JP2012215458A - 微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】光源に起因するノイズが少なく、マイクロチップを使用した測定においても高精度な測定を安定して行うことができる微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法を提供する。
【解決手段】流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部と、レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する検出部と、を有する微小粒子分析装置の光照射部に、少なくとも、半導体レーザからなる光源と、この光源から発生したレーザ光のビームパターンをトップハット型に変換する光ファイバと、光源に直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を供給する光源駆動制御部とを設ける。
【選択図】図１

Description

本技術は、微小粒子等の試料を光学的に検出する微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法に関する。より詳しくは、光源に半導体レーザを使用した微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法に関する。

一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する方法である。

具体的には、流路内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態で流路に向けてレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などの光検出器を用いて検出する。そして、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化し、統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ及び構造などを判定する。

一方、前述したフローサイトメトリーにおいて、試料を定量的及び安定的に分析するためには、試料に照射される励起光（レーザ光）の光量を常に一定にしておくことが望ましい。しかしながら、一般に、励起光（レーザ光）のビームスポットは数十μｍと小さく、また、ビームスポット内でも、３次元方向（光軸深さ方向及び光軸と直交する方向）において、パワー密度にばらつきが生じてしまう。

そこで、従来、レーザ駆動を制御することにより、光源に由来するノイズ低減を図った微小粒子分析装置が提案されている（特許文献１〜４参照）。例えば、特許文献１に記載の装置では、光源にシングルモード発振型半導体レーザを使用し、このレーザに内蔵された光量センサの出力が一定になるようにレーザ電流を制御すると共に、モードホップを検出した時点でレーザの温度制御における設定温度を切り換えている。

一方、特許文献２に記載の装置では、直流電流に高周波成分を重畳した駆動電流を出力するレーザ駆動回路によって、光源であるレーザダイオードを駆動し、このレーザダイオードの縦モードをマルチモードにしている。また、特許文献３に記載の装置では、レーザダイオードがマルチモード発振するように、直流駆動回路から出力される直流電流回路から出力された直流電流の大きさに応じて、高周波重畳回路から出力される高周波の振幅を制御している。更に、特許文献４に記載の装置では、半導体レーザの駆動電流に、発振器からの高周波電流成分を重畳することにより、半導体レーザの発振中心波長を共振波長に追従させている。

特開平５−２３２０１２号公報 特開平９−１７８６４５号公報 特開２００９−５３０２０号公報 特開２００５−１７２４６５号公報

中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行

フローサイトメーターなどの微小粒子分析装置は、励起光（レーザ光）の照射スポットの位置ずれによる検出信号の変化が大きいため、装置性能を安定化し、測定精度を向上させるためには、照射スポットの位置を常に一定にしておく必要がある。しかしながら、シングルモードファイバを用いた場合、励起光のスポット位置ずれを厳しく管理する必要があるにもかかわらず、実際には装置に加わる振動や温度変化などで容易に発生し、また、経時的に自然にずれが生じることもある。特に、マイクロチップを使用して測定する場合、チップを交換する毎に光軸調整を行わなければならず、更に、チップに形成された流路の位置精度や装置にチップを取り付ける際の精度も影響するため、調整が適正に行われていないと、検出信号が劣化するという問題点がある。

一方、特許文献１〜４に記載されている装置のようにレーザ駆動を制御すると、照射スポットの光量などを一定にすることが可能であるが、これらの従来の技術は、シングルモードファイバの使用を前提としている。このため、そのままトップハットファイバに適用すると、ビーム強度のプロファイルがスポット内で一様にならず、斑（スペックル）が発生し、スポットと細胞の流れる流路の位置によっては、検出信号の信号成分対ノイズ成分（Ｓ／Ｎ比）が低下する。

そこで、本開示は、光源に起因するノイズが少なく、マイクロチップを使用した測定においても高精度な測定を安定して行うことができる微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法を提供することを主目的とする。

