試料の調製に使用する際、本発明の組成物は、次の:栄養学的に許容できる担体、栄養学的に許容できる希釈剤、栄養学的に許容できる賦形剤、栄養学的に許容できる補助剤、栄養学的有効成分のうちの1つ以上と組み合わせて使用できる。
好ましい実施形態では、本発明の飼料添加用組成物を飼料成分と混合して動物用飼料を製造する。
本明細書で使用するとき、用語「飼料成分」は、動物用飼料の全て又は一部を意味する。「動物用飼料の一部」は、動物用飼料に含まれる成分のうちの1つ、あるいは動物用飼料に含まれる成分のうちの1つ以上、例えば、2、又は3、又は4を意味し得る。一実施形態では、用語「飼料成分」は、プレミックス又はプレミックス成分を包含する。
好ましくは、飼料は、飼い葉又はそれらの混合物、配合飼料又はそれらのプレミックスであり得る。一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、配合飼料又は配合飼料成分と混合してよく、あるいは配合飼料のプレミックス、又は飼い葉、飼い葉成分、若しくは飼い葉プレミックスと混合してよい。
本明細書で使用するとき、用語「飼い葉」は、動物に提供される(動物がそれを求めて探しまわるというものではない)任意の食物を意味する。飼い葉には、切断済みの植物を包含する。
用語「飼い葉」には、干し草、わら、貯蔵牧草、圧縮及びペレット化飼料、油及び混合飼料、並びに同様に発芽穀類及びマメ科植物が包含される。
飼い葉は次の植物:アルファルファ(ルーサン)、大麦、シャジクソウ(birdsfoot trefoil)、アブラナ属、シャウ・モエラー(Chau moellier)、ケール、菜種(キャノーラ)、ルタバガ(スウェーデンカブ)、カブ、ツメクサ、タチオランダゲンゲ、ムラサキツメクサ、サブタレニアンクローバー、シロツメクサ、イネ科草本、偽エンバク(false oat grass)、ウシノケグサ、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、ヒース・グラス(heath grass)、牧草(牧草地及び草原の草が自然と混ぜ合わされたもの)、カモガヤ、ホソムギ、オオアワガエリ、コーン(maize)、アワ、エンバク、サトウモロコシ、大豆、樹木(まぐさ用に刈り込まれた枝葉)、小麦、及びマメ科植物のうちの1種以上から得られる。
用語「配合飼料」は、粉末、ペレット、ナッツ、ケーキ、又はクランブルの形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、各種原材料及び添加剤を配合したものであってよい。これらの配合物は、対象とする動物の求める具体的な必要量に従って配合される。
配合飼料は、1日に必要とされる栄養分をすべて提供する完全飼料、飼料の一部(タンパク質、エネルギー)を提供する濃厚飼料、又はミネラル及びビタミンなどのその他の微量栄養素のみを提供する栄養補助剤であってよい。
配合飼料には、コーン、大豆、サトウモロコシ、オーツ麦、小麦、及び大麦などの飼料用穀類が主成分として使用される。
本明細書で記載される通りに好適なプレミックスは、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵産物、及びその他の必須成分などの微量成分からなる組成物であり得る。一般的に、プレミックスは、市販の飼料に配合するのに好適な組成物である。
本発明の任意の動物用飼料は、a)シリアル類、例えば、小粒穀物(例えば、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、及びこれらの組み合わせ)、及び/又は大粒穀物(例えば、コーン又はサトウモロコシなど)など、b)シリアル類を原料とする製品、例えば、コーングルテンミール、コーン等の穀物からアルコールを作製した後の蒸留粕(DDGS)、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート(wheat shorts)、米ぬか、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプ、c)タンパク質類、例えば、大豆、ヒマワリ、落花生、ルピナス、エンドウ豆、ソラマメ、綿、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質など、d)油類及び脂肪類、例えば、植物資源及び動物資源から得られる油類及び脂肪類、e)ミネラル類及びビタミン類、からなる群から選択される1種以上の飼料材料を含み得る。
本発明の動物用飼料は、コーン及び大豆ミール、又はコーン及び高脂肪分大豆又は小麦ミール又はヒマワリミールを、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、又は少なくとも60重量%含有し得る。
これに加え、又はこれに代替して、本発明の動物用飼料には、少なくとも1種の高繊維飼料材料及び/又は少なくとも1種の高繊維飼料材料の少なくとも1種の副産物を含有させて、動物用高繊維飼料を提供することもできる。高繊維飼料材料の例としては、小麦、大麦、ライ麦、オーツ麦、穀類由来の副産物、例えば、コーングルテンミール、コーン等の穀物からアルコールを作製した後の蒸留粕(DDGS)、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート、コメヌカ、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプが挙げられる。一部のタンパク質資源:ヒマワリ、ルピナス、ソラマメ、及び綿などの資源から得られたタンパク質も、高繊維であるとみなすことができる。
本発明では、飼料は、次の:ペレット、ナッツ又は(ウシ用)ケーキなどの配合飼料及びプレミックス、農作物又は農作物廃棄物:コーン、大豆、サトウモロコシ、オーツ麦、大麦、コーン茎葉、コプラ、麦わら、まぐさ、サトウダイコン廃棄物;魚粉;刈りたての牧草類及びその他の飼料用植物;肉骨粉飼料;糖蜜;油かす及び圧搾ケーキ;オリゴ糖;保存加工した飼料植物:まぐさ及び貯蔵牧草;海草;全粒の又は圧砕、製粉などを施した種子及び穀類;発芽粒及び豆類;酵母エキス、のうちの1つ以上であり得る。
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、ペットフードも包含する。ペットフードは、ドッグフード又はキャットフードなど、ペットによる消費が意図された植物性又は動物性物質である。ドッグフード及びキャットフードなどのペットフードは、犬用キブルなどの乾燥形態、又はウェットタイプの缶詰のいずれかであってもよい。キャットフードには、アミノ酸のタウリンを含有させてもよい。
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、魚用飼料も包含する。一般的に、魚用飼料は、飼育している魚の健康を良好に保つのに必要とされる多量栄養素、微量栄養素、及びビタミンを含有している。魚用飼料は、フレーク、顆粒、又は錠剤形態で有り得る。顆粒形態の飼料のうち、一部の迅速に沈降する飼料は、多くの場合、大型の魚又は水槽底部で生活する種に使用される。一部の魚用飼料は、観賞魚の発色を人工的に改良する目的で、βカロテン又は性ホルモンなどの添加剤も含有する。
本発明では、一部の実施形態において用語、「飼料」には、鳥用飼料も包含する。鳥用飼料には、バードフィーダーに用いられるもの及びペットの鳥に給餌するためのものの両方の飼料が包含される。典型的な鳥用サンプルは多様な種子から構成されるが、獣脂(牛脂又は羊脂)を含有させてもよい。
本明細書で使用するとき、用語「接触」は、本発明の組成物が間接的に又は直接的に製品(例えば、飼料)に適用されていることを意味する。使用することのできる本開示の適用例としては、限定するものではないが、飼料添加用組成物を材料として含む製品を処理する工程、飼料添加用組成物を製品と混合して直接適用する工程、飼料添加用組成物を製品表面に噴霧する工程、又は製品を飼料添加用組成物の調合液に浸漬する工程、が挙げられる。
一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、好ましくは製品(例えば、動物用飼料)と混合させる。別の方法としては、飼料添加用組成物は、動物用飼料の乳濁液又は原材料に含有させてもよい。
一部の用途に関しては、組成物を作用させる/組成物で処理する製品表面上に又は表面に対して利用可能であるように、組成物を製造することが重要である。これにより、組成物に次の望ましい特性:性能利益のうちの1つ以上を付与する。
本発明の飼料添加用組成物は、DFM及び酵素の量を調整して、製品(例えば、動物用飼料、又は動物用飼料の原材料)に点在、被覆、及び/又は含浸させることができる。
DFM及び酵素は、同時に(例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも)、又は連続的に(例えば、これらを別の経路により送達した場合)使用できる。一実施形態では、好ましくはDFMと酵素は同時に適用する。好ましくは、DFMと酵素は、動物用飼料への送達前に、又は動物用飼料の原材料への送達前に混合させる。
本発明の飼料添加用組成物に含まれるDFMは、好適な濃度で添加でき、例えば、最終的な飼料製品中で、日用量あたり約2×10CFU〜約2×1011CFU、好適には約2×10〜約1×1010、好適には約3.75×10CFU〜約1×1010CFUの濃度になるよう添加できる。
好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、約70℃、約85℃、又は約95℃までの熱処理に対して熱安定性である。熱処理は、最大で約1分、約5分、約10分、約30分、約60分まで実施することができる。用語「熱安定性」は、特定温度への加熱前に添加剤中に存在した/添加剤中で活性であった酵素成分及び/又はDFMのうちの少なくとも約75%が、室温への冷却後も存在する/活性であることを意味する。好ましくは、特定温度への加熱前に添加剤中に存在しかつ活性であった酵素成分及び/又はDFMのうちの少なくとも約80%が、室温への冷却後も存在しかつ活性である。
特に好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を均質化させて、粉末を製造する。
代替的な好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第2007/044968号(TPT顆粒剤と呼ばれる)に記載の通りに顆粒に配合する。
他の好ましい実施形態では、飼料添加用組成物を顆粒に配合する場合、顆粒は、タンパク質コアを被覆する防水塩を含む。このような塩コーティングには、熱耐性の向上、貯蔵安定性の向上、及びそのままでは酵素及び/又はDFMに対し悪影響を及ぼすその他の飼料添加物からの保護、という利点がある。
好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、20℃下で、60%超の一定湿度と、0.25超の水分活性を有する。
好ましくは、塩コーティングは、NaSOを含む。
飼料添加用組成物の製造法は、更に、粉末をペレット化する工程も含み得る。粉末は、当該技術分野において知られているその他の成分と混合させることもできる。粉末、又は粉末を含む混合物に、ダイを通過させ、得られたストランドを望ましい長さで好適なペレットに切断する。
任意に、ペレット化工程は、ペレットの製造前の蒸気処理、又は調整工程を包含し得る。粉末を含む混合物は、調整槽に、例えば、蒸気噴射装置を備えるミキサーに入れることができる。混合物を調整槽内で、規定の温度まで、例えば60〜100℃に加熱する。典型的な加熱温度は、70℃、80℃、85℃、90℃、又は95℃である。滞留時間は、例えば、5秒、10秒、15秒、30秒、1分、2分、5分、10分、15分、30分、及び1時間などのように、秒単位から分単位、及び更には時間単位で変化させることができる。
本発明の飼料添加用組成物は、任意の適切な飼料材料に添加するのに好適であることは理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、用語「飼料材料」は、動物により消費されている基本的な飼料材料を意味する。飼料材料には、例えば、少なくとも1種以上の未加工の穀類、及び/又は加工植物、及び/又は大豆ミール又は骨粉などの動物性材料が含まれ得ることは更に理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、用語「動物用飼料」は、1種以上の飼料添加組成物が添加されている飼料材料を意味する。
異なる動物種は異なる動物用飼料を必要とすること、並びに同種の動物であってさえも、動物の飼育目的に応じ、異なる動物用飼料を必要とする場合があることは、当業者により理解されるであろう。
好ましくは、動物用飼料は、コーン(maizeすなわちcorn)、小麦、大麦、ライ小麦、米、タピオカ、サトウモロコシ、及び/又は任意の副産物、並びに大豆ミール、ナタネミール、セイヨウアブラナミール、綿実ミール、ヒマワリ種子ミール、動物性残渣、及びこれらの混合物などの高タンパク質成分を含むサンプル材料を含み得る。より好ましくは、動物用飼料は、動物性脂肪及び/又は植物油を含み得る。
場合により、動物用飼料には、カルシウムなどの追加のミネラル、及び/又は追加のビタミン類を含有させることもできる。
好ましくは、動物用飼料は、コーン/大豆ミール混合物である。
一実施形態では、好ましくは、飼料はペットフードではない。
他の態様では、動物用飼料の製造方法を提供する。動物用飼料では、典型的には、最初に原材料を安定な粒経に挽き、次に適切な添加剤と混合する。次に、動物用飼料を水で溶くか、又はペレット化することができる。後者の場合、典型的には、目的とする高さまで温度を上昇させ、次に飼料をダイに通過させて、特定の大きさのペレットを製造する手法を包含する。ペレットを冷却させる。続いて、脂肪、及び酵素などの液性添加物を添加してもよい。動物用飼料の製造には、特に、少なくとも蒸気の使用を包含し得る適切な技術により、ペレット化の前に押し出す又は膨張させることを含む、追加工程を包含させてもよい。
動物用飼料は、家禽(例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラ種鶏、七面鳥、鴨、ガチョウ、水鳥)、ブタ(全年齢種)、ペット(例えば、イヌ類、ネコ類)、又は魚などの単胃動物用の動物用飼料であってよく、好ましくは、動物用飼料は家禽用である。
一実施形態では、動物用飼料は産卵鶏用のものではない。
ほんの一例として、鶏、例えば、ブロイラー用の鶏用動物飼料は、下表に掲載される1種以上の成分を、下表に掲載される日齢%(%ages)で含み得る。
Figure 2014509846
ほんの一例として、ブロイラーなどの鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
Figure 2014509846
ほんの一例として、産卵鶏用飼料は、下表に掲載される1種以上の成分を、下表に掲載される日齢%で含み得る。
Figure 2014509846
ほんの一例として、産卵鶏用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
Figure 2014509846
ほんの一例として、七面鳥用飼料は、下表に掲載される1種以上の成分を、下表に掲載される日齢%で含み得る。
Figure 2014509846
ほんの一例として、七面鳥用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
Figure 2014509846
ほんの一例として、子豚用の飼料は、下表に掲載される1種以上の成分を、下表に掲載される日齢%で含み得る。
Figure 2014509846
ほんの一例として、子豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
Figure 2014509846
ほんの一例として、育成期/出荷期の豚用の飼料は、下表に掲載される1種以上の成分を、下表に掲載される日齢%で含み得る。
Figure 2014509846
ほんの一例として、育成期/仕上げ期の豚用の飼料の仕様は、下表に記載の通りのものであってよい。
Figure 2014509846
形態
本発明の飼料添加用組成物、及び他の成分及び/又は他の成分を含む家畜飼料は、任意の好適な形態で使用できる。
本発明の飼料添加用組成物は、固体又は液体製剤の形態で、又はこれらの代替形態で使用できる。固体製剤例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、カプセル、ペレット、タブレット、細粉、及び可溶性のもの、噴霧乾燥させたもの、又は凍結乾燥させものであり得る顆粒が挙げられる。液体製剤例としては、限定するものではないが、水溶液、有機溶液、又は有機溶媒水溶液、懸濁液、及び乳濁液が挙げられる。
一部の用途では、本発明のDFM又は飼料添加用組成物は、飼料と混合してもよく、又は飲用水に投与してもよい。一実施形態では、水に含有させる際の投与範囲は、約1×10CFU/動物/日〜約1×1010CFU/動物/日、及びより好ましくは約1×10CFU/動物/日である。
好適な形態例としては、粉末、ペースト、巨丸剤、ペレット、タブレット、丸剤、カプセル、腔坐剤、溶液又は懸濁液のうちの1つ以上が挙げられ、これらには、即効性、徐放性、修飾性(modified-)、持続性、周期性、拍動性、又は放出制御性投与用の着香剤又は着色剤を含有させることもできる。
例えば、本発明の組成物を固体形態、例えば、ペレット形態で使用する場合、組成物には、賦形剤(例えば、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム及びグリジンなど)、崩壊剤(例えば、デンプン(好ましくは、コーン、ポテト、又はタピオカ澱粉)、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の珪酸塩複合体など)、造粒結合剤(例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチン及びアカシアなど)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルク)のうちの一種以上を含有させることもできる。
