RU2777606C2 - Композиции и способы для борьбы с фузариозом - Google Patents

Композиции и способы для борьбы с фузариозом Download PDF

Info

Publication number
RU2777606C2
RU2777606C2 RU2020136616A RU2020136616A RU2777606C2 RU 2777606 C2 RU2777606 C2 RU 2777606C2 RU 2020136616 A RU2020136616 A RU 2020136616A RU 2020136616 A RU2020136616 A RU 2020136616A RU 2777606 C2 RU2777606 C2 RU 2777606C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
leu
ala
fusarium
plant
gly
Prior art date
Application number
RU2020136616A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2020136616A (ru
Inventor
Кристофер Дж. ГРЭНДЛИК
Уэйн А. ГРИН
Янне С. КЕРОВУО
Райан Т. МАККАНН
Original Assignee
Монсанто Текнолоджи Ллс
Filing date
Publication date
Application filed by Монсанто Текнолоджи Ллс filed Critical Монсанто Текнолоджи Ллс
Publication of RU2020136616A publication Critical patent/RU2020136616A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2777606C2 publication Critical patent/RU2777606C2/ru

Links

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены выделенный штамм Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-50760, обладающий подавляющей активностью в отношении фузариоза, композиции и способы с использованием указанного штамма. Способ предотвращения развития фузариоза включает выращивание микробного штамма или его культуры в среде для роста или почве растения или включает нанесение на растение или на окружающую его среду эффективного количества микробного штамма или его культуры. Также предложены композиции для подавления фузариоза, содержащие микробный штамм или его культуру, семя, резистентное к инфекции грибка Fusarium. Изобретения эффективны в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 табл., 11 пр.

Description

[0001] Содержание прилагаемого Перечня последовательностей включено здесь во всей его полноте посредством ссылки. Прилагаемый файл под наименованием «SGI1520-lWO_ST25.txt» был создан 24 июля 2012 г. и имеет размер 55 Kб. Этот файл открыт для доступа с помощью Microsoft Word на компьютере с операционной системой Window OS.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002] Настоящее изобретение относится к биологическим методам борьбы с фитопатогенными болезнями. В частности, изобретение относится к композициям и способам, которые могут использоваться в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Фузариоз, известный также как парша, плесневидная розовая гниль и фузариоз, является болезнью, опустошающей сельскохозяйственные угодья пшеницы, ячменя и многих других злаковых культур во всем мире и, особенно, в США, Европе и Китае. Эта болезнь может достигать эпидемических масштабов и наносить обширные уроны зерновым культурам, особенно пшенице и ячменю, во влажных и полувлажных ареалах выращивания хлебных злаков, включая Индию, Россию, Францию, Германию и Великобританию. В частности, фузариоз или фузариоз пшеницы является одной из наиболее убыточных болезней пшеницы в Соединенных Штатах. В общенациональных масштабах эта болезнь, развившаяся на Среднем Западе и на Высоких Равнинах, принесла производству пшеницы потери, достигающие миллионов долларов, и стала, таким образом, главным препятствием для успешного функционирования этой индустрии в последние годы. Фузариоз, помимо пшеницы, поражает также ячмень, овес, кукурузу и множество других зерновых культур, и репродуцируется на них.
[0004] Эта болезнь может вызываться множеством различных фитопатогенов и, в первую очередь, несколькими видами грибов рода Fusarium. В число вероятных возбудителей фузариоза пшеницы входит множество различных видов Fusarium, например, F. culmorum, F. graminearum (телеоморф, Gibberella zeae), F. avenaceum (телеоморф, G. avenacea), F. poae, а также патогены, не относящиеся к роду Fusarium, такие как Microdochium nivale (телеоморф, Monographella nivalis), и Microdochium majus. В Соединенных Штатах, Европе и других наиболее важных агрономических ареалах мира доминирующим возбудителем фузариоза выступает Fusarium graminearum (телеоморф, Gibberella zeae в буквальном смысле).
[0005] Эти патогены, как правило, выживают на растительных остатках. На колоски злаков они попадают и поражают их во время цветения, останавливая или частично задерживая развитие зерна в колосе злака. В результате, попавший на растение патоген может убить часть колоса либо весь колос. Некоторые инфицированные семена имеют настолько низкую энергию прорастания, что зачастую не могут прорасти. Проросшие инфицированные семена часто рано погибают в фазе прорастания вследствие пелликуляриоза или корневой гнили, вызывающих плохой хлебостой выросшего злака. Здоровые сеянцы могут инфицироваться также в фазе появления всходов. Помимо плохого, неэкономичного хлебостоя, потери урожая вследствие поражения патогеном могут быть довольно высокими, если условия благоприятствуют развитию болезни.
[0006] Грибные патогены рода Fusarium распространяются по ареалам культивирования злаков во всем мире и наносят особенно большой ущерб в местах выпадения больших осадков в период между цветением и наливом зерна. Если возбудителем заболевания является Fusarium graminearum, то данная болезнь требует первоочередного вмешательства, не только потому что она снижает коммерческие показатели пораженного зерна, вдобавок к прямым потерям урожая, но также потому, что заражение грибом Fusarium может приводить к накоплению микотоксинов, трихотеценов, в зернах, создавая, таким образом, угрозу здоровью людей и скота. Трихотецены представляют собой главное микотоксиновое загрязнение зерновых культур во всем мире, способное у нежвачных животных вызывать отказ от пищи, рвоту, диарею и потерю веса и создавать угрозу здоровью для других животных и людей в случаях высоких уровней воздействия этих токсинов. В Соединенных Штатах эта угроза возросла еще больше вследствие недавно произошедшего смещения в штаммах F. graminearum в сторону повышения выработки и силы токсинов. Микотоксинами, обнаруживаемыми чаще всего, являются дезоксиниваленол (DON, известный также как вомитоксин) и зеараленон (ZEA). Дезоксиниваленол является особенно опасным токсином, вызывающим желудочно-кишечные расстройства, которые сопровождаются кровотечениями и другими тяжелыми состояниями у людей и животных, принявших в пищу инфицированные зерна, и в некоторых случаях могут привести к смерти. Поскольку дезоксиниваленол в общем случае является стойким к изменениям pH и к высоким температурам, дезинтоксикация может проходить очень тяжело. Таким образом, зерна, загрязненные выше определенного уровня, не могут использоваться в пивоварении, переработке, корме для скота и, следовательно, должны удаляться в отходы.
[0007] На сегодняшний день разработано множество различных стратегий по борьбе с фузариозом у сельскохозяйственных культур. Наиболее перспективными среди них являются химические методы, разработка стойких сортов культур, а также традиционные методы севооборота и обработки полей. Среди этих направлений определенную эффективность в снижении заражения фузариозом можно получить от применения химических пестицидов, однако остатки фунгицидов, использованных на поздних стадиях роста культур, как правило, в периоды цветения, всего за несколько недель до сбора урожая, снижают привлекательность этих методов. С другой стороны, альтернативный подход в борьбе с этой болезнью представляют методы традиционной селекции и генной инженерии, благодаря которым происходит заметный прогресс в разработках стойких сортов агрокультур. Генная инженерия позволяет изменять продуцирование фитогормона и осуществлять манипуляции в его сигнальном пути. Достигнутый в последние годы прогресс в области традиционной селекции позволил значительно продвинуться в понимании генетических основ стойкости к фузариозу и получить сведения о множестве генов и локусах количественных признаков (QTL: quantitative trait loci), придающих этой стойкости. Однако прогресс в повышении стойкости агрокультур к фузариозу был медленным, что объясняется, в первую очередь, трудностью изучения данной болезни. Фактически о механизмах, определяющих стойкость или восприимчивость растений к фузариозу, в настоящее время известно сравнительно мало. Кроме того, генетическое разнообразие грибов вида Fusarium, которые являются преобладающими возбудителями болезни, часто создает проблемы в определении того, насколько длительной должна быть эффективность химических фунгицидов и насколько стойкими должны быть защищаемые агрокультуры. В результате, в настоящее время практически все сорта пшеницы в агропромышленном производстве остаются уязвимыми для инфицирования.
[0008] Кроме того, несмотря на определенный успех в борьбе с фузариозом, который могут давать традиционные методы пахотной обработки с закапыванием пожнивных остатков, инфицированных возбудителем, например, F. graminearum, обычная вспашка почвы после жнив является несовместимой с устоявшейся практикой охраны почв, то есть с условием минимальной пахотной обработки. Принимая во внимание вероятность разброса инокулята на большие расстояния и то, что различные культуры могут становиться альтернативными хозяевами патогенов, метод севооборота нередко оказывается неприемлемым. Помимо загрязнения окружающей среды пестицидами, их использование может порождать проблемы, связанные с пестицидостойкостью. Кроме того, с их использованием могут быть связаны также зарегистрированные случаи роста содержания DON в зернах. Помимо этого, расходы и растущие проблемы как в государственном, так и в частном секторах, связанные с загрязнением пестицидами окружающей среды и требованиями к безопасности пищевых продуктов, делают данный способ борьбы с такими болезнями менее привлекательным и заставляют в уходе за агрокультурами применять пестициды как можно меньше.
[0009] Подводя итог, можно сказать, что, несмотря на существенное продвижение в области разработок способов борьбы с фузариозом, уменьшение влияния этой губительной болезни на производство и качество зерна пока остается нерешенной проблемой. Следовательно, для повышения продуктивности производства и качества многих зерновых культур важно вести поиск и разработку новых способов борьбы с фузариозом. Эти проблемы требуют срочного решения не только в Соединенных Штатах, но и на всем земном шаре, включая Азию и Европу.
[0010] Борьба с фузариозом с помощью биологических агентов стала привлекать к себе внимание, начиная с середины 1990-х годов. Биологические агенты для такой борьбы (BCA: Biological control agents), несмотря на то что количество их в настоящее время весьма ограничено, могут, при своей невраждебности к окружающей среде, быть очень эффективными в снижении уровня заболеваемости, инициируемой патогенами рода Fusarium. Общественное признание, совместимость с другими средствами борьбы с болезнями агрокультур, долговечность и стойкость - все это, наряду с другими положительными факторами, говорит о необходимости разработок стратегий биологической борьбы с фузариозом. Средства такой биологической борьбы могут сыграть важную роль в органической зерновой индустрии. В обычном производстве зерна такие средства могут продлить защиту колосков на время после фазы цветения, когда химические фунгициды применяться больше не могут. На сегодняшний день, в области биологической борьбы уже достигнут значительный прогресс. Так, например, некоторые штаммы споро-продуцирующих бактерий (например, видов Bacillus и Pseudomonas) и дрожжей (например, вида Cryptococcus) демонстрируют качества, требующиеся для борьбы с фузариозом и для снижения микотоксинового загрязнения. Однако, несмотря на этот прогресс, остается неудовлетворенной потребность в улучшенных микроорганизмах для их использования в борьбе с фузариозом. Хотя сами по себе BCA-средства уже признаны более подходящим инструментом для борьбы с фитопатогенами, а BCA-продукты находят на рынке значительно более широкий сбыт, чем когда-либо ранее, все же на сегодняшний день было предпринято совсем мало попыток разработать стратегии и антагонистический микроорганизм для биологической борьбы с фузариозом. Кроме того, жизненный цикл рода Fusarium и других возбудителей фузариоза указывает на то, что эти патогены потенциально могут быть подходящими для использования их в методах биоборьбы с помощью антагонистических микроорганизмов на различных фазах роста и развития. Таким образом, существует потребность в поиске новых средств биологической борьбы, желательно с различными способами активности, а также способов биоборьбы, которые бы позволяли эффективно предотвращать или подавлять развитие фузариоза.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Изобретение относится к композициям, содержащим микробиологические штаммы и культуры. Некоторые штаммы, культуры и их композиции могут использоваться для борьбы с фузариозом, например, различных сельскохозяйственных культур, включая пшеницу и другие зерновые. Изобретение также относится к композициям для биологической борьбы и способам использования этих композиций для предотвращения возникновения, подавления развития или лечения вызванной патогенами болезни и для сохранения урожая. Изобретение также относится к способам использования таких композиций в качестве средств биологической борьбы в комбинации с другими эффективными в сельском хозяйстве соединениями или композициями для борьбы с вредными фитопатогенами.
[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным микробным штаммам, обладающим супрессорной активностью по отношению к фузариозу. Микробные штаммы в соответствии с этим аспектом выбираются из группы, состоящей из видов Microbacterium, Bacillus, Mycosphaerella и Variovorax. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения микробные штаммы выбираются из группы, состоящей из вида Mycosphaerella штамм SGI-010-HI 1 (депозит NRRL 50471), вида Microbacterium штамм SGI-014-C06 (депозит NRRL B-50470), вида Variovorax штамм SGI-014-G01 (депозит NRRL B-50469), вида Bacillus штамм SGI-Q15-F03 (депозит NRRL B-50760), вида Bacillus штамм SGI-015-H06 (депозит NRRL B-50761) и их вариантов, обладающих пестицидной активностью. Микробный штамм в соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления может содержать последовательность ДНК, демонстрирующую по меньшей мере 85% идентичность любой из нуклеотидных последовательностей, приведенных в прилагаемом Перечне последовательностей. Изобретение также относится к биологически чистым культурам и обогащенным культурам описанных здесь микробных штаммов.
[0013] В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композициям, содержащим микробный штамм по изобретению или его культуру и эффективное для сельскохозяйственного производства количество соединения или композиции, выбранных из группы, состоящей из акарицида, бактерицида, фунгицида, инсектицида, микробицида, нематицида, пестицида и удобрения. Указанные композиции в некоторых вариантах осуществления этого аспекта могут быть получены в форме препарата, выбранного из группы, состоящей из эмульсии, коллоида, пылевидного препарата, частицы, гранулы, порошка, спрея и раствора; в некоторых других вариантах осуществления указанные композиции могут содержать носитель. В одном из предпочтительных вариантов носитель является приемлемым для сельскохозяйственного производства. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления изобретения носителем является семя растения. В других предпочтительных вариантах композицией является препарат покрытия семени. Кроме того, изобретение относится к семенам, покрытым композицией в соответствии с настоящим изобретением.
[0014] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фитопатогена. Эти способы включают выращивание микробного штамма по изобретению или его культуры в питательной среде или почве растения-хозяина перед или одновременно с выращиванием растения-хозяина в питательной среде или почве, где в некоторых предпочтительных вариантах осуществления данного аспекта изобретения, фитопатоген вызывает фузариоз. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления фитопатогеном является Fusarium graminearum.
[0015] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения, ингибирования или обработки против развития фузариоза растения. Эти способы включают поставку к растению или к среде, окружающей растение, эффективного количества микробного штамма по изобретению или его культуры. В одном из вариантов осуществления изобретения такой фузариоз вызывается грибом Fusarium graminearum. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта микробный штамм или его культуру поставляют к почве, семени, корням, цветку, листу, части растения или всему растению, где в предпочтительном варианте растение является восприимчивым к Fusarium graminearum. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления изобретения растением является пшеница, кукуруза, ячмень или овес, в другом предпочтительном варианте осуществления микробный штамм по изобретению или его культуру вводят в растение в качестве эндофита.
[0016] В следующем аспекте изобретение относится к растениям неприродного происхождения. Растения неприродного происхождения искусственно инфицируются микробным штаммом по изобретению или его культурой. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления этого аспекта изобретение относится к семени, репродуктивной ткани, вегетативной ткани, частям растения и потомству растения неприродного происхождения.
[0017] В другом аспекте изобретение относится к способу получения сельскохозяйственной композиции. Этот способ включает инокуляцию микробного штамма в соответствии с настоящим изобретением или его культуры в субстрат или на субстрат и выращивание его при температуре 1-37°C до получения клеток или спор в количестве по меньшей мере 102-103 на миллилитр или на грамм.
[0018] Этим и другим целям и признакам данного изобретения дано более полное разъяснение в нижеследующем подробном описании и формуле изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
[0019] Если не указано иного, то все используемые в настоящем описании термины, относящиеся к данной области техники, условные обозначения и другие научные термины несут общепринятые значения, известные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Некоторым терминам с общеизвестными значениями здесь даны определения в целях избегания разночтения и/или для облегчения ссылок, и включение здесь таких определений не должно рассматриваться как представляющее существенное отличие от значений, общепринятых среди специалистов. Многие способы и процедуры, которые здесь описаны или на которые делаются ссылки, должны быть специалистам хорошо известными и широко используемыми ими в соответствии с обычными методологиями.
[0020] Если из контекста данного описания ясно не вытекает иного, то единственное число существительных предполагает равным образом их значения во множественном числе. Например, термин «клетка» может означать как одну, так и множество клеток, включая их смеси.
[0021] Выражения «антагонистический микроорганизм» и «микробный антагонист» - оба означают микроорганизм, штамм которого показывает степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования от необработанного контроля.
[0022] Антибиотик: термин «антибиотик» в данном описании означает субстанцию, способную убить или ингибировать рост микроорганизма. Антибиотики могут продуцироваться по меньшей мере одним из таких источников: 1) микроорганизмом, 2) процессом синтеза и 3) процессом полусинтеза. Антибиотиком может быть микроорганизм, выделяющий летучее органическое соединение. Кроме того, антибиотиком может быть летучее органическое соединение, выделяемое микроорганизмом.
[0023] Бактерицидный: термин «бактерицидный» в данном описании означает способность композиции или субстанции повысить смертность бактерий или ингибировать скорость их роста. Ингибирование скорости роста бактерий в большинстве случаев может оцениваться по уменьшению количества жизнеспособных бактериальных клеток с течением времени.
[0024] Биологическая борьба: термин «биологическая борьба» и его сокращенная форма «биоборьба» в данном описании означают борьбу с патогенном, либо с насекомым, либо с любым другим нежелательным организмом с помощью по меньшей мере одного другого организма, не являющегося человеком. В качестве примера известного механизма биологической борьбы можно привести использование микроорганизмов, которые борются с корневой гнилью путем вытеснения грибов из конкуренции за пространство на поверхности корня, или микроорганизмов, которые либо ингибируют рост патогена, либо убивают его. «Растением-хозяином» в контексте биологической борьбы является растение, восприимчивое к болезни, вызываемой данным патогеном. «Растением-хозяином» в контексте отделения принадлежащего к виду грибов организма от его естественной среды является такое растение, которое поддерживает рост гриба, то есть, например, растение вида, для которого гриб является эндофитом.
[0025] Термин «зерновой» в данном описании означает любой зерновой вид, который может быть восприимчивым к фузариозу. К числу таких восприимчивых зерновых культур относятся пшеница, ячмень, овес и тритикале; при этом пшеница и ячмень являются двумя культурами, для которых данная болезнь представляет особенно значительную экономическую проблему.
[0026] Термин «эффективное количество» означает количество, достаточное для получения полезных или целевых результатов. В отношении борьбы с болезнью, к лечебной обработке, ингибированию болезни или защиты от нее, эффективным является количество, достаточное для подавления, стабилизации, поворота хода болезни вспять, замедления или задержания развития инфекции-мишени или болезненного состояния. Таким образом, выражение «эффективное количество» в данном описании означает такое количество антагонистической обработки, которое является необходимым для снижения уровня развития патогена и/или уровня вызванной патогеном болезни по сравнению с уровнем, который наблюдается у необработанного контроля. Как правило, эффективное количество данной антагонистической обработки дает снижение по меньшей мере на: 20%; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; или, как правило, от 90 до 95% по сравнению с уровнем болезни и/или уровнем развития патогена, наблюдаемым у необработанного контроля в соответствующих условиях лечебной обработки. Эффективное количество может поставляться за один или больше приемов. Фактическая скорость поставки жидкого препарата обычно лежит в пределах приблизительно от минимум 1×103 до 1×1010 жизнеспособных клеток/мл и предпочтительно приблизительно от 1×106 до 5×109 жизнеспособных клеток/мл. В большинстве состояний антагонистические микробные штаммы по изобретению, описанные в Примерах ниже, будут оптимально эффективными при скорости поставки в интервале приблизительно от 1×106 до 1×109 жизнеспособных клеток/мл, если при поставке обеспечивается практически однородный контакт по меньшей мере приблизительно 50% тканей растения. Если антагонисты поставляются в форме твердого препарата, то скорость поставки должна регулироваться таким образом, чтобы обеспечивать количество жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности ткани растения, сравнимое с получаемым при вышеупомянутых величинах скорости обработки жидкостью. Как правило, средства биологической борьбы согласно изобретению являются биологически эффективными, если они поставляются в концентрации выше 106 КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм), предпочтительно, если выше 107 КОЕ/г, еще предпочтительнее, если выше 108 КОЕ/г, и наиболее предпочтительно, если в концентрации 109 КОЕ/г.
[0027] Далее, выражение «эффективный микробный антагонист», используемое по отношению к микроорганизму, означает, что данный микробный штамм демонстрирует степень ингибирования фузариоза, которая на статистически значимом уровне превышает степень ингибирования, наблюдаемую у необработанного контроля. Как правило, эффективный микробный антагонист обладает способностью давать снижение по меньшей мере на: 20% и больше; как правило, от 30 до 40% и больше; как правило, от 50 до 60% и больше; как правило, от 70 до 80% и больше; как правило, от 90 до 95% относительно уровня болезни и/или уровня развития патогена, имеющего место в необработанном контроле при соответствующих условиях лечебной обработки.
[0028] Композиция: термин «композиция» означает комбинацию активного агента по меньшей мере с другим соединением, носителем или композицией, инертным(-й) (например, детектируемым агентом или меткой, жидким носителем и т.п.) или активным, например, пестицидом.
[0029] Выделенный микробный штамм, выделенная культура, биологически чистая культура и обогащенная культура: используемый в данном описании термин «выделенный» в применении к микроорганизму (например, бактерии или микрогрибу) означает микроорганизм, который был отделен и/или очищен от среды, где он природно возникает. Аналогично этому, термин «выделенный штамм» микроба означает штамм, который был отделен и/или очищен от своей естественной среды. Таким образом, термин «выделенный микроорганизм» не включает в свое значение микроорганизм, пребывающий в среде, в которой он нормально возникает. Кроме того, термин «выделенный» не обязательно отражает степень, до которой данный микроб был очищен. Термин «по существу чистая культура» микробного штамма означает культуру, которая по существу не содержит других микробов, кроме целевого микробного штамма или штаммов. Другими словами, «по существу чистая культура» микробного штамма по существу не содержит загрязнений, которые могут включать микробные загрязнения, а также нежелательные химические загрязнения. Кроме того, используемый здесь термин «биологически чистый» штамм означает штамм, выделенный из материалов, с которыми он нормально ассоциируется в природных условиях. Следует заметить, что штамм, ассоциированный с другими штаммами или соединениями, или материалами, которые в природных условиях нормально не встречаются, также имеет определение «биологически чистый». Вполне понятно, что монокультура того или иного штамма является «биологически чистой». Используемый здесь термин «обогащенная культура» выделенного микробного штамма означает микробную культуру, содержащую более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% выделенного штамма.
