WO2022264481A1 - 粒子分取装置、粒子分取方法及びプログラム - Google Patents

粒子分取装置、粒子分取方法及びプログラム Download PDF

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WO2022264481A1
WO2022264481A1 PCT/JP2022/003823 JP2022003823W WO2022264481A1 WO 2022264481 A1 WO2022264481 A1 WO 2022264481A1 JP 2022003823 W JP2022003823 W JP 2022003823W WO 2022264481 A1 WO2022264481 A1 WO 2022264481A1
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frequency
liquid
droplets
droplet
particle sorting
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PCT/JP2022/003823
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English (en)
French (fr)
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慎 増原
務 丸山
伊佐夫 日高
友行 梅津
Original Assignee
ソニーグループ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry

Definitions

  • This technology relates to a particle sorting device, a particle sorting method, and a program. More specifically, the present invention relates to a particle sorting device, a particle sorting method, and a program capable of stabilizing droplets.
  • flow cytometry is an analysis that analyzes and fractionates particles by injecting aligned particles into a fluid and irradiating the particles with light to detect the light emitted from each particle. method.
  • a device used for this flow cytometry is called a flow cytometer (also called a “cell sorter”).
  • a vibrating element is provided in part of a channel through which particles surrounded by a sheath liquid flow.
  • the fluid ejected from the outlet of the passage is continuously formed into droplets.
  • the droplet containing the particles is given a positive (+) or negative (-) charge, or is made uncharged, and a deflection plate is used depending on the charge state.
  • the target particles are collected in the respective collection containers.
  • a group of liquid droplets deflected to the left or right by positive or negative charge passes through a certain trajectory, and appears to be a linear liquid flow with an inclination. These slanted, straight liquid streams are called “side streams", while the uncharged, vertically traveling droplets are called "center streams”.
  • Stabilizing the droplets so that this side stream is correctly guided to the collection container is important for maintaining a constant side stream trajectory.
  • the vibration element in a droplet observation image, the vibration element is driven so that the distance between the tip of the droplet immediately before the breakoff and the tip of the satellite droplet immediately before that is constant.
  • Techniques for controlling voltage and stabilizing droplets have been disclosed.
  • Patent Literature 2 discloses a technique for stabilizing liquid droplets by controlling the drive voltage of the vibrating element by focusing on the length of the first satellite.
  • Patent Document 3 although the main purpose is to stabilize the flow velocity during measurement, there is a problem in the flow path against the instability of droplets caused by fluctuations in the flow velocity of the sheath liquid due to changes in the environmental temperature.
  • the main purpose of this technology is to provide a technology that can stabilize droplets.
  • a vibrating unit that vibrates a fluid containing a sheath liquid by supplying driving voltages based on a plurality of frequencies; an imaging unit that acquires an image of a droplet; a liquid temperature control unit that controls the temperature of the sheath liquid; and a frequency control unit that acquires data about a state and controls the frequency of the drive voltage based on fluctuations in the data that accompany changes in the temperature of the sheath liquid.
  • a vibrating step of vibrating a fluid containing a sheath liquid by supplying drive voltages based on a plurality of frequencies an imaging step of acquiring an image of a droplet; a liquid temperature control step of controlling the liquid temperature of the sheath liquid; a control step of acquiring data on a state and controlling the frequency of the drive voltage based on fluctuations in the data associated with changes in the liquid temperature.
  • a fluid containing a sheath liquid is vibrated by supplying driving voltages based on a plurality of frequencies, and an image of the fluid and the droplet is generated at a position where the fluid is dropletized by the vibration.
  • to control the liquid temperature of the sheath liquid obtain data on the state of the droplet at each frequency for each liquid temperature of the sheath liquid from the captured image, and obtain the Also provided is a program that causes the particle sorting device to perform a function of controlling the frequency of the drive voltage based on data fluctuations.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration example of a first embodiment of a particle sorting device according to the present technology
  • FIG. FIG. 4 is a schematic diagram showing another configuration example of the first embodiment of the particle sorting device according to the present technology
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between one droplet cycle and the correct timing of the charging signal
  • FIG. 10 is a diagram showing how the droplet changes near the break-off position and the side stream trajectory opens and closes accordingly.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of observing droplets at a frequency of 100 kHz in an environment where the room temperature drops by 3.7° C. in one hour.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of observation of droplets at a frequency of 100 kHz when room temperature fluctuations within one hour are suppressed to 23.4 ⁇ 0.3° C.;
  • FIG. 10 illustrates an example of droplet instability at a particular frequency;
  • 6 is a flow chart showing an example of control by the particle sorting device according to the present technology; It is a figure which shows the mode of the control example by the particle
  • FIG. 10 is a diagram showing the result of fluctuation of the BOP length depending on the temperature of the sheath liquid;
  • particles aligned in a flow path are irradiated with light, the light emitted from each particle is detected, and based on the detection signal, a droplet containing the particles plus (+ ) or negative (-) charge or uncharged, divided into respective droplet trajectories by a deflection plate, and in a device for collecting target particles, a constant side stream trajectory that carries the particles to the collection container It is intended to keep
  • the charge pulse has the same time width T as one cycle of the droplet, so first, the timing is adjusted so that the break-off time of the target particle falls within the charge pulse width T.
  • the maximum voltage Vtop is obtained.
  • FIG. 3 shows the relationship between one droplet cycle and the correct timing of the charge signal.
  • Fluctuations in the droplet break-off position are measured by illuminating the droplet with a light source that blinks in synchronization with the drive signal of the vibrating element, and capturing an image of the droplet observed by the imaging element.
  • FIG. 4 shows that when the frequency is 100 kHz and the droplet is left for 2000 seconds, the droplet changes near the BOP and the side stream trajectory opens and closes accordingly.
  • the charging pulse is phased to the droplet so that the side stream opens to the maximum angle at the start of observation.
  • FIG. 4 shows that when the frequency is 100 kHz and the droplet is left for 2000 seconds, the droplet changes near the BOP and the side stream trajectory opens and closes accordingly.
  • the charging pulse is phased to the droplet so that the side stream opens to the maximum angle at the start of observation.
  • break-off timing advances with the lapse of time, and in particular, the length and position of the satellite droplets located between the main droplets change. After 2000 seconds, the break-off timing is advanced by an amount equivalent to one cycle of the droplet, and the side stream returns to the maximum angle again. Instead of the drop, the one drop above will be deflected.
  • the lighting for the side stream may be blocked by the collection container due to the configuration of the apparatus, or the sorting frequency may be very low. cannot be clearly observed. Therefore, this is a method of applying stabilization feedback control to droplets using the droplet observation image.
  • the liquid droplet observation image at the start of measurement is used as a reference, and the liquid droplet is adjusted by constant feedback to the driving voltage of the vibrating element so that no change occurs with respect to the reference.
  • the driving voltage of the vibrating element is controlled so that the distance from the end of the vibrating element is constant. Further, in Patent Document 2, the driving voltage of the vibration element is controlled by focusing on the length of the first satellite.
  • the most influential droplet fluctuation factor is the environmental temperature change, except for irregular cases such as foreign matter and air bubbles.
  • Fluctuations in the temperature of the sheath liquid due to changes in environmental temperature, heat generated by the device itself, etc. have two different effects on the droplets.
  • FIG. 5 shows an example of observation of droplets at a frequency of 100 kHz in an environment where the room temperature drops by 3.7° C. in one hour.
  • the first is the change in flow velocity. Fluctuations in the temperature of the sheath liquid cause changes in the viscosity of the sheath liquid. As a result, the pressure loss in the flow path increases and decreases, and as a result, the flow velocity of the jet discharged from the orifice fluctuates. For example, as a result of experiments conducted by the inventors of the present application, when the temperature of the sheath liquid is lowered to 4° C., the liquid viscosity increases by 8% and the flow velocity of the jet of 30 m/s decreases by about 2%. At this time, although the BOP is slightly shortened by 20 to 30 ⁇ m, the break-off time does not change. No.
  • the second is the change in break-off timing.
  • the break-off timing may fluctuate rapidly due to fluctuations in the temperature of the sheath liquid.
  • the breakoff timing is advanced by about two wavelengths (20 ⁇ sec). This change is of great concern because it directly affects the sidestream trajectory.
  • this phenomenon is thought to be caused by the vibration characteristics of the system as a whole. Depending on the formation conditions, it shows random behavior, and it is very difficult to deal with it.
  • a problem in the present technology is BOP variation caused by the second phenomenon.
  • FIG. 6 shows an example of observing droplets at a frequency of 100 kHz when room temperature fluctuations within one hour are suppressed to 23.4 ⁇ 0.3°C.
  • FIG. 5 it can be seen that changes in flow velocity and changes in break-off timing are greatly suppressed.
  • more precise droplet control is required to maintain a constant sidestream trajectory.
  • Patent Document 3 since the sheath liquid temperature fluctuation has a large effect, although the main purpose of Patent Document 3 is to stabilize the flow velocity during measurement, the sheath liquid flow velocity fluctuates due to environmental temperature changes. In order to deal with the instability of droplets that occurs in the flow path, there has been proposed a technique for controlling the temperature of the sheath liquid in the sheath liquid introduction section that introduces the sheath liquid into the channel.
  • FIG. 7 shows an example in which droplets become unstable at a specific frequency.
  • FIG. 7 shows that under the condition of a liquid feeding pressure of 600 kPa, droplets are constantly formed for about 2 hours, and the droplet frequency is changed in the range of 100 ⁇ 20 kHz, and the frequency characteristics of BOP are changed to 3 in 1 kHz steps. It was measured twice. Note that the driving voltage of the vibrating element was fixed and no feedback control was applied. In the first measurement the test chamber temperature was 25.6°C, in the second measurement the test chamber temperature was 26.5°C and in the third measurement the test chamber temperature was 26.8°C. In other words, FIG. 7 is obtained by evaluating droplet stability while the environmental temperature changes by 1.2° C. over about two hours.
  • the X-axis of the graph shown in FIG. 7 is the droplet frequency
  • the Y-axis is the BOP (position coordinates; the larger the value, the shorter the actual BOP length).
  • the BOP fluctuation is large and fluctuates by about 5 mm, which is one of the amplitudes of the vibration element. It can be said that this is an abnormal behavior corresponding to an order of magnitude change.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration example of a first embodiment of a particle sorting device 1 according to the present technology.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing another configuration example of the first embodiment of the particle sorting device according to the present technology.
  • the particle sorting device 1 shown in FIGS. 1 and 2 includes at least a vibrating section 11, an imaging section 12, a liquid temperature control section 13, and a frequency control section .
  • the particle sorting apparatus 1 optionally includes a channel P, a determination unit 15, a charging unit 16a, a deflection plate 16b, a collection container 16c, a break-off control unit 17, a detection unit 18, an analysis unit 19, and a storage unit. 20, a display unit 21, a user interface 22, and the like.
  • a fluid containing at least a sheath liquid flows through the flow path P.
  • the sample liquid containing the particles and the sheath liquid that flows so as to enclose the sample liquid may flow.
  • the flow path P may be provided in advance in the particle sorting device 1, but it is also possible to install a commercially available flow path or a disposable chip provided with a flow path.
  • the form of the flow path P is also not particularly limited, and can be designed freely as appropriate.
  • it is not limited to a channel formed in a two-dimensional or three-dimensional substrate such as plastic or glass as shown in FIG. can also be used.
  • the channel width, channel depth, channel cross-sectional shape, etc. of the channel P are also not particularly limited, and can be designed freely as appropriate.
  • a microchannel having a channel width of 1 mm or less can also be used in the particle sorting device 1 .
  • a microchannel having a channel width of about 10 ⁇ m or more and 1 mm or less can be particularly preferably used.
  • the vibrating section 11 vibrates the fluid containing the sheath liquid by supplying drive voltages based on at least two or more frequencies. This allows the fluid to be continuously dropletized to generate a fluid stream.
  • the plurality of frequencies may be a frequency range specified by a user.
  • the entire channel system including the nozzle as shown in FIG. It is applicable to the flow cell system in which only the nozzle is replaceable.
  • the vibration is applied by the vibration element 111, for example.
  • the vibrating element 111 is not particularly limited, and conventionally known elements can be appropriately selected and used. Specific examples include a piezo element.
