JP2008189661A - Method for producing aqueous cadaverine salt solution, cadaverine salt solution, cadaverine salt, polyamide resin, and molding - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カダベリン塩水溶液の製造方法等に関し、より詳しくは、高分子不純物が除去されるカダベリン塩水溶液の製造方法等に関する。 The present invention relates to a method for producing a cadaverine salt aqueous solution, and more particularly to a method for producing a cadaverine salt aqueous solution from which polymer impurities are removed.
プラスチック原料として、その殆どにいわゆる化石原料が用いられている。再生利用する場合を除き、プラスチックを廃棄する場合、燃焼等による廃棄は炭酸ガスの放出を招くことから近年問題となりつつある。そこで、地球温暖化防止及び循環型社会の形成に向けて、プラスチックの製造原料をバイオマス由来の原料に置き換えることが嘱望されている。このようなニーズは、フィルム、自動車部品、電気・電子部品、機械部品等の射出成形品、繊維、モノフィラメント等、多岐にわたる。 Most of plastic materials are so-called fossil materials. Except for the case of recycling, when plastic is discarded, disposal due to combustion or the like causes a release of carbon dioxide gas, which is becoming a problem in recent years. Therefore, in order to prevent global warming and form a recycling-oriented society, it is desired to replace the raw materials for producing plastics with raw materials derived from biomass. Such needs are diverse such as films, automobile parts, electrical / electronic parts, injection molded products such as mechanical parts, fibers, monofilaments, and the like.
ところで、ポリアミド樹脂は、機械的強度、耐熱性、耐薬品性等に優れており、いわゆるエンジニアリングプラスチックスの1つとして多くの分野で用いられている。中でもフィルムは、二軸延伸ポリプロピレンフィルムや二軸延伸ポリエステルフィルム等に比べ、優れた機械的特性、耐熱性、透明性、ガスバリア性等の特徴を有しており、食品、医薬品、雑貨等の包装用フィルムとして広く利用されている。 By the way, the polyamide resin is excellent in mechanical strength, heat resistance, chemical resistance, etc., and is used in many fields as one of so-called engineering plastics. Above all, the film has excellent mechanical properties, heat resistance, transparency, gas barrier properties, etc. compared to biaxially stretched polypropylene film and biaxially stretched polyester film, etc. Widely used as an industrial film.
ポリアミド樹脂のフィルムは強度やガスバリア性を付与するため、二軸延伸等の延伸処理を施して使用される場合が多い。この際、フィッシュアイと称される粒状欠陥があると、それを起点に延伸破断を起こし生産性を損なうだけでなく、フィルムの外観を悪化させ商品価値を著しく損なう。このため、フィッシュアイを極力低減することが求められている。
また、ポリアミド樹脂はその優れた性能を生かし、繊維やモノフィラメントの分野でも広く用いられている。これらの用途でも、上述のフィルム同様、フィッシュアイは成形時の延伸破断や表面外観の悪化を招くため、その低減が求められている。
Polyamide resin films are often used after being subjected to stretching treatment such as biaxial stretching in order to impart strength and gas barrier properties. At this time, if there is a granular defect called “fish eye”, not only does it cause stretching and breakage, but the productivity is deteriorated, and the appearance of the film is deteriorated and the commercial value is remarkably impaired. For this reason, it is required to reduce fish eyes as much as possible.
Polyamide resins are also widely used in the field of fibers and monofilaments, taking advantage of their superior performance. Even in these applications, as with the above-described film, fish eyes are subject to stretch breakage during molding and deterioration of the surface appearance.
一方、ポリアミド樹脂からなる射出成形品には、自動車部品、電気・電子部品、機械部品等が挙げられる。いずれの場合も、部品のコンパクト化や軽量化を目的に薄肉化が望まれている。この場合、ポリアミド樹脂本来の物性を維持するため分子量(数平均分子量)を下げることなく、高い流動性を有するポリアミド樹脂が必要となる。 On the other hand, injection molded products made of polyamide resin include automobile parts, electrical / electronic parts, mechanical parts and the like. In either case, thinning is desired for the purpose of reducing the size and weight of parts. In this case, in order to maintain the original physical properties of the polyamide resin, a polyamide resin having high fluidity is required without lowering the molecular weight (number average molecular weight).
バイオマス由来の原料を使用して製造されるポリアミド樹脂としては、カダベリンを原料とするものが知られている。例えば、特許文献1、特許文献2にはその原料であるカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法、精製方法が提案されている。 As a polyamide resin manufactured using a raw material derived from biomass, one using cadaverine as a raw material is known. For example, Patent Literature 1 and Patent Literature 2 propose a method for producing and purifying cadaverine dicarboxylate, which is a raw material.
ところが、前記特許文献には、ポリアミド樹脂フィルムのフィッシュアイ(F/E)や射出成形時の流動性と、ポリアミド樹脂に含まれる高分子不純物との関連性については何ら言及されていない。 However, the patent document does not mention anything about the relationship between the fish eye (F / E) of the polyamide resin film, the fluidity during injection molding, and the polymer impurities contained in the polyamide resin.
本発明は、上述したバイオマス由来の原料から得られたポリアミド樹脂における課題を解決するためになされたものである。
即ち、本発明の目的は、高分子不純物が除去されたカダベリン塩水溶液の製造方法を提供することにある。
本発明の目的は、高分子不純物が減少したカダベリン塩水溶液を提供することにある。
本発明の目的は、カダベリン塩水溶液から得られるカダベリン塩を提供することにある。
本発明の目的は、バイオマス由来の原料から得られたポリアミド樹脂を提供することにある。
本発明の目的は、斯かるポリアミド樹脂から得られる成形品を提供することにある。
This invention is made | formed in order to solve the subject in the polyamide resin obtained from the raw material derived from biomass mentioned above.
That is, an object of the present invention is to provide a method for producing a cadaverine salt aqueous solution from which polymer impurities are removed.
An object of the present invention is to provide an aqueous cadaverine salt solution with reduced polymer impurities.
An object of the present invention is to provide a cadaverine salt obtained from a cadaverine salt aqueous solution.
The objective of this invention is providing the polyamide resin obtained from the raw material derived from biomass.
An object of the present invention is to provide a molded product obtained from such a polyamide resin.
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行った結果、バイオマス由来の原料から得られたカダベリン塩水溶液から高分子不純物を除去しポリアミド樹脂を製造すると、著しくフィッシュアイが少なく表面外観に優れたポリアミド樹脂フィルムを得ることが可能であり、且つ、著しく射出成形時の流動性が優れることを見出し、斯かる知見に基づき本発明を完成した。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted intensive studies. As a result, when a polyamide resin is produced by removing polymer impurities from a cadaverine salt aqueous solution obtained from a biomass-derived raw material, the surface of the fish is remarkably reduced. It has been found that a polyamide resin film having an excellent appearance can be obtained and the fluidity during injection molding is remarkably excellent, and the present invention has been completed based on such findings.
かくして本発明によれば、分子量12,000以上の高分子不純物を除去することを特徴とするカダベリン塩水溶液の製造方法が提供される。
ここで、本発明が適用されるカダベリン塩水溶液の製造方法において、さらに分子量5,000以上の高分子不純物を除去することが好ましい。
また、斯かる高分子不純物は、膜処理による除去を行うことが好ましい。
また、斯かる膜処理としては、限外濾過膜(UF膜)処理を行うことが好ましい。
ここで、本発明が適用されるカダベリン塩水溶液の製造方法において、カダベリンが、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物又はリジン脱炭酸酵素を産生する細胞もしくはこの細胞の処理物を使用して、リジンから産出されたものであることが好ましい。
また、カダベリンが、ジカルボン酸塩であることが好ましい。
Thus, according to the present invention, there is provided a method for producing a cadaverine salt aqueous solution, which is characterized by removing polymer impurities having a molecular weight of 12,000 or more.
Here, in the method for producing an aqueous cadaverine salt to which the present invention is applied, it is preferable to further remove polymer impurities having a molecular weight of 5,000 or more.
Moreover, it is preferable to remove such polymer impurities by film treatment.
Moreover, as such a membrane treatment, it is preferable to perform an ultrafiltration membrane (UF membrane) treatment.
Here, in the method for producing an aqueous solution of cadaverine salt to which the present invention is applied, cadaverine is a lysine decarboxylase, a recombinant microorganism having improved lysine decarboxylase activity, a cell producing lysine decarboxylase, or a processed product of this cell And is preferably produced from lysine.
Moreover, it is preferable that cadaverine is a dicarboxylate.
次に、本発明によれば、上述したカダベリン塩水溶液の製造方法に記載の製造方法で得られたことを特徴とするカダベリン塩水溶液が提供される。 Next, according to the present invention, there is provided a cadaverine salt aqueous solution obtained by the production method described in the above-described method for producing a cadaverine salt aqueous solution.
本発明によれば、上述したカダベリン塩水溶液を晶析することにより製造したことを特徴とするカダベリン塩が提供される。 According to the present invention, there is provided a cadaverine salt produced by crystallizing the cadaverine salt aqueous solution described above.
本発明によれば、斯かるカダベリン塩水溶液を原料とする重縮合反応により得られたことを特徴とするポリアミド樹脂が提供される。 According to the present invention, there is provided a polyamide resin obtained by a polycondensation reaction using such a cadaverine salt aqueous solution as a raw material.
本発明によれば、上述したカダベリン塩の重縮合反応により、又はカダベリン塩と他の共重合成分との重縮合反応により得られることを特徴とするポリアミド樹脂が提供される。 According to the present invention, there is provided a polyamide resin obtained by the above polycondensation reaction of a cadaverine salt or a polycondensation reaction of a cadaverine salt with another copolymer component.
さらに、本発明によれば、所定の成形方法により、斯かるポリアミド樹脂を成形してなることを特徴とする成形品が提供される。
ここで、成形品としては、フィルム、射出成形品、繊維、モノフィラメントが好ましい。
Furthermore, according to the present invention, there is provided a molded product obtained by molding such a polyamide resin by a predetermined molding method.
Here, as a molded product, a film, an injection molded product, a fiber, and a monofilament are preferable.
本発明によれば、高分子不純物が除去されるカダベリン塩水溶液が得られる。 According to the present invention, an aqueous cadaverine salt solution from which polymer impurities are removed is obtained.
以下、本発明を実施するための最良の形態(実施の形態)について詳細に説明する。尚、以下に記載する説明は、本発明の実施の形態の代表例であり、これらの内容に本発明は限定されるものではない。 Hereinafter, the best mode (embodiment) for carrying out the present invention will be described in detail. The following description is a representative example of the embodiment of the present invention, and the present invention is not limited to these contents.
(カダベリン)
本実施の形態におけるカダベリンは、例えば、リジン溶液に、同溶液のpHが酵素的脱炭酸反応に適したpHに維持されるように酸を加えながら、リジンの酵素的脱炭酸反応を行うことにより、製造することができる。
ここで用いる酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸や、酢酸等の有機酸が挙げられる。得られた反応生成液から、通常の分離精製方法を用いて遊離カダベリンを採取することができる。
更には、上記酸としてジカルボン酸を用いて、直接ポリアミドの製造原料となるカダベリン・ジカルボン酸塩を採取することも可能である。
(Cadaverine)
The cadaverine in the present embodiment is obtained by, for example, performing an enzymatic decarboxylation reaction of lysine while adding an acid to the lysine solution so that the pH of the solution is maintained at a pH suitable for the enzymatic decarboxylation reaction. Can be manufactured.
Examples of the acid used here include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid. Free cadaverine can be collected from the resulting reaction product solution using a conventional separation and purification method.
Furthermore, it is also possible to collect cadaverine dicarboxylate, which is a raw material for producing polyamide directly, using dicarboxylic acid as the acid.
(カダベリン・アジピン酸塩の製造方法)
以下に、酸としてアジピン酸を用いて、リジンの酵素的脱炭酸反応により、カダベリン・アジピン酸塩を製造する方法について詳細に説明する。
原料として用いるリジンは、通常、遊離塩基(リジンベース。即ち、遊離リジン。)であることが好ましいが、リジンのアジピン酸塩であってもよい。リジンは、酵素的脱炭酸反応によりカダベリンを生成するものであれば、L−リジン、D−リジンのいずれであってもよいが、通常は入手のしやすさからL−リジンが好ましい。
また、リジンは、精製されたリジンであってもよく、酵素的脱炭酸反応により生成するカダベリンがアジピン酸と塩を形成することが可能であれば、リジンを含む発酵液であってもよい。
(Method for producing cadaverine adipate)
Hereinafter, a method for producing cadaverine adipate by enzymatic decarboxylation of lysine using adipic acid as an acid will be described in detail.
The lysine used as a raw material is usually preferably a free base (lysine base, ie, free lysine), but may be an adipate of lysine. The lysine may be either L-lysine or D-lysine as long as it produces cadaverine by enzymatic decarboxylation, but L-lysine is usually preferred because of its availability.