[0030] Используемый здесь термин «эндофит» означает эндосимбионт, живущий внутри растения на протяжении по меньшей мере части своей жизни, не вызывая очевидной болезни. Трансмиссия эндофитов может происходить либо по вертикали (непосредственно от родителя к потомству) либо по горизонтали (от индивида к неродственному индивиду). Переданные по вертикали грибные эндофиты являются, как правило, бесполыми и переносятся от материнского растения к потомству путем проникновения в семена хозяина через грибные гифы. Бактериальные эндофиты могут переноситься по вертикали также от семян к саженцам (Ferreira et al., 2008). В противоположность этому, горизонтально передаваемые эндофиты, как правило, имеют пол и переносятся спорами ветром и/или насекомыми-переносчиками. Эндофиты возделываемых зерновых привлекли к себе большое внимание в связи с их способностью бороться как с болезнью, так и с заражением насекомыми, а также активировать рост растений.
[0031] Функционально сравнимый протеин: используемый здесь термин «функционально сравнимый протеин» относится к протеинам, имеющим по меньшей мере одну общую характеристику. Такими характеристиками могут быть подобие друг другу последовательностей, биохимическая активность, подобие друг другу схем транскрипции и фенотипичная активность. Как правило, функционально сравнимые протеины имеют некоторое подобие между собой последовательностей или являются подобными по меньшей мере по одному биохимическому признаку. В рамках этого определения функционально сравнимыми считаются гомологи, ортологи, паралоги и аналоги. Кроме того, функционально сравнимые протеины, в общем случае, имеют схожую по меньшей мере одну биохимическую и/или фенотипичную активность. Функционально сравнимые протеины придают одной и той же характеристике подобие, но не обязательно в одинаковой степени. Как правило, функционально сравнимые протеины дают одни и те же характеристики, которые в количественном измерении у одного из сравниваемых протеинов, составляют по меньшей мере 20% от таковых у другого, чаще от 30 до 40%; еще чаще от 50 до 60%, еще чаще от 70 до 80%, еще чаще от 90 до 95% и, как правило, от 98 до 100% от таковых у другого.
[0032] Фунгицидный: используемый здесь термин «фунгицидный» означает способность композиции или субстанции снизить скорость роста грибов или повысить смертность грибов.
[0033] Гриб Fusarium: в контексте данного изобретения термин «гриб Fusarium» включает в себя как половую (телеоморфную) фазу этого организма, так и бесполую (анаморфную) его фазу, называемые также фазами, соответственно, совершенных и несовершенных грибов. Например, анаморфной фазой гриба Fusarium graminearum является Gibberella zeae, то есть возбудитель фузариоза. Эта болезнь, как правило, возникает, когда цветок или семенная шапка инокулируется конидиями, выпускаемыми несовершенной формой, или аскоспорами, выпускаемыми совершенной формой этого гриба.
[0034] Мутант: используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к микроорганизму означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Например, в случае Microbacterium «родительским штаммом» называется оригинальный штамм Microbacterium до мутагенеза. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и составов, известных специалистам в данной отрасли. Например, родительский штамм может быть обработан химикатом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанид, этилметансульфон, или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.
[0035] Нематоцидный: термин «нематоцидный» в данном описании означает способность субстанции или композиции повысить смертность или ингибировать скорость роста нематодов.
[0036] Патоген: термин «патоген» в данном описании означает организм, такой как водоросль, паукообразное, бактерия, гриб, насекомое, нематод, растение-паразит, дрожжи, простейшее животное или вирус, способный продуцировать болезнь у растения или животного. Термин «фитопатоген» в данном описании означает патогенный организм, инфицирующий растение.
[0037] Процент идентичности: «процент идентичности последовательности», в соответствии с данным описанием, определяют путем локального сопоставления двух оптимально выровненных последовательностей на участке выравнивания, определяемом длиной локального выравнивания двух последовательностей. При оптимальном выравнивании двух последовательностей данная аминокислотная последовательность на участке выравнивания может содержать добавки или делеции (например, пробелы или оверхэнги) в сравнении с эталонной последовательностью (которая не содержит добавок или делеций). Локальное выравнивание двух последовательностей проводится только по тем сегментам каждой последовательности, которые предположительно являются достаточно подобными по определенному критерию, выбираемому в соответствии с алгоритмом, используемым для выравнивания (например, программой BLAST). Процент идентичности вычисляют путем определения количества совпадений позиций, в которых в обеих последовательностях размещаются идентичные основания нуклеиновых кислот или остатки аминокислот, деления полученной величины совпадений на общее количество позиций на данном участке выравнивания и умножения полученного результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей может осуществляться с помощью алгоритма локальной гомологии Смита-Ватермана (Smith and Waterman, Add. APL. Math. 2:482, 1981) или алгоритма глобальной гомологии Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), методом исследования подобия Пирсона-Липмана (Pearson and Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), эвристической имплементации этих алгоритмов (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ) или путем визуальных исследований. Если две последовательности были выбраны для выравнивания, то для проведения их оптимального выравнивания предпочтительно использовать алгоритмы GAP и BESTFIT. Как правило, по умолчанию задают величины 5.00 для веса пробелов и 0.30 для длины веса пробелов. Термин «существенная идентичность последовательностей» между полинуклеотидными или полипептидными последовательностями относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичность в сравнении с эталонной идентичностью, определенную с помощью компьютерной программы.
[0038] Анализ нуклеинокислотных и аминокислотных последовательностей может проводиться путем сопоставления их с соответствующими нуклеинокислотными или аминокислотными последовательностями, хранящимися в публичных или частных базах данных. Такие исследования могут проводиться с помощью программы NCBI BLAST v 2.18 Национального центра информации по биотехнологиями (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool). Программа NCBI BLAST доступна в сети Интернет по адресу blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (National Center for Biotechnology Information). В программе NCBI BLAST могут использоваться, как правило, следующие параметры: Опции фильтров устанавливают по умолчанию «default»; Матрицу выравнивания (Comparison Matrix) устанавливают на «BLOSUM62»; Издержки на пробелы (Gap Costs) устанавливают на «Existence: 11, Extension: 1», Размер слова (Word Size) устанавливают на 3, Порог ожидания Expect (E threshold) устанавливают на 1e-3, а минимальную длину локального выравнивания устанавливают на 50% длины анализируемой последовательности. Идентичность и сходство последовательности могут определяться также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA).
[0039] Термин «пестицидный» в данном описании означает способность данной субстанции или композиции снизить скорость роста организма-вредителя, то есть нежелаемого организма, или повысить смертность организма-вредителя.
[0040] Под «супрессорной активностью» средства биологической борьбы с данным фитопатогеном понимают способность данного средства (агента) подавлять, ингибировать, стабилизировать, поворачивать ход болезни вспять, замедлять или задерживать развитие самого патогена или прогрессирование инфекции или болезненного состояния, вызванного данным патогеном.
[0041] Вариант: термин «вариант», используемый в данном описании по отношению к микроорганизму, означает штамм, имеющий идентифицирующие характеристики вида, к которому он принадлежит, и при этом по меньшей мере одну вариацию нуклеотидной последовательности или идентифицируемую отличительную особенность, относящуюся к родительскому штамму и являющуюся генетически (наследуемой). Например, штамм SGI-SGI-014-CQ6 вида Microbacterium, обладающий фунгицидной активностью и имеющий идентифицируемые особенности, включающие 1) способность подавлять рост гриба Fusarium graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae, 2) способность подавлять развитие фузариоза, 3) наличие обязательных генов с идентичностью более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99% с обязательными генами SGI-014-C06 вида Microbacterium, может использоваться для подтверждения того, что анализируемый вариант является SGI-014-C06 вида Microbacterium.
[0042] В отношении нуклеиновых кислот и полипептидов термин «вариант» используется здесь для обозначения полипептидной, протеиновой или полинуклеотидной молекулы с некоторыми отличиями, созданными искусственно или природным путем, в их аминокислотных или нуклеинокислотных последовательностях от эталонных полипептидов или полинуклеотидов, соответственно. Этими отличиями могут быть, например, замены, инсерции, делеции или любые целевые комбинации таких изменений в эталонном полипептиде или полипептиде. Полипептидные и протеиновые варианты могут, кроме того, состоять из изменений в заряде и/или посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования, метилирования, фосфорилирования и др.).
[0043] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены здесь посредством ссылки так, как если бы каждая из публикаций или патентных заявок была индивидуально включена посредством ссылки.
[0044] Ссылки не означают признания их известным уровнем техники или прототипом. Обсуждением ссылок констатируется, что их авторы декларируют, а заявители имеют право, оспаривать точность и релевантность цитированных документов. Вполне понятно, что, хотя здесь сделаны ссылки на множество публикаций известного уровня техники, эти ссылки не означают признания того, что любой из этих документов образует собой часть общеизвестных сведений в данной отрасли.
Методы таксономической идентификации
[0045] Микроорганизмы часто можно различать путем прямого микроскопического исследования (ведь все клетки в образце выглядят под микроскопом по-разному), по характеристикам окрашивания, путем простого молекулярного анализа (например, просто путем определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и т.д. В дополнение к иллюстративным примерам таких методов таксономического анализа, описанных ниже, в Примерах 2-3, в таксономической идентификации того или иного микроорганизма может использоваться до нескольких различных уровней анализа, и каждый анализ может основываться на отличающихся от других характеристиках данного организма. В число таких разновидностей таксономического анализа могут входить анализ на основе нуклеиновых кислот (например, анализ индивидуальных специфических генов по уровню их присутствия или по их точной последовательности, либо по экспрессии конкретного гена или семейства генов), протеиновый анализ (например, на функциональном уровне с помощью прямого или косвенного ферментного анализа или на структурном уровне с помощью методов иммунодетектирования) и т.д.
[0046] a. Анализ посредством нуклеиновых кислот. Специалистам в данной отрасли хорошо известно, что в таксономической идентификации данного микроорганизма могут использоваться самые различные методы нуклеинокислотного анализа. Эти методы могут использоваться для идентификации клеток по нуклеотидной последовательности гена или для идентификации клетки, имеющей конкретные гены или семейства генов. Подходящими для таксономических исследований общими семействами генов могут быть семейство генов 16S, семейство актиновых генов и семейство генов рекомбиназы A (recA). В число этих методов, как правило, входят амплификация и секвенирование генов из очень малых количеств клеток, что зачастую позволяет преодолеть проблемы, связанные с концентрированием клеток и их ДНК из разбавленных суспензий. Термин «амплификация нуклеиновых кислот», в общем случае, относится к методам увеличения количества копий нуклеинокислотной молекулы в образце или препарате. Техника амплификации нуклеиновых кислот хорошо известна. Амплификацию нуклеиновых кислот можно осуществлять, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой взятый у субъекта биологический образец приводят в контакт с парой олигонуклеотидных праймеров в условиях, позволяющих осуществлять гибридизацию праймеров c нуклеинокислотной матрицей в данном образце. Праймеры в подходящих условиях удлиняются, отделяются от матрицы и затем отжигаются, удлиняются и отделяются, увеличивая число копий нуклеиновых кислот. Амплификация in vitro может проводиться также методом смещения нитей, изотермическим методом без транскрипции, методом амплификации с реакцией репарации цепей, методом лигазной цепной реакции, методом лигазной цепной реакции с заполнением разрывов, спаренным методом лигазной детекции и ПЦР; и методом амплификации без транскрипции РНК.
[0047] Кроме праймеров, приведенных в иллюстративных Примерах 2-3 и прилагаемом Перечне последовательностей, авторами в ходе лабораторных экспериментов были сконструированы также другие праймеры и, кроме того, непрерывно продолжается конструирование новых праймеров для индивидуальных биологических видов и филогенетических групп микроорганизмов. Такие узконаправленные праймеры могут находить применение в описанных здесь способах для отбора и/или специфической идентификации конкретных, целевых микроорганизмов.
[0048] Методы приготовления и использования нуклеинокислотных праймеров описаны, например, в [Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989], Ausubel et al. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998]. Пары праймеров для амплификации могут быть получены из известной последовательности, например, с помощью специальной компьютерной программы «Primer», разработанной Институтом фузариоза, г. Кембридж, шт. Массачусетс, США (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Специалисту в данной отрасли хорошо известно, что специфичность зонда или праймера возрастает с его длиной. Так, например, праймер, содержащий 30 последовательных нуклеотидов его рРНК-кодирующего нуклеотидного или фланкирующего участка, будет отжигаться до целевой последовательности с более высокой специфичностью, чем соответствующий праймер, состоящий только из 15 нуклеотидов. Таким образом, для получения большей специфичности можно отбирать зонды и праймеры, содержащие по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или больше последовательных нуклеотидов целевой нуклеотидной последовательности, такие как 16S рРНК.
[0049] Нуклеиновые кислоты, подходящие для нуклеинокислотных манипуляций (например, ПЦР), можно получать с помощью таких общеизвестных технологий, как экстрагирование фенол-хлороформом, или с помощью одного из множества продажных комплектов экстрагирования ДНК. Альтернативным путем амплификации ДНК может быть присаживание клеток непосредственно в реакционную смесь для амплификации нуклеиновых кислот и проведение всех остальных манипуляций на стадии денатурации с лизисом клеток и выделением ДНК.
[0050] Полученный продукт реакций амплификации нуклеиновых кислот анализируют с помощью стандартных методов, включая электрофорез, картины расщепления рестрикционной эндонуклеазой, гибридизацию или лигирование олигонуклеотидов и/или секвенирование нуклеиновых кислот. Если методы гибридизации используются для всех целей идентификации клеток, то подходящими для этого могут быть самые различные способы мечения зондов, включая флуоресцентное мечение, радиоактивное мечение и нерадиоактивное мечение. При использовании методов секвенирования нуклеиновых кислот может проводиться исследование гомологии нуклеотидных последовательностей амплифицированных нуклеинокислотных молекул с помощью различных баз данных известных последовательностей, включая, например, базы данных DDBJ/GenBank/EMBL.
[0051] b. Протеин-опосредованный анализ. В дополнение к анализу нуклеиновых кислот, микроорганизмы могут характеризоваться с помощью таксономии и идентифицироваться непосредственно по присутствию (или отсутствию) специфических протеинов. В таком анализе за основу может приниматься активность определенного протеина, например, в ферментном анализе, или ответ совместно культивируемых организмов, или просто присутствие специфицированного протеина (которое может определяться, например, с помощью иммунологических методов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание антителами in situ).
[0052] Ферментный анализ. Для проведения такого анализа, в питательную среду (например, культуры на микротитровальном планшете) включают флуоресцентные или хромогенные аналоги субстрата, а затем проводят инкубацию и скрининг по продуктам реакции, идентифицируя, таким образом, культуры по их ферментативной активности.
[0053] Ответ при совместной культивации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность фермента, несомого микробным изолятом, можно определять по ответу (или степени ответа) совместно культивируемого организма (например, организма-репортера).
[0054] Для идентификации микроорганизмов, выбранных и выделенных из окружающей среды-источника путем связывания по меньшей мере одного антитела или одной молекулы, полученной из антитела, с определенной молекулой, а точнее - с эпитопом молекулы, микроорганизма, также могут применяться самые различные способы.
[0055] Антитела к белкам микроорганизмов могут быть получены с помощью стандартных методик, описанных во многих литературных источниках, например, (Harlow and Lane, (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988). Определить то, связывается ли данный агент по существу только с протеином целевого микроорганизма, можно легко с помощью обычных или адаптированных методик. Одной из таких методик, подходящих для анализа in vitro, является процедура вестерн-блоттинга, описанная во многих известных работах, включая (Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988).
[0056] Более короткие фрагменты антител (молекул, полученных из антител, например, FAbs, Fvs и одноцепочечные Fvs (SCFvs)) также могут служить специфически связывающими агентами. Способы приготовления таких фрагментов широко известны.
[0057] Детекция антител, связывающихся с клетками в соответствии с изобретением, может осуществляться с помощью стандартных методов, например, иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющих получать детектируемый, например, флуоресцентный или люминесцентный, сигнал.
Выделенные культуры в соответствии с изобретением
[0058] Как более подробно описано в разделе ПРИМЕРЫ, авторами было обнаружено несколько полезных для сельского хозяйства новых микроорганизмов, способных, например, эффективно подавлять фузариоз. Указанные новые антагонистические микроорганизмы, в частности, являются эффективным средством для уменьшения тяжести заболевания фузариозом и для ингибирования роста гриба Fusarium graminearum, главного возбудителя фузариоза в пшенице. Эти микробные антагонисты были идентифицированы из пула, составляющего приблизительно 5000 микробных штаммов, полученных из образцов диких растений, собранных в нескольких местах на территории Соединенных Штатов. Начальный отбор антагонистического микроорганизма производился по способности микроорганизмов подавлять развитие патогена F. graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae в испытаниях на антагонизм in vitro. Отобранные микробные антагонисты подвергались затем биологическим испытаниям в теплице на сеянцах пшеницы, где проводилась инокуляция сеянцев микробными штаммами, а затем - повторные инокуляции спор F. graminearum, на способность этих микробных штаммов уменьшать тяжесть инфицирования грибом и на их способность сохранять выход семян. Отобранные таким образом антагонистические микроорганизмы продемонстрировали в тепличных испытаниях свою эффективность в уменьшении тяжести фузариоза.
[0059] Кроме того, таксономический анализ показал, что каждый из описанных здесь антагонистических микроорганизмов имеет близкое родство либо с бактериальным родом Microbacterium, бактериальным родом Bacillus, бактериальным родом Variovorax, либо с родом грибов Mycosphaerella.
[0060] Род Microbacterium, типичный род семейства Microbacteriaceae, в общем случае относится к приспосабливающимся, грамположительным, неспорообразующим, палочковидным бактериям, которые изначально, на ранних стадиях исследований, были выделены на бактериях, вырабатывающих молочную кислоту. Члены рода Microbacterium поначалу широко характеризовались своей заметной теплостойкостью, присутствием в молочных продуктах и продуцированием небольших количеств L(+) молочной кислоты из глюкозы. В противоположность этим родам семейства Microbacteriaceae, виды которого отличаются когерентным пептидогликановым типом, вид Microbacterium имеет орнитин или лизин либо во межпептидном мостике, либо в позиции 3 пептидогликана B-типа. В других хемотаксономических свойствах, таких как изопреноидные хиноны (MK-11, MK-12, MK-13), полярные липиды, жирные кислоты и основной состав ДНК, члены этого семейства демонстрируют обычный диапазон разнообразия, наблюдаемый в других родах Microbacteriaceae. По результатам некоторых таксономических исследований два бактериальных рода Microbacterium и Aureo бактерия могут быть объединены. На сегодняшний день род Microbacterium включает по меньшей мере 33 вида, которые были выделены из широкого диапазона мест обитания, включая почву, молочные продукты, растительные галлы, насекомых и клинические образцы. Различные аспекты их экологии, филогении, таксономии, культивирования и условий долговременного хранения недавно были подсумированы Евтушенко и Такэути (Evtushenko и Takeuchi, 2006). Вполне понятно, что микроорганизм рода Microbacterium может быть вполне надежно идентифицирован любыми таксономическими методами, описанными выше, включая хемотаксономический анализ пептидогликанов клеточной стенки и анализ последовательностей методом выравнивания с 16S рДНК, как описано (Evtushenko и Takeuchi, 2006) и цитированных ими ссылках, а также в ссылках, цитированных в Примерах 2-3 настоящего описания. Как более подробно рассмотрено ниже, ранее сообщалось об обнаружении антагонистической активности против фузариоза у нескольких микроорганизмов природного происхождения. Однако, о том, что такой антагонистической активностью обладает микроорганизм рода Mycobacterium, до настоящего изобретения сообщений не было. Кроме того, до настоящего изобретения его авторам не были известны способы и процессы использования бактериального штамма рода Mycobacterium как агента биоборьбы для предотвращения, ингибирования или обработки против развития патогена, вызывающего фузариоз.
[0061] Bacillus является родом грамположительных вариабельных, спорообразующих палочковидных бактерий. Подобно другим родам, ассоциирующимся с ранней историей развития микробиологии, таким как Pseudomonas или Vibrio, около 266 видовых членов рода Bacillus обнаруживаются повсюду, и он широко признан как один из родов с наибольшим многообразием 16S и окружающей среды. Виды Bacillus могут быть обязательными аэробами или факультативными анаэробами, и иметь положительный тест на каталазу. Убиквист по своей природе, род Bacillus включает в себя как свободноживущие, так и патогенные виды. В тяжелых окружающих условиях эти клетки продуцируют овальные эндоспоры, которые длительное время могут пребывать в состоянии покоя. Эти характеристики изначально определяли данный род, однако не все такие виды имеют близкое родство, и многие переместились к другим родам. Фактически было предпринято несколько попыток реконструировать филогению этого рода. Bacillus-специфические исследования с наибольшим многообразием были проведены в работе (Xu and Cote, Intl. J. of Syst. Evol. Microbiol. 53 (3): 695-704; 2003) с использованием 16S и участка ITS (внутреннего транскрибированного спейсера), где авторы разделили род на 10 групп, которые включают гнездовые роды Paenibacillus, Brevibacillus, Geobacillus, Marinibacillus и Virgibacillus. Однако, согласно более поздним исследованиям род Bacillus содержит очень большое число гнездовых таксонов и особенно как в 16S, так и в 23S, он считается парафилетическим к Lactobacillales (Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria и др.) благодаря Bacillus coahuilensis и др., например, (Yarda et al, Syst. Appl. Microbiol. 31 (4): 241-250, 2008; Yarda et al, Syst. Appl. Microbiol. 33 (6): 291-299, 2010). Одна из клад, образованная видами B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis и B. weihenstephanensis в соответствии с современными стандартами классификации, должна быть единичного вида (с 97% 16S идентичностью), однако по медицинским соображениям, их считают отдельными видами. В дополнение к методам таксономического анализа, описанным в Примерах 2-3, филогенетический и таксономический анализы вида Bacillus могут проводиться с помощью ряда различных методов, включая подробно описанные в (Xu and Cote, 2003; Yarda et al., 2008; Yarda et al., 2010).
