JP2014531893A - 胴枯病を制御するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
添付の配列表中の物質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。「SGI1520−1WO_ST25.txt」という名の添付のファイルは、2012年7月24日に作成され、55キロバイトである。このファイルは、Window OSを使用するコンピュータ上のMicrosoft Wordを用いてアクセスされ得る。
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術、表記、および他の科学的用語または専門用語の全用語は、本発明が関連する当業者に一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合では、一般に理解される意味の用語は、本明細書において明確さおよび/または即時参照のために定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、当該技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な相違を表すものと必ずしも解釈されないものとする。本明細書に記載または参照される技術および手順の多くは、当業者に十分に理解され、従来の方法を使用して一般的に採用される。
微生物は、直接顕微鏡分析(サンプル中の全細胞は検査上で同じに見える)、染色特性、単純な分子分析(単純な制限断片長多型(RFLP)決定等)などに基づき区別され得ることが多い。本開示の実施例2〜3に記載されるそのような分類分析法の例示的な例に加えて、微生物の分類識別は最大いくつかの異なるレベルの分析を伴うことができ、各分析は生物の異なる特性に基づき得る。そのような分類分析は、核酸に基づく分析(例えば、個々の特定の遺伝子の分析であって、それらの存在もしくはそれらの正確な配列、または特定の遺伝子もしくは遺伝子のファミリーの発現のいずれかに関する、分析)、タンパク質に基づく分析(例えば、直接的もしくは間接的酵素アッセイを使用する機能レベルで、またはイムノ検出法を使用する構造レベルで)などを含み得る。
本開示の実施例のセクションでより詳細に記載されるように、出願者は、いくつかの農学的に有益な新規微生物、例えば胴枯病の有効な抑制因子を発見した。具体的には、これらの新規拮抗微生物は、胴枯の重症度を低減し、小麦の胴枯病の主な原因因子であるフザリウム・グラミネアラムの成長の阻害に有効である。微生物拮抗薬は、米国のいくつかの場所から収集した野生植物サンプルから得た約5,000の微生物株の中から識別された。拮抗微生物の最初の選択は、微生物が、生体外拮抗アッセイにおいて、フザリウム・グラミネアラム病原体およびその有性世代ジベレラ・ゼアエの発現を抑制する能力に基づいた。選択された微生物拮抗薬は、次に、小麦幼苗の温室研究において生物アッセイされ、これは、幼苗に微生物株を播種し、続いて、微生物株が真菌侵襲の重症度を低減させる能力および種子収率を保つその能力について、フザリウム・グラミネアラム胞子の播種を繰り返すことを伴う。この様式で選択された拮抗微生物は、温室試験において、胴枯の重症度を低減させるのに有効であることが分かった。
胴枯病に対して抑制活性を有すると識別された微生物株の精製された培養物は、特許手続の目的に関するブダペスト条約およびそれに従う規制により(ブダペスト条約)、1815 N.University Street,Peoria,IL 61604,USA(NRRL)に位置する農業研究サービス培養物保存機関(Agricultural Research Service Culture Collection)に寄託された。これらの寄託の受託番号は次の通りである。
単離された微生物株またはその培養物を含む本発明の微生物組成物は、静置培養物、全培養物、細胞の保存貯蔵物、菌糸体および/もしくは菌糸(特にグリセロール貯蔵物)、寒天片、グリセロール/水中の保存された寒天プラグ、凍結乾燥貯蔵物、および濾紙もしくは穀類種子上に乾燥させた凍結乾燥物(lyophilisate)または菌糸体等の乾燥貯蔵物を含むがこれらに限定されない様々な形態であり得る。本明細書の他の箇所で定義されるように、本開示および当該技術分野において使用される、「単離された培養物」または文法上の等価物は、培養物と呼ばれるものが、培養液、ペレット、剥離物、乾燥サンプル、凍結乾燥物(lyophilate)、または切片(例えば菌糸もしくは菌糸体)、あるいは単一タイプの生物を含むプレート、紙、フィルタ、マトリックス、ストロー、ピペット、もしくはピペットチップ、繊維、針、ゲル、スワブ、チューブ、バイアル、粒子等の支持体、容器、または培地であることを意味することを理解する。本発明において、微生物拮抗薬である単離された培養物は、培養液、または微生物の剥離物、ペレット、乾燥調製物、凍結乾燥物(lyophilate)、もしくは切片、あるいは他の生物の不在下で微生物を含む支持体、容器、または培地である。