The lysine may be a purified lysine or a fermentation broth containing lysine as long as cadaverine produced by enzymatic decarboxylation can form a salt with adipic acid.
リジン溶液を調製する溶媒としては、好適には水が用いられる。反応液のpHは、アジピン酸によって調整するため、他のpH調整剤や緩衝剤を用いる必要はないが、前記溶媒として緩衝液を用いてもよい。
このような緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。但し、カダベリンとアジピン酸との塩を形成させるという点からは、緩衝剤等は用いないか、用いる場合であっても低濃度に抑えることが好ましい。
As a solvent for preparing the lysine solution, water is preferably used. Since the pH of the reaction solution is adjusted with adipic acid, it is not necessary to use other pH adjusting agents or buffers, but a buffer solution may be used as the solvent.
Examples of such a buffer include sodium acetate buffer. However, from the viewpoint of forming a salt of cadaverine and adipic acid, it is preferable not to use a buffering agent or the like, or to suppress it to a low concentration even if it is used.
リジンとして遊離リジンを用いる場合は、リジン溶液にアジピン酸を加えて酵素的脱炭酸反応に適したpHとなるように調整する。具体的には、pHとしては、通常4.0以上、好ましくは5.0以上、より好ましくは5.5以上で、通常8.0以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは6.5以下が挙げられる。
尚、リジンとして、リジンのアジピン酸塩を用いる場合は、反応液調製時にアジピン酸を加える必要はない。以下、このように、反応液のpHを酵素的脱炭酸反応に適したpHに調整することを、「中和」と称す場合がある。
When free lysine is used as lysine, adipic acid is added to the lysine solution to adjust to a pH suitable for enzymatic decarboxylation. Specifically, the pH is usually 4.0 or more, preferably 5.0 or more, more preferably 5.5 or more, and usually 8.0 or less, preferably 7.0 or less, more preferably 6.5. The following are mentioned.
When lysine adipate is used as lysine, it is not necessary to add adipic acid when preparing the reaction solution. Hereinafter, the adjustment of the pH of the reaction solution to a pH suitable for the enzymatic decarboxylation reaction may be referred to as “neutralization”.
リジンの酵素的脱炭酸反応の際には、生産速度及び反応収率向上のため、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサル及びピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも1種のビタミンB6を配合することが好ましく、なかでもピリドキサルリン酸が特に好ましい。
ビタミンB6を添加する方法には特に制限はない。反応中に適宜添加しても良い。
In the enzymatic decarboxylation reaction of lysine, it is preferable to add at least one vitamin B6 selected from pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal and pyridoxal phosphate in order to improve the production rate and reaction yield, and in particular, pyridoxal phosphate Is particularly preferred.
There is no restriction | limiting in particular in the method of adding vitamin B6. You may add suitably during reaction.
リジンの酵素的脱炭酸反応は、例えば、上記のようにして中和されたリジン溶液にリジン脱炭酸酵素(LDC)を添加することによって行うことができる。
LDCとしては、リジンに作用してカダベリンを生成させるものであれば特に制限はない。LDCとしては、精製酵素を用いてもよいし、LDCを産生する微生物、植物細胞又は動物細胞等の細胞を用いてもよい。LDC又はそれを産生する細胞は、1種でもよく、2種以上の混合物であってもよい。
また、細胞をそのまま用いてもよく、LDCを含む細胞処理物を用いてもよい。細胞処理物としては、細胞破砕液及びその分画物が挙げられる。
The enzymatic decarboxylation reaction of lysine can be performed, for example, by adding lysine decarboxylase (LDC) to the lysine solution neutralized as described above.
The LDC is not particularly limited as long as it acts on lysine to produce cadaverine. As the LDC, a purified enzyme may be used, or a cell such as a microorganism, a plant cell, or an animal cell that produces LDC may be used. One type of LDC or a cell that produces it may be used, or a mixture of two or more types may be used.
Further, the cells may be used as they are, or a cell treatment product containing LDC may be used. Examples of the cell treatment product include a cell lysate and a fraction thereof.
前記微生物としては、E.coli等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)等のコリネ型細菌、バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)等のセラチア属細菌等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の真核細胞が挙げられる。これらの中では細菌、特にE.coliが好ましい。 Examples of the microorganism include E. coli. Escherichia bacteria such as E. coli, coryneform bacteria such as Brevibacterium lactofermentum, Bacillus subtilis such as Bacillus subtilis, Serratia marcescens such as Serratia marcescens And eukaryotic cells such as Saccharomyces cerevisiae. Among these, bacteria, in particular E. coli. E. coli is preferred.
前記微生物は、LDCを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。また、LDC活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。植物細胞又は動物細胞も、LDC活性が上昇するように改変された組換え細胞を用いることができる。組換え細胞については、後述する。 The microorganism may be a wild strain or a mutant strain as long as it produces LDC. Moreover, the recombinant strain modified so that LDC activity may increase may be sufficient. Plant cells or animal cells can also be recombinant cells that have been modified to increase LDC activity. The recombinant cell will be described later.
リジン溶液にLDCを添加して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応液から放出され、pHが上昇する。従って、反応液のpHが前記範囲となるように、アジピン酸を反応液に添加する。アジピン酸は連続的に添加してもよく、pHが前記範囲に維持される限り、分割して添加してもよい。
反応温度は、LDCがリジンに作用してカダベリンを生成させる温度であれば特に制限はないが、温度は、通常20℃以上、好ましくは30℃以上で、通常60℃以下、好ましくは40℃以下で行う。
After starting the reaction by adding LDC to the lysine solution, as the reaction proceeds, carbon dioxide released from the lysine is released from the reaction solution, and the pH rises. Therefore, adipic acid is added to the reaction solution so that the pH of the reaction solution is in the above range. Adipic acid may be added continuously, or may be added in portions as long as the pH is maintained in the above range.
The reaction temperature is not particularly limited as long as LDC acts on lysine to produce cadaverine, but the temperature is usually 20 ° C or higher, preferably 30 ° C or higher, and usually 60 ° C or lower, preferably 40 ° C or lower. To do.
原料のリジン又はリジン・アジピン酸塩は、反応開始時に反応液に全量添加してもよく、LDC反応の進行に応じて、分割して添加してもよい。 The raw material lysine or lysine adipate may be added to the reaction solution in its entirety at the start of the reaction, or may be added in portions as the LDC reaction proceeds.
酵素反応は、バッチ式によって行うと、アジピン酸の添加を容易に行うことができる。また、LDC、LDCを産生する細胞又はその処理物を固定化した担体を用いた移動床カラムクロマトグラフィーによって、反応を行うこともできる。
その場合は、反応系のpHが所定の範囲に維持されたまま反応が進行するように、リジン及びアジピン酸をカラムの適当な部位に注入すればよい。
When the enzyme reaction is carried out batchwise, adipic acid can be easily added. The reaction can also be carried out by moving bed column chromatography using a carrier on which LDC, LDC-producing cells or treatments thereof are immobilized.
In that case, lysine and adipic acid may be injected into an appropriate part of the column so that the reaction proceeds while the pH of the reaction system is maintained within a predetermined range.
上記のようにして、リジンの酵素的脱炭酸反応によるカダベリン生成に伴って上昇するpHを、アジピン酸を用いて逐次中和することにより、酵素反応が良好に進行する。このようにして生成するカダベリンは、アジピン酸塩として反応液中に蓄積する。 As described above, the enzymatic reaction proceeds favorably by sequentially neutralizing the pH, which increases with cadaverine production by enzymatic decarboxylation of lysine, using adipic acid. The cadaverine thus produced accumulates in the reaction solution as an adipate.
本実施の形態においては、LDCを用いて得られたカダベリン塩水溶液から、分子量12,000以上、好ましくは5,000以上、特に好ましくは1,000以上の高分子不純物を除去することを特徴とする。
上記高分子不純物をカダベリン水溶液から除去する時期についての制限はなく、上記LDCによる反応が終了した時点で得られたカダベリン・塩酸塩水溶液、カダベリン・硫酸塩水溶液、カダベリン・リン酸塩水溶液、カダベリン・炭酸塩水溶液、カダベリン・ジカルボン酸塩水溶液等から直接除去しても良い。
The present embodiment is characterized in that polymer impurities having a molecular weight of 12,000 or more, preferably 5,000 or more, particularly preferably 1,000 or more are removed from a cadaverine salt aqueous solution obtained using LDC. To do.
There is no limitation on the timing of removing the polymer impurities from the cadaverine aqueous solution, and the cadaverine / hydrochloride aqueous solution, cadaverine / sulfate aqueous solution, cadaverine / phosphate aqueous solution, cadaverine · You may remove directly from carbonate aqueous solution, cadaverine dicarboxylate aqueous solution, etc.
菌体を用いた場合には、LDCで得られたカダベリン塩水溶液中の菌体を滅菌処理し、遠心分離等の方法で菌体等の不溶物を除去した後に実施しても良い。
また、カダベリン塩水溶液がカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液ではない場合には、カダベリン塩水溶液からイオン交換樹脂等を用いてカダベリン水溶液とした後、高分子不純物を除去する操作を行ってから、ジカルボン酸を添加してカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液を得ても良い。さらに、前記カダベリン水溶液にジカルボン酸を添加し、カダベリン・ジカルボン酸塩水溶液を得た後、高分子不純物を除去する操作を行っても良い。
When the microbial cells are used, the microbial cells in the cadaverine salt aqueous solution obtained by LDC may be sterilized and insoluble matters such as microbial cells may be removed by a method such as centrifugation.
Also, when the cadaverine salt aqueous solution is not a cadaverine dicarboxylate aqueous solution, the cadaverine salt aqueous solution is made into a cadaverine aqueous solution using an ion exchange resin or the like, and then an operation for removing polymer impurities is performed, and then the dicarboxylic acid is added. It may be added to obtain a cadaverine / dicarboxylate aqueous solution. Furthermore, after adding dicarboxylic acid to the said cadaverine aqueous solution and obtaining cadaverine dicarboxylate aqueous solution, operation which removes a polymer impurity may be performed.
中でも、操作の煩雑さを軽減し、高分子不純物除去の効率を上げるために、LDCによる反応終了後に不溶物を除去したカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液から高分子不純物を除去する方法が好ましい。
特に、カダベリン・ジカルボン酸塩水溶液から晶析を行い、カダベリン・ジカルボン酸塩を得る場合には、晶析した塩に高分子不純物が混入すると品質の良いポリアミド樹脂が得られないため、晶析操作の前に高分子不純物を除去しておくことが好ましい。
Among these, in order to reduce the complexity of operation and increase the efficiency of polymer impurity removal, a method of removing polymer impurities from the cadaverine dicarboxylate aqueous solution from which insolubles have been removed after the reaction by LDC is preferable.
In particular, when crystallization is performed from an aqueous solution of cadaverine / dicarboxylate to obtain cadaverine / dicarboxylate, a high-quality polyamide resin cannot be obtained if polymer impurities are mixed into the crystallized salt. It is preferable to remove the polymer impurities before the step.
分子量12,000以上の高分子不純物を除去する方法について制限はなく、吸着剤を用いる方法や膜処理等が挙げられる。中でも簡便性と除去効果の観点から、限外濾過膜(UF膜)を用いる方法が好ましい。
限外濾過膜は、その種類により除去できる分子量範囲が定められている。本実施の形態においては、除去できる分子量は12,000以上が好ましく、さらに好ましくは5,000以上、特に好ましくは1,000以上である。
除去する高分子不純物としては、タンパクや核酸、多糖等が挙げられる。特に、微生物を用いた反応を伴う場合には、タンパクが混入しやすいので、本実施の形態により得られる効果が顕著である。
There is no limitation on the method for removing polymer impurities having a molecular weight of 12,000 or more, and examples thereof include a method using an adsorbent and a film treatment. Among these, a method using an ultrafiltration membrane (UF membrane) is preferable from the viewpoint of simplicity and removal effect.
The molecular weight range that can be removed by the type of the ultrafiltration membrane is determined. In the present embodiment, the molecular weight that can be removed is preferably 12,000 or more, more preferably 5,000 or more, and particularly preferably 1,000 or more.
Examples of polymer impurities to be removed include proteins, nucleic acids, and polysaccharides. In particular, when a reaction using microorganisms is involved, proteins are likely to be mixed, so the effect obtained by this embodiment is remarkable.
限外濾過膜の材質や膜形状に制限はない。具体的な材質としては、例えば、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アクリロニトリル共重合体、ポリアミド12等が挙げられる。中でも、アクリロニトリル共重合体が好ましい。
膜形状としては、平膜、中空糸、板、管、スパイラル巻き等が挙げられ、中でも中空糸が好ましい。
また、種々の限外濾過膜モジュールが各社から販売されているが、操作のしやすさからモジュール化したものが好ましい。
There are no restrictions on the material and shape of the ultrafiltration membrane. Specific examples of the material include cellulose acetate, polyethersulfone, polysulfone, polyvinylidene fluoride, polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride, sodium polystyrenesulfonate, acrylonitrile copolymer, polyamide 12 and the like. Of these, acrylonitrile copolymers are preferred.