成形の際に使用するにあたって栄養学的に許容できる担体例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペトロエトラル脂肪酸エステル(petroethral fatty acid esters)、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
成形に好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
水懸濁液及び/又はエリキシル剤の場合には、本発明の組成物は、各種甘味料又は着香料、着色剤又は染料、乳化剤及び/又は懸濁剤、並びに希釈剤(例えば、水、プロピレングリコール及びグリセリン、及びこれらの組み合わせ)と組み合わせることができる。
多くの場合、非吸湿性乳清は、DFM用(特に、微生物系DFM)の担体として使用され、DFMの増殖開始に良好な培地である。
ペーストを含有している微生物性DFMは、植物油及び不活性なゲル化材料と配合することもできる。
穀類副産物を担体とし、これに真菌製品を配合することもできる。
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、国際公開第2005/123034号に教示される微小粒子などの微小粒子系の形態ではない。
投与
本発明のDFM及び/又は飼料添加用組成物は、単回投与用に設計することができ、又は日単位での供給を目的として設計することもできる。
本発明と組み合わせて使用する組成物(及び組成物に含まれる各成分)の最適量は、処理する製品、及び/又は組成物を製品に接触させる方法、及び/又は製品の使用目的に応じて異なる。
組成物に使用するDFM及び酵素の量は、有効性を得るために、及びかかる組成物を含有している飼料を給与された動物の性能を向上させるのに十分な有効性を保持させるために、十分な量でなくてはならない。このような有効時間の長さは、少なくとも製品(例えば、飼料添加用組成物、又は飼料添加用組成物を含有している飼料)が利用される時間だけ延長させるべきである。
飼料に含まれるDFM対各酵素の比は、下記範囲で有り得る:
DFM:フィターゼ(CFU/FTU):5.0×10CFU DFM:1FTU酵素〜5.0×10CFU:1FTU酵素、好ましくは7.5×10CFU DFM:1FTU酵素〜2.5×10CFU:1FTU酵素の範囲。
一実施形態では、好ましくは、動物用飼料は次のものを含む:
フィターゼを少なくとも500FTU/kg(飼料)、並びに
Enviva Pro(登録商標)(DFM)を75,000CFU/g〜150,000CFU/g(飼料)。
一実施形態では、好ましくは、動物用飼料は次のものを含む:
フィターゼを500FTU/kg(飼料)、及び
Enviva Pro(登録商標)(DFM)を75,000CFU/g〜150,000CFU/g(飼料)。
他の実施形態では、動物用飼料は、次のものを含む:
フィターゼを625FTU/kg(飼料);及び
Enviva Pro(登録商標)(DFM)を37,500CFU/g〜75,000CFU/g(飼料)。
好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、次の通りに、動物用飼料に投与するのに十分な量の酵素及びDFMを含む:
フィターゼを500FTU/kg(飼料)、及び
Enviva Pro(登録商標)(DFM)を75,000CFU/g〜150,000CFU/g(飼料)。
好ましい実施形態では、飼料添加用組成物は、次の通りに、動物用飼料に投与するのに十分な量の酵素及びDFMを含む:
フィターゼを500FTU/kg(飼料)、及び
Enviva Pro(登録商標)(DFM)を37,500CFU/g〜75,000CFU/g(飼料)。
これらの好ましい実施形態に掲載したEnviva Pro(登録商標)は、本明細書に教示される任意の他のDFMと置き換えることができる。
好ましくは、これらの好ましい実施形態に掲載されるフィターゼは:(a)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド;(b)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、に1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び/又は保存的置換を含む、変異体;並びに/あるいは(c)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、の断片、からなる群から選択される、フィターゼ活性を有するポリペプチドを含む。
好ましくは、これらの好ましい実施形態に記載されるフィターゼは、酵素Ronozyme HiPhos(商標)であり、又は配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも98.6%同一であるアミノ酸を有する。
好ましい組み合わせでは、試料添加用組成物は、酵素Ronozyme HiPhos(商標)を、又は配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも98.6%同一であるアミノ酸を有するフィターゼを、DFMと組み合わせて含み、好ましくはDFMは、Envivo Pro(登録商標)、Calsporin(登録商標)、Clostat(登録商標)、Gallipro(登録商標)、GalliproMax(登録商標)、Gallipro(登録商標)Tect(登録商標)、Poultry star(登録商標)、Protexin(登録商標)、Proflora(登録商標)、Ecobiol(登録商標)、Ecobiol(登録商標)Plus、Fortiflora(登録商標)、BioPlus2B(登録商標)、Lactiferm(登録商標)、CSI(登録商標)、Yea−Sacc(登録商標)、Biomin IMB52(登録商標)、Biomin C5(登録商標)、Biacton(登録商標)、Oralin E1707(登録商標)、Probios−pioneer PDFM(登録商標)、Sorbiflore(登録商標)、Animavit(登録商標)、Bonvital(登録商標)、Levucell SB 20(登録商標)、Levucell SC 0 & SC10(登録商標)、ME Bactocell ActiSaf(登録商標)(旧称BioSaf(登録商標))、Miya−Gold(登録商標)、Fecinor、Fecinor Plus(登録商標)、InteSwine(登録商標)、BioSprint(登録商標)、Provita(登録商標)、PepSoyGen−C(登録商標)、Toyocerin(登録商標)、及びTOYOCERIN(登録商標)からなる群から選択される。
一実施形態では、試料添加用組成物は、フィターゼ、すなわち酵素Ronozyme HiPhos(商標)を、又は配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも98.6%同一であるアミノ酸を有するフィターゼを、DFMと組み合わせて含み、好ましくはDFMは:ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、バチルス(Bacillus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、クロストリジウム(Clostridium)、及びメガスフェラ(Megasphaera)、並びにこれらの組み合わせからなる属から選択される細菌である。
試料添加用組成物は、フィターゼ、すなわち酵素Ronozyme HiPhos(商標)を、又は配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも98.6%同一であるアミノ酸を有するフィターゼを、DFMと組み合わせて含み、好ましくはDFMは次の種(species):枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス菌種(Enterococcus spp)、及びペディオコッカス菌種(Pediococcus spp)、ラクトバチルス菌種(Lactobacillus spp)、ビフィドバクテリウム菌種(Bifidobacterium spp)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococsus acidilactici)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、枯草菌(Bacillus subtilis)、プロピオニバクテリウム・ソエニイ(Propionibacterium thoenii)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、メガスファエラ・エルスデニイ(Megasphaera elsdenii)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス(Bifidobacterium animalis ssp. animalis)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス(Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius)、プロピオニバクテリア(Propionibacteria sp)、並びにこれらの組み合わせの1つ以上に由来する細菌からなる群から選択される。
好ましい組み合わせでは、試料添加用組成物は:シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)(例えば、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113);シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)(例えば、C.フレウンディイ(C. freundii)NCIMB 41247);シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)(例えば、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)ATCC 25405又はシトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)ATCC 25407);シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)(例えば、シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)DSM 13694);シトロバクター中間種(Citrobacter intermedius)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シトロバクター・ムルリニアエ(Citrobacter murliniae)、シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)、シトロバクター・セドラキイ(Citrobacter sedlakii)、シトロバクター・ベルクマニイ(Citrobacter werkmanii)及びシトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)からなる群から選択されるシトロバクター(Citrobacter)細菌に由来する、好ましくは由来するフィターゼを、Enviva Pro(登録商標)、Calsporin(登録商標)、Clostat(登録商標)、Gallipro(登録商標)、GalliproMax(登録商標)、Gallipro(登録商標)Tect(登録商標)、Poultry star(登録商標)、Protexin(登録商標)、Proflora(登録商標)、Ecobiol(登録商標)、Ecobiol(登録商標)Plus、Fortiflora(登録商標)、BioPlus2B(登録商標)、Lactiferm(登録商標)、CSI(登録商標)、Yea−Sacc(登録商標)、Biomin IMB52(登録商標)、Biomin C5(登録商標)、Biacton(登録商標)、Oralin E1707(登録商標)、Probios−pioneer PDFM(登録商標)、Sorbiflore(登録商標)、Animavit(登録商標)、Bonvital.(登録商標)、Levucell SB 20(登録商標)、Levucell SC 0 & SC10(登録商標)、ME Bactocell ActiSaf(登録商標)(formerly BioSaf(登録商標))、Miya−Gold(登録商標)、Fecinor、Fecinor Plus(登録商標)、InteSwine(登録商標)、BioSprint(登録商標)、Provita(登録商標)、PepSoyGen−C(登録商標)、Toyocerin(登録商標)、及びTOYOCERIN(登録商標)からなる群から選択されるDFMと組み合わせて含む。
他の成分との組み合わせ
本発明での使用を目的としたDFM及び酵素は、他の成分と組み合わせて使用できる。したがって、本発明は、組み合わせにも関係する。本明細書において、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ(例えば、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼ、又はシトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)フィターゼ)と組み合わせたDFMを、「本発明の試料添加用組成物」として呼ぶことができる。
本発明の組み合わせは、本発明の飼料添加用組成物(又はこれらの構成成分の1種以上)と、動物による消費に好適でありかつ消費者に薬用効果又は生理学的効果を提供し得る他の成分と、を含む。
一実施形態では、「その他の成分」は、1つ以上の追加の飼料用酵素で有り得る。
本発明で使用するのに好適な追加の酵素は:アミラーゼ、キシラナーゼ、及び/又はプロテアーゼからなる群から選択される酵素のうちの1種以上で有り得る。
一実施形態では、好ましくは「他の成分」は、更なる酵素又は更なるDFMではない。
成分はプレバイオティクスであってもよい。典型的には、プレバイオティクスは、難消化性糖質(オリゴ糖類又は多糖類)、又は糖アルコールであり、上部消化管内では分解されず、すなわち吸収されない。市販品として用いられており、本発明に有用である既知のプレバイオティクスとしては、イヌリン(フラクトオリゴ糖、又はFOS)、及びトランス型ガラクトオリゴ糖(GOS又はTOS)が挙げられる。好適なプレバイオティクスとしては、パラチノースオリゴ糖、大豆オリゴ糖、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム(LBG)、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖(GOS)、フラクトオリゴ糖(FOS)、難消化性デンプン、ラクトスクロース(lactosaccharose)、ラクツロース、ラクチトール、マルチトール、マルトデキストリン、ポリデキストロース(すなわち、Litesse(登録商標))、ラクチトール、ラクトスクロース(lactosucrose)、大豆オリゴ糖、パラチノース、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖及びキシロオリゴ糖、ペクチン断片、食物繊維、マンナンオリゴ糖が挙げられる。
食物繊維としては、非デンプン性多糖類、例えば、アラビノキシラン、セルロース、及びその他の多くの植物成分、例えば、難消化性デキストリン、イヌリン、リグニン、ワックス、キチン、ペクチン、β−グルカン、及びオリゴ糖が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、本発明の飼料添加用組成物(又は飼料添加用組成物の1種以上の成分)と、プレバイオティクスとの組み合わせに関する。他の実施形態では、本発明は、DFMと、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びプレバイオティクスとを組み合わせて含む(又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる)飼料添加用組成物に関する。
プレバイオティクスは、本発明の飼料添加用組成物(又はこれらの成分)と同時に(例えば、一緒に混合することにより、又は同一の若しくは異なる経路により送達することにより同時に)、又は連続的に(例えば、同一の若しくは異なる経路により送達することにより連続的に)投与することができる。
本発明の組み合わせの他の成分としては、ポリデキストロース、例えば、Litesse(登録商標)、及び/又はマルトデキストリン、及び/又はラクチトールが挙げられる。場合によりこれらのその他の成分を飼料添加用組成物に添加することで、乾燥加工を補助し、かつDFMの生存を助けることもできる。
他の好適な成分の更なる例としては、次の:増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤、甘味剤(人口甘味剤を包含する)、レオロジー改質剤、安定化剤、抗酸化剤、染料、酵素、担体、賦形剤、添加剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、懸濁剤、崩壊剤、造粒結合剤などが挙げられる。これらのその他の成分は天然素材であってもよい。これらのその他の成分は化学的手法及び/又は酵素的手法を用い調製してもよい。
一実施形態では、DFM及び/又は酵素はカプセル封入することができる。一実施形態では、飼料添加用組成物、及び/又はDFM、及び/又は酵素は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第2007/044968号(TPT顆粒剤と呼ばれる)に記載される通りの乾燥粉末又は顆粒として配合される。
一実施形態では、本発明での使用を目的としたDFM及び/又は酵素は、1種以上の脂質と組み合わせて使用することもできる。
例えば、本発明での使用を目的としたDFM及び/又は酵素は、1種以上の脂質ミセルと組み合わせて使用することもできる。脂質ミセルは、単純脂質ミセル又は脂質ミセル複合体であってよい。
脂質ミセルは、脂質及び/又は油などの配向性両親媒性分子の集合体であってよい。