いくつかの特に好ましい実施形態では、本発明の生物制御組成物は、種子処理剤として製剤化される。種子処理剤は、好ましくは、少なくとも一つの昆虫制御剤と、少なくとも一つの生物学的制御剤とを含む。種子は、種子処理製品を種子に正確に、安全に、かつ効率的に適用するように特異的に設計され、製造される処理適用器具の使用を通して、混合、噴霧、またはそれらの組み合わせの従来の方法を使用して、本明細書に開示される一層以上の生物制御組成物で実質的に均質にコーティングされ得ることが想定される。そのような器具は、回転式塗布機、ドラム式塗布機、流動床技法、噴流床、回転ミスト、またはそれらの組み合わせ等の様々な種類のコーティング技術を使用する。本発明のもの等の液体種子処理剤は、スプレーパターンを通って移動するとき、種子処理剤を種子上に均一に分散させる回転「アトマイザー」ディスクまたはスプレーノズルのいずれかを介して適用され得る。好ましくは、種子は、次に、さらなる処理剤の分散および乾燥を達成するために、さらなる期間の間、混合または混転される。発芽および出芽の均一性を増加させるために本発明の組成物でコーティングされる前に、種子はプライミングされても、プライミングされなくてもよい。代替的実施形態では、乾燥粉末製剤が移動種子上に計られ、完全に分散されるまで混合され得る。
微生物拮抗薬の培養物は、当該技術分野において既知の標準的な静的乾燥および液体発酵法を使用して、本発明の生物制御組成物に使用するために調製され得る。成長は、一般的に、生物反応器中で達成される。
本実施例は、胴枯病の原因因子に対して、特にフザリウム・グラミネアラムに対して抑制活性を有する微生物の株を単離するために、Synthetic Genomics,Inc.で内部的に開発された、候補微生物を収集し、スクリーニングする高処理プロセスを説明する。新しい微生物拮抗株は、全米各地のいくつかの場所から収集した植物組織サンプルから単離された。細菌株SGI−014−C06、SGI−014−G01、SGI−015−F03、およびSGI−015−H06は、Julian,CA近くのEagle Peak Preserveから収集した植物根組織から単離した。真菌株SGI−010−H11および細菌株SGI−005−G08は、San Elijo Lagoon,Encinitas,CAから収集した二つの異なる植物サンプルの茎部組織から単離した。
真菌細胞溶解およびITS−5.8S rDNA配列情報の取得
真菌バイオマスは、50μlの2×溶解緩衝液(100mM Tris HCL、pH8.0、2mM EDTA、pH8.0、1%SDS、400μg/mlプロテイナーゼK)を含む96ウェルPCRマイクロプレートに移された。溶解条件は次の通りである:55℃で60分間、94℃で4分間。溶解生成物のアリコートは、PCR増幅のテンプレートDNAの供給源として使用された。ITS−5.8S rDNA配列は、M13−ITS1(配列番号15)およびITS4 M13尾状(配列番号16)の二つのプライマーを使用して、PCRを介して増幅された。
細胞懸濁液の20−μlのアリコートは、20μlの2×溶解緩衝液(100mM Tris HCL、pH8.0、2mM EDTA、pH8.0、1%SDS、400μg/mlプロテイナーゼK)を含む96ウェルPCRマイクロプレートに移された。溶解条件は次の通りである:55℃で30分間、94℃で4分間。溶解生成物のアリコートは、PCR増幅のテンプレートDNAの供給源として使用された。16S rRNA配列は、M13−27F(配列番号17)および1492R M13尾状(配列番号18)のプライマーを使用して、PCRを介して増幅された。
27種のミクロバクテリウム属のからのいくつかのハウスキーピング遺伝子の系統発生研究がRichert et al.(Syst.Appl.Microbiol.30:102−108,2007)によって報告された。この研究は、系統分類に関する16S rRNA配列分析の利点は卓越しているが、単一の分類学的パラメータにのみ重点を置くことによって系統的結論を導くべきではないと結論付けた。上記に開示される、SGI−014−C06の16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号1)は、Richert et al.(2007)の研究に含まれたミクロバクテリウム・オキシダンス株DSM 20578(GenBank Accession Yl7227.1)の16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列を含むいくつかのミクロバクテリウム種株の16S rRNA遺伝子と同一である。出願者は、次に、DNAジャイレースサブ単位B(gyrB)、RNA−ポリメラーゼサブ単位B(rpoB)、リコンビナーゼA(recA)、およびポリリン酸キナーゼ(ppk)である、単離株SGI−014−C06の四つのハウスキーピング遺伝子に対して系統発生的分析を実施した。