Examples of the membrane shape include a flat membrane, a hollow fiber, a plate, a tube, and a spiral winding. Among these, a hollow fiber is preferable.
Various ultrafiltration membrane modules are sold by various companies, but those made modular are preferable for ease of operation.
カダベリン塩水溶液から高分子不純物を除去せずに、これを原料の少なくとも一部として重合した場合、得られたポリアミド樹脂中には多くのゲルが存在する。このようなゲルは、射出成形品では、流動性や機械物性等の低下原因となり、フィルムやフィラメントでは、フィッシュアイ(F/E)による表面外観の低下や延伸破断の原因となる。
また、分子量が過度に低い物質を除去しようとすると、操作が煩雑になったり、生産性が低下したりするため好ましくない。
When polymer impurities are polymerized as at least a part of the raw material without removing polymer impurities from the aqueous cadaverine salt solution, many gels are present in the obtained polyamide resin. Such a gel causes a decrease in fluidity and mechanical properties in an injection-molded product, and causes a decrease in surface appearance due to fish eye (F / E) and a stretch fracture in a film and a filament.
Further, it is not preferable to remove a substance having an excessively low molecular weight because the operation becomes complicated and the productivity is lowered.
高分子不純物を除去したカダベリン塩水溶液は、必要に応じ公知の方法を組み合わせることにより精製し、ポリアミド樹脂の原料として使用することができる。 The cadaverine salt aqueous solution from which the polymer impurities have been removed can be purified by a combination of known methods as necessary and used as a raw material for the polyamide resin.
次に、一例として晶析法にて、本実施の形態におけるカダベリン・アジピン酸塩水溶液からカダベリン・アジピン酸塩を得る方法を具体的に説明する。 Next, as an example, a method for obtaining cadaverine adipate from the cadaverine adipate aqueous solution in the present embodiment will be specifically described by crystallization.
バイオマス原料から得られたカダベリン・アジピン酸塩水溶液は着色しているため、晶析前に脱色することが好ましく、脱色剤としては活性炭、合成吸着剤、活性白土、シリカ、ゼオライト等が挙げられ、中でも活性炭が好ましい。
脱色は、脱色剤を充填した塔にカダベリン・アジピン酸塩水溶液を通液する方法や、カダベリン・アジピン酸塩水溶液中に脱色剤を添加、撹拌する方法等が挙げられ、中でも前者が好ましい。
Since the cadaverine / adipate aqueous solution obtained from the biomass raw material is colored, it is preferable to decolorize it before crystallization, and examples of the decolorizing agent include activated carbon, synthetic adsorbent, activated clay, silica, zeolite, etc. Of these, activated carbon is preferred.
Examples of decolorization include a method in which a cadaverine / adipate aqueous solution is passed through a tower packed with a decolorizer, a method in which a decolorizer is added to and stirred in a cadaverine / adipate aqueous solution, and the former is preferred.
脱色後のカダベリン・アジピン酸塩水溶液は、窒素バブリングにより溶存酸素を追い出した後、カダベリン・アジピン酸塩濃度が50重量%〜69重量%、好ましくは60重量%〜67重量%まで濃縮する。カダベリン・アジピン酸塩濃度が過度に小さい場合は晶析後の収率が低くなり、過度に大きいとカダベリン・アジピン酸塩に混入する不純物濃度が高くなるので好ましくない。具体的には、リジン、アルギニン等の3官能以上のアミノ酸等の含有量が高くなるので好ましくない。
濃縮は、カダベリン・アジピン酸塩水溶液の温度50℃〜70℃、減圧度150Torr以下で行うのが好ましい。温度が過度に低いと濃縮時間が長くなり、温度が過度に高いとカダベリン・アジピン酸塩が分解するので好ましくない。また、減圧度が150Torrを超えると濃縮時間が長くなるので好ましくない。
The aqueous solution of cadaverine and adipate after decolorization expels dissolved oxygen by nitrogen bubbling, and then the cadaverine and adipate concentration is concentrated to 50% to 69% by weight, preferably 60% to 67% by weight. If the cadaverine / adipate concentration is excessively small, the yield after crystallization is low, and if it is excessively large, the concentration of impurities mixed in the cadaverine / adipate increases, which is not preferable. Specifically, it is not preferable because the content of trifunctional or higher functional amino acids such as lysine and arginine is increased.
Concentration is preferably carried out at a temperature of 50 ° C. to 70 ° C. and a reduced pressure of 150 Torr or less of the cadaverine / adipate aqueous solution. If the temperature is too low, the concentration time becomes long, and if the temperature is too high, cadaverine adipate is decomposed, which is not preferable. In addition, if the degree of vacuum exceeds 150 Torr, the concentration time becomes longer, which is not preferable.
晶析は、冷却してカダベリン・アジピン酸塩を析出させて行う。この場合、冷却している降温途中で種晶を添加することが好ましい。種晶は、種晶としての効果が得られるものであれば特に限定されない。例えば、析出するカダベリン・アジピン酸塩が好ましい。
冷却時の降温速度は、通常1℃/h以上、好ましくは2℃/h以上、さらに好ましくは3℃/h以上である。また、通常30℃/h以下、好ましくは20℃/h以下、さらに好ましくは10℃/h以下である。降温速度が過度に遅いと、晶析に時間を要する傾向となるので好ましくない。降温速度が過度に早いと、結晶サイズが小さくなる傾向があり、精製度合いが低下する方向となるので好ましくない。
晶析終了温度は、通常1℃以上、好ましくは5℃以上、さらに好ましくは10℃以上である。また、通常30℃以下、好ましくは25℃以下、さらに好ましくは20℃以下である。晶析終了温度が過度に高いと、収率が低くなる傾向があるので好ましくない。晶析終了温度が過度に低いと、カダベリン・アジピン酸塩スラリーを移送する際に、配管を閉塞しやすくなるので好ましくない。
Crystallization is performed by cooling to precipitate cadaverine adipate. In this case, it is preferable to add the seed crystal during cooling. A seed crystal will not be specifically limited if the effect as a seed crystal is acquired. For example, precipitated cadaverine adipate is preferred.
The cooling rate during cooling is usually 1 ° C./h or more, preferably 2 ° C./h or more, more preferably 3 ° C./h or more. Moreover, it is 30 degrees C / h or less normally, Preferably it is 20 degrees C / h or less, More preferably, it is 10 degrees C / h or less. An excessively low temperature drop rate is not preferable because it tends to require time for crystallization. If the rate of temperature decrease is excessively high, the crystal size tends to be small, and the degree of purification tends to decrease.
The crystallization end temperature is usually 1 ° C. or higher, preferably 5 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher. Moreover, it is 30 degrees C or less normally, Preferably it is 25 degrees C or less, More preferably, it is 20 degrees C or less. An excessively high crystallization end temperature is not preferable because the yield tends to be low. If the crystallization end temperature is excessively low, it is not preferable because the piping is easily blocked when the cadaverine / adipate slurry is transferred.
晶析率は、濃縮液のカダベリン・アジピン酸塩濃度と晶析終了温度により決められる。通常1重量%以上、好ましくは5重量%以上、さらに好ましくは10重量%以上である。また、通常46重量%以下、好ましくは39重量%以下、さらに好ましくは35重量%以下に制御することが好ましい。晶析率が過度に低いと、収率が低くなる傾向となるので好ましくない。晶析率が過度に高いと、カダベリン・アジピン酸塩に混入するリジン、アルギニン等の3官能以上のアミノ酸等の不純物濃度が高くなるので好ましくない。 The crystallization rate is determined by the cadaverine / adipate concentration in the concentrate and the crystallization end temperature. Usually, it is 1% by weight or more, preferably 5% by weight or more, more preferably 10% by weight or more. Moreover, it is preferable to control to 46 weight% or less normally, Preferably it is 39 weight% or less, More preferably, it is 35 weight% or less. An excessively low crystallization rate is not preferable because the yield tends to be low. If the crystallization rate is excessively high, the concentration of impurities such as lysine, arginine and other trifunctional amino acids mixed in cadaverine / adipate is not preferable.
晶析後のカダベリン・アジピン酸塩スラリーは、常法に従い固液分離して、結晶として得られる。例えば、遠心濾過を行う場合は、母液を振り切った後に、遠心濾過器が回転している状態で少量の脱塩水をシャワー状にふりかけ、カダベリン・アジピン酸塩に付着している母液をさらに洗い流すと精製度が上がり好ましい。
脱塩水量は、wetケーキ(若干の水を含んだカダベリン・アジピン酸塩)に対して、通常1重量%以上、好ましくは5重量%以上である。また、通常40重量%以下、好ましくは30重量%以下である。脱塩水量が過度に少ないと、洗浄効果が小さくなる傾向となるので好ましくない。脱塩水量が過度に多いと、収率が低下する傾向にあるので好ましくない。このようにして得られた結晶を1番晶と称する。
The cadaverine adipate slurry after crystallization is obtained as crystals by solid-liquid separation according to a conventional method. For example, when performing centrifugal filtration, after shaking off the mother liquor, sprinkle a small amount of demineralized water in the form of a shower while the centrifugal filter is rotating, and further wash away the mother liquor adhering to cadaverine and adipate. The degree of purification increases, which is preferable.
The amount of demineralized water is usually 1% by weight or more, preferably 5% by weight or more based on the wet cake (cadaverine adipate containing some water). Moreover, it is 40 weight% or less normally, Preferably it is 30 weight% or less. An excessively small amount of demineralized water is not preferable because the cleaning effect tends to be small. An excessively large amount of demineralized water is not preferable because the yield tends to decrease. The crystal thus obtained is referred to as the first crystal.
固液分離後の母液や洗浄液は回収して、再度、濃縮、晶析、固液分離を行い、2番晶を得る。同様にして、3番晶、4番晶等を得ることができる。 The mother liquor and the washing liquid after the solid-liquid separation are collected, and again concentrated, crystallized, and solid-liquid separated to obtain the second crystal. Similarly, the third crystal, the fourth crystal and the like can be obtained.
次に、微生物を、LDC活性が上昇するように改質する方法について例示する。尚、他の細胞についても、それに適するように下記の方法を適宜改変することによって、同様にLDC活性を上昇させることができる。 Next, a method for modifying microorganisms so that LDC activity is increased will be exemplified. For other cells, LDC activity can be similarly increased by appropriately modifying the following method so as to be suitable for the other cells.
LDC活性は、例えば、LDCをコードする遺伝子(LDC遺伝子)の発現を増強することによって上昇する。LDC遺伝子の発現の増強は、LDC遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、LDC遺伝子断片を、微生物で機能するベクター、好ましくは、マルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを適当な宿主に導入して形質変換すればよい。 The LDC activity is increased by, for example, enhancing the expression of a gene encoding LDC (LDC gene). Enhanced expression of the LDC gene is achieved by increasing the copy number of the LDC gene. For example, an LDC gene fragment may be ligated with a vector that functions in a microorganism, preferably a multicopy vector, to produce a recombinant DNA, which is introduced into a suitable host and transformed.
LDC遺伝子のコピー数を高めることは、LDC遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。
染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。或いは、特開平2−109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
Increasing the LDC gene copy number can also be achieved by having multiple copies of the LDC gene on the chromosomal DNA of the microorganism. In order to introduce a gene in multiple copies on the chromosomal DNA of a microorganism, homologous recombination is performed using a sequence present in multiple copies on the chromosomal DNA as a target.
As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, repetitive DNA and inverted repeat present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in JP-A-2-109985, a target gene can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA.
LDC活性の上昇は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上又はプラスミド上のLDC遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。
また、国際公開第00/18935号パンフレットに開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換又は改変によりLDC遺伝子の発現が強化され、LDC活性が上昇する。これら発現調節配列の改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
In addition to the gene amplification described above, the increase in LDC activity can also be achieved by replacing an expression regulatory sequence such as a promoter of LDC gene on chromosomal DNA or plasmid with a strong one. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter and the like are known as strong promoters.
Further, as disclosed in International Publication No. 00/18935 pamphlet, it is possible to introduce a base substitution of several bases into the promoter region of a gene and modify it to be more powerful. These promoter substitutions or modifications enhance LDC gene expression and increase LDC activity. Modification of these expression regulatory sequences may be combined with increasing the copy number of the gene.
発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。E.coliの温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えば、国際公開第99/03988号パンフレットに記載されたプラスミドpMAN997等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ(Red recombinase)を利用した方法(Datsenko,K.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97(12),6640−6645)によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。 The replacement of the expression regulatory sequence can be performed, for example, in the same manner as the gene replacement using a temperature sensitive plasmid. E. Examples of the vector having a temperature-sensitive replication origin of E. coli include plasmid pMAN997 described in International Publication No. 99/03988 pamphlet. In addition, expression control is also performed by a method using red recombinase of λ phage (Datsenko, KA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97 (12), 6640-6645). Sequence substitutions can be made.
