JP7271423B2 - 動物体内でのエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の増殖を阻害または遅延させるためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分 - Google Patents

Description

本分野は、動物体内でのエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の増殖を阻害または遅延させるための、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）をベースとする成分の使用に関する。

エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）はフィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門の乳酸菌の大きな属である。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌はしばしば対（双球菌）または短い連鎖で存在するグラム陽性球菌であり、物理的特徴のみでは連鎖球菌と区別することが困難である。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌は通性嫌気性生物であり、すなわち、酸素に富む環境および酸素に乏しい環境の両方で細胞呼吸を行うことができる。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌は、胞子を形成することはできないが、広範囲の環境条件に対して耐性を有する：極端な温度（１０～４５℃）、ｐＨ（４．５～１０．０）、および高塩化ナトリウム濃度。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバーは、ゲノムＤＮＡ分析により別の属への分類が適切であると示された１９８４年までは、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のＤ群として分類されていた。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種の中には、腸の外に出ると日和見病原体になることが知られているものがある。これはＥ．アビウム（Ｅ．ａｖｉｕｍ）、Ｅ．ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）およびＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）に関して当てはまり、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）はブロイラー鶏の生産チェーンにおいて家禽農家が受けている経済的損失の点で重要である。

エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）は、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、カナリア、ハト、シチメンチョウおよびバリケンなどの、鳥および他の脊椎動物の腸の常在菌である。これは、家禽および他の鳥類種の新たな病原体と考えられる。大腿骨頭壊死および脊椎炎は、感染したニワトリの主要な病理学的変化として報告されている。

正常な腸内細菌叢の一部、正常な腸機能の混乱または傷害は、鳥の脊椎へのエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の転移をもたらし得る。エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の脊椎への感染は、エンテロコッカス性脊椎炎（ｓｐｏｎｄｙｌｏｔｈｅｓｉｓ）または「キンキーバック」として知られる状態になって、脊椎および関節の病変、跛行および死亡をもたらす。

家禽生産者が「キンキーバック」と呼ぶ脊椎炎は、長年にわたって商業生産で知られており、典型的には、重くて成長の速い鳥、特に雄およびブロイラー種鶏に見られる（Ａｚｉｚ，Ｔ．＆ Ｂａｒｎｅｓ，Ｈ．Ｊ．（２００９）Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ ｉｓ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎ ｂｒｏｉｌｅｒｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｐｏｕｌｔｒｙ，２５，１９）。

エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の、高い病原性および抗生物質耐性を有する株は、ブロイラー鶏産業に経済的損失を引き起こし続けている。したがって、ルーチンの飼育場衛生管理および抗微生物療法は、病原性のエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の大発生を制御するには不十分であることが立証されている。

したがって、この重要な新しく出現した病原体を制御する安全かつ有効な代替手段が必要とされる。

一実施形態では、１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌株を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物から得られる上清、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の有効量を動物に投与することを含む、動物体内での病原性エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ）種の増殖の全部または一部を阻害または遅延させる方法が開示される。

第２の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される。

第３の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物は、以下の株の１種以上から選択される：Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）２０８４株アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ－５００１３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＬＳＳＡＯ１株アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０１０４およびＢａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）１５Ａ－Ｐ４ ＡＴＣＣ株アクセッション番号ＰＴＡ－６５０７。

第４の実施形態では、動物は単胃動物であり得、好ましくは家禽であり得る。

第５の実施形態では、動物は複胃動物であり得る。

第６の実施形態では、少なくとも１種のＢａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、動物飼料を通して動物に、飼料中に入れるか、飼料上に置くか、液体中に入れるかにかかわらず、直接投与することができる。

第７の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、飼料、飼料添加組成物、プレミックス、または水などの液体中からなる群から選択される形態で動物に投与することができる。

図１は、アメリカおよびヨーロッパの家禽生産から収集した、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）株に対する、Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯ株による平均阻害率を示す。 図２は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＢＳ８を含む／含まない場合の、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）株Ｇ８４－６８の増殖の動力学データを示す。 図３は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＢＳ８を含む／含まない場合の、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）株Ｄ４５－０８の増殖の動力学データを示す。 図４はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＢＳ８、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）１５ＡＰ４またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）２０８４の無細胞上清（ＣＦＳ）を伴って、または伴わずにインキュベートしたエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）株１１９７６－２の増殖阻害プロファイルを示す。 図５は、対照病原体の曲線が丁度ＯＤ ０．４に到達した終点における、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）亜種プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）１５ＡＰ４、ＢＳ８および２０８４のＣＦＳの、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＶＴＴ Ｅ－９７７７６Ｔに対する抗微生物活性を阻害％として示す。 図６は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）２０８４のＣＦＳと共にインキュベートした、またはしなかったエンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）Ｅ ８４１９７の増殖プロファイルを示す。 図７は、対照病原体の曲線がＯＤ ０．４に到達した、まさにその終点における、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＤＳＭ７^Ｔ、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ１０^ＴおよびＢ．リケノフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＳＭ１３^ＴのＣＦＳの、エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の１０種の臨床分離株に対する抗微生物活性を阻害％として示す。

引用した全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示では、多くの用語および略語が使用される。特に断らない限り、以下の定義が適用される。

要素または成分に先行する冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は要素または成分の事例（すなわち、出来事）の数に関して非限定的であることが意図される。このため「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、１つまたは少なくとも１つを含むと読むべきであり、要素または成分の単数形はまた、その数が明らかに単数であることを意味しない限り複数形も含む。

「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲で言及される場合、記載された特徴、整数、工程、または成分の存在を意味するが、１つ以上のその他の特徴、整数、工程、成分、または群の存在または追加を排除しない。「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。

存在する場合、全ての範囲は包括的であり、かつ組み合わせ可能である。例えば、「１～５」の範囲が挙げられる場合、挙げられた範囲は、「１～４」、「１～３」、「１～２」、「１～２および４～５」、「１～３および５」などを含むものと解釈されるべきである。

数値に関連して本明細書で使用される場合、「約」という用語は、その用語が文脈で特に定義されない限り、数値の＋／－０．５の範囲を指す。例えば、「約６のｐＨ値」という語句は、ｐＨ値が特に別に定義されない限り、５．５～６．５のｐＨ値を指す。

本明細書全体を通して与えられる全ての数値の上限が、全てのより低い数値の下限を、あたかもそのようなより低い数値の下限が本明細書に明示されているかのように含むことが意図される。本明細書全体を通して与えられる全ての数値の下限は、全てのより高い数値の限定を、あたかもそのようなより高い数値の限定が本明細書に明示されているかのように含むであろう。本明細書全体を通して与えられる全ての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲を、あたかもそのようなより狭い数値範囲が本明細書に全て明示されているかのように含むであろう。

「エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）」および「エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種」という用語は、互換的に使用され、本明細書では、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の乳酸菌の大きな属を指す。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌はグラム陽性球菌であり、しばしば対（双球菌）または短い連鎖で存在し、物理的特徴のみでは連鎖球菌と区別することが困難である。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌は通性嫌気性生物であり、すなわち、酸素に富む環境および酸素に乏しい環境の両方で細胞呼吸を行うことができる。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌は、胞子を形成することはできないが、広範囲の環境条件に対して耐性を有する：極端な温度（１０～４５℃）、ｐＨ（４．５～１０．０）、および高塩化ナトリウム濃度。エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバーは、ゲノムＤＮＡ分析により別の属への分類が適切であると示された１９８４年までは、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のＤ群として分類されていた。

「エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）」および「Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）はエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種であり、多くの家畜の腸管内細菌である。

「動物」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。動物は、全ての非反芻動物（ヒトを含む）および反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物はウマおよび単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、限定されないが、子ブタ、成長期ブタ、雌ブタなどのブタ類；七面鳥、アヒル、ニワトリ、ブロイラー鶏、産卵鶏などの家禽；サケ、マス、ティラピア、ナマズおよびコイなどの魚；ならびにエビおよびクルマエビなどの甲殻類が挙げられる。さらなる実施形態では、動物は、限定されないが、ウシ、若ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、ムース、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン、およびニルガイを含む、反芻動物などの複胃動物であり得る。

本明細書では、「反芻動物」という用語は、主に微生物作用によって、消化前に特殊化された胃で発酵させることによって、植物ベースの食物から栄養素を獲得することができる哺乳動物を指す。このプロセスは、典型的には、発酵した摂取物を逆流させ（食い戻しとして知られる）、再び噛むことを必要とする。植物物質をさらに分解させ、消化を刺激するために、再び食い戻しを噛むプロセスは反芻と呼ばれる。約１５０種の反芻動物には、家畜および野生種の両方が含まれる。反芻動物としては、限定されないが、ウシ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、ヤク、シカ、エルク、アンテロープ、バッファローなどが挙げられる。

本明細書では、「ＣＦＵ」という用語は、「コロニー形成単位」を意味し、コロニーが単一の前駆細胞に由来する細胞の凝集体を表す生存細胞の尺度である。

本明細書では、「直接給餌微生物」（「ＤＦＭ」）という用語は、生きた（生存可能な）天然に存在する微生物源である。ＤＦＭは、そのような天然に存在する、細菌株などの微生物の１種以上を含み得る。ＤＦＭのカテゴリーには、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）などの胞子形成細菌、ならびに乳酸菌、酵母および真菌などの非胞子形成細菌が含まれる。したがって、ＤＦＭという用語は、以下の１つ以上を包含する：直接給餌細菌、直接給餌酵母、直接給餌の酵母または真菌、およびそれらの組み合わせ。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）は、胞子を形成する特有のグラム陽性桿菌である。これらの胞子は非常に安定であり、熱、湿度およびｐＨ範囲などの環境条件に耐えることができる。これらの胞子は、動物によって摂取されると、活性な栄養細胞へと発芽し、したがってミールおよびペレット化された食物に使用することができる。乳酸菌は、病原体に拮抗する、乳酸を産生するグラム陽性球菌である。乳酸菌は、熱にいくらか敏感なようであるので、ペレット化された食物中ではそのまま使用されず、保護（コーティング）する必要がある。乳酸菌の種類には、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。

「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物」という用語は、１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌株を含む直接給餌微生物を意味する。

本明細書では、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分」という用語は、（ｉ）１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌株を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物、（ｉｉ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物から得られる上清、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを指す。

「飼料」および「食物」は、非ヒト動物およびヒトよってそれぞれ食べられる、摂取される、消化されることが意図された、またはそうされることが好適な、任意の天然もしくは人工の食物、ミールなど、またはそのようなミールの成分をそれぞれ意味する。

本明細書では、「食物」という用語は広義に使用され、ヒト用の食物および食物製品、ならびに非ヒト動物用の食物（すなわち、飼料）を包含する。

「飼料」という用語は、家畜を飼育する際に動物に給餌される製品に関して使用される。「飼料」および「動物飼料」は、互換的に使用される。好ましい実施形態では、食物または飼料は非反芻動物および反芻動物によって消費されるためのものである。

本明細書では、「プロバイオティクス」という用語は、生きた微生物（例えば、細菌または酵母を含む）であり、例えば、十分な数を摂取または局所的に適用する場合、宿主生物に有益な影響を及ぼす（すなわち、宿主生物に１つ以上の明らかな健康上の利益を与えることによって）微生物と定義される。プロバイオティクスは、１つ以上の粘膜表面の微生物バランスを改善し得る。例えば、粘膜表面は、腸、尿路、気道または皮膚でありえる。本明細書では、「プロバイオティクス」という用語はまた、免疫系の有益な分岐を刺激することができ、同時に粘膜表面、例えば腸の炎症反応を減少させることができる生きた微生物を包含する。プロバイオティクス摂取の下限または上限はないが、１日用量として、少なくとも１０^６～１０^１２、好ましくは少なくとも１０^６～１０^１０、好ましくは１０^８～１０^９ｃｆｕが、対象において有益な健康効果を得るのに有効であることが示唆されている。

「プレバイオティクス」という用語は、１つまたは限られた数の有益な細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することによって、宿主に有益な影響を及ぼす非消化性食物成分を意味する。

本明細書では、「病原体」という用語は、病気の原因物質を意味する。そのような原因物質には、限定されないが、細菌性、ウイルス性、真菌性の原因物質などが含まれ得る。

「由来する」および「から得られる」という用語は、問題の生物の株によって産生される、または産生できるタンパク質だけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、そのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物中で産生されるタンパク質も指す。さらに、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、問題のタンパク質を同定できる特性を有するタンパク質をいう。

「有効量」という用語は、特定成分の十分な量を意味する。

上記のように、エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）は家禽の新しく出現した病原体であると考えられ、ブロイラーおよびブロイラー種鶏の群れにかなりの損失を引き起こし得るＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）は、エンテロコッカス性脊椎炎（以前はニワトリではエンテロコッカス性変形性脊椎症（ＥＶＯＡ）と呼ばれていた）の原因として認識されることが多くなってきている。病気の大発生は、集約的生産システム下で飼育されているブロイラー鶏群で主に診断された。臨床的には、罹患した鳥は、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）性骨髄炎に起因する胸椎脊髄の圧迫および大腿骨頭壊死に起因する運動障害を患っていた。病気の大発生は、高い罹患率、死亡率、処分、屠体処理につながり、短期間のうちに深刻な経済的損失をもたらし得る。さらに、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）の分離株は、病原性の増大だけでなく、抗微生物薬耐性の増加も示している。

したがって、本明細書に記載の方法は、抗微生物薬耐性が地球規模での健康の主要な脅威となっていることから、抗生物質の使用の代替法を提供する。

一実施形態では、１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌株を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物から得られる上清、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の有効量を動物に投与することを含む、動物体内での病原性エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ）種の増殖の全部または一部を阻害または遅延させるための方法が本明細書に記載される。

本明細書に記載のＤＦＭは、生存可能な細菌株または生存可能な酵母または生存可能な真菌などの少なくとも１種の生存可能な微生物を含む。好ましくは、ＤＦＭが少なくとも１種の生存可能な細菌を含む。

一実施形態では、ＤＦＭは胞子形成細菌株であり得、したがって、ＤＦＭという用語は胞子、例えば、細菌胞子から構成されてもよく、またそれらを含んでもよい。したがって、本明細書では、「生存可能な微生物」という用語は、内生胞子または分生子などの微生物胞子を含み得る。あるいは、本明細書に記載の飼料添加組成物中のＤＦＭは微生物胞子、例えば内生胞子または分生子から構成されなくてもよく、またそれらを含まなくてもよい。