本明細書で使用するとき、用語「増粘剤又はゲル化剤」は、不混和性の液体の液滴、空気、又は不溶性固体のうちのいずれかの粒子の移動を緩慢にさせるか又は予防することにより、分離を防ぐ製品を指す。個々の水和分子の粘性が上昇し、分離が緩慢になった場合に、増粘がもたらされる。水和分子が結合して3次元ネットワークを形成し、粒子を捕捉し不動化させた場合に、ゲル化がもたらされる。
本明細書で使用するとき、用語、「安定化剤」は、経時変化から製品(例えば、食品)を保護する成分又は成分の組み合わせとして定義される。
本明細書で使用するとき、用語「乳化剤」は、エマルションの分離を予防する成分(例えば、食品成分)を指す。エマルションは、2種の不混和性の物質のうちの他方が液滴形態で存在し、他方に含有されている状態を指す。エマルションは、水中油型(油が液滴又は分散相となり、水が連続相となる)、又は油中水型(水が分散相となり、油が連続相となる)で構成される場合がある。液中気体の状態である発泡体、及び液中固体の状態である懸濁液も、乳化剤を使用して安定化させることができる。
本明細書で使用するとき、用語「結合剤」は、物理的又は化学的反応により製品を互いに結合させる成分(例えば、飼料成分)を指す。例えば、「ゲル化」中に水が吸収されることで、結合効果が得られる。しかしながら、結合剤は、油などの他の液体を吸収し、製品中に保持する場合もある。典型的には、本発明の文脈において、結合剤は、例えば、焼成製品、ペストリー、ドーナッツ、及びパンなどの、固体又は低湿分製品に使用されることになる。
「担体」又は「賦形剤」は、DFM及び/又は酵素の投与に好適な材料を意味し、このような材料としては、例えば、当該技術分野で知られている任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、又は可溶化剤などの任意の材料が挙げられる。これらの材料は、非毒性であり、かつ組成物に関係する任意の成分と有害な様式で相互作用しない。
本発明は、DFM及びサイトロバクターフィターゼを、少なくとも1種のマルトデキストリン、石灰岩(炭酸カルシウム)、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、NaSO、タルク、PVA、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩(sorbiate)、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、1,3−プロパンジオール、ブドウ糖、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物から選択される少なくとも1種の生理学的に許容できる担体と混合する工程を含む、飼料添加用組成物の製造方法を提供する。
賦形剤の例としては:微結晶セルロース及びその他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性のリン酸カルシウム、グリジン、デンプン、乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールのうちの1種以上が挙げられる。
崩壊剤の例としては:デンプン(好ましくはコーン、ポテト、又はタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の珪酸塩複合体のうちの1種以上が挙げられる。
造粒結合剤の例としては:ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、マルトース、ゼラチン、及びアカシアのうちの1種以上が挙げられる。
滑沢剤の例としては:ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルクのうちの1種以上が挙げられる。
希釈剤の例としては:水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン、並びにこれらの組み合わせのうちの1種以上が挙げられる。
他の成分は、同時に(例えば、これらを一緒に混合した場合、又は更には別の経路により送達した場合でも)、又は連続的に(例えば、これらを別の経路により送達した場合)使用できる。
好ましくは、本発明の飼料添加用組成物を他の成分と混合した場合にもDFMは生存活性を保持する。
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加用組成物はクロム又は有機クロムを含まない。
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はグルカナーゼを含有しない。
一実施形態では、好ましくは、本発明の飼料添加物はソルビン酸を含有しない。
濃縮物
本発明での使用を目的としたDFMは、濃縮物の形態であってもよい。典型的には、これらの濃縮物は、実質的に高濃度のDFMを含む。
本発明の飼料添加用組成物には、生細菌成分(コロニー形成単位、CFU)を含ませることができ、含有量は、少なくとも10CFU/g(好適には、少なくとも10CFU/g、例えば、少なくとも10CFU/g、少なくとも10CFU/g、少なくとも10CFU/g)〜約1010CFU/g(又は更には約1011CFU/g若しくは約1012CFU/g)の範囲である。
DFMが濃縮物の形態である場合、本発明の飼料添加用組成物には生細菌を少なくとも10CFU/g〜約1012CFU/g、好ましくは少なくとも1010CFU/g〜約1012CFU/gの範囲で含ませることができる。
濃縮形態の粉末、顆粒及び液体組成物を水で希釈するか、あるいは水又はその他の好適な希釈剤(例えば、ミルク又は鉱物油若しくは植物油などの好適な増殖培地)に再懸濁するかして、使用に際して組成物を用意することもできる。
本発明のDFM又は飼料添加用組成物、あるいは濃縮形態の本発明の組み合わせは、当該技術分野で知られている手法により製造することができる。
本発明の一態様では、酵素又は飼料は、濃縮形態の組成物と接触している。
本発明の組成物は、当該技術分野で知られている手法により噴霧乾燥又は凍結乾燥させてもよい。
噴霧乾燥工程を用い粒子を製造するための典型的な加工法は、固体材料を適切な溶媒に溶解させること(例えば、発酵培地でのDFMの培養)を伴う。別の方法としては、材料を非溶媒に懸濁又は乳化させて懸濁液又はエマルションを生成することもできる。場合により、この段階で、他の成分(上述のもの)、又は例えば、抗菌剤、安定化剤、染料、及び乾燥工程の助剤などの要素を添加してもよい。
次に溶液を霧化して、液滴の微細な霧を生成する。この液滴を直ちに乾燥チャンバに入れ、ガスと接触させる。液滴から乾燥ガス中に溶媒を蒸発させ、液体を固化させることで、粒子を生成する。次に粒子を乾燥ガスから分離し、回収する。
対象とする動物
本明細書で使用するとき、用語「対象とする動物(subject)」は、本発明の飼料添加用組成物、又は本発明の飼料添加用組成物を含む動物用飼料を、投与される又は投与されている動物(animal)を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「対象とする動物(subject)」は、動物(animal)を意味する。好ましくは、対象は、例えば、家畜類(livestock)、又は家畜(domesticated animal)(例えば、ペット)などの哺乳類、鳥類、魚類、又は甲殻類である。
一実施形態では、「対象とする動物」は家畜類である。
本明細書で使用するとき、用語「家畜類」は、任意の飼育動物を指す。好ましくは、家畜類は、雌牛又は雄牛(仔牛を含む)、豚(子豚を含む)、家禽(ブロイラー、鶏及び七面鳥を含む)、鳥類(例えば、アヒル、ライチョウ、キジ、及びウズラ)、魚類(サーモン、タラ、トラウト及びコイ科の魚(例えば、鯉)などの淡水魚、並びに海産魚(例えば、シーバス)を含む)、甲殻類(エビ、イガイ、及びホタテ貝など)、馬(競走馬を含む)、羊(子羊を含む)のうちの1種以上である。
一実施形態では、用語「家畜類及び/又は家禽及び/又は鶏」には産卵鶏は包含されない。
他の実施形態では、「対象とする動物」は家畜又はペット又は動物園などの環境で飼育されている動物である。
本明細書で使用するとき、用語「家畜」又は「ペット」、又は「動物園などの環境で飼育されている動物」は、イヌ科の動物(例えば、犬)、ネコ科の動物(例えば、猫)、げっ歯目(例えば、モルモット、ラット、マウス)、鳥類、魚類(淡水魚及び海産魚を含む)、並びに馬などの任意の関係性のある動物を指す。
一実施形態では、対象とする動物は腸内病原菌に曝露されている場合がある。
例えば、対象とする動物の腸又は消化管内には1種以上の腸内病原菌が存在している場合がある。例えば、対象とする動物の腸又は消化管内には1種以上の腸内病原菌が次の程度存在している場合がある:
i)動物の性能が低下する程度、及び/又は
ii)臨床的に意義のある程度、又は
iii)無症状の程度。
例えば、腸内病原菌はウェルシュ菌(Clostridium perfringens)であり得る。
性能
本明細書で使用するとき、「動物性能」は、飼料要求率及び/又は動物の体重増加により、並びに/あるいは飼料要求率により、並びに/あるいは飼料に含まれる栄養分の消化性(例えば、アミノ酸の消化性)及び/又は飼料に含まれるエネルギー又は代謝エネルギーの消化性により、並びに/あるいは窒素保持により、並びに/あるいは動物が壊死性腸炎の悪影響を回避する能力により、並びに/あるいは対象とする動物の免疫応答性により、決定することができる。
好ましくは「動物性能」は、飼料要求率及び/又は動物の体重増加により、並びに/あるいは飼料要求率により決定される。
「動物性能の向上」により、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用した場合に、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料と比較して、飼料要求率の向上、及び/又は体重増加の向上、及び/又は飼料要求率の減少、及び/又は飼料に含まれる栄養分若しくはエネルギーの可消化性の向上、及び/又は窒素保持の向上、及び/又は壊死性腸炎による悪影響を回避する能力の向上、及び/又は対象とする動物の免疫応答性の向上が得られることを意味する。
好ましくは、「動物性能の向上」により、飼料要求率の向上及び/又は体重増加の上昇及び/又は飼料要求率の減少が意味される。
本明細書で使用するとき、用語「飼料要求率」は、一定期間の間、動物に飼料を適宜又は規定量で給与した場合に生じる、体重増加の程度を指す。
「飼料要求率の向上」は、本発明の飼料添加用組成物を飼料に使用することで、飼料取り込み単位あたりの体重増加率が、既存の飼料添加用組成物を使用した場合と比較して向上していることを意味する。
飼料要求率(FCR)
本明細書で使用するとき、用語「飼料要求率」は、体重を特定量だけ増加させるために動物に給与する飼料量を指す。
飼料要求率の向上とは、飼料要求率が低くなることを意味する。
「飼料要求率の減少」又は「飼料要求率の向上」は、飼料に飼料添加用組成物を使用した場合に、動物の体重を特定量だけ増加させるために動物に給餌する必要のある飼料量が、かかる飼料添加用組成物を含有していない飼料を同量使用した場合と比較して少なくなることを意味する。
栄養素消化性
本明細書で使用するとき、栄養素消化性は、胃腸管又は胃腸管の特定の分節(例えば、小腸)から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素消化性は、対象とする動物に投与した量と、対象とする動物の糞便に分泌された量、又は胃腸管の特定の分節、例えば回腸において消化物中に残存している量との差として測定することができる。
本明細書で使用するとき、栄養素消化性は、期間中の***物の総回収量を用いて、栄養素の摂取量と排出量の差から測定することができ、あるいは動物により吸収されず、かつ胃腸管又は胃腸管分節において消失した栄養素の量が研究者により算出可能な不活性マーカーを用い、測定することができる。このような不活性マーカーとしては、二酸化チタン、酸化クロム、又は酸不溶性灰分が挙げられる。消化能は、飼料に含まれる栄養素の割合(%)として、又は飼料に含まれる栄養素の質量単位あたりの可消化栄養素の質量単位として、表すことができる。
本明細書で使用するとき、栄養素消化性能は、デンプン消化性、脂肪消化性、タンパク質消化性、ミネラル消化性、及びアミノ酸の可消化性能を包含する。
本明細書で使用するとき、「エネルギー消化率」は、飼料に含まれる総エネルギーから糞便に含まれる総エネルギーを減じるか、あるいは消費された飼料に含まれる総エネルギーから動物の胃腸管の特定の分節、例えば回腸に残存している総エネルギーを減じるかして算出された値を意味する。本明細書で使用するとき、「代謝エネルギー」は、見かけの代謝エネルギーを指し、消費された飼料に含まれる総エネルギーから、糞便、尿、及び消化に由来するガスに含まれる総エネルギーを減じた値を意味する。エネルギー消化率及び代謝エネルギーは、栄養素消化率の測定法と同様の方法を用い、飼料の代謝エネルギーを算出するために窒素排出について適切な補正を行って、摂取総エネルギーと、糞便に分泌された又は胃腸管の特定の分節に存在する消化物に残存する総エネルギーとの差として測定することができる。
窒素保持
本明細書で使用するとき、「窒素保持」は、対象とする動物が、食物由来の窒素を体重として保持する能力を意味する。窒素の排出が日常摂取量を超過した場合に負の窒素バランスが生じ、多くの場合、筋肉量の減少が見られる。正の窒素バランスは、多くの場合に筋肉の成長と関連付けられ、これは成長期の動物において顕著である。
窒素保持は、期間中の糞尿の総回収量を用いて、窒素摂取量と窒素排出量の差から測定することができる。窒素排出量には、飼料由来の未消化タンパク質、内因性のタンパク質性分泌物、微生物タンパク質、及び尿窒素が包含されることは理解されるであろう。
生存率
本明細書で使用するとき、用語「生存率」は、対象とする動物が生存し続ける率を意味する。用語「生存率の向上」は、「斃死率の低下」と言い換えることができる。
枝肉歩留まり及び精肉歩留まり
本明細書で使用するとき、用語「枝肉歩留まり」は、食肉処理に関係する商業工程又は試験工程後に得られる枝肉が生体重に占める割合を意味する。用語「枝肉」は、頭部、尾部、肢部、及び羽又は皮を取り除き食用に食肉処理された動物の肉体を意味する。本明細書で使用するとき、用語「精肉歩留まり」は、食肉が生体重に占める割合、あるいは特定の切り出し肉が生体重に占める割合を意味する。
体重増加
本発明は、更に、対象とする動物、例えば、家禽又はブタにおいて、体重増加率を向上させる方法を提供し、この方法は、本発明の飼料添加用組成物を含む動物用飼料を、対象とする動物に給与する工程を含む。
「体重増加の向上」は、飼料添加用組成物を含む飼料の給与を受けた動物の体重増加が、この飼料添加用組成物を含まない飼料の給与を受けた動物の体重増加と比較して向上していることを指す。
壊死性腸炎
壊死性腸炎は、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)により引き起こされる急性又は慢性の腸毒血症であり、世界中の鶏、七面鳥、及びアヒルで観察されている。多くの場合、壊死性腸炎は、一般的に小腸中央部に生じる線維素壊死性腸炎により特徴づけられる。斃死率は5〜50%であり、一般的には10%付近である。感染は、糞口感染により生じる。原因となる生物の芽胞は非常に耐性が高い。素因としては、コクシジウム症(coccidiosis/coccidiasis)、飼料(高タンパク)が挙げられ、アヒルでは、極度のストレス、高粘度の食餌(多くの場合、飼料のライ麦及び小麦含量が高いことに関係付けられる)、汚染された飼料及び/又は水、その他の衰弱を招く疾患などが挙げられる。
本発明は、対象とする動物の壊死性腸炎に対する耐性を向上させる工程に関する。換言すれば、本発明は、壊死性腸炎の副作用を回避する又は減少させる工程に関する。
本明細書で使用するとき、用語「に対する耐性」には、用語「〜耐性」を包含し得る。したがって、一実施形態では、対象とする動物は、壊死性腸炎耐性でない場合にも壊死性腸炎耐性とされる場合があり、すなわち、対象とする動物の性能に悪影響が現れない場合などがこれに当てはまる。
一実施形態では、本発明は、対象とする動物において壊死性腸炎を処理又は予防するための、本発明の飼料添加用組成物に関する。通常、対象とする動物は、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)及び/又はエイメリア(Eimeria)種を保有しているか、又はウェルシュ菌(Clostridium perfringens)及び/又はエイメリア(Eimeria)種に対し曝露されている。このような曝露は、環境に起因するか、あるいは例えば、コクシジウム生ワクチンが使用された場合など、飼料若しくは飲用水に生細菌が適用されたことに起因するものであり得る。
他の実施形態では、本発明は、対象とする動物においてコクシジウム症を予防及び/又は処置するための飼料添加用組成物に関する。
本発明は、壊死性腸炎及び/又はコクシジウム症を予防及び/又は処置する方法を更に提供し、本方法は、対象とする動物に、本発明に従う飼料添加用組成物を有効量で投与するものである。
免疫応答
本明細書で使用するとき、免疫応答は、抗体産生の増加、細胞介在性免疫の上方制御、炎症促進性サイトカインの上方制御、及びtoll様受容体シグナル伝達の増強など、DFMが動物の免疫系を調節する複数の経路のうちの1つを意味する。DFMによる胃腸管の免疫賦活は疾患から宿主を保護するのに有益な場合があり、及び胃腸管の免疫抑制は、免疫機能の支持に使用される栄養素及びエネルギーがより少なくなることから、宿主に有益な場合があることは、理解されるであろう。
好ましくは、免疫応答は、細胞性免疫応答である。
好ましくは、免疫応答は、免疫マーカーの観察により測定される。
病原菌
本明細書で使用するとき、用語「病原菌」は、例えば、毒素産生性のクロストリジウム(Clostridium)属例えば、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、及び/又は大腸菌(E. coli)、及び/又は、サルモネラ菌種(Salmonella spp)、及び/又はカンピロバクター菌種(Campylobacter spp)を意味する。一実施形態では、病原菌は、トリ病原性大腸菌(E. coli)属であり得る。
本発明は、対象とする動物の胃腸管において、病原菌数を減少させることができる。
栄養素の排出