[0062] Род Variovorax изначально был создан реклассификацией рода Alcaligenes paradoxus на Variovoraxparadoxus (Willems et al., 1991), который считается типичным видом этого рода. V. paradoxus был широко исследован как модель для новых биодеградационных агентов, а также взаимодействий микроб-микроб и микроб-растение. Другими видами этого рода являются V. dokdonensis, V. soli (Kim et al., 2006), и V. boronicumulans (Miwa et al., 2008). Виды Variovorax в плане катаболизма очень разнятся и вступают во взаимовыгодные взаимодействия с другими бактериальными видами во многих процессах биологического разложения и, следовательно, являются экологически значимыми и имеют высокий потенциал практического применения. Например, почвенный метанотроф, только при совместном культивировании со штамом V. paradoxus демонстрирует высокую афинность к метану (мощному тепличному газу) - особенность, которая обычно не наблюдается у лабораторных культур. Подобным образом было обнаружено, что его близкий родственник Variovorax является центральным, нефотосинтетическим партнером в рамках фототрофной консорции «Chlorochromatium aggregatum». Некоторые виды рода Variovorax обладают также способностью вмешиваться в коммуникацию других бактерий. Кроме того, некоторые виды рода Variovorax могут тесно взаимодействовать с другой биотой (например, растениями) в различных экосистемах. Более того, некоторые виды Variovorax, находясь на площади за пределами корней растения и/или внутри растения, проявляли способность активировать рост растения путем снижения уровней этилена, репрессии патогенеза, регулируемого чувством кворума, и повышения стойкости к тяжелым металлам, что очень полезно для фиторемедиации. В дополнение к методам анализа таксономии, описанным в Примерах 2-3, филогенетический и таксономический анализы вида Variovorax могут проводиться всевозможными методами, включая подробно рассмотренные в настоящем описании.
[0063] Mycosphaerella является очень большим родом грибов с более чем 2000 наименованиями видов и по меньшей мере 500 видами, ассоциированными с более чем 40 анаморфными родами (в частности, Cercospora, Pseudocercospora, Septoria, Ramularia и др.). Кроме того, несколько тысяч анаморфов не имеют телеморфов. Род Mycosphaerella включает виды, которые являются патогенами, сапробами, эндофитами или мутуалистическими ассоциациями. Разнообразные аспекты их экологии, происхождения, таксономии, методов культивирования и условий долговременного хранения недавно были описаны в (Crous et al., Persoonia, 23:119-146, 2009). Таксономическая идентификация микроорганизмов рода Mycosphaerella может производиться любым из вышеописанных соответствующих методов или их комбинацией. Наиболее общими из таких методов являются анализ последовательностей путем выравнивания с последовательностями 16S рДНК и участков внутренних транскрибированных спейсеров, как описано, например, в (Crous et al., Studies in Mycology, 55:235-253,2006; Crous et al, 2009, supra; Goodwin et al, Phytopathology 91: 648-658, 2001), а также методы, описанные в Примерах 2-3 ниже.
Депозиты биологических материалов
[0064] Очищенные культуры микробных штаммов, которые согласно их идентификации обладают супрессорной активностью против фузариоза, были депонированы в коллекцию агрокультур для исследований (Agricultural Research Service Culture Collection, размещенную по адресу 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USA (NRRL)) в соответствии с «Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры» и вытекающими из него нормативными положениями (Budapest Treaty). Эти депозиты размещены под следующими номерами:
Идентификация
SGI штамма		 Номер депозита Предварительная таксономия видов
SGI-005-G08 NRRL - Microbacterium
SGI-010-H11 NRRL 50471 Mycosphaerella
SGI-014-C06 NRRL B-50470 Microbacterium
SGI-014-G01 NRRL B-50469 Variovorax
SGI-015-F03 NRRL B-50760 Bacillus
SGI-015-H06 NRRL B-50761 Bacillus
[0065] Данные микробные штаммы были депонированы с условием обеспечения доступа к этой культуре в течение нахождения данной заявки в процессе рассмотрения и принятия решения по ней руководителем Патентного ведомства США согласно 37 C.F.R. §1.14 и 35 U.S.C. §122. Эти депозиты представляют по существу чистые культуры депонированных штаммов. Доступ к депозитам обеспечивается в соответствии с патентными законодательствами стран, где зарегистрированы противоположные стороны данной заявки или их наследники. Вполне понятно, что доступ к депозитам не означает разрешения на практическое применение предмета изобретения в нарушение патентных прав, гарантированных государством.
[0066] Предпочтительные микроорганизмы в соответствии с изобретением имеют все идентификационные характеристики депонированных штаммом и, в частности, идентификационные характеристики, касающиеся способности подавлять развитие фузариоза, как указано в данном описании, и способности подавлять развитие патогена Fusarium graminearum и его телеоморфа Gibberella zeae. В частности, предпочтительные микроорганизмы в соответствии с изобретением относятся к депонированным микроорганизмам, описанным выше, и их мутантам.
Микробиологические композиции
[0067] Микробиологические композиции в соответствии с изобретением, содержащие выделенные микробные штаммы или их культуры, могут иметь самые различные формы, включая, в том числе, формы стационарной культуры, цельной культуры, сохраняемого клеточного штамма, мицелия и/или гифы (особенно, исходных глицериновых растворов), агаровых полосок, агаровые комплексы в водно-глицериновой смеси, высушенных вымораживанием маточных растворов и высушенных маточных растворов, таких как лиофилизаты или мицелии, высушенные на фильтровальной бумаге или на посевном зерне. В соответствии с определением, данным в настоящем описании, термин «выделенная культура» или используемые здесь его грамматические эквиваленты означают, что данная культура представляет собой культуральную жидкость, гранулу, соскоб, высушенный образец, лиофилат или срез (например, гифа или мицелия); или подложку, контейнер или среду, например, планшет, бумагу, фильтр, матрицу, солому, пипетку или острие пипетки, волокно, иглу, гель, тампон, пробирку, флакончик, частицу и др., которая содержит один тип организма. В настоящем изобретении выделенной культурой микробного антагониста является культуральная жидкость или соскоб, гранула, высушенный препарат, лиофилат или срез микроорганизма, или подложка, контейнер, или среда, которая содержит микроорганизм в отсутствие других организмов.
[0068] Настоящим изобретением предлагаются также композиции, содержащие по меньшей мере один выделенный микробный штамм или его культуру в соответствии с изобретением и носитель. Носителем может быть любой один носитель или множество носителей, удовлетворяющий(-щие) разнообразным свойствам, таким как повышенная стойкость, смачиваемость, диспергируемость и др. Композиция согласно изобретению может включать в себя смачивающие агенты, такие как природные или искусственные поверхностно-активные вещества, которыми могут быть неионные или ионные поверхностно-активные вещества либо их комбинации. В состав композиции могут входить также эмульсии типа вода-в-масле, которые содержат по меньшей мере один выделенный микроорганизм в соответствии с изобретением (U.S. Patent No. 7485451), включенный здесь посредством ссылки. Требуемые препараты могут быть приготовлены из смачиваемых порошков, гранул, гелей, агаровые полосок или гранул, загустителей и т.п., заключенных в микрокапсулы частиц и т.п., жидкостей, таких как водные текучие среды, водные суспензии, эмульсии типа вода-в-масле и др. Препарат может содержать зерновые или бобовые продукты (например, дробленое зерно или бобы, бульон или муку, приготовленные из зерна или бобов), крахмал, сахар или растительное масло. Носителем может быть сельскохозяйственный носитель. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения носителем является семя, а композиция может наноситься на это семя или покрывать либо пропитывать его.
[0069] В некоторых вариантах осуществления изобретения сельскохозяйственным носителем может быть почва или среда для выращивания растений. Другими подходящими сельскохозяйственными носителями являются вода, удобрения, растительные масла, увлажнители и их комбинации. В альтернативном варианте сельскохозяйственным носителем может быть твердый материал, такой как инфузорная земля, суглинок, кремнезем, альгинат, глина, бентонит, вермикулит, семенные капсулы, другие растительные и животное продукты или их комбинации, включая гранулы, окатыши и суспензии. Носителями могут служить также смеси любых вышеуказанных ингредиентов, такие как, например, песта (pesta: мука и каолиновая глина), агаровые или мучные гранулы в суглинке, песке или глине и др. Препараты могут включать в себя пищевые источники для культивированных организмов, такие как ячмень, рис или другие биологические материалы, например, семена, части растений, багасса сахарного тростника, шелуха или черешки от обработки зерна, дробленый растительный материал (например «отходы складирования») или древесина из строительных отходов, опилки или мелкие волокна от повторной переработки бумаги, тканых материалов или древесины. Специалистам в данной отрасли могут быть известны также другие подходящие материалы для этой цели.
[0070] В жидкой форме, например, растворов или суспензий, микроорганизмы могут смешиваться или суспендироваться в воде или в водных растворах. Подходящими жидкими разбавителями или носителями при этом являются вода, водные растворы, нефтяные дистилляты и другие жидкие носители.
[0071] Твердые композиции могут готовиться путем диспергирования антагонистических микроорганизмов в или на соответствующим образом разделенном твердом носителе, таком как торф, пшеница, отруби, вермикулит, глина, тальк, бентонит, инфузорная земля, сукновальная глина, пастеризованная почва и т.п. Если такие препараты используются в качестве смачиваемых порошков, то могут применяться биологически совместимые диспергаторы, такие как неионные, анионные, амфотерные или катионные диспергаторы и эмульсификаторы.
[0072] В предпочтительном варианте осуществления изобретения рассматриваемые здесь композиции предотвращают поражение фузариозом растений и, особенно, зерновых, таких как пшеница, ячмень, овес и кукуруза, а при использовании их в достаточных количествах действуют как микробные антагонисты. Подобно другим средствам биологической борьбы, эти композиции имеют высокий порог безопасности, поскольку они, как правило, не обжигают и не повреждают растение.
[0073] Как подробно показано в настоящем описании, борьба с фузариозом может осуществляться путем нанесения одной или больше микробиологических композиций в соответствии с изобретением на растение-хозяина или на его части. Эти композиции могут наноситься в количестве, эффективном для понижения уровня фузариоза по сравнению с его уровнем в необработанном контроле. Активные компоненты при этом используются в концентрации, достаточной для ингибирования развития целевого фитопатогена, когда они приложены к зерновой культуре. Для специалиста должно быть очевидно, что эффективные концентрации могут быть различными и зависеть от следующих факторов: (a) типа растения или сельскохозяйственного продукта; (b) физиологического состояния растения или сельскохозяйственного продукта; (c) концентрации патогенов, поражающих растение или сельскохозяйственный продукт; (d) типа болезни, поражающей растение или сельскохозяйственный продукт; (e) погодных условий (например, температуры, влажности); и (f) стадии развития болезни растения. Согласно изобретению, типичные величины концентрации лежат выше уровня 1×102 КОЕ/мл носителя. Предпочтительные уровни концентрации лежат в интервале приблизительно от 1×104 до 1×109 КОЕ/мл, а еще лучше - в интервале от 1×106 до 1×108 КОЕ/мл. Более предпочтительным является интервал концентрации приблизительно от 35 до 150 мг сухой микробной массы на грамм носителя (сухой препарат) или на миллилитр носителя (жидкая композиция). У твердых препаратов скорость поставки должна регулироваться так, чтобы получать число жизнеспособных клеток на единицу площади поверхности ткани растения, сравнимое с получаемым от применения вышеуказанных концентраций жидкой обработки. Как правило, агенты биологического метода борьбы в соответствии с изобретением являются биологически эффективными, когда они поставляются в концентрации выше 106 КОЕ/г (колониеобразующих единиц на грамм), предпочтительно - выше 107 КОЕ/г, еще предпочтительнее - в концентрации 108 КОЕ/г, и наиболее предпочтительно - в концентрации 109 КОЕ/г.
[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения количество одного или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции в соответствии с изобретением может варьировать в зависимости от конечного препарата, а также размеров и типа растения или используемых семян. В предпочтительном варианте один или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции находится в количестве приблизительно от 2% (мас.) до 80% (мас.) от всего количества препарата. В предпочтительном варианте один или больше агентов биологической борьбы в микробной композиции находится в количестве приблизительно от 5% (мас.) до 65% (мас.), а в наиболее предпочтительном - приблизительно от 10% (мас.) до 60% (мас.) от всего количества препарата.
[0075] Микробиологические композиции согласно изобретению могут наноситься на пшеницу или другую зерновую культуру с помощью самых различных, хорошо известных специалистам способов, таких как опыление, создание покрытия, вливание, втирание, прикатывание, протравливание погружением, распыление, обтирка щеткой и другие подходящие способы, которые не вызывают существенных повреждений у пшеницы и других зерновых культур при их обработке. Особенно приемлемым является способ распыления.
[0076] Композиции в соответствии с изобретением, как правило, являются химически инертными; поэтому они являются совместимыми по существу с любыми другими компонентами схемы распыления. Они могут использоваться также в сочетании с биологически совместимыми пестицидными активными агентами, например, с гербицидами, нематицидами, фунгицидами, инсектицидами и т.п. Они могут использоваться также в сочетании с субстанциями регуляции роста растений, такими как удобрения, регуляторы роста растений и т.п., если только такие соединения или субстанции являются биологически совместимыми.
[0077] Если пестициды или фунгициды используются в их продажных препаратах и в формах, приготовленных из этих препаратов, то активные микробные антагонисты и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут, тем более, использоваться вместе с ними в форме синергетической смеси. Компоненты такой смеси, являясь синергистами, повышают эффективность активной композиции без необходимости добавлять в смесь специальные синергисты.
[0078] Используемые в качестве пестицидов в их продажных препаратах и в формах, приготовленных из этих препаратов, активные микробные антагонисты и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут, тем более, использоваться вместе с ними в форме смеси с ингибиторами, которые снижают деградацию активных композиций после их применения в месте произрастания растения, на поверхности частей растения или в его тканях.
[0079] Активные микробные антагонисты и композиции согласно изобретению, в своем исходном состоянии или в препаратах, могут использоваться также в форме смеси с известными акарицидами, бактерицидами, фунгицидами, инсектицидами, микробицидами, нематицидами, пестицидами или их комбинациями, например, с целью расширения их спектра действия или для предотвращения развития стойкости этим путем. Во многих случаях, синергетика дает положительный результат, то есть активность такой смеси может превышать активность ее индивидуальных компонентов. Смесь с другими известными активными соединениями, такими как удобрения, регуляторы роста, защитные агенты и/или химикалии сигнализации также охватываются объемом изобретения.
[0080] В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции могут содержать также по меньшей мере один химический или биологический пестицид. Количество по меньшей мере одного химического или биологического пестицида, используемого в данной композиции, может варьировать в зависимости от конечного препарата, а также размеров обрабатываемого растения и семени. В предпочтительном варианте количество по меньшей мере одного используемого химического или биологического пестицида составляет приблизительно от 0,1% (мас.) до 80% (мас.) от всего количества препарата. В более предпочтительном варианте, количество по меньшей мере одного используемого химического или биологического пестицида составляет приблизительно от 1% (мас.) до 60% (мас.), а в наиболее предпочтительном - приблизительно от 10% (мас.) до 50% (мас.).
[0081] В изобретении могут использоваться любые пестициды, известные специалистам в данной отрасли. Это могут быть, например, химические пестициды, принадлежащие к классам карбаматов, органофосфатов, хлорорганических соединений и пиретроидов. Изобретением предусмотрены также химические агенты биоборьбы, такие как, например: беномил; боракс; каптафол; каптан; хлорталонил; медьсодержащие препараты; препараты, содержащие дихлон, дихлоран, йод, цинк; фунгициды, ингибирующие биосинтез эргостерола, такие как, например, бластидидин, цимоксанил, фенаримол, флузилазол, фолпет, имазалил, ипордион, манеб, манокоцеб, металаксил, оксикарбоксин, миклобутанил, окситетрациклин, ПХНБ (пентахлорнитробензол), пентахлорфенол, прохлораз, пропиконазол, хинометионат, арсенит натрия, натрий DNOC (динитроокрезол), натрий гипохлорит, натрий фенилфенат, стрептомицин, сера, тебуконазол, тербутразол, тиабендозол, тиофанат-метил, триадимефон, трициклазол, трифорин, валидимицин, винклозолин, цинеб и цирам. В композициях согласно изобретению могут использоваться самые различные инсектицидные соединения, включая, например, указанные в заявке (U.S. Pat. Appl. No. 20110033432A1).
[0082] Микробиологические композиции в соответствии с изобретением в предпочтительном варианте содержат по меньшей мере один биологический пестицид. Типовыми биологическими пестицидами, которые являются подходящими для использования в соответствии с изобретением и могут входить в микробиологическую композицию в соответствии с изобретением для предотвращения фитопатогенной болезни, являются микробы, животные, бактерии, грибы, генетический материал, растение и природные продукты живых организмов. В этих композициях микроорганизм в соответствии с изобретением выделяется перед приготовлением препарата дополнительным организмом. В композиции с антагонистическими микроорганизмами согласно изобретению могут использоваться микробы, например, видов Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Mariannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces и Trichoderma, где особенно предпочтительными являются грибные штаммы рода Muscodor. Особенно предпочтительным является также использование микробиологических композиций в соответствии с настоящим изобретением в комбинации с микробными антагонистами, описанными в (US Patent No. 7518040; US Patent No. 7601346; US Patent No. 6312940).
[0083] В качестве примеров грибов, которые могут использоваться в комбинациях с микробными антагонистами и композициями в соответствии с изобретением, можно назвать виды Muscodor, Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana («белый мускарин»), Beauveria brongniartii, Chladosporium herbarum, Cordyceps clavulata, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps fads, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanthae, Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophila, Cordyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Cordycepshecocephala, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateralis, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutettae, Fusarium lateritium, Hirsutella citriformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae («зеленый мускарин»), Metarhizium flaviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans, и микоризные виды грибов, например, Laccaria bicolor. Подходящими могут быть также другие микопестицидные виды, известные специалистам в данной отрасли.
[0084] Настоящим изобретением предлагаются также способы лечебной обработки растения путем нанесения любого из множества обычных препаратов в эффективном количестве либо на почву (то есть, в борозды), на части растения (то есть опрыскиванием), либо на семена до их посадки (то есть нанесением покрытия или протравливанием). Обычными препаратами могут быть растворы, эмульсифицируемый концентрат, смачиваемые порошки, суспензионный концентрат, растворимые порошки, гранулы, суспензионно-эмульсионный концентрат, природные и искусственные материалы, пропитанные активным соединением, и очень мелкие полимерные капсулы с управляемым высвобождением. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции для биологической борьбы готовят в порошках, которые поступают в продажу либо в препаратах, готовых к употреблению, либо смешиваются друг с другом во время их употребления. В обоих случаях порошок может добавляться в почву перед посадкой или во время посадки. В альтернативном варианте агент биоборьбы и агент борьбы с насекомыми могут быть оба, или один из них, жидкими препаратами и смешиваться друг с другом во время лечебной обработки. Для специалиста понятно, что эффективное количество композиции согласно изобретению зависит от конечного препарата композиции, а также от размеров обрабатываемых растений или семян.
[0085] В зависимости от конечного препарата и способа его нанесения, композиция согласно изобретению может включать в себя одну или больше подходящих добавок. Такими добавками в данные композиции могут быть, например, адгезивы, такие как карбоксиметилцеллюлоза и природные либо искусственные полимеры в форме порошков, гранул или латексов, такие как гуммиарабик, хитин, поливиниловый спирт и поливинилацетат, а также природные фосфолипиды, такие как цефалины и лектицины, и искусственные фосфолипиды.
[0086] В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения микробиологические композиции готовят в едином стабильном растворе, эмульсии или суспензии. Для изготовления растворов активные химические соединения (то есть агенты биоборьбы с вредителями) перед добавлением агента биоборьбы, как правило, растворяют в растворителях. Подходящими жидкими растворителями могут быть, например, ароматические вещества из нефти, такие как ксилол, толуол или алкилнафталины, алифатические углеводороды, такие как циклогексан или парафины, например, нефтяные фракции, минеральные и растительные масла, спирты, такие как бутанол или гликоль, а также их простые и сложные эфиры, кетоны, такие как метилэтилкетон, метилизобутилкетон или циклогексанон, сильные полярные растворителями, такие как диметилформамид и диметилсульфоксид. Жидкой средой для эмульсии или суспензии является вода. В одном из вариантов осуществления изобретения агент химической борьбы и агент биологической борьбы суспендируются в жидкостях отдельно друг от друга и смешиваются во время употребления. В предпочтительном варианте приготовления суспензии агент борьбы с насекомыми и биологический агент объединяются в препарате, готовом к употреблению, имеющем срок хранения по меньшей мере два года. При употреблении жидкость может распыляться или наносится в форме пленки с помощью распылителя, либо в борозду во время посева культуры. Жидкая композиция может вводиться в почву перед прорастанием семян или непосредственно в почву в контакте с корнями с помощью разнообразных средств и методов, хорошо известных в данной отрасли, включая, например, капельное орошение, разбрызгиватели, инжекцию в почву или пропитывание почвы.
[0087] При необходимости могут добавляться стабилизаторы и буферы, включая соли щелочных и щелочноземельных металлов и органические кислоты, такие как лимонная кислота и аскорбиновая кислота, неорганические кислоты, такие как соляная кислота или серная кислота. Могут добавляться также биоциды, например, формальдегиды или формальдегид-выделяющие агенты, и производные бензойной кислоты, такие как p-гидроксибензойная кислота
Препараты для нанесения покрытий на семена
[0088] В некоторых, особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения, композиции для биоборьбы в соответствии с изобретением составляются для лечебной обработки семян. Композиция для лечебной обработки семян содержит по меньшей мере один агент борьбы с насекомыми и по меньшей мере один агент биологической борьбы. Предполагается, что семена могут по существу равномерно покрываться одним или больше слоями описанных здесь композиций для биоборьбы, используя для этого обычные методы смешивания и распыления или их комбинации и специально сконструированные и изготовленные устройства для создания покрытий, обеспечивающие требуемые точность, безопасность и эффективность нанесения на семена продуктов обработки. В таких устройствах используются различные технологии создания покрытий, например, роторного типа, барабанного типа, методы псевдоожиженного шара, фонтанирующего шара, роторного распыления или их комбинации. Жидкая обработка семян в соответствии с изобретением может осуществляться с помощью либо центрифужного дискового «распылителя», либо спрея, обеспечивающего равномерное распределение покрытия на семенах при их движении через профиль распыления. После этого семена в предпочтительном варианте перемешивают или ворошат в течение некоторого времени с целью дополнительного выравнивания распределения и сушат. Перед нанесением покрытия композицией согласно изобретению семена могут быть подвергнуты праймированию (стимуляции прорастания) для повышения равномерности прорастания и выпускания всходов. В альтернативном варианте сухой порошковый препарат может подаваться в определенных дозах на перемешиваемые семена и перемешиваться с ними до получения однородного распределения.
[0089] В другом аспекте согласно изобретению предлагаются семена, обработанные микробиологическими композициями в соответствии с изобретением. В одном из вариантов по меньшей мере часть поверхности семян является покрытой микробиологической композицией по изобретению. В одном из специфических вариантов осуществления обработанные микроорганизмами семена имеют концентрацию спор или микробных клеток приблизительно от 106 до 109 на одно семя. Семена могут иметь также большее количество спор или микробных клеток, например, 1010, 1011 или 1012 спор на семя. Микробные споры и/или клетки могут покрывать семена в свободном состоянии или, предпочтительно, наносится на них в предварительно приготовленной жидкой или твердой композиции. Твердая композиция, содержащая микроорганизмы, может готовиться путем перемешивания твердого носителя с суспензией спор до тех пор, пока твердые носители не будут пропитаны этой споровой или клеточной суспензией. После этого смесь просушивают, получая в результате требуемые частицы.