微生物は、天然に存在する微生物であってもよく、また形質転換された微生物であってもよい。好ましくは、微生物は、単離し得る少なくとも３種の好適な微生物、例えば細菌の組み合わせである。

本明細書に記載のＤＦＭは、以下の属の１つ以上からの微生物を含み得る：ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）ならびにこれらの組み合わせ。

ＤＦＭは、好ましくは、以下のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種から選択される１つ以上の細菌株を含む：バチスル・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびバチスル・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）。

本明細書では、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属は、当業者に知られているように、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての種、例えば、限定されないが、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．キルクランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含む。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、この属には、再分類された種、例えば、限定されないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロテルモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と名付けられているバチルス・ステアロテルモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、または、現在は「パエニバチルス・ポリミクサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）」であるバチリス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）などの生物が含まれるものとする。ストレスの多い環境条件下での耐性内生胞子の産生はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属を定義する特徴と考えられるが、この特徴は最近名付けられたアリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、テルモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも適用される。

好ましくは、ＤＦＭは、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから市販されている、Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯ中に見出される細菌株の１種以上であり得る。Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯは、（米国特許第７，７５４，４６９Ｂ号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に教示されているように）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）２０８４株アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ－５００１３、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＬＳＳＡＯ１株アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０１０４およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）１５Ａ－Ｐ４株ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－６５０７の組み合わせである。

別の態様では、ＤＦＭは、さらに以下のラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種と組み合わせ得る：ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ならびにそれらの組み合わせ。

ＤＦＭは、さらに以下のラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種と組み合わせ得る：ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバチルス・ビフィズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・クルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・フェルメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ファルキミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・デルブレウッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｅｕｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファルキミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）およびラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・アミロリティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・クルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファルキミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・フェルメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガリナルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヒルガルディイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバチルス・ムコサエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ）、ラクトバチルス・パニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ポンティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｎｔｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）およびこれらの組み合わせ。

さらに別の態様では、ＤＦＭは、さらに以下のビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種と組み合わせ得る：ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィディウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）およびビフィドバクテリウム・アングラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｇｕｌａｔｕｍ）ならびにこれらの任意の組み合わせ。

以下の種の細菌を挙げることができる：バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種およびペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）種、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、プロピオニバクテリウム・トエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルキミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）亜種アニマリス（ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）亜種サリバリウス（Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、およびこれらの組み合わせ。

本明細書に記載の、１種以上の細菌株を含む直接給餌微生物は、同じタイプ（属、種および株）のものであってもよく、また属、種および／または株の混合物を含んでもよい。好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の１種以上の細菌株を含む、本明細書に記載の直接給餌微生物。

好適には、本開示の組成物は、国際公開第２０１２１１０７７８号パンフレットで開示され、以下のように要約される、１種以上の生産物、またはそれらの生産物に含有された微生物と組み合わせることができる：
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）２０８４株アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ－５００１３、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＳＳＡＯ１株アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０１０４、およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１５Ａ－Ｐ４ ＡＴＣＣ株アクセッション番号ＰＴＡ－６５０７（Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯ（登録商標）．（以前はＡｖｉｃｏｒｒ（登録商標）として知られる）から；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｃ３１０２株（Ｃａｌｓｐｏｒｉｎ（登録商標）から）；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＢ６株（Ｃｌｏｓｔａｔ（登録商標）から）；バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）（８Ｇ－１３４）；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＮＣＩＭＢ １０４１５（ＳＦ６８）（Ｃｙｌａｃｔｉｎ（登録商標）から）；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｃ３１０２株（Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）＆ ＧａｌｌｉｐｒｏＭａｘ（登録商標）から）；バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）Ｔｅｃｔ（登録商標）から）；エンテロコッカス・ファエキウル（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｌ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）（Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｔａｒ（登録商標）から）；ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）および／またはエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）Ｐｒｏｔｅｘｉｎ（登録商標）から）；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＱＳＴ７１３株（Ｐｒｏｆｌｏｒａ（登録商標）から）；バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＣＥＣＴ－５９４０（Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）およびＥｃｏｂｉｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓから）；エンテロコッカス・ファエキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＳＦ６８（Ｆｏｒｔｉｆｌｏｒａ（登録商標）から）；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＢｉｏＰｌｕｓ２Ｂ（登録商標）から）；乳酸菌７エンテロコッカス・ファエキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（Ｌａｃｔｉｆｅｒｍ（登録商標）から）；バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（ＣＳＩ（登録商標）から）；サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｙｅａ－Ｓａｃｃ（登録商標）から）；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｂｉｏｍｉｎ ＩＭＢ５２（登録商標）から）；ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）亜種 アニマリス（ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）亜種サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｂｉｏｍｉｎ Ｃ５（登録商標）から）；ラクトバチルス・ファルキミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）（Ｂｉａｃｔｏｎ（登録商標）から）；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｏｒａｌｉｎ Ｅ１７０７（登録商標）から）；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（２株）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＤＳＭ １１０３（Ｐｒｏｂｉｏｓ－ｐｉｏｎｅｅｒ ＰＤＦＭ（登録商標）から）；ラクトバチルス・ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）およびラクトバチルス・ファルキミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）（Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）から）；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ａｎｉｍａｖｉｔ（登録商標）から）；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｂｏｎｖｉｔａｌ（登録商標）から）；サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｌｅｖｕｃｅｌｌ ＳＢ ２０（登録商標））から）；サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｌｅｖｕｃｅｌｌ ＳＣ ０ ＆ ＳＣ１０（登録商標）ＭＥから）；ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ）（Ｂａｃｔｏｃｅｌｌから）；サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡｃｔｉＳａｆ（登録商標）（以前は、ＢｉｏＳａｆ（登録商標））から）；サッカロミケス・セレビシアエＮＣＹＣ Ｓｃ４７（Ａｃｔｉｓａｆ（登録商標）ＳＣ４７から）；クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｍｉｙａ－Ｇｏｌｄ（登録商標）から）；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（ＦｅｃｉｎｏｒおよびＦｅｃｉｎｏｒ Ｐｌｕｓ（登録商標）から）；サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＣＹＣ Ｒ－６２５ （ＩｎｔｅＳｗｉｎｅ（登録商標）から）；サッカロミケス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）（ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ（登録商標）から）；エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびラクトバチルス・ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（Ｐｒｏｖｉｔａ（登録商標）から）；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＰｅｐＳｏｙＧｅｎ－Ｃ（登録商標）から）；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（Ｔｏｙｏｃｅｒｉｎ（登録商標）から）；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）変種ｔｏｙｏｉＮＣＩＭＢ ４０１１２／ＣＮＣＭ Ｉ－１０１２（ＴＯＹＯＣＥＲＩＮ（登録商標）から）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＬａｃｔｏＰｌａｎ（登録商標）から）、または、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＢｉｏＰｌｕｓ（登録商標）ＹＣから）ならびにバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧａｌｌｉＰｒｏ（登録商標）から）などの他のＤＦＭ。

本明細書に記載のＤＦＭを、以下の属および種の酵母と組み合わせることも可能である：デバリオミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ハンセニアスポラ・ウバルム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）、サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）（サッカロミケス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）の同義語）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状真菌。