  • the vibrating element 111 is preferably provided near the orifice O of the chip T. As shown in FIG.
  • the drive voltage is supplied to the vibrating section 11 by, for example, a voltage supply section.
  • the drive voltage is supplied according to, for example, a sinusoidal wave and is controlled by both frequency (clock value) and amplitude (drive value).
  • a sheath fluid inlet and sheath fluid flow paths P12a and P12b, a sample fluid inlet and sample fluid flow path P11, a main flow path P13 where these flow paths merge and are irradiated with light, and orifice O (exit nozzle) are integrated and replaceable.
  • the sample liquid flow path P11 is arranged linearly in the center, and the sheath liquid flow paths P12a and P12b branch left and right from the inlet so as to surround the sample liquid flow path P11. It becomes the road P13.
  • a laminar flow is formed so that the sample liquid is sandwiched between the sheath liquids, and advances to the linear flow path section where detection is performed by light irradiation.
  • a droplet D is formed from the liquid column L ejected from the orifice O.
  • the sheath liquid may be vibrated directly before the entrance of the tip T.
  • the sheath liquid and sample liquid are injected into a conical container.
  • the conical container is installed with its apex facing vertically downward, and a tube or the like for introducing the sheath liquid is connected to the upper side surface.
  • the upper surface of the conical container is open, and the vibrating element 111 is attached in a state sealed with an O-ring.
  • the sample liquid is injected vertically from above the container.
  • the conical container narrows at the bottom and is connected to a cuvette portion in which a main channel (straight channel) P13 is formed.
  • a laminar flow is formed in the conical container in such a manner that the sheath liquid surrounds the sample liquid, and when the laminar flow proceeds to the cuvette portion as it is, detection is performed by light irradiation in the main flow path P13.
  • a detachable outlet nozzle is installed at the end of the main flow path P13, and the connection is sloped to continuously narrow from the cuvette outlet to the outlet nozzle.
  • a vibrating element 111 mounted directly above the conical container gives the sheath liquid and the sample liquid minute vibrations in the longitudinal direction with respect to the flow.
  • the liquid column L ejected from the exit nozzle travels vertically downward while enlarging the constriction formed at the same frequency as the vibration of the vibrating element 111, and forms droplets at the break-off position from the nozzle exit.
  • the imaging unit 12 acquires an image of the fluid and the droplet at the position where the fluid is dropletized by the vibration. Specifically, at the break-off position, which is the position where the sheath liquid laminar flow discharged from the orifice O is formed into droplets, the fluid and droplets before being formed into droplets are imaged.
  • the imaging unit 12 include a droplet camera 121 such as a CCD camera and a CMOS sensor.
  • the droplet camera 121 can be arranged at a position where the droplet D can be imaged between the orifice O and a deflection plate 16b described later. Also, the droplet camera 121 can focus the captured image of the droplet D.
  • FIG. Examples of the light source that illuminates the imaging area in the droplet camera 121 include the strobe 122 and the like.
  • the imaging unit 12 can also obtain phase photographs at a certain time, and can continuously obtain the photographs within a certain period.
  • the “constant period” referred to here is not particularly limited, and may be one period or a plurality of periods. In the case of multiple cycles, each cycle may be temporally continuous or discontinuous.
  • the image captured by the droplet camera 121 is displayed on the display unit 21, which will be described later, and is used by the user to check the formation status of the droplets D (for example, the size, shape, and spacing of the droplets D).
  • the formation status of the droplets D for example, the size, shape, and spacing of the droplets D.
  • the strobe 122 may be controlled by the break-off control section 17, which will be described later.
  • the strobe 122 is composed of, for example, an LED for imaging droplets D and a laser for imaging particles (for example, a red laser light source). These switching is possible.
  • the specific structure of the strobe 122 is not particularly limited, and one or more conventionally known circuits or elements can be freely selected and used.
  • the liquid temperature control unit 13 controls the liquid temperature of the sheath liquid.
  • the liquid temperature control unit 13 may include, for example, a temperature sensor that measures the liquid temperature of the sheath liquid and a temperature control unit.
  • the temperature sensor and temperature control unit are connected through a circuit.
  • the installation position of the temperature sensor is not particularly limited, and it may come into direct contact with the sheath liquid, but in order to prevent contamination, it is preferably installed in a position where the temperature of the sheath liquid can be measured indirectly. .
  • a material with high thermal conductivity for example, a metal pipe
  • a temperature sensor is installed thereon. .
  • the temperature of the sheath liquid can be measured indirectly with high accuracy by covering the surface of the sensor with a heat insulating material so that the temperature sensor does not come into contact with the outside air. If there is a difference between the temperature detected by the temperature sensor and the target temperature to be reached, the liquid temperature control unit 13 may correct the target temperature of the temperature inspection unit, which will be described later, in consideration of this difference. .
  • the temperature sensor may be arranged in the vicinity of the channel where the sample liquid and the sheath liquid merge. preferable.
  • the temperature of the sheath liquid can be maintained even after the start of sorting, and destabilization of droplets due to fluctuations in the temperature of the sheath liquid can be suppressed.
  • the temperature sensor may be a sensor different from the temperature sensor provided in the liquid temperature control section 13 .
  • the temperature control unit may include, for example, a temperature control element, a metal member arranged to be in contact with the temperature control element, and a temperature inspection section that inspects the temperature of the metal member.
  • the temperature control element is, for example, a semiconductor cooling element or the like that produces a temperature difference by applying a direct current, and specifically includes a Peltier element or the like.
  • the metal member is not particularly limited, and can be made of copper, brass, or the like, for example.
  • the metal member may, for example, be placed in contact with a tubular member that supplies sheath fluid.
  • the temperature inspection unit is attached to the metal member, and inspects or controls the temperature of the metal member so that the temperature of the metal member reaches a target temperature.
  • the temperature control unit may further include a heat sink and a fan.
  • the frequency control unit 14 acquires data on the state of the droplet D at each frequency for each liquid temperature of the sheath liquid from the image captured by the imaging unit 12, and controls the sheath liquid.
  • the frequency of the driving voltage is controlled based on the fluctuation of the data accompanying the change in liquid temperature.
  • Data on the state of the droplet D include, for example, the size of the droplet D, the type of satellite droplet of the droplet D, the state of the liquid column L, the satellite droplet, and the main droplet, and the relationship between the droplet D and the liquid column L.
  • the combination state, the distance between the droplet D and the liquid column L, the break-off position of the droplet D (including the concept of "length of BOP"), and the like, among these, the break-off of the droplet D location is preferred.
  • the determination unit 15 determines the corresponding frequency as an "unstable frequency" when the difference between the break-off positions of the droplets is equal to or greater than a threshold. Further, when the difference between the break-off positions of the droplets is less than the threshold, the determination unit 15 may determine the corresponding frequency as the "stable frequency”. Further, the frequency at which the difference in the break-off positions of the droplets is the smallest may be determined as the "most stable frequency”.
  • the charging unit 16a charges the droplet D containing the target particles discharged from the orifice O.
  • the droplets D containing the target particles are formed into droplets by supplying a drive voltage based on a frequency other than the frequency determined as the “unstable frequency” by the determination unit 15 described above.
  • unstable frequencies can be eliminated in advance, so that sorting can be performed while droplets are stabilized.
  • particles can broadly include bio-related particles such as cells, microorganisms, and ribosomes, or synthetic particles such as latex particles, gel particles, industrial particles, and the like. Also, in the present technology, the particles may be contained in a fluid such as a liquid sample.
  • Bio-related particles can include chromosomes, ribosomes, mitochondria, organelles, etc. that constitute various cells.
  • Cells can include animal cells (eg, blood cells, etc.) and plant cells.
  • Microorganisms can include bacteria such as E. coli, viruses such as tobacco mosaic virus, fungi such as yeast, and the like.
  • Bio-related particles may also include bio-related macromolecules such as nucleic acids, proteins, and complexes thereof.
  • Technical particles can be, for example, organic or inorganic polymeric materials, metals, and the like.
  • Organic polymeric materials may include polystyrene, styrene-divinylbenzene, polymethylmethacrylate, and the like.
  • Inorganic polymeric materials may include glass, silica, magnetic materials, and the like.
  • Metals may include colloidal gold, aluminum, and the like.
  • the shape of these particles is generally spherical, but in the present technology, they may be non-spherical, and their size, mass and the like are not particularly limited. In the present technology, bio-related particles are preferred among these as the particles.
  • the particles may be labeled with one or more dyes such as fluorescent dyes.
  • fluorescent dyes include, for example, Cascade Blue, Pacific Blue, Fluorescein isothiocyanate (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidium iodide (PI), Texas red (TR), Peridinin chlorophyll protein (PerCP), Allophycocyanin (APC), 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), Cy3, Cy5, Cy7, Brilliant Violet (BV421) and the like.
  • the charging unit 16a can include a charging electrode and a voltage source that applies a desired voltage to the electrode.
  • the charging electrode may be placed in electrical contact with the sheath liquid flowing through the channel P, and may be inserted, for example, into the charging electrode inlet of the tip T as shown in FIG.
  • the deflection plate 16b deflects the traveling direction of each droplet D in the fluid stream by an electric force acting between the electric charge applied to the droplet D and guides it to a predetermined collection container 16c or the like. and are opposed to each other with the fluid stream S interposed therebetween.
  • the facing direction of the deflection plates 16b is indicated by the X-axis direction.
  • the deflection plate 16b is not particularly limited, and a conventionally known electrode or the like can be used. Different positive or negative voltages are applied to the deflection plates 16b, respectively, and when the charged droplets D pass through the electric field formed by this, an electric force (Coulomb force) is generated, and each droplet D is attracted toward one of the deflection plates 16b.
  • a plurality of collection containers 16c can be arranged substantially in a row in the direction facing the deflection plate 16b (the X-axis direction in FIG. 1).
  • the collection container 16c is not particularly limited, and examples thereof include plastic tubes and glass tubes.
  • FIGS. 1 and 2 show an example in which three containers are installed.
  • the collection container 16c may be exchangeably installed in a container for collection containers (not shown). Specifically, for example, a direction (the Z-axis in FIG. 1 direction) on a Z-axis stage (not shown).
  • the break-off control unit 17 controls the break-off of the droplet D containing the target particle based on the image of the state of the droplet D containing the target particle acquired by the imaging unit 12 .
  • the driving voltage of the vibration element 111 is adjusted based on the break-off timing of the droplet D containing the particles, which is specified by a plurality of droplet observation images captured by the imaging unit 12.
  • the combined state of the droplet D and the liquid column L and/or the distance between the droplet D and the liquid column L, and the break-off position of the droplet D are controlled to be maintained constant.
  • by constantly applying feedback to the drive voltage to adjust the droplets it is possible to suppress destabilization of the droplets after the start of sorting.
  • the detection unit 18 detects measurement target light generated from particles in the fluid flowing through the channel P by irradiation with light emitted from the light source 181 . Specifically, the detection unit 18 emits the light to be measured, which is generated from the particles by irradiating the particles that are sent in the main flow path P13 in a state substantially aligned in a line at the center of the three-dimensional laminar flow, to the detection unit. 18.
  • the light source 181 may be composed of a plurality of light sources, and in this case, the particles in the fluid flowing through the channel P can be irradiated with light from the plurality of light sources. Also, the plurality of light sources may emit light of the same wavelength, or may emit light of different wavelengths.
  • the type of light emitted from the light source 181 is not particularly limited, but light with a constant light direction, wavelength, and light intensity is desirable in order to reliably generate light from the particles.
  • a laser beam, an LED, or the like can be used.
  • laser light include semiconductor lasers, argon ion (Ar) lasers, helium-neon (He-Ne) lasers, dye lasers, krypton (Cr) lasers, and combinations of semiconductor lasers and wavelength conversion optical elements. Solid-state lasers and the like can be mentioned, and two or more of these can be used in combination.
  • the detection unit 18 includes at least one photodetector that detects the light to be measured.
  • the measurement target include fluorescence, scattered light (eg, forward scattered light, backscattered light, side scattered light, Rayleigh scattering, Mie scattering, etc.).
  • Each photodetector includes one or more photodetectors, such as a photodetector array.
  • Each photodetector may include one or more PMTs (photomultiplier tubes) and/or photodiodes such as APDs (Avalanche Photodiodes) and MPPCs (Multi-Pixel Photon Counters) as light receiving elements.