[0090] В некоторых других вариантах осуществления предполагается, что твердые или жидкие композиции для биоборьбы в соответствии с изобретением, кроме того, содержат функциональные агенты, способные защищать семена от вредного воздействия селективных гербицидов, такие как активированный уголь, питательные вещества (удобрения) и другие агенты, способные улучшать прорастание и качество продукции.
[0091] Известные способы и композиции для нанесения покрытий на семена могут быть особенно полезными, когда они модифицируются путем добавления одного из вариантов осуществления данного изобретения. Такие подходящие для применения способы и устройства для нанесения покрытий описаны, например, в (U.S. Pat Nos. 5918413; 5554445; 5389399; 4759945; 4465017). Всевозможные композиции для создания покрытий на семенах описаны, например, в (U.S. Pat. Appl. Nos. US20110033432, US20100154299, U.S. Pat. Nos. 5939356; 5876739, 5849320; 5791084, 5661103; 5580544, 5328942; 4735015; 4634587; 4372080, 4339456; и 4245432).
[0092] В препараты для обработки семян, содержащие композиции согласно изобретению, могут вводиться самые различные добавки. Такими добавками могут быть, например, связующие, состоящие предпочтительно адгезивного полимера, который может быть природным или искусственным и не должен оказывать фитотоксического воздействия на покрываемые семена. Связующее может выбираться среди следующих материалов: поливинилацетатов; coполимеров поливинилацетатов; coполимеров этиленвинилацетата (ЭВА); поливинилового спирта; coполимеров поливинилового спирта; целлюлоз, включая этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу; поливинилпиролидонов; полисахаридов, включая крахмал, модифицированный крахмал, декстрины, мальтодекстрины, альгинат и хитозаны; жиров; растительных масел; протеинов, включая желатин и зеины; гуммиарабиков; шеллаков; винилиденхлорида и сополимеров винилиденхлорида; лигносульфонатов кальция; акриловых coполимеров; поливинилакрилатов; полиэтиленоксида; акриламидных полимеров и coполимеров; полигидроксиэтилакрилата, метилакриламидных мономеров; и полихлоропрена.
[0093] Могут использоваться любые красители, включая органические хромофоры, относящиеся к классу нитрозо; нитро; азо, включая моназо, бизазо и полиазо; акридин, антрахинон, азин, дифенилметан, индамин, индофенол, метин, оксазин, фталоцианин, тиазин, тиазол, триарилметан, ксантен. Среди других допустимых добавок можно назвать следовые питательные добавки, такие как соли железа, марганца, бора, меди, кобальта, молибдена и цинка. Для удержания этих веществ на поверхности семян могут добавлять полимерные или другие пылевидные средства.
[0094] В некоторых специфических вариантах осуществления изобретения нанесенные покрытия, помимо микробных клеток или спор, могут содержать также слой адгезива. Адгезив должен быть нетоксичным, биоразлагаемым и клейким. Подходящими для него материалами являются, например: поливинилацетаты; coполимеры поливинилацетатов; поливиниловые спирты; coполимеры поливиниловых спиртов; целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза и гидроксиметилпропилцеллюлоза; декстрины; альгинаты; сахара; меляссы; поливинилпирролидоны; полисахариды; протеины; жиры; растительные масла; гуммиарабики; желатины; сиропы; и крахмалы. Подходящими могут быть также материалы, описанные в (U.S. Pat. No. 7213367 и U.S. Pat. Appln. No. US20100189693).
[0095] В препарат для обработки семян также могут входить различные добавки, такие как адгезивы, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, питательные и буферные ингредиенты. Обычными добавками в препарат для обработки семян являются, например, агенты для нанесения покрытия, смачивающие агенты, буферные агенты и полисахариды, а также по меньшей мере один подходящий для сельского хозяйства носитель, такой как вода, твердые тела или сухие порошки. Сухие порошки можно готовить из самых различных материалов, таких как карбонат кальция, гипс, вермикулит, тальк, гумус, активированный уголь и всевозможные соединения фосфора.
[0096] В одном из вариантов осуществления изобретения композиция для нанесение покрытия на семена может содержать по меньшей мере один наполнитель, являющийся органическим или неорганическим, природным или искусственным компонентом, с которым объединяются активные компоненты для облегчения их нанесения на семена. Желательно, чтобы наполнитель был инертным, твердым материалом, таким как глина, природный или искусственный силикат, кремнезем, смола, воск, твердое удобрение (например, соль аммония), природным почвенным минералом, таким как каолин, глина, тальк, известь, кварц, аттапульгит, монтмориллонит, бентонит или инфузорная земля, или искусственным минералом, таким как кремнезем, глинозем или силикат, из которых особенно подходящими являются силикаты алюминия или магния.
[0097] Препарат для обработки семян может содержать, кроме того, один или больше следующих ингредиентов: другие пестициды, включая соединения, действующие только под землей; фунгициды, такие как каптан, тирам, метаксил, флудиоксонил, оксадилил и изомеры каждого из этих материалов, и т.п.; гербициды, включая соединения, выбранные среди глифосфата, карбаматов, тиокарбаматов, ацетамидов, триазинов, динитроанилинов, глицериновых эфиров, пиридазинонов, урацилов, фенокси, мочевин и бензойных кислот; гербицидные защитные агенты, такие как бензоксазин, производные бензгидрила, N,N-диаллилдихлорацетамид, различные соединения дигалоацилов, оксазолидинилов и тиазолидинилов, этанон, соединения нафталевых ангидридов, и производные оксимов; удобрения; и агенты биоборьбы, такие как другие природные или рекомбинантные бактерии и грибы родов Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium и микоризные грибы. Эти ингредиенты могут добавляться в форме отдельного слоя на семенах или, в альтернативном варианте, в качестве части композиции для покрытия семян согласно изобретению.
[0098] В предпочтительном варианте, количество новой композиции или других ингредиентов, используемых для обработки семян, не должно ингибировать прорастание семян или вызывать у них фитотоксические повреждения.
[0099] Обработанные микроорганизмами семена могут быть далее покрыты пленкой поверх нанесенного на них покрытия для защиты последнего. Такие поверхностные покрытия являются хорошо известными и могут наноситься методами псевдоожиженного слоя и во вращающемся барабане.
[0100] В принципе, любые семена растений, способные прорастать и образовывать растение, восприимчивое к воздействию нематодов и/или патогенных грибов, могут обрабатываться в соответствии с изобретением. Подходящими для этого являются семена зерновых культур, кофе, капустных культур, волокнистых культур, цветов, фруктов, бобовых, масличных культур, деревьев, клубнеплодных культур, овощей, а также других растений однодольных и двудольных видов. Предпочтительными для покрытия являются семена, например, бобовых, моркови, кукурузы, хлопка, трав, салата, арахиса, перца, картофеля, рапса, риса, ржи, сорго, сои, сахарной свеклы, подсолнуха, табака и томатов. В наиболее предпочтительными для покрытия композициями согласно изобретению являются семена ячменя или пшеницы (яровой пшеницы или озимой пшеницы).
[0101] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается новое зерновое растение, созданное путем искусственного введения микробного эндофита по изобретению в зерновое растение, не содержащее эндофитных микроорганизмов. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта микробным эндофитом, введенным в зерновое растение, может быть эндофитный антагонист, обладающий супрессорной активностью против фузариоза или возбудителя фузариоза. Кроме того, эндофитным антагонистом, введенным в зерновое растение, может быть грибной штамм SGI-010-H11. Известно множество способов, продемонстрировавших свою эффективность для введения микробного эндофита в зерновые травы. Примеры таких способов можно найти в (U.S. Pat. Appl. No. 20030195117A1, U.S. Pat. Appl. No. 20010032343A1, U.S. Pat. No. 7084331). Для специалиста в данной отрасли должно быть вполне понятным, что многие из вышеупомянутых способов могут использоваться в культивировании нового зернового растения согласно изобретению.
[0102] После искусственной инфикации желательно ДНК выделенного эндофитного антагониста амплифицировать с помощью ПЦР реакции, и подтвердить его антагонистичность путем проведения исследований гомологии для амплифицированной ДНК. Далее, желательно в вышеупомянутый эндофитный антагонист ввести инородный ген, экспрессирующий идентифицируемое средство, и подтвердить наличие колонизации данного эндофитного антагониста, инфицирующего растение, вышеупомянутым идентифицирующим средством с помощью этого инородного гена.
Получение композиции для биоборьбы в соответствии с настоящим изобретением
[0103] Культуры микробных антагонистов могут быть получены для использования в композициях биоборьбы согласно изобретению с помощью известных методов стандартной статической сушки и жидкой ферментации. Культивирование, как обычно, проводят в биореакторе.
[0104] Биореактором называется любое устройство, обеспечивающее условия биологически активной окружающей среды. В контексте данного описания биореактором является сосуд, в котором можно выращивать микроорганизмы, включая микробные антагонисты, согласно изобретению. Биореактор может иметь любую форму и размеры, подходящие для культивирования микроорганизмов. Биореактор может иметь размеры от 10 мл до литров и кубических метров. Он может быть изготовлен из нержавеющей стали или любого другого подходящего материала. Биореактор может быть периодического действия или непрерывного действия (например, с непрерывным перемешиванием). По своему типу биореактор может относиться к хемостатам, какие используются в микробиологии для выращивания и сбора бактерий. Среди поступающих в продажу подходящих биореакторов можно назвать, например, аппараты, выпускаемые фирмой Bioreactor System Design, Asenjo & Merchuk, CRC Press, 1995.
[0105] Для маломасштабных нужд, например, для тестирования и разработки новых процессов и процессов, которые не могут быть преобразованы в непрерывные, можно использовать биореактор периодического действия.
[0106] Микроорганизмы, культивируемые в биореакторе, могут суспендироваться или иммобилизироваться. Культивация в биореакторе в общем случае осуществляется в аэробных условиях при соответствующих температурах и pH. Для получения организмов согласно изобретению культивация клеток осуществляется при температурах в интервале 5-37°C, в котором предпочтительными являются температуры в интервалах 15-30°C, 15-28°C, 20-30°C и 15-25°C. Величина pH питательной среды может варьировать от 4,0 до 9,0, однако предпочтительным является рабочий интервал от немного кисловатого до нейтрального с pH 4,0-7,0, или 4,5-6,5, или pH 5,0-6,0. Как правило, максимальный клеточный выход получают в период 20-72 часов после инокуляция.
[0107] Вполне понятно, что оптимальные условия культивации антагонистов согласно изобретению зависят от конкретного штамма. Однако главные ингредиенты и условия питания можно будет определить, исходя из условий, применяемых в процессе селекции, и общих требований для большинства микроорганизмов. Микробные антагонисты, как правило, должны выращиваться в аэробных жидких культурах на среде, содержащей источники углерода, азота и неорганических солей, которые могут ассимилироваться микроорганизмом и содействовать эффективному росту клеток. Предпочтительными источниками углерода являются гексозы, такие как глюкоза. Однако их могут заменить другие, легкоассимилируемые источники, такие как аминокислоты. Источниками азота в процессе выращивания могут служить многие неорганические и белковые материалы. Предпочтительными источниками азота являются аминокислоты и мочевины, однако могут использоваться также газообразный аммиак, неорганические соли нитрата и аммония, витамины, чистые питательные вещества, пиримидины, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, протеоз пептона, соевая мука, гидролизаты казеина, фильтрат барды и т.п. Среди неорганических минералов, которые могут вводиться в питательную среду, можно назвать обычные соли, способные поставлять ионы кальция, цинка, железа, марганца, магния, меди, кобальта, калия, натрия, молибдата, фосфата, сульфата, хлорида, бората и др. Предпочтительной питательной средой для грибных антагонистов является жидкая картофельная декстроза, а для бактериальных штаммов - бульон премикс R2A.
[0108] В настоящем описании указаны и включены посредством ссылок различные источники информации, среди которых, например, статьи из научных журналов, патентные документы, учебные пособия и адреса интернет-страниц. Ссылки на эти источники служат исключительно для целей показать общее состояние уровня техники на время подачи заявки. В то время как содержание и идеи, изложенные во всех и каждом из этих источников, могут послужить основой и использоваться для реализации и применения вариантов осуществления изобретения на практике, ни одно из обсуждений и ни один из комментариев в конкретном источнике информации не может считаться признанием того, что такой комментарий был в широком смысле принят в качестве общего мнения в данной отрасли.
[0109] Приведенное здесь описание общих способов имеет исключительно иллюстративные цели. Вполне очевидными могут быть вытекающие из этого описания другие альтернативные способы и варианты осуществления изобретения, которые также лежат в рамках идеи и сферы применения настоящей заявки.
[0110] Ниже приведены примеры, которые служат также исключительно для иллюстрации данного изобретения и не предполагают каких бы то ни было его ограничений.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. Описание антагонистических микроорганизмов, способных подавлять развитие Fusarium graminaerum и Gibberella zeae , являющихся возбудителями фузариоза
[0111] В данном примере описан высокопроизводительный процесс сбора и скрининга микроорганизмов-кандидатов, разработанный фирмой Synthetic Genomics, Inc. для выделения штаммов микроорганизмов, обладающих супрессорной активностью против возбудителей фузариоза и, в частности, против Fusarium graminearum. Новые микробные антагонистические штаммы были выделены из образцов растительной ткани, собранных в нескольких местах на территории Соединенных Штатов. Из тканей корней растений, собранных в заповеднике Eagle Peak Preserve вблизи Julian, CA, были выделены бактериальные штаммы SGI-014-C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06. Из тканей стеблей двух образцов различных растений, собранных в San Elijo Lagoon, Encinitas, CA, были выделены грибной штамм SGI-010-H11 и бактериальный штамм SGI-005-G08.
[0112] Выделение этих микроорганизмов производили следующим образом. Для выделения бактериального штамма ткани корней растений облучали ультразвуком и последовательно разбавляли на планшетах с 2xYT (дрожжевым экстрактом с триптоном) и с безазотистой агаровой средой. После этого по морфологическим характеристикам были отобраны индивидуальные колонии, которые индивидуально культивировали в жидкой бульонной среде. Для выделения грибов растительную ткань сначала подвергали поверхностной стерилизации погружением в 70% этанол и кратковременной обработкой в пламени. Затем ткань рассекали и помещали на картофельно-декстрозный агар (ПДА), после чего ее инкубировали при комнатной температуре. Когда начинал наблюдаться рост мицелия, сегмент мицелиальной культуры переносили на другой ПДА планшет. Штаммы микроорганизмов выделяли, очищали и хранили при -80°C в 15% глицероле для бактериальных штаммов и на высушенных семенах ячменя для грибных штаммов.
[0113] У выделенных штаммов микроорганизмов определяли способность подавлять рост мицелия F. graminearum в испытаниях на антагонизм in vitro, которые проводили на агаровых планшетах с картофельно-декстрозной агаровой (ПДА) питательной средой в соответствии с методикой высокоэффективного скрининга с небольшими модификациями, описанной в заявке (U.S. Pat. Appl. No. US20120107915A1), включенной здесь посредством ссылки. Вкратце, выделенные штаммы микроорганизмов выращивали на трипсин-соевом бульоновом агаре (ТСБА/5) с одной пятой нормальной концентрации в течение 24 ч перед употреблением. Конидиальный инокулят F. graminearum NRRL-5883 продуцировали путем гифального прищипывания активно растущей колонии гриба и переноса гифальных нитей в ПДА агаровую среду. После инкубирования планшетов в течение 7 дней при 25°C с 12 ч/день фотопериодом, конидии отмывали от ПДА планшетов с помощью слабого фосфатного буфера (0,004% фосфатный буфер, pH 7,2 с 0,019% MgCl2). Затем суспензию конидий F. graminearum в слабом фосфатном буфере (1×105 конидий/мл) сразу же распределяли по поверхности агара, и затем планшеты инкубировали при 25°C в течение 48-72 ч. Для инициации теста на антагонизм, клетки выделенных микробных штаммов точечно инокулировали на равных расстояниях внутри периметра планшета. Через пять дней штаммы отмечали как антибиоз-положительные, когда по периметру микробных колоний визуально наблюдалась светлая площадь, на которой отсутствовал мицелиальный рост.
[0114] По вышеописанной методике было выделено и проанализировано более 4000 микробных штаммов. Среди них шесть штаммов проявляли способность существенно подавлять мицелиальный рост F. graminearum NRRL-5883 на ПДА среде. Эти новые микробные антагонисты получили следующие наименования: SGI-005-G08, SGI-010-H11, SGI-014-C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06.
[0115] Вышеуказанные новые микробные антагонисты подвергались также тестированию на антагонизм по их способности подавлять рост грибного патогена Gibberella zeae, который является телеоморфным видом гриба Fusarium graminearum. Все используемые при этом методики были идентичными вышеописанным, за исключением того, что тестированным таким способом патогенным штаммом был патогенный штамм гриба Gibberella zeae. Среди этих шести микробных антагонистов четыре штамма SGI-010-H11, SGI-014-C06, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 продемонстрировали способность существенно подавлять мицелиальный рост гриба Gibberella zeae.
ПРИМЕР 2. Экстрагирование ДНК. Секвенирование и таксономия
Лизис грибных клеток и получение информации о последовательности ITS-5.8S рДНК
[0116] Грибную биомассу переносили на 96-луночный ПЦР микропланшет, содержащий 50 мкл 2× буфера для лизиса (100 мM Tris HCL, pH 8,0, 2 мM EDTA, pH 8,0, 1% SDS, 400 мкг/мл протеиназы K). Лизис проводили в следующих условиях: 55°C в течение 60 минут, 94°C в течение 4 минут. Аликвоту лизисного продукта использовали в качестве источника матричной ДНК для ПЦР амплификации. Последовательность ITS-5.8S рДНК амплифицировали с помощью ПЦР реакции с двумя праймерами M13-ITS1 (SEQ ID NO: 15) и ITS4 M13-хвост (SEQ ID NO: 16).
[0117] Для амплификации участка ITS-5.8S рДНК каждую ПЦР смесь готовили в реакционной смеси с конечным объемом 20 мкл, содержащей 4 мкл из реакционной смеси грибного лизиса, 0,2 мкM каждого праймера (ITS1/ITS4), 6% Tween-20 и 10 мкл 2× ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). ПЦР проводили в следующих условиях: 94°C в течение 10 минут; 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 75 секунд в течение 30 циклов; 72°C в течение 10 минут. 2-мкл аликвоту ПЦР продукта помещали на 1,0% агарозный гель для подтверждения одинарной полосы ожидаемого размера. Положительные полосы направляли на секвенирование по Сэнгеру в прямом и обратном направлениях с помощью M13 праймеров. Последовательность 5.8S межгенного участка (ITS) грибного штамма SGI-010-H11 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 11. Исследование гомологии для определенной нуклеотидной последовательности 5.8 S межгенного участка (ITS) проводили с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. После этого была проанализирована филогенетическая взаимосвязь нуклеотидной последовательности 5.8S межгенного участка (ITS) среди описанного здесь выделенного грибного антагониста SGI-010-H11, микроорганизмов родов и видов, демонстрирующих высокие гомологии последовательностей с выделенным грибным антагонистом SGI-010-H11, и другими разнообразными родами и видами микроорганизмов с помощью программы ClustalW строительства филогенетического дерева. Грибной штамм SGI-010-H11 считается родственным семейству Mycosphaerellaceae, если судить по ~97% сходству его последовательности ITS-5.8S рДНК с таковой у Mycosphaerellapunctiformis (GenBank EU343182) и Ramulariapratensis (GenBank EUO19284), 5.8S ITS последовательности которых демонстрируют явное родство с Mycosphaerellaceae.
Лизис бактериальных клеток и получение информации о последовательности 16S рРНК
[0118] 20 мкл аликвоту клеточной суспензия перенесли на 96-луночный ПЦР планшет, содержащей 20 мкл 2х буфера для лизиса (100 мM Tris HCL, pH 8,0,2 мM EDTA, pH 8,0,1% SDS, 400 мкг/мл Протеиназы K). Лизис проводили в следующих условиях: 55°C в течение 30 минут, 94°C в течение 4 минут. Аликвоту лизисного продукта использовали в качестве источника матричной ДНК для ПЦР амплификации. Последовательность 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР реакции с праймерами M13-27F (SEQ ID NO: 17) и 1492R M13-хвост (SEQ ID NO: 18).
[0119] Для амплификации участка 16S рРНК каждую ПЦР смесь готовили в реакционной смеси с конечным объемом 20 мкл, содержащей 4 мкл из реакционной смеси бактериального лизиса, 2 мкM каждого праймера (27F/1492R), 6% Tween-20 и 10 мкл 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). ПЦР реакцию проводили в следующих условиях: 94°C в течение 10 минут; 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 75 секунд в течение 30 циклов; 72°C в течение 10 минут. 2-мкл аликвоту ПЦР продукта поместили на 1,0% агарозный гель для подтверждения одиночной полосы ожидаемого размера. Положительные полосы направляли на секвенирование по Сэнгеру в прямом и обратном направлениях с Ml3 праймерами. Последовательности 16S рРНК бактериальных штаммов SGI-014-C06, SG1-005-G08, SGI-014-G01, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 имели длину приблизительно 1,4 Kb и представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1, 10, 12, 13 и 14, соответственно. Исследование гомологии для определенных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. После этого анализировали филогенетическую взаимосвязь нуклеотидной последовательности 16 рРНК генов среди описанных здесь выделенных бактериальных антагонистов, бактерий родов и видов, проявляющих высокие гомологии последовательностей с выделенными бактериальными антагонистами, и других разнообразных бактериальных родов и видов с помощью программы ClustalW строительства филогенетического дерева. Идентичность последовательностей и сходство определяли также с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA). Результаты анализа последовательностей показали, что бактериальный изолят SGI-014-G01 может считаться родственным роду Variovorax на основании ~99% сходства его 16S рРНК последовательности с таковыми у нескольких видов Variovorax, включая Variovorax. R-21938 (GenBank AJ786799) и Variovoraxparadoxus (GenBank GUI 86109), 16S рРНК последовательности которых демонстрируют явную родственность с видом Variovorax. Кроме того, результаты анализа последовательностей показали, что два бактериальных изолята SGI-015-F03 и SGI-015-H06 могут считаться родственными семейству Bacillaceae на основании >99% сходства их соответствующих 16S последовательностей таковым у нескольких видов Bacillus.
[0120] Результаты анализа последовательностей показали, что два бактериальных изолята SGI-014-C06 и SGI-055-G08 могут считаться родственными семейству Microbacteriaceae на основании >99% сходства их соответствующих 16S последовательностей таковым у нескольких видов Microbacterium. А именно, 1430 нт последовательность 16S рРНК гена SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) является идентичной 16S рРНК гена штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans и нескольких других штаммов Microbacterium (например, последовательностям Y17227.1, FJ200406, EU086800 и EU714335 из GenBank) на всей 1430 нт длине.