この目的に向かって、単離株SGI−014−C06の全ゲノムは、PCT特許出願第WO2010115156A2号に記載される手順を使用して、ショットガン配列決定され、組み立てられ、注釈が付けられた。ゲノムDNAは、SGI−014−C06の新しい培養物から調製された。細胞ペレットは、製造者の推奨プロトコルに従い、MO BIO Laboratories,Inc.のUltraClean(登録商標)Mega Soil DNA単離キット(カタログ番号12900−10)を使用して、高分子量DNA抽出のために使用された。次に、SGI−014−C06からのゲノムDNAは、ショットガン454−ピロシーケンス用に調製された。ゲノムDNA(7.5μg)は、長い単一読取用に推奨プロトコル(454 Life Sciences)に従い、ライブラリ構築のために使用された。配列は、二回のGS FLX チタンシリーズ配列決定作業によって生成された。
バリオボラックス種(NRRL B−50469)を使用するフザリウム・グラミネアラム感染からの小麦の保護
実施例1に記載される拮抗作用スクリーニングにおける抗生作用に対して陽性と分かった微生物株は、微生物株の細胞が影響を受けやすい穀物品種の種子上に直接適用され、続いてフザリウム・グラミネアラムの分生子胞子で播種される植物系バイオアッセイを通してさらに評価された。微生物株を十分な濁度に成長させ、水に希釈した。2グラムの影響を受けやすい小麦品種の小麦種子(Hank;WestBred LLC,Bozeman,MT)を、低温殺菌した土壌培地を含む1リットルの鉢に蒔いた。蒔いた後、20mLの微生物培養希釈物を蒔いた種子の上に移した。14時間の光周期を用いた蛍光灯下の温室条件で小麦種子を発芽させた。小麦が花成し始めたとき、小麦の胴は噴霧によりフザリウム・グラミネアラムNRRL5883分生子胞子に曝露された。分生子胞子は、0.01%のTween20を含む水をプレート上に注ぎ、胞子を懸濁液中にこすり落とすことによって、5日経ったPDAプレートから収集された。胞子を噴霧した後、感染させるため、小麦植物は、3日間、100%の湿度のミストチャンバに移された。処理は、次の通りであった。
拮抗作用プレートアッセイにおいてフザリウム・グラミネアラムに対して抑制活性を保有することが分かった微生物株は、小麦における胴枯病の発生率を減少させるその能力についてさらに検証された。影響を受けやすい小麦品種の種子(Hank;WestBred LLC,Bozeman,MT)を、直径20cmのプラスチックの鉢にそれぞれ低温殺菌された土壌培地を含む1リットルの鉢に蒔いた。微生物細胞懸濁液は次のように調製された。2YTまたは類似する成長培地のブロス培養物は、単離菌グリセロールストックまたは画線プレートから播種された。典型的には、培養は、培養物を後期指数増殖期に到達させる成長チャンバ、温室、または畑で使用する48〜72時間前に開始された。より長い倍加時間を有する単離菌は、さらに前もって開始された。培養物は、200rpmで、回転振とう器上で、30℃でインキュベートされた。成長後、細胞は、4℃で15分間、10,000×gでペレット化され、10mMのMgSO4緩衝液(pH7.0)に再懸濁された。細胞密度は、各単離菌に関してCFU/mL(1ミリリットル当たりの細胞性能単位)で基準化された。典型的に、各単離菌について約109CFU/mLの懸濁液が調製され、氷上の播種部位に移された。播種は、これらの細胞懸濁液1/20を灌漑用水中に5×107CFU/mLの最終密度に希釈することによって実施された。1−Lの鉢試験に関して、20mLのこの希釈細胞懸濁液を、各同型鉢の表面上に均一に分配した。マイクロ試験鉢に関して、細胞懸濁液は希釈されず、1mLの各109CFU/mL懸濁液を、埋めた種子の上の土壌潅注として各同型鉢の表面上に直接ピペットで入れた。種子および植物は、14時間の明の光周期で、室温の温室で維持された。
マイコスファエレラ種:純粋な培養物として単離した真菌を保管するために、いくつかの方法が使用され、そのうちの一つは濾紙法であった。真菌をPDA上でも成長させ、次に15%のグリセロールを含有するバイアル中に設置された小さい矩形に切り分け、−70℃で保管した。真菌はまた、グリセロールではなく蒸留水を用いて、類似する方法で4℃でも保管された。しかしながら、保管の好ましい方法のうちの一つは、−80℃での侵襲された減菌の大麦種子上であった。