  • the photodetector may include, for example, a PMT array in which a plurality of PMTs are arranged in one dimension.
  • the detection unit 18 may include an imaging device such as a CCD (Charge Coupled Device) or a CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor).
  • the light to be measured is converted into an electrical signal by the photodetector, and the electrical signal is output to the determination unit 15 and the break-off control unit 17 described above, the analysis unit 19 described later, and the like, and is used to determine the characteristics of each particle. be done.
  • an imaging device such as a CCD (Charge Coupled Device) or a CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor).
  • CCD Charge Coupled Device
  • CMOS Complementary Metal-Oxide-Semiconductor
  • the detection unit 18 may include a light guide optical system for guiding a plurality of lights to predetermined positions, a detection optical system for causing light of a predetermined detection wavelength to reach the corresponding photodetector, and the like.
  • the light guide optical system may include optical components such as a beam splitter group, a mirror group, and an optical fiber, for example.
  • the light guide optical system may include a lens group for condensing the combined excitation light, and may include an objective lens, for example.
  • the detection optical system may include a spectroscopic section such as a prism or diffraction grating, or a wavelength separation section such as a dichroic mirror or optical filter.
  • the detection unit 18 may detect the properties of particles magnetically or electrically.
  • microelectrodes are arranged to face the main flow path P13 of the chip T, and resistance value, capacitance value (capacitance value), inductance value, impedance, change value of electric field between electrodes, magnetization, magnetic field change , magnetic field changes, etc. can be detected.
  • the analysis unit 19 is connected to the imaging unit 12, the detection unit 18, etc. described above, and performs analysis based on the image acquired by the imaging unit 12, the electrical signal detected by the detection unit 18, and the like.
  • the analysis unit 19 analyzes or calculates data regarding the state of the droplets D described above based on the image acquired by the imaging unit 12 . Also, the BOP fluctuation amount ⁇ BOP (difference in break-off position) or the like may be obtained from the data regarding the state of the droplet D.
  • FIG. 1 the BOP fluctuation amount ⁇ BOP (difference in break-off position) or the like may be obtained from the data regarding the state of the droplet D.
  • the analysis unit 19 can correct the detection value detected by the detection unit 18 and calculate the feature amount of each particle. For example, from the detected values of the received fluorescence and scattered light, the feature quantities such as particle size, form, and internal structure are calculated. It is also possible to perform fractionation determination based on the calculated feature amount and fractionation conditions received from the user interface 22, which will be described later, and to generate a fractionation control signal. By controlling the charging section 16a described above based on the fractionation control signal, particles of a specific type can be separated and collected.
  • the analysis unit 19 may be included in the housing in which the detection unit 18 and the like are provided, or may be outside the housing. Moreover, it is not essential in the particle sorting device 1 according to the present embodiment, and it is possible to use an external analysis device or the like. Also, the analysis unit 19 may be connected to each unit of the particle sorting device 1 via a network.
  • the storage unit 20 stores detection values detected by the detection unit 18, feature values calculated by the analysis unit 19, generated preparative control signals, preparative conditions input via the user interface 22, and other data for analysis and preparative separation. Memorize everything involved.
  • the storage unit 20 may be contained within the housing in which the detection unit 18 and the like are provided, or may be outside the housing. Moreover, it is not essential in the particle sorting apparatus 1 according to the present embodiment, and it is possible to use an external storage device (for example, a hard disk, etc.). Moreover, the storage unit 20 may be connected to each unit of the particle sorting device 1 via a network.
  • the display unit 21 can display all items related to analysis and fractionation, and can display, for example, the feature amount of each particle calculated by the analysis unit 19 as a histogram or the like. It is also possible to display an image captured by the imaging unit 12 or the like.
  • the display unit 21 is not essential in the particle sorting device 1 according to the present embodiment, and it is possible to use an external display device (eg, display, printer, personal digital assistant, etc.). Also, the display unit 21 may be connected to each unit of the particle sorting device 1 via a network.
  • an external display device eg, display, printer, personal digital assistant, etc.
  • the display unit 21 may be connected to each unit of the particle sorting device 1 via a network.
  • the user interface 22 is a part operated by the user. Via the user interface 22, the user can input various data, access each section of the particle sorting apparatus 1, and control each section. For example, via the user interface 22, a region of interest is set for a histogram or the like displayed on the display unit 21, and fractionation conditions and the like are determined.
  • the user interface 22 is not essential in the particle sorting device 1 according to this embodiment, and it is possible to use an external operating device (for example, a mouse, a keyboard, a mobile information terminal, etc.). Also, the user interface 22 may be connected to each part of the particle sorting device 1 via a network.
  • an external operating device for example, a mouse, a keyboard, a mobile information terminal, etc.
  • the user interface 22 may be connected to each part of the particle sorting device 1 via a network.
  • each part of the particle sorting apparatus 1 can be controlled by a general-purpose computer, a control part including a CPU, a recording medium (e.g., non-volatile memory (e.g., USB memory, etc.), HDD, CD etc.) can be stored as a program in a hardware resource and made to function.
  • a control part including a CPU, a recording medium (e.g., non-volatile memory (e.g., USB memory, etc.), HDD, CD etc.) can be stored as a program in a hardware resource and made to function.
  • the functions may be implemented by a server computer or a cloud connected via a network.
  • FIG. 8 is a flow chart showing the control example.
  • FIG. 9 is a diagram showing the state of the control example, in which downward arrows all indicate unstable frequencies. Note that the execution of the operation described below may be controlled by a control unit (not shown) that controls the particle sorting device 1 or the like.
  • control flow example shown below coexists with the conventional droplet stabilization method described above, and may be inserted, for example, before the conventional method. It is possible to reduce the burden in the methods of (1) and to make the effects of these methods more effective.
  • step S101 parameters related to droplet formation other than frequency (mainly sheath liquid feeding pressure and driving voltage) are determined (step S101).
  • the sheath liquid feeding pressure is preferably the same as that during sorting.
  • the drive voltage is adjusted again according to the selected frequency before the start of sorting, it is not necessary to make the drive voltage the same at this stage.
  • step S103 the measurement start frequency; fb, the measurement end frequency; fe, and the measurement frequency step; ⁇ f are set.
  • the nozzle diameter and the sheath liquid feeding pressure are determined, there is an optimum frequency fs based on the corresponding physical properties (surface tension), so the range of ⁇ 10 to 20% around this fs should be investigated. is preferred.
  • step S103 similarly to step S102, if the frequency range is too wide or the frequency steps are too fine, the number of BOP measurement points will increase, requiring an excessive amount of time. Therefore, depending on the speed of BOP measurement, for example, about 10 BOP measurement points may be set for one sheath liquid temperature.
  • the vibrating section 11 vibrates the fluid containing only the sheath liquid to form droplets D. form (step S104).
  • the sheath liquid needs to flow through the channel P, and the sample liquid containing particles does not need to flow.
  • the liquid temperature control unit 13 sets the liquid temperature of the sheath liquid to the temperature T1, and waits for the liquid temperature to stabilize (step S105).
  • the break-off position data is obtained for each of the designated frequencies [fb, fb+ ⁇ f, fb+2 ⁇ f, . . . fe] (step S106).
  • the data can be acquired by analyzing an image captured by the imaging unit 12 by the analysis unit 19 . Also, if the position of the droplet camera 121 can be moved to track the BOP, the Z position of the camera 121 can be given to calculate the BOP.
  • the liquid temperature control unit 13 sets the liquid temperature of the sheath liquid to the temperature T2, and waits for the liquid temperature to stabilize again (step S107).
  • the data of the break-off positions are acquired again for the designated frequencies [fb, fb+ ⁇ f, fb+2 ⁇ f, . . . fe] (step S108).
  • step S109 the liquid temperature of the sheath liquid is set to the temperature Tn+1 until the liquid temperature of the sheath liquid reaches the temperature Tx (steps S109 to S110), and step S108 is repeated.
  • the analysis unit 19 analyzes the break-off position data obtained in the BOP measurement process described above. break-off position difference) is obtained (step S111).
  • the allowable BOP fluctuation amount; Bth is set (step S112).
  • Bth for example, when performing droplet stabilization control by feedback to the drive voltage, if a large voltage fluctuation range of about ⁇ 50% with respect to the initial value of the drive voltage is required, there is a danger that the output voltage range will be exceeded. Therefore, it is set in consideration of the BOP fluctuation of about one droplet before and after, which is a range in which the side stream trajectory can be easily stabilized by the feedback control. Specifically, for example, since it is known that the standard droplet interval is approximately nozzle diameter ⁇ 4.5, Bth can be arbitrarily determined from the relationship with the nozzle diameter used for measurement. In the example shown in FIG. 9, Bth is set to 0.6 mm.
  • the determination unit 15 compares ⁇ BOP and Bth at each frequency (step S113). If ⁇ BOP ⁇ Bth (YES in step S114), the determination unit 15 determines the corresponding frequency as the “unstable frequency”, and based on the determination result, the frequency control unit 14 adjusts the unstable frequency to the drive voltage. are excluded from the options of frequencies that can be taken as the frequency of (step S115). On the other hand, when ⁇ BOP ⁇ Bth (NO in step S114), the determination unit 15 determines the corresponding frequency as the “stable frequency”, and based on the determination result, the frequency control unit 14 drives the stable frequency. It can be included in the frequency options that can be taken as the frequency of the voltage (step S118).
  • the frequency control unit 14 may use any frequency as the stable frequency other than the unstable frequency excluded in step S115. Thereby, the side stream trajectory can be stabilized.
  • frequencies indicated by downward arrows are frequencies determined to be "unstable frequencies”.
  • other criteria for selecting the frequency include the event rate or the probability of occurrence of doublets (a state in which multiple particles are included in one droplet) with respect to sorting performance.
  • droplets there are indicators such as that an appropriate break-off position can be obtained with an appropriate driving voltage, or that a FAST satellite state with higher stability of the side stream trajectory is likely to occur. Therefore, the user can comprehensively judge these and determine the final frequency.
  • the process may be continued after excluding unstable frequencies in step S115.
  • An example of the algorithm is the method described in JP-A-2020-76786.
  • the guideline for frequency selection is that the BOP length should be as short as possible and that the satellite should be collected by the main droplet within an arbitrary designated distance range.
  • the most stable frequency is obtained from the stable frequency options (YES in step S119), and the frequency control unit 14 adopts the frequency with the smallest ⁇ BOP as the most stable frequency. can be done (step S120).
  • This is useful, for example, when the reliability of the sheath liquid temperature control accuracy is low (for example, when environmental temperature changes are large and may exceed the processing capacity of the temperature control unit 13).
  • the actual device is often used in a sealed environment of a safety cabinet, and the temperature inside the cabinet may continue to rise over time due to heat radiation from the temperature control unit 13, etc. In an environment where liquid temperature fluctuations are a concern, it is particularly effective to employ the most stable frequency.
  • ⁇ BOP is similarly small, a plurality of the most stable frequencies may exist.
  • an appropriate frequency can be selected from the stable frequency options that satisfy ⁇ BOP ⁇ Bth (step S116).
  • the most stable frequency against environmental temperature changes within the specified frequency range can be investigated in advance before sorting. For example, even if the environmental temperature changes greatly and the processing capacity of the temperature control unit 13 cannot handle it and the liquid temperature cannot be kept constant, by selecting the frequency, feedback control to the driving voltage of the vibration element can be combined. droplets can be stabilized.
  • the device has an existing frequency selection algorithm, it is possible to automatically determine a more optimized frequency by excluding unstable frequencies in advance before performing the processing.
  • the series of control flows described above can be easily executed in about 20 minutes. A stable operation can be reliably realized even when the state of the device changes or the state of the device changes.
  • the particle sorting method performs at least a vibration process, an imaging process, a liquid temperature control process, and a frequency control process. Moreover, a determination step, a charging step, and the like may be performed as necessary. In addition, since the specific method performed in each step is the same as the method performed in each part of the particle sorting apparatus 1 according to the first embodiment described above, the description is omitted here.
  • the charging step of charging droplets containing target particles is performed after the determination step.
  • the droplets containing the target particles are formed into droplets by vibration caused by supply of a driving voltage based on a frequency other than the unstable frequency. That is, by performing the determination step in advance before the start of sorting, it is possible to deal with errors in each device, changes in the environmental temperature, changes in the state of the device, and the like, so that particles can be fractionated with higher accuracy.