[0121] В частности, среди тысяч микробных штаммов, которые были выделены и протестированы на способность подавлять развитие Fusarium в анализе на антагонизм, как описано в Примере 1, восемьдесят восемь штаммов были вслед за этим идентифицированы как вид Microbacterium на основании подобия их 16S последовательностей таковым у известных видов Microbacterium. Однако, авторами было установлено, что супрессорной активностью против Fusarium graminearum обладали только два штамма - SGI-014-C06 и SGI-055-G08 Microbacterium. Как указывалось выше, на сегодняшний день сообщалось о нескольких микробах природного происхождения, обладающих антагонистической активностью против фузариоза. Однако до настоящего изобретения не было сообщений о микроорганизме рода Mycobacterium, обладающем антагонистической активностью. Кроме того, до настоящего изобретения его авторам не были известны способы или процессы, в которых бы использовался бактериальный штамм рода Mycobacterium в качестве агента биоборьбы по предотвращению, ингибированию или лечебной обработке по отношению к развитию патогена, являющегося возбудителем фузариоза.
ПРИМЕР 3. Анализ последовательностей обязательных генов из изолята SGI-014-C06
[0122] Недавно в работе (Richert et al. Syst. Appl. Microbiol. 30:102-108, 2007) сообщалось о филогенетических исследованиях нескольких обязательных генов из 27 видов рода Microbacterium. В этих исследованиях было сделано заключение, что хотя достоинства анализа 16S рРНК последовательностей для систематической таксономии являются непревзойденными, фокусирование внимания только на единственном таксономическом параметре не приведет к систематическим выводам. Как указывалось выше, нуклеотидная последовательность 16S рРНК гена штамма SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) является идентичной 16S рРНК гена нескольких штаммов Microbacterium, включая нуклеотидную последовательность 16S рРНК гена штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans, который был включен в исследования (Richert et al. (2007) (GenBank Accession Y17227.1)). Авторы изобретения распространили далее филогенетический анализ на четыре обязательные гена изолята SGI-014-C06, которыми являются субъединица B ДНК-гиразы (gyrB), субъединица B РНК-полимеразы (rpoE), рекомбиназа A (recA), и полифосфат-киназа (ppk). В направлении этого конца весь геном изолята SGI-014-C06 был секвенирован методом «шотган», собран и аннотирован в соответствии с методиками, описанными в (PCT Patent Application No. WO2010115156A2). Геномная ДНК была приготовлена из свежей культуры SGI-014-C06. Для экстрагирования высокомолекулярной ДНК использовались клеточная гранула и комплект для выделения ДНК UltraClean® Mega Soil DNA Isolation Kit (Cat. No 12900-10), выпускаемый MO BIO Laboratories, Inc., согласно протоколу, рекомендованному изготовителем. После этого была приготовлена геномная ДНК из SGI-014-C06 для «шотган» 454-пиросеквенирования. Геномная ДНК (7,5 мкг) использовалась для конструирования библиотеки в соответствии с рекомендованным протоколом (454 Life Sciences) для одиночных длинных ридов. Последовательности были генерированы двумя последовательными проходами секвенирования GS FLX Titanium.
[0123] Получены последовательности четырех обязательных генов gyrB, rpoB, recA, andppk изолята SGI-014-C06, приведенные в Перечне последовательностей. Исследования гомологии для определенных нуклеотидных последовательностей проводились с помощью базы данных DDBJ/GenBank/EMBL. Идентичность последовательностей и сходство также определялись с помощью программы GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. USA). Ниже более подробно показано, что результат секвенирования обязательных генов выявил новизну описанного здесь изолята SGI-014-C06, который является новым бактериальным штаммом и может считаться родственным семейству Microbacteriaceae.
[0124] Полинуклеотидная последовательность гена gyrB штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена gyrB штамма Microbacterium testaceum с номером доступа AP012052 в GenBank (82,69% по выравниванию 936/2172 нуклеотидов). По сравнению с геном gyrB штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81493; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~62% идентичными на нуклеотидном уровне и на ~37% идентичными на аминокислотном уровне.
[0125] Полинуклеотидная последовательность гена rpoB штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена rpoB штамма Microbacterium maritypicum с номером доступа AM181582 в GeneBank (96,98% по выравниванию 1093/3504 нуклеотидов). По сравнению с геном rpoB штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AM181583; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~96% идентичными на нуклеотидном уровне и на 99% идентичными на аминокислотном уровне.
[0126] Полинуклеотидная последовательность гена recA штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена recA штамма Microbacterium testaceum с номером доступа AP012052 в GeneBank (85,45% по выравниванию 962/1188 нуклеотидов). По сравнению с геном recA штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81527; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~92% идентичными на нуклеотидном уровне и на 100% идентичными на аминокислотном уровне.
[0127] Полинуклеотидная последовательность гена ppk штамма SGI-014-C06 имеет наибольшую идентичность с последовательностью гена ppk штамма Microbacterium luteolum с номером доступа AM181554 в GenBank (91,38% по выравниванию 1380/2175 нуклеотидов). По сравнению с геном ppk штамма DSM 20578 Microbacterium oxydans (GenBank AMI 81556; Richert et al., 2007), гомологии последовательностей между этими двумя генами были на ~91% идентичными на нуклеотидном уровне и на ~98% идентичными на аминокислотном уровне.
ПРИМЕР 4. Защита пшеницы от инфекции Fusarium graminearum с помощью микробных антагонистов Microbacterium . (NRRL B-50470) Mycophaerella . fNRRL 50471) и Variovorax . (NRRL B-50469)
[0128] Описанные в Примере 1 микробные штаммы, продемонстрировавшие положительную пробу на антибиоз в скрининге по антагонизму, далее были подвергнуты биоиспытаниям на растениях, в которых клетки микробных штаммов наносились непосредственно на семена восприимчивого зернового культивара с последующей инокуляцией конидиальными спорами гриба F. graminearum. Микробные штаммы выращивались до достаточной мутности и разбавлялись в воде. Два грамма семян пшеницы восприимчивого сорта (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) высеивали в однолитровые горшки с пастеризованной почвенной средой. После высеивания, поверх семян распределяли 20 мл раствора микробной культуры. Семена пшеницы выдерживали в тепличных условиях для проращивания под флуоресцентным освещением в течение 14 ч фотопериода. В начале цветения колос пшеницы подвергали заражению путем распыления конидиальных спор NRRL 5883 F. graminearum. Конидиальные споры собирали с ПДА планшетов пятидневного возраста путем выливания на планшеты воды с 0,01% Tween 20 и соскабливания спор в суспензию. После распыления спор пшеничные растения переносили в туманную камеру с 100% влажностью и выдерживали в ней в течение трех дней для инфицирования. Таким образом готовили следующие образцы:
[0129] 1. Необработанные образцы: без обработки микробным или химическим фунгицидом + заражение Fusarium.
[0130] 2. Неинфицированные образцы: без обработки микробным или химическим фунгицидом, без заражения Fusarium.
[0131] 3. SGI-010-H11: грибная обработка + заражение Fusarium.
[0132] 4. SGI-014-GO1: бактериальная обработка + заражение Fusarium.
[0133] 5. SGI-014-C06: бактериальная обработка + заражение Fusarium.
[0134] Через двадцать дней после инфицирования орошение прекращали, и пшеничным растениям давали высохнуть в течение трех недель перед сбором урожая. Затем каждый колос пшеницы срезали и собирали индивидуально. Тяжесть болезни определяли для каждого колоса, имевшего симптомы фузариоза. Численно тяжесть болезни определяли путем деления числа пораженных колосков на общее число колосков, приходившееся на один колос. Полученные результаты (таблица 2) показали, что пшеница, обработанная любым из трех микробных антагонистов SGI-014-C06 (NRRL B-50470), SGI-010-H11 (NRRL 50471) и SGI-014-G01 (NRRL B-50469), имела значительно меньшие тяжесть болезни и количество заражений Fusarium graminearum, чем «необработанный» контроль, выращиваемый в тех же самых условиях (P<0,05).
[0135] Семена с каждого колоса собирали вручную и взвешивали. Определяли средний вес семян на горшок и в каждом режиме обработки. Как показано в таблице 3, все микробные антагонисты дали значительное снижение потерь урожая, обусловленных инфицированием фузариозом.
Таблица 2
Эффективность микробных антагонистов в снижении количества заболеваний пшеницы фузариозом
Обработка Тяжесть заболевания, % Стандартное отклонение Величина P
Неинфицированный 1,30 0,0025 <0,0001
Необработанный 15,46 0,0364 Не определена
SGI-010-H11 7,42 0,0219 0,0005
SGI-014-G01 6,59 0,0315 0,0001
SGI-014-C06 7,21 0,0225 0,0004
Таблица 3
Эффективность микробных антагонистов в сохранении выхода семян в пшенице, зараженной фузариозом
Обработка Масса семени, г Величина P
Неинфицированный 0,8438±0,1633 0,0191
Необработанный 0,4669±0,1209 Не определена
SGI-010-H11 0,6200±0,1 844 0,7025
SGI-014-G01 0,7963±0,2032 0,5277
SGI-014-C06 0,6744±0,0948 0,0551
ПРИМЕР 5. Ингибирование роста Fusarium graminearum микробными антагонистами на сеянцах пшеницы
[0136] Микробные штаммы, продемонстрировавшие супрессорную активность против F. graminearum в лабораторном тесте на антагонизм, были исследованы также на их способность снижать заболеваемость фузариозом семян пшеницы. Семена восприимчивого сорта пшеницы (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) высеивали в 1-литровые пластмассовые горшки диметром 20 см с пастеризованной почвенной средой. Микробные клеточные суспензии готовили следующим образом. 2YT или другую подобную питательную среду инокулировали бульонными культурами из матричных глицериновых растворов изолятов или штриховых планшетов. Как правило, культуры инициировались за 48-72 ч до помещения их в камеру для культивирования, теплицу или на поле, где они достигали поздней экспоненциальной фазы роста. Изоляты с более длительным временем удвоения инициировались, кроме того, заранее. Культуры инкубировали при 30°C на роторном шейкере при 200 об./мин. После культивирования клетки формировались в гранулы 10000×г в течение 15 мин. при 4°C и ресуспендировались в 10 мM MgSO4 буфере (pH 7,0). Плотность клеток нормировали для каждого изолята в единицах КОЕ/мл (клеткообразующих единицах на миллилитр). Как правило, готовили ~109 КОЕ/мл суспензии для каждого изолята, которую доставляли к месту инокуляция на льду. Инокуляцию проводили путем разбавления этих клеточных суспензий в отношении 1/20 в ирригационной воде до конечной плотности 5×107 КОЕ/мл. Для опытов в 1 литровых горшках 20 мл этой разбавленной клеточной суспензии равномерно распределяли по культивационной поверхности каждого горшка. Для экспериментов в микрогоршках клеточные суспензии не разбавлялись, и 1 мл каждой 109 КОЕ/мл суспензии помещали пипеткой на культивационную поверхность каждого горшка подобно опрыскиванию по верху погруженных семян. Семена и растения выдерживались в теплице при комнатной температуре с 14-ти часовым фотопериодом освещения.
[0137] Мицелий штамма NRRL-5883 вида Fusarium graminearum выращивали на ПДА планшетах в течение 5 дней при непрерывном освещении. Гифы и конидии собирали путем выливания нескольких миллилитров стерильной воды (0,01% Tween 20) на планшеты и соскабливания поверхности агара стерильным шпателем. Концентрация спор в инокуляте составляла приблизительно 2×105 спор/мл, однако концентрация гифального фрагмента не определялась.
[0138] Инокуляцию видом F. graminearum начинали после выхода коротких ростков из семян и повторяли каждый второй вечер на протяжении 10 дней. Инокулят F. graminearum наносили путем разбрызгивания в количестве приблизительно 30 мл на горшок. Сразу после инокуляции, всякий раз растения опрыскивали сверху с помощью туманообразователя. При использовании химического фунгицида его готовили путем разбавления 2 мл фунгицидного исходного раствора (Banner Maxx, Syngenta) в 1 л дистиллированной воды и наносили с помощью разбрызгивателя в количестве приблизительно 30 мл на горшок.
[0139] Фузариозное поражение оценивали по степени Fusarium инфицирования, определяя ее числом Fusarium колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) растительных тканей. Все операции обработки выполнялись в четырех блоках по четыре горшка в каждом. Проводились следующие виды обработки:
[0140] 1. Необработанный: без обработки микробным или химическим фунгицидом + заражение Fusarium.
[0141] 2. Неинфицированный: без обработки микробным или химическим фунгицидом и без заражения Fusarium.
[0142] 3. Фунгицид: обработка химическим фунгицидом + заражение Fusarium.
[0143] 4. SGI-010-H11: грибная обработка + заражение Fusarium.
[0144] 5. SGI-014-G01: бактериальная обработка + заражение Fusarium.
[0145] 6. SGI-014-C06: бактериальная обработка + заражение Fusarium.
[0146] Полученные результаты, которые приведены в таблице 4, показали, что все три микробные обработки дали значительное снижение тяжести фузариоза по сравнению с неинфицированным контролем. В частности, два микробных антагониста, SGI-014-C06 и SGI-010-H11, значительно снизили инфицирование пшеницы видом Fusarium graminearum по сравнению с необработанным контролем, выращиваемым в таких же самых условиях. Защита пшеницы от Fusarium-инфицирования, осуществляемая любым из двух микроорганизмов - SGI-014-C06 или SGI-010-H11, была статистически сравнимой с защитой продажным химическим фунгицидом. При использовании микроорганизма SGI-014-G01 наблюдаемая защита пшеницы от Fusarium-инфицирования была намного менее заметной, а ее эффективность существенно изменялась от одного культивационного горшка к другому.
Таблица 4
Действие микробных антагонистов на инфицирование грибом Fusarium
Обработка КОЕ/г Величина P
Необработанный 1487±600 Не определена
Неинфицированный 0±0 <0,0001
Химический фунгицид 290±146 <0,0001
SGI-010-H11 671±450 0,0077
SGI-014-G01 1246±465 0,8387
SGI-014-C06 367±234 0,0001
ПРИМЕР 6. Культивирование и хранение микробных антагонистов
[0147] Вид Mycosphaerella. Для хранения выделенного гриба в качестве чистой культуры использовали несколько способов, в одном из которых применяли фильтровальную бумагу. В другом случае, после культивирования гриба на ПДА его разрезали на маленькие квадраты, которые помещали во флакончики с 15% раствором глицерола и сохраняли в них при -70°C. В аналогичном опыте этот гриб хранили при 4°C, но не в глицероле, а в дистиллированной воде. Однако одним из предпочтительных способов было хранение на инфицированных стерильных семенах ячменя при -80°C.
[0148] Виды Bacillus, Microbacterium и Variovorax. Выделенные бактерии сохранялись как чистая культура. Бактериальную колонию переносили в флакончик с жидкой бульонной средой R2A (Tecknova) и культивировали в нем при 30°C на шейкере при скорости 250 об./мин. в течение двух дней. После этого культуру переносили во флакончики с 15% раствором глицерола и сохраняли в них при -80°C.
ПРИМЕР 7. Обработка для продуцирования спор и нанесения покрытия на семена
[0149] Продуцирование спор. В соответствии с типовой методикой продуцирования спор, один литр питательной среды 2xYT (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl) инокулировали стартерной культурой в количестве 5 мл или соскобом чашки Петри и инкубировали в течение ночи при 30°C в ротационном шейкере со скоростью 225 об./мин. Бактериальные клетки гранулировали путем центрифугирования и промывали 1x ЗФР буфером (8 г/л NaCl; 0,2 г/л KC1; 1,44 г/л Na2HPO4; 0,24 г KH2PO4; pH 7,4). Клетки ресуспендировали в среде CDSM (Hageman et al, J. Bacterial., 438-441, 1984), и культивировали еще в течение четырех ночей при 30°C в ротационном шейкере. Споруляцию в бактериальной культуре контролировали ежедневно с помощью фазоконтрастного микроскопа до тех пор, пока не образовалась вся культура из свободно плавающих спор. Продолжительность такого инкубирования, как правило, не превышает четырех дней или же длится более шести дней, в зависимости от культивируемого вида. Под фазоконтрастным микроскопом эндоспоры видны внутри клеток в виде ярко-белых сплющенных сфероидов. Бактериальные споры гранулировали путем центрифугирования в режиме 10000 X г в течение 15 минут, дважды промывали стерильной dH2О и, при необходимости, концентрировали до 50 мл, и могли либо сразу использоваться, либо охлаждаться для использования в будущем. Концентрацию спор измеряли по методике OD600. Эта методика, как правило, давала по меньшей мере 2000 OD бактериальных спор.
[0150] В частности, несколько бактериальных штаммов в соответствии с изобретением, например, SGI-015-F03 вида Bacillus, могут продуцировать большие количества спор после 4 дней инкубации с простой инокуляцией большой, росшей в течение ночи стартерной культурой (~15 мл) в 1 л 2хSG питательной среды с последующей 4-дневной инкубацией при соответствующей температуре в ротационном шейкере в режиме 225 об./мин. Использовалась питательная среда 2хSG следующего состава: 16 г/л питательный бульон; 0,25 г/л MgSO4; 2,0 г/л KCl; 0,15 г/л CaCl2.2H2O; 0,025 г/л MnCl2.2H2O; 0,28 мг/л FeSO4-7H2O; 1,0 г/л декстрозы.
[0151] Нанесение покрытия на семена пшеницы и кукурузы. Проводили маломасштабный эксперимент по обработке семян в соответствии с минимально модифицированной методикой, описанной в (Sudisha et al., 2009). Как правило, готовили маточный раствор биополимера путем добавления 6 г порошка гуммиарабика (MP Biomedical) в 36 мл воды в 50 мл пробирке Falcon и последующего перемешивания до гомогенности с помощью колесного миксера. Для перемешивания больших количеств покрываемых семян, где необходимо, использовали смесительную плиту.
[0152] Если использовали растительные клетки, то мутные культуры активно растущих микробных клеток промывали ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором) и доводили до OD600~5,0. В альтернативном варианте микробные споровые суспензии готовили так, как описано выше. Бактериальные споры и/или растительные клетки тщательно ресуспендировали в ~32 мл гуммиарабик-биoполимерного маточного раствора, приготовленного так, как описано выше, и полученную суспензию тщательно перемешивали в 1 л бутыли. В бутыль добавляли приблизительно 400 г семян (пшеницы или кукурузы) и интенсивно перемешивали на шейкере или вихревом встряхивателе до достижения равномерного распределения гумми/клеточной суспензии. Затем покрытые семена распределяли по пластмассовым блюдцам для сушки в ламинарном потоке до устранения липкости, в общем случае в течение 3-6 ч с периодическим перемешиванием. В некоторых случаях, покрытые спорами семена можно сушить в течение ночи. Однако, семена, покрытые растительными культурами, как правило, отправлялись на хранение до того, как они полностью обезвоживались. Тест на жизнеспособность, которому периодически подвергались микробы, используемые в препаратах покрытий на семенах, показал, что эти микробы сохраняли жизнеспособность в течение по меньшей мере трех месяцев. Скорость прорастания покрытых семян была практически идентичной таковой у непокрытых контрольных семян.
ПРИМЕР 8. Влияние микробной обработки семян на развитие фузариоза в пшенице
[0153] Семена восприимчивого к фузариозу сорта (RB07) пшеницы покрывались микроорганизмами SGI-014-C06 или SGI-015-F03, или SGI-015-H06 в соответствии с методикой, описанной в Примере 8. Покрытые семена высевали в 1 л горшки с пастеризованной почвенной средой [(Metromix-Mix 200; Scotts-Sierra Horticultural Products, Marysville, OH; и 3 грамма удобрения 14-14-14 (N-P-K)]. Горшки засеменялись по 7-8 растений в каждом, после чего, в фазу роста 3-го листа, их засеменение уменьшали до 5 растений на горшок. Горшки объединяли в рандомизированные блоки по 5 горшков на обработку. Далее, покрытые семена ставили для прорастания в тепличные условия с флуоресцентным освещением в течение 16 ч в сутки. Когда началось цветение пшеницы, ее путем разбрызгивания на колос заражали макроконидиальными спорами штамма NRRL 5883 вида F. graminearum в концентрации 100000 спор/мл. После разбрызгивания спор пшеницу помещали в климатическую камеру с 100% влажностью и образованием росы, и выдерживали в этих благоприятных для инфицирования условиях в течение трех дней. Проводили такие виды обработки образцов:
[0154] 1. Необработанный: без микробной или химической фунгицидной обработки + заражение Fusarium.
[0155] 2. SGI-014-C06: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.
[0156] 3. SGI-015-F03: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.
[0157] 4. SGI-015-H06: бактериальная обработка семян + заражение Fusarium.
[0158] Тяжесть фузариоза оценивали визуально на десятый день и двадцать первый день после инфицирования. Степень инфицирования определяли для каждого колоска, проявляющего симптомы фузариоза, и вычисляли процент симптоматических колосков, то есть умноженное на 100 число колосков, демонстрирующих симптомы фузариоза, делили на общее число колосков. Полученные результаты (таблица 5) показали, что семена пшеницы, покрытые любым из трех тестируемых микробных антагонистов - SGI-014-C06, SGI-015-F03, SGI-015-H06, имели значительно пониженную степень инфицирования грибом Fusarium graminearum по сравнению с «необработанным» контролем, выращиваемым в таких же самых условиях (P<0,05).
Таблица 5
Развитие симптомов фузариоза в пшенице после обработки семян антагонистическими микроорганизмами
Обработка Степень инфицирования, %
На 10 день после инфицирования На 21 день после инфицирования
Необработанный контроль 49,31 66,10
SGI-014-C06 2,08 7,74
SGI-015-F03 23,12 31,53
SGI-015-H06 9,42 19,81
ПРИМЕР 9. Биоборьба с фузариозом пшеницы в тепличных испытаниях
[0159] Каждый из микроорганизмов SGI-014-C06, SGI-015-F03 и SGI-015-H06 тестировали в тепличных испытаниях большего масштаба. Испытания проводили в «теплице для культивирования растений» (PGCR: plant growth containment room) при фирме Synthetic Genomics, Inc., и включали такие виды лечебной обработки: инфицированный контроль, неинфицированный контроль, а также обработку промышленными фунгицидами четырех марок. Среди них были: химические фунгициды марок Banner MAXX® (Syngenta) с концентрацией 2 мл/л и Prosaro® (Bayer CropScience) с концентрацией 3 мл/л, которые наносились путем распыления на листья в соответствии с рекомендациями изготовителя, и биологические фунгициды марок Actinovate® (Natural Industries) и RhizoVital® (ABiTEP GmbH), которые наносились путем опрыскивания почвы также в соответствии с рекомендациями изготовителя.