LDC遺伝子としては、コードされるLDCが、リジンの脱炭酸反応に有効利用できるものであれば特に制限されないが、例えば、バクテリウム カダベリス、E.coli等の細菌や、ガラス豆等の植物、さらには、特開2002−223770号公報に記載の微生物のLDC遺伝子が挙げられる。 The LDC gene is not particularly limited as long as the encoded LDC can be effectively used for the lysine decarboxylation reaction. Examples thereof include bacteria such as E. coli, plants such as glass beans, and the LDC gene of microorganisms described in JP-A-2002-223770.
宿主微生物としてE.coliを用いる場合は、E.coli由来のLDC遺伝子が好ましい。
E.coliのLDC遺伝子としては、cadA遺伝子及びldc遺伝子(米国特許第5,827,698号)が知られているが、これらの中ではcadA遺伝子が好ましい。
E.coliのcadA遺伝子は配列が知られており(N.Watson et al.,Journal of bacteriology(1992)vol.174,p.530−540;S.Y.Meng et al.Journal of bacteriology(1992)vol.174,p.2659−2668;GenBank accession M76411)、その配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRにより、E.coli染色体DNAから単離することができる。
このようなプライマーとしては、配列番号1(配列;GTTGCGTGTTCTGCTTCATCGCGCTGATG)及び配列番号2(配列;ACCAAGCTGATGGGTGAGATAGAGAATGAGTAAG)に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
E. as a host microorganism When using E. coli, E. coli is used. The LDC gene derived from E. coli is preferred.
E. As the LDC gene of E. coli, cadA gene and ldc gene (US Pat. No. 5,827,698) are known, and among these, cadA gene is preferable.
E. The cadA gene of E. coli has a known sequence (N. Watson et al., Journal of Bacteriology (1992) vol. 174, p. 530-540; S. Y. Meng et al. Journal of Bacteriology (1992) vol. 174, p.2659-2668; GenBank accession M76411), by PCR using primers generated based on the sequence, E. coli. It can be isolated from E. coli chromosomal DNA.
Examples of such a primer include a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (sequence: GTTGCGGTTCTGCTTCCATCGCGCTGATG) and SEQ ID NO: 2 (sequence: ACCAAGCTGATGGGGTGAGAGAGAGAATGATAGAAG).
取得されたLDC遺伝子とベクターを連結して組換えDNAを調製するには、LDC遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断し、T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて前記遺伝子とベクターを連結すればよい。
E.coli用のベクターとしては、pUC18、pUC19、pSTV29、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219等が挙げられる。
In order to prepare a recombinant DNA by ligating the obtained LDC gene and the vector, the vector is cleaved with a restriction enzyme suitable for the end of the LDC gene, and the gene and the vector are used using a ligase such as T4 DNA ligase. What is necessary is just to connect.
E. Examples of the vector for E. coli include pUC18, pUC19, pSTV29, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219 and the like.
LDC遺伝子は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。例えばcadA遺伝子は、コードされるLDCの活性が損なわれない限り、1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むLDCをコードするものであってもよい。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には2個〜50個、好ましくは2個〜30個、より好ましくは2個〜10個である。
The LDC gene may be a wild type or a mutant type. For example, a cadA gene encodes an LDC that includes a substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids at one or more positions, as long as the activity of the encoded LDC is not impaired. Also good.
Here, “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 2 to 50, preferably 2 to 30, more preferably 2 -10.
上記のようなLDCと実質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むようにcadA遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。
また、上記のような改変されたDNAは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のDNAをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のDNAを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線又はN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルホン酸(EMS)等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
DNA encoding a protein substantially identical to LDC as described above is cadA so that the amino acid residue at a specific site contains a substitution, deletion, insertion, addition or inversion, for example, by site-directed mutagenesis. It is obtained by modifying the base sequence of the gene.
The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. As the mutation treatment, a method for treating DNA before mutation treatment with hydroxylamine or the like in vitro, and a microorganism that retains the DNA before mutation treatment, for example, Escherichia bacterium, by ultraviolet light or N-methyl-N′-nitro-N— A method of treating with a mutagen that is usually used for mutagenesis treatment such as nitrosoguanidine (NTG) or ethylmethanesulfonic acid (EMS) is mentioned.
上記のような変異を有するDNAを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、LDCと実質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。
また、変異を有するLDCをコードするDNA又はこれを保持する細胞から、例えば、cadA遺伝子(GenBank accession M76411)のコード領域の配列、又は同配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、LDCと同等の活性を有するタンパク質をコードするDNAが得られる。
By expressing the DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the activity of the expression product, DNA encoding a protein substantially identical to LDC can be obtained.
In addition, it hybridizes from a DNA encoding a mutated LDC or a cell harboring the same with a probe having a sequence of the coding region of the cadA gene (GenBank accession M76411) or a part of the sequence under stringent conditions. A DNA encoding a protein that is soybean and has an activity equivalent to that of LDC is obtained.
ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、或いは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。 The “stringent conditions” referred to herein are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, for example, DNAs having high homology, for example, DNAs having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, are present. 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.degree. Which is a condition in which the DNAs hybridize to each other, thereby preventing the low homology DNAs from hybridizing to each other, or normal Southern hybridization. Examples include conditions for hybridizing at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.
プローブとしてcadA遺伝子の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、公知のcadA遺伝子の塩基配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、cadA遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。プローブとして、300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。 A partial sequence of the cadA gene can also be used as a probe. Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on a known cadA gene base sequence as a primer and a DNA fragment containing the cadA gene as a template. When a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as a probe, hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 × SSC, and 0.1% SDS.
LDCと実質的に同一のタンパク質をコードするDNAとして具体的には、公知のcadA遺伝子がコードするアミノ酸配列と、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつLDC活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。 Specifically, DNA encoding a protein substantially identical to LDC is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more homology with an amino acid sequence encoded by a known cadA gene. And a DNA encoding a protein having LDC activity.
組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ K−12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))があり、バチルス・サチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法(Ducan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1997))がある。
或いは、バチルス・サチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラスト又はスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法(Chang,S.and Choen,S.N.,Molec,Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929(1978))も応用できる。また、電気パルス法(特開平2−207791号公報)によっても、微生物の形質転換を行うことができる。
In order to introduce the recombinant DNA into the microorganism, the transformation method reported so far may be performed. For example, as reported for Escherichia coli K-12, recipient cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970)), and a method of introducing competent cells from proliferating cells and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Ducan, CH, Wilson, G.). A. and Young, FE, Gene, 1, 153 (1997)).
Alternatively, DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, are introduced into the DNA-receptor cells in the form of protoplasts or spheroplasts that readily take up recombinant DNA. (Chang, S. and Choen, SN, Molec, Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, MJ, Ward, JM and Hopwood, O.A.,). Nature, 274, 398 (1978); Hinnn, A., Hicks, JB and Fink, GR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)). Also, transformation of microorganisms can be performed by an electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
LDCを産生する微生物又は細胞を得るための培養は、用いる微生物又は細胞に応じて、LDCの産生に適した方法によって行えばよい。
例えば、培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物等の糖類;グリセロール、マンニトールやソルビトール等のアルコール類;グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
Culture for obtaining microorganisms or cells producing LDC may be performed by a method suitable for production of LDC depending on the microorganism or cells used.
For example, the medium may be a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required. Carbon sources include glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, sugars such as ribose and starch hydrolysates; alcohols such as glycerol, mannitol and sorbitol; gluconic acid, fumaric acid, citric acid And organic acids such as succinic acid can be used.
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養素としては、ビタミンB1等のビタミン類、アデニンやRNA等の核酸類等の要求物質又は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia, and the like can be used.
As organic micronutrients, it is desirable to contain an appropriate amount of required substances such as vitamins such as vitamin B1, nucleic acids such as adenine and RNA, or yeast extract. In addition to these, a small amount of calcium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion or the like is added as necessary.
培養は、エシェリヒア・コリの場合は、好気的条件下で16時間〜72時間程度実施するのがよく、培養温度は30℃〜45℃に、培養中のpHは5〜8に制御する。尚、pH調整には無機或いは有機の酸性又はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
尚、LDC遺伝子が、誘導可能なプロモーターによって発現が調節されている場合には、誘導剤を培地に添加する。
In the case of Escherichia coli, the culture is preferably carried out for about 16 to 72 hours under aerobic conditions. The culture temperature is controlled to 30 ° C. to 45 ° C., and the pH during the culture is controlled to 5 to 8. In addition, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas, or the like can be used for pH adjustment.
When the expression of the LDC gene is regulated by an inducible promoter, an inducing agent is added to the medium.
培養後、細胞は、遠心分離機や膜により集めることにより、培養液から回収することができる。細胞は、そのまま用いてもよいが、LDCを含むそれらの処理物を用いる場合は、細胞を超音波、フレンチプレス、又は酵素的処理により破砕し酵素を抽出させ、無細胞抽出液とし、さらにそこからLDCを精製する場合には、常法に従い、硫安塩折、各種クロマトグラフィーを使用することによって精製することができる。 After culturing, the cells can be recovered from the culture solution by collecting them with a centrifuge or a membrane. The cells may be used as they are, but when those treated products containing LDC are used, the cells are disrupted by ultrasonication, French press, or enzymatic treatment to extract the enzyme, and a cell-free extract is obtained. In the case of purifying LDC from, it can be purified by using ammonium sulfate or various chromatography according to a conventional method.
(ポリアミド樹脂)
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂は、カダベリン単位、ジカルボン酸単位を構成成分として含み、本発明の効果を損なわない範囲において、それ以外の共重合成分が含有されていてもよい。
(Polyamide resin)
The polyamide resin to which this embodiment is applied contains a cadaverine unit and a dicarboxylic acid unit as constituent components, and may contain other copolymerization components as long as the effects of the present invention are not impaired.
この場合、共重合成分としては、例えば、6−アミノカプロン酸、11−アミノウンデカン酸、12−アミノドデカン酸、パラアミノメチル安息香酸等のアミノ酸;ε−カプロラクタム、ω−ラウロラクタム等のラクタム;シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸等の脂肪族ジカルボン酸;シクロヘキサンジカルボン酸等の脂環式ジカルボン酸;フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸; In this case, examples of the copolymer component include amino acids such as 6-aminocaproic acid, 11-aminoundecanoic acid, 12-aminododecanoic acid and paraaminomethylbenzoic acid; lactams such as ε-caprolactam and ω-laurolactam; oxalic acid Fats such as malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, undecanedioic acid, dodecanedioic acid, brassic acid, tetradecanedioic acid, pentadecanedioic acid, octadecanedioic acid Aromatic dicarboxylic acids such as cyclohexanedicarboxylic acid; Aromatic dicarboxylic acids such as phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, naphthalenedicarboxylic acid;
エチレンジアミン、1,3−ジアミノプロパン、1,4−ジアミノブタン、1,6−ジアミノヘキサン、1,7−ジアミノヘプタン、1,8−ジアミノオクタン、1,9−ジアミノノナン、1,10−ジアミノデカン、1,11−ジアミノウンデカン、1,12−ジアミノドデカン、1,13−ジアミノトリデカン、1,14−ジアミノテトラデカン、1,15−ジアミノペンタデカン、1,16−ジアミノヘキサデカン、1,17−ジアミノヘプタデカン、1,18−ジアミノオクタデカン、1,19−ジアミノノナデカン、1,20−ジアミノエイコサン、2−メチル−1,5−ジアミノペンタン等の脂肪族ジアミン;シクロヘキサンジアミン、ビス−(4−アミノヘキシル)メタン等の脂環式ジアミン;キシリレンジアミン等の芳香族ジアミンが挙げられる。 Ethylenediamine, 1,3-diaminopropane, 1,4-diaminobutane, 1,6-diaminohexane, 1,7-diaminoheptane, 1,8-diaminooctane, 1,9-diaminononane, 1,10-diaminodecane, 1,11-diaminoundecane, 1,12-diaminododecane, 1,13-diaminotridecane, 1,14-diaminotetradecane, 1,15-diaminopentadecane, 1,16-diaminohexadecane, 1,17-diaminoheptadecane Aliphatic diamines such as 1,18-diaminooctadecane, 1,19-diaminononadecane, 1,20-diaminoeicosane, 2-methyl-1,5-diaminopentane; cyclohexanediamine, bis- (4-aminohexyl) ) Alicyclic diamines such as methane; Aromatics such as xylylenediamine Amines.
また、本実施の形態で使用するジカルボン酸は、前述した芳香族ジカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂環式ジカルボン酸と同様の化合物を挙げることができる。
これらの共重合成分は1種を単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
Examples of the dicarboxylic acid used in the present embodiment include the same compounds as the above-mentioned aromatic dicarboxylic acid, aliphatic dicarboxylic acid, and alicyclic dicarboxylic acid.