好ましくは、本明細書に記載のＤＦＭは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）微生物、好ましくはＧＲＡＳ承認され、かつ／または、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）（ＥＦＳＡ）による適格安全推定の微生物を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＦＭは熱に耐えられる、すなわち耐熱性であることが重要である。これは、飼料がペレット化される場合に特に当てはまる。したがって、ＤＦＭは耐熱性細菌、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含む胞子形成細菌などの耐熱性微生物であり得る。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、増殖条件が好ましくない場合に、安定な内生胞子を形成することができ、したがってそれらは、熱、ｐＨ、湿度および殺菌剤に対して非常な耐性を示す。細菌／ＤＦＭが胞子形成体でない場合、以下の記載のように、飼料加工に耐えるように保護されなければならない。

本明細書に記載の本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭは、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）の増殖の全部または一部を阻害または遅延させ得る。換言すれば、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭは抗病原性である。本明細書では、「抗病原性」という用語は、ＤＦＭが病原体、この場合は病原性エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えばＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）の効果（負の効果）に対抗することを意味する。

例えば、微生物の、ＤＦＭとしての適合性、または本実施形態では、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭとしての適合性を決定するために、以下のアッセイ「ＤＦＭアッセイ」を使用し得る。そのようなＤＦＭは、以下のように試験することができる：

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の完全に増殖した培養物を遠心分離し、濾過滅菌（０．２μｍ）して、無菌の無細胞上清（ＣＦＳ）を得た。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、１８０μｌの病原体／ＢＨＩ（または適切な増殖培地）懸濁液（１％）を満たす。陽性対照ウェルには、同じブイヨン培地を追加で２０μｌ加え、他方、試験ウェルには２０μｌの試験ＣＦＳを満たす。陰性対照は、ブイヨン培地のみか、または２０μｌのＣＦＳを加えたブイヨン培地を含む。次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを、Ｆｌｅｘ ｓｔａｔｉｏｎ装置中、３７℃で１４時間、好気的にインキュベートし、吸光度を記録し、分析のためにデータをコンピューターに直接転送し、動力学的増殖曲線を生成する。測定は１５分毎に行った。結果は、ＯＤ＝０．４（病原体単独）での対照と、処理物（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ）のＣＦＳと共にインキュベートした病原体）を比較した阻害％として示す。増殖の遅延を、ＯＤが０．４に到達するまでの、対照とＣＦＳ補充ウェルとの時間差として算出する。全てのアッセイを２回行う。ＪＭＰ １１においてテューキーのＨＳＤを用いて平均の分離を行った；差はＰ＜０．０５で有意であると見なした。

抗病原性ＤＦＭは以下の細菌の１種以上を含み、それらは国際公開第２０１３０２９０１３号パンフレットに記載されている：
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株 アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０５１０、
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）９１８ ＡＴＣＣ株 アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０５０８、および
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１０１３ ＡＴＣＣ株 アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０５０９。

本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、培養物および担体（使用される場合）として調製することができ、リボンまたはパドルミキサーに入れ、約１５分間混合することができるが、この時間は増加または減少することができる。成分を、培養物と担体との均一な混合物が得られるようにブレンドする。最終生成物は、好ましくは乾燥した流動性粉末である。したがって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、ａ：１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌株を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物から得られる上清、または組み合わせを含み得る。このようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、その後、動物飼料または飼料プレミックスに加えることができる。それは、動物飼料の上（「トップ給餌」）に加えることができ、または動物の飲料水などの液体に加えることができる。

本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭへの個々の株の添加は、１％～９９％、好ましくは２５％～７５％の範囲で変化する割合とすることができる。

本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の、動物飼料中における好適な用量は、約１×１０^３ＣＦＵ／ｇ飼料～約１×１０^１０ＣＦＵ／ｇ飼料、好適には約１×１０^４ＣＦＵ／ｇ飼料～約１×１０^８ＣＦＵ／ｇ飼料、好適には約７．５×１０^４ＣＦＵ／ｇ飼料～約１×１０^７ＣＦＵ／ｇの範囲であり得る。

当業者であれば、食品および／または農業産業で使用され、一般に動物による消費に適していると考えられる、本明細書に記載の属内微生物の特定の種および／または株は容易にわかるであろう。動物飼料は、家禽、ブタ、反芻動物、養殖およびペットのための、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリなどの植物材料、またはこれらの植物材料もしくは植物タンパク質源の混合物を含み得る。

「動物飼料」、「飼料（ｆｅｅｄ）」、および「飼料（ｆｅｅｄｓｔｕｆｆ）」という用語は互換的に使用され、ａ）穀類、例えば小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、およびそれらの組み合わせ）および／もしくはトウモロコシ、ソルガムなどの大粒穀物；ｂ）穀類の副産物、例えばコーングルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシベースの可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ｃＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、およびシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、ワタ、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉および骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物および動物源から得られる油脂；ならびに／またはｅ）ミネラルおよびビタミンを含む群から選択される１種以上の飼料材料を含むことができる。

機能性飼料などの飼料として、またはその調製に使用される場合、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、栄養学的に許容される担体、栄養学的に許容される希釈剤、栄養学的に許容される賦形剤、栄養学的に許容されるアジュバント、栄養学的に活性な成分のうちの１つ以上と併せて使用し得る。例えば、タンパク質、ペプチド、スクロース、ラクトース、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、ソルビン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、ソルビン酸マグネシウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベンおよびプロピルパラベンからなる群から選択される少なくとも１種の成分を挙げることができよう。

好ましい実施形態では、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を飼料成分と混合して飼料を形成し得る。本明細書では、「飼料成分」という用語は、飼料の全部または一部を意味する。飼料の一部は、飼料の１種の成分を、または飼料の２種以上の成分、例えば、２または３または４種もしくはそれ以上を意味し得る。一実施形態では、「飼料成分」という用語は、プレミックスまたはプレミックス成分を包含する。好ましくは、飼料は飼葉またはそのプレミックス、配合飼料またはそのプレミックスであり得る。本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含む飼料添加組成物は、配合飼料と、または配合飼料のプレミックスと、または飼葉、飼葉成分もしくは飼葉のプレミックスと混合し得る。

本明細書では「飼葉」という用語は、（動物自身で探さなければならないもの食物ではなく）動物に与えられる食物を意味する。飼葉は、切断されている植物を包含する。

飼葉という用語には、干し草、わら、サイレージ、圧縮およびペレット化飼料、油および混合飼料、そしてまた発芽穀物およびマメ科植物が含まれる。

飼葉は、アルファルファ（ルーサン）、オオムギ、セイヨウミヤコグサ、ブラシカ、チャウ・モエリア、ケール、アブラナ（キャノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、カブ、クローバ、アルサイククローバ、アカツメクサ、サブタレニアンクローバ、シロツメクサ、草、偽エンバク草、ウシノケグサ、バミューダグラス、スズメノチャヒキ、ヒース、牧草（天然に混合された草原由来）、カモガヤ、ライグラス、オオアワガエリ、コーン（トウモロコシ）、キビ、カラスムギ、ソルガム、ダイズ、樹木（木の干し草用に枝を刈り込んだ木の若枝）、コムギおよびマメ科植物から選択される植物の１種以上から得ることができる。

「配合飼料」という用語は、ミール、ペレット、ナッツ、ケーキまたは粉砕物の形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、各種原料および添加剤からブレンドされ得る。これらのブレンド物は、標的動物の特定の要件に従って配合化される。