  • the determination process does not necessarily need to be performed every time before starting sorting.
  • the orifice O of the chip T is removed for cleaning or replacement, or when parts of the flow cell are replaced, it is better to perform the determination process as much as possible.
  • the tendency of the frequency behavior may change due to the individual difference of the chip T and chucking reproducibility.
  • the unstable frequency and the most stable frequency were searched.
  • a jet velocity of 30.0 m/s was obtained.
  • Fig. 10 shows the variation results of the BOP length depending on the temperature of the sheath liquid at each frequency. Since the vertical axis of this graph is "BOP length (BOP length)", it is reversed from FIG. 9 and the lower side of the graph is shorter.
  • the frequency with the lowest ⁇ BOP was 111 kHz.
  • the .DELTA.BOP is 26 .mu.m and tends to increase as the liquid temperature rises. Therefore, considering the measurement error of BOP, 80 kHz, 107 kHz, and 112 kHz, where ⁇ BOP ⁇ 100 ⁇ m, can also be considered to have similar stability, and are candidates for the most stable frequency.
  • the frequency for measurement is determined from these most stable frequencies.
  • the time required for measuring the BOP length was 12 minutes per step of the temperature parameter.
  • the breakdown was as follows: for every 1° C. rise in the sheath liquid temperature, the stabilization time was 4 minutes, and for the measurement at 41 frequency points, the automatic measurement time was 8 minutes.
  • a vibrating unit that vibrates a fluid containing a sheath liquid by supplying driving voltages based on a plurality of frequencies; an imaging unit that acquires an image of the fluid and the droplet at a position where the fluid is dropletized by the vibration; a liquid temperature control unit that controls the liquid temperature of the sheath liquid; Data on the state of the droplet at each frequency for each temperature of the sheath liquid is obtained from the image captured by the imaging unit, and the a frequency control unit that controls the frequency of the drive voltage; A particle sorting device.
  • the particle sorting apparatus according to any one of [4] to [6], further comprising a determination unit that determines a frequency as a stable frequency when the difference in break-off positions of the droplets is less than a threshold.
  • the frequency control unit adopts a frequency of the driving voltage at which the difference in the break-off positions of the droplets is the smallest.
  • a charging unit that charges droplets containing the desired particles;
  • the particle sorting apparatus according to [6], wherein the droplets containing the particles are droplets formed by vibration caused by supply of a driving voltage based on a frequency other than the unstable frequency.
  • the particle sorting apparatus according to [9], wherein the liquid temperature control unit includes a temperature sensor arranged near a flow path where the sample liquid containing the particles and the sheath liquid merge.
  • the imaging unit acquires an image of the state of the droplet containing the particles.
  • the particle sorting device according to [9] or [10], further comprising a break-off control unit that controls break-off of droplets containing the particles based on the image of the state captured by the imaging unit.
  • the particle sorting device according to any one of [9] to [11], wherein the particles are biologically relevant particles.
  • Particle sorting device 11 Vibration unit 111: Vibration element 12: Imaging unit 121: Droplet camera 122: Strobe 13: Liquid temperature control unit 14: Frequency control unit 15: Judgment unit 16a: Charging unit 16b: Deflecting plate 16c : collection container 17: break-off control unit 18: detection unit 181: light source 19: analysis unit 20: storage unit 21: display unit 22: user interface P: channel T: chip P11: sample liquid channels P12a, P12b: sheath Liquid flow path P13: Main flow path D: Droplet BOP: Break-off position O: Orifice L: Liquid column

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Abstract

液滴を安定化させることが可能な技術を提供すること。　シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える振動部と、前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する撮像部と、前記シース液の液温を制御する液温制御部と、前記撮像部で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴のブレイクオフに関するデータを取得し、前記シース液の液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する周波数制御部と、を有する、粒子分取装置などを提供する。

Description

粒子分取装置、粒子分取方法及びプログラム
　本技術は、粒子分取装置、粒子分取方法及びプログラムに関する。より詳しくは、液滴を安定化させることが可能な、粒子分取装置、粒子分取方法及びプログラムに関する。
　現在、細胞や微生物等の生体関連粒子、マイクロビースなどの粒子の分析には、フローサイトメトリーという技術が利用されている。フローサイトメトリーとは、粒子を流体中に整列させた状態で流し込み、当該粒子に光を照射することにより、各粒子から発せられた光を検出することで、粒子の解析や分取を行う分析手法である。このフローサイトメトリーに用いられる装置は、フローサイトメータ（「セルソータ」とも称する。）と呼ばれている。
　フローサイトメータでは、一般的に、シース液に包まれた粒子が通流する流路の一部に振動素子が設けられており、この振動素子により前記流路の一部に振動を与え、流路の吐出口から吐出される流体を連続的に液滴化する。そして、光の照射により得られた検出信号に基づいて粒子を内包した液滴に対し、プラス（＋）又はマイナス（－）の荷電を付与し、或いは非荷電とし、偏向板により荷電状態に応じて***し、それぞれの回収容器に目的とする粒子が回収される。プラス荷電又はマイナス荷電により左右に偏向された液滴群は、それぞれ一定の軌道を通過し、外観上は傾斜のついた直線状の液流となる。非荷電で垂直下方向に進行する液滴群を「センターストリーム」と呼ぶのに対し、これらの傾斜のついた直線状の液流を「サイドストリーム」と呼ぶ。
　このサイドストリームが回収容器へ正しく導かれるよう、液滴を安定化することが、サイドストリーム軌道を一定に維持する上で重要である。これに対し、例えば、特許文献１には、液滴観察画像において、ブレイクオフ直前の液滴の先端とその一つ手前のサテライト液滴の末端との距離が一定になるように振動素子の駆動電圧を制御し、液滴を安定化する技術が開示されている。また、特許文献２には、第１サテライトの長さに着目して振動素子の駆動電圧を制御し、液滴を安定化する技術が開示されている。更に、特許文献３には、測定時の流速を安定化させることが主目的ではあるものの、環境温度変化によりシース液の流速が変動することで起こる液滴の不安定化に対し、流路に対してシース液を導入するシース液導入部において、シース液の液温を制御する技術が開示されている。
国際公開第２０１４／１１５４０９号パンフレット 特開２００６－２９２７６９号公報 特開２０１９－１９０９９１号公報
　しかしながら、サイドストリーム軌道を一定に維持し、液滴を安定化させるための技術は未だ不十分であり、更なる技術の開発が求められているという実情がある。
　そこで、本技術では、液滴を安定化させることが可能な技術を提供することを主目的とする。
　本技術では、まず、シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える振動部と、前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する撮像部と、前記シース液の液温を制御する液温制御部と、前記撮像部で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記シース液の液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する周波数制御部と、を有する、粒子分取装置を提供する。
　また、本技術では、シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える振動工程と、前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する撮像工程と、前記シース液の液温を制御する液温制御工程と、前記撮像部で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する制御工程と、を行う、粒子分取方法も提供する。