本開示に係る微小粒子分析装置は、流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部と、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する検出部と、を有し、前記光照射部は、少なくとも、半導体レーザからなる光源と、該光源から発生したレーザ光のビームパターンをトップハット型に変換する光ファイバと、前記光源に直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を供給する光源駆動制御部と、を備える。
この装置は、前記光源駆動制御部に、少なくとも、高周波発振器と、広帯域増幅器と、電流スイッチ回路とを設け、これらを直流的に結合してもよい。
その場合、前記電流スイッチ回路をエミッタ結合型回路とし、光源に接続されていない出力端子から取り出された平均電流に基づいて重畳電流を調節することができる。
また、前記光ファイバの出射端側のコアの断面形状は、矩形状又は略矩形状にすることができる。

本開示に係る微小粒子分析方法は、半導体レーザからなる光源から出射したレーザ光を光ファイバに入射し、該光ファイバにより前記レーザ光のビームパターンをトップハット型に変換した後、流路内を通流する微小粒子に変換後のレーザ光を照射する工程と、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する工程と、
を有し、直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を、前記光源に供給する。

本開示によれば、トップハットファイバを介して励起光を照射すると共に、光源となる半導体レーザの駆動電流に大振幅の高周波電流を重畳しているため、光源に起因するノイズが少なく、マイクロチップを使用した測定においても高精度な測定を安定して行うことができる。

本開示の第１の実施形態の微小粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。 （ａ）はトップハット型光ファイバ２５から出射したレーザ光のビーム強度を示す図であり、（ｂ）はそのビームスポット形状を示す図である。 光源駆動制御部２７の構成を示す図である。 （ａ）〜（ｅ）は図３に示す高周波駆動回路５０の動作を示す図である。 本開示の第１の実施形態の変形例の微小粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。

以下、本開示を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本開示は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。なお、本開示は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。

１．第１の実施の形態
（光源駆動制御部を備えた微小粒子分析装置の例）
２．第１の実施の形態の変形例
（光源駆動制御部に加えて、音響光学素子を備えた微小粒子分析装置の例）

＜１．第１の実施の形態＞
［微小粒子分析装置の全体構成］
先ず、本開示の第１の実施形態に係る微小粒子分析装置の構成について説明する。図１は本実施形態の微小粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置１は、サンプル流４内を１列になって通流する微小粒子５に、レーザ光を照射する光照射部２と、レーザ光が照射された微小粒子５から発せられた蛍光及び／又は散乱光を検出する検出部３が設けられている。

［光照射部２］
光照射部２は、少なくとも、励起光となるレーザ光を発生する光源２１と、光源２１から出射したレーザ光のビームパターンをトップハット型に変換する光ファイバ２５と、光源２１の駆動を制御する光源駆動制御部２７とを備えている。また、光照射部２には、必要に応じて、コリメータレンズ２２、ミラー２３、集光レンズ２４，２６などを設けることができる。

図２（ａ）はトップハット型光ファイバ２５から出射したレーザ光のビーム強度を示す図であり、図２（ｂ）はそのビームスポット形状を示す図である。トップハット型光ファイバ２５の入射端２５ａから入射したレーザ光は、コア内を多くのモードに分かれて伝搬し、コア中を広がりながら進み、出射端２５ｂからコアの全領域に均一に広がった状態で出射される。

そして、トップハット型光ファイバ２５を通過し、サンプル流４に照射される励起光（レーザ光）の断面強度は、図２（ａ）に示すように、出射端２５ｂにおけるコア形状に対応した形状（出射スポットＬ）で、略均一に分布する。なお、トップハット型光ファイバ２５の出射端２５ｂにおけるコア形状は、矩形状又は矩形状に近い形状（以下、略矩形状という。）であることが望ましい。これにより、微小粒子の通流位置が変動しても、レーザ光を均一に照射することができる。

一方、トップハット型光ファイバ２５を使用した場合でも、近視野像（ＮＦＰ）のスペックルにより、ビームがトップハット形状を成さなかったり、モードホップに起因する光源２１の変動が生じたりすることがある（図２（ａ）の破線で囲った部分参照）。そして、出射スポットＬにおけるビーム強度が弱い領域（図２（ｂ）の黒で塗りつぶした部分）を微小粒子が通過すると、検出精度を低下させる原因となる。