[0160] Препарат для микробной обработки наносили либо путем опрыскивания почвы, либо путем покрытия семени. Когда микробную обработку проводили путем опрыскивания почвы, клеточные суспензии каждого микроорганизма индивидуально наносили на семена перед покрытием их большим количеством питательной среды. Для этого, свежеприготовленные культуры гранулировали, удаляя с них питательные вещества, и повторно суспендировали в 10 мM сульфат-магниевого (MgSO4) буфера. После этого клеточные суспензии добавляли путем пипетирования и равномерного распределения 20 миллилитров суспензии по семенам при общем количестве ~109 клеток на горшок. В случае микробной обработки путем нанесения покрытий на семена, микроорганизмы (клетки/споры) готовили по существу так, как описано выше, в Примере 8. Покрытые семена получали путем введения в клеточную суспензию раствора гуммиарабика и, таким образом, создания липкой смеси для последующего нанесения ее на семена. После этого микробное покрытие семян просушивали, в результате чего образовывался твердый, но водорастворимый, биополимер захватывающий микроорганизмы (клетки/споры). Цель этих манипуляций состояла в том чтобы обеспечить титр клеток по меньшей мере 106-107 жизнеспособных клеток/семя. В этом тепличном эксперименте покрытие на семена наносили за день до посева.
[0161] Для каждого вида обработки было предусмотрено четыре одинаковых комплекта образцов, размещенных по рандомизированной полнооблочной схеме проведения эксперимента (RCBD: Randomized Complete Block Design) на трехуровневых полках, расположенных в два ряда вдоль боковых сторон теплицы. Полки были оборудованы флуоресцентной системой освещения (Agrosun, 5850K), которая обеспечивала освещенность в среднем 800 мкмоль, измеренную на поверхности горшка. Каждый комплект образцов состоял из четырех неподвижно установленных 1 л горшков. Горшки наполняли искусственной питательной средой, состоящей из питательной среды на основе резуховидки Arabidopsis Growth Medium AIS (от фирмы Lehle Seeds) и крупного промытого песка в объемном соотношении 3:1. Во всех горшках по поверхности питательной среды распределяли по два грамма семян яровой пшеницы (Hank, WestBred). Горшки имели донную подачу воды с поддержанием ~2 см уровня воды и визуально контролировались на прорастание и рост.
[0162] В фазу цветения (по системе идентификации роста и развития зерновых культур Feekes 10.5.1) колос пшеницы инфицировали распылением суспензии конидиальных спор Fusarium graminearum. Для этого тепличного эксперимента споры грибов готовили путем посадки гомогенизированного мицелия штамма NRRL 5883 F. graminearum на большие ПДА планшеты и последующей пятидневной инкубации в условиях непрерывного освещения при комнатной температуре. После этого грибные споры собирали путем заливки планшетов магний-сульфатным буфером (10 мM MgSО4; 0,01% Tween 20) и соскабливания поверхности агара стерильным шпателем. После регулирования концентрации спор, их в количестве приблизительно 50000 конидиальных спор на один колос наносили на растения с помощью ручного распылителя. Относительную влажность в теплице повышали до 90% и выдерживали в течение трех дней для инфицирования, а затем возвращали на нормальный уровень. После того как семена пшеницы завязались, подачу воды прекратили и колоскам дали возможность полностью высохнуть. Затем колосья пшеницы собирали каждый индивидуально. Тяжесть заболевания определяли для каждого колоса, имевшего симптомы фузариоза, путем подсчета числа пораженных колосков и деления его на общее число колосков, приходящееся на один колос. Полученные результаты (таблица 6) показали, что пшеница, обработанная любым из трех тестируемых микробных антагонистов, SGI-014-C06, SGI-015-F03, SGI-015-H06, имела значительно меньшую тяжесть и количество инфикаций Fusarium graminearum по сравнению с «необработанным» контролем, выращиваемым в таких же самых условиях (P<0,05).
Таблица 6
Эффективность микробных антагонистов в уменьшении заболеваемости пшеницы фузариозом
Обработка Степень инфицирования, % Защита от инфекции, %
Неинфицированный 2,1±2,9 Не определена
Инфицированный 37,2±9,8 0,00
Prosario® 4,6±2,8 93,00
Banner-MAXX® 12,5±5,8 70,00
Actinovate® 38,9±12,1 -5,00
Rhizo Vital® 28,0±5,4 26,00
SGI-014-C06 18,4±9,1 30,00
SGI-015-F03 25,4±6,9 54,00
SGI-015-H06 26,6±7,4 34,00
[0163] Для определения выхода семян, каждый колос пшеницы срезали вручную, семена собирали и очищали от шелухи и других детритов, посчитывали и взвешивали. Общий выход семян определяли как общую массу семян, полученных от растений в 16 горшках для каждого вида обработки. Как показано в таблице 7, все три тестированных микробных антагониста продемонстрировали существенное сохранение выхода семян, то есть потери семян, обусловленные фузариозной инфикацией, были значительно снижены.
Таблица 7
Эффективность микробных антагонистов в сохранении выхода семян пшеницы, пораженной фузариозом
Обработка Общий выход семян, г Защита выхода семян, %
Неинфицированный 14,36 Не определено
Необработанный 11,05 0,00
Prosario® 13,44 72,00
Banner-MAXX® 14,41 102,00
Actinovate® 11,99 28,00
RhizoVital® 12,65 48,00
SGI-014-C06 14,70 110,00
SGI-015-F03 15,03 120,00
SGI-015-H06 14,14 93,00
[0164] Таким образом, обработка пшеницы любым из рассмотренных микроорганизмов позволила заметно предохранить выход семян от потерь, вызываемых Fusarium инфицированием. В частности, пшеница, обработанная любым из штаммов SGI-014-C06 или SGI-015-F03, продемонстрировала существенное улучшение общего выхода семян, то есть 110% и 120%, соответственно, по сравнению с неинфицированным контролем. В противоположность этому, продажные фунгициды марок Actinovate®, RhizoVital® и Prosario® не продемонстрировали существенной защиты урожая обработанной ими пшеницы от потерь, вызываемых инфикацией Fusarium.
ПРИМЕР 10. Биоборьба с фузариозом пшеницы в полевых условиях
[0165] Антагонистические микроорганизмы, проявившие свою супрессорную активность против патогена F. graminearum и фузариоза в анализе на антагонизм in vitro и в тепличных исследованиях, описанных в Примерах 4-9, продолжают исследоваться далее, в серии полевых испытаний в различных географических ареалах на территории Соединенных Штатов. Некоторые эксперименты проводятся на сельскохозяйственных площадях, которые используются для микробиологической борьбы с фузариозом пшеницы, где происходит природное инфицирование этим заболеванием. В этих испытаниях используются сорта пшеницы, чувствительные к заражению грибом F. graminearum. В этих испытаниях, пшеницу, обработанную различными методами, высевают на небольших участках из 12 рядов, длиной около 3 метров. Промежуток между рядами равен приблизительно 20 см. Обработанные участки в каждом эксперименте вносятся в рандомизированную блочную схему. Оценивается также эффективность различных композиций из смачиваемых порошков, содержащих микробные антагонисты в соответствии с изобретением, в снижении тяжести и количества случаев инфицирования фузариозом. В этих экспериментах, микробные антагонисты оцениваются как индивидуально, так и в комбинациях.
[0166] В этих испытаниях антагонистические микроорганизмы оцениваются в различных покрытиях на семенах и/или в полевых условиях, где микробные суспензии наносят непосредственно на цветущие пшеничные колосья. В каждом из этих экспериментов микроорганизмы оцениваются на идентичных участках. В экспериментах могут использоваться антагонисты, патогены и методы аграрного производства, описанные в Примерах 4-9.
[0167] Нанесение покрытия на семена. Помимо способов нанесения покрытий на семена, описанных выше, в Примере 7, могут приспосабливаться самые различные известные технологии и препараты для обработки семян пшеницы микробными антагонистами, например, описанные в работах (Fernando et al, 2002; Bello et al., 2002; Kim et al, 1997). В общем случае, семена пшеницы вначале увлажняют и выдерживают при комнатной температуре для инициации прорастания. Перед высеванием проросшие семена можно погружать в микробные суспензии. Патогенные споры можно инокулировать либо до бактериальной инокуляции либо после нее. Способы приготовления антагонистов, патогенов и растений для такой обработки семян могут быть такими, как описано в Примерах 4 и 5.
[0168] Оценка тяжести заболевания и выхода семян.
Антагонисты поддаются дальнейшим оценкам в тепличных условиях на их супрессорную активность против фузариоза на пшенице и ячмене в фазе цветения с помощью самых различных способов и методик, включая описанные, например, в (Schisler, Plant Disease, Vol 86(12), 1350-1356, 2002; Schisler et al. Biological Control, 39:497-506,2006; and Khan and Doohan, Biological Control, 48:42-47,2009). В одном из таких экспериментов инокуляты штамма G. zeae готовят на стерильной, желтозерновой кукурузе, как описано в (Khan et al. Biological Control, 29:245-255, 2004). Полностью колонизированные липидные культуры (48-часовая культивация) микробных штаммов разбавляют до одной четвертой концентрации фосфатным буфером. Конечное число КОЕ на мл для антагонистической обработки составляет от 1×109 КОЕ/мл до 6×109 КОЕ/мл. После этого к колосьям цветущей пшеницы применяется обработка суспензиями с помощью CO2 ручного распылителя. Обработку, как правило, производят после захода солнца для снижения до минимума возможную УФ деградацию антагонистических клеток. Готовят 5 репликатов (групп образцов-копий) на одну обработку, вносимых в рандомизированную блок-схему. Первым контролем обработки являются растения, обработанные буферным раствором. Вторым контролем обработки являются необработанные растения. Оценка тяжести инфицирования и заболеваемости фузариозом в полевых условиях производится путем подсчета 60 колосьев на репликат (то есть 300 колосьев/обработку), где развитие растения происходит от фазы средней молочной спелости и до фазы мягкой восковой спелости. Когда зерна достигают полной зрелости, колосья пшеницы собирают вручную и обмолачивают с помощью молотилки марки Almaco для единичных растений и колосьев (Almaco, IA). Образцы зерен, полученные из каждого ряда репликатов, оцениваются по весу 100 зерновок. Данные по тяжести заболевания, заболеваемости и весу 100 зерновок анализируют методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).
[0169] Композиции, содержащие микробные антагонисты согласно изобретению, индивидуально или в комбинации, демонстрируют значительное снижение заболеваемости. Эти результаты являются свидетельством того, что биологический метод борьбы с помощью данных активных микробных агентов может играть важную роль в борьбе с паршой зерновых растений, таких как пшеница.
ПРИМЕР 11. Разработка культиваров неприродного происхождения и программ по их селекционированию
[0170] Эндофитные микроорганизмы в соответствии с изобретением вводятся в культурные растения, включая зерновые культуры, различных генотипов и географического происхождения. Однако подобные им эндофитные микроорганизмы, с которыми бы можно было создавать растение-эндофитных комбинации с улучшенными агрономическими характеристиками с помощью методик, аналогичных известным в данной отрасли методикам, включая, среди прочих, методики, описанные в (U.S. Pat Appl. No. 20030195117A1; U.S. Pat. Appl. No. 20010032343A1; и U.S. Pat. No. 7084331), отсутствуют. Таким образом, требуемые искусственные растение-эндофитные комбинации могут создаваться и селектироваться по программе селекции и разработке культиваров на базе их способности образовывать и поддерживать мутуалистическую комбинацию, дающую в итоге агрономический эффект. В такой селекционной программе может использоваться также рейтинг агрономических характеристик данной комбинации. В число этих характеристик могут входить, например, засухоустойчивость, аккумулирование биомассы, стойкость к инфицированию насекомыми, поедаемость скотом (например, травоядными), легкость репродукции, выход семян и др. Такие комбинации могут различаться по уровню аккумулирования микробных метаболитов, являющихся токсичными к сельскохозяйственным вредителям и сорнякам, включая уровни эргот-алкалоидов, уровни лолина, уровни перамина или уровни лолитрема, и демонстрировать при этом требуемые агрономические характеристики возделываемых растений, включая стойкость к инфицированию или поеданию насекомыми, стойкость к абиотическому стрессу, поедаемость скотом, аккумулирование биомассы, легкость размножения и выход семян и др.
[0171] Здесь дано описание множества вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, вполне понятно, что элементы описанных здесь вариантов осуществления изобретения могут объединяться в комбинации, образовывая новые варианты осуществления изобретения и его различные модификации, которые не выходят за рамки идеи и объема настоящего изобретения. Следовательно, все другие варианты осуществления изобретения, альтернативы и эквиваленты охватываются объемом изобретения в соответствии с данным описанием изобретения и его формулой.
[0172] Заглавие в настоящей заявке дано исключительно для облегчения восприятия читателем и никоим образом не ограничивает объема изобретения или вариантов его осуществления.
[0173] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены здесь посредством ссылки в такой же мере, как если бы каждая публикация или патентная заявка индивидуально указывалась как включенная посредством ссылки.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> SYNTHETIC GENOMICS, INC.
GRANDLIC, CHRISTOPHER J.
GREEN, WAYNE A.
KEROVUO, JANNE S.
MCCANN, RYAN T.
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С ФУЗАРИОЗОМ
<130> SGI1520-1WO
<150> US 61/511,467
<151> 2011-07-25
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1430
<212> ДНК
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует 16S рибосомную РНК
<400> 1
acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacggtga acacggagct tgctctgtgg60
gatcagtggc gaacgggtga gtaacacgtg agcaacctgc ccctgactct gggataagcg 120
ctggaaacgg cgtctaatac tggatatgtg acgtgaccgc atggtctgcg tctggaaaga 180
atttcggttg gggatgggct cgcggcctat cagcttgttg gtgaggtaat ggctcaccaa 240
ggcgtcgacg ggtagccggc ctgagagggt gaccggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag 360
caacgccgcg tgagggacga cggccttcgg gttgtaaacc tcttttagca gggaagaagc 420
gaaagtgacg gtacctgcag aaaaagcgcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtagggcg caagcgttat ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggtttgtc 540
gcgtctgctg tgaaatccgg aggctcaacc tccggcctgc agtgggtacg ggcagactag 600
agtgcggtag gggagattgg aattcctggt gtagcggtgg aatgcgcaga tatcaggagg 660
aacaccgatg gcgaaggcag atctctgggc cgtaactgac gctgaggagc gaaagggtgg 720
ggagcaaaca ggcttagata ccctggtagt ccaccccgta aacgttggga actagttgtg 780
gggtccattc cacggattcc gtgacgcagc taacgcatta agttccccgc ctggggagta 840
cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg cggagcatgc 900
ggattaattc gatgcaacgc gaagaacctt accaaggctt gacatatacg agaacgggcc 960
agaaatggtc aactctttgg acactcgtaa acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgttctat gttgccagca 1080
cgtaatggtg ggaactcatg ggatactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac 1140
gtcaaatcat catgcccctt atgtcttggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa 1200
gggctgcaat accgcgaggt ggagcgaatc ccaaaaagcc ggtcccagtt cggattgagg 1260
tctgcaactc gacctcatga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg 1320
tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcaagt catgaaagtc ggtaacacct 1380
gaagccggtg gcctaaccct tgtggaggga gccgtcgaag gtgggatcgg 1430
<210> 2
<211> 2172
<212> ДНК
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI Ген ID SG1MICG850682
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует пептидную последовательность SED ID NO 3
<400> 2
gtgtctgcgg ccggagagcg gctgtcgaga atagactcgg agattgtgaa tgccgagtat60
tccgcccatc atctccaggt gcttgagggg ctcgaagctg tccgcaagcg cccgggcatg 120
tacatcgggt cgaacggctc gccgggcctc atgcactgcc tttgggagat catcgacaac 180
tctgtcgacg aggcggtggc aggcaacggc acgaagatcg acatcatcct gcactccgac 240
ggcagcgtcg aggtgcacga ccgcggtcgc ggcatccctg tcgacgtcga gccgcgcacc 300
ggtctcaccg gtgtcgaggt cgtctacacc aagctgcacg ccggaggaaa gttcggcggc 360
ggctcgtacg cggcatccgg tggactgcac ggtgtcggcg cctccgtcgt gaacgcgctc 420
tccgagcgcc tcgacgtcga ggtcgaccgc gggggcaaga cctacgcgat gtcgttccat 480
cgcggtgagc ccggcatctt cacggactcc ggcgagaagc ggccggacgc cccgttcacg 540
ccgttcgagg agaacagcga gctgcgcgtc atcggcaagg cgccgcgtgg cgtgaccggc 600
acccgggtgc gctactgggc cgaccggcag atcttcacca aggatgcggc gttccagctc 660
tcggagctcg agacccgcgc acgccagacg gcgttcctcg ttcccggtct cgagatcgtc 720
gtcaaggacg cacgggcggc cggtcaggtc atccccgtcc cggactccga cggcgagacg 780
accgtcgtcg ggaccgatga gacctcgtac ctctacgagg gcggcatctc cgagttcgtc 840
gagtacctcg ccatcgaccc tcccgtgacc gacacctggc gtatccaggg cgagggcatg 900
ttcaaggaga ccgtgcccgt cctgcaggca gacggccaca tggtcgccac cgaggtggag 960
cgtgtgtgcg ccgtcgacat cgcgctgcgc tgggggaccg gctacgacac ccgtgtgcgc 1020
tccttcgtga acatcatcgc gacgcccaag ggcggaaccc accagcaggg cttcgagcag 1080
gagctcctga aggtgctgcg ctcccaggtc gagcagaacg cccgccgtct gaaggtcggc 1140
aacgacaagc tggagaagga cgacgtcctc gccggcctca ccgccgtgct cacggtcaac 1200
gtgccggagc cgcagttcga gggccagacc aaggaagtgc tcggcacccc cgcggtgcgg 1260
cagatcgtgg cgcaggtgat ccgtaaggat ctggcgcagc gcttcagctc gaccaagcgc 1320
gacgacaaga accaggccac acagctgctc gacaagatcg tctccgagat gaaggcccgt 1380
gtctcggcgc gcgcccacaa ggagacgcag cgccgcaaga acgcgctgga gtcgtcgacg 1440
ctgccgacca agctcgtcga ctgccgcacg aacgaggtcg agcgcagcga gctcttcatc 1500
gtggagggcg actcggctct cggcaccgcc aagaacgcgc gcaacagcga gttccaggcg 1560
ctgctcccga tccgagggaa gatcctcaac gtgcagaagg cctctgtcgg cgacatgctg 1620
tcgaacaccg agtgcgcgtc gatcatccag gtgatcggcg ccggatccgg acgcaccttc 1680
gacatcgatg cggcgcgcta cggcaaggtg atcctgatga gcgacgccga tgtcgacggc 1740
gcgcacatcc gtaccctgct gctcacgctg ttcttccgct acatgcgacc gctgatcgag 1800
cacgggcgtg tgttcgccgc ggtgccgccg ttgcaccggg tgatcgtgat gaacccgggg 1860
tccaagccga acgagacgat ctacacctac agcgagcagg agatgcacgc gctgctggcg 1920
aagctccgca aggccggcaa gcgctggcac gagccgatcc agcgctacaa gggtctcggt 1980
gagatggacg cggaacagct cgcgaacacc accatggacc gctccggccg tctgctgcgc 2040
cgtgtgcgca tggaagacgc cgaggccgcc ggtcgcgtgt tcgagctgct gatgggcaac 2100
gaggtcgcgc cgcgccgcga gttcatcatc gactcctccg accggttgtc gcgcgagtcc 2160
atcgacgcct ga 2172
<210> 3
<211> 723
<212> ПРОТЕИН
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI пептид ID SG1MICT850682
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> субъединица гиразы B
<400> 3
Met Ser Ala Ala Gly Glu Arg Leu Ser Arg Ile Asp Ser Glu Ile Val
1 5 10 15
Asn Ala Glu Tyr Ser Ala His His Leu Gln Val Leu Glu Gly Leu Glu
20 25 30