一実施形態では、本発明は、糞尿への栄養素の排出の減少に関する。これにより、環境ハザードの減少に正の効果が得られる。例えば、好ましい実施形態では、本発明は、対象とする動物の糞尿に含まれる窒素、及び/又はリン含量を減少させることに関する。したがって、環境中の窒素及び/又はリンの量が減少することになり、都合がよい。
プロバイオティクス
一部の態様では、本発明の組成物に含まれるDFMは、プロバイオティクス培養効果を発揮し得ると考えられている。本発明の組成物に更にプロバイオティクス及び/又はプレバイオティクスを添加することも同様に本発明の範囲内に含まれる。
本明細書において、プレバイオティクスは、
「有益な細菌のうち1種又は限定種の増殖及び/又は活性を選択的に刺激することで宿主に有効に作用する難消化性食品成分」である。
本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティクス培養物」は、例えば、必要数だけ経口摂取又は局所適用された場合に、宿主生物に有利に作用する、すなわち、1種以上の実証可能な健康効果を宿主生物に付与する、生細菌(例えば、細菌又は酵母など)であると定義する。プロバイオティクスは、1箇所以上の粘膜表面において、微生物のバランスを改善し得る。例えば、粘膜表面は腸、尿路、気道又は皮膚であり得る。本明細書で使用するとき、用語「プロバイオティクス」は、免疫系の有効な分岐を刺激し得ると同時に、例えば、腸などの免疫表面において炎症応答を減少させる生細菌も包含する。
プロバイオティクス摂取の下限又は上限は存在しないものの、日用量として、少なくとも10〜1012、好ましくは少なくとも10〜1010、好ましくは10〜10cfuを用いることが、対象とする動物において有利な健康効果を得るのに有効であることが示唆されている。
本明細書で使用するとき、用語「善玉細菌」は、腸内に存在し、共生する、非病原性の細菌である。「善玉細菌」としては、ラクトバチルス菌種(Lactobacillus spp)(例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、及びビフィドバクテリウム(Bifidobacterium))が挙げられる。善玉細菌は、あまり望ましくない細菌が増殖しにくい環境を作り出し、疾患を予防する。
単離
一態様では、本発明で使用される好適な酵素又はDFMは、単離形態であってよい。用語「単離」は、酵素又はDFMが、少なくとも1種のその他の成分を少なくとも実質的に不含であることを意味し、少なくとも1種のその他の成分は、酵素又はDFMと、自然界において天然に関係するものであり、天然に見られる通りのものである。本発明の酵素又はDFMは、本来であればこの物質が関連付けられていたであろう1種以上の汚染物質を実質的に不含の形態で提供され得る。したがって、例えば、混入する可能性のある1種以上のポリペプチド及び/又は核酸分子を実質的に含まない。
精製
一態様では、好ましくは本発明に従う酵素及び/又はDFMは精製された形態である。用語「精製」は、酵素及び/又はDFMが高濃度で存在していることを意味する。酵素及び/又はDFMは、組成物中に存在する主成分として望ましいものである。好ましくは、酵素及び/又はDFMは、考慮中の総組成物に対し少なくとも約90%、又は少なくとも約95%、又は少なくとも約98%の濃度で存在し、この濃度は、乾燥重量/乾燥重量基準で決定される。
本明細書に記載の任意の特徴を組み合わせて本発明の範囲内に包含させるよう本発明の実施例を組み合わせ得ることも本発明の範囲内であると見なされる。特に、細菌に関係する何らかの治療上の効果が付随して発揮され得ることも本発明の範囲内のものであると見なされる。
ヌクレオチド配列
本発明の範囲は、本明細書に定義される通りの特性を有するタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を包含する。
本明細書で使用するとき、用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びに変異体、相同体、断片、及びこれらの誘導体(これらの一部分など)を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来、合成由来、又は組み換え由来であってよく、センス鎖又はアンチセンス鎖に関わらず二本鎖又は一本鎖であり得る。
本発明に関係する用語「ヌクレオチド配列」としては、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、及びRNAが挙げられる。好ましくはDNAを意味し、より好ましくは本発明をコードしているcDNA配列を意味する。
好ましい実施形態では、本発明の範囲それ自体に関係するとき、及び本発明の範囲それ自体に包含されるとき、ヌクレオチド配列は、天然の状態であるならば、及び同様にその天然の状態である天然に関連付けられる配列と結合しているならば、本発明に従うネイティブなヌクレオチド配列を含有しない。参照しやすさのため、出願人らは、この好ましい実施形態のことを「非ネイティブなヌクレオチド配列」と呼ぶことにする。この観点で、用語「ネイティブなヌクレオチド配列」は、ネイティブな状態のヌクレオチド配列全長を意味し、かつ天然に関連付けられる完全なプロモータに操作可能に連結させてある場合には、このプロモータもネイティブな状態のものである。しかしながら、本発明の範囲に包含されるアミノ酸配列は、ネイティブな生物においてヌクレオチド配列を発現させた後で単離することができ、及び/又は精製することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の範囲内に包含されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によりそのネイティブな生物において発現させることができるものの、本明細書では、ヌクレオチド配列は、生物内で天然に関連付けられるプロモータの制御下にはない。
典型的には、本発明の範囲内に包含されるヌクレオチド配列は、組み換えDNA技術を用い調製される(すなわち、組み換えDNA)。しかしながら、本発明の代替的な実施形態においては、ヌクレオチド配列は、当該技術分野で広く知られる化学な手法により、その全体又は一部を合成することができる(Caruthers MH et al.(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215〜23及びHorn T et al.(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225〜232を参照されたい)。
ヌクレオチド配列の調製
本明細書に定義される通りの特性を有するタンパク質又は修飾に好適なタンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列は、このタンパク質を生産する任意の細胞又は生物から同定及び/又は単離及び/又は精製することができる。当該技術分野ではヌクレオチド配列の同定及び/又は単離及び/又は精製に関し各種手法が広く知られている。例えば、同定及び/又は単離及び/又は精製された好適な配列をより多量に調製するためには、PCRによる増幅法を使用できる。
更なる例に関しては、酵素を産生する生物由来の染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用い、ゲノムDNA及び/又はcDNAライブラリを構築することができる。酵素のアミノ酸配列が既知のものである場合、標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用い、生物から作成したゲノムライブラリ由来のクローンをコードしている酵素を同定することもできる。別の方法としては、その他の既知の酵素遺伝子と配列相同性である、標識化したオリゴヌクレオチドプローブを使用して、クローンをコードしている酵素を同定することもできる。後者の場合、厳密度の低いハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件が用いられる。
別の方法としては、ゲノムDNA断片を、プラスミドなどの発現ベクターに挿入し、これにより得られるゲノムDNAライブラリにより、酵素の発現が陰性の細菌を形質転換させ、この形質転換させた細菌を、酵素用の基質(すなわち、マルトース)を含有している寒天プレートに播種することにより、酵素を発現しているクローンを同定することもできる。
更に他の態様では、酵素をコードしているヌクレオチド配列を、例えば、Beucage S.L.et al.(1981)Tetrahedron Letters 22,p 1859〜1869により記載のホスホラミダイト法、又はMatthes et al.(1984)EMBO J.3,p 801〜805により記載の方法などの、確立されている標準法により合成し、調製することもできる。ホスホラミダイト法では、例えば、DNA自動合成装置によりオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、アニーリングされ、適切なベクターにライゲーションされ、及びクローン化される。
ヌクレオチド配列は、合成起点、ゲノム起点、又はcDNA起点(必要に応じて)の断片を、一般的な手法により連結することで調製される、ゲノム起点と合成起点の混合物、合成起点とcDNA起点の混合物、又はゲノム起点とcDNA起点の混合物、であってよい。ライゲートした各断片は、完全なヌクレオチド配列の各部位に対応する。DNA配列は、特異的なプライマーを用い、例えば、米国特許第4,683,202号又はSaiki R K et al.(Science(1988)239,pp 487〜491)に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により調製することもできる。
アミノ酸配列
本発明の範囲には、本明細書に定義される通りの特性を有する酵素のアミノ酸配列も包含される。
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び/又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
アミノ酸配列は、好適な供給源から調製/単離することができ、あるいは合成することができ、あるいは組み換えDNA法により調製することができる。
本発明に包含されるタンパク質は、他のタンパク質、特に酵素と組み合わせて使用することもできる。したがって、本発明は、タンパク質の組み合わせも範囲とし、この組み合わせには、本発明のタンパク質/酵素、及びその他のタンパク質/酵素が含まれ、その他のタンパク質/酵素は、本発明のその他のタンパク質/酵素であってよい。
好ましくは、アミノ酸配列は、本発明の範囲に関係する場合、及び本発明の範囲に包含される場合、ネイティブな酵素ではない。この点において、用語「ネイティブな酵素」は、そのネイティブな環境に存在し、かつネイティブなヌクレオチド配列により発現されたものである場合、完全な酵素を意味する。
配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に定義される特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列と、又はこのようなポリペプチドをコードしている任意のヌクレオチド配列と、ある程度の配列同一性又は配列相同性を有する、配列の使用も包含する(本明細書において、以降「相同性配列」として参照する)。本明細書において、用語「相同性」は、参照している配列が、対象とするアミノ酸配列及び対象とするヌクレオチド配列と一定の相同性を有することを意味する。本明細書において、用語「相同性」は、「同一性」と等しい。
相同性アミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持し及び/又は酵素活性を増大させるポリペプチドを提供及び/又はコードしなくてはならない。
本文脈では、相同性配列は、対象とする配列と少なくとも75、85、又は90%同一性である、好ましくは少なくとも95又は98%同一性であるアミノ酸配列を含有する。一般的には、相同性配列は、対象とするアミノ酸配列と同様の活性部位などを含み得る。相同性は、類似度(すなわち、アミノ酸残基が類似する化学特性/機能を有する程度)の観点から考慮することもできるものの、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表現するのが好ましい。
本発明の文脈では、相同性配列は、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列(参照配列)と少なくとも75、85又は90%同一である、好ましくは少なくとも95又は98%同一であるヌクレオチド配列を包含する。一般的には、相同性配列は、対象とする配列の活性部位などをコードする配列と同様の配列を含む。相同性は、類似度(すなわち、アミノ酸残基が類似する化学特性/機能を有する程度)の観点から考慮することもできるものの、本発明の文脈では、配列同一性の観点で相同性を表現するのが好ましい。
相同性比較は、目視検査により実施することができ、あるいはより一般的には、すぐに利用できる配列比較プログラムの補助により実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムでは、2つ以上の配列の相同性(%)を算出することができる。
相同性(%)は、連続する配列間で算出することができ、すなわち1つの配列を他の配列と整列させ、一方の配列に含まれる各アミノ酸を、他方の配列に含まれる対応するアミノ酸と一度に一残基ずつ直接比較することで算出することができる。この手法は「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアライメントは、残基数が比較的少ない場合にのみ実施される。
この手法は非常に単純でかつ着実な手法であるものの、例えば、本来であれば同一である配列対において、1箇所に挿入又は欠失が入っている場合を考慮に入れることができず、以降のアミノ酸残基はアラインメントから除外されることになり、したがって、グローバルアラインメントを実施した場合に、相同性(%)が大幅に低下する可能性がある。これらを踏まえ、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに対して重すぎるペナルティーを設けずに、可能性のある挿入及び欠失を考慮に入れ、最適なアラインメントを生成するよう設計されている。この手法は、配列アラインメント時に「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化させることで実施される。
しかしながら、これらのより複雑な手法は各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てるものであり、同数の同一のアミノ酸に関し可能な限りギャップが少なくなる−比較する2つの配列間の関連性がより大きく反映される−ような配列アラインメントは、ギャップを多く含むアラインメントと比較してより高いスコアが付けられるようになる。「アフィンギャップコスト」は、一般的に用いられる手法であり、この手法では、ペナルティは、ギャップの伸長に対して比較的重く設定され、ギャップ中で続く各残基に対しては軽く設定される。この手法は、最も一般的に使用されているギャップスコアリング系である。当然のことながら、ギャップペナルティが高い場合には、ギャップ数がより少なくなるよう最適化されたアラインメントが得られることになる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較の際にこのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用することが好ましい。
したがって、配列の最大一致度を計算するには、まず第一にギャップペナルティを考慮に入れて最適アラインメントを行うことが必要とされる。このようなアラインメントを実施するのに好適なコンピュータプログラムはVector NTI(Invitrogen Corp.)である。配列比較を実行するソフトウェアの例としては、限定するものではないが、BLASTパッケージ(Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed−Chapter 18を参照されたい)、BLAST 2(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247〜50;FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187〜8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照されたい)、FASTA(Altschul et al 1990 J.Mol.Biol.403〜410)、及びAlignXが挙げられる。オフライン及びオンライン検索には、少なくともBLAST、BLAST 2及びFASTAを利用することができる(Ausubel et al 1999,pages 7〜58〜7〜60を参照されたい)。
最終的な相同性(%)は、同一性の観点から評価され得るものの、アラインメント方法は、典型的には、全か無かの対比較に基づくものではない。その代わりに、一般的にはスケールを用いた類似性スコアマトリックスが用いられ、各一対比較に対し、科学的類似性又は進化距離に基づきスコアが割り当てられる。一般的に用いられるこのようなマトリックス例としては、BLOSUM62マトリックスが挙げられ、この場合、プログラムにはBLAST向けのデフォルトのマトリックスが適する。ベクターNTIプログラムには、概して、一般的なデフォルト値、又は提供された場合にはカスタムされたシンボル比較表のいずれかが用いられる(更なる詳細については使用者マニュアルを参照されたい)。一部の用途に関しては、ベクターNTIパッケージにはデフォルト値を用いることが好ましい。
別の方法としては、相同性(%)は、CLUSTAL.(Higgins DG & Sharp PM(1988),Gene 73(1),237〜244)に類似するアルゴリズムに基づき、ベクターNTI(Invitrogen Corp.)における多重配列アラインメントによる特性を用い、算出することができる。
ソフトウェアにより最適アラインメントを生成すれば、相同性(%)、好ましくは配列同一性(%)を算出することができる。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこの算出を行い、計算結果を生成する。