　更に、本技術では、シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与え、前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得し、前記シース液の液温を制御し、撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する機能を、粒子分取装置に実行させるプログラムも提供する。
本技術に係る粒子分取装置の第１実施形態の構成例を示す模式図である。 本技術に係る粒子分取装置の第１実施形態の他の構成例を示す模式図である。 液滴一周期と荷電信号の正しいタイミングとの関係を示す図である。 ブレイクオフ位置付近で液滴が変化し、それに伴ってサイドストリーム軌道が開閉する様子を示す図である。 １時間で３．７℃室温が低下する環境下で、周波数を１００ｋＨｚとし、液滴を観察した例を示す図である。 １時間内の室温変動を２３．４±０．３℃に抑えた場合において、周波数を１００ｋＨｚとし、液滴を観察した例を示す図である。 特定の周波数において液滴が不安定になる例を示す図である。 本技術に係る粒子分取装置による制御例を示すフローチャートである。 本技術に係る粒子分取装置による制御例の様子を示す図である。 シース液の液温に依存するＢＯＰ長の変動結果を示す図である。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。
　以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。

１．本技術の概要
２．第１実施形態（粒子分取装置１）
（１）流路Ｐ
（２）振動部１１
（３）撮像部１２
（４）液温制御部１３
（５）周波数制御部１４
（６）判定部１５
（７）荷電部１６ａ，偏向板１６ｂ，回収容器１６ｃ
（８）ブレイクオフ制御部１７
（９）検出部１８
（１０）解析部１９
（１１）記憶部２０
（１２）表示部２１
（１３）ユーザインターフェース２２
（１４）その他
３．制御フロー例
（１）測定パラメータ設定プロセス（ステップS101～S103）
（２）ＢＯＰ測定プロセス（ステップS104～S110）
（３）ＢＯＰデータ解析プロセス（ステップS111～S120）
（４）効果
４．第２実施形態（粒子分取方法）
１．本技術の概要
　本技術は、流路中に整列させた状態の粒子に光を照射し、各粒子から発せられた光を検出し、検出信号に基づいて前記粒子を内包した液滴に対して、プラス（＋）又はマイナス（－）の荷電を付与し、或いは非荷電とし、偏向板によりそれぞれの液滴軌道に***させ、目的とする粒子を回収する装置において、粒子を回収容器へ運ぶサイドストリーム軌道を一定に維持するためのものである。
　サイドストリーム軌道を一定にするためには、時間的変動や揺らぎの少ない、精密な液滴の制御が要求される。ここで、上述した装置における液滴への荷電は、液滴が液柱から切断される瞬間に行われる。したがって、液滴切断（「ブレイクオフ」（Break Off）とも称する。）と荷電パルスとのタイミング調整が必須である。荷電信号のパルス幅内でブレイクオフがなされなければ、液滴に十分な電荷を与えられず、電荷量に比例して偏向角度は狭まり、サイドストリームは内側へ閉じてしまう。
　通常、荷電パルスは液滴一周期と同じ時間幅Ｔを持たせているので、まずは、目的とする粒子のブレイクオフ時刻が、荷電パルス幅Ｔの間に入るようにタイミング調整を行う。ただし、実際の荷電パルスには、荷電信号の立上り時間；Ｔｒ、立下り時間；Ｔｆが存在するため、最大電圧；Ｖｔｏｐが得られる実効的パルス幅：Ｔｅは、Ｔからそれらを引いて、Ｔｅ＝Ｔ－（Ｔｆ＋Ｔｒ）となる。例えば、駆動電圧の周波数が１００ｋＨｚであれば、液滴一周期Ｔ＝１０μｓｅｃ、そして、Ｔｒ，Ｔｆがともに３μｓｅｃであれば、Ｔｅ＝４μｓｅｃに半減する。単純化すれば、このＴｅ値が、ブレイクオフの時間変動として許されるマージンである。図３に、液滴一周期と荷電信号の正しいタイミングとの関係を示す。
　液滴のブレイクオフ位置（「ブレイクオフポイント」、「ＢОＰ」とも称する。）の変動は、振動素子の駆動信号と同期して点滅する光源で液滴を照明し、撮像素子により液滴観察画像を取得することで詳細に観察できる。例えば、図４に、周波数を１００ｋＨｚとし、液滴を２０００秒間放置した場合、ＢＯＰ付近で液滴が変化し、それに伴ってサイドストリーム軌道が開閉する様子を示す。図４では、観察開始時にサイドストリームが最大角に開くように、荷電パルスの位相を液滴に対して合わせ込んでいる。図４では、時間の経過とともにブレイクオフタイミングが早まり、特に、主液滴同士の間に位置するサテライト液滴の長さと位置が変化する様子が見て取れる。そして、２０００秒後には、ほぼ液滴一周期に相当する分、ブレイクオフタイミングが早まったために、再びサイドストリームが最大角に戻ってはいるが、本来荷電を行わなくてはいけない下側の液滴ではなく、一つずれて上側の液滴が偏向されてしまうことになる。
　目的とする粒子を含む液滴の分取（「ソーティング」とも称する。）動作時間を通じてサイドストリーム軌道を一定に維持するためには、上述した液滴観察画像について変化がほぼ検知できないレベルに保つ必要がある。その対策として、従来、液滴安定化の手法がいくつか提案されてきた。ここでは、代表的な手法として以下の２つを挙げる。
　（ｉ）液滴観察画像を参照し、液滴に対して安定化制御を行う。
　（ｉｉ）シース液の液温を一定に維持する。
　以下、それぞれの手法について詳細に説明する。
　上記（ｉ）の手法では、ソーティング中には、装置構成上サイドストリーム用の照明が回収容器に遮られたり、或いはソーティング頻度が非常に少なかったりして、図４で示したようにサイドストリーム軌道が鮮明に観察できるとは限らない。したがって、液滴観察画像を利用して、液滴に対して安定化フィードバック制御をかける手法である。具体的には、測定開始時の液滴観察画像をリファレンスとして、それに対して変化が生じないように、振動素子の駆動電圧に常時フィードバックをかけて液滴を調整する。液滴観察画像の着眼点には、これまでいくつかの提案があり、例えば、上記特許文献１では、液滴観察像において、ブレイクオフ直前の液滴の先端とその一つ手前のサテライト液滴の末端との距離が一定になるように振動素子の駆動電圧を制御している。また、上記特許文献２では、第１サテライトの長さに着目して振動素子の駆動電圧を制御している。
　上記（ｉｉ）の手法では、液滴変動要因として最も影響が大きいものは、異物や気泡混入といったイレギュラーな場合を除き、環境温度変化であり、特に、直接影響するのはシース液の液温であるという考えに基づく。環境温度変化や装置自体の発熱等により、シース液の液温が変動すると、液滴に対して２つの異なる影響を与える。ここで、１時間で３．７℃室温が低下する環境下で、周波数を１００ｋＨｚとし、液滴を観察した例を図５に示し、それぞれの影響について詳細に説明する。
　１つ目は、流速の変化である。シース液の液温が変動することにより液粘度が変化するため、流路内での圧力損失の増減が生じた結果、オリフィスから吐出されるジェットの流速が変動する。例えば、本願発明者らが実験した結果、４℃のシース液の液温低下では液粘度が８％上昇し、３０ｍ／ｓのジェットの流速が約２％低下した。この際、ＢＯＰが２０～３０μｍ短くなる程度の微小な変動はしてはいるが、ブレイクオフ時刻は変わらないため、荷電信号とのタイミングのずれは発生せず、サイドストリーム軌道には影響を与えない。
　２つ目は、ブレイクオフタイミングの変化である。シース液の液温変動によってブレイクオフタイミングが急速に変動する場合がある。図５では、最初の３０分間で室温が約２℃下降した段階で、約２波長分（２０μｓｅｃ）ブレイクオフタイミングが早まっている。この変化は、サイドストリーム軌道に直接影響を与えるため、大きな問題となる。この現象は、上述した１つ目のように、シース液の物性に基づき再現性がある現象とは異なり、系全体としての振動特性に原因があるものと考えられるため、装置の状態や液滴形成条件によってはランダムな挙動を示し、対応が非常に困難である。本技術において問題とするのは、２つ目の現象を要因とするＢＯＰ変動である。
　ここで、１時間内の室温変動を２３．４±０．３℃に抑えた場合において、周波数を１００ｋＨｚとし、液滴を観察した例を図６に示す。図５と比較すると、流速の変化、及びブレイクオフタイミングの変化が大きく抑制されていることが分かる。ただし、サイドストリーム軌道を一定に維持するためには、更に高精度な液滴制御が必要である。
　このようにシース液の液温変動が与える影響は大きいため、上記特許文献３では、測定時の流速を安定化させることが主目的ではあるものの、環境温度変化によりシース液の流速が変動することで起きる液滴の不安定化に対し、流路に対してシース液を導入するシース液導入部において、シース液の液温を制御する技術が提案されている。
　液滴安定化の手法として、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の２つのアプローチはいずれも正しく、有効である。しかしながら、これらの対策を行っても制御不可能なほど、液滴が著しく不安定化する場合があり、予めそのような事態を避ける必要がある。本技術は、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の２つのアプローチに先立ち、元々、環境温度変化に対して耐性が高い液滴安定条件の探索方法を提案するものである。
　ここで、特定の周波数において液滴が不安定になる例を図７に示す。図７は、送液圧力が６００ｋＰａの条件下で、約２時間に渡って常時液滴を形成しつつ、液滴周波数を１００±２０ｋＨｚの範囲で変化させ、ＢＯＰの周波数特性を１ｋＨｚステップで３回測定したものである。なお、振動素子の駆動電圧は固定し、フィードバック制御はかけていない。１回目の測定では試験室温度は２５．６℃であり、２回目の測定では試験室温度は２６．５℃であり、３回目の測定では試験室温度は２６．８℃であった。つまり、図７は、約２時間に渡って環境温度が１．２℃変化する中で、液滴安定性の評価を行ったものである。また、図７に示すグラフのＸ軸は液滴周波数、Ｙ軸はＢＯＰ（位置座標であり、値が大きくなるほど実際のＢＯＰ長は短くなる。）である。
　図７に示すように、１．２℃の温度変化に対して約２時間の間、ほとんどＢＯＰが変動しない周波数と、大きく変動する周波数とが存在する。前者としては、８５～９２ｋＨｚ、９５～１０１ｋＨｚなどが挙げられ、これらの周波数は、温度変化に対して安定する周波数と言える。一方で、後者としては、８０～８２ｋＨｚ、９３～９４ｋＨｚ、１０５～１０６ｋＨｚなどが挙げられ、特に、１０５～１０６ｋＨｚにおいてはＢＯＰ変動が大きく、５ｍｍ程度変動しており、これは振動素子の振幅の一桁変化に相当する異常な挙動であると言える。そのため、このレベルのＢＯＰ変動が発生した場合、従来の液滴安定化の手法では対応不可能となる場合も考えられる。具体的には、上記（ｉ）の手法では、ＢＯＰ変動が大き過ぎる場合に、駆動電圧の調整範囲を越えてしまい制御不可能となり得る。また、上記（ｉｉ）の手法では、シース液の液温変動を完全にゼロに抑え込むことは現実的に難しい。
　以上の理由から、より高精度にサイドストリーム軌道を制御し、液滴を安定化させるため、経時的な環境温度変化等に対して周波数を制御することが望ましいと言える。
２．第１実施形態（粒子分取装置１）
　図１は、本技術に係る粒子分取装置１の第１実施形態の構成例を示す模式図である。また、図２は、本技術に係る粒子分取装置の第１実施形態の他の構成例を示す模式図である。
　図１及び図２に示す粒子分取装置１は、振動部１１と、撮像部１２と、液温制御部１３と、周波数制御部１４と、を少なくとも有する。また、粒子分取装置１は、必要に応じて、流路Ｐ、判定部１５、荷電部１６ａ、偏向板１６ｂ、回収容器１６ｃ、ブレイクオフ制御部１７、検出部１８、解析部１９、記憶部２０、表示部２１、ユーザインターフェース２２等を含んでいてもよい。
（１）流路Ｐ
　流路Ｐは、少なくともシース液を含む流体が通流する。また、必要に応じて、粒子を含むサンプル液と当該サンプル液を内包するように流れるシース液とが通流してよく、この場合、流路Ｐは、粒子が略一列に並んだ流れが形成されるように構成され得る。流路Ｐは、粒子分取装置１に予め備えられていてもよいが、市販の流路や流路が設けられた使い捨てのチップなどを設置することも可能である。
　流路Ｐの形態も特に限定されず、適宜自由に設計できる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板内に形成した流路に限らず、図２に示すような従来のフローサイトメータで用いられているような流路も用いることができる。
　流路Ｐの流路幅、流路深さ、流路断面形状等も特に限定されず、適宜自由に設計できる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、粒子分取装置１に用いることができる。
　本技術においては、特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路を好適に用いることができる。
（２）振動部１１
　振動部１１は、シース液を含む流体に対し、少なくとも２以上の複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える。これにより、前記流体を連続的に液滴化し、流体ストリーム（液滴の流れ）を発生させることができる。前記複数の周波数は、ユーザにより指定された周波数領域であってもよい。本実施形態は、図１に示すようなノズルを含む流路系全体が一体化され、交換可能となっているチップ方式や、図２に示すような流路系が固定されており、先端のノズルのみ交換可能なフローセル方式に適用可能である。
　前記振動は、例えば、振動素子１１１により付与される。振動素子１１１としては特に限定されず、従来公知のものを適宜自由に選択して用いることができるが、具体的には、ピエゾ素子などが挙げられる。振動素子１１１は、流路ＰとしてチップＴを用いた場合は、チップＴのオリフィスＯの付近に設けられていることが好ましい。
　振動部１１に対する駆動電圧の供給は、例えば、電圧供給部により行われる。駆動電圧は、安定した液滴Ｄを形成するために、例えば、正弦波に従って供給され、周波数（クロック値）と振幅（ドライブ値）の２つにより制御される。