Ala Val Arg Lys Arg Pro Gly Met Tyr Ile Gly Ser Asn Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Leu Met His Cys Leu Trp Glu Ile Ile Asp Asn Ser Val Asp Glu
50 55 60
Ala Val Ala Gly Asn Gly Thr Lys Ile Asp Ile Ile Leu His Ser Asp
65 70 75 80
Gly Ser Val Glu Val His Asp Arg Gly Arg Gly Ile Pro Val Asp Val
85 90 95
Glu Pro Arg Thr Gly Leu Thr Gly Val Glu Val Val Tyr Thr Lys Leu
100 105 110
His Ala Gly Gly Lys Phe Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Ala Ser Gly Gly
115 120 125
Leu His Gly Val Gly Ala Ser Val Val Asn Ala Leu Ser Glu Arg Leu
130 135 140
Asp Val Glu Val Asp Arg Gly Gly Lys Thr Tyr Ala Met Ser Phe His
145 150 155 160
Arg Gly Glu Pro Gly Ile Phe Thr Asp Ser Gly Glu Lys Arg Pro Asp
165 170 175
Ala Pro Phe Thr Pro Phe Glu Glu Asn Ser Glu Leu Arg Val Ile Gly
180 185 190
Lys Ala Pro Arg Gly Val Thr Gly Thr Arg Val Arg Tyr Trp Ala Asp
195 200 205
Arg Gln Ile Phe Thr Lys Asp Ala Ala Phe Gln Leu Ser Glu Leu Glu
210 215 220
Thr Arg Ala Arg Gln Thr Ala Phe Leu Val Pro Gly Leu Glu Ile Val
225 230 235 240
Val Lys Asp Ala Arg Ala Ala Gly Gln Val Ile Pro Val Pro Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Glu Thr Thr Val Val Gly Thr Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr
260 265 270
Glu Gly Gly Ile Ser Glu Phe Val Glu Tyr Leu Ala Ile Asp Pro Pro
275 280 285
Val Thr Asp Thr Trp Arg Ile Gln Gly Glu Gly Met Phe Lys Glu Thr
290 295 300
Val Pro Val Leu Gln Ala Asp Gly His Met Val Ala Thr Glu Val Glu
305 310 315 320
Arg Val Cys Ala Val Asp Ile Ala Leu Arg Trp Gly Thr Gly Tyr Asp
325 330 335
Thr Arg Val Arg Ser Phe Val Asn Ile Ile Ala Thr Pro Lys Gly Gly
340 345 350
Thr His Gln Gln Gly Phe Glu Gln Glu Leu Leu Lys Val Leu Arg Ser
355 360 365
Gln Val Glu Gln Asn Ala Arg Arg Leu Lys Val Gly Asn Asp Lys Leu
370 375 380
Glu Lys Asp Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Val Leu Thr Val Asn
385 390 395 400
Val Pro Glu Pro Gln Phe Glu Gly Gln Thr Lys Glu Val Leu Gly Thr
405 410 415
Pro Ala Val Arg Gln Ile Val Ala Gln Val Ile Arg Lys Asp Leu Ala
420 425 430
Gln Arg Phe Ser Ser Thr Lys Arg Asp Asp Lys Asn Gln Ala Thr Gln
435 440 445
Leu Leu Asp Lys Ile Val Ser Glu Met Lys Ala Arg Val Ser Ala Arg
450 455 460
Ala His Lys Glu Thr Gln Arg Arg Lys Asn Ala Leu Glu Ser Ser Thr
465 470 475 480
Leu Pro Thr Lys Leu Val Asp Cys Arg Thr Asn Glu Val Glu Arg Ser
485 490 495
Glu Leu Phe Ile Val Glu Gly Asp Ser Ala Leu Gly Thr Ala Lys Asn
500 505 510
Ala Arg Asn Ser Glu Phe Gln Ala Leu Leu Pro Ile Arg Gly Lys Ile
515 520 525
Leu Asn Val Gln Lys Ala Ser Val Gly Asp Met Leu Ser Asn Thr Glu
530 535 540
Cys Ala Ser Ile Ile Gln Val Ile Gly Ala Gly Ser Gly Arg Thr Phe
545 550 555 560
Asp Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Val Ile Leu Met Ser Asp Ala
565 570 575
Asp Val Asp Gly Ala His Ile Arg Thr Leu Leu Leu Thr Leu Phe Phe
580 585 590
Arg Tyr Met Arg Pro Leu Ile Glu His Gly Arg Val Phe Ala Ala Val
595 600 605
Pro Pro Leu His Arg Val Ile Val Met Asn Pro Gly Ser Lys Pro Asn
610 615 620
Glu Thr Ile Tyr Thr Tyr Ser Glu Gln Glu Met His Ala Leu Leu Ala
625 630 635 640
Lys Leu Arg Lys Ala Gly Lys Arg Trp His Glu Pro Ile Gln Arg Tyr
645 650 655
Lys Gly Leu Gly Glu Met Asp Ala Glu Gln Leu Ala Asn Thr Thr Met
660 665 670
Asp Arg Ser Gly Arg Leu Leu Arg Arg Val Arg Met Glu Asp Ala Glu
675 680 685
Ala Ala Gly Arg Val Phe Glu Leu Leu Met Gly Asn Glu Val Ala Pro
690 695 700
Arg Arg Glu Phe Ile Ile Asp Ser Ser Asp Arg Leu Ser Arg Glu Ser
705 710 715 720
Ile Asp Ala
<210> 4
<211> 3504
<212> ДНК
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI Ген ID SG1MICG850290
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует пептидную последовательность SEQ ID NO 5
<400> 4
ttggctgctg ctcgcaacgc atccacatcc accaccacca agaacggacg cggagcttcc60
cgtctttcgt tcgccaagat ctccgacacg ctgacggtcc ctgaccttct cgccctgcag 120
accgaatcct tcggttggct ggtcggcaac gacgcctgga aggcgcgcgt ggccgaggcc 180
aagaagcagg ggcgcaccga cgtcaacgag aacagcggtc tgggcgagat cttcgaggag 240
atctctccga tcgaggacct cggcgagacg atgcagctgt cgttcacgaa cccctacctc 300
gagccggaga agtactccat cgaggagtgc aaggagcgtg gcaagaccta cgccgctccg 360
ctgtacgtcg aggccgagtt catgaaccac ctcacgggtg agatcaagac ccagacggtc 420
ttcatgggcg acttcccgct gcagaccgac aagggaacgt tcatcatcaa cggctccgag 480
cgcgtcgtcg tctcgcagct ggtgcgttcg cccggtgtct acttcgacaa gacccccgac 540
aagacgtccg acaaggacat cgtctcggca cgcgtcatcc cgagccgtgg tgcctggctc 600
gagttcgaga tcgacaagcg cgaccaggtc ggcgtgcgcg tcgaccgcaa gcgcaagcag 660
tcggtcacgg tcttcctcaa ggcgctgggc atgaccagcg aggagatcct cgccgagttc 720
gccggctaca cctcgatcga ggagacgctc gcgaaggaca cgatcgtcac gaaggaagat 780
gcgctccgcg acatctaccg caagctccgt ccgggcgagc aggtcgccgc cgaggccgcc 840
cgcgcgctcc tggacaactt ctacttcaac ccgaagcgct acgacctggc caaggtcggt 900
cgctacaaga tcaaccacaa gctgggcctg gaccagccgc tgaactcgtc ggtcctgacc 960
gtcgaagaca tcgtggccac gatcaagtac ctggtgcgtc tgcacgccgg caccgaggag 1020
accttcacgg gcatccgcgg tggtaagaag gccgagatcc gtctcgcgac cgacgacatc 1080
gacaacttcg gcaaccgtcg catccgcgcg gtcggcgagc tgatccagaa ccaggtccgc 1140
accggtctct cccgcatgga gcgcgtcgtc cgcgagcgca tgaccacgca ggacatcgag 1200
gcgatcacgc cgcagaccct gatcaacgtg cgccccgtcg tcgccgcgat caaggagttc 1260
ttcggaacgt cgcagctgtc gcagttcatg gaccagaaca acccgctcgc gggtctgacg 1320
aacaagcgtc gtctgtctgc gctcggcccc ggtggtctct cgcgagaccg cgccggcgtc 1380
gaggtccgtg acgtccaccc ctcgcactac ggccgcatgt gcccgatcga gactccggaa 1440
ggcccgaaca tcggtctgat cggtgctctc gcgaccttcg cgcgcatcaa ctcgttcgga 1500
ttcatcgaga ccccgtaccg caaggtcgtc gacggtgtcg tgaccgacca gatcgactac 1560
ctgacggctt ccgaagaggt cgacttcaac atcgcgcagg ccaacgcccc gctcgatgcc 1620
aagggtcgct tccgcgagag ccacgtcctg gcccgcccca agggtggcag cggcgaggtc 1680
gacctgttcg tccccgagga gatcggctac atcgacgtct ccccgcgcca gatggtgtcg 1740
gtcgcgacct cgctcgtgcc cttcctcgag cacgacgacg cacagcgcgc cctcatgggt 1800
gccaacatgc agcgtcaggc tgtgccgctg ctgcgcagcg actcgccgct cgtcggaacc 1860
ggtatggagg gctacacggc catcgacgcc ggtgacgtgc tcaccgccga gaaggccggt 1920
gtcgtctccg aggtctccgc agaccgcgtc gtcgtcatgc tcgacgaggg cggaacgcag 1980
gagtaccacc tgcgcaagtt cgaccgctcc aaccagggca cgtcgtacaa ccagaaggtc 2040
gtcgtcaccg ccggtgagcg cgtcgaggtc ggagaggtca tcgccgatgg ccccgccacc 2100
gagaacggcg agctggccct cggaaagaac ctcctcgtcg cgttcatgac gtgggagggc 2160
tacaacttcg aggacgcgat catcctgagc caggacctgg tgaaggacga caccctctcc 2220
tcgatccaca tcgaggagta cgaggtcgat gctcgcgaca ccaagctcgg caaggaggag 2280
atcacgcgtg acctccccaa cgtcagcccg gagctgctga aggacctcga cgagcgcggc 2340
atcatccgca tcggtgccga ggtccgccct ggcgacatcc tcgtcggcaa ggtcacgccg 2400
aagggtgaga ccgagctgtc ggccgaggag cgcctgctcc gcgcgatctt caacgagaag 2460
agccgcgaag tccgtgacac ctcgctgaag gtgccccacg gtgagcaggg cacgatcatc 2520
gccgtcaagg agttcaacgc tgaggacggc gacgacgagc tcggctccgg cgtcaaccgc 2580
cgcgtcgtgg tctacatcgc ccagaagcgc aagatcaccg agggtgacaa gctcgccggc 2640
cgtcacggca acaagggtgt catcgcgaag atcctcccga tcgaggacat gccgttcctt 2700
tcggacggta ccccggtcga catcgtgctg aacccgctcg gtatccccgg tcgaatgaac 2760
ttcggtcagg tcctggagac ccacctcggg tggatcgcga agcagggctg gaaggtcgag 2820
ggcaacccgg agtgggctgt gaagctcccg aaggacgcat tcgaggccgc ccccggcacg 2880
aaggtcgcca ccccggtgtt cgacggtgcg agcgaggagg agatcgctgg tctcctcgac 2940
gcgaccaccc cgacccgtga cggcgtccgc ctgatcgact cgagcggcaa gacgcagctg 3000
ttcgacggtc gttcgggtga gccgttcccg gcgccgatct ccgtgggcta catgtacatc 3060
ctgaagctgc accacctggt cgacgacaag atccacgcac gttccacggg tccgtactcg 3120
atgatcaccc agcagccgct cggtggtaag gcgcagttcg gtggacagcg cttcggtgag 3180
atggaggtgt gggccctcga ggcctacggc gccgcatacg cgctccagga gctcctcacg 3240
atcaagtccg acgacatcct cggccgcgtc aaggtgtacg aggcgatcgt caagggcgag 3300
aacatccagg agcccggcat ccccgagtcg ttcaaggtgc tcatgaagga gatgcagtcg 3360
ctctgcctga acgtcgaggt cctctcggcc gacggcacgc tggtcaacct ccgcgacacc 3420
gacgacgagg cgttccgcgc cgcggaagag ctcggtatca acatctccag ccgcttcgag 3480
gccgcctcga tcgacgagat ctaa 3504
<210> 5
<211> 1167
<212> ПРОТЕИН
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI пептид ID SG1MICT850290
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> Субъединица В РНК-полимеразы
<400> 5
Met Ala Ala Ala Arg Asn Ala Ser Thr Ser Thr Thr Thr Lys Asn Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ala Ser Arg Leu Ser Phe Ala Lys Ile Ser Asp Thr Leu Thr
20 25 30
Val Pro Asp Leu Leu Ala Leu Gln Thr Glu Ser Phe Gly Trp Leu Val
35 40 45
Gly Asn Asp Ala Trp Lys Ala Arg Val Ala Glu Ala Lys Lys Gln Gly
50 55 60
Arg Thr Asp Val Asn Glu Asn Ser Gly Leu Gly Glu Ile Phe Glu Glu
65 70 75 80
Ile Ser Pro Ile Glu Asp Leu Gly Glu Thr Met Gln Leu Ser Phe Thr
85 90 95
Asn Pro Tyr Leu Glu Pro Glu Lys Tyr Ser Ile Glu Glu Cys Lys Glu
100 105 110
Arg Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Pro Leu Tyr Val Glu Ala Glu Phe Met
115 120 125
Asn His Leu Thr Gly Glu Ile Lys Thr Gln Thr Val Phe Met Gly Asp
130 135 140
Phe Pro Leu Gln Thr Asp Lys Gly Thr Phe Ile Ile Asn Gly Ser Glu
145 150 155 160
Arg Val Val Val Ser Gln Leu Val Arg Ser Pro Gly Val Tyr Phe Asp
165 170 175
Lys Thr Pro Asp Lys Thr Ser Asp Lys Asp Ile Val Ser Ala Arg Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Gly Ala Trp Leu Glu Phe Glu Ile Asp Lys Arg Asp
195 200 205
Gln Val Gly Val Arg Val Asp Arg Lys Arg Lys Gln Ser Val Thr Val
210 215 220
Phe Leu Lys Ala Leu Gly Met Thr Ser Glu Glu Ile Leu Ala Glu Phe
225 230 235 240
Ala Gly Tyr Thr Ser Ile Glu Glu Thr Leu Ala Lys Asp Thr Ile Val
245 250 255
Thr Lys Glu Asp Ala Leu Arg Asp Ile Tyr Arg Lys Leu Arg Pro Gly
260 265 270
Glu Gln Val Ala Ala Glu Ala Ala Arg Ala Leu Leu Asp Asn Phe Tyr
275 280 285
Phe Asn Pro Lys Arg Tyr Asp Leu Ala Lys Val Gly Arg Tyr Lys Ile
290 295 300
Asn His Lys Leu Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ser Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Glu Asp Ile Val Ala Thr Ile Lys Tyr Leu Val Arg Leu His Ala
325 330 335
Gly Thr Glu Glu Thr Phe Thr Gly Ile Arg Gly Gly Lys Lys Ala Glu
340 345 350
Ile Arg Leu Ala Thr Asp Asp Ile Asp Asn Phe Gly Asn Arg Arg Ile
355 360 365
Arg Ala Val Gly Glu Leu Ile Gln Asn Gln Val Arg Thr Gly Leu Ser
370 375 380
Arg Met Glu Arg Val Val Arg Glu Arg Met Thr Thr Gln Asp Ile Glu
385 390 395 400
Ala Ile Thr Pro Gln Thr Leu Ile Asn Val Arg Pro Val Val Ala Ala
405 410 415
Ile Lys Glu Phe Phe Gly Thr Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln
420 425 430
Asn Asn Pro Leu Ala Gly Leu Thr Asn Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu
435 440 445
Gly Pro Gly Gly Leu Ser Arg Asp Arg Ala Gly Val Glu Val Arg Asp
450 455 460
Val His Pro Ser His Tyr Gly Arg Met Cys Pro Ile Glu Thr Pro Glu
465 470 475 480
Gly Pro Asn Ile Gly Leu Ile Gly Ala Leu Ala Thr Phe Ala Arg Ile
485 490 495
Asn Ser Phe Gly Phe Ile Glu Thr Pro Tyr Arg Lys Val Val Asp Gly
500 505 510
Val Val Thr Asp Gln Ile Asp Tyr Leu Thr Ala Ser Glu Glu Val Asp
515 520 525
Phe Asn Ile Ala Gln Ala Asn Ala Pro Leu Asp Ala Lys Gly Arg Phe
530 535 540
Arg Glu Ser His Val Leu Ala Arg Pro Lys Gly Gly Ser Gly Glu Val
545 550 555 560
Asp Leu Phe Val Pro Glu Glu Ile Gly Tyr Ile Asp Val Ser Pro Arg
565 570 575
Gln Met Val Ser Val Ala Thr Ser Leu Val Pro Phe Leu Glu His Asp
580 585 590
Asp Ala Gln Arg Ala Leu Met Gly Ala Asn Met Gln Arg Gln Ala Val
595 600 605
Pro Leu Leu Arg Ser Asp Ser Pro Leu Val Gly Thr Gly Met Glu Gly
610 615 620
Tyr Thr Ala Ile Asp Ala Gly Asp Val Leu Thr Ala Glu Lys Ala Gly
625 630 635 640
Val Val Ser Glu Val Ser Ala Asp Arg Val Val Val Met Leu Asp Glu
645 650 655
Gly Gly Thr Gln Glu Tyr His Leu Arg Lys Phe Asp Arg Ser Asn Gln
660 665 670
Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Val Val Val Thr Ala Gly Glu Arg Val
675 680 685
Glu Val Gly Glu Val Ile Ala Asp Gly Pro Ala Thr Glu Asn Gly Glu
690 695 700
Leu Ala Leu Gly Lys Asn Leu Leu Val Ala Phe Met Thr Trp Glu Gly
705 710 715 720
Tyr Asn Phe Glu Asp Ala Ile Ile Leu Ser Gln Asp Leu Val Lys Asp
725 730 735
Asp Thr Leu Ser Ser Ile His Ile Glu Glu Tyr Glu Val Asp Ala Arg
740 745 750
Asp Thr Lys Leu Gly Lys Glu Glu Ile Thr Arg Asp Leu Pro Asn Val
755 760 765
Ser Pro Glu Leu Leu Lys Asp Leu Asp Glu Arg Gly Ile Ile Arg Ile
770 775 780
Gly Ala Glu Val Arg Pro Gly Asp Ile Leu Val Gly Lys Val Thr Pro
785 790 795 800
Lys Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala Glu Glu Arg Leu Leu Arg Ala Ile
805 810 815
Phe Asn Glu Lys Ser Arg Glu Val Arg Asp Thr Ser Leu Lys Val Pro
820 825 830
His Gly Glu Gln Gly Thr Ile Ile Ala Val Lys Glu Phe Asn Ala Glu
835 840 845
Asp Gly Asp Asp Glu Leu Gly Ser Gly Val Asn Arg Arg Val Val Val
850 855 860
Tyr Ile Ala Gln Lys Arg Lys Ile Thr Glu Gly Asp Lys Leu Ala Gly
865 870 875 880
Arg His Gly Asn Lys Gly Val Ile Ala Lys Ile Leu Pro Ile Glu Asp
885 890 895
Met Pro Phe Leu Ser Asp Gly Thr Pro Val Asp Ile Val Leu Asn Pro
900 905 910
Leu Gly Ile Pro Gly Arg Met Asn Phe Gly Gln Val Leu Glu Thr His
915 920 925
Leu Gly Trp Ile Ala Lys Gln Gly Trp Lys Val Glu Gly Asn Pro Glu
930 935 940
Trp Ala Val Lys Leu Pro Lys Asp Ala Phe Glu Ala Ala Pro Gly Thr
945 950 955 960
Lys Val Ala Thr Pro Val Phe Asp Gly Ala Ser Glu Glu Glu Ile Ala
965 970 975
Gly Leu Leu Asp Ala Thr Thr Pro Thr Arg Asp Gly Val Arg Leu Ile
980 985 990
Asp Ser Ser Gly Lys Thr Gln Leu Phe Asp Gly Arg Ser Gly Glu Pro
995 1000 1005
Phe Pro Ala Pro Ile Ser Val Gly Tyr Met Tyr Ile Leu Lys Leu
1010 1015 1020
His His Leu Val Asp Asp Lys Ile His Ala Arg Ser Thr Gly Pro
1025 1030 1035
Tyr Ser Met Ile Thr Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala Gln Phe
1040 1045 1050
Gly Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Val Trp Ala Leu Glu Ala
1055 1060 1065
Tyr Gly Ala Ala Tyr Ala Leu Gln Glu Leu Leu Thr Ile Lys Ser
1070 1075 1080
Asp Asp Ile Leu Gly Arg Val Lys Val Tyr Glu Ala Ile Val Lys
1085 1090 1095
Gly Glu Asn Ile Gln Glu Pro Gly Ile Pro Glu Ser Phe Lys Val
1100 1105 1110
Leu Met Lys Glu Met Gln Ser Leu Cys Leu Asn Val Glu Val Leu
1115 1120 1125
Ser Ala Asp Gly Thr Leu Val Asn Leu Arg Asp Thr Asp Asp Glu
1130 1135 1140
Ala Phe Arg Ala Ala Glu Glu Leu Gly Ile Asn Ile Ser Ser Arg
1145 1150 1155
Phe Glu Ala Ala Ser Ile Asp Glu Ile
1160 1165
<210> 6
<211> 1188
<212> ДНК
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI Ген ID SG1MICG851004
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует пептидную последовательность SEQ ID NO 7
<400> 6
ttgccgactc gatgtcggtg gcctctccta cggtggaaaa caagccgaag agccattacg60
ccttgtcgga gagttgctcc caaccgggag cgccgcgaca gcctacaggc ggcaccacgc 120
gcgcagaagg agcacatcat gccatcaccc gccgaccgcg agaagtccct cgagaccgcc 180
ctcgcccaga tcgaccgcca gttcggaaag ggctcggtca tgcggctggg cagcgatgag 240
cgcgcccccg tggccgtcat ccccaccggc tccatcgccc tcgacgtcgc cctcggcgtc 300
ggaggactcc cgcgtggtcg catcgtcgag atctacggac cggagtcctc cggtaagacg 360
acgctcaccc tgcacgcgat cgcgaacgca cagcgtgccg gtggcatcgc ggcgttcatc 420
gacgccgagc acgcgctcga ccccgactac gccgccaagc tcggcgtcga catcgatgcg 480
ctcctggtct cgcagcccga cacgggtgag caggcgctcg agatcgccga catgctcgtg 540
cgctccggtg cgatcgacct catcgtcatc gactccgtcg cggccctcgt gccgcgcgcc 600
gagatcgagg gcgagatggg tgactcgcac gtcggtctgc aggctcgcct catgtcgcag 660
gcgctgcgaa agctcaccgg tggtctgaac cagacgaaca ccacgatgat cttcatcaac 720
cagctccgcg agaagatcgg tgtcttcttc ggttcgccgg agaccactgc cggcggtaag 780
gcgctcaagt tctacgcctc ggtccgcatg gacatccgtc gtatcgagac gctcaaggac 840
ggtactgacg ctgtcggtaa ccgcaccagg gtcaaggtcg tcaagaacaa gatggctccg 900
cctttcaagc aggccgagtt cgacatcctc tacggcgtcg gcatctcgcg cgagggaagc 960
ctgatcgact tcggtgtcga gcatgcgatc gtcaagaagt ccggttcctg gtatacgtac 1020
gacggtgacc agctgggtca gggcaaggag aacgcgcgga cgttcctgct caacaacccc 1080
gacatcgcgc tggcgatcga gacgcagatc aagcagaagc tcggcatcgg cggtcccgcc 1140
gcggcgcctg ctgcggcaga cgagctcgct gagcgtcgtc cggcctga 1188
<210> 7
<211> 395
<212> ПРОТЕИН
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI пептид ID SG1MICT851004
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> рекомбиназа A
<400> 7
Met Pro Thr Arg Cys Arg Trp Pro Leu Leu Arg Trp Lys Thr Ser Arg
1 5 10 15
Arg Ala Ile Thr Pro Cys Arg Arg Val Ala Pro Asn Arg Glu Arg Arg
20 25 30
Asp Ser Leu Gln Ala Ala Pro Arg Ala Gln Lys Glu His Ile Met Pro
35 40 45
Ser Pro Ala Asp Arg Glu Lys Ser Leu Glu Thr Ala Leu Ala Gln Ile
50 55 60
Asp Arg Gln Phe Gly Lys Gly Ser Val Met Arg Leu Gly Ser Asp Glu
65 70 75 80
Arg Ala Pro Val Ala Val Ile Pro Thr Gly Ser Ile Ala Leu Asp Val
85 90 95
Ala Leu Gly Val Gly Gly Leu Pro Arg Gly Arg Ile Val Glu Ile Tyr
100 105 110
Gly Pro Glu Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Thr Leu His Ala Ile Ala
115 120 125
Asn Ala Gln Arg Ala Gly Gly Ile Ala Ala Phe Ile Asp Ala Glu His
130 135 140
Ala Leu Asp Pro Asp Tyr Ala Ala Lys Leu Gly Val Asp Ile Asp Ala
145 150 155 160
Leu Leu Val Ser Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Ala
165 170 175
Asp Met Leu Val Arg Ser Gly Ala Ile Asp Leu Ile Val Ile Asp Ser
180 185 190
Val Ala Ala Leu Val Pro Arg Ala Glu Ile Glu Gly Glu Met Gly Asp
195 200 205
Ser His Val Gly Leu Gln Ala Arg Leu Met Ser Gln Ala Leu Arg Lys
210 215 220
Leu Thr Gly Gly Leu Asn Gln Thr Asn Thr Thr Met Ile Phe Ile Asn
225 230 235 240
Gln Leu Arg Glu Lys Ile Gly Val Phe Phe Gly Ser Pro Glu Thr Thr
245 250 255
Ala Gly Gly Lys Ala Leu Lys Phe Tyr Ala Ser Val Arg Met Asp Ile
260 265 270
Arg Arg Ile Glu Thr Leu Lys Asp Gly Thr Asp Ala Val Gly Asn Arg
275 280 285
Thr Arg Val Lys Val Val Lys Asn Lys Met Ala Pro Pro Phe Lys Gln
290 295 300
Ala Glu Phe Asp Ile Leu Tyr Gly Val Gly Ile Ser Arg Glu Gly Ser
305 310 315 320
Leu Ile Asp Phe Gly Val Glu His Ala Ile Val Lys Lys Ser Gly Ser
325 330 335
Trp Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Gln Leu Gly Gln Gly Lys Glu Asn Ala
340 345 350
Arg Thr Phe Leu Leu Asn Asn Pro Asp Ile Ala Leu Ala Ile Glu Thr
355 360 365
Gln Ile Lys Gln Lys Leu Gly Ile Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala
370 375 380
Ala Ala Asp Glu Leu Ala Glu Arg Arg Pro Ala
385 390 395
<210> 8
<211> 2175
<212> ДНК
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI Ген ID SG1MICG849768
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует пептидную последовательность SEQ ID NO 9
<400> 8
atgtacccca tgatcgatcc cgcactcgcc gacgccggcc tcggtgacgc cgaagacgac60
gacttcgacg ccatcgagtc tcccgactcc cagctcccgg accaccgcta cctggatcgc 120
gagctgagct ggctcgcctt caaccagcgc gtaatggagc tcgccgagga tccgtcactg 180
cccgaactcg agcgggcgaa cttcctggcg atcttcgcca gcaacctcga cgagttcttc 240
atggtgcgcg tcgccggcct caagcgccgc atcatgaccg gcctggccgt gccgacgaac 300
atcggccgct cccccgtcga cgcgctcgcc gacatctccc gcgaagcgca cgccctgcag 360
ctgcgtcacg ccgaggcctg gacctcgctc gtgcgccccg ccctggccga ctccggcatc 420
gagatcacgg actggtccga gctgaccgac gacgagcgct ccggattgtc cgagtacttc 480
cagctccagg tcttcccggt gctgatgccg ctcgcggtcg acccggcgca tccgttcccc 540
tacatctccg gcctgtcgct gaacctcgcg atccgcatcc gcaatgcccg caccgggcgc 600
caggagttcg cgcgcctcaa ggtgccgccc atgctccccc gcttcgtgga ggtgccgggc 660