配列同一性を決定する場合にはギャップペナルティを用いるべきであり、好ましくは、ペアワイズアラインメントに関し以降のパラメータを用いる:
Figure 2014509846
Figure 2014509846
一実施形態では、ギャップペナルティ及びギャップ伸長については上記の通りの設定を用い、CLUSTALを使用することができる。
好適には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、少なくとも20個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも30個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも40個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも50個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも60個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも100個の連続するヌクレオチドにわたって決定される。
好適には、ヌクレオチド配列に対する同一度は、配列全長にわたって決定することができる。
ハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の核酸配列に対する相補的配列、あるいは本発明の配列又は本発明の配列に相補的な配列のいずれかとハイブリッド形成し得る配列に対する相補的配列、も包含する。
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイゼーション」には、「核酸鎖が塩基対形成により相補鎖と結合する工程」、並びにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法で実施される増幅工程を包含するものとする。
本発明は、本明細書において示す配列に相補的な配列に対してハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列、又は任意の誘導体、断片、あるいはこれらの誘導体の使用も包含する。
用語「変異体」は、本明細書において示すヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成し得る配列に相補的な配列も包含する。
好ましくは、相補的配列は、厳密な条件下(例えば、50℃かつ0.2xSSC {1xSSC=0.15M NaCl、0.015M Naクエン酸塩、pH 7.0})で、本明細書に示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得る。
より好ましくは、相補的配列は、非常に厳密な条件下(例えば、65℃かつ0.1xSSC{1xSSC=0.15M NaCl、0.015M Naクエン酸塩、pH 7.0})で、本明細書に示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成し得る。
より好ましい態様では、本発明は、非常に厳密な条件下(例えば、65℃かつ0.1xSSC)で、本発明のヌクレオチド配列、又はその相補配列とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列を含む。
実施例1
方法
4000羽の1日齢のCobb雄雛を民間の孵化場から購入する。試験の開始時に50羽の雄を一集団として各処理区画に割りつけ、一処理につき計9区画を用意する。試験は、次の処理から構成される(表1):
表1.実施例1の試験設計
Figure 2014509846
「バチルス(Bacillus)DFM」:Danisco A/Sより提供される、枯草菌(Bacillus subtilis)株Bs2084、LSSAO1及び15AP4を組み合わせた商品である、Enviva Pro(登録商標)を、150,000CFU/g(飼料)で投与。
「ラクトバチルス(Lactobacillus)DFM」:Danisco Animal Nutritionより提供される、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)及びラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)を組み合わせた商品である、Sorbiflore(登録商標)を、350,000CFU/g(飼料)で投与。
「Ronozyme P(登録商標)」は、コウジカビ(Aspergillus oryzae)において発現させた、ペニフォラ・リシイ(Peniphora lycii)由来の6−フィターゼである。このアミノ酸配列は、本明細書において配列番号8として提供される。(これは「シトロバクター(Citrobacter)以外」の6フィターゼである)
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株ATCC 51113由来の6−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号1として提供される。
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株YH−15由来の6−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号7として提供される。
各区画の鳥類の体重を、試験初日、23日目、35日目、及び最終日(42日)に測定する。各区画を測定単位とする。ブロイラー用の飼料は、マッシュ飼料として給与する。飼料は、NRC標準を満たすか、又は超過する(表2)。飼料間の相互混入を防止するため、ミキサーはフラッシングする。すべての処理飼料は、Davis S−20ミキサーを用い混合する。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料から試料を回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びDFMの存在を確認した。
表2.実施例1の試験飼料の組成
Figure 2014509846
鳥類に適宜給餌し、0日〜42日の間処理した。すべての試験処理群に関し、酵素及びDFMは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でDaniscoから提供される。混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防する。試験の21日目に、前期飼料から後期飼料に変えた。試験の35日目に、育成飼料を仕上げ飼料に変える。各飼料の交換時に、飼育者は、各区画毎に飼料を回収し、計量し、空にし、適切な処理飼料を再充填する。試験の最終日に飼料を計量する。各区画の斃死を毎日確認する。間引きしたか、又は斃死が発見された場合、日付及び取り除いた鶏の重量(kg)を記録する。すべての斃死又は間引き鶏に対し、肉眼剖検を実施し、性別及び推定される死因を判定する。壊死性腸炎の兆候を記録する。
すべての区画は約10.2cm(4インチ)に組み立て、床敷を敷き詰めた。区画に配置する前に、市販のコクシジウム症ワクチン(Coccivac−B)を用い、すべての鳥類に噴霧ワクチンを接種する。18、19、及び20日目に、処理群1を除きすべての鳥類にウェルシュ菌(Clostridium perfringens)のブロス培地を投与する。NEを引き起こすことが知られており、商用ブロイラーの運用に由来する、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)の野生分離株を曝露菌として利用する。毎日、新鮮な摂取材料を使用する。滴定レベルは約1.0×108〜9である。各区画に対する接種は同量で行う。接種材料は、チューブフィーダーのベースに一般的に見られる飼料に混合して投与する。21日目に、各区画から5羽の鳥を選別し、屠殺し、グループを計量し、及び壊死性腸炎領域の病変の程度について評価する。採点は、0〜3点で行う。0が正常であり、3が最も深刻である(0=所見なし、1=わずかに症状が見られる、2=中等度の症状が見られる、3=顕著な/深刻な症状が見られる;Hofacre et al.,2003 J.Appl.Poult.Res.12:60〜4)。試験の間、薬剤の併用は行わない。新鮮なサンプル(0.5g)を5mLの脱イオン水で希釈し、ガラス製の参照微小電極を併用して、空腸内容物のpHを測定した。
サンプル採取
21日目に、各処理毎に計8羽の鳥を屠殺し、それぞれの鳥から砂嚢〜回腸・盲腸接合部までの消化管をすべて回収し、氷で冷やしながら一晩のうちに研究室に送る。研究室で、試料を更に細断し、メッケル憩室周辺の空腸(20cm)を得て、腸管の残りは廃棄する。このようにして得た空腸断片を0.1%ペプトンですすぎ洗いし、腸内容物を洗い流し、長手方向軸に沿って切り開いて上皮層を露出させる。99mLの0.1%ペプトンを用い、空腸断片を7.0ストローク/sで60秒間処理しパルプ状にし、粘膜関連細菌を放出させる。12,000×gで10分遠心分離し、パルプ溶液から細菌を回収する。得られる細菌ペレットを、10mLのMRSブロス+10%グリセロールに再懸濁し、液体窒素で瞬間冷凍し、更なる解析までの間−20℃で保存する。
DNA単離
フェノールクロロホルム抽出を行い、すべての試料からゲノムDNAを単離し、ロシュ・アプライド・サイエンスのHigh Pure PCR Template Purification Kit(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、Indianapolis、IN)を用い精製する。
パイロシーケンス
Dowd(Dowd et al.2008;8,125)の記載の通りに、細菌タグをコードさせたFLXアンプリコンのパイロシーケンスを実施する。各鳥の腸粘膜から単離した同量のDNAを解析する。プライマー28F(5’−GAGTTTGATCNTGGCTCAG)及び519R(5’−GTNTTACNGCGGCKGCTG)を用い、各試料において16S rRNA遺伝子のV1〜V3領域を増幅させる。配列決定後、生データを選別し、品質に応じてトリミングする。個々の試料のバーコード配列をもとに、配列を選別する。バーコードタグを除去し、非細菌性リボソーム配列を除去する。BlastN比較により、細菌集団の組成を決定して品質を制御し、かつNCBIのデータベースを手作業で精選する。各試料毎に、各細菌IDの相対量を決定する。NCBI命名法により、各分類レベルをもとにデータを編集する。
統計解析
ペアワイズt検定により性能データの中央値を分別する。P<0.05を有意な差と見なした。試験単位として区画を使用する。計数データ、及び分類によるモデル解析を用い解析した結果ををもとに、次いで、JMP 8.0.2(SAS institute、Cary、NC)によりカイ二乗検定を行った。この場合、各サンプルは実験単位として1羽の鳥から構成される。
結果及び考察
ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)処理群では、未処理対照群と比較して、体重増加及び飼料要求率が有意に低下する。NEによる処理前では、DFMを添加した又は非添加のシトロバクター(Citrobacter)フィターゼは、他の処理群と比較して、ブロイラーの体重増加及び飼料要求率を有意に改善する。18〜20日の間の処理期間を含む、全試験期間において(0〜42日)、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ、Ronozyme P、バチルス(Bacillus)DFM、又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFM添加処理群では、対照処理群と比較して体重増加及び飼料要求率がわずかに向上する(0〜42日)。Ronozyme P及びバチルスDMF又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMを組み合わせて投与した場合には、ブロイラーの体重増加又は飼料要求率は、Ronozyme P単独又はDFM単独で投与した場合と比較して有意には向上しない。これとは対照的に、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ(シトロバクター(Citrobacter)フィターゼA又はBのいずれか)と、いずれかのDFMとを組み合わせた場合には、ブロイラーの体重増加及び飼料要求率は、未処理対照群よりも向上するため、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びDFMを組み合わせた生成物が相乗効果することが示される。この効果は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBよりも、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター(Citrobacter)AをDFMと組み合わせて用いることで、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBをDFMと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
バチルス(Bacillus)又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMのいずれかを添加した場合、非処理対照群と比べて同等と行かないでも、それにある程度近い程度まで、斃死率及び病変スコアが低下するのが観察された。Ronozyme Pは、対照群と比較して斃死率及び病変スコアを低下させるものの、非処理対照群と同程度にまでは低下させない。シトロバクター(Citrobacter)フィターゼA及びBは、病変スコアの深刻度に対し、又は処理対照群と比較してNEに起因する斃死率に対し、有意な変化は与えない。Ronozyme Pを、バチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMのいずれかと組み合わせた場合、NEによる斃死率、及び病変スコアが非処理対照群と同程度にまで低下した。シトロバクター(Citrobacter)フィターゼを、バチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMのいずれかと組み合わせた場合、NEによる斃死率、及び病変スコアが、非処理対照群と比較してわずかに改善された(斃死率及び病変スコアがより低い)。この効果は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBよりも、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター(Citrobacter)AをDFMと組み合わせて用いることで、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBをDFMと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
いずれのDFMも、処理対照群と比較して空腸内容物のpHを低下させた。それに対しRonozyme PはpHを変化させず、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼはpHを上昇させた。Ronozyme P又はシトロバクター(Citrobacter)フィターゼA又はシトロバクター(Citrobacter)フィターゼBを、バチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMと組み合わせた場合、空腸内容物のpHは、処理対照群及び非処理対照群よりも低下する。空腸内容物のpHは、ラクトバチルス(Lactobacillus)菌種のDNAが、21日齢の時点での空腸粘膜に含まれる総細菌DNAに占める割合と逆の相関がある。また、ラクトバチルス(Lactobacillus)菌種の相対的な割合は、処理後(21日齢〜35日齢)の体重増加及び飼料要求率と正の相関がある。
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ(特に、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼA)をDFMと組み合わせた場合、特にウェルシュ菌(C. perfringens)による処理時の損失を予防し、かつミネラル、タンパク質、及びエネルギーの可消化性に対し本フィターゼが有する効果を最大化するという効果があり、言い換えれば、処理対照群及び非処理対照群と比較して、飼料要求率及び体重増加が増大するという効果がある。これらの効果は、本発明の示す組み合わせにより、フィターゼを単独で用いた処理群及び処理対照群と比較して、腸の損傷が減少すること及びNEにより斃死率が低下することにからも認められる。
考察
この場合もやはり理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをDFMと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びDFMをどのように組み合わせればよいのかを提案する。一例としては、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低pH(例えば、3.5〜4.5)での活性が高い。単胃家畜(例えば、ブタ又は鶏)の胃腸(GI)管の胃領域はpHが低いことから、GI管のこの領域ではシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼの活性がより高くなることは明らかであり、したがって、これらのフィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較してより迅速に、フィチン酸基質から、リン、及びその他の栄養素、例えば、タンパク質を放出させ得る。特にpHの上昇に伴い、ミネラル及びなどのその他の基質と複合体を形成する傾向があるフィチン酸に対し、可能な限り迅速に作用させることが望ましい場合などの、多くの状況下で有利である。フィチン酸が複合体を形成した場合には、酵素が接近してフィチン酸を分解する可能性は低くなる。したがって、pHが低いGI管の胃領域において、フィターゼ基質に作用させることが望ましい。しかしながら、GI管の胃領域においてフィチン酸を分解させると、GI管の空腸及び以降の腸領域におけるリンの可用性が比較的低くなり、ラクトバチルス(これまでに、免疫系の調節、及び腸内pHを低下させる有機酸の産生などの、有益な効果を有すると示されている)などの常在性の「善玉」細菌集団に対し、悪影響が生じる恐れがある。常在性の「善玉」細菌に対し、このように悪影響が及ぼされることにより、日和見的に病原菌が増殖することになり、ひいては腸内細菌の全体的な平衡が崩れることになる。