そこで、本実施形態の微小粒子分析装置１においては、光源２１に半導体レーザ（レーザダイオード）を使用し、光源駆動制御部２７によって、このレーザダイオードの駆動を制御する。図３は光源駆動制御部２７の構成を示す図である。また、図４（ａ）〜（ｅ）は図３に示す高周波駆動回路５０の動作を示す図である。なお、図３においては、光源２１にレーザダイオードＬＤを使用し、検出器３３にフォトダイオードＰＤを使用した場合を例に示している。

光源駆動制御部２７は、光源２１であるレーザダイオードＬＤに、直流電流に大振幅の高周波電流を重畳した駆動電流を供給するものであり、少なくとも、高周波発振器（重畳信号発振回路５１）と、広帯域増幅器（高周波増幅回路５２）と、電流スイッチ回路（高周波駆動回路５０）とを備えている。また、重畳信号発振回路５１、高周波増幅回路５２及び高周波駆動回路５０は、直流的に結合されている。

高周波駆動回路５０は、光源２１であるレーザダイオードＬＤを駆動するものであり、レーザダイオードＬＤの近傍に設けられており、例えば、エミッタ結合の電流スイッチ回路の構成をとることができる。ただし、電流スイッチ回路そのものの回路構成で駆動すると、重畳のＯＮとＯＦＦとで、レーザダイオードＬＤに流れる平均電流値に変化が生じてしまう。つまり、通常のエミッタ結合の電流スイッチ回路は、ＡＰＣ（Auto Power Control）などを経由して供給される直流電流から、パルス状の電流を引き算する形式であるため、パルス形状に応じて平均電流が低下する。

このため、低下した分の電流を補う必要があるが、仮に、ＡＰＣによって電流低下分を賄おうとすると、重畳振幅を上昇させたときに、ＡＰＣが自動的に平均電流を上昇させてしまうため、レーザダイオードＬＤの閾値電流を割り込みにくくなる。その結果、高周波重畳の効果が低くなり、更には効果がなくなる場合もある。

そこで、本実施形態の微小粒子分析装置１においては、重畳をかけても平均電流が変化しない構成を採っている。具体的には、高周波駆動回路５０について、電流スイッチ回路の出力端子のうち一方をレーザダイオードＬＤに接続すると共に、他方を外部に接続し、レーザダイオードＬＤに供給されない電流を、外部に取り出す構成としている。そして、その取りだした平均電流と設定振幅で演算を行い、更に、ＡＰＣ６０からの制御電流Ｄに直流電流Ｃを加算する。これにより、高周波重畳のＯＮ／ＯＦＦに関わらず、レーザダイオードＬＤに流れる平均電流を一定にすることができる。

なお、光源駆動制御部２７におけるＡＰＣ６０は、例えば、引き算回路６１，６２、電流電圧変改回路６３、差動増幅回路６４、電圧電流変換回路６５などで構成され、電源６に接続されている。

また、高周波駆動回路５０は、レーザダイオードＬＤの近傍（数ｍｍ以内）に配置されているが、一方の直流の加算電流Ｃは、ＡＰＣ６０による制御電流Ｄに加算して、駆動することが可能であるため、レーザダイオードＬＤから離れた位置（数十ｃｍ）に配置してもよい。ただし、その場合、高周波電流と、直流電流とを混合する前に、コイルにより交流的に分離することが望ましい。

図４（ａ）〜（ｅ）は図３に示す高周波駆動回路５０の動作を示す図である。重畳の振幅Ａを、図４（ｄ）に示す設定にすると、図４（ｅ）に示すように、重畳電流の平均、即ちレーザダイオードＬＤに接続されていない方の電流スイッチの出力が検出される。図４（ａ）に示すように、この値をＢとすると、加算すべき直流電流はＣとなる。そして、図４（ｂ）に示すように、このＣを、ＡＰＣ６０からの制御電流Ｄ（直流）に加算して、レーザダイオードＬＤに印加する。