ggcggcgaga tcaagcgctt cctgcgcctg gaggaactga tcgcgaacca cctcggcgac 720
ctgttccccg gcatggaggt gctcgaccac cacgcgttcc gcctcacccg caacgaagac 780
gtggagatcg aggaagacga gagcgagaac ctcatccagg cgctcgaggc cgagctgctg 840
cgccgtcgat tcggcccgcc gatccgcctc gagatcacgg acgacatgga cgaggtcacg 900
atggacctgc tcgtccgcga gctcgacatc accgacctgg aggtctaccg cctccccggt 960
ccgctcgacc tgcgcggact gttcgatctg tcccgcatcg accgtcccga cctgcgctac 1020
ccgccgcacc tgcccaccac ggccgtggcc ttccagcccg caggatcgag caaccgcgcc 1080
gacatcttca aagcgatccg caagtcggat gtgctcgtgc accacccgta cgagtcgttc 1140
acgaccagcg tgcaggcgtt cctcgaacag gccgcccgcg acccgcacgt gctcgccatc 1200
aagcagaccc tgtaccgcac ctcgggcgac agcccggtcg tgcaggcgct gatcgacgcg 1260
gccgaagccg gcaagcaggt gctggccctc gtcgaggtga aggcccgttt cgacgaggcc 1320
aacaacatcg tctgggcacg caagctcgag aaggccggcg tgcacgtggt ctacggtctc 1380
gtcggactca agacccactg caagctcgcc ctcgtcatcc gcgaggaaga ggggatgctg 1440
cgccactact cgcacgtcgg caccggcaac tacaacccca agaccagccg catctacgag 1500
gacttcggtc tgttcaccgc agacgcgcag gtcggcaaag acctgacacg cctgttcaac 1560
gagctcagcg gctacgcgat cgagaagaag ttcaagcgcc tgctggtcgc cccgctgcac 1620
ctgcgcaagg gcctcatccg ccagatcgac gccgagcgca ggaacgccga ggcggggatc 1680
cccgcgcaca tccgcatcaa ggtgaactcg atggtcgatg aggagatcat cgacgcgctc 1740
taccgcgcga gcgcggccgg ggtgaaggtc gacgtgtggg tgcgcggcat ctgcagcctg 1800
cgcaccgacc tcgacggcat cagtgacaac atcacggtgc gcagcatcct cggccgctac 1860
ctcgagcact cccgcatctt cgcgttcgag aacgccggcg acccgcaggt gtacatcggc 1920
agcgccgaca tgatgcaccg caacctcgac cgtcgtgtgg aggcgctggt gcgcgtcacc 1980
gacgccgacc acctcaagga actgcaggcg ttcttcgacc tcgcgatgga cgacggaacc 2040
tcgtcgtggc atctcggcgc cggcggcgtc tgggagcgcc acgccgtgaa cgccgacggc 2100
aagccgctga tcgacctgca ggataagacc atggggttga tccagcggcg ccgccgcgcg 2160
cgggcggttc gatga 2175
<210> 9
<211> 724
<212> ПРОТЕИН
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-C06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI пептид ID SG1MICT849768
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> полифосфат киназа
<400> 9
Met Tyr Pro Met Ile Asp Pro Ala Leu Ala Asp Ala Gly Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ala Glu Asp Asp Asp Phe Asp Ala Ile Glu Ser Pro Asp Ser Gln Leu
20 25 30
Pro Asp His Arg Tyr Leu Asp Arg Glu Leu Ser Trp Leu Ala Phe Asn
35 40 45
Gln Arg Val Met Glu Leu Ala Glu Asp Pro Ser Leu Pro Glu Leu Glu
50 55 60
Arg Ala Asn Phe Leu Ala Ile Phe Ala Ser Asn Leu Asp Glu Phe Phe
65 70 75 80
Met Val Arg Val Ala Gly Leu Lys Arg Arg Ile Met Thr Gly Leu Ala
85 90 95
Val Pro Thr Asn Ile Gly Arg Ser Pro Val Asp Ala Leu Ala Asp Ile
100 105 110
Ser Arg Glu Ala His Ala Leu Gln Leu Arg His Ala Glu Ala Trp Thr
115 120 125
Ser Leu Val Arg Pro Ala Leu Ala Asp Ser Gly Ile Glu Ile Thr Asp
130 135 140
Trp Ser Glu Leu Thr Asp Asp Glu Arg Ser Gly Leu Ser Glu Tyr Phe
145 150 155 160
Gln Leu Gln Val Phe Pro Val Leu Met Pro Leu Ala Val Asp Pro Ala
165 170 175
His Pro Phe Pro Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Leu Asn Leu Ala Ile Arg
180 185 190
Ile Arg Asn Ala Arg Thr Gly Arg Gln Glu Phe Ala Arg Leu Lys Val
195 200 205
Pro Pro Met Leu Pro Arg Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Gly Glu Ile
210 215 220
Lys Arg Phe Leu Arg Leu Glu Glu Leu Ile Ala Asn His Leu Gly Asp
225 230 235 240
Leu Phe Pro Gly Met Glu Val Leu Asp His His Ala Phe Arg Leu Thr
245 250 255
Arg Asn Glu Asp Val Glu Ile Glu Glu Asp Glu Ser Glu Asn Leu Ile
260 265 270
Gln Ala Leu Glu Ala Glu Leu Leu Arg Arg Arg Phe Gly Pro Pro Ile
275 280 285
Arg Leu Glu Ile Thr Asp Asp Met Asp Glu Val Thr Met Asp Leu Leu
290 295 300
Val Arg Glu Leu Asp Ile Thr Asp Leu Glu Val Tyr Arg Leu Pro Gly
305 310 315 320
Pro Leu Asp Leu Arg Gly Leu Phe Asp Leu Ser Arg Ile Asp Arg Pro
325 330 335
Asp Leu Arg Tyr Pro Pro His Leu Pro Thr Thr Ala Val Ala Phe Gln
340 345 350
Pro Ala Gly Ser Ser Asn Arg Ala Asp Ile Phe Lys Ala Ile Arg Lys
355 360 365
Ser Asp Val Leu Val His His Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Thr Ser Val
370 375 380
Gln Ala Phe Leu Glu Gln Ala Ala Arg Asp Pro His Val Leu Ala Ile
385 390 395 400
Lys Gln Thr Leu Tyr Arg Thr Ser Gly Asp Ser Pro Val Val Gln Ala
405 410 415
Leu Ile Asp Ala Ala Glu Ala Gly Lys Gln Val Leu Ala Leu Val Glu
420 425 430
Val Lys Ala Arg Phe Asp Glu Ala Asn Asn Ile Val Trp Ala Arg Lys
435 440 445
Leu Glu Lys Ala Gly Val His Val Val Tyr Gly Leu Val Gly Leu Lys
450 455 460
Thr His Cys Lys Leu Ala Leu Val Ile Arg Glu Glu Glu Gly Met Leu
465 470 475 480
Arg His Tyr Ser His Val Gly Thr Gly Asn Tyr Asn Pro Lys Thr Ser
485 490 495
Arg Ile Tyr Glu Asp Phe Gly Leu Phe Thr Ala Asp Ala Gln Val Gly
500 505 510
Lys Asp Leu Thr Arg Leu Phe Asn Glu Leu Ser Gly Tyr Ala Ile Glu
515 520 525
Lys Lys Phe Lys Arg Leu Leu Val Ala Pro Leu His Leu Arg Lys Gly
530 535 540
Leu Ile Arg Gln Ile Asp Ala Glu Arg Arg Asn Ala Glu Ala Gly Ile
545 550 555 560
Pro Ala His Ile Arg Ile Lys Val Asn Ser Met Val Asp Glu Glu Ile
565 570 575
Ile Asp Ala Leu Tyr Arg Ala Ser Ala Ala Gly Val Lys Val Asp Val
580 585 590
Trp Val Arg Gly Ile Cys Ser Leu Arg Thr Asp Leu Asp Gly Ile Ser
595 600 605
Asp Asn Ile Thr Val Arg Ser Ile Leu Gly Arg Tyr Leu Glu His Ser
610 615 620
Arg Ile Phe Ala Phe Glu Asn Ala Gly Asp Pro Gln Val Tyr Ile Gly
625 630 635 640
Ser Ala Asp Met Met His Arg Asn Leu Asp Arg Arg Val Glu Ala Leu
645 650 655
Val Arg Val Thr Asp Ala Asp His Leu Lys Glu Leu Gln Ala Phe Phe
660 665 670
Asp Leu Ala Met Asp Asp Gly Thr Ser Ser Trp His Leu Gly Ala Gly
675 680 685
Gly Val Trp Glu Arg His Ala Val Asn Ala Asp Gly Lys Pro Leu Ile
690 695 700
Asp Leu Gln Asp Lys Thr Met Gly Leu Ile Gln Arg Arg Arg Arg Ala
705 710 715 720
Arg Ala Val Arg
<210> 10
<211> 1390
<212> ДНК
<213> Microbacterium sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-005-G08
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует 16S рибосомную РНК
<220>
<221> разнообразные признаки
<222> (29)..(36)
<223> n есть a, c, g, t и другие
<220>
<221> разнообразные признаки
<222> (38)..(41)
<223> n есть a, c, g, t и другие
<400> 10
aacggtgaac acggagcttg ctctgtggnn nnnnnngnnn ncgggtgagt aacacgtgag60
caacctgccc ctgactctgg gataagcgct ggaaacggcg tctaatactg gatacgagta 120
gcgatcgcat ggtcagctac tggaaagatt ttttggttgg ggatgggctc gcggcctatc 180
agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgtcgacgg gtagccggcc tgagagggtg 240
accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attgcacaat gggcggaagc ctgatgcagc aacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg 360
ttgtaaacct cttttagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga aaaagcgccg 420
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttatc cggaattatt 480
gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg cgtctgctgt gaaatcccga ggctcaacct 540
cgggcctgca gtgggtacgg gcagactaga gtgcggtagg ggagattgga attcctggtg 600
tagcggtgga atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg cgaaggcaga tctctgggcc 660
gtaactgacg ctgaggagcg aaagggtggg gagcaaacag gcttagatac cctggtagtc 720
caccccgtaa acgttgggaa ctagttgtgg ggtccattcc acggattccg tgacgcagct 780
aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga 840
cggggacccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta 900
ccaaggcttg acatatacga gaacgggcca gaaatggtca actctttgga cactcgtaaa 960
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020
agcgcaaccc tcgttctatg ttgccagcac gtaatggtgg gaactcatgg gatactgccg 1080
gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgtcttgggc 1140
ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaaag ggctgcaata ccgtgaggtg gagcgaatcc 1200
caaaaagccg gtcccagttc ggattgaggt ctgcaactcg acctcatgaa gtcggagtcg 1260
ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc 1320
ccgtcaagtc atgaaagtcg gtaacacctg aagccggtgg cctaaccctt gtggagggag 1380
ccgtcgaagg 1390
<210> 11
<211> 532
<212> ДНК
<213> Mycosphaerella sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-010-H11
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> Внутренний транскрибированный спейсер 1_5.8S рибосомная ДНК
<220>
<221> разнообразные признаки
<222> (43)..(43)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> разнообразные признаки
<222> (526)..(526)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<400> 11
cggagggatc attaatgagt gagggggcca cccccaacct ccnacccttt gtgaacgcat60
catgttgctt cgggggcgac cctgccgttc gcggcattcc ccccggaggt catcaaaaca 120
ctgcattctt acgtcggagt aaaaagttaa tttaataaaa ctttcaacaa cggatctctt 180
ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc 240
agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct 300
gttcgagcgt catttcacca ctcaagcctc gcttggtatt gggcgtcgcg agtctctcgc 360
gcgcctcaaa gtctccggct gttcggttcg tctcccagcg ttgtggcaac tatttcgcag 420
tggagtacga gtcgtggcgg ccgttaaatc tttcaaaggt tgacctcgga tcaggtaggg 480
atacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaggt catagntgtt tc532
<210> 12
<211> 1431
<212> ДНК
<213> Variovorax sp.
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-014-G01
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует 16S рибосомную РНК
<400> 12
tgccttacac atgcaagtcg aacggcagcg cgggagcaat cctggcggcg agtggcgaac60
gggtgagtaa tacatcggaa cgtgcccaat cgtgggggat aacgcagcga aagctgtgct 120
aataccgcat acgatctacg gatgaaagca ggggatcgca agaccttgcg cgaatggagc 180
ggccgatggc agattaggta gttggtgagg taaaggctca ccaagccttc gatctgtagc 240
tggtctgaga ggacgaccag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtgg ggaattttgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc cgcgtgcagg 360
atgaaggcct tcgggttgta aactgctttt gtacggaacg aaacggcctt ttctaataaa 420
gagggctaat gacggtaccg taagaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtgc gcaggcggtt 540
atgtaagaca gttgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctgt gactgcatag 600
ctagagtacg gtagaggggg atggaattcc gcgtgtagca gtgaaatgcg tagatatgcg 660
gaggaacacc gatggcgaag gcaatcccct ggacctgtac tgacgctcat gcacgaaagc 720
gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat gtcaactggt 780
tgttgggtct tcactgactc agtaacgaag ctaacgcgtg aagttgaccg cctggggagt 840
acggccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggatgatg 900
tggtttaatt cgatgcaacg cgaaaaacct tacccacctt tgacatgtac ggaattcgcc 960
agagatggct tagtgctcga aagagaaccg taacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc attagttgct 1080
acattcagtt gggcactcta atgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140
cgtcaagtcc tcatggccct tataggtggg gctacacacg tcatacaatg gctggtacaa 1200
agggttgcca acccgcgagg gggagctaat cccataaaac cagtcgtagt ccggatcgca 1260
gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtggatcag aatgtcacgg 1320
tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagcg ggttctgcca 1380
gaagtagtta gcttaaccgc aaggagggcg attaccacgg cagggttcgt g1431
<210> 13
<211> 1424
<212> ДНК
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-015-F03
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует 16S рибосомную РНК
<400> 13
ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt60
tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120
gaaaccgggg ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc 180
ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240
accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360
cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420
gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540
cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600
agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660
cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720
actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780
gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840
cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960
gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200
acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260
atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttt 1424
<210> 14
<211> 1425
<212> ДНК
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> SGI бактериальный изолят SGI-015-H06
<220>
<221> разнообразные признаки
<223> кодирует 16S рибосомную РНК
<400> 14
gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180
cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420
agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260
aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttt1425
<210> 15
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер M13-ITS1
<400> 15
tgtaaaacga cggccagttt cgtaggtgaa cctgcgg 37
<210> 16
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер ITS4-M13
<400> 16
caggaaacag ctatgacctc ctccgcttat tgatatgc 38
<210> 17
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер M13-27F Bac
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtta gagtttgatc ctggctcag 39
<210> 18
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер 1492R-M13 Bac
<400> 18
caggaaacag ctatgaccgg ttaccttgtt acgactt 37
<---

Claims (19)

1. Выделенный микробный штамм, представляющий собой штамм Bacillus amyloliquefaciens, для которого репрезентативный образец депонирован как NRRL B-50760, причем выделенный микробный штамм имеет подавляющую активность против фузариоза.
2. Выделенный микробный штамм по п.1, причем указанный микробный штамм содержит последовательность ДНК, демонстрирующую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 13.
3. Обогащенная культура микробного штамма по п.1 для подавления фузариоза, содержащая по меньшей мере 50% выделенного микробного штамма.
4. Композиция для подавления фузариоза, содержащая микробный штамм или его культуру по любому из пп.1-3 и эффективное для сельскохозяйственного производства количество соединения или композиции, выбранных из группы, состоящей из акарицида, бактерицида, фунгицида, инсектицида, микробицида, нематицида, пестицида и удобрения.
5. Композиция для подавления фузариоза, содержащая микробный штамм или его культуру по любому из пп.1-3 и носитель.
6. Композиция по п.5, в которой указанный носитель представляет собой сельскохозяйственно приемлемый носитель.
7. Композиция по п.5, в которой указанный носитель представляет собой семена растения.
8. Композиция по п.5, где указанную композицию получают в форме состава, выбранного из группы, состоящей из эмульсии, коллоида, пыли, гранулы, шарика, порошка, спрея, эмульсии и раствора.
9. Композиция по п.5, где указанная композиция представляет собой состав для покрытия семян.
10. Семя, резистентное к грибковой инфекции Fusarium, причем семя покрыто составом для покрытия семян, содержащим композицию по п.5.
11. Способ предотвращения развития патогена растений Fusarium, где указанный способ включает выращивание микробного штамма или его культуры по любому из пп.1-3 в среде для роста или почве растения-хозяина перед выращиванием или одновременно с выращиванием растения-хозяина в указанной среде для роста или почве.
12. Способ по п.11, в котором указанный патоген растений вызывает фузариоз.
13. Способ по п.12, в котором указанным патогеном растений является Fusarium graminearum.
14. Способ предотвращения развития фузариоза растения, где указанный способ включает нанесение на растение или на окружающую среду растения эффективного количества микробного штамма или его культуры по любому из пп.1-3.
15. Способ по п.14, в котором указанный микробный штамм или его культуру наносят на почву, семя, корень, цветок, лист, часть растения или все растение.
16. Способ по п.14, в котором указанное растение чувствительно к Fusarium graminearum.
17. Способ по п.14, в котором указанное растение представляет собой растение пшеницы, растение кукурузы, растение ячменя или растение овса.
18. Способ по п.14, в котором указанный микробный штамм или его культура является установленным(ой) как эндофит к указанному растению.
19. Способ получения сельскохозяйственной композиции для подавления фузариоза, где указанный способ включает инокуляцию микробного штамма или его культуры по любому из пп.1-3 в субстрат или на него и обеспечение роста указанного микробного штамма или его культуры при температуре 1-37°C до получения количества клеток или спор по меньшей мере 102 -103 на миллилитр или на грамм.
RU2020136616A 2020-11-09 Композиции и способы для борьбы с фузариозом RU2777606C2 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61/511,467 2011-07-25

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019133657A Division RU2736382C1 (ru) 2011-07-25 2019-10-23 Композиции и способы для борьбы с фузариозом

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2022120989A Division RU2022120989A (ru) 2011-07-25 2022-08-02 Композиции и способы для борьбы с фузариозом

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2020136616A RU2020136616A (ru) 2022-05-11
RU2777606C2 true RU2777606C2 (ru) 2022-08-08

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6312940B1 (en) * 1999-10-07 2001-11-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Bacillus species for reducing fusarium head blight in cereals
RU2284353C1 (ru) * 2005-05-05 2006-09-27 Общество с ограниченной ответственностью "БИО-АГРО" Штамм микроорганизмов bacillus mycoides var. b.a. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6312940B1 (en) * 1999-10-07 2001-11-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Bacillus species for reducing fusarium head blight in cereals
RU2284353C1 (ru) * 2005-05-05 2006-09-27 Общество с ограниченной ответственностью "БИО-АГРО" Штамм микроорганизмов bacillus mycoides var. b.a. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PEREIRA P. et al. Efficacy of bacterial seed treatments for the control of Fusarium verticillioides in maize, BioControl, 2009, v.54, p.103-111. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2736382C1 (ru) Композиции и способы для борьбы с фузариозом
CN117604062A (zh) 用于开发土传植物病原体抑制微生物菌群的平台
RU2777606C2 (ru) Композиции и способы для борьбы с фузариозом
KR20230105465A (ko) 고추 탄저병과 세균병 방제 및 생육촉진 효과를 가진 다기능 천연식물보호제 개발
ADETUNJI et al. Production of phytotoxic metabolite using biphasic fermentation system from strain C1136 of Lasiodiplodia pseudotheobromae, a potential bioherbicidal agent
NZ704721B2 (en) Compositions and methods for controlling head blight disease
NZ620577B2 (en) Compositions and methods for controlling head blight disease
NZ712059B2 (en) Compositions and methods for controlling head blight disease
NZ709801B2 (en) Compositions and methods for controlling head blight disease
NZ715042B2 (en) Compositions and methods for controlling head blight disease
MX2011013051A (es) Sistema autonomo para evaluar equilibrio a partir de los movimientos de la cabeza humana.
MX2011013044A (es) Cepa de streptomyces sp. con actividad antagónica, composición que la contiene y uso de la misma.