配合飼料は、毎日必要とされる栄養素の全てを提供する完全な飼料、飼料の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃縮物、またはミネラルおよびビタミンなどの追加の微量栄養素のみを提供するサプリメントでありえる。

配合飼料に使用される主な成分は、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、カラスムギ、およびオオムギを含む飼料穀物である。

好適には、本明細書で言及されるプレミックスは、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵生成物、および他の必須成分などの微量成分から構成される組成物であり得る。プレミックスは、通常、市販の飼料にブレンドするのに適した組成物である。

本明細書に記載の飼料は、ａ）穀類、例えば小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、およびそれらの組み合わせ）および／もしくはトウモロコシ、ソルガムなどの大粒穀物；ｂ）穀類の副産物、例えばコーングルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、およびシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、ワタ、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉および骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物および動物源から得られる油脂；ならびに／またはｅ）ミネラルおよびビタミンを含む群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。

さらに、そのような飼料は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％または少なくとも６０重量％のトウモロコシおよびダイズミールまたはトウモロコシおよび全脂肪ダイズ、またはコムギミールもしくはヒマワリミールを含有し得る。

加えて、または代替として、飼料は、高繊維飼料を提供するために、少なくとも１種の高繊維飼料材料および／または少なくとも１種の高繊維飼料材料の少なくとも１種の副産物を含み得る。高繊維飼料材料の例には、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、穀類からの副産物、例えばコーングルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、およびシトラスパルプが含まれる。いくつかのタンパク質源もまた、高繊維であると見なされ得る：ヒマワリ、ルピン、ソラマメおよびワタなどの供給源から得られるタンパク質。

本明細書に記載のように、飼料は以下の中の１種以上であり得る：ペレット、ナッツまたは（畜牛用）ケーキを含む配合飼料およびプレミックス；作物または作物残渣：トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシ茎葉、コプラ、わら、切りわら、サトウダイコン廃棄物；魚粉；切断した新鮮な草および他の飼料植物；肉および骨粉；糖蜜；オイルケーキおよびプレスケーキ；オリゴ糖；保存された飼料植物：乾草およびサイレージ；海藻；全粒、または粉砕、製粉などによって調製した種子および穀粒；発芽した穀物およびマメ科植物；酵母エキス。

本明細書で使用される飼料という用語はまた、いくつかの実施形態では、ペットフードを包含する。ペットフードは、ドッグフードまたはキャットフードなどの、ペットによる消費を意図した植物性または動物性材料である。ドッグフードおよびキャットフードなどのペットフードは、イヌ用のキブルなどの乾燥形態、または湿式缶詰形態であり得る。キャットフードは、アミノ酸のタウリンを含有し得る。

飼料という用語はまた、いくつかの実施形態では、フィッシュフードを包含し得る。フィッシュフードは、通常、捕獲された魚を良好な健康状態に保つために必要な、多量栄養素、微量元素、およびビタミンを含有する。フィッシュフードは、フレーク、ペレットまたはタブレットの形態であり得る。ペレット化形態（そのなかには、急速に沈むものがある）は、多くの場合、比較的大きな魚または底部摂食種用に使用される。一部のフィッシュフードはまた、観賞魚の発色を人工的に改善するために、ベータカロテンまたは性ホルモンなどの添加剤も含有する。

また、「飼料」という用語には、バードフィーダ用とペットの鳥への給餌用の両方で使用される餌を含む鳥用の餌も含まれる。通常、鳥用の餌には様々な種子が含まれるが、スエット（ビーフまたはマトンの脂肪）もまた包含され得る。

本明細書では、「接触した」という用語は、製品（例えば、飼料）へ飼料添加組成物を間接的または直接的に塗布することを指す。使用し得る塗布方法の例としては、飼料添加組成物を含む材料中で製品を処理すること、飼料添加組成物を製品と混合することによる直接的な塗布、飼料添加組成物を製品表面に噴霧すること、または製品を飼料添加組成物の調製物中に浸漬することが挙げられるが、これらに限定されない。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、好ましくは製品（例えば、飼料）と混合され得る。あるいは、それは、飼料のエマルション中、または飼料の原料中に含まれ得る。

いくつかの用途では、作用させる／処理する製品の表面上で、または表面に対してそれが利用できるようにすることが重要である。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を塗布して、製品（例えば、飼料または飼料の原料）に、制御された量のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を散在させ、被覆し、かつ／または含浸させることができる。

少なくとも１種の細菌株を含むＤＦＭは、好適な濃度で、例えば、約２×１０^３ＣＦＵ／ｇ飼料～約２×１０^１１ＣＦＵ／ｇ飼料、好適には約２×１０^６～約１×１０^１０、好適には約３．７５×１０^７ＣＦＵ／ｇ飼料～約１×１０^１０ＣＦＵ／ｇ飼料の１日用量を提供する最終飼料製品中の濃度で加えることができる。

好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、約７０℃まで；約８５℃まで；または約９５℃までの熱処理に対して熱的に安定である。熱処理は、約３０秒から数分まで行い得る。「熱的に安定な」という用語は、特定の温度にまで加熱する前に存在し／活性であったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の少なくとも約５０％が、室温にまで冷却した後もなお存在し／活性であることを意味する。特に好ましい実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、粉末を製造するために均質化される。

あるいは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレットに記載されるような顆粒（ＴＰＴ顆粒と呼ばれる）に形成される。

別の好ましい実施形態では、飼料添加組成物が顆粒に形成される場合、顆粒は、タンパク質の核の上にコーティングされた水和バリア塩を含む。そうした塩コーティングの利点は、耐熱性の改善、貯蔵安定性の改善、ならびに１種以上の細菌株を含む少なくとも１種のプロテアーゼおよび／またはＤＦＭに悪影響を及ぼす他の飼料添加剤に対する保護である。好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、２０℃で０．２５を超える水分活性または６０％を超える一定湿度を有する。好ましくは、塩コーティングはＮａ_２ＳＯ_４を含む。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含有する飼料は、飼料ペレット化プロセスを用いて製造し得る。任意選択により、ペレット化工程はペレットの形成前に、蒸気処理、またはコンディショニング段階を含み得る。粉末を含む混合物は、コンディショナー、例えば、蒸気注入を有するミキサーに入れることができる。混合物はコンディショナー内で、６０～１００℃などの特定の温度まで加熱されるが、典型的な温度は７０℃、８０℃、８５℃、９０℃または９５℃であろう。滞留時間は、数秒から数分、さらには数時間まで変えることができる。例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分２分、５分、１０分、１５分、３０分、および１時間。

顆粒に関しては、少なくとも１つのコーティングは、顆粒の少なくとも５５重量％を占める水分水和物質を含んでもよく、かつ／または少なくとも１つのコーティングは２つのコーティングを含んでもよい。２つのコーティングは、水分水和コーティングと水分バリアコーティングであり得る。いくつかの実施形態では、水分水和コーティングは、顆粒の２５重量％～６０重量％であり得、水分バリアコーティングは顆粒の２重量％～１５重量％であり得る。水分水和コーティングは無機塩、スクロース、デンプン、およびマルトデキストリンから選択し得、水分バリアコーティングは、ポリマー、ガム、ホエイ、およびデンプンから選択し得る。