そうすると、図４（ｃ）に示すように、レーザダイオードＬＤには、Ｃ＋Ｄの直流電流とスイッチング電流Ｇの引き算した電流が流れる。これにより、レーザダイオードＬＤへの電流平均値（Ｄ×ｇｍ−ｋ×ｇｍ×Ａ）＋ｋ×ｇｍ×Ａ＝Ｄ×ｇｍとなり、レーザダイオードＬＤに流れる平均電流は一致することとなる。なお、図４（ｂ）及び図４（ｃ）の縦軸方向のディメンジョンは、図４（ｂ）から図４（ｃ）へは、ｇｍをかける関係、即ちＰ×ｇｍ＝Ｅとなる。なお、ｇｍは、電圧を電流に変換するアンプの固有係数である。

前述した方法により、直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を光源２１に供給することで、トップハット型光ファイバ２５の出射端２５ｂから出射するレーザ光のスペックルを軽減できると共に、モードホップによる光源２１のパワー変動を抑制することが可能となる。

なお、光源駆動制御部２７においては、フォトダイオードＰＤにより検出した結果を、ＡＰＣ回路にフィードバックしてもよい。

［検出部３］
検出部３は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）及びＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などの光検出器３３、対物レンズ３１、波長フィルタ３２などを備えている。そして、微小粒子５から発せられた蛍光及び／又は散乱光は、集光レンズ３１で集光された後、波長フィルタ３２により検出対象の波長のみが反射され、光検出器３３に入射する。

［動作］
次に、微小粒子分析装置１の動作、即ち、本実施形態の微小粒子分析装置１を使用して微小粒子を分析する方法について説明する。本実施形態の微小粒子分析方法において測定される「微小粒子」には、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。

そして、生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれる。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。この生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。

一方、工業用粒子としては、例えば有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成されたものが挙げられる。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどを使用することができる。また、無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用することができる。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用することができる。なお、これら微小粒子の形状は、一般には球形であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。

本実施形態の微小粒子測定装置１においては、光照射部２の光源２１から出射されたレーザ光を、トップハット型光ファイバ２５を介して、マイクロチップ（図示せず）に形成された流路内を通流する微小粒子５に照射する。そして、微小粒子５から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、検出部３の対物レンズ３１で捕捉した後、波長フィルタ３２により試料から発せられた光以外の外乱成分を除去し、光検出器３３で検出する。

その際、光源駆動制御部２７において、直流電流に、大振幅の高周波電流を重畳し、これを駆動電流として光源２１を構成するレーザダイオードＬＤに供給する。具体的には、光源駆動制御部２７に設けられた高周波駆動回路５０において、パルス状のｓｉｎｋ電流を生成し、レーザダイオードＬＤに流れる直流電流を「減らす」又は「減らさない」の動作を繰り返し行う。なお、ここでいう「大振幅の高周波電流」とは、振幅が１００ｍＡｐ−ｐ以上の電流をいう。

以上詳述したように、本実施形態の微小粒子分析装置１においては、光源２１から出射したレーザ光を、トップハット型光ファイバ２５を介して微小粒子５に照射しているため、励起光（レーザ光）の断面強度を均一にすることができる。また、光源駆動制御部２７により、高周波重畳によるレーザダイオードＬＤの波長スペクトルのマルチモード化を図っているため、光ファイバの出射端面から発せられるＮＦＰのスペックルを抑制することができると共に、モードホップによる光源であるレーザダイオードＬＤのパワー変動を抑制することも期待できる。

そして、本実施形態の微小粒子分析装置１では、高周波駆動回路５０を、電流で駆動する形式とし、重畳電流がレーザの微分抵抗の温度変化で変動しにくい構成としている。また、高周波重畳電流の振幅によらず、光源２１を構成するレーザダイオードＬＤのもつ閾値電流を割り込む時間及び間隔（デューティ）が変わらないようパルス駆動としている。更に、高周波駆動回路５０におけるレーザダイオードＬＤ駆動側の電源電圧は、レーザダイオードＬＤの通電電圧と、ＡＰＣ及び重畳用の加算電流Ｃを利用した構成としている。