　図１に示すようなチップ方式の場合、シース液インレットとシース液流路Ｐ１２ａ，Ｐ１２ｂ、サンプル液インレットとサンプル液流路Ｐ１１、それらの流路が合流し、光が照射される主流路Ｐ１３、及びオリフィスО（出口ノズル）等が一体化されており、交換式となっている。サンプル液流路Ｐ１１が中央に直線的に配置され、シース液流路Ｐ１２ａ，Ｐ１２ｂは当該サンプル液流路Ｐ１１を取り囲むように入口から左右に分岐し、やがて３本の流路が合流して主流路Ｐ１３となる。これにより、サンプル液をシース液で挟むように層流が形成され、光の照射による検出を行う直線流路部へと進行する。この場合、チップＴを形成する基板表面の一部に対して振動素子１１１により振動を与えると、オリフィスОから射出された液柱Ｌから液滴Ｄが形成される。或いは、シース液をチップＴの入り口手前で直接振動させてもよい。
　図２に示すようなフローセル方式の場合、シース液、及びサンプル液は、円錐状容器内へ注入される。当該円錐状容器は、その頂点を垂直下向きにして設置されており、上部側面にシース液を導入するためのチューブ等が接続されている。円錐状容器の上面は開放されており、振動素子１１１がＯリングでシールされた状態で取り付けられている。サンプル液は容器上方から垂直に注入される。前記円錐状容器は最下部で狭まり、その先は主流路（直線流路）Ｐ１３が内部に形成されたキュベット部へ連結している。円錐状容器内でシース液がサンプル液を取り囲むようにして層流が形成され、そのまま層流としてキュベット部へ進行すると、主流路Ｐ１３において光の照射による検出が行われる。主流路Ｐ１３の終点では脱着可能な出口ノズルが設置されており、接続部はキュベット出口から出口ノズルへ連続的に狭まるようスロープ状となっている。シース液、及びサンプル液は円錐状容器の直上に取り付けられた振動素子１１１から、流れに対して前後方向へ、微小な加振を与えられる。そして、出口ノズルから射出された液柱Ｌは、振動素子１１１による振動と同一の周波数で形成されたクビレを拡大させつつ垂直下方向へ進行し、ノズル出口からブレイクオフ位置で液滴化する。
（３）撮像部１２
　撮像部１２は、前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する。具体的には、オリフィスＯから排出されたシース液層流が液滴化される位置であるブレイクオフ位置において、液滴化する前の流体及び液滴を撮像する。
　撮像部１２としては、具体的には、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳセンサ等のドロップレットカメラ１２１などが挙げられる。ドロップレットカメラ１２１は、オリフィスＯと後述する偏向板１６ｂとの間における、液滴Ｄを撮像可能な位置に配置し得る。また、ドロップレットカメラ１２１は、撮像した液滴Ｄの画像の焦点調節を行い得る。ドロップレットカメラ１２１において撮影領域を照明する光源としては、例えば、ストロボ１２２などが挙げられる。なお、撮像部１２では、ある時間における位相の写真を得ることもでき、一定周期内の当該写真を連続して取得することも可能である。ここでいう「一定周期」とは特に限定されず、一周期でもよく、複数周期であってもよい。複数周期の場合は、それぞれの周期が時間的に連続していてよく、不連続であってもよい。
　ドロップレットカメラ１２１により撮像された画像は、後述する表示部２１に表示されて、ユーザが液滴Ｄの形成状況（例えば、液滴Ｄの大きさ、形状、間隔など）を確認するために利用され得る。
　ストロボ１２２は、後述するブレイクオフ制御部１７によって制御されていてよい。ストロボ１２２は、例えば、液滴Ｄを撮像するためのＬＥＤ及び粒子を撮像するためのレーザ（例えば、赤色レーザ光源など）から構成され、ブレイクオフ制御部１７により、撮像する目的等に応じて、これらの切り替えが可能である。ストロボ１２２の具体的な構造は特に限定されず、従来公知の回路又は素子を１種又は２種以上適宜自由に選択して用いることができる。
（４）液温制御部１３
　液温制御部１３は、前記シース液の液温を制御する。液温制御部１３は、例えば、シース液の液温を測定する温度センサ及び温調ユニットを備え得る。温度センサと温調ユニットとは、回路を通じて接続されている。温度センサの設置位置は特に限定されず、シース液に対して直接接触してもよいが、コンタミネーションを防ぐため、間接的にシース液の液温を測定可能な位置に設置されることが好ましい。具体的には、シース液が通流するチューブの終点で、フローセル又はチップＴのインレットの直前に熱伝導率が高い素材（例えば、金属パイプなど）を挿入し、その上に温度センサを設置する。この場合、温度センサが外気に触れないように、センサ表面を更に断熱素材で覆うことで、間接的にシース液の液温を精度高く測定することができる。また、前記温度センサによる検出温度と到達すべき目標温度との間に差がある場合は、液温制御部１３は、この差を考慮して後述する温度検査部の目標温度を修正してよい。
　また、流路Ｐを、粒子を含むサンプル液と、シース液と、が通流する場合は、温度センサは、当該サンプル液と当該シース液とが合流する流路近傍に配置されていることが好ましい。これにより、ソーティング開始後においても、シース液の液温を保つことができ、シース液の液温変動による液滴不安定化を抑制できる。また、当該流路近傍から離れ過ぎると、その間に環境温度の影響を受ける可能性があるためである。なお、この場合、温度センサは、液温制御部１３に備えられた温度センサとは別のセンサであってもよい。
　前記温調ユニットは、例えば、温度制御素子、当該温度制御素子に接するように配置された金属部材、及び当該金属部材の温度を検査する温度検査部を備え得る。温度制御素子は、例えば、直流電流を流すことで温度差を生じる半導体冷熱素子等であり、具体的には、ペルチェ素子などが挙げられる。金属部材は特に限定されず、例えば、銅、真鍮などから構成され得る。当該金属部材は、例えば、シース液を供給する管状部材に接触するように配置され得る。温度検査部は、前記金属部材に取り付けられており、当該金属部材の温度が目標温度に到達するようにその温度を検査或いは制御する。また、前記温調ユニットには、ヒートシンクやファンが更に備えられていてよい。
（５）周波数制御部１４
　周波数制御部１４は、その詳細については後述するが、前記撮像部１２で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴Ｄの状態に関するデータを取得し、前記シース液の液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する。
　液滴Ｄの状態に関するデータとしては、例えば、液滴Ｄの大きさ、液滴Ｄのサテライトの種類、液柱Ｌやサテライト液滴や主液滴の状態、液滴Ｄと液柱Ｌとの結合状態、液滴Ｄと液柱Ｌとの距離、液滴Ｄのブレイクオフ位置（「ＢＯＰの長さ」の概念も含む。）などが挙げられるが、これらの中でも、液滴Ｄのブレイクオフ位置が好ましい。
(６)判定部１５
　判定部１５は、その詳細については後述するが、前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値以上である場合、該当する周波数を「不安定周波数」を判定する。また、判定部１５は、前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値未満である場合、該当する周波数を「安定周波数」と判定してよい。更に、前記液滴のブレイクオフ位置の差が最も小さい周波数を「最安定周波数」と判定してもよい。
（７）荷電部１６ａ，偏向板１６ｂ，回収容器１６ｃ
　荷電部１６ａは、オリフィスОから吐出された、目的とする粒子を含む液滴Ｄに荷電する。本技術では、当該目的とする粒子を含む液滴Ｄは、上述した判定部１５において「不安定周波数」と判定した周波数以外の周波数に基づく駆動電圧の供給により液滴化されたものである。これにより、予め不安定周波数を排除できるため、液滴が安定化された状態でソーティングを行うことが可能となる。
　本技術において、「粒子」には、細胞や微生物、リボソーム等の生体関連粒子、或いはラテックス粒子、ゲル粒子、工業用粒子等の合成粒子などが広く含まれ得る。また、本技術において、当該粒子は、液状試料等の流体に含まれ得る。
　生体関連粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボソーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれ得る。細胞には、動物細胞（例えば、血球系細胞など）及び植物細胞が含まれ得る。微生物には、大腸菌等の細菌類、タバコモザイクウイルス等のウイルス類、イースト菌等の菌類などが含まれ得る。また、生体関連粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体等の生体関連高分子なども包含され得る。
　工業用粒子は、例えば、有機又は無機高分子材料、金属等であってよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート等が含まれ得る。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料等が含まれ得る。金属には、金コロイド、アルミ等が含まれ得る。これらの粒子の形状は、一般的には球形であるのが普通であるが、本技術では、非球形であってよく、その大きさ、質量等も特に限定されない。
　本技術においては、粒子として、これらの中でも、生体関連粒子が好ましい。
　本技術において、前記粒子は、１種又は２種以上の蛍光色素等の色素で標識されていてよい。この場合、使用可能な蛍光色素としては、例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate（FITC）、Phycoerythrin（PE）、Propidium iodide（PI）、Texas red（TR）、Peridinin chlorophyll protein（PerCP）、Allophycocyanin（APC）、4’,6-Diamidino-2-phenylindole（DAPI）、Cy3、Cy5、Cy7、Brilliant Violet（BV421）などが挙げられる。
　目的とする粒子を含む液滴Ｄの分取方法としては、例えば、上述した振動部１１からの振動により生成された液滴Ｄに対し、後述する光源１８１による光の照射から得られた検出信号に基づいて、必要に応じて荷電部１６ａによりプラス又はマイナスの電荷を付与し、当該液滴Ｄ２の進行方向を偏向板１６ｂとの間の電気的な力の有無やその大小により制御して、所定の回収容器１６ｃに誘導する。
　荷電部１６ａは、荷電用電極及び当該電極に所望の電圧を印加する電圧源などを備え得る。当該荷電用電極は、流路Ｐ中を通流するシース液に電気的に接触するように配置されていてよく、例えば、図１に示すようにチップＴの荷電電極インレットに挿入され得る。
　偏向板１６ｂは、液滴Ｄに付与された電荷との間に作用する電気的な力によって、流体ストリーム中の各液滴Ｄの進行方向を偏向し、所定の回収容器１６ｃ等に誘導するものであり、流体ストリームＳを挟んで対向配置されている。図１では、偏向板１６ｂの対向方向をＸ軸方向によって示している。偏向板１６ｂとしては特に限定されず、従来公知の電極などを用いることができる。偏向板１６ｂには、それぞれプラス又はマイナスの異なる電圧が印可され、これにより形成される電界内を荷電された液滴Ｄが通過すると、電気的な力（クーロン力）が発生し、各液滴Ｄはいずれかの偏向板１６ｂの方向に引き寄せられる。
　回収容器１６ｃは、偏向板１６ｂの対向方向（図１のＸ軸方向）に略一列に複数配設され得る。回収容器１６ｃとしては特に限定されず、例えば、プラスチック製チューブ、ガラス製チューブ等が挙げられる。回収容器１６ｃの個数も特に限定されないが、図１及び図２では、３つ設置する例を示している。なお、回収容器１６ｃは、回収容器用コンテナ（不図示）に交換可能に設置されていてよい。具体的には、例えば、オリフィスＯからの液滴Ｄの排出方向（図１のＹ軸方向）及び偏光板１６ｂの対向方向（図１のＸ軸方向）に直交する方向（図１のＺ軸方向）に移動可能に構成されたＺ軸ステージ（不図示）上に配設され得る。
（８）ブレイクオフ制御部１７
　ブレイクオフ制御部１７は、撮像部１２で取得された目的とする粒子を含む液滴Ｄの状態の画像に基づいて、前記粒子を含む液滴Ｄのブレイクオフを制御する。具体的には、撮像部１２で撮像された複数の液滴観察画像によって特定された、前記粒子を含む液滴Ｄのブレイクオフするタイミングに基づいて、振動素子１１１の駆動電圧を調整することで、液滴Ｄと液柱Ｌとの結合状態及び／又は液滴Ｄと液柱Ｌとの距離や、液滴Ｄのブレイクオフ位置を一定に維持するように制御する。これにより、駆動電圧に常時フィードバックをかけて液滴を調整することで、ソーティング開始後における液滴不安定化を抑制できる。
（９）検出部１８
　検出部１８は、光源１８１から発せられる光の照射によって、流路Ｐ内を通流する流体中の粒子から発生する測定対象光を検出する。具体的には、検出部１８は、主流路Ｐ１３中を三次元層流の中心に略一列に並んだ状態で送流される粒子に対する光の照射により、当該粒子から発生する測定対象光が検出部１８によって検出される。
　光源１８１は、複数の光源からなっていてもよく、この場合、流路Ｐ内を通流する流体中の粒子に前記複数の光源からの光を照射し得る。また、前記複数の光源は、互いに同一の波長の光を出射してよく、互いに異なる波長の光を出射してもよい。
　光源１８１から照射される光の種類は特に限定されないが、粒子から光を確実に発生させるためには、光方向、波長、及び光強度が一定の光が望ましい。具体的には、例えば、レーザ光、ＬＥＤなどを挙げることができる。
　レーザ光としては、例えば、半導体レーザ、アルゴンイオン（Ar）レーザ、ヘリウム－ネオン（He-Ne）レーザ、ダイ（dye）レーザ、クリプトン（Cr）レーザ、半導体レーザと波長変換光学素子とを組み合わせた固体レーザなどが挙げられ、これらを２種以上組み合わせて用いることもできる。