顆粒は飼料ペレット化プロセスを使用して製造することができ、飼料前処理プロセスは、７０℃～９５℃で、例えば８５℃～９５℃で数分間まで実施し得る。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、コア；貯蔵後、かつ顆粒が成分である場合には蒸気加熱ペレット化プロセス後に、少なくとも８０％の活性を保持する顆粒の活性剤；水分バリアコーティング；および、顆粒の少なくとも２５重量％である水分水和コーティングを含む動物飼料用の顆粒であって、蒸気加熱ペレット化プロセス前に０．５未満の水分活性を有する顆粒に形成されてもよい。

顆粒はポリマーおよびガムから選択される水分バリアコーティングを有してよく、水分水和材料は無機塩であってよい。水分水和コーティングは、顆粒の２５重量％～４５重量％であり得、水分バリアコーティングは顆粒の２重量％～１０重量％であり得る。

顆粒は、８５℃～９５℃で数分間まで行われ得る蒸気加熱ペレット化プロセスを用いて製造し得る。

あるいは、組成物は消費に適した液体製剤中に存在し、好ましくはそのような液体消費物は、次の１種以上を含む：緩衝液、塩、ソルビトールおよび／またはグリセロール。

また、飼料添加組成物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を、例えば粉砕コムギなどの担体基材上に塗布、例えば噴霧することによって製剤化し得る。

一実施形態では、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含むそのような飼料添加組成物を、プレミックスとして製剤化し得る。単なる例として、プレミックスは、１種以上のミネラルおよび／または１種以上のビタミンなどの、１種以上の飼料成分を含んでもよい。

あるいは、組成物は消費に適した液体製剤中に存在し、好ましくはそのような液体消費物は、以下の１種以上を含む：緩衝液、塩、ソルビトールおよび／またはグリセロール。

また、飼料添加組成物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を、例えば粉砕コムギなどの担体基材上に塗布、例えば噴霧することによって製剤化し得る。

一実施形態では、本明細書に記載のそのようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を、プレミックスとして製剤化し得る。単なる例として、プレミックスは、１種以上のミネラルおよび／または１種以上のビタミンなどの、１種以上の飼料成分を含んでもよい。

本明細書に開示のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、任意の適切な飼料材料への添加に適していることが理解されるであろう。

本明細書では、飼料材料という用語は、動物によって消費される基本的な飼料材料を指す。さらに、これが、例えば、少なくとも１つ以上の未加工穀物、ならびに／または、ダイズミールもしくは骨粉などの加工された植物性および／もしくは動物性材料を含み得ることは理解されるであろう。

異なる動物は異なる飼料を必要とし、同じ動物であっても、動物の飼育される目的に応じて異なる飼料を必要とし得ることは、当業者には理解されるであろう。

好ましくは、飼料は、トウモロコシまたはコーン、コムギ、オオムギ、ライコムギ、ライムギ、コメ、タピオカ、ソルガム、および／または任意の副産物、ならびにダイズ平均、ナタネミール、キャノーラミール、綿実ミール、ヒマワリ種子の平均、動物副産物ミール、およびこれらの混合物などのタンパク質に富む成分を含む飼料材料を含み得る。より好ましくは、飼料は動物性脂肪および／または植物油を含み得る。

任意選択により、飼料はまた、例えばカルシウムなどの追加のミネラル、および／または追加のビタミンを含み得る。好ましくは、飼料はトウモロコシダイズミールミックスである。

別の態様では、飼料の製造方法が提供される。飼料は典型的には飼料ミルで製造され、そこでは、まず原料が好適な粒径に粉砕され、次いで適切な添加剤と混合される。その後、飼料はマッシュまたはペレットとして製造され得、後者は、典型的には、温度を目標レベルまで上昇させ、次いで、飼料をダイに通して、特定のサイズのペレットを製造する方法を含む。ペレットを冷却する。続いて、脂肪および酵素などの液体添加剤を添加し得る。飼料の製造はまた、特に少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な手法による、ペレット化の前の押し出しまたは膨張を含む、さらなる工程を含み得る。

飼料は、家禽（例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラー種鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、水鳥）、ブタ（全ての年齢区分）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）または魚などの単胃動物用の飼料であり得、好ましくは、飼料は家禽用である。

本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は動物飼料の上に置く、すなわち、上置き給餌し得る。あるいは、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、動物の飲料水中などの液体に添加し得る。

本明細書では、「接触した」という用語は、製品（例えば、飼料）へ本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を間接的または直接的に塗布することを指す。

使用し得る塗布方法の例としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含む材料中で製品を処理すること、本明細書に記載の飼料添加組成物であるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を製品と混合することによる直接的な塗布、そのような飼料添加組成物を製品表面に噴霧すること、または製品を飼料添加組成物の調製物中に浸漬することが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載の飼料添加組成物、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、好ましくは製品（例えば、飼料）と混合される。あるいは、飼料添加組成物は、飼料のエマルション中、または飼料の原料中に含まれ得る。これは、組成物に性能上の利益を与える。

本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を調製する方法はまた、粉末をペレット化するさらなる工程を含み得る。粉末は、当該技術分野で知られている他の成分と混合し得る。粉末、または粉末を含む混合物は、ダイを通して押し出すことができ、得られたストランドは可変長の好適なペレットに切断される。

任意選択により、ペレット化工程は、ペレットの形成前に、蒸気処理、またはコンディショニング段階を含み得る。粉末を含む混合物は、コンディショナー、例えば、蒸気注入を有するミキサーに入れることができる。混合物はコンディショナー内で、６０～１００℃などの特定の温度まで加熱されるが、典型的な温度は７０℃、８０℃、８５℃、９０℃または９５℃であろう。滞留時間は、数秒から数分、さらには数時間まで変えることができる。例えば、５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間および１時間。

異なる動物は異なる飼料を必要とし、同じ動物であっても、動物が飼育される目的に応じて異なる飼料を必要とし得ることは、当業者によって理解されるであろう。

任意選択により、飼料はまた、例えばカルシウムなどの追加のミネラル、および／または追加のビタミンを含み得る。いくつかの実施例では、飼料はトウモロコシダイズミールミックスである。

飼料は典型的には飼料ミルで製造され、そこでは、まず原料が好適な粒径に粉砕され、次いで適切な添加剤と混合される。その後、飼料はマッシュまたはペレットとして製造され得、後者は、典型的には、温度を目標レベルまで上昇させ、次いで、飼料をダイに通して、特定のサイズのペレットを製造する方法を含む。ペレットを冷却する。続いて、脂肪および酵素などの液体添加剤を添加し得る。飼料の製造はまた、特に少なくとも蒸気の使用を含む好適な手法による、ペレット化の前の押し出しまたは膨張を含む、さらなる工程を含み得る。

上述したように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分および／またはそれを含む飼料は、任意の適切な形態で使用し得る。それは、固体もしくは液体調製物またはその代替物の形態で使用し得る。固体調製物の例としては、粉末、ペースト、ボーラス、カプセル、ペレット、錠剤、ダストおよび顆粒が挙げられ、これらは可溶性とされた、スプレー乾燥された、または凍結乾燥されたものであり得る。液体調製物の例としては、限定されないが、水溶液、有機溶液または水性－有機溶液、懸濁液およびエマルションが挙げられる。

いくつかの用途では、飼料添加組成物は、飼料と混合するか、または飲料水に入れて投与することができる。

本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）をベースとする成分を、飼料として許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合すること、および（任意選択により）包装することを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分。