胞子生成:典型的な胞子生成手順では、1リットルの2×YT成長培地(16g/Lトリプトン、10g/L酵母抽出物、5g/L NaCl)は、5mLの初期培養物またはペトリ皿剥離物で播種され、225rpmに設定された回転振とう器中で、30℃で一晩インキュベートされた。遠心分離によって細菌細胞をペレット化し、PBS緩衝液(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2 HPO4、0.24gのKH2PO4、pH7.4)で一回洗浄した。細胞をCDSM培地(Hageman et al.,J.Bacteriol,438−441,1984)に懸濁し、回転振とう器中で、30℃でさらに4日間成長させた。細菌培養物中の胞子形成は、全培養物が可視的に浮動性胞子で覆われるまで、位相差顕微鏡を使用して毎日観察された。インキュベーション時間は、典型的に、種により4日未満から6日を超えた。位相差顕微鏡下で、内生胞子が、明るい白色の偏球として細胞内で検出された。10,000×gで15分間遠心分離することによって、細菌胞子をペレット化し、減菌dH20で二回洗浄し、必要に応じて50mLまで濃縮し、直ぐに使用するか、後に使用するために冷蔵するかのいずれかであり得る。胞子濃度はOD600で測定された。この手順は、典型的に、少なくとも2000ODの細菌胞子を生成した。
実施例8に記載される手順により、FHBの影響を受けやすい小麦品種(RB07)の種子を、微生物SGI−014−C06、SGI−015−F03、およびSGI−015−H06のそれぞれでコーティングした。その後、コーティングされた種子を、低温殺菌された土壌培地[(Metromix−Mix 200、Scotts−Sierra Horticultural Products,Marysville,OH、および3グラムの肥料14−14−14(N−P−K)]を含む1リットルの鉢に蒔いた。鉢当たり7〜8の植物を鉢に蒔き、その後、3葉期で鉢当たり五つの植物に間引きした。乱塊法で1処理あたり鉢五つに鉢を配分した。次に、コーティングされた種子を、1日当たり16時間の照明の蛍光照明下、温室条件で発芽させた。小麦花成(開花)の開始時に、小麦の胴は、100,000胞子/mLの濃度でフザリウム・グラミネアラムNRRL 5883巨大分生子胞子を噴霧することによって曝露された。胞子を噴霧した後、感染させるため、小麦植物は、3日間、100%の湿度の露チャンバ(dew chamber)に移された。処理は次の通りであった。
微生物SGI−014−C06、SGI−015−F03、およびSGI−015−H06のそれぞれは、大規模な温室試験でさらに試験された。試験は、Synthetic Genomics,Inc.に位置する「植物成長格納室」(PGCR)で行われ、次の対照処理を含んだ:感染対照、非感染対照、ならびに四つの市販の殺真菌剤基準。基準化学殺真菌剤は、2ml/Lの濃度のBanner MAXX(登録商標)(Syngenta)、および3ml/Lの濃度のProsaro(登録商標)(Bayer CropScience)であり、それぞれ、製造者の推奨に従い、葉面噴霧として適用された。基準生物学的殺真菌剤は、Actinovate(登録商標)(Natural Industries)およびRhizo Vital(登録商標)(ABiTEP GmbH)であり、それぞれ、製造者によって推奨される取扱説明書により、土壌潅注として適用された。
病原体フザリウム・グラミネアラムに対して抑制活性を有する微生物拮抗薬が発見され、実施例4〜9に記載される生体外拮抗作用アッセイおよび温室研究における胴枯病は、全米の異なる地理的位置で、一連の野外実験においてさらに評価される。いくつかの実験は、コムギ腐敗病の微生物学的制御に使用される、自然病害感染が生じる農業地帯で行われる。試験に使用される小麦の種類は、フザリウム・グラミネアラムに影響を受けやすい種類である。一般的に、各処理をされた小麦植物は、長さが約3メートルの12列のプロットに蒔かれた。列間の間隔は約20cmである。各実験の処理されたプロットは、乱塊法で配分された。胴枯病の重症度および発生率の減少に本発明の微生物拮抗薬を含む様々な水和剤組成物の有効性も評価される。これらの実験では、微生物拮抗薬は、個別に、または組み合せのいずれかで評価される。
植物生産法は、これらの種子処理に使用され得る。
本発明の内部寄生菌微生物は、特に米国特許出願第20030195117A1号、米国特許出願第20010032343A1、および米国特許第7,084,331号に記載されるものを含む、当該技術分野において既知のものに類似する手順を使用して、改善された農業特性を有する植物−内部寄生菌の組み合わせを作り出すために、そのような内部寄生菌微生物を欠く様々な遺伝子型および地理学的起源の穀類を含む作物植物に導入される。よって、所与の合成植物−内部寄生菌の組み合わせは、農業利益をもたらす相利共生の組み合わせを形成し、維持するその能力に基づく育種/品種開発プログラムにおいて作り出され、選択され得る。組み合わせの農業特性の評定は、そのような育種プログラムにおいても利用することができる。これらの特性は、特に干ばつに対する耐性、バイオマス蓄積、昆虫侵襲に対する耐性、家畜に対する旨味(例えば草食動物)、再生産の容易性、および種子収率を含むが、これらに限定されない。そのような組み合わせは、麦角アルカロイドレベル、ロリン(loline)レベル、ペラミンレベル、またはロリトレムレベルを含む、害虫および雑草に毒性である微生物代謝物の蓄積レベルの点で異なり、一方で、他の特徴の中でも昆虫摂食または侵襲に対する耐性、非生物学的ストレスに対する耐性、家畜に対する旨味、バイオマス蓄積、再生産の容易性、および種子収率を含む、作物植物の所望の農業特性を表し得る。