These copolymerization components may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
(ポリアミド樹脂の製造方法)
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂の製造方法としては、公知の方法が使用でき、具体的には「ポリアミド樹脂ハンドブック」(日刊工業社出版:福本修編)等に開示されている。例えば、ポリアミド56の製造方法としては、カダベリン・アジピン酸塩を、水の共存下で混合し、加熱して脱水反応を進行させる方法(加熱重縮合)が好ましい。
(Production method of polyamide resin)
As a method for producing a polyamide resin to which the present embodiment is applied, a known method can be used, and specifically disclosed in “Polyamide Resin Handbook” (published by Nikkan Kogyo Co., Ltd .: Osamu Fukumoto). For example, as a method for producing polyamide 56, a method in which cadaverine adipate is mixed in the presence of water and heated to proceed with a dehydration reaction (heat polycondensation) is preferable.
尚、本実施の形態における上記加熱重縮合とは、ポリアミド樹脂の製造における重合反応物の最高到達温度を200℃以上に上昇させる製造プロセスである。最高到達反応温度の上限としては、重合反応時の熱安定性を考慮して、通常300℃以下である。重合方式には特に制限は無く回分式、連続方式が採用できる。 In addition, the said heat polycondensation in this Embodiment is a manufacturing process which raises the highest ultimate temperature of the polymerization reaction material in manufacture of a polyamide resin to 200 degreeC or more. The upper limit of the maximum reaction temperature is usually 300 ° C. or lower in consideration of the thermal stability during the polymerization reaction. The polymerization method is not particularly limited, and a batch method or a continuous method can be adopted.
上記の方法で製造されたポリアミド樹脂は加熱重縮合後に更に固相重合することができる。これにより、ポリアミド樹脂の分子量を高くすることができる。固相重合は、例えば、100℃以上融点以下の温度で真空中、或いは不活性ガス中で加熱することにより行うことができる。 The polyamide resin produced by the above method can be further subjected to solid phase polymerization after heat polycondensation. Thereby, the molecular weight of the polyamide resin can be increased. The solid phase polymerization can be performed, for example, by heating in a vacuum or an inert gas at a temperature of 100 ° C. or higher and a melting point or lower.
本実施の形態が適用されるポリアミド樹脂の重合度は、特に制限がなく、濃度0.01g/mlとした98%硫酸溶液の25℃における相対粘度(ηr)が1.5〜8.0であることが好ましく、2.0〜5.5であることがさらに好ましい。
相対粘度(ηr)が過度に低いと、実用的強度が不十分であり、一方、過度に高いと、流動性が低下し、成形加工性が損なわれるので好ましくない。
相対粘度(ηr)は、成形性の観点から、フィルム、繊維、モノフィラメント等の押出成形では3.0〜5.5、射出成形では2.0〜3.5が特に好ましい。
The degree of polymerization of the polyamide resin to which the present embodiment is applied is not particularly limited, and the relative viscosity (η r ) at 25 ° C. of a 98% sulfuric acid solution having a concentration of 0.01 g / ml is 1.5 to 8.0. It is preferable that it is 2.0-5.5.
If the relative viscosity (η r ) is excessively low, the practical strength is insufficient. On the other hand, if the relative viscosity is excessively high, the fluidity is lowered and the moldability is impaired.
From the viewpoint of moldability, the relative viscosity (η r ) is particularly preferably 3.0 to 5.5 for extrusion molding of films, fibers, monofilaments, and 2.0 to 3.5 for injection molding.
本実施の形態におけるポリアミド樹脂には、本発明の効果を損なわない範囲で他の成分を、ポリアミド樹脂の重合から成形までの任意の段階で配合することができる。
このような他の成分としては、例えば、酸化防止剤や熱安定剤(ヒンダードフェノール系、ヒドロキノン系、ホスファイト系及びこれらの置換体、ハロゲン化銅、ヨウ素化合物等);耐候剤(レゾルシノール系、サリシレート系、ベンゾトリアゾール系、ベンゾフェノン系、ヒンダードアミン系等);離型剤及び滑剤(脂肪族アルコール、脂肪族アミド、脂肪族ビスアミド、ビス尿素及びポリエチレンワックス等);顔料(硫化カドミウム、フタロシアニン、カーボンブラック等);染料(ニグロシン、アニリンブラック等);可塑剤(p−オキシ安息香酸オクチル、N−ブチルベンゼンスルホンアミド等);
In the polyamide resin in the present embodiment, other components can be blended at any stage from the polymerization of the polyamide resin to the molding as long as the effects of the present invention are not impaired.
Examples of such other components include antioxidants and heat stabilizers (hindered phenols, hydroquinones, phosphites and their substitutes, copper halides, iodine compounds, etc.); weathering agents (resorcinols) , Salicylates, benzotriazoles, benzophenones, hindered amines, etc.); mold release agents and lubricants (aliphatic alcohols, aliphatic amides, aliphatic bisamides, bisureas, polyethylene waxes, etc.); pigments (cadmium sulfide, phthalocyanine, carbon) Dye (Nigrosine, aniline black, etc.); Plasticizer (octyl p-oxybenzoate, N-butylbenzenesulfonamide, etc.);
帯電防止剤(アルキルサルフェート型アニオン系帯電防止剤、4級アンモニウム塩型カチオン系帯電防止剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等の非イオン系帯電防止剤、ベタイン系両性帯電防止剤等);難燃剤(メラミンシアヌレート、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の水酸化物、ポリリン酸アンモニウム、臭素化ポリスチレン、臭素化ポリフェニレンオキシド、臭素化ポリカーボネート、臭素化エポキシ樹脂又はこれらの臭素系難燃剤と三酸化アンチモンとの組み合わせ等);他の重合体(他のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、液晶ポリマー、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ABS樹脂、SAN樹脂、ポリスチレン等)が挙げられる。
これらの他の成分は、ドライブレンド又は押出機を用いて溶融混練するのが好ましい。
Antistatic agents (alkyl sulfate type anionic antistatic agents, quaternary ammonium salt type cationic antistatic agents, nonionic antistatic agents such as polyoxyethylene sorbitan monostearate, betaine amphoteric antistatic agents, etc.); difficult Flame retardant (hydramine such as melamine cyanurate, magnesium hydroxide, aluminum hydroxide, ammonium polyphosphate, brominated polystyrene, brominated polyphenylene oxide, brominated polycarbonate, brominated epoxy resin or brominated flame retardant and trioxide Combination with antimony); other polymers (other polyamides, polyethylene, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyphenylene ether, polyphenylene sulfide, liquid crystal polymer, polysulfone, polyethersulfone, ABS resin, SAN Fat, polystyrene, etc.).
These other components are preferably melt kneaded using a dry blend or an extruder.
また、本実施の形態のポリアミド樹脂をフィルム用途に用いる場合には、滑り性向上のため、タルク、カオリン、焼成カオリン、シリカ、ゼオライト等の無機フィラー、特に微粒子状の無機フィラーを配合することが好ましい。更に好ましくは、無機フィラーと離型剤及び/または滑剤とを併用する態様が挙げられる。
無機フィラーの配合量としては、ポリアミド樹脂100重量部当り0.005重量部〜0.1重量部が好ましく用いられる。また、離型剤及び/または滑剤は、ポリアミド樹脂100重量部当り0.01重量部〜0.5重量部が好ましく用いられる。
In addition, when the polyamide resin of the present embodiment is used for a film, an inorganic filler such as talc, kaolin, calcined kaolin, silica, zeolite, etc., particularly a fine inorganic filler may be blended for improving the slipping property. preferable. More preferably, the aspect which uses together an inorganic filler, a mold release agent, and / or a lubricant is mentioned.
The blending amount of the inorganic filler is preferably 0.005 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the polyamide resin. The release agent and / or lubricant is preferably used in an amount of 0.01 to 0.5 parts by weight per 100 parts by weight of the polyamide resin.
また、本実施の形態のポリアミド樹脂は、射出成形、フィルム成形、溶融紡糸、ブロー成形、真空成形等の任意の成形方法により、所望の形状に成形することができる。成形品としては、例えば、射出成形品、フィルム、シート、フィラメント、テーパードフィラメント、繊維等が挙げられる。また、ポリアミド樹脂は、接着剤、塗料等にも使用することができる。 Further, the polyamide resin of the present embodiment can be molded into a desired shape by any molding method such as injection molding, film molding, melt spinning, blow molding, vacuum molding and the like. Examples of the molded product include injection molded products, films, sheets, filaments, tapered filaments, fibers, and the like. Polyamide resins can also be used for adhesives, paints, and the like.
また、本実施の形態のポリアミド樹脂の具体的な用途例としては、自動車・車両関連部品として、例えば、インテークマニホールド、ヒンジ付きクリップ(ヒンジ付き成形品)、結束バンド、レゾネーター、エアークリーナー、エンジンカバー、ロッカーカバー、シリンダーヘッドカバー、タイミングベルトカバー、ガソリンタンク、ガソリンサブタンク、ラジエータータンク、インタークーラータンク、オイルリザーバータンク、オイルパン、電動パワステギヤ、オイルストレーナー、キャニスター、エンジンマウント、ジャンクションブロック、リレーブロック、コネクター、コルゲートチューブ、プロテクター等の自動車用アンダーフード部品;ドアハンドル、フェンダー、フードバルジ、ルーフレールレグ、ドアミラーステー、バンパー、スポイラー、ホイールカバー等の自動車用外装部品;カップホルダー、コンソールボックス、アクセルペダル、クラッチペダル、シフトレバー台座、シフトレバーノブ等の自動車用内装部品が挙げられる。 Further, specific examples of applications of the polyamide resin of the present embodiment include, for example, an intake manifold, a clip with a hinge (molded product with a hinge), a binding band, a resonator, an air cleaner, and an engine cover as automobile / vehicle-related parts. , Rocker cover, cylinder head cover, timing belt cover, gasoline tank, gasoline sub tank, radiator tank, intercooler tank, oil reservoir tank, oil pan, electric power steering gear, oil strainer, canister, engine mount, junction block, relay block, connector, corrugated Automotive under hood parts such as tubes and protectors; door handles, fenders, hood bulges, roof rail legs, door mirror stays, vans Chromatography, spoilers, automobile exterior parts such as wheel covers, cup holders, console boxes, accelerator pedals, clutch pedals, shift lever pedestals, automobile interior parts such as a shift lever knob and the like.
さらに、本実施の形態のポリアミド樹脂は、釣り糸、漁網等の漁業関連資材、スイッチ類、超小型スライドスイッチ、DIPスイッチ、スイッチのハウジング、ランプソケット、結束バンド、コネクタ、コネクタのハウジング、コネクタのシェル、ICソケット類、コイルボビン、ボビンカバー、リレー、リレーボックス、コンデンサーケース、モーターの内部部品、小型モーターケース、ギヤ・カム、ダンシングプーリー、スペーサー、インシュレーター、キャスター、端子台、電動工具のハウジング、スターターの絶縁部分、ヒューズボックス、ターミナルのハウジング、ベアリングリテーナー、スピーカー振動板、耐熱容器、電子レンジ部品、炊飯器部品、プリンタリボンガイド等に代表される電気・電子関連部品、家庭・事務電気製品部品、コンピューター関連部品、ファクシミリ・複写機関連部品、機械関連部品等各種用途に使用することができる。 Further, the polyamide resin of the present embodiment includes fishing line, fishing net and other fishery-related materials, switches, micro slide switches, DIP switches, switch housings, lamp sockets, cable ties, connectors, connector housings, connector shells. , IC sockets, coil bobbins, bobbin covers, relays, relay boxes, condenser cases, motor internal parts, small motor cases, gears / cams, dancing pulleys, spacers, insulators, casters, terminal blocks, power tool housings, starter Electrical / electronic parts such as insulation parts, fuse boxes, terminal housings, bearing retainers, speaker diaphragms, heat-resistant containers, microwave oven parts, rice cooker parts, printer ribbon guides, etc. Parts, computer-related parts, facsimile-copier-related parts, can be used in the machine-related parts such as various applications.
(ポリアミド樹脂フィルムの成形方法)
本実施の形態におけるポリアミド樹脂フィルムは、公知の方法で成形することができる。例えば、ポリアミド樹脂に離型剤や滑剤等をドライブレンドしたポリアミド樹脂組成物の溶融体を連続的にT−ダイより押出し、キャスティングロールにて冷却しながらフィルム状に成形するT−ダイ法;環状のダイスより連続的に押出し、水を接触させて冷却する水冷インフレーション法;同じく環状のダイスより押出し、空気によって冷却する空冷インフレーション法等が用いられる。また、これらの成形法で他の材料を同時に押し出す共押出法で多層のフィルムを得ることもできる。
(Polyamide resin film molding method)
The polyamide resin film in the present embodiment can be formed by a known method. For example, a T-die method in which a melt of a polyamide resin composition obtained by dry blending a release agent or a lubricant with a polyamide resin is continuously extruded from a T-die and cooled into a film by a casting roll; For example, a water-cooled inflation method in which water is extruded from a continuous die and cooled by contact with water; an air-cooled inflation method in which the material is extruded from an annular die and cooled by air is used. Moreover, a multilayer film can also be obtained by a coextrusion method in which other materials are simultaneously extruded by these molding methods.