飼料および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、少なくとも１種のミネラルおよび／または少なくとも１種のビタミンと併用し得る。このようにして得られた組成物を、本明細書ではプレミックスと呼び得る。飼料は、少なくとも０．０００１重量％のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含み得る。好適には、飼料は、少なくとも０．０００５重量％；少なくとも０．００１０重量％；少なくとも０．００２０重量％；少なくとも０．００２５重量％；少なくとも０．００５０重量％；少なくとも０．０１００重量％；少なくとも０．０２０重量％；少なくとも０．１００重量％；少なくとも０．２００重量％；少なくとも０．２５０重量％；少なくとも０．５００重量％のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含み得る。

好ましくは、食物またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、少なくとも１つの生理学的に許容される担体をさらに含み得る。生理学的に許容される担体は、好ましくはマルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ_２ＳＯ_４、タルク、ＰＶＡおよびそれらの混合物の少なくとも１つから選択される。さらなる実施形態では、食物または飼料は金属イオンキレート剤をさらに含み得る。金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡまたはクエン酸から選択し得る。

一実施形態では、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分（カプセル化されているか否かを問わない）は、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ_２ＳＯ_４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルベート、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、およびこれらの混合物の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの生理学的に許容される担体と共に製剤化することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、生理学的に許容される担体中に存在するであろう。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子などの、大きくて、ゆっくりと代謝される巨大分子であり得る。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの無機酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体をさらに含有し得る。さらに、湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質が、このような組成物中に存在してもよい。そのような担体は、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として医薬組成物を製剤化することを可能にする。製剤化されれば、対象に直接投与することができる。治療の対象は動物であり得る。

本明細書で開示される組成物および方法の非限定的な例には、以下のものが含まれる：

１．１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌株を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物から得られる上清、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、有効量の、少なくとも１種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を動物に投与することを含む、動物体内での病原性エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ）種の増殖の全部または一部を阻害または遅延させる方法。

２．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される、実施形態１の方法。

３．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物は、以下の株：Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株２０８４アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ－５００１３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＬＳＳＡＯ１アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０１０４およびＢａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株１５Ａ－Ｐ４ ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－６５０７の１種以上から選択される、実施形態１または２の方法。

４．動物は単胃動物である実施形態１、２または３の方法。

５．動物は複胃動物である実施形態１、２または３の方法。

６．単胃動物は家禽である実施形態１、２、３または４の方法。

７．少なくとも１種のＢａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、動物飼料を通して動物に、飼料中に入れるか、飼料上に置くか、液体中に入れるかにかかわらず、直接投与される、上記実施形態１～６のいずれかの方法。

８．少なくとも１種のＢａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、飼料、飼料添加組成物、プレミックス、または水などの液体中からなる群から選択される形態で動物に投与される、実施形態１～７のいずれかの方法。

本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

本開示は、以下の実施例においてさらに定義される。実施例は、いくつかの実施形態を示しているものの、例示のためにだけ与えられていることを理解すべきである。上記の考察および実施例から、当業者は本開示の本質的な特徴を確かめることができ、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合するよう、様々な変更および修正を加えることができる。

実施例１
エンテロコッカス・セコルム（ｃｅｃｏｒｕｍ）とバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株
５２種のエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）株を、下記表１に要約するように、北米およびヨーロッパの微生物保存機関から収集した。収集中、腸管外病変から単離されたエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）株を収集することに重点を置き、かつ脊椎炎の大発生を確認したことから、試験した株が悪性であり、病気を引き起こす可能性があることを確信した。

計１１種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の阻害能を試験した。これらは、表２に要約されるように、ＤｕＰｏｎｔ所有のＤＦＭ株および競合会社のＤＦＭ製品から単離されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の両方を含んだ。試験した全てのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、家禽生産に使用するために商品化されている。Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから商業的に入手可能であるＥｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯは、（米国特許第７，７５４，４６９Ｂ号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に教示されているように）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株２０８４アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ－５００１３、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＬＳＳＡＯ１アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０１０４およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株１５Ａ－Ｐ４ ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－６５０７の組み合わせである。

全ての非ＤｕＰｏｎｔバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）製品を購入し、３つの別々の製造バッチから３つの単離物を単離した。回収された菌株が、製品ラベルの菌株表示に適合することを確実にするために、全ての菌株を同定した。上記表２に示すように、非ＤｕＰｏｎｔ製品を、全エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）収集物からの９分離株のサブセットに対して試験した。

実施例２
無細胞上清（ＣＦＳ）の製造とエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）およびエンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）株の増殖
白金耳を使用して、１０ｍｌのトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）を入れた３０ｍｌの振盪チューブに、凍結バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ストックから植菌する。３２℃のインキュベーター内で２４時間、チューブをインキュベートし、１３０で振盪してバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を増殖させる。

フラスコを１８時間インキュベートした後、分光計で光学濃度（ＯＤ）をチェックした（波長６００ｎｍ、吸光度０）。２ｍｌの滅菌ＴＳＢをピペットでキュベットに加え、ブランク対照を作製した。１．８ｍｌの滅菌ＴＳＢおよび０．２ｍｌの１８時間増殖物をピペットで各キュベットに入れ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の１０倍希釈物を作製した。完全な混合を確実にするために、キュベットにカバーをし、逆さにした。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）希釈液の吸光度は、０．２５～０．３であると決定された（吸光度読み取り値が０．２５未満の試料は、吸光度が許容レベルに達するまで再インキュベートした）。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）増殖物を各フラスコから無菌の２５０ｍｌ遠心ボトルに移し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離後、各タイプのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の上清をＮａｌｇｅｎｅボトルトップフィルターに移し、ポンプで５０ｍｌのコニカルチューブに注入した。

この手順を全てのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株について行った。その後、無細胞上清（ＣＦＳ）を、必要になるまで－８０℃で凍結した。

Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）株を、冷凍ストック培養物から、ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）ブロスおよびＢＨＩ寒天プレート（純度をチェックするため）に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。増殖培地への適合を確実にするために、アッセイに組み入れる前に、全ての株を少なくとも２回継代培養した。

全てのアッセイは、上記表２に同定された各バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭについて２回行った。

エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）細胞への熱ショックを避けるために、アッセイ前に２０ｍｌのＢＨＩブロスを１時間インキュベートした。

平底ウェルの９６ウェルＵＶ処理マイクロタイタープレートに、培地（ＢＨＩブロス）ならびにＣＦＳおよび標的微生物を次のように加えた：
・陽性対照：２００μｌの培地＋２μｌの細菌（１％）
・陰性対照：２００μｌの培地
・ＣＦＳアッセイウェル：１８０μｌの培地＋２０μｌのＣＦＳ＋２μｌの細菌（１％）
・陰性ＣＦＳウェル：１８０μｌの培地＋２０μｌのＣＦＳ

プレートを、Ｆｌｅｘ ｓｔａｔｉｏｎ装置中、３７℃で１４時間インキュベートし、吸光度を記録し、分析のためにデータをコンピューターに直接転送した。測定は１５分毎に行った。

結果は、ＯＤ＝０．４（Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）単独）における対照と、処理物（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ）のＣＦＳと共にインキュベートしたＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ））を比較し、阻害％として示す。図１に示すように、４２の個々の株に対して、３種の各Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯ株（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分）による平均阻害率は＞８５％であった。＞５０％の阻害率は、許容可能であると見なし、≧７５％の阻害率は優れていると見なすこととした。１００％を超える阻害率は、病原体単離物が単に阻害されるのではなく、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）によって溶解されたことを示す。