その結果、光源に起因するノイズを低減することができると共に、マイクロチップを使用した測定においても、高精度でかつ安定した測定を行うことができる。これにより、光軸調整の難易度だけでなく、チップに形成される流路の位置精度や装置へのチップの取り付け精度も緩和されるため、作業者の負担が軽減されると共に、測定安定性（信頼性）の向上にも貢献することができる。

＜２．第１の実施の形態の変形例＞
本開示の微小粒子分析装置は、図１に示す構成に限定されるものではなく、光照射部に、少なくとも、光源、トップハット型光ファイバ及び光源駆動制御部が設けられていればよい。図５は本開示の第１の実施形態の変形例に係る微小粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。

例えば、図５に示す本開示の変形例の微小粒子分析装置４１のように、光照射部４２に、結晶の粗密波による回折を利用して、光の周波数を変化させる音響光学素子（ＡＯＭ）２８が配設されていてもよい。この場合、音響素子２８は、光源２１とトップハット型光ファイバ２５との間に配置される。このように、音響素子２８を併用することにより、出射スポット内のビーム強度を、更に均一にすることができる。即ち、音響素子２８を併用することにより、トップハット型光ファイバ２５によりレーザ光のビームパターンをトップハット型にした効果を、更に高めることができる。

なお、本開示は、以下のような構成をとることもできる。
（１）
流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部と、
前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する検出部と、
を有し、
前記光照射部は、少なくとも、
半導体レーザからなる光源と、
該光源から発生したレーザ光のビームパターンをトップハット型に変換する光ファイバと、
前記光源に直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を供給する光源駆動制御部と、
を備える微小粒子分析装置。
（２）
前記光源駆動制御部には少なくとも、高周波発振器と、広帯域増幅器と、電流スイッチ回路とが設けられており、これらが直流的に結合されている（１）に記載の微小粒子分析装置。
（３）
前記電流スイッチ回路は、エミッタ結合型回路であり、光源に接続されていない出力端子から取り出された平均電流に基づいて重畳電流を調節する（２）に記載の微小粒子分析装置。
（４）
前記光ファイバの出射端側のコアの断面形状が略矩形状である（１）〜（３）のいずれかに記載の微小粒子分析装置。
（５）
半導体レーザからなる光源から出射したレーザ光を光ファイバに入射し、該光ファイバにより前記レーザ光のビームパターンをトップハット型に変換した後、流路内を通流する微小粒子に変換後のレーザ光を照射する工程と、
前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する工程と、
を有し、
直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を、前記光源に供給する微小粒子分析方法。

１、４１ 微小粒子分析装置
２、４２ 光照射部
３ 検出部
４ サンプル流
５ 微小粒子
６ 電源
２１ 光源
２５ 光ファイバ
２７ 光源駆動制御部
２８ 音響素子
５０ 高周波駆動回路
５１ 重畳信号発振回路
５２ 高周波増幅回路
６０ ＡＰＣ

Claims (5)

1. 流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部と、
   前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する検出部と、
   を有し、
   前記光照射部は、少なくとも、
   半導体レーザからなる光源と、
   該光源から発生したレーザ光のビームパターンをトップハット型に変換する光ファイバと、
   前記光源に直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を供給する光源駆動制御部と、
   を備える微小粒子分析装置。
2. 前記光源駆動制御部には、少なくとも、高周波発振器と、広帯域増幅器と、電流スイッチ回路とが設けられており、これらが直流的に結合されている請求項１に記載の微小粒子分析装置。
3. 前記電流スイッチ回路は、エミッタ結合型回路であり、光源に接続されていない出力端子から取り出された平均電流に基づいて重畳電流を調節する請求項２に記載の微小粒子分析装置。
4. 前記光ファイバの出射端側のコアの断面形状が矩形状又は略矩形状である請求項１に記載の微小粒子分析装置。
5. 半導体レーザからなる光源から出射したレーザ光を光ファイバに入射し、該光ファイバにより前記レーザ光のビームパターンをトップハット型に変換した後、流路内を通流する微小粒子に変換後のレーザ光を照射する工程と、
   前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する工程と、
   を有し、
   直流電流に高周波電流を重畳した駆動電流を、前記光源に供給する微小粒子分析方法。

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