本発明に関し、驚くべきことに、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼを使用した場合の副作用は、1種以上のDFMと組み合わせて使用することで克服できることが判明している。DFMは、腸内細菌の平衡を回復させ、ひいては病原菌に起因する腸の損傷を軽減させ、対象とする動物の性能を向上させる。
この場合もやはり理論に束縛されるものではないが、その他のフィターゼをDFMと組み合わせた場合と比較して驚くほど良好な結果を得るにあたって、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びDFMをどのように組み合わせればよいのかを提案する。シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼは、シトロバクター(Citrobacter)以外に由来するその他の一部のフィターゼと比較して、低pH(例えば、3.5〜4.5)での活性が高い。胃腸(GI)管の胃領域はpHが低いことから、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼは、GI管のこの領域においてより活性を示すことは明らかである。フィチン酸はタンパク質と結合して複合体を形成し得ることから、フィターゼがGI管の胃領域で活性であることにより、対象とする動物によるタンパク質の消化性も向上し得る。胃領域でタンパク質吸収が増加すると、動物による塩酸(HCl)の産生が減少する場合がある。塩酸(HCl)の産生が減少すると、GI管の以降の領域のpHが上昇することから、GI管の以降の領域において悪影響を与える可能性がある。病原体を腸内で増殖させる機会を増やすことから、GI管の腸以降の領域でpHが上昇することは、有利ではない。驚くべきことに、本発明により、これらの副作用は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼをDFMと組み合わせることで克服されることが判明している。
驚くべきことに、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株ATCC 51113(配列番号1のアミノ酸配列を有する)由来の6−フィターゼは、その他のシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)6−フィターゼ酵素、例えば、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株YH−15由来の6−フィターゼ(配列番号7のアミノ酸配列を有する)と比べて、更に良い影響を受ける。
実施例2−性能試験
方法
4000羽の1日齢のCobb雄雛を民間の孵化場から購入する。試験の開始時に50羽の雄を一集団として各処理区画に割りつけ、一処理につき計8区画を用意する。試験は、次の処理から構成される(表1):
表1.実施例2の実験設計
Figure 2014509846

Figure 2014509846
「バチルス(Bacillus)DFM」:Danisco A/Sより提供される、枯草菌(Bacillus subtilis)株Bs2084、LSSAO1及び15AP4を組み合わせた商品である、Enviva Pro(登録商標)を、150,000CFU/g(飼料)で投与。
「ラクトバチルス(Lactobacillus)DFM」:Danisco Animal Nutritionより提供される、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)及びラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)を組み合わせた商品である、Sorbiflore(登録商標)を、350,000CFU/g(飼料)で投与。
「Ronozyme P(登録商標)」は、コウジカビ(Aspergillus oryzae)において発現させた、ペニフォラ・リシイ(Peniphora lycii)由来の6−フィターゼである。このアミノ酸配列は、本明細書において配列番号8として提供される。(これは「シトロバクター(Citrobacter)以外」の6フィターゼである)
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株ATCC 51113由来の6−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号1として提供される。
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株YH−15由来の6−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号7として提供される。
表2.実施例2の試験飼料の組成
Figure 2014509846

Figure 2014509846
鳥類に適宜給餌し、0日〜42日の間処理した。すべての試験処理群に関し、酵素及びDFMは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でDaniscoから提供される。飼料の相互混入を避ける目的で、各区画を施設内に配置し、直接的な接触を予防した。21日目に前期飼料を後期飼料に置き換え、35日目に後期飼料を仕上げ飼料に置き換える。各飼料の交換時に、飼育者は、各区画毎に飼料を回収し、計量し、空にし、適切な処理飼料を再充填する。試験の最終日に飼料を計量する。各区画の斃死を毎日確認する。間引きしたか、又は斃死が発見された場合、日付及び取り除いた鶏の重量(kg)を記録する。
すべての区画は約10.2cm(4インチ)に組み立て、マツ材の新しい床敷を敷き詰めた。区画に配置する前に、市販のコクシジウム症ワクチン(Coccivac−B)を用い、すべての鳥類に噴霧ワクチンを接種する。試験の間、薬剤の併用は行わない。
ペアワイズt検定により中央値を分取する。P<0.05を有意な差と見なした。試験単位として区画を使用する。
結果及び考察
42日経過時点で、陰性対照処理群では、体重増加は有意に低下する。いずれのDFMを添加した場合にも、性能に有意な向上は見られなかった。これとは対照的に、飼料にシトロバクター(Citrobacter)フィターゼを添加した場合、陽性対照群と同程度にまで体重増加が向上した。しかしながら、Ronozyme Pは、陰性対照に対し有意な向上を示さなかった。Ronozyme Pとバチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMを組み合わせた場合、42日経過時点で、陰性対照と比較して体重増加は非常に向上する。シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びバチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMは、陽性対照飼料と比較して有意な向上を示すため、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びDFMの効果が増大していることが示される。
飼料要求率(FCR)を解析した場合にも同様の結果が観察される。いずれかのプロバイオティクスを添加した場合、数値はわずかに上昇したものの、飼料要求率に有意な効果は観察されない。フィターゼを単独で添加する場合、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼでのみ有意な効果が見られ、Ronozyme Pでは効果は観察されない。同様に、ラクトバチルス(lactobacillus)又はバチルスのいずれかとRonozyme Pを組み合わせて添加した場合、陰性対照よりも有意な向上は観察されない。しかしながら、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼを、バチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMのいずれかと組み合わせた場合、FCRが陽性対照と比較して有意に低くなるよう改善され(飼料要求率が向上する)、かつラクトバチルス(Lactobacillus)DFM又はバチルス(Bacillus)DFMのいずれか、及びフィターゼを単独で添加した場合に得られる効果よりも良好である(飼料要求率が向上する)。この効果は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBよりも、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター(Citrobacter)AをDFMと組み合わせて用いることで、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBをDFMと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
要するに、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及び各DFM、すなわちバチルス及びラクトバチルス(Lactobacillus)との間には好ましい効果が存在する。これは、体重増加及び飼料要求率の増加率が、これらのいずれかを単独で添加した場合に得られる増加率よりも大きいことからも裏付けられる。この効果は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBと比較して、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAについてより顕著である。
実施例3−消化性試験
方法
1000羽の雄Ross 308ブロイラーを、12日齢まで床区画で生育し、一般的な市販の前期飼料を給与する。13日目に、1処理につき合計64羽の鳥を8区画に割りつける(ケージ毎に8羽ずつ割りつける)。13日齢〜21日齢の間、処理飼料を給与した(表1)。
表1.実施例3の試験設計
Figure 2014509846

Figure 2014509846
「バチルス(Bacillus)DFM」:Danisco A/Sより提供される、枯草菌(Bacillus subtilis)株Bs2084、LSSAO1及び15AP4を組み合わせた商品である、Enviva Pro(登録商標)を、150,000CFU/g(飼料)で投与。
「ラクトバチルス(Lactobacillus)DFM」:Danisco Animal Nutritionより提供される、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)及びラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)を組み合わせた商品である、Sorbiflore(登録商標)を、350,000CFU/g(飼料)で投与。
「Ronozyme P(登録商標)」は、コウジカビ(Aspergillus oryzae)において発現させた、ペニフォラ・リシイ(Peniphora lycii)由来の6−フィターゼである。このアミノ酸配列は、本明細書において配列番号8として提供される。(これは「シトロバクター(Citrobacter)以外」の6フィターゼである)
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株ATCC 51113由来の6−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号1として提供される。
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBは、シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)株YH−15由来の6−フィターゼである。この酵素のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号7として提供される。
ブロイラー飼料はマッシュとして給与する。飼料はNRC飼養標準に一致するか超過した(表2)。飼料間の相互混入を防止するため、ミキサーはフラッシングする。すべての処理飼料は、Davis S−20ミキサーを用い混合する。各バッチの試験開始時、試験期間中央時、及び試験終了時に、各処理飼料から試料を回収し、合わせて混合し、飼料に含まれる酵素活性及びDFMの存在を確認する。
表2.実施例3の試験飼料の組成
Figure 2014509846

Figure 2014509846
0〜21日齢の間、鳥類には適宜適切な餌を給与する。試験の間、薬剤の併用は行わない。すべての試験処理群に関し、酵素及びDFMは、適切な混合物として、かつ適切な濃度でDaniscoから提供される。直接的な接触を予防して、相互混入を避ける目的で、ケージには物理的に仕切りを設ける。試験の最終日に、鳥類、並びにフィーダー内の試料を計量する。
18、19、及び20日目に糞便飼料を回収し、回収日に計量及び記録した後、−20℃で保存する。続いて各処理群毎に***物をプールし、ブレンダにより混合し、サンプルを2本採取した。飼料を凍結乾燥させ、0.5mmシーブを通して粉砕し、再凍結させ、以降の;乾燥重量(DM)、総エネルギー(GE)、窒素(N)、リン(P)、及びカルシウム(Ca)についての解析までの間保管する。
21日目に、すべての鳥を屠殺し、回腸の下半分の含有物を蒸留水で押し流して得る。各ケージの鳥から得た***物をプールし、回収後直ちに凍結する。飼料、回腸消化物及び***物を、DM、N、アミノ酸、GE、Ca、P、及び不活性マーカーについて2度ずつ近似分析する。
DMは、全てのサンプルを100℃で24時間乾燥させて測定する。飼料及び回腸消化物に対して高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を実施して、相対的なアミノ酸濃度を評価する。リン及びカルシウム濃度は、誘導結合プラズマ原子発光分光法により測定し、エネルギーはカロリーメーター(Model 1261,Parr Instrument Co.,Moline,IL)を用い測定する。最後に、燃焼法(Model FP2000,LECO Corp.,St.Joseph,MI)によりN含有を測定する。糞便及び回腸消化物の両方について、消化吸収率を算出する。
ペアワイズt検定により中央値を分取する。各ケージを試験単位として用い、P<0.05の場合、有意な差があるものと見なした。
結果及び考察
バチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMを単独で添加する陰性対照と比較して、回腸におけるリン可消化性に対し有意な効果は観察されない。しかしながら、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼを添加することで、回腸におけるリン可消化性は陽性対照群と同程度にまで増加する。Ronozyme Pを単独で飼料に添加する場合と比較して、回腸におけるリン可消化性は有意に増加する。シトロバクター(Citrobacter)フィターゼとDFMを組み合わせて飼料に添加した場合、回腸におけるリン可消化性は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼを単独で添加する場合と比較して増加する。これとは対照的に、Ronozyme P及びDFMを組み合わせて飼料に添加する場合、回腸におけるリン可消化係数は、Ronozyme Pを単独で加えた場合に観察されるものと同様である。これらの傾向は、腸管全体のリン可消化性を反映している。
シトロバクター(Citrobacter)フィターゼを飼料に添加した場合、陰性対照群と比較して、回腸におけるアミノ酸の可消化性は有意に増加する。Ronozyme Pを添加した場合、陰性対照と比較して、回腸におけるアミノ酸の可消化性はわずかに増加する。バチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMを単独で添加した場合には、回腸におけるアミノ酸の可消化性はほんのわずかに増加する。シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びバチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMを組み合わせて添加した場合、DFM又はシトロバクター(Citrobacter)フィターゼを単独で添加した場合と比較して、アミノ酸の可消化性に対して有意な効果が存在し、この効果は、いずれかを単独で添加した場合の増加効果を足し合わせたものよりも大きい。この増加効果は、RonozymeP及びDFMを組み合わせて飼料に添加した場合には観察されない。この効果は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBよりも、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター(Citrobacter)AをDFMと組み合わせて用いることで、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBをDFMと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。
エネルギー可消化性(AME)は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼを飼料に添加した場合に、陰性対照の場合と比べて有意に増加する。これは、Ronozyme Pを飼料に添加した場合には当てはまらない(Ronozyme Pを飼料に添加した場合には、AMEの増大はほんの僅かにしか観察されない)。バチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMのいずれかを飼料に添加した場合、AMEは顕著に増加するものの、陰性対照群との有意な差はない。いずれかのDFMをシトロバクター(Citrobacter)フィターゼと組み合わせて添加した場合、フィターゼ又はいずれかのDFMを単独で加えた場合の増分を足し合わせたものと比較して、AMEは有意に増加する。これは、いずれかのDFMをRonozyme Pフィターゼと組み合わせて添加した場合には観察されなかった。