　検出部１８は、前記測定対象光を検出する少なくとも一つの光検出器を備える。前記測定対象としては、例えば、蛍光、散乱光（例えば、前方散乱光、後方散乱光、側方散乱光、レイリー散乱、ミー散乱など）などが挙げられる。各光検出器は、１以上の受光素子を含み、例えば、受光素子アレイを有する。各光検出器は、受光素子として、１又は複数のＰＭＴ（光電子増倍管）及び／又はＡＰＤ（Avalanche Photodiode）及びＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）などのフォトダイオードを含んでいてもよい。当該光検出器は、例えば、複数のＰＭＴを一次元方向に配列したＰＭＴアレイを含み得る。また、検出部１８は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）又はＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor）などの撮像素子を含んでいてもよい。前記測定対象光は、前記光検出器により電気信号に変換され、当該電気信号は上述した判定部１５やブレイクオフ制御部１７、後述する解析部１９等に出力され、各粒子の特性判定に供される。
　検出部１８は、光源１８１の他、複数の光を所定の位置に導くための導光光学系や、所定の検出波長の光を、対応する光検出器に到達させる検出光学系などを含み得る。前記導光光学系は、例えば、ビームスプリッター群、ミラー群、光ファイバなどの光学部品を含んでいてよい。また、前記導光光学系は、合波された励起光を集光するためのレンズ群を含んでいてよく、例えば、対物レンズを含み得る。前記検出光学系は、プリズムや回折格子等の分光部、又はダイクロイックミラーや光学フィルタ等の波長分離部を含み得る。
　なお、検出部１８は、磁気的や電気的に粒子の特性を検出するものであってもよい。この場合、例えば、チップＴの主流路Ｐ１３に微小電極を対向させて配設し、抵抗値、容量値（キャパシタンス値）、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値、或いは磁化、磁界変化、磁場変化等を検出することができる。
（１０）解析部１９
　解析部１９は、上述した撮像部１２や検出部１８等と接続され、撮像部１２で取得した画像や検出部１８で検出した電気信号等に基づいて解析を行う。
　具体的には、解析部１９は、撮像部１２により取得された画像により上述した液滴Ｄの状態に関するデータを解析或いは算出する。また、液滴Ｄの状態に関するデータから、ＢＯＰ変動量；ΔＢＯＰ（ブレイクオフ位置の差）等を求めてもよい。
　また、解析部１９は、検出部１８により検出された検出値を補正し、各粒子の特徴量を算出することができる。例えば、受光した蛍光や散乱光の検出値より粒子の大きさ、形態、内部構造等の特徴量を算出する。また、算出した特徴量及び後述するユーザインターフェース２２から受け取った分取条件等に基づき分取判断を行い、分取制御信号を生成することもできる。当該分取制御信号に基づき上述した荷電部１６ａを制御することで、特定の種別の粒子を分別して捕集し得る。
　解析部１９は、検出部１８等が備えられている筐体内に含まれていてよく、又は当該筐体の外にあってもよい。また、本実施形態に係る粒子分取装置１において必須ではなく、外部の解析装置等を用いることも可能である。また、解析部１９は、粒子分取装置１の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
（１１）記憶部２０
　記憶部２０は、検出部１８により検出された検出値、解析部１９により算出された特徴量や生成された分取制御信号、ユーザインターフェース２２で入力された分取条件等の分析や分取に関わるあらゆる事項を記憶する。
　記憶部２０は、検出部１８等が備えられている筐体内に含まれていてよく、又は当該筐体の外にあってもよい。また、本実施形態に係る粒子分取装置１において必須ではなく、外部の記憶装置（例えば、ハードディスクなど）等を用いることも可能である。また、記憶部２０は、粒子分取装置１の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
（１２）表示部２１
　表示部２１は、分析や分取に関わるあらゆる事項を表示でき、例えば、解析部１９により算出された各粒子の特徴量をヒストグラム等として表示し得る。また、撮像部１２により撮像された画像などを表示することも可能である。
　表示部２１は、本実施形態に係る粒子分取装置１において必須ではなく、外部の表示装置（例えば、ディスプレイ、プリンタ、携帯情報端末など）等を用いることも可能である。また、表示部２１は、粒子分取装置１の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
（１３）ユーザインターフェース２２
　ユーザインターフェース２２は、ユーザが操作するための部位である。ユーザは、ユーザインターフェース２２を介して、各種データを入力したり、粒子分取装置１の各部にアクセスして当該各部を制御したりすることができる。例えば、ユーザインターフェース２２を介して、表示部２１に表示されたヒストグラム等に対して注目領域を設定し、分取条件等を決定する。
　ユーザインターフェース２２は、本実施形態に係る粒子分取装置１において必須ではなく、外部の操作装置（例えば、マウス、キーボード、携帯情報端末など）等を用いることも可能である。また、ユーザインターフェース２２は、粒子分取装置１の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
（１４）その他
　なお、本技術に係る粒子分取装置１の各部で行われる機能を、汎用のコンピュータや、ＣＰＵ等を含む制御部及び記録媒体（例えば、不揮発性メモリ（例えば、ＵＳＢメモリなど）、ＨＤＤ、ＣＤなど）等を備えるハードウェア資源にプログラムとして格納し、機能させることも可能である。また、前記機能は、ネットワークを介して接続されたサーバコンピュータ又はクラウドにより実現されてもよい。
３．制御フロー例
　つづいて、図１及び図２で示した実施形態に係る粒子分取装置１が実行する制御例について説明する。図８は、当該制御例を示すフローチャートである。また、図９は、当該制御例の様子を示す図であり、下向きの矢印部分は全て不安定周波数を示している。なお、後述する動作の実行は、粒子分取装置１を制御する不図示の制御部等よって制御されていてもよい。
　以下に示す制御フロー例は、上述した従来の液滴安定化の手法と共存するものであり、例えば、従来の手法の前段に挿入して行ってよく、その場合は、従来の液滴安定化の手法における負担を軽減し、且つ、これらの手法による効果をより発揮させ得る。
（１）測定パラメータ設定プロセス（ステップS101～S103）
　まず、周波数以外の液滴形成に関わるパラメータ（主に、シース送液圧力及び駆動電圧）を決定する（ステップS101）。この際に、シース送液圧力は、ソーティング時と同一にすることが好ましい。一方で、駆動電圧については、ソーティング開始前に選択した周波数に合わせて再度調整を行うため、この段階で必ずしも同一にする必要はない。
　次いで、シース液の液温を数段階に変化させてブレイクオフ位置の測定を行うため、液温設定値を[Ｔ１，Ｔ２，，，Ｔｘ]（ｘ≧２）と複数値入力する（ステップS102）。この際に、あまり液温設定値の点数を増やしてしまうと、液温設定値を変更した時に温度が安定するまでに時間を要するため、その分、所要時間が増してしまう。そのため、特にＢＯＰ変動を詳細に調査する必要がある場合を除き、例えば、測定開始時の室温、或いは所定の設定値に対して、想定する温度変動（例えば、±３℃）の範囲内で最大値、中心値、及び最小値の３点を入力してよい。図９に示す例では、シース液の液温を２４℃、２８℃、３２℃の３段階で設定している。
　次いで、測定開始周波数；ｆｂ，測定終了周波数；ｆｅ、及び測定周波数ステップ；Δｆを設定する（ステップS103）。一般的に、ノズル径とシース送液圧力が決まると、それに対応して物性（表面張力）に基づく最適周波数ｆｓが存在するので、このｆｓを中心に±１０～２０％の範囲を調査することが好ましい。ステップS103においても、ステップS102と同様に、周波数範囲を広げ過ぎたり、周波数ステップを細かくし過ぎたりすると、ＢＯＰ測定ポイントが増加するため、過剰な時間を要してしまう。そのため、ＢＯＰ測定の速度にもよるが、例えば、シース液温１点につきＢＯＰ測定ポイントを１０ポイント程度としてよい。
（２）ＢＯＰ測定プロセス（ステップS104～S110）
　上述した測定パラメータ設定プロセスで入力した各パラメータ（シース送液圧力、駆動電圧、及び測定開始周波数ｆｂ）にて、振動部１１によりシース液のみを含む流体に対して振動を与えて液滴Ｄを形成する（ステップS104）。なお、本ＢＯＰ測定プロセスでは、流路Ｐにシース液のみ通流させればよく、粒子を含むサンプル液を通流させる必要はない。
　次いで、液温制御部１３により、シース液の液温を温度Ｔ１に設定し、液温が安定するのを待つ（ステップS105）。液温が安定したら、指定周波数［ｆｂ，ｆｂ＋Δｆ，ｆｂ＋２Δｆ，，，ｆｅ］について、それぞれブレイクオフ位置のデータを取得する（ステップS106）。前記データは、撮像部１２で撮像された画像を、解析部１９で解析することにより取得できる。また、ドロップレットカメラ１２１の位置を移動させてＢＯＰを追跡できる場合は、当該カメラ１２１のＺ位置を付与してＢＯＰを計算し得る。
　次いで、液温制御部１３により、シース液の液温を温度Ｔ２に設定し、再び液温が安定するのを待つ（ステップS107）。液温が安定したら、再び指定周波数［ｆｂ，ｆｂ＋Δｆ，ｆｂ＋２Δｆ，，，ｆｅ］について、それぞれブレイクオフ位置のデータを取得する（ステップS108）。
　その後、シース液の液温が温度Ｔｘになるまで、シース液の液温を温度Ｔｎ＋１に設定し（ステップS109～S110）、ステップS108を繰り返す。
（３）ＢＯＰデータ解析プロセス（ステップS111～S120）
　上述したＢＯＰ測定プロセスで得られたブレイクオフ位置のデータを用いて解析部１９で解析し、各周波数における、シース液の液温変化［Ｔ１，Ｔ２，，，Ｔｘ］によるＢＯＰ変動量；ΔＢＯＰ（ブレイクオフ位置の差）を求める（ステップS111）。次いで、ＢＯＰ変動許容量；Ｂｔｈを設定する（ステップS112）。Ｂｔｈは、例えば、駆動電圧へのフィードバックによって液滴安定化制御を行う場合は、駆動電圧の初期値に対して±５０％程度の大きな電圧変動範囲が必要になると出力電圧範囲を越えてしまう危険性があるため、当該フィードバック制御によりサイドストリーム軌道を容易に安定化できる範囲である、前後一液滴分程度のＢＯＰ変動を考慮して設定する。具体的には、例えば、標準的な液滴間隔はノズル径×４．５程度となることが知られているため、測定に用いたノズル径との関係から、任意にＢｔｈを決定し得る。図９に示す例では、Ｂｔｈ＝０．６ｍｍに設定している。
　次いで、判定部１５は、各周波数において、ΔＢＯＰとＢｔｈとを比較する（ステップS113）。判定部１５は、ΔＢＯＰ≧Ｂｔｈの場合（ステップS114のYES）、該当する周波数を「不安定周波数」と判定し、当該判定結果に基づいて、周波数制御部１４は、当該不安定周波数を駆動電圧の周波数として採り得る周波数の選択肢から除外する（ステップS115）。一方で、判定部１５は、ΔＢＯＰ＜Ｂｔｈの場合（ステップS114のNO）、該当する周波数を「安定周波数」と判定し、該判定結果に基づいて、周波数制御部１４は、当該安定周波数を駆動電圧の周波数として採り得る周波数の選択肢に含め得る（ステップS118）。すなわち、周波数制御部１４は、ステップS115で除外した不安定周波数以外の周波数は、安定周波数として、どの周波数を用いてもよい。これにより、サイドストリーム軌道を安定させることができる。図９に示す例では、下矢印で示す周波数が、「不安定周波数」と判定された周波数である。
　また、その他の周波数を選択する際の基準としては、ソーティング性能に関して、event rate、或いはダブレット（複数粒子が１液滴に包含される状態）の発生確率などが挙げられる。更に、液滴に関しても、適切な駆動電圧で適切なブレイクオフ位置が得られる、或いはサイドストリーム軌道の安定性がより高いFASTサテライトの状態が発生し易いなどの指標が存在する。したがって、ユーザは、これらを総合的に判断し、最終的な周波数を決定し得る。
　或いは、装置が既存の周波数選択アルゴリズムを有する場合には、ステップS115で不安定周波数を除外した上で、その処理を続けて行ってもよい。アルゴリズムの一例としては、特開２０２０－７６７８６号公報に記載された方法が挙げられる。この方法においては、ＢＯＰ長ができるだけ短くなること、サテライトが任意の指定距離範囲内で主液滴に回収されることを周波数選択の指針としている。当該アルゴリズムを本技術と組み合わせて用いることで、経時的なサイドストリーム軌道の安定を保証できる。
　次いで、ユーザが液滴安定性を重視したい場合は、安定周波数の選択肢から最安定周波数を求め（ステップS119のYES）、周波数制御部１４は、最安定周波数としてΔＢＯＰが最も小さい周波数を採用することができる（ステップS120）。これは、例えば、シース液の液温制御の精度の信頼性が低い場合（例えば、環境温度変化が大きく、温度制御部１３の処理能力を超える可能性がある場合など）などに有用である。具体的には、実際の装置はセーフティキャビネットの密閉環境で使用される場合が多く、温度制御部１３からの放熱等によりキャビネット内の温度が経時的に上昇し続ける場合があるため、このような液温変動が懸念される環境下においては、特に、最安定周波数を採用することが効果的である。
　なお、ΔＢＯＰが同程度に小さい場合、最安定周波数は、複数存在していてもよい。
　一方で、ユーザがソーティング性能を重視したい場合などは、ΔＢＯＰ＜Ｂｔｈに該当する各安定周波数の選択肢から、適切な周波数を採用することができる（ステップS116）。
（４）効果
　以上のプロセスにより、経時的な環境温度変化に対して不安定な周波数を事前に検出し、駆動電圧の周波数として採り得る周波数の選択肢から除外できる。したがって、長時間に渡って、サイドストリーム軌道を一定に維持することが可能となる。また、上記特許文献１に示すような駆動電圧へのフィードバック制御や、上記特許文献２に示すようなシース液の温度制御といった従来の液滴安定制御手段を組み合わせて用いる場合には、これらの負担を軽減し、且つ、より強固な液滴安定性をもたらし、サイドストリーム軌道が長時間に渡って一定に保たれ、ソーティングしたい粒子を安定に回収容器へと導くことができる。