表３は、Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯ株による、５１種のエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）株の平均増殖阻害率を示す。全ての株は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＣＦＳを加えずにインキュベートしたＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）と比較して、エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の増殖を有意に阻害することができた。最も有効な株は１５ＡＰ４（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分）であり、平均阻害率は８８．７９％であったが、菌株間の差は統計的に有意ではなかった。

表４は、１２種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株による、９種のエンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）株サブセットの平均増殖阻害率を示す。最も有効な菌株はＢＳ２０８４（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分）であり、平均阻害率は８５．３３％であった。有効性が最も低いバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、平均阻害率が－８０．１７％の２Ｂ２であり、エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＣＦＳ（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分）の非存在下より、存在下でより早く増殖したことを示した。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株間で有効性に有意差があった。

表５のデータは、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）亜種、プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）１５ＡＰ４、ＢＳ８および２０８４（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分）ＣＦＳの、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＶＴＴ Ｅ－９７７７６Ｔに対する抗微生物活性を示す。

図１および図２は、それぞれアメリカおよびヨーロッパの家禽生産から収集した、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）株に対する平均阻害率を示す。

図３は、Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯ株を含む／含まない場合の、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）株の増殖の動力学データを示す。いくつかのＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の上清、すなわちバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分によって完全には阻害されない。１４時間のインキュベーション時間の終わりでは、病原体の濃度は対照プレートおよび処理プレートで同じであるが、遅延期は延長され、指数関数的増殖は遅延される。家禽の腸管通過時間を考慮すると、この種の結果は、（全体的な阻害の欠如にもかかわらず）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、腸管を通過する間に病原体の増殖を妨げることができ、癒着および転移のリスクを低減し得ることを意味する。図４に示すように、他の株は１４時間の時点で遅延され、かつ阻害される。

図５は、対照病原体の曲線が丁度ＯＤ ０．４に到達した終点における、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）亜種プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）１５ＡＰ４、ＢＳ８および２０８４（バチルス属（（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分）のＣＦＳの、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＶＴＴ Ｅ－９７７７６Ｔに対する抗微生物活性を阻害の％として示す。

図６は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）２０８４（バチルス属（（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分）のＣＦＳと共にインキュベートした、またはインキュベートしなかったエンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）Ｅ ８４１９７の増殖プロファイルを示す。

図７は、対照病原体曲線が丁度ＯＤ ０．４に達した終点における阻害の％として表した、米国およびベルギーの家禽生産システムから単離した１０種の臨床分離株エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）に対するバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＤＳＭ７^Ｔ、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ１０^ＴおよびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＳＭ１３^ＴのＣＦＳの抗微生物活性を示す（黒色の棒は阻害の平均％に対応する）。

以前の研究で、指数増殖期にあるＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）の完全な阻害および遅延の両方が見られるような、生産中の１～３週の間に、ブロイラーが敗血症を発症することが示されている。本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭを家禽飼料に補充すると、腸のコロニー形成、癒着、およびその後の侵入を遅らせることができ、これは、臨床症状の発生率を低下させて食肉処理に間に合うことを意味する。

これらのデータは、これまでに試験された他の病原体の阻害範囲と比較して極めて説得力がある。この効果はまた、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の効力の自然な変動にもかかわらず、試験したＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）分離株の範囲にわたって全く一貫しているように思われる。

本明細書に示すインビトロの結果によれば、本明細書に記載のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を家禽飼料に補充することは、新興病原体であるＥ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）の増殖の全てまたは一部を阻害または遅延させること、ならびに動物体内でのエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の増殖を阻害または遅延させることに非常に有効であり得ることが示された（図５に示すように）。

実施例３
動物体内におけるエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓｓ）種の増殖を阻害または遅延させるためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分
基準株は、「国際細菌命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ）」において、「種の命名基準」として定義され、他の全ての株がその種に属するか否かを決定するために比較される「参照ポイント」である。本研究に含まれる各細菌種の基準株（下記表６を参照されたい）を含めることは、「プロバイオティクス」として特徴付けられる株と、同じ種に属するが「プロバイオティクス」として特徴付けられない株との阻害能の比較を可能にする。ここでの仮説は、プロバイオティクス特性は特定の菌株に特有であり、これらの特性は同じ種に属する他の菌株には移すことができないということである。完全に特徴付けられ、評価された菌株のみを「プロバイオティクス」と指定することができる。本実験に含まれる基準株は、ここで研究された株に関連する３つの異なるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の代表である。それらの起源、および他の微生物保存機関で利用可能な同等株の非網羅的なリストを表６に示す。

これらの３つの基準株の抗微生物活性を、前述のように、エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の１０種の分離株のセットに対して評価した（表７）。

３種の異なる基準株から得た各ＣＦＳによる、１０種の病原性エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）分離株に対する増殖阻害のパーセンテージを図７に示す。Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ由来の３種のＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）株（１５ＡＰ４；ＢＳ８および２０８４）（上記表４を参照されたい）とは異なり、Ｂ．アミロリクエファシエンス（（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ））ＤＳＭ７Ｔ型株は、試験した病原体に対して抗微生物活性を示さなかった（図７）。本実験では、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）基準株（ＤＳＭ７^Ｔ）由来のＣＦＳは、病原体の増殖を促進し、試験した病原体のいずれをも阻害することができなかった。この発見は、抗微生物特性の株特異性を支持する。特定の菌株についてのプロバイオティクス・クレームは、その菌株または数千の菌株の中の菌株を同定することを目的とする科学的スクリーニングアプローチから生じ、独自性を示し、したがって、宿主に利益を提供することができ、また、その経済的価値を提供することができる。

したがって、Ｂ．リケノフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＳＭ１３^Ｔが、市販のプロバイオティクスＢ．リケノフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株および＃１０／４のそれぞれ１．３６％および－１２．４１％（表４）と比較して、Ｅ．セコルム（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）病原性分離株に対してより大きな抗微生物活性（平均６８．５８％）を示したことは驚くべきことであった。基準株Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＳＭ１０^Ｔは、市販のプロバイオティクスＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株＃１１／１（－２１％）が示す平均パーセンテージと比較した場合、平均で２６％の、依然、より高い阻害パーセンテージを示した（図７および表４）。

Claims (7)

1. 動物体内での病原性エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の増殖の全部または一部を阻害または遅延させるための組成物であって、
   バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給餌微生物であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）２０８４およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１５Ａ－Ｐ４から選択される、バチルス属ベースの直接給餌微生物
   を含む、組成物。
2. 前記動物は単胃動物である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記動物は複胃動物である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記単胃動物は家禽である、請求項２に記載の組成物。
5. 前記組成物は、動物飼料を通して動物に、前記飼料中に入れるか、前記飼料上に置くか、液体中に入れるかにかかわらず、直接投与される、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物は、飼料、飼料添加組成物、プレミックス、または液体の形態である、請求項１に記載の組成物。
7. 非ヒト動物体内での病原性エンテロコッカス・セコルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）の増殖の全部または一部を阻害または遅延させる方法であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）２０８４およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１５Ａ－Ｐ４から選択されるバチルス属ベースの直接給餌微生物を前記動物に投与することを含む、方法。

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