必要に応じて一軸または二軸延伸フィルムとして使用することも可能である。延伸方法は公知の方法が応用できる。例えば、T−ダイ法にて成形したフィルムの場合、縦延伸(一軸延伸)はロール方式を用いる。さらに横方向に延伸する際には、テンター方式を使用した逐次二軸延伸法が挙げられる。環状ダイより成形したチューブ状フィルムについては、上記の逐次二軸延伸法以外に縦横同時に延伸できるチューブラー延伸法が用いられる。
共押出しフィルムについても同様の方法で各層を同時に延伸(共延伸)することができる。尚、延伸倍率は縦方向、横方向とも2倍〜4倍、好ましくは2倍〜3.5倍である。
If necessary, it can be used as a uniaxially or biaxially stretched film. A known method can be applied as the stretching method. For example, in the case of a film formed by the T-die method, the roll method is used for longitudinal stretching (uniaxial stretching). Furthermore, when extending | stretching to a horizontal direction, the sequential biaxial stretching method which uses a tenter system is mentioned. For the tubular film formed from an annular die, a tubular stretching method that can be simultaneously stretched in the vertical and horizontal directions is used in addition to the sequential biaxial stretching method.
Each layer can be stretched (co-stretched) at the same time by the same method for the coextruded film. The stretching ratio is 2 to 4 times, preferably 2 to 3.5 times in both the vertical and horizontal directions.
本実施の形態におけるポリアミド樹脂のフィルムの厚みは、好ましくは1μm〜70μmである。フィルムの厚みが過度に小さいと強度が不充分になりやすく、過度に大きいと繰り返し屈曲疲労性が低下しやすい。
フィルムがポリアミド樹脂単層フィルムの場合、より好ましくは5μm〜50μm、更に好ましくは10μm〜30μmであり、多層フィルムの場合、ポリアミド樹脂層としての厚みは、より好ましくは2μm〜50μm、更に好ましくは5μm〜30μmである。
The thickness of the polyamide resin film in the present embodiment is preferably 1 μm to 70 μm. If the thickness of the film is excessively small, the strength tends to be insufficient, and if it is excessively large, the bending fatigue resistance tends to decrease.
When the film is a polyamide resin monolayer film, the thickness is more preferably 5 μm to 50 μm, still more preferably 10 μm to 30 μm. When the film is a multilayer film, the thickness as the polyamide resin layer is more preferably 2 μm to 50 μm, still more preferably 5 μm. ˜30 μm.
本実施の形態におけるポリアミド樹脂のフィルムは、印刷性の改良や、ラミネート性(接着性)の改良のために片面、または両面にコロナ処理した後使用することもできる。
本実施の形態では、射出成形方法により、所望の形状に成形されたポリアミド樹脂の射出成形品を得ることができる。
The polyamide resin film in the present embodiment can also be used after corona treatment on one side or both sides in order to improve printability or laminate properties (adhesiveness).
In the present embodiment, an injection molded product of polyamide resin molded into a desired shape can be obtained by an injection molding method.
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例の記載に限定されるものではない。
[相対粘度(ηr)]
試料を98%濃硫酸に溶解して濃度0.01g/mlとし、25℃でオストワルド式粘度計を用いて測定を行い、(試料溶液の落下時間)/(濃硫酸の落下時間)を相対粘度(ηr)とした。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the description of these examples.
[Relative viscosity (η r )]
The sample was dissolved in 98% concentrated sulfuric acid to a concentration of 0.01 g / ml, and measured at 25 ° C. using an Ostwald viscometer. The (sample solution falling time) / (concentrated sulfuric acid falling time) was the relative viscosity. (Η r ).
[DSC(示差走査熱量測定)]
セイコー電子工業製ロボットDSCを用い、窒素雰囲気下、試料約5mgを採取し、次の条件で測定した。
ポリアミド樹脂を完全に融解させて3分間保持した後、20℃/分の降温速度で、30℃まで降温したときに現れる発熱ピークの温度(降温結晶化温度Tc)と、これに続いて、30℃で3分間保持した後、30℃から20℃/分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度(融点Tm)を求めた。吸熱ピークが複数の場合は、最も高い温度を融点Tmとした。
[DSC (Differential Scanning Calorimetry)]
About 5 mg of a sample was collected under a nitrogen atmosphere using a Seiko Electronics robot DSC and measured under the following conditions.
After the polyamide resin is completely melted and held for 3 minutes, the temperature of the exothermic peak that appears when the temperature is lowered to 30 ° C. at a temperature lowering rate of 20 ° C./min (temperature-lowering crystallization temperature Tc), followed by 30 After holding at 3 ° C. for 3 minutes, an endothermic peak temperature (melting point Tm) observed when the temperature was raised from 30 ° C. at a rate of temperature increase of 20 ° C./min was determined. When there were a plurality of endothermic peaks, the highest temperature was defined as the melting point Tm.
[静止摩擦係数(滑り性)]
相対湿度65%、温度23℃の条件下、平行移動式により静止摩擦係数を測定した。
[Static friction coefficient (sliding property)]
The coefficient of static friction was measured by a parallel movement method under conditions of a relative humidity of 65% and a temperature of 23 ° C.
[F/E(フィッシュアイ)数]
ポリアミド樹脂原料を、押出機シリンダー径が30mmφのT−ダイ式製膜機を用いて40μm厚みのポリアミド樹脂フィルムを製膜する。製膜条件は、押出機のシリンダー設定温度が280℃、ポリアミド樹脂フィルムを巻き取る冷却ロール温度が90℃、吐出量が2kg/時である。
面積が900cm2中における、大きさが50μm以上の粒状欠陥をフィッシュアイとし、当該フィッシュアイの数を数えた(単位:個/900cm2)。
[F / E (fisheye) number]
A polyamide resin film having a thickness of 40 μm is formed from the polyamide resin raw material using a T-die type film forming machine having an extruder cylinder diameter of 30 mmφ. The film forming conditions are: the cylinder set temperature of the extruder is 280 ° C., the cooling roll temperature for winding the polyamide resin film is 90 ° C., and the discharge amount is 2 kg / hour.
A granular defect having an area of 900 cm 2 having a size of 50 μm or more was defined as a fish eye, and the number of the fish eye was counted (unit: piece / 900 cm 2 ).
[数平均分子量]
(1)末端アミノ基
ポリアミド樹脂の試料0.1g〜2gを正確に秤量し、フェノール50ml中に溶解した後、自動滴定装置(三菱化学株式会社製、GT−06)を用いて0.1N塩酸で滴定し、算出した(単位:eq/g)。
(2)末端カルボキシル基
ポリアミド樹脂の試料0.1g〜2gを正確に秤量し、ベンジルアルコール50ml中に溶解した後、自動滴定装置(三菱化学株式会社製、GT−06)または通常のビュレット型滴定装置を用いて0.1N水酸化ナトリウムで滴定し算出した(単位:eq/g)。
(3)数平均分子量
上記(1)、(2)の方法で求めた末端の総数から次式に従って算出した。
[Number average molecular weight]
(1) Terminal amino group After 0.1 g to 2 g of a polyamide resin sample was accurately weighed and dissolved in 50 ml of phenol, 0.1N hydrochloric acid was used using an automatic titrator (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, GT-06). And calculated (unit: eq / g).
(2) Terminal carboxyl group After 0.1 g to 2 g of a polyamide resin sample was accurately weighed and dissolved in 50 ml of benzyl alcohol, an automatic titrator (manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd., GT-06) or a normal burette type titration Titration with 0.1N sodium hydroxide was performed using an apparatus, and calculation was performed (unit: eq / g).
(3) Number average molecular weight The number average molecular weight was calculated according to the following formula from the total number of terminals determined by the methods (1) and (2).
[スパイラル流動長]
スパイラルフロー試験片の成形、日本製鋼所社製J75EII型射出成形機を使用し、樹脂温度265℃、金型温度75℃、射出圧力50MPa、スパイラルフロー試験片厚み3mmにて行った。スパイラルフロー試験片の長さを測定し、スパイラル流動長とした(単位:mm)。
[Spiral flow length]
Molding of a spiral flow test piece was performed using a J75EII type injection molding machine manufactured by Nippon Steel Works, at a resin temperature of 265 ° C., a mold temperature of 75 ° C., an injection pressure of 50 MPa, and a spiral flow test piece thickness of 3 mm. The length of the spiral flow test piece was measured and defined as the spiral flow length (unit: mm).
[リジン脱炭酸酵素遺伝子(cadA)増強株の作製]
(A)大腸菌DNA抽出
LB培地[組成:トリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl5gを蒸留水1Lに溶解]10mLに、大腸菌(Eschericia coli)JM109株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を10mg/mLのリゾチームを含む10mM NaCl/20mM トリス緩衝液(pH8.0)/1mM EDTA・2Na溶液0.15mLに懸濁した。
[Preparation of lysine decarboxylase gene (cadA) -enhanced strain]
(A) Escherichia coli DNA extraction LB medium [composition: tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g dissolved in 1 L of distilled water] 10 mL of Escherichia coli JM109 strain was cultured until the late logarithmic phase, and the resulting bacteria The body was suspended in 0.15 mL of 10 mM NaCl / 20 mM Tris buffer (pH 8.0) / 1 mM EDTA · 2Na solution containing 10 mg / mL lysozyme.
次に、上記懸濁液にプロテナーゼKを、最終濃度が100μg/mLになるように添加し、37℃で1時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が0.5%になるように添加し、50℃で6時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール/クロロフォルム溶液を添加し、室温で10分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離(5,000×g、20分間、10℃〜12℃)し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを0.3Mとなるように添加した後、2倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離(15,000×g、2分間)により回収した沈殿物を70%エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたDNAに10mM トリス緩衝液(pH7.5)−1mM EDTA・2Na溶液5mLを加え、4℃で一晩静置し、以後のPCRの鋳型DNAに使用した。 Next, proteinase K was added to the suspension so that the final concentration was 100 μg / mL, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 6 hours for lysis. To this lysate, add an equal amount of phenol / chloroform solution, shake gently at room temperature for 10 minutes, and then centrifuge (5,000 × g, 20 minutes, 10 ° C. to 12 ° C.) to obtain the supernatant. Fractions were collected and sodium acetate was added to a concentration of 0.3 M, and then twice the amount of ethanol was added and mixed. The precipitate collected by centrifugation (15,000 × g, 2 minutes) was washed with 70% ethanol and then air-dried. To the obtained DNA, 5 mL of a 10 mM Tris buffer (pH 7.5) -1 mM EDTA · 2Na solution was added and allowed to stand at 4 ° C. overnight, and used as template DNA for subsequent PCR.
(B)cadAのクローニング
大腸菌cadAの取得は、上記(A)で調製したDNAを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌K12−MG1655株の該遺伝子の配列(GenBank Database Accession No.U00096)を基に設計した合成DNA(配列番号1(配列;GTTGCGTGTTCTGCTTCATCGCGCTGATG)及び配列番号2(配列;ACCAAGCTGATGGGTGAGATAGAGAATGAGTAAG))を用いたPCRによって行った。
(B) Cloning of cadA E. coli cadA is obtained by using the DNA prepared in the above (A) as a template and the sequence of the gene of E. coli K12-MG1655 strain (GenBank Database Accession No. U00096) for which the entire genome sequence has been reported. This was performed by PCR using synthetic DNAs (SEQ ID NO: 1 (sequence; GTTGCGGTTCTGCTTCCATCGCGCTGATG) and SEQ ID NO: 2 (sequence; ACCAAGCTGATGGGTGGAGAGAGAGATGAGTAAG)) designed based on the above.
(反応液組成)
鋳型DNA1μL、PfxDNAポリメラーゼ(インビトロジェン社製)0.2μL、1倍濃度添付バッファー、0.3μM各々プライマー、1mMMgSO4、0.25μMdNTPsを混合し、全量を20μLとした。
(Reaction solution composition)
Template DNA 1 μL, Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen) 0.2 μL, 1 × concentration attached buffer, 0.3 μM each primer, 1 mM MgSO 4 , 0.25 μM dNTPs were mixed to make a total volume of 20 μL.
(反応温度条件)
DNAサーマルサイクラー(MJResearch社製PTC−200)を用い、94℃で20秒間、60℃で20秒間、72℃で2.5分間からなるサイクルを35回繰り返した。但し、1サイクル目の94℃での保温は1分20秒間、最終サイクルの72℃での保温は10分間とした。
(Reaction temperature conditions)
Using a DNA thermal cycler (PTJ-200 manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 2.5 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C. in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C. in the final cycle was 10 minutes.