　また、必要に応じて、指定周波数範囲内で環境温度変化に対して最も安定する周波数を、ソーティング前に事前調査することができる。例えば、環境温度変化が大きく、温度制御部１３の処理能力が対応できずに液温を一定に維持できない場合においても、前記周波数を選択することで、振動素子の駆動電圧へのフィードバック制御と組み合わせて液滴を安定化させることが可能となる。
　更に、装置が既存の周波数選択アルゴリズムを有する場合には、その処理を行う前に、不安定周波数を予め除外しておくことで、より最適化された周波数を自動で決定することができる。
　加えて、設定条件によっては、上述した一連の制御フローを、所要時間２０分程度で容易に実行できるため、ソーティングを行う前に毎回最適な周波数を選択して、装置が異なったり、環境温度が変化したり、装置の状態が変化したりした場合においても、確実に安定動作を実現できる。
４．第２実施形態（粒子分取方法）
　本実施形態に係る粒子分取方法は、振動工程と、撮像工程と、液温制御工程と、周波数制御工程と、を少なくとも行う。また、必要に応じて、判定工程、荷電工程等を行ってもよい。なお、各工程で行う具体的な方法は、上述した第１実施形態に係る粒子分取装置１の各部で行う方法と同様であるため、ここでは説明を割愛する。
　本実施形態に係る粒子分取方法では、目的とする粒子を含む液滴に荷電する荷電工程を判定工程の後に行う。当該荷電工程において、前記目的とする粒子を含む液滴は、前記不安定周波数以外の周波数に基づく駆動電圧の供給による振動により液滴化されたものである。すなわち、ソーティング開始前に予め判定工程を行うことで、装置毎の誤差、環境温度変化、装置の状態変化等に対応でき、より精度高く粒子を分取することができる。
　ただし、装置の状態等が変化していない場合は、周波数挙動の傾向は保たれるので、必ずしもソーティング開始前に毎回判定工程を実行しなくてもよい。一方で、例えば、チップＴのオリフィスОを洗浄や交換で脱着した場合、或いはフローセルの部品を交換した場合には、可能な限り判定工程を行った方がよい。特に、チップ方式を採用した場合は、チップＴの個体差やチャッキング再現性が要因となって周波数挙動の傾向が変化し得るため、新しいチップＴをローディングした後に行うことが推奨される。
　以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
＜１＞試験方法
　図２に示すようなフローセル方式を用いて、不安定周波数、及び最安定周波数の探索を行った。
　ノズル径を７０μｍとし、送液圧力を６００ｋＰａとして、ジェット流速＝３０．０ｍ／ｓを得た。ピエゾ駆動電圧を固定（振幅±８ｎｍ）し、１００±２０ｋＨｚ（Ｓｔｅｐ＿Δｆ＝１ｋＨｚ）の範囲でＢＯＰ長を測定した。
　シース液温は、５段階（Ｔ１＝２３℃、Ｔ２＝２４℃、Ｔ３＝２５℃、Ｔ４＝２６℃、Ｔ５＝２７℃）で設定した。
＜２＞試験結果
　各周波数における、シース液の液温に依存するＢＯＰ長の変動結果を図１０に示す。なお、このグラフの縦軸は「ＢＯＰ長（ＢＯＰの長さ）」であるため、図９とは反転してグラフ下側が短くなっている。
　図１０に示す結果から、ΔＢＯＰの大小が存在しており、ＢＯＰ変動が大きい周波数帯が９５～１００ｋＨｚ付近に見られ、一方で、ほとんどＢＯＰが変動しない周波数が８０ｋＨｚ、１１２ｋＨｚ周辺に存在していることが分かった。
＜３＞不安定周波数の検出
　不安定周波数を判定するための閾値（Ｂｔｈ）を前後一液滴分程度に設定し、ここでは、Ｂｔｈ＝０．６５ｍｍとした。その結果、ΔＢＯＰ≧Ｂｔｈとなる以下の周波数が不安定周波数として検出された。
　・９１、９２ｋＨｚ
　・９６～１００ｋＨｚ
　したがって、これらの不安定周波数以外を選択することで、サイドストリーム軌道を測定時間中、高精度に安定化させることが可能となる。
＜４＞最安定周波数の決定
　調査した１００±２０ｋＨｚ内の全ての周波数において、最もΔＢＯＰが少ない周波数は１１１ｋＨｚであった。そのΔＢＯＰは２６μｍであり、液温上昇に伴って増加傾向にあることから、ほぼ流速変動分の変化と考えられる。したがって、ＢＯＰの測定誤差を考慮すると、ΔＢＯＰ＜１００μｍであった８０ｋＨｚ、１０７ｋＨｚ、１１２ｋＨｚも同程度の安定性を有するとみなすことができ、最安定周波数の選択肢として候補に入る。ソーティングの際に、液滴の対温度安定性を最重要視する場合は、これらの最安定周波数から測定時の周波数を決定する。
＜５＞その他
　なお、ＢＯＰ長の測定の所要時間については、本試験例において、温度パラメータ１段階あたり１２分であった。その内訳は、シース液の液温を１℃上昇する毎に、安定時間が４分、及び周波数４１ポイント測定につき自動測定時間が８分であった。
　周波数の測定ポイントは削減可能であり、例えば、±１２ｋＨｚ（Δｆ＝２ｋＨｚ）に設定することも可能である。この場合、測定ポイントは１３ポイントと約１／３になるので、自動測定時間が２分半程度に減少する。また、例えば、温度設定を３段階で設定すれば、更に所要時間を短縮できる。
　なお、本技術では、以下の構成を採用することもできる。
〔１〕
　シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える振動部と、
　前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する撮像部と、
　前記シース液の液温を制御する液温制御部と、
　前記撮像部で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記シース液の液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する周波数制御部と、
を有する、粒子分取装置。
〔２〕
　前記データは、各周波数における前記液滴のブレイクオフ位置のデータである、〔１〕に記載の粒子分取装置。
〔３〕
　前記周波数制御部は、前記シース液の液温毎の前記液滴のブレイクオフ位置を比較する、〔２〕に記載の粒子分取装置。
〔４〕
　前記周波数制御部は、前記シース液の液温間での前記液滴のブレイクオフ位置の差に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する、〔３〕に記載の粒子分取装置。
〔５〕
　前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値以上である場合、該当する周波数を不安定周波数と判定する判定部を更に有する、〔４〕に記載の粒子分取装置。
〔６〕
　前記周波数制御部は、前記不安定周波数を前記駆動電圧の周波数として採り得る周波数の選択肢から除外する、〔５〕に記載の粒子分取装置。
〔７〕
　前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値未満である場合、該当する周波数を安定周波数と判定する判定部を更に有する、〔４〕から〔６〕のいずれかに記載の粒子分取装置。
〔８〕
　前記周波数制御部は、前記駆動電圧の周波数として前記液滴のブレイクオフ位置の差が最も小さい周波数を採用する、〔７〕に記載の粒子分取装置。
〔９〕
　目的とする粒子を含む液滴に荷電する荷電部を更に有し、
　前記粒子を含む液滴は、前記不安定周波数以外の周波数に基づく駆動電圧の供給による振動により液滴化されたものである、〔６〕に記載の粒子分取装置。
〔１０〕
　前記液温制御部は、前記粒子を含むサンプル液と、前記シース液と、が合流する流路近傍に配置された温度センサを含む、〔９〕に記載の粒子分取装置。
〔１１〕
　前記撮像部は、前記粒子を含む液滴の状態の画像を取得し、
　前記撮像部で撮像された前記状態の画像に基づいて、前記粒子を含む液滴のブレイクオフを制御するブレイクオフ制御部を更に有する、〔９〕又は〔１０〕に記載の粒子分取装置。
〔１２〕
　前記粒子は、生体関連粒子である、〔９〕から〔１１〕のいずれかに記載の粒子分取装置。
〔１３〕
　シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える振動工程と、
　前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する撮像工程と、
　前記シース液の液温を制御する液温制御工程と、
　前記撮像部で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する周波数制御工程と、
を行う、粒子分取方法。
〔１４〕
　前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値以上である場合、該当する周波数を不安定周波数と判定する判定工程を更に行う、〔１３〕に記載の粒子分取方法。
〔１５〕
　前記判定工程の後に、対象となる粒子を含む液滴に荷電する荷電工程を更に行い、
　前記液滴は、前記不安定周波数以外の周波数に基づく駆動電圧の供給による振動により液滴化されたものである、〔１４〕に記載の粒子分取方法。
〔１６〕
　シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与え、前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得し、前記シース液の液温を制御し、撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する機能を、粒子分取装置に実行させるプログラム。
１：粒子分取装置
１１：振動部
１１１：振動素子
１２：撮像部
１２１：ドロップレットカメラ
１２２：ストロボ
１３：液温制御部
１４：周波数制御部
１５：判定部
１６ａ：荷電部
１６ｂ：偏向板
１６ｃ：回収容器
１７：ブレイクオフ制御部
１８：検出部
１８１：光源
１９：解析部
２０：記憶部
２１：表示部
２２：ユーザインターフェース
Ｐ：流路
Ｔ：チップ
Ｐ１１：サンプル液流路
Ｐ１２ａ，Ｐ１２ｂ：シース液流路
Ｐ１３：主流路
Ｄ：液滴
ＢＯＰ：ブレイクオフ位置
О：オリフィス
Ｌ：液柱
 

Claims (16)

  1. 　シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える振動部と、
    　前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する撮像部と、
    　前記シース液の液温を制御する液温制御部と、
    　前記撮像部で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記シース液の液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する周波数制御部と、
    を有する、粒子分取装置。
  2. 　前記データは、各周波数における前記液滴のブレイクオフ位置のデータである、請求項１に記載の粒子分取装置。
  3. 　前記周波数制御部は、前記シース液の液温毎の前記液滴のブレイクオフ位置を比較する、請求項２に記載の粒子分取装置。
  4. 　前記周波数制御部は、前記シース液の液温間での前記液滴のブレイクオフ位置の差に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する、請求項３に記載の粒子分取装置。
  5. 　前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値以上である場合、該当する周波数を不安定周波数と判定する判定部を更に有する、請求項４に記載の粒子分取装置。
  6. 　前記周波数制御部は、前記不安定周波数を前記駆動電圧の周波数として採り得る周波数の選択肢から除外する、請求項５に記載の粒子分取装置。
  7. 　前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値未満である場合、該当する周波数を安定周波数と判定する判定部を更に有する、請求項４に記載の粒子分取装置。
  8. 　前記周波数制御部は、前記駆動電圧の周波数として前記液滴のブレイクオフ位置の差が最も小さい周波数を採用する、請求項７に記載の粒子分取装置。
  9. 　目的とする粒子を含む液滴に荷電する荷電部を更に有し、
    　前記粒子を含む液滴は、前記不安定周波数以外の周波数に基づく駆動電圧の供給による振動により液滴化されたものである、請求項６に記載の粒子分取装置。
  10. 　前記液温制御部は、前記粒子を含むサンプル液と、前記シース液と、が合流する流路近傍に配置された温度センサを含む、請求項９に記載の粒子分取装置。
  11. 　前記撮像部は、前記粒子を含む液滴の状態の画像を取得し、
    　前記撮像部で撮像された前記状態の画像に基づいて、前記粒子を含む液滴のブレイクオフを制御するブレイクオフ制御部を更に有する、請求項９に記載の粒子分取装置。
  12. 　前記粒子は、生体関連粒子である、請求項９に記載の粒子分取装置。
  13. 　シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与える振動工程と、
    　前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得する撮像工程と、
    　前記シース液の液温を制御する液温制御工程と、
    　前記撮像部で撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する周波数制御工程と、
    を行う、粒子分取方法。
  14. 　前記液滴のブレイクオフ位置の差が閾値以上である場合、該当する周波数を不安定周波数と判定する判定工程を更に行う、請求項１３に記載の粒子分取方法。
  15. 　前記判定工程の後に、目的とする粒子を含む液滴に荷電する荷電工程を更に行い、
    　前記液滴は、前記不安定周波数以外の周波数に基づく駆動電圧の供給による振動により液滴化されたものである、請求項１４に記載の粒子分取方法。
  16. 　シース液を含む流体に対し、複数の周波数に基づく駆動電圧の供給により振動を与え、前記流体が前記振動により液滴化される位置において、前記流体及び前記液滴の画像を取得し、前記シース液の液温を制御し、撮像された画像から、前記シース液の液温毎に各周波数における前記液滴の状態に関するデータを取得し、前記液温の変化に伴う前記データの変動に基づいて前記駆動電圧の周波数を制御する機能を、粒子分取装置に実行させるプログラム。
     
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