Claims (23)
- 胴枯病(head blight disease)に対する抑制活性を有する、ミクロバクテリウム(Microbacterium)種株、バチルス(Bacillus)種株、マイコスファエレラ(Mycosphaerella)種株、およびバリオボラックス(Variovorax)種株からなる群から選択される、単離された微生物株。
- 前記微生物株が、マイコスファエレラ種株のSGI−010−H11(NRRL 50471として寄託)、ミクロバクテリウム種株SGI−014−C06(NRRL B−50470として寄託)、ミクロバクテリウム種株SGI−005−G08(NRRL_−_____として寄託)、バリオボラックス種株SGI−014−G01(NRRL B−50469として寄託)、バチルス種株SGI−015−F03(NRRL B−50760として寄託)、バチルス種株SGI−015−H06(NRRL B−50761として寄託)、およびそれらのうちのいずれかの殺虫的に活性な変異体からなる群から選択される、請求項1に記載の単離された微生物株。
- 前記微生物株が、配列表中のヌクレオチド配列のうちのいずれか一つに対して少なくとも85%の配列同一性を示すDNA配列を含む、請求項2に記載の単離された微生物株。
- 請求項1に記載の微生物株の生物学的に純粋な培養物。
- 請求項1に記載の微生物株の濃縮された培養物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物と、ダニ駆除剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、駆除剤、および肥料からなる群から選択される農業的に有効な量の化合物または組成物と、を含む、組成物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物と、担体と、を含む、組成物。
- 前記担体が、農業的に許容される担体である、請求項7に記載の組成物。
- 前記担体が、植物種子である、請求項7に記載の組成物。
- 前記組成物が、エマルジョン、コロイド、細粉、顆粒、ペレット、粉末、スプレー、エマルジョン、および溶液からなる群から選択される製剤として調製される、請求項7に記載の組成物。
- 前記組成物が、種子コーティング製剤である、請求項7に記載の組成物。
- 請求項7に記載の組成物を含むコーティングを有する種子。
- 植物病原体の発現を予防、阻害、または処理するための方法であって、成長培地または土壌での宿主植物の成長前または成長と同時に、宿主植物の前記成長培地または土壌で請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物を成長させることを含む、方法。
- 前記植物病原体が、胴枯病を引き起こす、請求項13に記載の方法。
- 前記植物病原体が、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)である、請求項14に記載の方法。
- 植物の胴枯病の発現を予防、阻害、または処理するための方法であって、前記植物または前記植物の周囲に、有効な量の請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物を適用することを含む、方法。
- 前記微生物株またはその培養物が、土壌、種子、根、花、葉、前記植物の一部、または前記植物全体に適用される、請求項16に記載の方法。
- 前記植物が、フザリウム・グラミネアラムの影響を受けやすい、請求項16に記載の方法。
- 前記植物が、小麦植物、トウモロコシ植物、大麦植物、またはオート麦植物である、請求項16に記載の方法。
- 前記微生物株またはその培養物が、前記植物上に内部寄生菌として定着する、請求項16に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物に人工的に感染した植物である、天然に存在しない植物。
- 請求項21に記載の天然に存在しない植物の種子、生殖組織、栄養組織、植物部分、または子孫。
- 農業組成物を調製するための方法であって、請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物を基層中または基層上に播種することと、1ミリリットルまたは1グラム当たり少なくとも102〜103個の細胞または胞子を得るまで、前記微生物株またはその培養物を1〜37℃の温度で成長させることと、を含む、方法。
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