結論として、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ及びバチルス(Bacillus)DFM又はラクトバチルス(Lactobacillus)DFMの間には有意な作用が存在する。この効果は、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBよりも、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼAについてより顕著になり、すなわち、シトロバクター(Citrobacter)AをDFMと組み合わせて用いることで、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼBをDFMと組み合わせて用いた場合と比較して、想定外のより良好な効果を得ることができる。この効果は、P、AME、及び回腸におけるアミノ酸の可消化性が増加するという点に反映される。生成物を組み合わせて添加した場合の可消化係数における増加は、いずれかを単独で添加した場合の増加分よりも大きい。
本明細書においてこれまでに言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明に関し記載される手法及び系に対し、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく加えられる各種修正及び変更は当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは明白である。加えて、生化学及びバイオテクノロジー又は関連する分野に属する当業者には本発明を実施する際に記載のモデルに関し加えられる各種修正は明白なものであり、このような修正も以降の特許請求の範囲内で意図されるものとする。

Claims (84)

  1. 直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種に由来するフィターゼと組み合わせて含む、飼料添加用組成物。
  2. 前記フィターゼが:シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)、シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)、シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)、シトロバクター中間種(Citrobacter intermedius)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シトロバクター・ムルリニアエ(Citrobacter murliniae)、シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)、シトロバクター・セドラキイ(Citrobacter sedlakii)、シトロバクター・ベルクマニイ(Citrobacter werkmanii)、及びシトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)からなる群から選択されるシトロバクター(Citrobacter)細菌に由来するものである、請求項1に記載の飼料添加用組成物。
  3. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する、請求項1又は2に記載の飼料添加用組成物。
  4. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113に由来するものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  5. 前記フィターゼが6−フィターゼ(E.C.3.1.3.26)である、請求項1に記載の飼料添加用組成物。
  6. 前記フィターゼが:(a)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド;(b)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、に1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び/又は保存的置換を含む、変異体;並びに/あるいは(c)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  7. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも99.1%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  8. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、前記1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E、241Q、273L、276K、379K、385D、91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q、及び362K、R、から選択される、請求項6又は7に記載の飼料添加用組成物。
  9. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、前記1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、から選択される、請求項8に記載の飼料添加用組成物。
  10. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 4.5の範囲である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  11. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 3.5の範囲である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  12. 前記直接給与微生物が、抗病原性直接給与微生物である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  13. 前記直接給与微生物が生細菌である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  14. 前記直接給与微生物が、次の属:ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、バチルス(Bacillus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、クロストリジウム(Clostridium)、及びメガスフェラ(Megasphaera)、並びにこれらの組み合わせのうちの1種以上の細菌を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  15. 前記直接給与微生物が、次の種:枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス菌種(Enterococcus spp)、及びペディオコッカス菌種(Pediococcus spp)、ラクトバチルス菌種(Lactobacillus spp)、ビフィドバクテリウム菌種(Bifidobacterium spp)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococsus acidilactici)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、プロピオニバクテリウム・ソエニイ(Propionibacterium thoenii)、ラクトバチルス・ファルシミナス(Lactobacillus farciminus)、ラクトバチルス・ラムノサス(lactobacillus rhamnosus)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス(Lactobacillus salivarius ssp. salivarius)、メガスファエラ・エルスデニイ(Megasphaera elsdenii)、プロピオニバクテリア(Propionibacteria sp)、及びこれらの組み合わせのうちの1種以上の細菌を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  16. 前記直接給与微生物が、次の:枯草菌(Bacillus subtilis)株3A−P4(PTA−6506);15A−P4(PTA−6507);22C−P1(PTA−6508);2084(NRRL B−500130);LSSA01(NRRL−B−50104);BS27(NRRL B−50105);BS18(NRRL B−50633);及びBS 278(NRRL B−50634)のうちの1種以上である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  17. 前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  18. 前記フィターゼが、200FTU/飼料添加用組成物(g)〜10000FTU/飼料添加用組成物(g)の投与量で存在する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  19. 前記プロテアーゼが、1000PU/飼料添加用組成物(g)及び60000PU/飼料添加用組成物(g)の投与量で存在する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  20. 前記DFMが、3.75×10CFU/飼料添加用組成物(g)及び1×1011CFU/飼料添加用組成物(g)の投与量で存在する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  21. 対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性(例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性)の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率(FCR)の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節(例えば、改善させる)、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、のための方法であって、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種に由来するフィターゼと組み合わせて、対象とする動物に投与する工程を含む、方法。
  22. 請求項1〜21のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を投与する工程を含む、請求項21に記載の方法。
  23. 前記フィターゼが:シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)、シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)、シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)、シトロバクター中間種(Citrobacter intermedius)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シトロバクター・ムルリニアエ(Citrobacter murliniae)、シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)、シトロバクター・セドラキイ(Citrobacter sedlakii)、シトロバクター・ベルクマニイ(Citrobacter werkmanii)、及びシトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)、からなる群から選択されるシトロバクター(Citrobacter)細菌に由来するものである、請求項20又は22に記載の方法。
  24. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113に由来する、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記フィターゼが6−フィターゼ(E.C.3.1.3.26)である、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記フィターゼが:(a)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド;(b)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、に1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び/又は保存的置換を含む、変異体;並びに/あるいは(c)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項21〜26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも99.1%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項21〜27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E、241Q、273L、276K、379K、385D、91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q、及び362K、R、から選択される、請求項21〜28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、から選択される、請求項29に記載の方法。
  31. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 4.5の範囲である、請求項21〜30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 3.5の範囲である、請求項21〜31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記直接給与微生物が抗病原性直接給与微生物である、請求項21〜32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記直接給与微生物が生細菌である、請求項21〜33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記直接給与微生物が、次の属:ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、バチルス(Bacillus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、クロストリジウム(Clostridium)、及びメガスフェラ(Megasphaera)、及びこれらの組み合わせのうちの1種以上に由来する細菌を含む、請求項21〜34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記直接給与微生物が、次の種:枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス菌種(Enterococcus spp)、及びペディオコッカス菌種(Pediococcus spp)、ラクトバチルス菌種(Lactobacillus spp)、ビフィドバクテリウム菌種(Bifidobacterium spp)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococsus acidilactici)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、プロピオニバクテリウム・ソエニイ(Propionibacterium thoenii)、ラクトバチルス・ファルシミナス(Lactobacillus farciminus)、ラクトバチルス・ラムノサス(lactobacillus rhamnosus)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス(Bifidobacterium animalis ssp. animalis)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス(Lactobacillus salivarius ssp. salivarius)、メガスファエラ・エルスデニイ(Megasphaera elsdenii)、プロピオニバクテリア(Propionibacteria sp)、及びこれらの組み合わせのうちの1つ以上に由来する細菌を含む、請求項21〜35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記直接給与微生物が、次の:枯草菌(Bacillus subtilis)株3A−P4(PTA−6506);15A−P4(PTA−6507);22C−P1(PTA−6508);2084(NRRL B−500130);LSSA01(NRRL−B−50104);BS27(NRRL B−50105);BS18(NRRL B−50633);及びBS278(NRRL B−50634)、のうちの1種以上である、請求項21〜36のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項21〜37のいずれか一項に記載の方法。