図1は、cadAのクローニングの手順を説明する図である。
図1に示すように、PCR反応終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製した後、制限酵素KpnI及び制限酵素SphIで切断した。このDNA標品を、0.75%アガロース(SeaKem GTG agarose:FMCBioProducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することによりcadAを含む約2.6kbの断片を検出し、QIAQuick Gel Extraction Kit(QIAGEN製)を用いて目的DNA断片の回収を行った。
FIG. 1 is a diagram for explaining the procedure for cloning cadA.
As shown in FIG. 1, after completion of the PCR reaction, the amplified product was purified by ethanol precipitation, and then cleaved with restriction enzyme KpnI and restriction enzyme SphI. This DNA preparation was separated by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis, and visualized by ethidium bromide staining to detect a fragment of about 2.6 kb containing cadA, and QIAQuick Gel The DNA fragment of interest was recovered using an Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
回収したDNA断片を、大腸菌プラスミドベクターpUC18(宝酒造株式会社製)を制限酵素KpnI及び制限酵素SphIで切断して調整したDNA断片と混合し、ライゲーションキットver.2(宝酒造株式会社製)を用いて連結後、得られたプラスミドDNAを用いて大腸菌(JM109株)を形質転換した。
この様にして得られた組換え大腸菌を、50μg/mL アンピシリン、0.2mM IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)及び50μg/mL X−Galを含むLB寒天培地に塗抹した。
The recovered DNA fragment was mixed with a DNA fragment prepared by cleaving E. coli plasmid vector pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) with restriction enzymes KpnI and restriction enzyme SphI, and ligation kit ver. After ligation using 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), Escherichia coli (JM109 strain) was transformed with the obtained plasmid DNA.
The recombinant Escherichia coli thus obtained was smeared on an LB agar medium containing 50 μg / mL ampicillin, 0.2 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) and 50 μg / mL X-Gal.
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドDNAを精製した。得られたプラスミドDNAを制限酵素KpnI及び制限酵素SphIで切断することにより、約2.5kbの挿入断片が認められることを確認し、これをpCAD1、pCAD1を含む大腸菌株をJM109/pCAD1とそれぞれ命名した。 Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. By cleaving the obtained plasmid DNA with restriction enzymes KpnI and restriction enzyme SphI, it was confirmed that an inserted fragment of about 2.5 kb was observed, and these E. coli strains containing pCAD1 and pCAD1 were named JM109 / pCAD1, respectively. did.
[カダベリン・アジピン酸塩水溶液の調製(1)]
以下の実施例で使用した反応液(カダベリン・アジピン酸塩水溶液)は、cadA増幅株を用い、リジン・アジピン酸塩を原料とし、以下の方法で調製した。
(1)cadA増幅株の培養
E.coli JM109/pCAD1をLB培地入りフラスコ10本で前培養した後、1Lの培養液を99LのLB培地が入った200L容ジャーファーメンターに接種し、通気量0.5vvm、35℃、250rpmで通気撹拌培養を行った。
培養開始6時間後、この培養液全量を、3m3の2×LB培地が入った5m3容培養タンクに接種して更に培養を行った。5m3容培養タンクでの培養条件は、通気量0.5vvm、35℃であった。撹拌回転数は溶存酸素濃度が十分高い値になるように60rpm〜100rpmの範囲で調節した。培養4時間目に、滅菌したIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を終濃度で0.5mMになるように添加し、その後14時間培養を継続した。
[Preparation of cadaverine / adipate aqueous solution (1)]
The reaction solution (cadaverine / adipate aqueous solution) used in the following examples was prepared by the following method using a cadA amplified strain and lysine / adipate as a raw material.
(1) Culture of cadA amplified strain E. coli JM109 / pCAD1 was pre-cultured in 10 flasks containing LB medium, then 1 L of the culture solution was inoculated into a 200 L jar fermenter containing 99 L of LB medium, and aerated at 0.5 vvm, 35 ° C., 250 rpm. Stirring culture was performed.
Six hours after the start of the culture, the whole culture solution was inoculated into a 5 m 3 volume culture tank containing 3 m 3 of 2 × LB medium and further cultured. The culture conditions in a 5 m 3 volume culture tank were an aeration rate of 0.5 vvm and 35 ° C. The stirring rotation speed was adjusted in the range of 60 to 100 rpm so that the dissolved oxygen concentration had a sufficiently high value. At 4 hours of culture, sterilized IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.5 mM, and then the culture was continued for 14 hours.
(2)菌体の分離
6,400rpm、フィード速度750L/hrの条件下で、アルファラバル分離機により培養液からの菌体回収を行った。回収された菌体の湿重量は36.9kgであった。この湿菌体を10mMの酢酸ナトリウム溶液160Lに懸濁したのち、15,000rpm、フィード速度1.0L/minの条件下でシャープレス遠心機により再度菌体回収を行い、18.7kgの湿菌体を取得した。
(2) Separation of bacterial cells Under the conditions of 6,400 rpm and a feed rate of 750 L / hr, the bacterial cells were collected from the culture solution using an Alfa Laval separator. The wet weight of the collected cells was 36.9 kg. After suspending the wet cells in 160 L of 10 mM sodium acetate solution, the cells were collected again with a sharp press centrifuge at 15,000 rpm and a feed rate of 1.0 L / min, and 18.7 kg of wet cells were collected. Acquired the body.
(3)カダベリン・アジピン酸塩の製造
50%(w/v)リジンベース溶液(協和醗酵工業株式会社製)にpHが6.0となるようにアジピン酸を添加して、リジン・アジピン酸塩の濃厚溶液を調製した。リジン濃度で60g/Lとなるように基質溶液(3m3)を作成し、5m3容培養タンクにはり込んだ。ピリドキサルリン酸を0.1mMとなるように基質溶液に添加し、さらにE.coli JM109/pCAD1の菌体をOD660が0.5になるように添加して反応を開始した。
(3) Manufacture of cadaverine and adipate Addition of adipic acid to 50% (w / v) lysine base solution (manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) so that pH is 6.0, A concentrated solution of was prepared. A substrate solution (3 m 3 ) was prepared so as to have a lysine concentration of 60 g / L, and placed in a 5 m 3 culture tank. Pyridoxal phosphate was added to the substrate solution to 0.1 mM, and E. coli was further added. The reaction was started by adding E. coli JM109 / pCAD1 cells so that the OD660 was 0.5.
反応条件は、37℃、0.5vvm通気、70rpmとした。反応中の溶液のpHは、250kgのアジピン酸をイオン交換水400Lに懸濁したスラリーを添加し、6.5になるように制御した。
また、リジン濃度318g/Lの基質濃厚溶液(600L)を開始から約130L/hで連続的にフィードし、約4.5時間で全量を添加した。さらに反応を継続して計22時間反応させた。
The reaction conditions were 37 ° C., 0.5 vvm aeration, and 70 rpm. The pH of the solution during the reaction was controlled to be 6.5 by adding a slurry in which 250 kg of adipic acid was suspended in 400 L of ion-exchanged water.
Further, a substrate concentrated solution (600 L) having a lysine concentration of 318 g / L was continuously fed at about 130 L / h from the start, and the whole amount was added in about 4.5 hours. The reaction was further continued for a total of 22 hours.
反応終了時には、リジン残存濃度が0.03g/L以下であり、ほぼ100%のリジンがカダベリンに変換されていた。
反応後の溶液は、菌体の不活化処理(80℃、30min)を行い、カダベリンとアジピン酸とを略等モル含むカダベリン・アジピン塩水溶液(約3.9m3)を取得した。
At the end of the reaction, the residual concentration of lysine was 0.03 g / L or less, and almost 100% of lysine was converted to cadaverine.
The solution after the reaction was inactivated (80 ° C., 30 min) to obtain a cadaverine / adipine salt aqueous solution (about 3.9 m 3 ) containing approximately equimolar amounts of cadaverine and adipic acid.
(4)UF膜処理
(A)分子量13,000以上の高分子不純物の除去
分子量13,000以上の高分子不純物を除去するUF膜モジュールACP−3053(旭化成工業株式会社製)を通して高分子量体の不純物除去を行ない、約1.3m3のカダベリン・アジピン酸塩水溶液(a)を得た。UF膜処理による回収率は99.4%であった。
(4) UF membrane treatment (A) Removal of polymer impurities with a molecular weight of 13,000 or more Through the UF membrane module ACP-3053 (manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) for removing polymer impurities with a molecular weight of 13,000 or more, Impurities were removed to obtain about 1.3 m 3 of cadaverine / adipate aqueous solution (a). The recovery rate by the UF membrane treatment was 99.4%.
(B)分子量6,000以上の高分子不純物の除去
分子量6,000以上の高分子不純物を除去するUF膜モジュールAIP−0013UF(旭化成工業株式会社製)を通して高分子量体の不純物除去を行ない、約1.3m3のカダベリン・アジピン酸塩水溶液(b)を得た。UF膜処理による回収率は99.1%であった。
(B) Removal of polymer impurities having a molecular weight of 6,000 or more The impurities of the polymer molecules are removed through a UF membrane module AIP-0013UF (manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) that removes polymer impurities having a molecular weight of 6,000 or more. A 1.3 m 3 cadaverine-adipate aqueous solution (b) was obtained. The recovery rate by the UF membrane treatment was 99.1%.
(C)UF膜未処理
UF膜処理を行わず、約1.3m3のカダベリン・アジピン酸塩水溶液(c)を得た。
(C) Untreated UF membrane A cadaverine / adipate aqueous solution (c) of about 1.3 m 3 was obtained without performing the UF membrane treatment.
[カダベリン・アジピン酸塩の精製・単離(A)]
(1)活性炭による脱色
直径500mmの活性炭塔に三菱化学カルゴン株式会社製活性炭MM−11(35kg、約150L)を仕込み、2日間脱塩水を通水した。次に、前記カダベリン・アジピン酸塩水溶液(a)(約1.3m3)を1.32m3/hの速度で通液し、最後に200Lの脱塩水を通水した。初期150Lをパージした後、活性炭処理したカダベリン・アジピン酸塩水溶液を採取した。
[Purification and isolation of cadaverine adipate (A)]
(1) Decolorization by activated carbon Activated carbon MM-11 (35 kg, about 150 L) manufactured by Mitsubishi Chemical Calgon Co., Ltd. was charged into an activated carbon tower having a diameter of 500 mm, and demineralized water was passed through for 2 days. Next, the cadaverine adipate aqueous solution (a) (about 1.3 m 3 ) was passed at a rate of 1.32 m 3 / h, and finally 200 L of demineralized water was passed. After initially purging 150 L, activated carbon-treated cadaverine / adipate aqueous solution was collected.
(2)濃縮
PPプリーツカートリッジフィルターTCP−JXを通して、前記活性炭処理後のカダベリン・アジピン酸塩水溶液(a)を2m3撹拌槽に仕込み、ジャケット温度110℃、内温57℃、真空度140〜150Torrにて濃縮を行ない、カダベリン・アジピン酸塩濃度は63.5wt%に調整して、濃縮液を得た。
(2) Concentration Through the PP pleated cartridge filter TCP-JX, the activated cadaverine / adipate aqueous solution (a) is charged into a 2 m 3 stirring tank, jacket temperature is 110 ° C., internal temperature is 57 ° C., and the degree of vacuum is 140 to 150 Torr. The cadaverine / adipate concentration was adjusted to 63.5 wt% to obtain a concentrated solution.
尚、上記濃縮液等のカダベリン・アジピン酸塩水溶液中のカダベリン濃度は、1N−HCl水溶液にて滴定して、pHの変曲点までの滴定量から算出した。同様に上記濃縮液等のカダベリン・アジピン酸塩水溶液中のアジピン酸濃度は、1N−NaOH水溶液にて滴定して、pHの変曲点までの滴定量から算出した。滴定には、自動滴定装置(三菱化学株式会社製GT−06型)を使用した。 The cadaverine concentration in the cadaverine / adipate aqueous solution such as the above concentrated solution was titrated with a 1N-HCl aqueous solution and calculated from the titration amount up to the inflection point of pH. Similarly, the concentration of adipic acid in the cadaverine / adipate aqueous solution such as the above concentrated solution was titrated with a 1N-NaOH aqueous solution and calculated from the titration amount up to the inflection point of pH. For titration, an automatic titration apparatus (GT-06 model manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) was used.
(3)晶析
次に、濃縮液同一の2m3撹拌槽にて、晶析を行った。撹拌翼は3枚後退翼、撹拌速度は40rpm、降温速度は8℃/h、内温38℃の時に予め作成したカダベリン・アジピン酸塩を種晶として350g添加して結晶を析出させ、内温10℃で晶析終了として、カダベリン・アジピン酸塩スラリーを得た。尚、種晶としてのカダベリン・アジピン酸塩は、本実施例に準じてラボスケールにて準備した。
(3) Crystallization Next, crystallization was performed in the same 2m 3 stirring tank of the concentrated liquid. 350 g of stirring blades were added, 350 g of cadaverine adipate prepared in advance was added as a seed crystal when the stirring speed was 40 rpm, the cooling rate was 8 ° C./h, and the internal temperature was 38 ° C. At the end of crystallization at 10 ° C., a cadaverine / adipate slurry was obtained. Cadaverine adipate as a seed crystal was prepared on a lab scale according to this example.