  39. 対象とする動物の性能の向上、又は飼料中の原材料の消化性(例えば、アミノ酸の可消化性などの栄養素消化性)の向上、又は窒素保持の向上、又は壊死性腸炎の悪影響回避、又は飼料要求率(FCR)の向上、又は対象とする動物の体重増加の向上、又は対象とする動物の飼料効率の向上、又は対象とする動物の免疫応答性の調節(例えば、改善させる)、又は対象とする動物の胃腸管における有益微生物の増殖促進、又は対象とする動物の胃腸管における病原菌数の減少、又は糞尿への栄養素の排出の減少、を目的として、直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter)菌種に由来するフィターゼと組み合わせて使用する、方法。
  40. 請求項1〜20のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を使用する、請求項39に記載の使用法。
  41. 前記フィターゼが:シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)、シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)、シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)、シトロバクター中間種(Citrobacter intermedius)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シトロバクター・ムルリニアエ(Citrobacter murliniae)、シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)、シトロバクター・セドラキイ(Citrobacter sedlakii)、シトロバクター・ベルクマニイ(Citrobacter werkmanii)、及びシトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)、からなる群から選択されるシトロバクター(Citrobacter)細菌に由来するものである、請求項39又は40に記載の使用法。
  42. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する、請求項39〜41のいずれか一項に記載の使用法。
  43. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113に由来する、請求項39〜42のいずれか一項に記載の使用法。
  44. 前記フィターゼが6−フィターゼ(E.C.3.1.3.26)である、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記フィターゼが:(a)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド;(b)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、に1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び/又は保存的置換を含む、変異体;並びに/あるいは(c)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項39〜44のいずれか一項に記載の使用法。
  46. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも99.1%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項39〜45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E、241Q、273L、276K、379K、385D、91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q、及び362K、R、から選択される、請求項39〜46のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、から選択される、請求項47に記載の使用法。
  49. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 4.5の範囲である、請求項39〜48のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 3.5の範囲である、請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記直接給与微生物が、抗病原体用直接給与微生物である、請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記直接給与微生物が生細菌である、請求項39〜51のいずれか一項に記載の使用法。
  53. 前記直接給与微生物が、次の属:ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、バチルス(Bacillus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、クロストリジウム(Clostridium)、及びメガスフェラ(Megasphaera)、及びこれらの組み合わせのうちの1種以上に由来する細菌を含む、請求項39〜52のいずれか一項に記載の使用法。
  54. 前記直接給与微生物が、次の種:枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス菌種(Enterococcus spp)、及びペディオコッカス菌種(Pediococcus spp)、ラクトバチルス菌種(Lactobacillus spp)、ビフィドバクテリウム菌種(Bifidobacterium spp)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococsus acidilactici)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、プロピオニバクテリウム・ソエニイ(Propionibacterium thoenii)、ラクトバチルス・ファルシミナス(Lactobacillus farciminus)、ラクトバチルス・ラムノサス(lactobacillus rhamnosus)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス(Bifidobacterium animalis ssp. animalis)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス(Lactobacillus salivarius ssp. salivarius)、メガスファエラ・エルスデニイ(Megasphaera elsdenii)、プロピオニバクテリア(Propionibacteria sp)、及びこれらの組み合わせのうちの1つ以上に由来する細菌を含む、請求項39〜53のいずれか一項に記載の使用法。
  55. 前記直接給与微生物が、次の株:枯草菌(Bacillus subtilis)株3A−P4(PTA−6506);15A−P4(PTA−6507);22C−P1(PTA−6508);2084(NRRL B−500130);LSSA01(NRRL−B−50104);BS27(NRRL B−50105);BS18(NRRL B−50633);及びBS278(NRRL B−50634)のうちの1種以上である、請求項39〜54のいずれか一項に記載の使用法。
  56. 前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項39〜55のいずれか一項に記載の使用法。
  57. 直接給与微生物(DFM)、シトロバクター(Citrobacter spp.)菌種に由来するフィターゼ、場合により少なくとも1種のビタミン、場合により少なくとも1種のミネラル)、及び投与用の指示書を含む、キット。
  58. 前記キットが、請求項1〜20のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む、請求項57に記載のキット。
  59. 前記フィターゼが:シトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)、シトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、シトロバクター・アマロナティカス(Citrobacter amalonaticus)、シトロバクター・ギレニイ(Citrobacter gillenii)、シトロバクター中間種(Citrobacter intermedius)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)、シトロバクター・ムルリニアエ(Citrobacter murliniae)、シトロバクター・ロデンティウム(Citrobacter rodentium)、シトロバクター・セドラキイ(Citrobacter sedlakii)、シトロバクター・ベルクマニイ(Citrobacter werkmanii)、及びシトロバクター・ヤンガエ(Citrobacter youngae)、からなる群から選択されるシトロバクター(Citrobacter)細菌に由来するものである、請求項57又は58に記載のキット。
  60. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)に由来する請求項57〜59のいずれか一項に記載のキット。
  61. 前記フィターゼがシトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)ATCC 51113からに由来する、請求項57〜60のいずれか一項に記載のキット。
  62. 前記フィターゼが6−フィターゼ(E.C.3.1.3.26)である、請求項57〜61のいずれか一項に記載のキット。
  63. 前記フィターゼが:(a)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも98.6%同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド;(b)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、に1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、及び/又は保存的置換を含む、変異体;並びに/あるいは(c)(i)配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433、及び/又は(ii)配列番号1又は配列番号2の成熟ポリペプチド部分、及び/又は(iii)配列番号7、及び/又は(iv)配列番号5、及び/又は(v)配列番号9、及び/又は(vi)配列番号10、の断片、からなる群から選択される、ポリペプチドを含む、請求項57〜62のいずれか一項に記載のキット。
  64. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2の配列のアミノ酸23〜433と少なくとも99.1%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項57〜63のいずれか一項に記載のキット。
  65. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:4P、46E、107G、111P、119K、162C、223E、241Q、273L、276K、379K、385D、91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、31C、119K、202N、286Q、及び362K、R、から選択される、請求項57〜64のいずれか一項に記載のキット。
  66. 前記フィターゼが、配列番号1又は配列番号2と比較して少なくとも1つ以上4つ以下の変更を含み、1〜4つの変更のうち、少なくとも1つは、次の:91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、141C/199C、162C/247C、111P/241Q、から選択される、請求項65に記載のキット。
  67. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 4.5の範囲である、請求項57〜66のいずれか一項に記載のキット。
  68. 前記フィターゼの至適pHがpH 3〜pH 3.5の範囲である、請求項57〜67のいずれか一項に記載のキット。
  69. 前記直接給与微生物が、抗病原体用直接給与微生物である、請求項57〜68のいずれか一項に記載のキット。
  70. 前記直接給与微生物が生細菌である、請求項57〜69のいずれか一項に記載のキット。
  71. 前記直接給与微生物が、次の属:ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、バチルス(Bacillus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、クロストリジウム(Clostridium)、及びメガスフェラ(Megasphaera)、及びこれらの組み合わせのうちの1種以上に由来する細菌を含む、請求項57〜70のいずれか一項に記載のキット。
  72. 前記直接給与微生物が、次の種:枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス菌種(Enterococcus spp)、及びペディオコッカス菌種(Pediococcus spp)、ラクトバチルス菌種(Lactobacillus spp)、ビフィドバクテリウム菌種(Bifidobacterium spp)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococsus acidilactici)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、プロピオニバクテリウム・ソエニイ(Propionibacterium thoenii)、ラクトバチルス・ファルシミナス(Lactobacillus farciminus)、ラクトバチルス・ラムノサス(lactobacillus rhamnosus)、酪酸菌(Clostridium butyricum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス菌種アニマリス(Bifidobacterium animalis ssp. animalis)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、ラクトバチルス・サリバリウス菌種サリバリウス(Lactobacillus salivarius ssp. salivarius)、メガスファエラ・エルスデニイ(Megasphaera elsdenii)、プロピオニバクテリア(Propionibacteria sp)、及びこれらの組み合わせのうちの1種以上に由来する細菌を含む、請求項57〜71のいずれか一項に記載のキット。
  73. 前記直接給与微生物が、次の株:枯草菌(Bacillus subtilis)株3A−P4(PTA−6506);15A−P4(PTA−6507);22C−P1(PTA−6508);2084(NRRL B−500130);LSSA01(NRRL−B−50104);BS27(NRRL B−50105);BS 18(NRRL B−50633);及びBS278(NRRL B−50634)のうちの1種以上である、請求項57〜72のいずれか一項に記載のキット。
  74. 前記直接給与微生物が芽胞の形態である、請求項57〜73のいずれか一項に記載のキット。
  75. 直接給与微生物(DFM)を、シトロバクター(Citrobacter spp.)菌種に由来するフィターゼと混合する工程、及び(所望により)パッケージングする工程、を含む、飼料添加用組成物の製造法。
  76. 請求項1〜20のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を含む飼料。
  77. 前記フィターゼが、400FTU/飼料(kg)〜1000FTU/飼料(kg)の投与量で存在する、請求項76に記載の飼料。
  78. 前記DFMが、7.5×10CFU/飼料(kg)及び1×10CFU/飼料(kg)の投与量で存在する、請求項76〜77のいずれか一項に記載の飼料。
  79. 飼料成分を請求項1〜20のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物と混合する工程を含む、家畜飼料の製造法。
  80. 直接給与微生物を、シトロバクター(Citrobacter)フィターゼ、並びに少なくとも1種のミネラル及び/又は少なくとも1種のビタミンと組み合わせて含む飼料添加用組成物を含むプレミックス。
  81. 請求項1〜20のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物を、少なくとも1種のミネラル及び/又は少なくとも1種のビタミンと組み合わせて含む、プレミックス。
  82. 対象においてコクシジウム症及び/又は壊死性腸炎を予防及び/又は処置するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の飼料添加用組成物。
  83. 壊死性腸炎及び/又はコクシジウム症の予防及び/又は処置法であって、請求項1〜20のいずれか一項に記載の有効量の飼料添加用組成物を対象に投与する、方法。
  84. 図面及び実施例を参照して本明細書において全体を定義される通りの飼料添加用組成物又は飼料又はキット又は方法又は使用法又はプレミックス。
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