(4)遠心濾過
直径1.22mの遠心濾過器を用い、前記カダベリン・アジピン酸塩スラリーを遠心濾過した。回転数は980rpm、母液振り切り時間は15分、母液振り切り後に10℃の脱塩水約15kgをシャワー状に振りかけて洗浄し、その脱塩水の振り切り時間は15分とした。1番晶として得られたwetケーキは約70kg、カダベリン・アジピン酸塩(a)として約60kgを得た。
尚、上記カダベリン・アジピン酸塩重量は、wetケーキの水分量を水分計(三菱化学株式会社製電量滴定式水分測定装置CA−06型、及び水分気化装置VA−06型)にて測定して算出した。
(4) Centrifugal filtration The cadaverine adipate slurry was centrifugally filtered using a centrifugal filter having a diameter of 1.22 m. The number of revolutions was 980 rpm, the mother liquor was shaken off for 15 minutes, and after washing off the mother liquor, about 15 kg of demineralized water at 10 ° C. was sprinkled and washed, and the demineralized water was shaken off for 15 minutes. About 70 kg of wet cake obtained as the first crystal was obtained, and about 60 kg of cadaverine adipate (a) was obtained.
The weight of the cadaverine adipate is measured by measuring the moisture content of the wet cake with a moisture meter (coulometric titration moisture measuring device CA-06 type and moisture vaporizer VA-06 type manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). Calculated.
[カダベリン・アジピン酸塩の精製・単離(B)]
前記カダベリン・アジピン酸塩水溶液(b)(約1.3m3)を使用して、[カダベリン・アジピン酸塩の精製・単離(A)]と同様にして、wetケーキは約70kg、カダベリン・アジピン酸塩(b)として約60kgを得た。
[Purification and isolation of cadaverine adipate (B)]
Using the cadaverine adipate aqueous solution (b) (about 1.3 m 3 ), the wet cake was about 70 kg in the same manner as [Purification and isolation of cadaverine adipate (A)]. About 60 kg of adipate (b) was obtained.
[カダベリン・アジピン酸塩の精製・単離(C)]
前記カダベリン・アジピン酸塩水溶液(c)(約1.3m3)を使用して、[カダベリン・アジピン酸塩の精製・単離(A)]と同様にして、wetケーキは約70kg、カダベリン・アジピン酸塩(c)として約60kgを得た。
[Purification and isolation of cadaverine adipate (C)]
Using the cadaverine adipate aqueous solution (c) (about 1.3 m 3 ), the wet cake was about 70 kg in the same manner as [Purification and isolation of cadaverine adipate (A)]. About 60 kg of adipate (c) was obtained.
[実施例1]
<ポリアミド樹脂の製造>
前記カダベリン・アジピン酸塩(a)25kgに水25kgを添加した後、亜燐酸1.25gを添加し、窒素雰囲気下で混合物を完全に溶解させ、原料水溶液を得た。プランジャーポンプにて予め窒素置換したオートクレーブに、上記の原料水溶液を移送した。ジャケット温度を280℃に、オートクレーブの圧力を1.47MPaにそれぞれ調節し、内容物を270℃に昇温した。
[Example 1]
<Manufacture of polyamide resin>
After 25 kg of water was added to 25 kg of the cadaverine adipate (a), 1.25 g of phosphorous acid was added, and the mixture was completely dissolved under a nitrogen atmosphere to obtain a raw material aqueous solution. The raw material aqueous solution was transferred to an autoclave which had been previously purged with nitrogen by a plunger pump. The jacket temperature was adjusted to 280 ° C., the autoclave pressure was adjusted to 1.47 MPa, and the contents were heated to 270 ° C.
次に、オートクレーブ内の圧力を除々に放圧した後、更に減圧して所定の撹拌動力に到達した時点で反応終了とした。反応終了後に窒素にて復圧し、内容物をストランド状に冷却水槽へ導入した後、回転式カッターでペレット化した。得られたペレットは、120℃、1torr(0.13kPa)の条件で、水分量が0.1%以下となる迄乾燥を行い、ポリアミド樹脂を得た。相対粘度(ηr)は3.51であった。 Next, after gradually releasing the pressure in the autoclave, the pressure was further reduced and the reaction was terminated when a predetermined stirring power was reached. After completion of the reaction, the pressure was restored with nitrogen, and the contents were introduced into a cooling water tank in the form of a strand and then pelletized with a rotary cutter. The obtained pellets were dried under the conditions of 120 ° C. and 1 torr (0.13 kPa) until the water content became 0.1% or less to obtain a polyamide resin. The relative viscosity (η r ) was 3.51.
<フィルム成形>
得られたポリアミド樹脂100重量部に対し、平均粒子径が3.0μmのタルク0.03重量部、及びエチレンビスステアリン酸アマイド(花王株式会社製、カオーワックスEB−FF)0.1重量部をドライブレンドして得たポリアミド樹脂組成物を原料として、押出機シリンダ径40mmのT−ダイ式製膜機を用い、押出機シリンダ設定温度260℃、冷却ロール温度90℃にて、厚み25μmのフィルムを製膜した。
製膜開始後、1時間目のフィルムを用い、耐熱性(融点)、滑り性(静止摩擦係数)、フィッシュアイ(F/E)の評価を行った。結果を表1に示す。
<Film forming>
For 100 parts by weight of the obtained polyamide resin, 0.03 part by weight of talc having an average particle size of 3.0 μm and 0.1 part by weight of ethylenebisstearic acid amide (Kao Wax EB-FF, manufactured by Kao Corporation) Using a polyamide resin composition obtained by dry blending as a raw material, using a T-die film forming machine having an extruder cylinder diameter of 40 mm, an extruder cylinder set temperature of 260 ° C., a cooling roll temperature of 90 ° C., and a film having a thickness of 25 μm Was formed.
The heat resistance (melting point), slipperiness (coefficient of static friction), and fish eye (F / E) were evaluated using the film for 1 hour after the start of film formation. The results are shown in Table 1.
[実施例2]
実施例1において、カダベリン・アジピン酸塩(b)を用いた以外は実施例1と同様にして、ポリアミド樹脂の取得(相対粘度(ηr)3.52)、フィルム成形、及びその評価を行った。結果を表1に示す。
[Example 2]
In Example 1, except that cadaverine adipate (b) was used, polyamide resin was obtained (relative viscosity (η r ) 3.52), film formation, and evaluation was performed in the same manner as in Example 1. It was. The results are shown in Table 1.
[実施例3]
重合終了時の撹拌動力を変更した以外は、実施例1と同様にしてポリアミド樹脂を取得(相対粘度(ηr)2.72)した。得られたポリアミド樹脂を用いて、末端アミノ基、末端カルボキシル基を測定して数平均分子量を算出した。結果を表1に示す。
[Example 3]
A polyamide resin was obtained (relative viscosity (η r ) 2.72) in the same manner as in Example 1 except that the stirring power at the end of the polymerization was changed. Using the obtained polyamide resin, the terminal amino group and terminal carboxyl group were measured, and the number average molecular weight was calculated. The results are shown in Table 1.
<スパイラルフロー試験片の成形>
得られたポリアミド樹脂100重量部に対し、結晶核剤として平均粒子径が3.0μmのタルク0.03重量部をドライブレンドして得たポリアミド樹脂組成物を原料として、スパイラルフロー試験片の成形を行った。
成形は、日本製鋼所社製J75EII型射出成形機を使用し、樹脂温度265℃、金型温度75℃、射出圧力50MPa、スパイラルフロー試験片厚み3mmにて行った。スパイラル流動長を表1に示す。
<Formation of spiral flow test piece>
Spiral flow test piece molding using as raw material a polyamide resin composition obtained by dry blending 0.03 part by weight of talc having an average particle size of 3.0 μm as a crystal nucleating agent with respect to 100 parts by weight of the obtained polyamide resin. Went.
Molding was performed using a J75EII type injection molding machine manufactured by Nippon Steel, Ltd. at a resin temperature of 265 ° C., a mold temperature of 75 ° C., an injection pressure of 50 MPa, and a spiral flow test piece thickness of 3 mm. Table 1 shows the spiral flow length.
[実施例4]
重合終了時の撹拌動力を変更した以外は、実施例2と同様にしてポリアミド樹脂を取得(相対粘度(ηr)2.72)した。得られたポリアミド樹脂を用いて、末端アミノ基、末端カルボキシル基を測定して数平均分子量を算出した。結果を表1に示す。
[Example 4]
A polyamide resin was obtained (relative viscosity (η r ) 2.72) in the same manner as in Example 2 except that the stirring power at the end of the polymerization was changed. Using the obtained polyamide resin, the terminal amino group and terminal carboxyl group were measured, and the number average molecular weight was calculated. The results are shown in Table 1.
<スパイラルフロー試験片の成形>
得られたポリアミド樹脂100重量部に対し、結晶核剤として平均粒子径が3.0μmのタルク0.03重量部をドライブレンドして得たポリアミド樹脂組成物を原料として、スパイラルフロー試験片の成形を行った。
成形は、日本製鋼所社製J75EII型射出成形機を使用し、樹脂温度265℃、金型温度75℃、射出圧力50MPa、スパイラルフロー試験片厚み3mmにて行った。スパイラル流動長を表1に示す。
<Formation of spiral flow test piece>
Spiral flow test piece molding using as raw material a polyamide resin composition obtained by dry blending 0.03 part by weight of talc having an average particle size of 3.0 μm as a crystal nucleating agent with respect to 100 parts by weight of the obtained polyamide resin. Went.
Molding was performed using a J75EII type injection molding machine manufactured by Nippon Steel, Ltd. at a resin temperature of 265 ° C., a mold temperature of 75 ° C., an injection pressure of 50 MPa, and a spiral flow test piece thickness of 3 mm. Table 1 shows the spiral flow length.
[比較例1]
実施例1において、カダベリン・アジピン酸塩(c)を用いた以外は実施例1と同様にして、ポリアミド樹脂の取得(相対粘度(ηr)3.54)、フィルム成形、及びその評価を行った。結果を表1に示す。
[Comparative Example 1]
In Example 1, polyamide resin was obtained (relative viscosity (η r ) 3.54), film formation, and evaluation was performed in the same manner as in Example 1 except that cadaverine adipate (c) was used. It was. The results are shown in Table 1.
[比較例2]
<ポリアミド樹脂の製造>
重合終了時の撹拌動力を変更した以外は、比較例1と同様にしてポリアミド樹脂を取得(相対粘度(ηr)3.03)した。得られたポリアミド樹脂を用いて、末端アミノ基、末端カルボキシル基を測定して数平均分子量を算出した。結果を表1に示す。
[Comparative Example 2]
<Manufacture of polyamide resin>
A polyamide resin was obtained (relative viscosity (η r ) 3.03) in the same manner as in Comparative Example 1 except that the stirring power at the end of the polymerization was changed. Using the obtained polyamide resin, the terminal amino group and terminal carboxyl group were measured, and the number average molecular weight was calculated. The results are shown in Table 1.
<スパイラルフロー試験片の成形>
実施例4と同様にして、スパイラルフロー試験片の成形を行った。スパイラル流動長を表1に示す。
<Formation of spiral flow test piece>
In the same manner as in Example 4, a spiral flow test piece was molded. Table 1 shows the spiral flow length.
以上、詳述したように、本実施の形態におけるカダベリン塩水溶液の製造方法は、タンパク、核酸、多糖等の高分子不純物を除去することが特徴である。これを原料にしてなるポリアミド樹脂は、架橋等によるゲルの発生が少なく、フィルム、射出成形品、繊維、モノフィラメント等に極めて好適に使用することが可能である。具体的には、著しくフィッシュアイが少なく表面外観に優れたポリアミド樹脂フィルム、繊維、モノフィラメントを得ることが可能であり、且つ、著しく射出成形時の流動性が優れるものである。
さらにバイオマス由来の原料を用いることが可能であるため、地球温暖化の防止や循環型社会を形成する上で極めて有効である。
As described above in detail, the method for producing an aqueous cadaverine salt solution in the present embodiment is characterized by removing polymer impurities such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides. Polyamide resin made from this material is less likely to generate gel due to crosslinking or the like, and can be used very suitably for films, injection-molded products, fibers, monofilaments, and the like. Specifically, it is possible to obtain a polyamide resin film, fiber, and monofilament having a very small fish eye and excellent surface appearance, and the fluidity during injection molding is remarkably excellent.
Furthermore, since biomass-derived raw materials can be used, it is extremely effective in preventing global warming and forming a recycling society.
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